JP2009506836A - 生物学的に統合された電極装置 - Google Patents

Abstract

向上した生体適合性及び生体模倣の特徴を持つバイオ電極が提供された。このバイオ電極を製造しそして使用する方法も提供された。第一電気伝導性基質及び生物学的要素を含むバイオ電極を使用して電子的信号を検出するための生物学的に統合されたバイオ電極及び方法。このバイオ電極はバイオ電極を規定する第一電気伝導性基質及び生物学的要素に電気的に結合した伝導性ポリマーを含む。このバイオ電極は電気伝導性基質及び生物学的要素及び伝導性ポリマーの間の電気信号を伝達又は受信することができる。

Description

政府の権利
この開示は、国立科学財団助成金Ｎｏ．ＤＭＲ−００８４３０４及び国立衛生研究所助成金Ｎｏ．Ｎ０１−ＮＳ−１−２３３８による政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を保有する。

この教示は、生物学的構成要素が存在する中に伝導性ポリマーが無毒性で堆積しそして重合することにより形成される生体適合性で、生物学的に統合された電極装置に関係する。特に、本教示は、バイオ電極と種々の生物学的及び化学的標的の間の電気的、化学的及びイオン的相互作用の検出、刺激及び記録のための装置及び方法に関係する。この方法は、伝導性ポリマーとバイオ電極と相互作用することができる周囲の組織、細胞、化学物質、電解質、チャージキャリアー受容体及び酵素の間の電荷移動相互作用の検出と刺激のために使用することができる。

本質的に、「伝導性ポリマー」（π−結合伝導性ポリマー）及び伝導性ドーパントを含有する非伝導性ポリマーは、以前から存在する電極、プローブ及びセンサーのための独特の電気的、生化学的及び電気活性特性を示す生体適合ポリマーコーティング材料として有用である。重合して伝導性ポリマーを形成するモノマーは、３，４−エチレンジオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）、ピロール、アニリン、アセチレン、チオフェン及びそれらの混合物の一つ以上を含むことができる。

生物医学装置の電極として現在使用されている表面及び大量の材料は生体適合性に限界があり、埋め込まれた装置の近傍に組織傷害及び炎症を生じる。限定された生体適合性に加えて、慢性陰性免疫系反応の刺激はしばしば存在する移植電極の生体汚染及び装置表面物質の腐食を生じる。中枢神経系（ＣＮＳ）を含む種々の生体組織は埋め込んだ装置に否定的に反応し、埋め込んだ部位、使用した材料及び電極の形態及び埋め込みの方法の相違によりその重症度はまちまちである。ＣＮＳに埋め込み可能な装置の慢性的拒絶反応は、フィラメントタンパク質及びビメンチンの発現増加による周囲の星状細胞の肥大反応により特徴付けることができる。装置表面へのタンパク質の吸着に加えて、ミクログリア細胞及び異物巨細胞が埋め込んだ装置を包み、装置がカプセルの中に閉じ込められ、電気抵抗の高い繊維質の瘢痕組織を生じる。これにより、組織と装置の間の信号伝達は減少し、最終的に無くなる。同様な異物反応は、新規の埋め込み生物医学装置の主要な標的である脳、心臓及び皮膚を含めて、ヒト及び動物の組織全てに認められる。生体非適合性は、現在開発中の新しい埋め込み可能な生物医学装置の重要な弱点であり、インビボにおける試験及び使用に成功するために真っ先に解決すべき障碍である。

埋め込み可能な電極及びセンサーの表面の修飾は、長期的生体適合性及び電気的性能の両者の改善をもたらすはずである。電極の部位を生きている組織に密着して境界面を接することができ、同時にイオン伝導性の組織から電気伝導性の電極へ有効に電荷を移動させ、周囲の組織を埋め込まれた装置に接着又は直接境界面を接しさせる電極装置を設計することは非常に好ましいであろう。

要約
本教示は、電気化学的に検出しそして刺激する装置を構築するための組成物を提供し、その中の電極は記録及び刺激操作の間生物学的要素に密着して接触している。電気的に伝導性の物質又は作動中の電極は、生きている組織、細胞、細胞構成成分及び人工的足場の存在する中に伝導性ポリマーとして重合することができる伝導性ポリマーでコーティングされており、それはバイオ電極の有効表面積を大きく増加し、インピーダンスの減少を生じ、そして生体適合性を増加し、それにより信号伝達を容易にする。生物学的に統合された電極は、埋め込んだ時に周囲の細胞及び／又は組織と電気伝導性物質が境界を接することにより、さらに電気伝導性基質を安定化させ、そして好ましくない免疫拒絶反応の形成を予防する生物活性物質を負荷することができる。

本教示の別の態様は、第一の電気伝導性物質及び生物学的要素を含む生物学的に統合された電極に関係する。バイオ電極は、又生物学的要素に第一の伝導性物質を電気的に結合する一つ以上の伝導性ポリマーを含む伝導性ポリマーを含み、バイオ電極を定義する。バイオ電極は、第一の電気伝導物質及び生物学的要素及び伝導性ポリマーの間の電気信号を伝達又は受け取ることができる。

本教示の別の態様は、生きている組織中の細胞間又は細胞内の電荷の移動を電気的に検出する方法に関係する。この方法は、電荷を移動させることができる組織と密着して接触した第一の電気伝導性物質又は作動電極を含むバイオ電極装置を提供するステップを含む。バイオ電極装置は第一の電気伝導性基質及び生物学的要素から作られている。バイオ電極は、また第一の電気伝導性物質を生物学的要素に電気的に結合している伝導性ポリマーを含み、集合してバイオ電極を定義する。このバイオ電極は、第一の電気伝導性物質、生物学的要素のいずれか一つ及び伝導性ポリマーの間の電気信号を伝達するか又は受け取ることができる。この方法は、又バイオ電極装置及びバイオ電極と電気的に結合した第二の電気伝導性物質（別の電極）を電源に電気的に連結することも含む。この方法は、さらに、第一及び第二の電気伝導性物質を横断して電圧又は電流を適用することを含み、それによりこの伝導性ポリマーを通る電圧又は電流を誘発する。この方法は、バイオ電極装置により電気信号の移動の検出もする。

本教示のこの他の応用分野は、この後に示される詳細な説明により明らかになるであろう。詳細な説明及び特定の実施例は、本教示の一定の態様を示しているが、説明の目的のみを意図しており、この発明の範囲を限定することは意図していないことは理解されなければならない。

図面
ここに記述された図面は、いずれにしても、説明の目的のためだけのものであり、本開示の範囲を限定することは意図していない。

本教示の一定の態様により考慮されている生体適合性電極（バイオ電極）、改良電極及びコーティングは、インビボ条件において低い生分解性、低い電気的インピーダンス、長期の電気的安定性を持つ電極装置及び／又は伝導性ポリマーコーティングを含み、機械的に柔らかであり、ナノメーター及びマイクロメーターの表面特徴を持つ（細胞特徴／細胞表面を模った及びパターンを持つ）生体模倣物である。本教示の一定の態様は、伝導性の細胞を模った、生きた細胞を接種したバイオ電極、又は分子電極ネットワークに関係し、それらはいずれの分子種にも適用することができ、例えば：伝導性高分子ネットワークを形成することができる：ポリマー又は高分子の状態において生体適合性で無毒性及び／又は非免疫原性である：ＵＶ／光、電気、熱、化学又は自働開始のいずれかにより電気化学又は化学的重合又は交差結合することにより水又は食塩液の溶液又はモノマー単位のゲル又は小型のオリゴマー成分から高分子又はポリマーフィルム又はネットワークを調製することができることを含む。こうして得られた電気伝導性フィルム及び電極被膜は、実施している間、機械的に安定であり、分解に抵抗し、そして電気的完全性と連結性を維持することができる。

組織、細胞及び膜、受容体、抗体、イオン−チャネル、成長因子及びその他の生物学的分子及び作用物質を含む細胞構成物を含む生化学的要素の存在する中で重合した該電気伝導性ポリマーにより、マクロ、マイクロ及びナノ−スケールの部品を持つ装置が形作られる。本教示のバイオ電極、改良電極及び電極被膜は、組織に埋め込まれた後に電気的に安定であり、シリコン、白金、イリジウム、インジウム、酸化チタン及びタングステンのような一般的に使用されている伝導性基質材料に比較して非生分解性であるが生体適合性があり、免疫反応の発現のレベルが低い電極及び電極被膜材料を含む有用な特徴を示す。本教示のバイオ電極又は電極被膜は、標的細胞上の特定のタンパク質又は生体分子との相互作用を促進するために、容易に改良して多様な生物活性物質を含有することができ、そして装置表面の生体汚染による非特異的相互作用を制限することができる。タンパク質は、電気化学的沈殿、共有結合及びポリマーマトリックス中への取り込みのような種々な方法により伝導性ポリマーの中に取り込むことができる。ここに記述した電極被膜を含むバイオ電極及び装置は、低い電気的インピーダンスと生体類似の表面パターン（細胞の形を持つ孔及び細胞表面を模ったナノスケールの特徴を持つトンネル）の大きな表面積を持つ軟らかく、ふわふわした電極でありえる。この大きな表面積は、電極と標的組織の間の最大の電荷移動を促進するのに理想的である。ポリマーの柔軟性は、硬い金属電極に比較して、軟組織と硬い装置表面の間の接触面における機械的緊張を減少させることができる。まとめて、これらの品質は、本教示の伝導性ポリマーで覆われた細胞、細胞構成成分及び生物活性分子を、既存の電極を使用する生物医学装置の代わりに、大きな表面積の、軟らかい、生体適合性のそして電気的に安定な表面被膜として役立たせることができ、そしてそれは免疫反応の減少及び信号伝達の改善及び組織と装置の間の境界面における融合（組織接着）を生じる。

一部の態様において、電気伝導性基質の表面上に模様をつけた伝導性ポリマーを使用することにより、イオン性伝導組織から電気伝導電極へ信号の伝達を容易にする。生物学的要素と共に重合した伝導性ポリマーも、伝導性基質被膜の３次元の性質を記述するために、ここでは「伝導性ポリマーネットワーク」又は「生化学的要素−伝導性ポリマー複合材料」と称される。本教示の一定の態様は、電極を使用する装置の表面及び生物学的環境の間の密着した、直接の境界面を生じる組織、細胞、細胞構成成分及びその他の生物活性分子が存在する中において、新規伝導性ポリマーネットワーク並びに伝導性ポリマーを重合する方法を提供する。

本教示の詳細な説明は、電気伝導性基質、共役伝導性ポリマー、生物学的要素、コントローラー及び分析装置及び電源を含む追加の機器構成を含む電極構成要素を別々に扱う。種々の代表的バイオ電極及び生物学的要素を埋め込んだ伝導性ポリマーにより修飾された電極及びその使用は別に記述される。最後に、本教示は、その有用性及び新規性を示すために、多数のバイオ電極及び装置及び実験により例示する。
Ａ．装置構成要素及び材料

１．電気伝導性基質
電極基質は、伝導性材料又は伝導性及び非伝導性の材料の組合せのいずれかを含むことができる。電気伝導性基質の代表的形状は多数記述されており、他の形状を使用することができると理解されうる。非限定的な態様において、電気伝導性基質は、限定はしないが：金（Ａｕ）、白金（Ｐｔ）、イリジウム（Ｉｒ）、パラジウム（Ｐｄ）、タングステン（Ｗ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、ステンレス鋼（ＳＳ）、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）、亜鉛（Ｚｎ）、チタン（Ｔｉ）、タングステン（Ｗ）及びそれらの合金及び酸化物を含む金属から製造することができる。他の電気伝導性基質として：炭素、炭素繊維、ガラス状炭素、炭素コンポジット、炭素ペースト、伝導性セラミック、例えば、ドープシリコン（Ｓｉ）、伝導性モノマー及びポリマーが含まれうる。ここに使用されている第一電気伝導性基質は、生物学的要素及び伝導性ポリマーと接触又は連結している基質又は電極である。第一電気伝導性基質は、マルチ伝導性基質バイオ電極装置における作動電極とも呼ばれる。第二電気伝導性基質は、次のいずれか一つと呼ばれることがあり得る：対照電極、対電極又は飽和カロメル電極。

一部の態様において、電極は、金属粉、伝導性ポリマー又は伝導性セラミックのような電気伝導性材料により模様をつけることができる。下にある支持材料は、この支持材料を伝導性にすることができるか又は非伝導性支持体の中又は上に伝導性材料を形成又は模様をつけることができる限り、伝導性材料で構成されている必要は無い。

一つ以上の電極のアレイを含む装置は、いずれかの適する支持材料を含み、その上に複数の伝導性材料のチャネル、点、スポットが形成される。一般的に、この電極の支持材料は、生物学的な液と接触するようになった場合に、この支持体は本質的に生体適合性でなければならない。本教示のマイクロ電極アレイはいずれかの特別な形である必要はなく、すなわち、この電極は正方形のマトリックス形である必要はない。考慮されている電極アレイの形状は次のものを含むことができる：正方形；長方形；直線で囲まれそして６角形の格子状アレイ；種々の多角形の境界線；電極が共通の中心の周りに同心円を形成している同心円格子形状、そしてそれは任意の多角形により結束されていることがある；また、それぞれの格子アレイ形状が同じ又は異なる直径の電極を持つ。織り合わせた電極も、本教示に従って使用することができる。一部の態様において、電極のアレイは、４×４マトリックス中に約９から約１６個の電極、５×５マトリックス中に１６から約２５個の電極、１０×１０マトリックス中に１０から１００個の電極を含むことができる。この分野で知られている他のサイズを、本教示に従って使用することができる。

マイクロ電極のパターン化されたアレイの製造は、限定せずに、マルチラインヘッドのノズルにより複数の電気伝導性ポリマーの射出、インクジェット技術などを含む、マイクロアレイの生産において一般的に知られている種々のマイクロプリンティング方法により実施することができる。それらは、コンピューターチップ製造のために知られている写真平板法及びエッチング法を使用してパターン化することができる。微小機械部品は、適合する「マイクロマシーン」操作（シリコンウエーファー、又は相当する基質の部分を選択的にエッチングにより取り除く）を使用するか又は新たに構造層を追加して機械的及び／又は電気機械的部品を形成することにより製造することができる

マイクロ−電気−機械的システム（ＭＥＭＳ）製造において想定されているようなポリマー支持体上に形成された電極は、支持材料の上に伝導性材料の薄いフィルムを沈殿させ、写真平板画像又は他の既知リトグラフ法によりフィルムの上にパターン化マスクを適用し、そしてフィルムを選択的にエッチングする。薄いフィルムは数ナノメーターから１００マイクロメーターの範囲の厚さを持つことができる。本教示において想定されているマイクロ又はナノ電極として使用するための電気伝導性材料の沈殿は、化学気相成長法（ＣＶＤ）、電着、エピタキシー及び熱酸化のような化学的方法及び物理気相成長法（ＰＶＤ）及び鋳造のような物理的方法も含むことができる。伝導性ポリマー及び細胞及び細胞構成成分を含む生体分子を含む強化された生体適合境界面を持つナノ−電気機械システムの製造方法は、本開示の一定の態様に使用することができる。（例えば、Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５３２−３６，２０００参照）。

本教示の一部の態様において、電極上に１以上の細胞、細胞構成成分及び／又は生物活性分子を含む伝導性ポリマーのアレイ又はサブアレイは、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル及び／又はマイクロチャネルのようなコンパートメントを充たす種々の液（細胞、細胞構成成分を含むモノマー溶液、ヒドロゲル及び生物学的分子を含む）に連結することができる。装置のこれら及び他の部品は、一つの単位、例えば、チップ、マイクロキャピラリー又はマイクロ流体チップの形に形成することができる。マイクロ成型チップの種々な形は、例えばＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）から商業的に入手できる。

一部の態様において、電極基質の分解性は装置又は電極により提供される機能に依存することがあり得る。例えば、伝導性材料及び伝導性分解性ポリマーを伴う非伝導性材料は、ＰＬＧＡ，ＰＬＡ，ＨＡ，バイオゴム、酸化ガラス及び当業者には既知の生体適合性の生分解性材料を含む材料から合成することができる。該材料の妥当性は、装置又は電極の機能が、一時的に刺激し、傷害され又は欠損した組織を再生し、次いで細胞又は組織の完全な再生と連結性のための空間を作るために成功した埋め込みの後に広がりをしぼませることである場合には、明らかである。一部の態様において、この電気伝導性基質は、永久的から半永久的であることができ、その場合、装置が長時間使用できるか又は埋め込んだ後は除去することが有害である時、例えば、深部の脳神経の人工補綴物、心臓ペースメーカーなどに使用することができる。該長期使用を想定した電気伝導性基質は、金属、セラミック及び非分解性伝導性ポリマー、例えば、ＰＥＤＯＴを含むことができる。

一部の態様において、電極は、バイオ電極、細胞、伝導性ポリマー−細胞境界面又は埋め込み部位のインピーダンス、インダクタンス、抵抗又はキャパシタンスにおける電流の測定、記録及び分析又は電荷の検出に使用されるほかの装置部品と電気的連絡をしている電線、リード、伝導性ポリマーを含む装置の他の部品に部分的に又は全体的に連結することができる。本教示の種々の態様において、伝導性モノマーを重合し、電気化学的酸化／還元反応を行い、組織及び／又は細胞を刺激するために電流及び電圧を供給し、生物活性物質を放出するために、電気化学事象を記録又は検出するために、複数又は多数の電極が並列又は直列で使用することができる。ここに記述した装置の中に設置することができるほかの電極は、さらに、種々の対電極及び飽和カロメル電極又は対照電極を含むことができる。

ＩＩ．伝導性ポリマー
本教示の一定の態様において、伝導性ポリマーは好ましい特徴に影響を及ぼすことができ、例えば：組織内に埋め込まれた後の時間電気的に安定であり、比較的非−生分解性であるが、生体適合性があり、一般に使用されている伝導性材料、例えば、シリコン、白金、イリジウム、インジウム−スズ−酸化物及びタングステンよりは免疫反応性は低い。ここに使用されている伝導性ポリマーは、電子を伝導することができる共役ポリマーである。用語“ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ（ｓ）”は“ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ（ｓ）”と互換的に使用される。伝導性ポリマーは、そのモノマー型から電気化学的重合、酸化的重合及び当業者が一般的に使用しているほかの方法により形成される。電気伝導基質の周りに重合した伝導性ポリマーは、電気伝導性基質から広がったその３次元の、ふわふわした、軟らかい原線維であるために、伝導性ポリマーネットワークとも呼ばれる。一部の態様において、この伝導ポリマーネットワークは、細胞、細胞構成成分、生物活性分子又は物質及びそれらの組合せを含む生物学的要素を埋め込んで含んでいる。一つ以上の生物学的要素を持つ伝導性ポリマーネットワークは、また生物学的要素−伝導性ポリマー複合材料とも呼ばれる。本教示の一定の態様において、この伝導性ポリマーは、ドーパント、組織、細胞、細胞のパーツ、細胞構成成分、他の生物活性分子、ウイルス、プラスミド、イースト、デンドロマー、量子ドット又はマイクロ−ナノ粒子遺伝子輸送ベクター及び／又は標的組織の特定の細胞又は分子と相互作用することを意図した表面官能基又は分子で修飾することができる天然由来又は合成ポリマーからなる生分解性マイクロ−ナノ粒子又は線維が存在する中で重合でき、又はその中に含有された生物活性分子の調節放出のために使用することができる。

一部の態様において、伝導性ポリマーは、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（ピロール）、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）、ポリ−４−ビニルピリジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリチオフェン、それらのポリマー混合物、及び電荷又はイオンを伝導する能力を持つコンポジット、及び電気又はイオンの伝導性があるポリマー−金属複合材料を含むことができるがこれに限定されない。他の伝導性ポリマーは、ＥＤＯＴ及び他の伝導性ポリマー誘導体、ＲＧＤ，ＩＫＶＡＶ，ＹＩＧＳＲペプチドのような官能基、及び伝導性モノマーに共有結合で接着できる他の官能基から造られる官能化コポリマーを含むことができ、或いはそれらは伝導性モノマーに接着することができる２価官能基を持つスペーサーに連結することができる。共有結合による接着は、当業者に既知の共有化学のいずれかを使用して行うことができる。好ましい共有結合による接着化学の例は、アミン、アミド、エステル、エーテル及びそのヘテロ原子同族体、例えば、スルホンアミド、チオエーテルなどを含む。一対の結合する物のそれぞれは、一対の反応基、例えば求核基及び求電子基を、共同してその対になったメンバーのそれぞれに一つ含むことができる。生物学的実体（生体分子、細胞、細胞フラグメント、細胞小器官又は他の生物体）がモノマー又はポリマーに直接接着する場合は、それぞれ一対の反応基を含むであろう。接着がリンカーを介して生じる場合は、リンカーは二つの反応基を含み、その一つはモノマーの反応基と共有結合反応をすることができ、そして他の一つは生物学的実体の反応基と共有結合反応をすることができる。反応基は、モノマー、リンカー又は生物学的実体の部分として予め存在することができ、或いは接着反応の実施に先立って反応によりそこに付加することができる。接着がリンカーを介して生じる場合は、リンカーは最初にポリマーに、最初に生物学的実体に、又は両者に同時に接着することができる。共有結合による接着の形成に使用するための好ましい求核基及び求電子基の非限定的例を表１に示す。

典型的に、共有結合により接着する実体は、適するｐＨ，一般的にはｐＨ約７からｐＨ約１０において、また約１０℃から約４０℃の温度において、適する溶媒、例えば、水性メタノール、水性エタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド又はそれらの組合せの中に懸濁又は溶解することができる。中性から塩基性のｐＨが典型的に使用され、そしてこれはほとんどの場合に、反応液に塩基を加えることにより達成される。この目的に好ましい塩基の例は、無機塩基及び有機窒素系塩基を含む。無機塩基の中では、金属の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩が好ましく、アルカリ金属の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩およびそれらの組合せが好ましい。好ましい無機塩の例は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、水酸化リチウム、炭酸リチウム、水酸化カリウム及びそれらの組合せを含む。

一部の態様において、伝導性ポリマーは、適当なドーピングシステムの存在により伝導性にすることができる非伝導性のモノマー又はポリマーのいずれかであり得る。一部の態様において、ここに記述した共役ポリマーは、化学的に合成され、重合の前又は後にタンパク質、脂質及び核酸と結合することができる官能基を含むことができる。伝導性ポリマーの官能化に加えて、タンパク質、脂質及び核酸を含む生物活性分子を、水素結合、静電的及び非極性相互作用により伝導性ポリマーに接着することもできる。一部の態様において、伝導性ポリマーは生分解性であり、そして生物学的液の存在により溶解する、例えば、装置がその場に埋め込まれた場合、例えば、埋め込み可能な脳補綴物、神経刺激物、一時的心臓装置など。生分解性伝導性ポリマーは、限定せずに、ポリピロール ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ブロックＰＥＧ及びポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、テトラメタクリレート及びＴＤＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｗｈｅａｔ Ｒｉｄｇｅ ＣＯ，ＵＳＡから商業的に入手できるものを含むことができる。

本教示により想定されている伝導性ポリマーは、典型的に重合及び電極−組織境界面を横切る電気伝導性のために対イオンを必要とする。伝導性ポリマーは、分子レベルにおいてポリ電解質になる。電子の非局在性は、伝導性ポリマー骨格の中に共役二重結合が存在する結果である。伝導性ポリマーを電気伝導性にするために、二重結合の中に移動担体を導入することが必要であり、これは酸化又は還元反応（「ドーピング」と呼ばれる）により達成される。ドーピングのコンセプトにより、伝導性ポリマーは他の種類のポリマーとは区別される。この方法は、無機半導体におけるドーピングに類似して、ポリマー鎖の中に注入された電荷の符号の正又は負によりｐ−ドーピング又はｎ−ドーピングとして指定することができる。これらの電荷は非局在化しており、ドーパントを指定する対イオン（アニオン又はカチオン）の導入により中和される。一定の態様において、伝導性ポリマーを重合するために使用されるイオン性電解質又はドーパントは、限定せずに、ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ），ＬｉＣｌＯ_４，リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ），Ｈａｎｋの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ），コラーゲン、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−オルニチン、及び使用するタイプのドーピングシステムに適するイオン電荷を持つ関心の生物活性分子を含み、そして、限定せずに、デキサメタゾン又は他の抗炎症剤、抗生物質、抗有糸分裂薬、成長因子、瘢痕減少薬、ポリアクリル酸、ドデシルベンゼンスルホン酸（ＤＢＳＡ）、ｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ＴＳＡ）及びそれらの組合せを含むことができる。

ＩＩＩ．生物学的要素
装置、電極及び電極に基づく装置の被膜は、１以上の生物学的要素を使用することを想定している。この用語「生物学的要素」は、細胞の集合のような複雑な材料、例えば組織から単位、例えば細胞構成成分、例えば細胞の中の、上の或いは細胞により生産される受容体、イオンチャネル、膜、細胞小器官、酵素、抗体及び染色体及びアミノ酸の重合体、糖及び核酸までを含む有機材料のいずれも包含することができる。種々の態様において、生物活性分子は、バイオ電極に、或いは細胞、組織及び他の生物学的要素の増殖を支持するために使用されるヒドロゲル足場に加えることができる。生物活性分子は、いずれかの生物学的要素の発現、分化又は増殖に影響することができる自然に細胞が生産するタンパク質、脂質、糖類又は核酸分子のいずれかであり得るが、また同じパラメーターに影響することができる天然及び合成分子も含むことができ、また原核及び真核細胞の両者における該細胞パラメーターに影響することが知られている薬物、医薬品、生物学的物質及び化学物質を含むことができる。したがって、本教示の目的のために、生物学的要素は、限定せずに、組織、真核及び原核細胞を含む細胞、古細菌、細胞の膜、膜タンパク質、例えば、いずれかの細胞により生産された受容体、細胞外マトリックス分子、例えば、ラミニン、コラーゲン及びフィブロネクチン、受容体、抗体、イオンチャネル、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖含有代謝物酵素を持つ或いは持たない細胞膜類似合成膜又はフィルム、及び核酸（ＲＮＡ，ＤＮＡ及びｃＤＮＡ）を含む細胞構成成分を含むことができる。一部の態様において、有機的な生きている細胞は、いずれかの生きている原核細胞、例えば、細菌、そして真核細胞、例えば、イースト及び種々の組織及び器官において見出される哺乳動物細胞であり得る。有機的生きた細胞は天然に見出すことができ、或いはそれらは天然に由来し、当業者に一般的に知られている方法を使用して操作されて、外来ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を導入され、いずれかの細胞のタンパク質及び他の生体分子の発現、分化及び成長の特性を変化させることができる。一部の態様において、生物学的要素は、限定せずに、心臓細胞、ニューロン、グリア細胞を含む神経細胞及び天然に筋肉中に見出される細胞を含む電気的に活性な組織に由来する１以上の細胞であり得る。

一部の態様において、細胞（真核細胞又は細菌のような原核細胞）は、ＲＧＤ，ＩＫＶＡＶ，ＹＩＧＳＲペプチドのような官能基、及び細菌、細胞又は細胞部分、細胞膜、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、細胞表面タンパク質などに共有結合により接着できる他の官能基を加えることにより機能化することができ、或いはそれらは、細菌、細胞又は細胞の部分、細胞膜、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、細胞表面タンパク質などと同様に接着することができる２価官能基を持つスペーサーに連結することができる。一部の態様において、真核細胞（電気的活性細胞を含む）及び細菌細胞は、組換え操作を受けて、埋め込み部位の周囲に細胞を誘引しそして／又は支持することができる成長及び分化因子、ホルモン、酵素、細胞表面抗原（ＣＤ抗原）、イオンチャネルを含めてバイオ電極の生体適合性を増強するために使用することができる種々の細胞構成成分及び生物活性分子を発現及び／又は分泌することができる。

ＩＶ．バイオセンサー、診断装置及び装置／プローブ及び電極の被膜
本教示の種々な態様において、生物学的要素が存在する中において重合した本伝導性ポリマー構造は、裸の電極基質上に適用することができ、既存の電極に基づく装置の質を高め、生理的液、組織、細胞培養及び空気検体や水検体中で遭遇するような非生理的環境における電気的事象を検出し、記録しそして刺激するための改良されたマイクロアレイ電極部品を創り出すことができる。

限定せずに、マイクロ電極に基づく神経補綴装置、心臓の抗不整脈装置（ペースメーカー）、除細動器、蝸牛、網膜の補綴物、深部脳刺激装置及び生物学的要素−伝導性ポリマー境界面上のインピーダンス、抵抗又はキャパシタンス又は表面エネルギーの電流又は変化の検出に基づいて有機及び無機の基質、薬物、及び生化学物質を検出するために現在使用されている電極に基づく装置を含む多様な装置及び電極に基づくシステムは、ここに記述した伝導性ポリマー−生物学的要素混成材料の適用により機能的に強化することができる。

同族のリガンド、薬物、基質のポリマーに捕捉された受容体、イオンチャネル又は酵素への結合は、１以上の電極及び処理部品を使用して検出及び処理することができる。一部の態様において、酵素は、電気化学的に重合した伝導性ポリマーのなかに埋め込むことができる。種々の態様において、本教示のバイオセンサーの製造に想定されている酵素は、酸化酵素、還元酵素、転移酵素、酸化還元酵素、分解酵素、加水分解酵素、結合酵素及び異性化酵素を含むいずれかの補因子に対する同族基質に結合した時に酸化還元反応に関与するいずれかの酵素を含むことができる。グルコース酸化酵素は、グルコースを監視するために、本教示のバイオセンサーに使用することができる。同様に他の医学的に重要な酵素は、診断検査装置の分野において同族基質を監視するために使用することができる。標的分析物と生物学的要素の間の特異的結合が、サイクリックボルタンメトリー及びインピーダンススペクトルを使用して測定することができる電気抵抗に物理的変化を生じる場合に、バイオ電極はバイオセンシング装置の部分であり得る。生物学的要素−伝導性ポリマーと分析物の境界面において生じる表面エネルギー及び抵抗の変化に対応する伝導性ポリマーから得られる電気信号を読み取りそしてバイオ電極に接着する感知及び処理装置へ変換する自働システムは当業者には既知である。

Ｖ．器具類及び分析の道具
既存の電極を修飾するために使用される電極、電極に基づく装置及び被膜は、電流又は電圧の出力を調節するために使用することができる調節器、分析器及び他の検出装置及びコンピューターを任意に含むことができる。これらの任意の部品は、電子の流れに対する統合ネットワークの電気的事象、電流、電気的インピーダンススペクトル、サイクリックボルタンメトリー、抵抗、コンダクタンス、キャパシタンス、及び電位差を実施、測定及び記録のために使用することができる。これらの分析システム及び装置は、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ ＵＳＡ）から入手できる種々のＣＰＵ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）又はＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピューター）に連結したＢｒｉｎｋｍａｎ’ｓ（Ｅｃｏ Ｃｈｅｍｉｅ）Ａｕｔｏｌａｂ ｓｙｓｔｅｍを商業的に入手することができる。

ＶＩ．電源、調節器及び分析
既存の電極を修飾するために使用されるバイオ電極、電極に基づく装置及び被膜は、生物学的要素の周囲の伝導性モノマーの電気重合のための電流及び／又は電圧を供給するための、及び生物学的要素と隣接して接触している伝導性ポリマーに電流及び電圧を供給するための電源、作動器及びコントローラーを任意に含むことができる。電源は、電圧、ＡＣ及びＤＣ電流を供給することができる。一部の態様において、生物学的要素−伝導性ポリマー被膜を用いるバイオ電極及び電極に基づく装置は、電池を電源にすることもできる。

Ｂ．製造の方法
１．生きている細胞の電極及び電極被膜
電極は、生きている組織中、血流中、湖、川又は大洋の中、複雑な化学的溶液の中、又はほとんどのタイプのゲルの中のような水性又は液体で飽和した環境中で使用することができる。バイオ電極は、１）細胞の小集団、１個の細胞、又は細胞の膜の高度に局在化した領域の直接的電気刺激又は記録；２）細胞集団の細胞外電気刺激又は記録；３）タンパク質（成長因子）、薬物、化学物質、ビタミン、トキシン、薬物輸送ベジクル／パーティクルのような分子の供給（受動的又は一時的調節）；４）環境からの機械的、電気化学的及び／又は生物化学的情報の感知／検出を含む多数の活動を行うことができる。記録又は検出機構により得られた情報は、バイオ電極装置から直接又は記録装置及びコンピューターに付属した検出装置に連結したほかの電極を介して間接的にコンピューターに中継することができる。一部の態様において、生きている細胞は、金属プローブ又は電線のような第一電気伝導基質と接触していることがある。細胞を含む生物学的要素は、第一電気伝導性基質上で増殖することができ、或いは、第一電気伝導基質は生きている組織又は生物学的に適合した電極を造るために生物学的要素を含む溶液に挿入されるか又はそれと接触することができる。

図１に示すように、モノマー、例えばＥＤＯＴ３０の溶液は、電極（図１に示された陰極）上に接着したいずれかの生きている細胞であり得る生物学的要素を浸す。バイオ電極の伝導性ポリマー３０成分は適当なドーパント３４と混合されて、重合のための必要な酸化還元条件を提供する。定電流又は定電圧の電流を適用した後、陰極として図１に示されている電気伝導性基質から送られる電流によりモノマーは重合する。電導性ポリマー５０は、電極に送られたいずれの電荷も同様に伝導性ポリマーを介して送られ、そして伝導性ポリマーマトリックスが電極自体になるように、伝導性基質／電極の表面に直接堆積することができる。一部の態様において、伝導性ポリマー、例えば、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）はバイオ電極を製造するために使用することができる。本教示のバイオ電極は、低い生分解性、低い電気的インピーダンス、水溶液中における長期間の電気的安定性を有することができ、機械的に柔らかであり、（ナノメーター及び／又はマイクロメータースケールの次数、多孔性及び粗さのレベルを変えて）種々の表面形態を持つように仕立てることができ、そして天然又は合成の生物活性分子／タンパク質（薬物、化学物質、ビタミン、成長因子、細胞接着タンパク質、シグナリングタンパク質、酵素、酵素の基質）を空間的に管理された場所に取り込むことができ、そして必要があれば、これらの分子は低い電流を適用することにより一時的に管理された場所に放出することができ、またマイクロ又はナノパーティクル又は薬物／分子輸送ベシクルを取り込むこともできる。

一部の態様において電気的に活性な細胞、例えば、心臓、脳、ＣＮＳ及び筋肉の細胞を含めて生きている細胞を含む生物学的要素は、図２に示すように細胞の原形質膜がポリマー分子と密着した境界面を作って、伝導性ポリマー、細胞及び電極の間の継ぎ目の無い電気信号伝達ができるように、伝導性ポリマーマトリックスの中に完全に取り込むことができる。バイオ電極装置又は電極被膜中に取り込まれる細胞のタイプは、得られるバイオ電極の求める機能に従って選ぶことができる。例えば、一部の態様において、水性環境中の重金属及び殺虫剤を伝導度測定により検出するための生物学的要素として、微小藻類の使用を取り入れることができる。他の態様において、生物学的要素は、組織再生及び脳の中に埋め込まれた神経補綴装置のようなバイオ電極装置へ向う神経突起伸長を促進するために、バイオ電極又は電極被膜の中に取り込まれる成長因子を分泌する神経幹細胞であり得る。

ＩＩ．細胞を鋳型にした電極及び電極被膜
種々の態様において、ナノメーター及びマイクロメータースケールの表面特徴を鋳型とするか又はそれをパターン化した細胞の特徴／細胞表面の特徴を持つ高度に生体模倣電極及び既存の電極基質及びマイクロアレイ電極に基づく装置のための電極被膜が記述される。本教示による伝導性ポリマーは、種々の厚さのフィルムとして鋳造することができる。伝導性ポリマーのモノマーは電極上で電気化学的に重合することができる。本教示の一定の態様において、伝導性モノマーは、電極の表面上で増殖した生細胞が存在する中で重合することができる。伝導性ポリマーの中に捕捉されうる細胞は、電気信号を伝達することができる電気的に活性な細胞（例えば、限定せずに、ニューロン、骨格及び心臓の細胞）又は周囲の環境とイオン的に相互作用できる細胞であり得る。周囲の環境中の標的細胞は、伝導性ポリマーの中に埋め込まれた細胞と化学的に反応することができ、信号伝達又は他の化学的酸化還元（還元／酸化）反応、例えば、リガンド−受容体、及びリガンド−酵素結合事象、例えば、グルコース酸化酵素／グルコース反応を促進することができる。

一定の態様において、細胞の形／模様を持つ伝導性ポリマーネットワークは、その細胞を取り去った後にプローブ細胞で鋳造された電気伝導性基質の表面上で生細胞の単層培養が存在する中で電気化学的に堆積した伝導性ポリマーにより創ることができる。多孔性で織り地のような細胞に基づく伝導電極は、ふわふわした伝導性ポリマーの高い表面積及び細胞の形の模様により、細胞、例えば、ニューロン又は筋細胞に電極表面に密に接触させることができる。図３パネルＡ〜Ｃに示すように、細胞に規定されたポリマーの形状は、ポリマー表面の細胞の形の孔及び模様並びにミクロンサイズのトンネル、裂け目及び、例えば、神経突起の大きさの陥入を生じる伸長した神経突起の周囲に形成されたニューロン、神経突起の形を鋳型にした伝導性ポリマーのトンネルによる陥没を含む。一定の態様において、細胞を鋳型にしたバイオ電極は、組織内に埋め込むことができ、宿主組織中の細胞を細胞の形をした孔の中に再度増殖させることができそしてポリマー表面のミクロンサイズの裂け目及び陥入の中に突起を送り込むことができる細胞を鋳型とするポリマー電極表面を生じる。一つの表面の細胞と伝導性ポリマーの間及び他の表面の伝導性ポリマーと電極基質の間の密着は、細胞を鋳型にしてコートされたバイオ電極により提供される電気シグナルの利点により示される電極と標的組織の継ぎ目の無い電気的接触を可能にするであろう。

細胞鋳型の特徴を持つバイオ電極は、またそして裸の電極ワイヤーに比較して電極の有効表面積の増加により、電極の電荷移動能力を増加し、バイオ電極により経験する電気的インピーダンスを減少させる。図４、パネル（Ａ）に示すように、細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴは、ＰＥＤＯＴでコートされた電気伝導性基質とＰＥＤＯＴに埋め込まれたＳＹ５Ｙ細胞（生細胞のバイオ電極）の間のインピーダンスプロットを示す。

ＩＩＩ．空間を充たすヒドロゲルバイオ電極及び電極被膜
本教示による一定の態様において、生体適合性で埋め込み可能な電極は、１以上の生物学的要素、例えば、それにより伝導性ポリマーが電気化学的に堆積する生細胞を接種したヒドロゲルを含む。図５に示すように、空間を充たすバイオ電極は、生きている組織、例えば、脳の中に埋め込むことができる。生体適合性ヒドロゲル１２０又は親水性ポリマーの３次元的に交差結合した高分子は頭蓋９０を通して注入することができ、そして生きている細胞１１０の栄養物質及び物理的支持環境の両者として役立ち、そしてマイクロメーター及びナノメーターの細い線維の拡散した伝導性ポリマーネットワークを造る足場として役立つことができる。組織に注入されるとすれば、細胞１１０は、天然又は組換え細胞、例えば、埋め込み部位へ神経突起を誘引する作用因子のような成長因子を発現する細胞のいずれかであり得る。一定の態様において、ヒドロゲル材料は極めて軟らかく、親水性でありそして「組織様」であるので、生物医学的装置の被膜として充分に適しており、装置の埋め込みの間の宿主組織に対する外傷性傷害を低いレベルにすることを可能にする。さらに、ヒドロゲルには生物活性分子、例えば、薬物（限定せずに、抗ウイルス薬、抗微生物薬、抗酸化薬及び抗炎症薬を含む）を加えることができ、好ましくない免疫系の反応及び／又は生体分子（細胞接着タンパク質、例えば、インテグリン、神経細胞接着分子、ＮＣＡＭ；ラミニン；フィブロネクチン；ビトロネクチン；カドヘリンなど）を阻止し、シナプス形成及び神経誘導のような特異的細胞−ポリマー相互作用を促進する。ヒドロゲルマトリックスは、生きている幹細胞を接種することもでき、それは、埋め込み部位に近い宿主組織に対して、局所組織再生を促進するための成長因子分泌、装置の埋め込み部位へ外来性幹細胞の動員、及び装置の埋め込み操作の間に傷害を受け或いは殺された細胞を置き換えるための多能性前駆細胞の源を含む様々な利点を提供する。ヒドロゲルの生分解性は、ゆっくりと吸収されるように調節することができ、遊走細胞（例えば、ニューロン）を伝導性ポリマーネットワークの中に侵入させることができ、最終的にホスト組織中の細胞をバイオ電極と直接接触させる。まとめると、炎症、走化性／接着及び成長因子の追加の調節を含めることは、少なくとも３つの異なる機能に役立つ：（１）これらの因子は組織の傷害及び炎症を改善し、緩和する、（２）装置埋め込み部位における再生の増加、及び（３）バイオ電極と宿主細胞の間の密着した接触を容易にする。

一定の態様において、ヒドロゲルが３次元の足場に交差結合する前に、生きている細胞を水性ヒドロゲルの中に取り込むことができる。本教示の方法に従って、限定せずに、アルギン酸カルシウム（交差結合剤）及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、キトサン、自己集合性タンパク質及び機能性ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−グリコール酸）（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）を含む多数の適当な無毒性ヒドロゲル組成物は生きている細胞の存在する中で交差結合することができる。伝導性ポリマー−細胞−ヒドロゲルの混成組成物は、例えば、限定せずに、電極の周囲に交差結合することができる細胞接種ヒドロゲルでコートした白金、シリコン又は金電極基質のような伝導性基質を使用することにより電極を細胞−ヒドロゲル複合物中に埋めることにより調製することができ、或いは伝導性マイクロワイヤーを治療される生組織の中の細胞を含む交差結合した３次元ヒドロゲル足場の中へ挿入することができる

重合のために、ヒドロゲル−電極複合体を、ＰＢＳ又はＨＢＳＳのような食塩液中に必要なモノマー並びにイオン性ドーパント又はポリ電解質を含む電気的に連結した容器の中に沈めることができる。ＡｕｔｏＬａｂ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ）を使用して１分間〜２時間、電極基質及び溶液に定電流（典型的に０．１〜１００μＡ／ｍｍ^２）を適用することができる。モノマーの電気化学的な酸化／還元は、ヒドロゲル−細胞複合体の中に拡散した伝導性ポリマーネットワークを生じる。一部の態様において、組織内に埋め込まれた細胞−ヒドロゲルマトリックスに対して伝導性モノマーを輸送するためにマイクロ液体モノマー輸送装置を使用することができる。

図５に示すように、生きているモルモットの蝸牛のような生組織の中に埋め込んだ空間を充たす電極の電気化学的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）及びサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）分析は、パネル（Ａ）に示すようにＰＢＳ中の裸の金に比較して有効にインピーダンスを減らすことを示した。本教示の空間を充たすバイオ電極は、モルモット蝸牛中の栄養性ヒドロゲルの中の伝導性ポリマーの大きな表面積を開発したことに関連して数桁の大きさでインピーダンスの減少を示した。パネル（Ａ）及び（Ｂ）において、ヒドロゲルは、アルギン酸塩交差結合剤及び伝導性モノマーを含んでいた。伝導性モノマーはその場で重合した。ＣＶは、多孔性ヒドロゲルの中の伝導性ポリマーネットワークの生成に関連して電荷貯蔵能力の増加を示した。

一定の態様において、ヒドロゲルは、バイオ電極挿入部位における組織再生及び損傷治癒を促進することができる生きている幹細胞又は前駆細胞のための足場又はマトリックスであり得る。他の態様において、ヒドロゲルの足場は、薬物、タンパク質及び他の生物活性分子及び標的組織の標識試薬のための輸送装置として使用することができる。一定の態様において、ヒドロゲルの足場の中に伝導性ポリマーネットワークを含むバイオ電極は、薬物又は他の試薬をヒドロゲルの中から放出させるために、又はヒドロゲルマトリックスの中の前駆細胞の分化を調節して刺激するために使用することができる。一定の態様において、ヒドロゲルマトリックスの中に含まれる伝導性ポリマーは、機械的に軟らかく、免疫原生の無い被膜として役立つことができる。さらに、一定の態様において、ヒドロゲルは、必ずしも標的組織の中に挿入される必要ななく、むしろ標的に隣接して置かれているが、ヒドロゲル内に含まれる伝導性ポリマーネットワークの成長による標的組織の電気的な神経支配ができる「空間充満」電極として使用することができる。

ＩＶ．その場に注入できる電極
本教示の一定の態様において、伝導性ポリマーネットワークは生きている組織内で直接重合することができ、それにより電極による傷害のようなもの及び電極の埋め込みの間及びその後の組織障害を減少させる。一定の態様において、得られた伝導性ポリマーネットワークは、生きている細胞の細胞膜と密接に接触することができる。一定の態様において、埋め込んだマイクロ液体バイオ電極装置の表面の拡散した生物学的要素−伝導性ポリマー混成物の成長は、電気的に連結した、細胞の周囲を囲む分子ほどに細い線維及び鎖の拡散したネットワークを創ることができ、有効に組織を神経支配する。図７参照。種々の態様において、伝導性モノマー１５０にバイオ電極を埋め込む組織を浸す。種々の態様において、モノマー溶液１５０は組織１６０、例えば、脳又は心臓又は筋肉組織の中に注入することができる。伝導性モノマー１５０をその場で重合させるために、作動電極又は第一電気伝導性基質１８０をモノマー１５０が注入される組織の中に挿入する。ついで第二電気伝導基質１７０（対照又は対電極）が第一電気伝導基質１８０の近くに置かれ、そしてその場で伝導性ポリマーを重合させるために一定の電流が適用される。この操作により、ホスト組織の電気的に活性な細胞と埋め込まれた装置の電極の間の密着した、特異的そして高感度の信号伝達が達成され、電極の改善された電荷転移能力を生じる。図７参照。本教示の一定の態様において、本技術による伝導性ポリマーは、生きている組織の中で重合することができ、完全に統合されそして有効な埋め込み電極、例えば、限定せずに、皮質の記録／刺激、深部脳刺激装置、末梢神経電極、心臓の抗不整脈治療（徐脈、頻脈及び他の不整脈）、筋肉刺激、外科的切除、（例えば、てんかんの治療）、ｐＨ監視、グルコース検査、蝸牛移植及び網膜補綴を生じる。さらに、拡散した伝導性ポリマーは、硬いシリコンに基づく又は金属に基づくプローブ電極の必要性を最小にし、そして新しい生細胞を組み込んだ極めて軟らかいナノ電極の周りに建設された電極パラダイムを重要にする。また、直接重合して、生きている組織の中に埋め込まれた電極に達する拡散した伝導性ポリマーネットワークは、独立して伝導性ポリマーネットワークの境界の中に挿入された別の電極を介して電気的に連結することもできる。必要があれば、最初に伝導性ポリマーが重合した埋め込み電極は取り去ることができ、そして新しい独立した電極を伝導性ポリマーネットワークの中に挿入することができ、そして伝導性ポリマーネットワークと境界を接する主電極として機能することができる。

Ｖ．全ポリマー電極
一部の態様において、電極基質及び埋め込み部品の全てポリマーの、非金属性の部品で組み立てられる。ポリマーワイヤー／電極は、非金属、非セラミックであり、半金属（例えば、シリコン）又は合金を含まない。ポリマー電極は、伝導性ポリマー又は伝導性ポリマーと非伝導性ポリマーの組合せ、又は「通常の」金属電極又はワイヤーの代わりに使用することができる電極リードを生じる特殊な配置で併置されたヒドロゲルからなる。一部の態様において、ポリマー電極は、炭素又は炭素ナノチューブも含むことができる。ポリマー電極は、磁場の存在（例えば、金属製の電極装置又はバイオ補綴物を含む埋め込み装置をつけている人のＭＲＩスキャン）のような金属を使用することが好ましくない、危険であるか又は不可能であるような状態のいずれにおいても使用することができる。第二に、ポリマー電極は、多様な基質及び材料からいくつもの方法で創ることができ、そして高度に適用性があり、特別な、種々の応用に対して容易に仕立てることができる。

Ｃ．使用の方法
本教示において想定されている電極及び電極に基づく装置の被膜は、心臓のペースメーカー及び除細動器、バイオセンサー、深部脳刺激装置、蝸牛インプラント、網膜補綴及び薬物検出及び生物活性物質輸送装置を含む多様な電気的生物医学的装置の応用における電極の性能を改良する能力を提供する。本教示の一部の態様において、裸の電極又は既存の電極に基づく装置に適用される多用途の伝導性ポリマー被膜は、低い電気的インピーダンスによって電気的に活性であるだけでなく、それらは生体適合性、機械的に軟らかく、そして「ふわふわ」して、マイクロ及びナノスケールの高い表面積を持っているので、電極装置と標的組織又は培地の間の直接的相互作用及び継ぎ目の無い統合を容易にする装置表面を提供する。さらに、これらの新規電気的に活性な伝導性ポリマーは、生物活性にすることができ、幹細胞又はその表面上に、受容体、イオンチャネル、抗原又は抗体、成長因子、又は他のバイオ分子のような種々の分子又は成長因子及び受容体を発現させるために、並びにナノ線維及び小結節、細胞の形状の孔、ナノ球状鋳型、及び神経突起を鋳型にしたマイクロチューブを模ることができる外来性生物活性分子を生産させる。

ここに記述された埋め込み生物医学装置上の電気活性伝導性ポリマー被膜により付け加えられた新規機能は、線維性瘢痕中への装置の封入の形成及び程度の減少に対応し、高品質の電気信号を記録する能力を改善し、電気刺激能力を増加し、そして装置の寿命を延長する。一部の態様において、電極基質は伝導性ポリマー及び生物学的要素を含む本教示の電気的に活性な生体材料でコーティングされている。少なくとも、電気伝導性ポリマーの一部は、生物学的要素及び電気伝導基質に隣接して堆積及び重合する。

Ｉ．検出及び記録電極
既存のマイクロ電極に基づく神経補綴装置の慢性的埋め込みはＣＮＳ傷害及び炎症と関連し、そのことは電極周囲のニューロン消失を生じ、補綴装置のグリア／免疫細胞中封入による高インピーダンスの発生を生じる。まとめると、これらの現象は、埋め込み後に時間と共に記録しうる神経のシグナルの品質の低下を生じ、最終的に記録する能力を阻害する。これは皮質補綴物の機能に必要である脳−コンピューターインターフェースを確立する能力を損なう。

この生物学的要素を含む新規の生物活性、生体適合性、低インピーダンス電気活性伝導性ポリマー被膜は、神経補綴装置の記録電極の理想的表面改良である。この「ふわふわ」した、大きな有効表面積は、電極−組織境界における低電気インピーダンスを促進し、それにより、たとえ線維性グリア封入が存在しても、標的細胞からの高品質シグナルを記録する可能性が増加する。

種々な態様において、神経の活性マッピングのための検出及び記録電極及びマイクロアレイ電極は、周囲の組織と密接に境界を接することができる統合されたバイオ電極装置が必要である。このタイプの電極の改良された電気応答は電極の有効表面積を増加することにより達成される。本教示の伝導性ポリマーは、有効表面積の該増加を提供し、生きている細胞、例えば埋め込み部位に成長因子及び分化因子を発現する幹細胞の増殖と生存を支持することができる。検出電極は、細胞及び薬物、成長因子、抗炎症薬及び抗生物質を含む生物活性分子を含む天然の足場を模倣することにより選択性及び感受性をさらに増加させることができる。一部の態様において、生きている細胞の周囲に重合した伝導性ポリマーを含むバイオ電極は組織の中に埋め込まれ、荷電容量の増加及び免疫及びグリア細胞封入によるバイオ電極周囲の瘢痕形成によるインピーダンスの減少のために、高品質信号を記録する正確で高い確率を可能にすることができる。まとめて、この意図は、現在の神経補綴電極技術よりも安定で感受性があり、長期間の神経の記録を可能にする。本教示の細胞を埋め込んだ伝導性ポリマーネットワークでコートした電極は、心臓、ＣＮＳ及び筋肉のような電気的活動性組織の電気生理学的マッピングのための皮質補綴物、改良カテーテルを含む。

一部の態様において、本教示の電極は、修飾されて、電気的活動性組織に接着するための高度に組織特異的で生体適合性の被膜を提供することができる。一つ以上の生物学的要素及び電極基質の周囲の伝導性ポリマーの重合に続いて、埋め込んだ生物学的要素、例えば、細胞（ニューロン、筋肉細胞、線維芽細胞、幹細胞など）を取り除いた跡に細胞膜成分、及び孔又は陥入、及び電極に隣接するか又は近隣の細胞の結合及びクローン化を促進する３次元構造を残すことにより、電極の３次元表面は周囲の組織の細胞をさらに誘引するようにすることができる。得られる電極は高度に統合されそして生体に類似し、電気活動性細胞の機能特性の高感度記録を可能にする。本教示の発明者らは、本教示の電極が、細胞を鋳型にした「ふわふわ」した伝導性ポリマー構造でコートされた時に、電荷移動能力の有意な増加及び電気的インピーダンスの著しい低下を発見した。電極に細胞を引き寄せ、そして電極基質から生物学的要素を取り除いた後に残される細胞の形をした孔、トンネル及び裂け目に入り、占有するように隣接細胞を仕向けることは、電極の安定性を改善し、電極表面の腐食を防止し、電極の好ましくない免疫反応による生体汚染を減らし、そして現在使用されている硬い金属電極に比較して電極の性能を改善するのに役立つ。

一部の態様において、細胞動員及び電極基質と周囲の組織の間の連絡にはより多くのナノスケールの細胞鋳型構造が必要である。これらのタイプ又は応用、例えば脳、心臓、及び中枢及び末梢神経系の中に埋め込むことができる電極のために、検出及び記録電極は、さらに大きな生体適合性と分子の類似性が必要である。一部の態様において、本教示の電極は、任意にヒドロゲル材料を電極基質の挿入の前に対象の中に埋め込むことができ、或いは電極基質と同時に対象の中に埋め込むこともできる。

アルギン酸、ポリビニルアルコール及びその他の生体適合性材料を含むヒドロゲルの足場は、電極の挿入の前に電極の部位に埋め込むか又は注入することができる。一部の態様において、ヒドロゲル足場は、生分解性であるか又は非生分解性でありうる。伝導性ポリマーと共に使用するためのヒドロゲル足場の例として、Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｇｅｌ ａｎｄ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，２：（１９９４）１３５−１４３，及びＧｈｏｓｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４７：１８７２−１８７７（２０００）を参照。本教示は、その場に使用した場合に、１以上の生物学的要素の存在する中のヒドロゲル中の伝導性ポリマーの重合のために、著しく改良されたヒドロゲル足場を提供する。一部の態様において、伝導性モノマーを含むヒドロゲルは隙間の部位、例えば、くぼみの中に、一般的に関心の細胞又は組織の中に注入され、次いで第一電気伝導基質が挿入され、その場で伝導性ポリマーは重合する。伝導ポリマーネットワークはヒドロゲルを含む高分子及び線維を周囲に形成し、これらのヒドロゲル成分及び特徴を、組織の中で直接重合する場合に伝導性ポリマーネットワークを形成するのと同じように重合するための足場として使用する。生じたバイオ電極は、ヒドロゲルの枠内に細胞の周囲に詰まった伝導性ポリマーを含む。一部の態様において、ヒドロゲルは、他の細胞、例えば、神経栄養性成長因子を生産する組換え幹細胞及び周囲の細胞及び組織の成長と分化を支持することができる他の関心の生体分子を添加することができる。

一部の態様において、生物学的に統合されたバイオ電極を含む記録装置は、細胞間及び組織間の電気信号を記録又は検出するために使用することができる。生きている細胞の間の電気信号の移動を電気的に検出する方法は次のステップを含む：電荷を移動することができる組織と密接に接触した第一電気伝導基質を含むバイオ電極装置を提供する。バイオ電極装置は、第一電気伝導基質；生物学的要素；及び電気的に第一電気伝導性基質を生物学的要素に電気的に結合して集合的にバイオ電極を規定する伝導性ポリマーを含む。バイオ電極は、第一電気伝導基質、いずれか一つの生物学的要素及び伝導性ポリマーの間の電気信号を伝達又は受け取る。回路は、バイオ電極装置及びバイオ電極と電気的に結合した第二電気伝導基質を電源に連結することにより達成される。連結した後に、電源が適用され、第一及び第二電気伝導基質を通して電圧又は電流の有効量が供給され、伝導性ポリマーを通して電圧又は電流を導入する。このシステムは、該バイオ電極装置により電気信号の移動を検出する。

一部の態様において、このバイオ電極装置は、検出、記録及び細胞刺激の間及び伝導性モノマーの重合のために、対照電極、対電極及び飽和カロメル電極のような他の電極を含むこともできる。

ＩＩ．刺激電極
電極上の１以上の生物学的要素、例えば、細胞、受容体、細胞の膜、細胞のマトリックスタンパク質などを含む伝導性ポリマー被膜は、バイオ電極に接触しているか又はその近傍のニューロン、電極の電荷容量を増加することにより、及び平坦な電極からニューロンに向って柔らかなポリマーの弦により表面を拡大することにより、筋細胞及び筋肉細胞を含む細胞の電気刺激を改善する。一部の態様において、本開示のバイオ電極及び生物学的要素−伝導性ポリマー電極混成被膜は、薬物、又は生きている細胞を固定化することができ、瘢痕の予防／減少のために物質を分泌し、神経の生存能力を改善し、神経突起を誘引し、そして安定で直接の信号伝達のための組織とバイオ電極の間の統合を促進する。一部の態様において、神経の前駆細胞を接種された第一電気伝導基質を含み、そして電気化学的に重合した伝導性ポリマーでコートされたバイオ電極は、脳又は中枢又は末梢神経系のようなニューロンに富む組織の中に埋め込むことができ、内因性ニューロンの成長を電気的にそして生物学的に刺激することができる。神経前駆細胞はニューロンの常在母集団を誘引できる因子を分泌することができ、バイオ電極を統合し、それと連絡する。形態学的に小さな足及び神経突起のバイオ電極の方向への伸長により裏付けられるニューロンの統合の後に、バイオ電極は電圧及び／又は電流バイアスを適用することにより作動することができ、バイオ電極と連絡している相互に連結したニューロンの成長を刺激する。いずれの特別な理論に限定されずに、バイオ電極及び周囲の組織の間の改善された生体適合性には、炎症及びグリアの瘢痕形成の減少、埋め込んだ装置の近くの組織再生の促進及び電極表面と標的ニューロンの間の密接な接触の形成が寄与している可能性がある。

一部の態様において、本教示のバイオ電極は、電気的機能及び心臓の細胞又は線維芽細胞のような電気的に応答する細胞、及び骨生成細胞を含む他の電気的活動性細胞に同様に作用することができる。電極基質上に重合した伝導性ポリマー−生物学的要素の混成被膜は、電気的活動性心筋細胞と埋め込まれた電極の間の直接の統合を提供する。生物学的要素、例えば、細胞又は細胞の膜、イオンチャネル、受容体、成長因子及び酵素を含むふわふわした、軟らかい線維性の伝導性ポリマーを含む電極被膜は刺激電荷容量を増加し、一方で記録電極インピーダンスの減少を生じる。一部の態様において、創傷治癒及び骨の治癒及び成長に関係する療法のための電気刺激のようなものに応答する細胞は、治療の形として、本教示の埋め込み可能なバイオ電極により提供される刺激療法により特に利益を受けることができる。生きている細胞は、天然又は合成ヒドロゲルの足場の中に増殖又は不動化することができ、そして電極基質、例えば、埋め込む前のワイヤー又はプローブに適合し、バイオ電極装置に対する細胞の応答を改善しそして指令し、そして活性組織との統合を促進する。一部の態様において、伝導性ポリマー中に埋め込まれた生細胞は、成長因子、分化因子（１以上のインシュリン様成長因子、神経栄養因子のＮＧＦファミリー、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及び下垂体アデニル酸シクラーゼ−活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、骨形成因子１〜１７、線維芽細胞成長因子及び神経、心臓、骨及び筋肉組織を再生するために使用される一般的に知られている成長因子のいずれかを含む）、受容体アゴニスト及び／又はアンタゴニスト、酵素阻害物質、及び心臓、脳、中枢及び末梢神経系及び筋肉系を含む電気的活動性組織の疾患及び病気を持つ被検者に投与されることが知られている治療上有効な生物活性物質を発現及び分泌をするように組換えられた細胞を含む治療上利点がある細胞のいずれかを含むことができる。

種々の態様において、組織再生は、抗炎症薬及び他の成長及び分化因子を含むヒドロゲル足場においてニューロン、筋肉細胞及び心筋細胞に分化することができる胚性及び／又は造血及び／又は実質の幹細の周囲に重合した伝導性ポリマーを含むバイオ電極を埋め込むことにより促進することができる。一部の態様において、バイオ電極は、特に対イオンとして使用された場合、又はヒドロゲルの足場に添加された場合に、組織−電極境界の中に、貯蔵した薬物及び他の生物活性物質を放出することができる。一部の態様において、バイオ電極の周囲の栄養性ヒドロゲル足場は、バイオ電極上又は周囲の伝導性ポリマー及び／又はヒドロゲルを免疫系から防護することができ、そしてそれらを増殖させそして分化させることができる。重合した伝導性ポリマーを含むヒドロゲル足場は、重合した伝導性ポリマーを介して電極基質と密に接触しているので、未熟電気活動性細胞に成熟細胞機能をプログラムするために電機療法を行うことができる。

ＩＩＩ．電極の位置を記す方法
一部の態様において、マイクロメーターの細いワイヤー及び他の電極基質を含む電極の設置は、特に、電極が金属材料を全く含まない場合又は組織の組織学的分析をする前に取り去られた場合には、後に位置の確認を困難にする可能性がある。一部の態様において、バイオ電極、電極被膜、及びここに記述されたその場で重合した生物学的要素−伝導性ポリマー材料は、修飾することができ、既存の電極は目に見える位置の手掛りを、ある場合は組織中に埋め込まれた電極の以前の位置を提供することができる。伝導性ポリマーは、生きている組織中に埋め込まれた場合には、典型的によく造影される。

ＩＶ．埋め込んだ組織へ電極を接着する方法
一部の態様において、既存の電極及び新しい電極装置は、埋め込んだ電極の周囲の組織内のその場で重合した伝導性ポリマーネットワークにより埋めこまれた組織内に固定又は定着させることができる。この方法は、組織の隙間空間にナノスケールの線維、原線維及び他の構造を与える「ふわふわ」した３次元構造を提供するので、電極を埋め込んだ組織内に固定する。これは時間経過の間の電極のずれ及び移動の問題を改善し、電極は埋め込まれ、そしてその適切な刺激及び記録部位に電極の位置を固定することができる。

Ｖ．生物、細胞、薬物、化学物質及びバイオ分子のセンサー
電気活性伝導性ポリマーは、電流を適用した時にポリマー内に生じる電気反応により検出装置として働くことができる伝導性ポリマーの本来の性質を損なわずに、限定せずに、生きている細胞、細胞成分、核酸、分子機能化マイクロ−ナノパーティクル、酵素、タンパク質、又はペプチドを含めて検出する物質を電極の表面上に固定化するために使用することができる。この反応は、ポリマーの表面の近く又は伝導性ポリマーマトリックスの中で生じる酸化／還元反応を検出するために利用することができる。多様な検出物質を伝導性ポリマーマトリックスの中に取り込む能力と対になって、これは、検出物質とその相補的相手、例えば、酵素とその基質、受容体とリガンド、抗体と抗原又は細胞と病原体の間に生じる電子移動反応を検出するための強力なシステムを提供する。不動化した分子の電子移動を検出することにより、電気活性伝導性ポリマー電極は、グルコース、コリン、リン酸イオン、核酸及びクロルプロマジン及びドパミンを含む多数の分子の濃度変動を検出することが示された。

さらに、伝導性ポリマーは、容易に修飾することができ、特定のタンパク質又は生体分子との相互作用を促進し、そして装置表面の汚染による非特異的な相互作用を制限するための種々の生物活性物質を含むことができる。タンパク質は、種々の方法、例えば電気化学的な沈殿、共有結合及び伝導性ポリマーネットワークの中への捕捉により伝導性ポリマーフィルムの中に取り込むことができる。伝導性ポリマーのこの特徴は、１以上の生物学的要素を埋め込んだ伝導性ポリマーネットワークを生物活性にすると共に、特別な刺激により電気伝導度の可逆的変化を可能にして、このバイオ電極がバイオ分子検出装置として働くことが出来るようにするために利用することができる。

一部の態様において、細胞又は受容体、抗体、イオンチャネルのような特定の生物学的要素の周囲に重合した伝導性ポリマーを含む電極を特定の化学的存在を検出するために使用することができる。一部の態様において、電極基質上に存在する伝導性ポリマーの中に埋め込まれた生物学的細胞は、環境中の栄養を使用して生存を維持して、（使用した細胞のタイプにより予め定められた）特定の生化学的又は電気化学的変化を検出するために定常的に環境をサンプリングすることによりバイオセンシング機能を実行することができる。環境における変化が検出された場合には、その信号は細胞又は受容体上の正味表面電荷の局所変動を生じる細胞関連酵素反応により伝達され、それは次いで伝導性ポリマー−生物学的要素混成電極上の伝導性ポリマーを介して電極に伝達される。

一部の態様において、バイオセンサーは液体中の生物学的物質を検出するために使用することができる。該装置を製造するために使用される方法は、第一及び第二電気伝導性基質を支持体上に組み合わせて取り付けることを含むことができる。支持体は、分解を受けない生体適合性材料、例えば、生体適合性プラスチック、例えば、テフロン（登録商標）、セラミック、例えば、磁器、及び金属材料、例えば、ステンレススチールのいずれかであり得る。生物学的要素、例えば、酵素又は細胞受容体又は抗体の溶液は、第一電気伝導性基質の部分に適用される。生物学的要素は、電気伝導性基質上に層を形成するために、生体適合性ヒドロゲル、例えば、アルギン酸ヒドロゲルを含む保護的、多孔性そして液体透過性物質を持つことができる。伝導性モノマーは、生物学的要素及びヒドロゲルを含む溶液中に加えられ、そして第一電極基質の部分の上で均一に混合される。次いで、定電流又は定電圧の電流を第一電気伝導性基質に適用するか又は直接的酸化重合によりこの伝導性モノマーは重合し、ヒドロゲルマトリックス中の生物学的要素の周囲に伝導性ポリマーを含むネットワークを形成する。分析すべき標的分析物を含む検体を入れる容器を準備する（それは溶液及び二つの電気伝導性基質を入れることができる容器、例えば、非伝導性材料で造られた立方体フローセルを含む）。一部の態様において、標的分析物は、その存在又は量が測定される基質のいずれかであり得る。標的分析物は、生物学的要素に対する結合パートナー、例えば、その抗体に対する特定の抗原、その受容体に対する特定のリガンドである。適用する電圧を選択して、生物学的要素と伝導性ポリマーの間の電荷移動を促進する。

生物学的要素に対する標的分析物の特異的結合は、該生物学的要素の表面に測定可能な電位差測定上の又は電流測定上の電荷の相違を生じ、それは第一電気伝導性基質に密着接触している伝導性ポリマーに伝達される。生物学的要素から伝導性ポリマーに、次いで第一電気伝導性基質へ移動した電荷の結果として発生した電流は、標的分析物の濃度に正比例するので、標的分析物の濃度の定量化が可能である。バイアス源として、装置が容器内で標的分析物を含む液と接触している場合には、第一及び第二電気伝導性基質の間の一定の電位差を利用する。

一部の態様において、バイオ電極は、バイオ電極の細胞−伝導性ポリマー混成マトリックスの周囲の薄い非生分解性ヒドロゲル被膜を含むことができ、生物学的要素の外部環境への暴露を防ぐ。同様に、さらに他の態様において、細胞−伝導性ポリマー混成電極は、電極上に埋め込まれた細胞に栄養源を供給することにより、維持することができる。毒性の可能性がある環境から栄養性ゲルを保護するために、非吸収性ヒドロゲルの追加の薄層を使用することができ、栄養性ゲルを分解から保護する。伝導性ポリマーに含まれそしてそれで覆われた埋め込まれた細胞に栄養源を供給することは、実際に環境に暴露されずに、そして本教示のバイオ電極の細胞に対する環境に細胞／組織を暴露することなく、電極の細胞が環境と相互作用すること（例えば、生化学物質の検出又は薬物の分泌）を可能にする。

電極に基づく薬物輸送装置のための新規伝導性ポリマーセンサー被膜は、薬物輸送装置に対するフィードバックによる標的分子のリアルタイム検出、次いで調節薬物放出の刺激の統合を可能にする。生物活性分子の検出／監視又は化学的サンプリング装置は、溶液中の一つの標的生物活性分子であっても定量化を可能にする。「賢明な」ポリマー表面は、特定の細胞型と接触している時に、ポリマー内のリガンドがその標的受容体に結合した時に生じる酵素仲介検出反応により、検出することができる。この過程は、ポリマーフィルムの細胞型特異的信号を運ぶために使用することができるであろう。

ＶＩ．生物活性カテーテル
埋め込んだカテーテルの周囲に閉塞／凝血を防ぐために、本「賢明な」カテーテルは薬物溶出ポリマー被膜を使用し、細胞及びタンパク質の接着及び封入を防止する。本教示の伝導性ポリマー−生物学的要素混成ポリマー被膜は、調節可能な表面電荷、調節された形の変化、結合又は放出可能な薬物又はタンパク質の取り込み、及び周囲の組織と装置お集積体に直接治療薬を放出することができる生細胞の固定により、細胞及び非特異的タンパク質の吸着を減少させることができる。

一部の態様において、本態様により想定される電極被膜及び関連するバイオ電極装置は、伝導性ポリマーが生物学的要素、例えば、生きている細胞の細胞膜と境界を接する能力を生じた。本バイオ電極装置は、生きている細胞を埋め込みそして包み込むための材料の新しい型として取り入れることができ、細胞の３次元「反転」画像を形成する能力による細胞表面特性の研究及び細胞領域（体細胞、樹状突起／突起）にわたる細胞膜分極及びイオンチャネル活動のリアルタイム動態の研究を促進する。基質上の生きている細胞を固定化するための新規材料は、非真空又は低真空顕微鏡画像（ＴＥＭ，ＡＦＭ，ＥＳＥＭ，ＥＦＭ）及び多分生きている細胞には未だ使用されていないＦＴＩＲ及びＳＦＧのような他の表面分析技術のために（使用することができる又は適している可能性がある）。

一部の態様において、電気信号を受け取るために作動する１以上の生物学的要素を含む本教示の伝導性ポリマーに基づくマイクロ電極アレイ（ＭＥＡ）装置及び電気信号を受け取るための電気伝導性基質；及び電極及び生物学的要素に隣接して配置され、その中で少なくとも複数の伝導性ポリマーの一部は電気信号を電極と生物学的要素の間に伝達する、重合した複数の伝導性ポリマーを含む伝導性ポリマーマトリックス、は電気的刺激及び細胞の活動電位及び一つ又は多数の生きている電気的活性細胞の細胞外フィールドポテンシャルの記録のために使用することができる。伝導性ポリマー及び細胞の細胞膜の間の密着した接触は、現在利用できるＭＥＡ又は一般的パッチクランプに基づく電気生理学的技術では不可能である高感度の、高度に局所的な、さらに細胞部分のシナプス連絡及び神経活動の活性化に関する研究を可能にする。

種々の態様において、細胞の膜が接着している基質の領域上には伝導性ポリマーが形成できないことにより、この電極は、細胞−基質接着の可視化及び分析に使用することができる。このことは、細胞−基質接着の詳細をナノメータースケールで明らかにする。これらの研究のために電気的に活性な生体材料を使用することは、生物医学研究分野では広く使用されている免疫細胞／組織化学及び全反射顕微鏡（ＴＩＲＦ）を含む現在の方法に代わる安価で、早い代替方法であろう。石英結晶微量天秤も細胞−基質接着をアッセイするために使用することができるが、この方法は生物医学研究に広くは利用されない。

本教示の電極組成物は、体の他の末梢組織に埋め込んだ同様な生物医学装置に代わることができる。

本教示の一定の態様において、細胞に基づく伝導性ポリマー電極は、低い電気的インピーダンスと非常に大きな有効表面積を持つ軟らかい、ふわふわした材料である。伝導性ポリマーの大きな表面積は、電極と標的環境の間の最大電荷移動を容易にすることができる。さらに、一定の態様において、伝導性ポリマーの柔軟性は、金属電極基質のみに比較して、軟らかい組織と硬い装置表面の間の境界における機械的緊張減少させることができる。

さらに、バイオ電極は、組織の中の隙間空間及び細胞の間の細胞外マトリックスに挿入又は埋め込むことができ、細胞表面に密着して組み込むことができる電極を生じるが、その分子又はナノメータースケールのために免疫反応は発生しないはずである。

本開示は以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるであろう。

実施例
実施例１．生きている細胞を含むバイオ電極
電極の作成と細胞培養の細胞培養容器：細胞は、電気化学的重合工程用に伝導性基質「又は電極に接着されるか又はその上で培養される。電極は細胞に暴露される前に７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間洗うか、又はＵＶ光線に２０分間暴露することにより滅菌した。次いで、必要なタイプの細胞を培養するために滅菌電極を培養皿の中に入れる。電極の形状によっては、ある場合には電極を細胞培養皿の底に貼り付けて、電極の横への移動を抑える。これは、Ｌｏｃｔｉｔｅ Ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ（Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ）のような液状環境において接着するスーパーグルーの最少量（例えば１〜１０μｌ）を使用して、電極を皿の底に接着することにより行う。大部分の細胞型について、細胞を接着できるように、電極の高さは細胞培養皿の表面から２５０〜５００μｍを越えてはならず、電極表面積は、多数の細胞を伝導表面上に接種できるように充分広くなくてはならない（例えば、＞１００μｍ^２）。細胞培養皿は細胞接着を促進する荷電表面を持っていなくてはならないので、われわれはＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の血漿処理培養容器及びポリ（リシン）コーティング培養容器（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用する。さらに、一部の細胞型（例えば、ニューロン）については、細胞が表面に接着できるようにポリ（リシン）で電極をコーティングすることも必要である。そうして、電極を最初に滅菌し、次いで血漿処理細胞培養容器の底に接着し、次いでリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）中のポリ（リシン）溶液（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を皿に加え、そして無菌状態（組織培養フード中）の下に室温（ＲＴ）で２〜１２時間（ｈ）インキュベートする。インキュベーション後、ポリ（リシン）溶液をＰＢＳによる１回洗浄ですすいで、細胞を接種することができる。

組織／細胞の培養；選択した細胞型を、その細胞型に適する公表されている方法に従って、培養中で維持する。例えば、現在の研究において、われわれの実験室は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞芽腫−由来細胞系（ミシガン大学のＤｒ．Ｅｖａ Ｆｅｌｄｍａｎより供与；また、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで入手可能）、並びにマウス胚から分離した皮質神経培養を使用している。ＳＹ５Ｙ細胞は、ｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ混合抗生物質溶液（細胞培地中１：１００に希釈；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、グルコース添加、Ｌ−グルタミン添加；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で維持される。培地は１週間に１度交換され、細胞は継代／１：４分割を２週間毎に行う。

生きている細胞が存在する中における電気化学的な重合：生細胞電極を作成するために、細胞を接種した電極を、（細胞型による）水溶液、例えばイオン性ドーパント及び／又はバイオ分子と共に必要なモノマーを含む水、ＰＢＳ又はＨＢＳＳを入れた電気的に連結した保存容器に入れる。伝導性ポリマーフィルムの必要な厚さに応じて１〜１０μＡ／ｍｍ^２の直流（ＤＣ）を０．５〜１０分間供給することができるＡｕｔｏＬａｂ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ，オランダ）或いは類似の装置を使用して、電極及びモノマー溶液に定電流を適用する。モノマーの電気化学的酸化／還元により、接着細胞の周囲及び上に伝導性ポリマーフィルム及びネットワークが形成するので、伝導性ポリマーの足場の中にそれらの包埋及び固定を生じる。生細胞電極を作成するために、生じた細胞−伝導性ポリマー混成材料が、ポリマーが生きている細胞を取り囲むが、その操作により細胞全体を覆わない状態になるように、電気化学的重合をそれぞれの細胞型及び電極の形状に応じて最適化することができる。

細胞−ポリマー混成電極マトリックス中の細胞維持：生細胞電極が適切に機能するために、細胞−伝導性ポリマーマトリックスに取り込まれた細胞は、装置が機能することが期待されている長期間にわたり生存を維持しなければならない。生きている細胞は、それぞれの細胞型に特異的な栄養、増殖因子及び溶解ガスの宿主に接触する。

表面形状の特性解析：生細胞電極の表面形状は、「生きている」電極の統合性を破壊せずに特性解析することはできない。２バッチの電極、１バッチは電気的特性解析と実験に、他のバッチは顕微鏡検査のために作成された。光学及び蛍光顕微鏡を使用して、細胞の生存、細胞形態、及び細胞−伝導性ポリマー混成マトリックスの統合性／品質を評価するために、バイオ電極を顕微鏡検査する。さらに、水性環境中においてタッピングモードのＡＦＭ並びにチャンバー内湿度５０〜７０％の冷却ステージ（Ｐｅｌｔｉｅｒステージ）上きわめて低い真空中で実施される環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）を使用して、表面の形状／特徴を解明する。

光学顕微鏡は、反射光及び透過光の両者の観察ができるＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ ＰＯＬを使用して行う。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピューターで作動するＳｐｏｔ ＲＴデジタルカメラで画像を撮影した。傾向顕微鏡については、われわれは、Ｈｏｆｆｍａｎコントラスト調節装置、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＣＤカメラ及びＤｅｌｌ ＰＣコンピューターで作動する付属Ｏｌｙｍｐｕｓデジタル画像ソフトウエアを装備したＯｌｙｍｐｕｓ ＩＭＴ−２上向光顕微鏡を使用する。検体表面の形状に関する情報は、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＡＬ）に設置されているマルチモードヘッドを持つＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩによりＡＦＭで得られるであろう。得られた画像は、典型的に１００ミクロンから１ミクロンのスキャンサイズにわたる高さデータの５１２×５１２アレイからなっている。生細胞電極の表面及び微細構造に関する情報は、ＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ２００ ３Ｄ集束イオンビームワークステーション及び環境制御型走査顕微鏡を使用して得ることができる。

細胞生存能力の評価：生細胞電極が適切に機能するために、細胞−伝導性ポリマー混成マトリックスの中へ取り込まれた細胞は、ポリマー中に埋め込まれた後並びに装置の寿命を通して生存能力を維持しなければならない。細胞生存能力は、種々の方法を使用して評価することができ、その多くは細胞型に特異的である。哺乳動物細胞の多くに共通する二つのアッセイを使用することができる；Ｖｙｂｒａｎｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及び細胞死に関係するタンパク質、特異的にアポトーシス関連プロテアーゼ活性化カスパーゼ３（抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能）の免疫細胞化学。Ｖｙｂｒａｎｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイでは、３つの異なる色素、特にＨｏｅｃｈｓｔ（全ての細胞に対して透過性であるが、染色する細胞においてより明るい）、ＳＹＴＯＸグリーン（アポトーシスにより染色する細胞に大部分存在する）及びヨードプロピジウム（傷害された膜を持つ細胞；アポトーシス又は壊死の細胞のいずれにも存在する）を使用して、細胞数量、大きさ及び核の染色強度のタイプを測定する。免疫細胞化学（ＩＣＣ）では、細胞はＰＢＳで希釈した３．７％ホルムアルデヒド中３０分間室温（ＲＴ）で、又は終夜（ＯＮ）４℃で固定する。次いで細胞を冷ＰＢＳ中で洗い、次いでＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ（ＰＢＳＸ）中１時間からＯＮ透過性にした。非特異的標識を、１時間ＲＴで３〜５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋ＰＢＳＸ中インキュベーションしてブロックする。次いで、１．５〜３％ＢＳＡ／ＰＢＳＸ又はＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した一次抗体（この場合、抗−活性化カスパーゼ３＠１：１００）に細胞を２時間〜ＯＮ暴露する。次いで、細胞をＰＢＳ又はＰＢＳＸ中３回洗い、次いで暗所室温において蛍光団結合二次抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳＸ中１：１００）とインキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳＸ中３回洗い、全ての核をＨｏｅｃｈｔ３３３４２で対比染色し、細胞をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ水性マウントにのせ、顕微鏡画像を作成するまで４℃で保存する。

培養細胞は以下を含むことができるが、これに限定されない：線維芽細胞、ニューロン、筋細胞、平滑筋、グリア、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、前駆細胞、胚性幹細胞。神経又は他の幹細胞は、電気化学的な重合操作のために、電極基質上で培養することができる。電極は細胞に暴露する前に、７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で１０分間洗うか又はＵＶ光線に２０分間暴露することにより滅菌することができる。Ｌｏｃｔｉｔｅ Ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ（Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ）のような液状環境において接着するスーパーグルーの最少量（例えば１〜１０μｌ）を使用して、滅菌電極を細胞培養皿の底に固定することができる。細胞が電極に接着できるように、電極の高さは細胞培養皿の表面から２５０〜５００μｍを越えることはできない。電極基質表面積は、多数の細胞を伝導表面上に接触できるように充分広くなくてはならない（例えば、＞２０μｍ^２）。細胞培養皿は、細胞接着を促進するために、（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の血漿処理培養容器）及びポリ（リシン）コーティング培養容器（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用する。さらに、ニューロンは、細胞が表面に接着できるようにポリ（リシン）で電極基質をコーティングした後に、電極基質上で培養することができる。そうして、電極を最初に滅菌し、次いで血漿処理細胞培養容器の底に接着し、次いでリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）中のポリ（リシン）溶液（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を皿に加え、そして無菌状態（組織培養フード中）で室温（ＲＴ）において２〜１２時間（ｈ）インキュベートすることができる。インキュベーション後、ポリ（リシン）溶液をＰＢＳによる１回洗浄ですすいで、細胞を接種することができる。

組織／細胞培養：選択した細胞タイプは、その細胞型に適する公表された方法に従って、上記のように培地中に維持することができる。組織培養の方法及び材料は、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１の中に見出すことができ、引用してここに取り入れられている。

一次神経細胞培養は胎齢１３〜１４日に到着するように注文することができる適時の妊娠マウス（Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）から調製することができる。胎齢１８，１９又は２０日に、ＣＯ_２窒息によりマウスを殺処理し、胎児を取り出し、直ちに氷冷Ｈａｎｋの緩衝食塩液（ＭｇＣｌ又はＣａＣｌを除いたＨＢＳＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ）に入れる。胎児を断頭し、頭蓋から脳を取り出し、髄膜を除去し、新皮質を切り取る。解離を行うまで、皮質組織の小片を４５ｍｌの氷冷ＨＢＳＳの中に入れる（通常２０分以内）。組織を移動するための滅菌１０ｍｌピペットを使用して、この組織小片を新鮮氷冷ＨＢＳＳで３回洗う。１０〜１５匹のマウス胎児の皮質組織を２ｍｌ解離培地に沈める。解離培地は、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％ＦＢＳ及びｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ（培地で１：１００希釈）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成される。解離培地中における組織の機械的な破壊／解離を行うために１０００ｍＬピペットチップを使用する（５００μｌのダイアルピペッター及び２０回処理、泡を発生させない）。組織が完全に解離した後、細胞懸濁を１０００×ｇで３分間室温（ＲＴ）で遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットをプレーティング培地中に再懸濁する。プレーティング培地は、０．５ｍＭグルタミン、ｐｅｎｎ−ｓｔｒｅｐ，１％ＦＢＳ，２％Ｂ２７無血清培地添加物（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地である。細胞はポリ（リシン）コーティング培養容器にプレートすることができる。プレート後５〜７日毎に、３０％の培地交換をすることができる。培養は、７〜１０日までに実験の準備をすることができ、培養２１日もの長い間使用することができる。

実施例２．細胞鋳型電極及び電極被膜
細胞鋳型伝導性ポリマーフィルムを作成するための細胞の除去：実施例１に既に記述した電極基質の表面上の電気化学的重合に続いて、伝導性ポリマーに埋め込まれた細胞は、水、食塩液の中で激しく振とうすることによる機械的破壊によるか、又は電極基質に細胞を接着しているタンパク質を分解するカルシウムキレート剤（ＥＤＴＡ，ＥＧＴＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びトリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ）のようなタンパク質分解酵素に暴露することにより除去される。一定の態様において、水洗浄及び機械的分解の併用は、細胞本体及び細胞成分の大部分を取り除くであろうが、しかし通常細胞表面に存在する一部の細胞成分及び細胞接着タンパク質は残される。得られた伝導性ポリマー表面は、細胞表面及び細胞−基質接着タンパク質及び／又はタンパク質フラグメントを有しており、これはこの生物活性及び生体模倣材料に接触する細胞及び組織の結合を促進することができる。これに対して、タンパク質分解酵素への暴露により除去された細胞は、細胞鋳型特徴を持つ伝導性フィルムを生じるが、細胞成分を全て除去するために本質的生物学的活性は持っていない。

実験
材料及び方法：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫由来細胞を、Ｐｅｎｎ−Ｓｔｒｅｐ混合抗生物質溶液（細胞培地中１：１００に希釈；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、グルコース添加、Ｌ−グルタミン添加；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で維持した。マウス解離皮質一次培養（ＭＣＣ）を胎齢１８〜２０日（Ｅ１８〜２０）マウスから調製した。脳を取り出し、氷冷Ｈａｎｋの緩衝食塩液（ＨＢＳＳ；塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム又はフェノールレッドを除く；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に浸し、新皮質を切り出し、髄膜を除き、組織を氷冷ＨＢＳＳで洗い、次いで１ｍｌピペットチップを使用して手動で解離した。ＭＣＣを０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン及び２％無血清栄養添加物Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を塩化したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に３７℃で５％ＣＯ_２中維持した。培地の３分の１を４日毎に置換し、そして実験に使用する前に少なくとも７日間成熟させた。

細胞培養のための電極：細胞に暴露する前に、電極（裸又はＰＥＤＯＴ−コーティング）を７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間洗浄して滅菌した。われわれは、この試験に二つの異なるタイプの電極を使用した、特別に設計した自作のＡｕ／Ｐｄスパッターコーティング電極（Ａｕ／Ｐｄ；直径６ｍｍ）及びＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ（Ｔｒｏｙ，ＮＹ）ＥＣＩＳ電極（ＡＢＰ；直径２５０μｍ）。Ａｕ／Ｐｄ電極では、電極を細胞培養皿の底に貼り付けて、電極の横の動きを防ぐ必要があった（１〜１０μｌ Ｌｏｃｔｉｔｅ Ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ；Ｈｅｎｋｅｌ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｈｙ Ｈｉｌｌ，ＣＴ）。細胞培養では、われわれは、ＳＹ５Ｙ細胞に関する全ての実験においてＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の血漿処理ポリスチレンを使用し、ＭＣＣに関する全ての実験は、ポリ（リシン）（ＰＤＬ）コーティング培養容器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）又はＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ ＰＤＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２〜１２時間コーティングした（次いで、細胞暴露の前にＰＢＳで洗った）皿及び電極で行った。生きている細胞の周囲にＰＥＤＯＴが重合する実験では、神経細胞は電気化学的重合操作の前に２４〜４８時間電極上で培養した。

電気化学的重合及びＰＥＤＯＴから細胞の除去：モノマー水溶液（この試験では：リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中０．０１ Ｍ ＥＤＯＴ及び０．０２ Ｍポリ−アニオン性ドーパントであるポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ））を含む電気的に連結した容器に電極を入れた。ＡｕｔｏＬａｂ ＰＧｓｔａｔ１２ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ，オランダ）を使用して電極の形状及びポリマーフィルムの必要な厚さに応じて０．５〜１０分間、定電流（０．５〜１０μＡ／ｍｍ^２）を電極及びモノマー溶液に適用した。細胞鋳型ＰＥＤＯＴ基質では、細胞を電極上で培養し、ＰＥＤＯＴは電気化学的に細胞周囲に堆積し、重合の後直ちに１００ｍＭ ｔｒｙｐｓｉｎ−ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）に３７℃で２時間暴露し、次いで機械的に破壊することにより細胞を除去した。

顕微鏡。われわれは、いくつかの異なるタイプの顕微鏡を使用して、電極と神経細胞の相互作用の特性解析をした。１）光学顕微鏡：Ｓｐｏｔ ＲＴ デジタルカメラを装着したＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ ＰＯＬ；２）位相差／蛍光顕微鏡：Ｈｇアークランプ装着Ｎｉｋｏｎ Ｔ２０００倒立光学／蛍光顕微鏡、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＣＣＤ １６ビットカメラとＳｉｍｐｌｅ ＰＣＩ画像ソフトウエア（Ｔａｋａｙａｍａ ｌａｂの好意）；Ｈｇアークランプ装着Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＺ−５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＣＤカメラ及びＯｌｙｍｐｕｓ画像ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｙｓｉｓ Ｃｏｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＩＬ）；３）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び環境制御ＳＥＭ（ＥＳＥＭ）：ＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ３Ｄ Ｄｕａｌｂｅａｍ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＥＭＡＬ）；４）原子力顕微鏡（ＡＦＭ）：マルチモードヘッド装着Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩ，タッピングモード（ＥＭＡＬ）。

細胞生存能力アッセイ：細胞生存能力は、３つのアッセイを使用して評価した；Ｖｙｂｒａｎｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｓｓａｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ），ＭＴＴ細胞生存能力アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）及びアポトーシス関連プロテアーゼ、活性化カスパーゼ３に関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）（Ｃｅｌｌ Ｓｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。Ｖｙｂｒａｎｔ Ｌｅｖｅ／Ｄｅａｄアッセイでは、３つの異なる色素、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（全ての細胞核を標識するが、アポトーシス細胞の核で明るい）、ＹｏＰｒｏ−３（アポトーシス細胞を標識する）及びヨードプロピジウム（ＰＩ）（傷害膜を持つ細胞；アポトーシス及び壊死細胞を標識）を使用して、蛍光顕微鏡により細胞数量、大きさ及び核染色強度のタイプを評価した。

免疫細胞化学及び細胞染色：細胞を３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中室温で３０分〜１時間固定した。ＩＣＣでは、非特異的結合を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（ＰＢＳＸ）でブロックし、一次抗体（活性化カスパーゼ３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｖｅｒｌｙ，ＭＡ）をブロッキング緩衝液で１：１００に希釈し、そして細胞と終夜４℃でインキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳＸで洗い、二次抗体（ブロッキング緩衝液中１：３００）とインキュベートし、核をＨｏｅｃｈｓｔ／ＰＢＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）で対比染色し、次いで、画像化するためにＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（Ｆｉｓｃｈｅｒ）で水性マウントした。Ｆ−アクチン細胞骨格をＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ−Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＰＢＳＸ中１：３００）で１時間室温又は終夜４℃で標識した。蛍光顕微鏡及びＥＳＥＭでは、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中に維持し、次いで、画像化の前に水で洗った。ＳＥＭでは、１％グルタルデヒドを使用して細胞を固定し、水で洗い、次いで、エタノールの濃度を上げて（５０％、７５％、９５％、１００％；各１０分）脱水し、次いでＰｅｌｄｒｉ ＩＩ又はヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）中で終夜乾燥した。

電気的性質の分析；電極の電気的試験は、ＡｕｔｏＬａｂ ＰＧｓｔａｔ及び電解質としてＰＢＳ（ｐＨ ７．０）、対電極（ＣＥ）としてプラチナワイヤー、対照電極（ＲＥ）として飽和Ａｇ／ＡｇＣｌカロメル電極（ＳＣＥ）の３つの電極システムを使用して、ＰＥＤＯＴ堆積の前と後に行った。電極自体は刺激／作動電極（ＳＥ／ＷＥ）であった。電気化学的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）により、周波数（１〜１００，０００Ｈｚ）の範囲の交流（ＡＣ）に対する応答を評価し、典型的にマイクロ電極による神経活動の検出に関係する周波数である１００〜１０００Ｈｚにおける反応を厳密に観察した。サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を、電極の荷電容量の測定に使用した。電圧を、ＳＣＥに対して−１から＋１Ｖ又は−０．９から０．５Ｖ（０．１Ｖ／秒）の率で循環し、電流を測定した。

等価回路モデル：ＥＩＳデータから回路モデルを開発するために、ＺＳｉｍｐＷｉｎ（ＥＣｈｅｍＳｏｆｔｗａｒｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用した。データはＡｕｔｏＬａｂ ＰＧｓｔａｔソフトウエア、Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＦＲＡ）から輸入した。得られたモデルの実験データへの合致を決定するために、モデル全体のχ自乗値（χ^２）及び各回路成分のパーセント誤差値を使用して、モデル作成プロセスを反復した。電気化学的細胞試験の理論及び各成分追加はχ^２値を一桁減少するというＢｏｕｋａｍｐの示唆を使用して、成分を選択した。回路モデルは、Ｂｏｕｋａｍｐの示唆を使用して呈示されている。χ^２値は以下のアルゴリズムにしたがって計算した：

実験データポイントが理論的データポイントと相関する場合には、χ^２値は最小となった。これは、実験及び計算のデータポイントの間の差を最初に計算することにより行われた。この差は、自乗して大きな分散を与える程、有意性は大きい。全てのデータポイントに対する差は合計され、次いで重み付け係数で割られる。１×１０^−３又はそれより低いχ^２値は当てられたモデルに受け入れられる。

結果と考察
インビトロにおける伝導性ポリマー、ＰＥＤＯＴ及びニューロンの間の相互作用を試験するために、われわれは二つの異なるタイプの神経細胞培養、一次マウス皮質培養（ＭＣＣ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫由来細胞系（ＳＹ５Ｙ）及び二つのタイプの電極、特別設計、自作Ａｕ／Ｐｄスパッターコーティング（Ａｕ／Ｐｄ；６ｍｍ直径電極）及びＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ（Ｔｒｏｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）ＥＣＩＳ電極（ＡＢＰ；２５０μｍ直径電極）を使用した。細胞を数日から数週間、ＰＥＤＯＴ及びポリ（ピロール）のような伝導性ポリマー上で、ほとんど又は全く毒性無く培養することができた。しかし、モノマーの細胞生存能力に対する影響は判らなかった。したがって、われわれは、ＰＥＤＯＴモノマー、エチレンヂオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）及びポリ−アニオン性ドーパントポリ（スチレンスルホン酸塩）（ＰＳＳ，０．０２Ｍ）の系統希釈に対する細胞毒性用量作用曲線を最初に測定した。ＳＹ５Ｙ細胞及びＭＣＣのいずれも、少なくとも７５％の細胞生存能力維持であったが、０．０１Ｍ ＥＤＯＴ、０．０２Ｍ ＰＳＳまでの量に７２時間まで培養することができることを、われわれは見出した。したがって、それ以後、われわれは典型的に３０秒〜１０分間のＰＥＤＯＴ重合操作を使用したのでわれわれは細胞毒性を無視できると予想している。

生きている細胞周囲のＰＥＤＯＴの重合。ＰＥＤＯＴが、生きている神経細胞が存在する中で直接重合できるか否かを調べるために、われわれは、０．５〜１μＡ／ｍｍ^２の定電流を使用して、０．０１Ｍ ＥＤＯＴ，０．０２Ｍ ＰＳＳを含むモノマー溶液から電気化学的にＰＥＤＯＴを、神経細胞を接種した電極上に堆積させた。これにより、細胞を取り囲み、細胞を埋め込んだＰＥＤＯＴを電極上に生じた。われわれは、光学顕微鏡及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、神経細胞の周囲に重合したＰＥＤＯＴの形態と形状を評価した。堆積の後、ＰＥＤＯＴは細胞を取り囲む暗い、不透明な物質のように見え、細胞の核は重合の間そしてその後無傷で残った。興味あることに、ＰＥＤＯＴは、細胞が基質に明らかに強く接着している領域には堆積できなかった。ＳＥＭを使用して、電極上、細胞を取り囲んでいるＰＥＤＯＴは、ＰＥＤＯＴに典型的な、ふわふわした、結節性の表面形状を示した。また、このポリマーは、細胞の外側を包み込み、ある場合には成長して細胞体を巻き込んでいるように見えた。

細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜の作成。次いで、われわれは、細胞表面の模様と同じスケールの細胞の形の孔と模様からなる生物模倣の形状を持つ伝導性ポリマー基質を作成するためにこの技術を応用した。ニューロンの周囲のＰＥＤＯＴの重合の後、酵素的及び機械的破壊を使用してＰＥＤＯＴマトリックスから細胞及び細胞物質を除去した。これにより、ナノメーター及びマイクロメータースケールの模様を持つ神経細胞を鋳型とするふわふわしたＰＥＤＯＴ材料が生じた。神経細胞を鋳型にしたポリマーの形状は、細胞本体及び伸びた神経突起の周囲を囲む伝導性ポリマーから生じたニューロンの形をした孔及びトンネル、裂け目、及びくぼみであった。この方法を使用して、われわれは、ＰＥＤＯＴ（暗い物質）が神経突起の先端のナノスケールの弦を明示しているＰＥＤＯＴマトリックスと細胞膜の間の境界面における密着した接触のエビデンスを見出した。ＡＦＧ画像はポリマー表面の形状について更に詳細を提供し、ニューロンの鋳型による模様は約１．５〜３μｍの高さであった。

細胞の鋳型によるＰＥＤＯＴの生体模倣表面は、ナノメートルスケールの「ふわふわさ」及び独特な細胞の形をした孔と模様のために、細胞にとって魅力があるとわれわれは仮定した。細胞の鋳型によるＰＥＤＯＴの上に新しい細胞を接種した後、細胞の形をした孔の細胞の最生息又は細胞の鋳型による表面への接着の増加のエビデンスを調べた。ニューロンの鋳型によるＰＥＤＯＴ基質上において培養されたＳＹ５Ｙ細胞は、鋳型を使用しないＰＥＤＯＴの領域よりも、細胞鋳型を使用した領域へ優先して接着することを示すことを、われわれは発見した。細胞のサブセットはこのフィルムの細胞型の穴に再生息するように見えたが、鋳型にするために使用した元の細胞と同じ位置には定着しなかった。

ＰＥＤＯＴに包埋されたことに対する細胞反応の評価。電気的重合方法及びＰＥＤＯＴの中に包埋することに対する細胞の反応をより良く理解するために、われわれは、重合後数分から数日の細胞生存能力、細胞骨格及び核の形態、細胞接着及び細胞膜の統合性を評価した。これらの実験のために、完全に包み込まずに、栄養素に対する細胞の活性及び接近が維持できるＰＥＤＯＴマトリックスを生じる重合方法を、われわれは使用した。重合後２４時間は正常核形態（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色）により裏付けられるように、細胞は分解的又は壊死的死を受けていないことを、われわれは認めた。従って、われわれは、Ｖｙｂｒａｎｔ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びアポトーシス関連プロテアーゼである活性化カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の免疫細胞化学を使用して、誘因損傷の後２４〜９６時間に生じるプログラム死又はアポトーシスの細胞をアッセイした。事実、重合後７２時間から、核内の活性化カスパーゼ３の存在によって示されるように、ＰＥＤＯＴマトリックスに埋め込まれた細胞中のアポトーシスのパーセンテージの増加の検出が始まった。例えば、重合後０ｈ（図５ｃ）及び１２０ｈにおけるＭＣＣ中の活性化カスパーゼ（＋）細胞のパーセンテージの比較。重合後０ｈにおけるアポトーシス細胞数は、あったとしてもわずかであったが、重合後１２０ｈでは、ＳＹ５Ｙ及びＭＣＣにおいて、それぞれ２５％及び３３％のアポトーシス細胞が検出された。

無傷の細胞膜を持つ細胞に対しては浸透性のない核酸色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって細胞は染色された。ＰＩ（＋）染色は一過性であり、２４ｈでは電気化学的重合の細胞と対照（電流暴露なし）の間に有意な相違は無かった。細胞は、体細胞の近くの最も高い細胞の領域を残して大部分の神経突起を覆う厚い、密集したＰＥＤＯＴマトリックス（暗い、不透明な物質）に取り囲まれていた。

細胞を含むＰＥＤＯＴの電気的性質の特性分析。ついで、われわれは、電気的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）及びサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を使用して、ニューロンを鋳型としたＰＥＤＯＴ及びＰＥＤＯＴ＋生ニューロン電極被膜の電気的特性の分析を行った。ニューロン及び心筋細胞のような電気的に活性名細胞からの電気生理学的シグナルの記録は、典型的に、０．１〜１ｋＨｚの周波数範囲において、最高の信号対ノイズ比及び記録可能単位数を提供する低インピーダンス、高感度の電極で行った。電極のインピーダンスは電極と電解質の間の境界表面積に関係し、表面積の増加に従ってインピーダンスは減少した。既報に一致して、ＰＥＤＯＴによる電極のコーティングは、０．０１〜１００Ｈｚの間の周波数において１〜２桁の電極インピーダンスの低下を生じた。これは明らかに、大部分はふわふわした、ナノ−多孔性、かつ伝導性ＰＥＤＯＴマトリックスにより提供される電極の有効表面積の増加によるものである。ＰＥＤＯＴ単独に比較して、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン被膜のインピーダンスは細胞の存在のために増加する。これは、電極の一部の領域上の細胞はＰＥＤＯＴ重合に対して障碍として働くために、電極表面のＰＥＤＯＴによる被覆を減らすことに関係しているようである。しかし、神経細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜はＰＥＤＯＴでコーティングした電極とＰＥＤＯＴ＋神経細胞の間のインピーダンススペクトルを示したというわれわれが予想しなかった結果は、ＰＥＤＯＴに比較してＰＥＤＯＴ＋ニューロンのインピーダンス増加の一部は電極とＰＥＤＯＴの間の信号伝達を妨害する可能性がある細胞の電気活動性による可能性があることを示唆している。神経細胞を接種した電極（２．７ｋオーム）、ＰＥＤＯＴコーティング限局（０．２ｋオーム）、ＰＥＤＯＴ＋生神経細胞（２．７ｋオーム）及び神経細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴ電極（０．７ｋオーム）のインピーダンスに対して、裸の、コーティングを施してない電極（４．４ｋオーム）の１０００Ｈｚインピーダンス（Ｚ）を比較せよ。

インピーダンススペクトルのフェーズプロットは、＜１０ｋＨｚの周波数において、裸及び神経細胞を接種したＡＢＰ電極の位相角は７５〜８５°であることを明らかにし、電極は主としてコンデンサーとして機能していることを示した。ＰＥＤＯＴによるコーティングは、位相角を＜２０°に劇的に低下させ、０．１ｋＨｚを超す周波数において電極を蓄電性でなくより抵抗性にした。しかし、ＰＥＤＯＴマトリックス中に神経細胞が存在することは、この反応を緩和し、位相角の減少を少なくして、＞１０ｋＨｚ周波数まで主として抵抗性にならない。これは、本来抵抗性と蓄電性の二つの要素を持つ神経細胞の膜の間の複雑な相互作用によるらしい（通常、脱分極抵抗Ｒ及び膜電荷蓄積能Ｃ及びＰＥＤＯＴが生きている細胞の存在下に重合する時に形成される独特なＰＥＤＯＴマトリックスの微細構造を持つＲＣ回路により現される）。

電極の電気的インピーダンスを減少させる能力に関して、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン及びニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜がＰＥＤＯＴ被膜とどのような関係にあるかをより良く理解するために、われわれは、これらを以前の出版中で特性分析をした二つの類似のＰＥＤＯＴと比較した。ＰＥＤＯＴ＋ニューロン及びニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜を、本試験に使用したのと同じポリアニオン性ドーパント、ＰＳＳを含むＥＤＯＴモノマー溶液から成るＰＥＤＯＴ、並びに細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴを調製するためにここに示した方法に類似する方法を使用して４８５ｎｍポリ（スチレン）スフェアーを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜と比較した。われわれの出版物の中では多様な電極のタイプと形状を使用したので、比較の目的で、データを電極表面積（Ｚ＊Ａ＝オーム＊ｍ^２）について正規化し、そして１ｋＨｚインピーダンス値を蓄積電荷密度（Ｃ／Ａ＝Ｃ／ｍ^２）の関数としてグラフにした。

また、われわれは、いかにＰＥＤＯＴ被膜の複雑さ、ミクロ多孔性、及び非均一性を増加させることがＰＥＤＯＴの被膜の抵抗性に劇的に影響するかをより良く理解するために、等価回路モデルを作成した。典型的な裸の電極はＲ_Ｓ（Ｔ（Ｒ_ＴＱ））によって表すことができ、式中Ｒ_Ｓは溶液抵抗、Ｔは拡散に関係するＷａｒｂｕｒｇ成分（定位相成分Ｑ_ｎ＝０．５）、Ｒ_Ｔは電極−電荷質境界における電荷移動抵抗、及びＱは多孔性及び電解質−電極境界のキャパシタンスを表す定位相成分である。既に、ＰＥＤＯＴ−コーティング電極の等価回路モデルはＲ（Ｃ（Ｒ_ＴＱ_ｎ＝０．５））と定義されており、式中裸の電極のＴは、ポリマー表面におけるイオンの拡散及び裸の電極よりもより蓄電的であるポリマーを介しての電流伝導のために、Ｃに置換されている。興味あることに、ＰＥＤＯＴ、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン及びＡＢＰ電極上のニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜のモデル計算は、ＰＥＤＯＴマトリックスは、ＰＥＤＯＴ単独についてはＱ_ｎ＝０．９７、ＰＥＤＯＴ＋ニューロンについてはＱ_ｎ＝０．８８、そしてニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴについてはＱ_ｎ＝０．７２の定位相成分によって最もよく表されることを示した（表２参照）。この減少傾向は、ＰＥＤＯＴ、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン及びニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴの定量的分析により確証することができたＰＥＤＯＴの表面多孔性の増加を表しており、それはニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴは、ＰＥＤＯＴマトリックス中に細胞の形をした孔が存在するために最高の総多孔性を有していることを示している。

ＰＥＤＯＴマトリックス中に神経細胞が存在することは、ＰＥＤＯＴのＣ（ＲＱ）と同様に、神経細胞膜に典型的なＲＣ成分を与え、［Ｒ_Ｓ（Ｃ（Ｒ_ＴＱ）（ＲＣ））］を生じる。興味あることに、同じモデルは神経細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴに適用することができるが、この場合に、追加のＲＣは細胞膜の影響でなく、ＰＥＤＯＴから細胞を取り除いた後に残される蓄電的ギャップによるものである。同じモデルであるにも係らず、ＲＣ成分中の抵抗器及び蓄電器の両者に対する値は、ニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜（Ｒ＝７．１４×１０^−３オームｃｍ^２，Ｃ＝７．６６×１０^−１Ｆ／ｃｍ^２）と比較して、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン被膜では高かった（Ｒ＝３．１８×１０^−３オームｃｍ^２，Ｃ＝２．４６×１０^−１Ｆ／ｃｍ^２）。抵抗及び蓄電のこの増加は、ニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴがＰＥＤＯＴ＋ニューロンマトリックスよりも伝導性がよい理由を説明できる電荷移動能力の増加に現れた。

Ａｕ／Ｐｄ電極上のＰＥＤＯＴ、ＰＥＤＯＴ＋ニューロン及びニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜の電荷移動能力を評価するために、サイクリックボルタンメトリーを使用した。裸のＡｕ／Ｐｄ電極に比較してＰＥＤＯＴ及びニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴでコーティングした電極に対する電荷移動能力（ＣＶ曲線下面積）の劇的増加は、ＰＥＤＯＴ被膜と一致した。ＣＶスペクトルは、電極の電位の偏りがマイナスからプラスへそして復帰を繰り返す時に電極材料の内因性の酸化還元反応を示した。これが電極と電解質の間でのイオン交換を推進し、ＰＥＤＯＴマトリックスの中及び外の移動性イオンキャリアーを移動させた。この電圧偏差のスイッチング過程は、このフィルムの電気的又は物理的安定性をほとんど又は全く損なうことなくＰＥＤＯＴ被膜に繰り返して適用することができ、ＰＥＤＯＴコーティング電極をバイオセンシング及び薬物放出−生体材料への応用のための理想的候補にしている。ＰＥＤＯＴ＋ニューロン電極被膜の電荷容量は、神経細胞を接種した裸のＡｕ／Ｐｄ電極より大きく増加するが、ＰＥＤＯＴで認められるレベルには達せず、明らかに異なる形をしている。

神経細胞培養と伝動性ポリマーの間の相互作用は、脳及び心臓のような電気的に活性な組織と接触することを意図している電気伝導性生体材料の開発には利点である。ＰＥＤＯＴは、電極の上に接種した神経細胞の存在下に直接電気的に重合し、接着した細胞の周囲及び上に伝動性ポリマーを形成する。ＳＥＭ及び光学的画像は、モノマーからの重合は、重合の足場として細胞、細胞膜、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を使用して、細胞−電極境界にポリマーが沈殿することを可能にしていることを示唆した。

生神経細胞を含むＰＥＤＯＴマトリックスの電気的特性分析は、神経細胞が金属電極の上又は近傍で培養され、電気的にニューロンと境界を接するために使用されたより典型的な形状とは異なる電極と神経細胞の間の関係を示唆した。伝導性ポリマーと神経の膜の間の密着した相互作用は、ＰＥＤＯＴが繊細な糸状仮足及び神経突起を覆っていることを明らかにした。独特の細胞−ポリマー−電極境界は、新しい世代のバイオセンサー及び「スマートな」バイオ電極を開発のための理想的候補物質であり得る。電気的に応答し、電極に接着する細胞を伝導性ポリマー中に取り込むことは、センシングの目的に取り込まれた細胞の生化学的及び電気化学的性質を利用する新たな機会を提供する。

電極上で培養された細胞の周囲に重合したＰＥＤＯＴは、また、生きている細胞の周囲に電気的に重合する方法は、固定された伝導性マトリックス中に細胞を捕捉し、固定するための新規方法であることを示した。ＰＥＤＯＴ中の電極部位上に細胞を捕捉することは、電極部位からニューロンが移動することにより現在では困難である神経ネットワーク内のシグナリングのマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）に基づく塩基生理学的試験を単純化する。電極上の細胞の電気重合は、伝導性基質及び／又は固定化標的が必要である原子力顕微鏡（ＡＦＭ）及び走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を使用して細胞の画像化を容易にすることができる。電極上で培養された細胞の周囲に重合したＰＥＤＯＴは、細胞の外側の周囲にＰＥＤＯＴが沈殿する方式であるために、細胞−基質接着の形態の「陰」画を明らかにする新規方法であることも、われわれは認めた。これは、免疫細胞化学及び全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡のような細胞−基質相互作用を可視化するためのほかの方法の代替を提供する可能性がある。

次に、われわれは、細胞の周囲に重合した後に、ＰＥＤＯＴマトリックスから細胞及び細胞物質を除去することによりニューロンを鋳型にしたＰＥＤＯＴ被膜を作成した。細胞を鋳型にした表面は細胞類似であり、生態適合性である可能性があり、細胞誘因性である可能性があると、とわれわれは仮定した。事実、細胞に規定されたＰＥＤＯＴマトリックスは細胞上のそして神経突起の長さのスケールの表面特徴を提供し、延びた神経突起及び種々の細胞突起の周囲を埋めたＰＥＤＯＴから生じたトンネル、溝、裂け目及びくぼみを含んでいた。ここに示したわれわれのインビトロの結果は、組織内に埋め込まれた場合に、この細胞を鋳型にしたポリマー表面は、組織内の細胞に細胞を模った孔に再生息させ、トンネル及び裂け目の中に突起を送り込むようにさせることができることを示している。これは、細胞と伝導性ポリマーの間の非常に密着した接触を提供し、電極と組織の間の連続的電気的接触を可能にするであろう。細胞の除去の技術を変えることは、細胞のそして細胞以下の大きさのスケールにおける標的細胞と電極の間の相互作用を空間的に局在した生化学的な調節ための機会を提供することができる。細胞を模倣した形状により提供される機械的調節、細胞を鋳型にした表面の生化学の個別化は、神経突起の誘導、成長及び信号伝達の操作と追跡を可能にする。
他の伝導性ポリマー電極被膜と一致して、ここに記述した細胞を鋳型にしたＰＥＤＯＴ及びＰＥＤＯＴ＋ニューロン被膜は、１ｋＨｚにおける電気的インピーダンスの少なくとも一桁の減少及び裸の電極の２〜４倍の電荷容量の増加により示されるように、電極機能を向上させる能力を立証した。従って、生体を模倣した性質と併せて、これらの新規電極被膜は電極−組織境界を改善するための優れた候補材料である。

実施例３．ヒドロゲルの足場の中に含まれる細胞を含むバイオ電極。
ゲルの中及び細胞の周囲に堆積した伝導性ポリマーネットワークにより３Ｄヒドロゲル足場の中に固定され、生きている、活性細胞を含む電極。伝導性ポリマーは、バイオ電極が電気的交信のために他の装置へ、及びから電気的又は電子的信号を中継することを可能にする。ヒドロゲル中に懸垂された細胞は、電極により直接監視することができ、そして必要な交信源と生化学的に又は電気的に相互作用するために使用することができる。

方法及び材料。組織／細胞培養：実験１に記述したように、細胞を回収する。実験１に従って調製した神経細胞については、ポリ（リシン）コーティング培養容器にプレートした。培地中のグリア細胞は、培地交換のために使用する培地中にＦＢＳを含めないことにより制限することができる。実験１に従って細胞を増殖する。ヒドロゲル足場の中に固定する前に、皿の中で培養された細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ ０．２５％（Ｂｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３７℃で１０〜１５分間インキュベーションすることのより基質から酵素的に取り出す。細胞と培地を１０００ ＲＰＭで２分間遠心分離して、上清を捨てる。残る細胞ペレットを再懸濁し、細胞を解離するために１０^５〜１０^７細胞／ｍｌの濃度になる量の培地中で処理する。

一定の態様において、アルギン酸塩及びポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）ヒドロゲルは使用できるが、しかし、この方法は無毒性交差結合を持つ多数の生体適合性ヒドロゲル又は化学的に機能性のあるヒドロゲルを使用することができる。アルギン酸ヒドロゲルは、ＰＢＳ（１〜６％（ｗ／ｖ））の中に溶解した高いＧで、中粘度アルギン酸パウダー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から作られ、次いで．４５μｍシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を使用して濾過、滅菌する。次いで、アルギン酸塩：ＰＢＳ溶液を、細胞濃度が５×１０^４〜５×１０^６細胞／ｍｌ及びアルギン酸塩濃度が０５〜％（ｗ／ｖ）になる量の細胞溶液と充分に混合する。Ｃａ^２＋又はＭｇ^２＋のような二価イオンの滅菌した溶液を加えて交差結合を行う。生細胞を含むヒドロゲルの薄い電極被膜（５μｍ〜２ｍｍ）は、電極又はワイヤーをヒドロゲル−細胞溶液中に浸し、次いで、２２μｍシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して滅菌した脱イオン水中の２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中に沈めることにより適用する。ヒドロゲル適用及び交差結合の反復を厚い被膜を創るために使用することができる。大きな（１０ｃｍ^３までの）かさばったヒドロゲルは、ヒドロゲル水溶液とフィルター滅菌した脱イオン水中の４％（ｗ／ｖ）ＣａＳＯ４溶液をモル比０．１８で充分に混合することにより造られる。次いで、ゲルは滅菌した鋳型又は選択した容器中に注入される。ヒドロゲルの足場は、ヒドロゲル−空間充満バイオ電極を作る間ＰＢＳ又はＨＢＳＳ中に一時的に保存することができる。

生きている細胞が存在する中における電気化学的重合：細胞を接種したヒドロゲルでコーティングした電極を、ＰＢＳ又はＨＢＳＳのような食塩溶液及びドーパント及び／又は生態分子を含む必要なモノマーを含む電気的に連結した容器中に入れることができる。かさばったヒドロゲルについては、電極又はマイクロワイヤーをヒドロゲル中に挿入する。ＡｕｔｏＬａｂ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖａｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ，オランダ）又はポリマーフィルムの必要な厚さに応じて１〜１０μＡ／ｍｍ^２の直流を０．５〜１２０分間供給できる類似の装置を使用して、定電流を電極及びモノマー溶液に適用する。モノマーの電気化学的酸化／還元は、ヒドロゲルの中及び細胞の周囲に伝導性ポリマーフィルム及びネットワークを生じるので、３Ｄポリマーヒドロゲル足場の中に細胞を埋め込みそして固定する。

細胞生存能力の評価：伝導性ポリマー電極ネットワークに接触している細胞の生存能力は、実施例１及び２における記述に従って初めて評価することができる。

機能と有効性の特性分析／測定：表面形態の特性分析：電気的性質の評価：生きている細胞の存在する中における電気化学的重合により生じる伝導性ポリマーフィルム／ネットワーク及び細胞を鋳型にした孔とチューブのマイクロメータ及びナノメータースケールの粗さの組合せは、電極の有効表面積の増加及び電気的インピーダンスの有意な減少、一方で電極の電荷容量の増加を示すことができる。これらの変化を評価するために、われわれは、電気的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）及び大クリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行うことにより３次元電極ネットワークの電気的性質を測定する。この測定を行うために、Ｄｅｌｌコンピューターに接続したＢｒｉｎｋｍａｎｎ Ａｕｔｏｌａｂシステムをわれわれは使用する。３電極電池の電解質として０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．０）の溶液を使用する。白金ホイルを対電極として使用し、対照電極として飽和カロメル電極を使用する。伝導性ポリマー電極ネットワークは作動電極に連結される（そして作動電極になる）。

ＥＩＳについては、５ｍＶ振幅のＡＣ正弦曲線の信号を使用し、そしてＤＣポテンシャルを０にセットする。インピーダンスの値は、１０^５〜１０Ｈｚの範囲について１０毎に５つの異なる周波数において測定する。インピーダンスの実数及び虚数成分を周波数の関数として測定し、分析のために種々の様式（振幅対周波数、位相角対周波数、実数部分対虚数部分）でプロットした。ＣＶについては、３電極電池セットアップはＥＩＳに使用したものと同じである。１０ｍＶ／ｓのスキャン速度が使用されるであろう、そして作動電極のポテンシャルはＳＣＥに対して−１．０から１．０Ｖの間でスイープするであろう。この限界は、可逆的酸化還元反応を含むには広すぎるし、過剰酸化を避けそして水ウインドウ内に留まるには狭すぎる。

実施例４．その場で重合した電極ネットワーク
この態様において、伝導性ポリマーは、組織内の間隙空間及び細胞間の細胞外マトリックスの中のその場で成長する分子的な薄さ及びナノメータースケールの伝導性ポリマー原線維の拡散したネットワークである。組織内に電極を作るために、植込み可能な生物医学的装置上に、電極部位を通して伝導性モノマーの重合を行うための電流を供給するための電極基質を持つ必要があり得る。伝導性ポリマーの重合のために、電極部位に近い組織は無毒性のモノマー溶液で飽和されている必要があり、それは生物医学的装置のマイクロ液体チャネルを介するか又は注入により行うことができる。

モノマー溶液の存在下に電流が供給された時に、先ずポリマー電極が電極部位上に堆積し、次いで電極部位から、電極によって作られた電場に従って成長する。その結果、細いポリマー線維の電気的に連結し、拡散したネットワーク及び細胞の周囲及びその間に織られた鎖を創製し、有効に組織を神経支配し、そして生きている組織の３Ｄ空間にある細胞の形質膜と密着接触する。拡散ポリマーネットワーク電極は、生組織内に完全に統合されており、組織と共に移動した時に電気的完全性及び安定性を維持しているので、組織−装置の境界において充分に統合されていない物理的につなぎ合わせた、硬い電極ではよく認められる微動による組織障害を除去する。

一定の態様において、伝導性ポリマーは、限定せずに、上皮組織、皮膚、心筋及び脳を含む多様な組織の中で重合することができる。それは電極の部位から少なくとも５００μｍから１ｍｍの長さまで細胞間のナノメーターの狭い空間の中及び空間を通して成長できるので、このタイプの３次元電極ネットワークは、埋め込んだ電極の周囲に形成することがよくある繊維性の瘢痕による包埋及び免疫細胞の集合に浸透しそして回避することができる。これにより、装置が電気的インピーダンスが高い中に取り囲まれそして信号を遮断する瘢痕組織があっても、埋め込んだ生物医学的装置と健康な標的細胞組織の間の機能的、長期的電気的交信が可能になる。

拡散したポリマー電極ネットワークの合成：１以上の電極部位を持つ電極又は生物医学的装置は、標的組織の中に挿入される。この電極は、（電気的ワイヤー又はある種の遠隔測定により）埋め込んだ装置の電極に電気的刺激を供給することができる装置及び／又はコンピューターに電気的に連結されていなければならない。伝導性ポリマーを重合させるために、電極部位に近い組織は無毒性モノマー溶液で飽和されていなければならず、これは生物医学的装置のマイクロ液体チャネル又はそれぞれ注射又は注入によりモノマーを供給することにより行うことができる。

急性インビトロ試験のための組織中重合：その中に拡散ポリマー電極ネットワークが作られる組織（例えば、脳、心臓、皮膚、筋肉など）は、屠殺（過量のＣ_２）した成熟Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから切除し、直ちに氷冷モノマー溶液に４℃で１０〜３０分間浸す。このモノマー溶液は、０．０１Ｍ ３，４−エチレンヂオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）、イオン性ドーパント ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）０．２５ｍｇ／ｍｌを含有する食塩液（ＰＢＳ又はＨＢＳＳ）である。種々のほかのドーパント及び生体分子をモノマー溶液に含めることもできる。モノマー溶液中でインキュベーション後、組織を、電気的に連結し、冷却したモノマー溶液を充たした容器に入れることができ、そして７５μｍ直径の金（Ａｕ；テフロン（登録商標）コーティング）マイクロワイヤー（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）電極を組織の必要な位置に挿入する。ついで、ＡｕｔｏＬａｂ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖｅｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ，オランダ）又は１〜１０μＡ／ｍｍ^２の直流（ＤＣ）を供給でき、コンピューター及び電気的分析ソフトウエアに連結されている類似の装置を使用して、定電流を電極及びモノマー溶液に適用する。重合操作は、１５分〜４時間室温（ＲＴ）で進行する。モノマーの電気化学的酸化／還元は、組織内細胞の周囲及び間隙空間内に、分子的に細くそしてナノメータースケールの伝導性ポリマーの弦及びネットワークを生じる。重合操作の後、組織は（埋め込んだ電極と共に）、４％パラホルムアルデヒド又は２．５％グルタルデヒド（いずれもＰＢＳで希釈）中で終夜、４℃で固定することができる。翌日、組織をＰＢＳで洗い、次いで組織切片を作成する。

慢性試験のための脳スライスの器官型培養における重合：雄のラット又はマウス（５〜１０日齢）をイソフルオラン暴露により深麻酔し、次いで速やかに断頭する。脳を取り出し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び６％グルコースを加えたＨａｎｋの緩衝液からなる氷冷切開培地に入れる。海馬及び新皮質を切り出し、４００μｍの厚さに横にスライスする。スライスを、３５ｍｍポリ（リシン）−コーティング組織培養皿（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中の平板マイクロ電極アレイ（ＭｕｌｔｉＣｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，ドイツのＭＥＡ）上に置くか、又は７５μｍ直径金（Ａｕ，テフロン（登録商標）コーティング）ミイクロワイヤー（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）をスライスに挿入し、そしてスライスを半多孔性膜（０．４μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）の上におく。電極を付けたスライスを、５０％ＭＥＭ，２５％ウマ血清，２５％Ｈａｎｋの緩衝液，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭグルタミン及び５ｍｇ／ｍｌグルコースを含む増殖培地中、５％ＣＯ_２中、３７℃で培養する。実験まで及び実験中２〜３日毎に培地を交換して培養を３〜２１日間インビトロで維持する。培養の３〜７日後、組織をモノマー（０．０１Ｍ ＥＤＯＴ）を培地中に浸し、１〜４時間３７℃でインキュベートする。次いで、組織スライスに接触している電極をＡｕｔｏＬａｂ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ／Ｇａｌｖｅｎｏｓｔａｔ（ＥｃｏＣｈｅｍｉｅ，オランダ）又は１〜１０μＡ／ｍｍ^２の直流（ＤＣ）を供給でき、コンピューター及び電気的分析ソフトウエアに連結されている類似の装置に電気的に連結する。次いで、細胞の生存を維持するインビボの条件（５％ＣＯ_２中、３７℃）の下に１５分間〜１時間、定電流を組織内の電極に適用する。モノマーの電気化学的酸化／還元により、組織内の細胞の周囲及び間隙空間中に分子的細さの、ナノメータースケールの伝導性ポリマーの弦とネットワークを生じる。重合操作の後、組織を重合後必要な時間インキュベーターに戻し、次いで、実験の終わりに、組織（及び関連電極）を４％パラホルムアルデヒド又は２．５％グルタルデヒド（いずれもＰＢＳで希釈）のいずれかの中に浸して終夜（ＯＮ）４℃で固定する。翌日、組織をＰＢＳで洗い、組織切片を作成する。

拡散したポリマー電極の機能及び有効性の特性分析／測定：拡散したポリマー電極形状の特性分析：拡散したポリマー電極は、生きている組織に埋め込まれた電極から動的に、リアルタイムに合成することができる。拡散したポリマー電極ネットワークは、３次元ポリマー電極ネットワークのもう一つの例である。拡散したポリマー電極を含む組織は、通常は顕微鏡法を使用して画像化するには厚すぎるので、組織を切片にする必要がある。これは、使用する組織染色及び顕微鏡のタイプにより、いくつかの方法のうちの一つにより行われる：１）固定又は未固定の組織をアルミニウムフォイルに包み、次いで液体窒素又はドライアイス冷却イソプロパノール中瞬間凍結し、次いでＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ．Ｃ．Ｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）中に包埋し、次いでＣｒｙｏｓｔａｔにより超薄切する（４〜２０μｍスライス）；２）固定した組織を脱水、キシレン処理、パラフィン包埋、次いで、ミクロトームで超薄切する（４〜１２μｍスライス）；３）未固定組織を１０％ゼラチン中に包埋し（＜５０℃）、次いで、ビブラトームで薄切（２０〜５００μｍ）；４）固定組織を１０％ゼラチン中に包埋し、組織＋ゼラチン複合体を終夜４℃で固定し、次いで、ビブラトームで薄切する（２０〜５００μｍ）

薄切の後、完全に統合された組織−伝導性ポリマー混成ネットワークの細胞の生存能力、細胞形態及び統合性／品質を評価するために、拡散した電極ネットワークを光学及び蛍光顕微鏡を使用して顕微鏡的に評価する。さらに、水性環境においてタッピングモードのＡＦＭ、並びにチャンバー内湿度５０〜７０％で冷却ステージ（Ｐｅｌｔｉｅｒステージ）上極めて低い真空で行われる環境制御走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）を使用して、表面の形状／特徴を探求する。降格顕微鏡観察は、反射光及び透過光のいずれの観察も可能であるＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ ＰＯＬにより行った。画像は、コンピューター上で作動するＳｐｏｔ ＲＴデジタルカメラにより撮影した。

蛍光顕微鏡については、われわれは、Ｈｏｆｆｍａｎ変調コントラスト付きＯｌｙｍｐｕｓ ＩＭＴ−２直立光顕微鏡及びＬｅｉｃａ ＤＭＩＲＢ蛍光倒立顕微鏡を使用し、いずれもＵＶ光用の水銀アークランプ、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＣＤカメラ及びＤｅｌｌ ＰＣコンピューターで作動する付属Ｏｌｙｍｐｕｓデジタル画像ソフトウエアを装着している。さらに、厚い組織切片（＞２０μｍ）については、われわれは、透過光画像で４画像まで供給するＵＶ，Ａｒｇｏｎ及び２グリーンＨｅＮｅレーザーによるＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ倒立顕微鏡に装着したＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０共焦点顕微鏡そしてそれに付属するＤｅｌｌ ＰＣ上で作動するＺｅｉｓ ＭＥＴＡ画像分析ソフトウエアを使用する。その場で重合したバイオ電極の表面及び微細構造に関する情報は、自動コンパステージ及びＫｏｄａｋ １．６ Ｍｅｇａｐｌｕｓ高分解能デジタルカメラを装着したＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ２００ ３Ｄ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ及び環境制御遠視顕微鏡及びＰｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ−１００透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して得られるであろう。

拡散したポリマー電極ネットワークの電気的性質の評価：生組織の足場の上で電気化学的重合により得られた分子的に細くそしてナノスケールの伝導性ポリマーの小繊維のネットワークは、電極の有効表面積の大きな増加及び電気的インピーダンスの有意な減少を示し、一方で電極の電荷容量を増加する。これらの変化を評価するために、われわれは、実施例１及び２に記述したように、電気的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）及びサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行うことにより、拡散ポリマー電極ネットワークの電気的性質を測定する。

実施例５．全ポリマー電極
一定の態様において、ポリマーワイヤー／電極は、非金属性、非セラミックであり、半金属（例えば、シリコン）又は合金を含まない。ポリマー電極は、伝導性ポリマー、又は「通常の」金属電極又はワイヤーに代わって使用することができる電極リードを生じる特別な配置で併置される伝導性ポリマーと非伝導性ポリマー又はヒドロゲルの組合せから構成される。一部の態様において、ポリマー電極は、炭素又は炭素ナノチューブを含むこともできる。全てのポリマーワイヤー／電極は、従来の金属電極よりも優れる少なくとも２つの利点を提供する。ポリマー電極は、磁場が存在する場における金属の使用（例えば、金属製の電極又は生体補綴物を着けている人のＭＲＩスキャン）が好ましくない、危険又は不可能であるような状況においても使用することができる。二番目に、ポリマー電極は、基質及び材料の供給により種々な方法で創ることができ、そして高度に適用性があり、また、次世代の実験室及び科学的試験／分析装置のための化学的検出から組織工学まで特別な、様々な応用のために容易に仕立てることができる。これらを含むポリマーに加えて、ポリマー電極は、電極と電解質の境界における電極（又は装置）の機能及び交信／統合を向上させることができる生物活性物質を含有し、そして放出するように造ることができる。

電極が破壊されてしまうような水性環境における応用は、全ポリマー電極の使用により最も利益を受ける可能性があるであろう。これは、一部は、金属性ワイヤーの機能は水性環境において損なわれることが多く、同時に、全ポリマー電極の機能は一部は水性環境において電解質との相互作用に依存しそしてそれにより向上することがあるという事実による。さらに、ポリマー電極と電解質の間の特別なイオン性の相互作用を、装置の機能を向上させるために利用することができ、その装置とのポリマー電極の交信類似の柔軟性は従来の金属性電極には本来備わっていない。全ポリマー電極に対する４つの可能なデザインを添付する図に示す。

方法及び材料。０．５ｃｍ〜１０ｃｍの長さで、直径１〜５ｃｍの非分解性のチューブ状ポリマー容器を滅菌する。０．５〜９ｃｍの長さのポリマーのマイクロ／ナノ線維をこの容器の内側に並べる。ＥＤＯＴモノマー溶液及び適当なドーパント、例えば、ポリ（スチレンスルホナート）をこの容器の中に入れ、そしてリードを介して線維を電流源に連結する。伝導性モノマーの重合は実施例１＆２に記述したように行う。過剰の試薬を除去して、伝導性ポリマーでコーティングされた線維が残される。電気的接続は容器の一端に接続されている。任意に、ヒドロゲルを容器の中に注ぎ、伝導性マイクロ／なの線維の周囲をコーティングする。ヒドロゲルは、任意に、生きている細胞、例えば、幹細胞又は生物活性物質、例えば、薬物、医薬品、酵素、成長因子などを含む生分解性マイクロ／ナノ粒子を含むことができる。容器をバイオ電極を埋め込む部位に埋め込むことができ、そして金属又は伝導性ポリマーのポリマーリードを介して電源に接続することができる。

ポリマー電極の機能及び有効性の特性分析／測定。全ポリマー電極が電気的に活性で、機能的電極であるか否かを評価するために、実施例１〜３に記述したように電極を試験する。

従来の金属性ワイヤーを介して装置に連結することができる特殊のリードとして、全ポリマー電極を埋め込むことができる。したがって、全ポリマー電極／リードに連結するために使用できる種々の装置及びリード／ワイヤーを持つ必要がある。多様な装置；バイオ／イオン／化学検出器、「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」装置、埋め込み生物医学的装置及び生体補綴部品と互換性があるとわれわれは予想している。

実施例６．診断及び「Ｌａｂ−ｏｎ Ｃｈｉｐ」装置
伝導性ポリマーに基づく被膜を、本教示の種々な態様に記述されている伝導性モノマーの電気化学的重合により、「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」電極に応用することができる。種々の生物学的要素を、電気化学的重合操作の間に伝導性ポリマーマトリックスの中に取り込むことができる。この要素には、限定せずに、抗原、抗体、受容体、天然又は合成のタンパク質を含む膜、抗体、抗原又はリガンド特異的表面被膜（例えば、ペプチド、核酸、化学物質、受容体、タンパク質）、生きている細胞又は生物（例えば、細菌、ウイルス）、酵素、合成又は天然のポリマー／高分子及び複数タンパク質複合体が含まれる。

これらの生物学的要素は、次の方法の一つを使用して、電気化学的重合の間にポリマーマトリックスに取り込まれる；１）物質は直接モノマー溶液中に加えられる（イオン性ドーパント及び対イオンも含むことができる）、２）物質は裸の電極の表面上に堆積するか又は接着する、３）電気化学的重合操作が行われた後に、物質は電極部位の近くに注射される。これらの状況の全てにおいて、電極の総表面積は計算され、この装置のマイクロ電極はモノマー溶液に浸され、次いで、典型的に３０秒から３０分間の範囲で電流（０．５〜１．５μＡ／ｍｍ^２）を適用される。モノマーは生物学的要素の周囲に重合し、（ポリマーマトリックスを通してイオンの流れ及び大量のイオンを輸送／拡散することができる）ナノ多孔性のポリマーマトリックス中にそれらを取り込み、そのマトリックスはマイクロ電極部位の上に直接そして優先的に形成する。

「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」電極用の伝導性ポリマーに基づく被膜の機能及び有効性の特性分析／測定：
「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」電極用の伝導性ポリマーに基づく被膜の電気的性質は、ここに記述された他の伝導性ポリマー（例えば、ＰＥＤＯＴ）に基づく電極被膜（特に、生きている細胞のバイオ電極及び細胞を鋳型にしたバイオ電極）に対して記述されたのと同じ方法を使用して評価される。「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」上のＰＥＤＯＴに基づく被膜の検出及び刺激機能は、各「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」装置の文脈の中において一意的に評価することができる。例えば：「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」装置は、ＰＥＤＯＴマトリックス内に埋め込まれた抗体を使用して特異的抗原の存在を検出する。病原体が存在する場合には、病原体表面上ｊの抗原はポリマーマトリックス内の抗体と結合して、電極抵抗を増加させそして／又は伝導性ポリマーの表面電荷の変化を誘発する。抵抗の増加及び／又はポリマー表面の電荷の変化は下にある電極により検出され、それはその情報を装置に伝え、それにより装置は抗原の検出に成功したことを報告することができる。このようにして、「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」電極上のＰＥＤＯＴに基づく検出器／被膜の機能及び有効性は、電極被膜の電気的性質並びに被膜の生物活性／検出の性質の両者に依存する多数のパラメーターを使用して評価することができる。病原体検出能力の感度と特異性は測定され、そして問題の病原体を検出する既存の従来方法と比較することが好ましい。

伝導性ポリマーの独特の電気的性質及び伝導性ポリマーマトリックスに取り込まれた生物学的要素により提供される特異的に検出する機能を最もよく利用するために、種々の電気化学的分析が使用され、伝導性ポリマーマトリックス中の生物学的要素と検体溶液中の「標的分析物」の間の結合事象の検出を可能にするであろう。これには、限定せずに、電圧測定、電流測定、サイクリックボルタンメトリー、容量結合、及び／又は電気的インピーダンススペクトルが含まれる。装置が使用する特異的電気化学的分析は、伝導性ポリマーマトリックス中に存在する生物学区的要素のタイプ及び検出すべき検体溶液中の標的分析物のタイプによるであろう。種々の電気化学的分析方法は以下に記述され、そして実施例が（伝導性ポリマーマトリックス、「ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」応用の文脈の中で）その使用のために示される。

電位差測定：この電気化学的分析方法において、電圧又は電位差は、２電極システム、陽極と陰極を使用して、ゼロ電流の条件の下に測定される。陽極と陰極の間の電圧差は電気化学電池の電位差と考えられる。ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ応用のために、生物学的要素を含む伝導性ポリマーマトリックスを第一電極基質（通常陽極）にコーティングする。検体溶液に第一及び第二電極を浸し、そして検体溶液中の標的分析物は伝導性ポリマーマトリックス中の生物学的要素に結合することができる。この事象は、第一電極表面の分子種（及びその電荷）を変化させること、並びに生物学的要素及び標的分析物のいずれか又は両者における立体配座変化を誘発する可能性により伝導性ポリマーマトリックス及び下にある陽極の表面エネルギーの変化をひきおこし、これが結合／複合体化した物質上の電荷分布を変化させる。表面のエネルギー変化は、陰極と陽極の間の電圧差を生じる。これが、ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置の陽性検出応答を誘発する。

電流測定：この電気化学的分析方法において、２電極間の電流の差が測定され、一方、定電圧が電極の一つ（作動電極を考慮）に適用される。電位差測定と同様に、この方法は伝導性ポリマーマトリックス／電極の表面エネルギーの変化を検出するためにも使用することができ、そして同様なコンセプトを応用することができる。

ボルタンメトリー（リニアスイープ及びサイクリック）：この電気化学的分析方法のために３電極セットアップ、作動電極、対電極及び対照電極を使用する。（対照電極に比較した）電圧をある電圧から別の電圧へ一定の速度でスイープし、アッセイの間中電流の変化を測定する。リニアスイープボルタンメトリーのために、電圧は低い電位（０．５から５Ｖ）から少し高い電位までスイープし、一方、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）に対しては三角波形が用いられ、その場合に電圧は、ある負電位から正電位までスイープして、次いで負電位へ戻る（−１Ｖから＋１Ｖそして−１Ｖ）。ＣＶは一般的に、電解質溶液中の化学物質及び境界の酸化還元電位を測定するために使用される。ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置への応用のために、標的分析物を含有する検体溶液に暴露する前及びその後に、生物学的要素を含む伝導性ポリマーマトリックスでコーティングした第一電極基質上においてＣＶを行うことができる。結合／複合体化した物質は、検体溶液への暴露又は結合事象の前の伝導性ポリマーマトリックスに特徴的な位置とは異なる位置に酸化還元ピークを持つ独特のＣＶスキャンを示すであろう。酸化還元活性を検出する能力のために、このＣＶスキャンは２つの新たな分析に使用することができる；１）伝導性ポリマーマトリックスにおける相補的分子間の結合事象の形成のリアルタイム検出、及び２）伝導性ポリマーマトリックスの分解又は電気的又は物理的安定性の変化の検出。

電気的インピーダンススペクトル（ＥＩＳ）：ボルタンメトリーと同様に、３電極セットアップをＥＩＳのために使用する。この方法では、交流（ＡＣ）を一連の増加する周波数（Ｈｚ）を適用して、インピーダンス（Ｚ）を記録する。ＺはＤＣ環境における抵抗に類似するが、この場合にＡＣであるために、Ｚは本質的にオーム則の抵抗と等価であり、３要素、抵抗、キャパシタンス及びインダクタンスの間の関係によって決定される。ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置の態様では、生物学的要素を含む伝導性ポリマーでコーティングされた第一電気伝導基質のインピーダンスは、検体溶液に暴露する前と後に測定する。検体溶液中の標的分析物の伝導性ポリマーマトリックス中の生物学的要素との特異的結合は、インピーダンスを増加させ、またインピーダンスの位相角を変化させ、そしてこれが装置の陽性検出応答を引き出すであろう。ＣＶと同様に、ＥＩＳは、電極と溶液の間の相互作用の他の局面を測定するためにも使用することができる。例えば、相補的生物学的要素−標的分析物の間の特異的結合は、異なるＥＩＳプロフィールと関係するであろう、一方、伝導性ポリマーマトリックス及び電極に対する検体溶液中の物質の非特異的結合もまたインピーダンスを増加させるであろうが、これは特異的結合事象とは区別される独特のパターンを示すであろう。

電位差測定及び電流測定はいずれも単純な、一段階分析であり、プログラミング又は電源をほとんど必要としない利点がある。したがって、選択された電気化学的分析方法は、使用される生物学的要素並びに電極が暴露される検体溶液の種類に基づくことができる。例えば、電位差測定を使用するｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置は、その他に食塩溶液を含んでいる実験室検体から核酸を検出することが求められているような応用に好ましいであろう。これに対して、電位差測定は選択性が低い。血液又は血清中の抗体の検出には、ＣＶ又はＥＩＳ電気化学的分析を使用するｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置を設計することが好ましいであろう。

伝導性ポリマーに基づく被膜は装置上の電極に応用されるので、装置上の電極基質は重合操作を行いやすい必要がある。更に、伝導性ポリマー被膜は向上した電極感度及び電荷移動能力を提供するので、装置の機能に関係するハードウエア及びソフトウエアのいずれも、ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ装置から来る情報を伝達しそして判断する能力があることが好ましい。

本開示の記述は本質的に説明に過ぎず、従って、本発明の要旨から外れない変更は本発明の範囲内にあると考えられている。そのような変更は本発明の本質及び範囲から外れていないと見なされる。

図１は、本開示にしたがって電気伝導性物質上に電気的に重合された生きた細胞の図を示している。 図２パネルＡ及びＢは、本開示の態様に従って電気伝導性物質が成長しそして重合したニューロン周囲のＰＥＤＯＴポリマーの走査電子顕微鏡写真を示す。パネルＣは、伝導性ポリマーと本開示に従って埋め込まれたニューロンの細胞膜の間の密着した接触を高倍率で示す。 図３パネルＡ，Ｂ及びＣは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の周囲に重合したＰＥＤＯＴ（ＥＤＯＴ−ＰＢＳ−ＰＳＳ）により鋳造された細胞の走査電子顕微鏡写真を示す。ＳＥＭ画像は、本開示に従うポリマーのナノメーター及びマイクロメータースケールの凹凸並びに細胞の形の孔とトンネルを示す。 図４パネルＡ−Ｃは、本開示に従って、ＰＥＤＯＴ及び／又はＳＹ５Ｙ細胞でコーティングした種々のプローブの電気化学インピーダンススペクトル、フェーズアングルプロット及び電荷密度対インピーダンスのグラフ表示を示す。 図５は、本開示に従って、ニューロンを含む組織中へインザイチューバイオ電極挿入及びヒドロゲル中へ伝導性ポリマーの挿入の図示である。 図６は、本開示に従って、生きているモルモットの蝸牛中に生成したヒドロゲルバイオ電極の電気化学的インピーダンススペクトル及びサイクリックボルタンメトリーのグラフ表示である。 図７は、本開示に従って、インザイチューバイオ電極装置を製造するために使用された方法と要素を示す。詳細な説明

Claims (31)

1. （ｉ）第一電気伝導性基質；
   （ｉｉ）生物学的要素；及び
   （ｉｉｉ）該第一電気伝導性基質を該生物学的要素に電気的に結合して、総合的にバイオ電極を定義する伝導性ポリマーであって、該バイオ電極は第一伝導性基質、生物学的要素及び伝導性ポリマーのいずれか一つの間の電気信号を伝達又は受信するものである上記伝導性ポリマー
   を含む生物学的に統合されたバイオ電極装置。
2. 前記生物学的要素が１以上の組織、有機の生きている細胞、細胞成分又はそれらの組合せを含んでいる請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
3. 前記有機の生きている細胞が、天然又は組換えの真核細胞又は原核細胞から本質的になる群から選択されている請求項２に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
4. 前記細胞成分が、膜、細胞小器官、イオンチャネル、脂質二重層、受容体、酵素、タンパク質、抗体、抗原、核酸又はそれらの組合せから本質的になる群から選択される請求項２に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
5. 前記の真核細胞が、心臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、幹細胞、間質細胞、造血細胞及びそれらの組合せから本質的になる群から選択されている請求項３に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
6. 前記神経細胞がニューロンを含む請求項５に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
7. 前記バイオ電極が前記伝導性ポリマーに近接して接触した少なくとも一つのヒドロゲルをさらに含む請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
8. 前記ヒドロゲルが生物活性物質をさらに含む請求項７に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
9. 前記の伝導性ポリマーが、ＥＤＯＴ、ピロールのコポリマー及びホモポリマー、及びその官能化誘導体及びコポリマー、ポリアニリン、ポリアニリンの塩、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリ（３，４−エチレンジチアチオフェン）、それらのポリマーブレンド、ポリマー−金属混成材料及びそれらの組合せから本質的になる群から選択される請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
10. ＥＤＯＴ及びピロールのポリマーが、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（ピロール）、その誘導体及びそれらの組合せから本質的になる群から選択される請求項９に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
11. 前記伝導性ポリマーが前記生物学的要素及び前記第一電気伝導基質の周囲に重合されている請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
12. 前記第一電気伝導性基質が、金、銀、プラチナ、パラジウム、タングステン、ニッケル、チタン、インジウムスズ酸化物、銅、炭素、カーボンブラック、炭素線維、カーボンペースト、グラファイト、ドープシリコン、セラミック、伝導性ポリマー及びそれらの組合せから本質的になる群から選択された導体を含む請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
13. 前記バイオ電極がさらに、第一電気伝導性基質及び該伝導性ポリマーの間の前記電気信号を伝達又は受信する伝導ポリマーの重合に関与し、１以上のドーパントを含む、請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
14. さらに第二電気伝導性基質を含む請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
15. 装置の１以上の電気信号を使用して前記第一及び第二電極基質及び生物学的要素と交信することができる電源又は電流源をさらに含む請求項１に記載の生物学的に統合されたバイオ電極装置。
16. （ａ）電気伝導性基質；
    （ｂ）該電気伝導性基質の少なくとも一つの表面の少なくとも一部の上の被膜を含む生体適合性電極であって、その被膜は
    （ｉ）生物学的要素、及び
    （ｉｉ）伝導性ポリマー
    を含み、該電気伝導性ポリマーの少なくとも一部が該生物学的要素及び電気伝導性基質と隣接して接触して配置され、重合されているものである上記生体適合性電極。
17. （ａ）電気伝導性ポリマー、及び
    （ｂ）生物学的要素
    を含み、該電気伝導性ポリマーの少なくとも一部が該生物学的要素及び電気伝導性基質と隣接して接触して配置され、重合されている電気伝導性基質のための生体適合性及び生体模倣被膜。
18. 該被膜がマイクロ電極アレイ、ラブオンチップ（ｌａｂ ｏｎ ｃｈｉｐ）装置及び標的分析物検出装置に応用される請求項１７に記載の生体適合性及び生体模倣被膜。
19. 以下のステップ：
    （ａ）電荷を移動することができる組織に密着接触している第一電気伝導性基質を含むバイオ電極装置を準備し、該電極装置は
    （ｉ）第一電気伝導性基質；
    （ｉｉ）生物学的要素；及び
    （ｉｉｉ）該第一電気伝導性基質を該生物学的要素に電気的に結合して、総合的にバイオ電極を定義する伝導性ポリマーであって、該バイオ電極は第一伝導性基質、生物学的要素及び伝導性ポリマーのいずれか一つの間の電気信号を伝達又は受信するものである上記伝導性ポリマー、
    を含み、
    （ｂ）該バイオ電極装置及び該バイオ電極に電気的に結合した第二電気伝導性基質を電源に電気的に連結し；そして
    （ｃ）該第一及び第二電気伝導性基質を通して電圧又は電流を適用し、これにより該伝導性ポリマーを通して電圧又は電流を誘発し；
    （ｄ）該バイオ電極装置により電気信号の移動を検出する
    を含む、生きている細胞間の電気的信号の移動を電気的に検出する方法。
20. 生物学的要素を含むバイオ電極を準備するステップ（ａ）（ｉｉ）において、該生物学的要素が、心臓細胞、神経細胞及び筋肉細胞から本質的になる群から選択されている請求項１９に記載の方法。
21. 検出ステップ（ｃ）が電気信号の移動を検出することを含み、該信号がインピーダンス、抵抗、キャパシタンス、インダクタンス及び電流から本質的になる群から選択されている請求項１９に記載の方法。
22. 前記の伝導性ポリマーが、ＥＤＯＴ、ピロールのコポリマー及びホモポリマー、及びその官能化誘導体及びコポリマー、ポリアニリン、ポリアニリンの塩、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリ（３，４−エチレンジチアチオフェン）、それらのポリマーブレンド、ポリマー−金属混成材料及びそれらの組合せから本質的になる群から選択されている請求項１９に記載の方法。
23. ＥＤＯＴ及びピロールのコポリマー及びホモポリマーが、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（ピロール）及びそれらの組み合わせから本質的になる群から選択されている請求項２２に記載の方法。
24. 以下のステップ：
    （ａ）第一及び第二電気伝導性基質を支持体上に配置する；
    （ｂ）生物学的要素、ヒドロゲル及び伝導性モノマーを含む伝導性ゲルを適用して該第一電気伝導性基質上の一部に層を形成する；
    （ｃ）該伝導性モノマーを重合させて該生物学的要素の周囲に重合した伝導性ポリマーを含む伝導性ゲル層を形成する；
    （ｄ）分析する標的分析物を含む検体を入れる容器を準備する；
    （ｅ）該第一電極及び第二電極を該容器中の分析する該検体と接触させ、それによる生物学的要素への標的分析物の特異的結合は該生物学的要素の表面上に測定可能な電荷の差を生じ、それは該第一及び第二電気伝導性基質に充分な量の電流又は電圧を充分な時間適用した後に伝導性ポリマーへ移転される；
    （ｆ）伝導性ポリマーに移転された電荷の該差を検出する、
    を含む液体又は気体中の生物学的物質を検出する方法。
25. 伝導性ポリマーに移転された電荷の差をインピーダンス、抵抗、キャパシタンス、インダクタンス及び電流電位及びそれらの組合せのいずれか一つを測定することにより検出する請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ｄ）において重合する伝導性モノマーが、ＥＤＯＴ、ピロールのコポリマー及びホモポリマー、及びその官能化誘導体、ポリアニリン、ポリアニリンの塩、ポリアセチレン、ポリチオフェン、ポリ（３，４−エチレンジチアチオフェン）、それらのポリマーブレンド、ポリマー−金属混成材料及びそれらの組合せから本質的になる群から選択されている請求項２４に記載の方法。
27. 前記伝導性ポリマーが電気化学的に重合している請求項２４に記載の方法。
28. 重合及び検出ステップが第一及び第二電気伝導性基質を電力、定電流、定電圧電流又はそれらの組合せの源のいずれか一つに連結した１以上の電気的リードに連結することを更に含む請求項２４に記載の方法。
29. 生物学的要素を含む伝導性ゲルを適用する前記ステップにおいて、該生物学的要素が１以上の組織、細胞、膜、細胞小器官、イオンチャネル、脂質二重層、受容体、受容体フラグメント、タンパク質、酵素、抗体、核酸又は誘導体化核酸を含む請求項２４に記載の方法。
30. 伝導性ゲルを適用する前記ステップにおいて、該ゲルが、ポリ（スチレンスルホナート）、ＬｉＣｌＯ_４，リン酸緩衝食塩溶液、Ｈａｎｋの平衡塩溶液、コラーゲン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｌ−リシン及びポリ−オルニチンから本質的になる群から選択された１以上のドーパントをさらに含む請求項２４に記載の方法。
31. 以下のステップ：
    （ａ）該生物学的要素を該第一電気伝導性基質と接触させ、生物学的に適合した電極を形成し、該第一電気伝導性基質は、金属、セラミック、炭素、伝導性ポリマー及びそれらの組合せから本質的になる群から選択されるものであり；
    （ｂ）生物学的に適合した電極を伝導性モノマー及びドーパントを含む溶液中に浸す；そして
    （ｃ）第二電気伝導性基質をステップ（ｂ）の該溶液の中に挿入し、生物学的に適合した電極を伝導性ポリマーでコーティングするのに十分な時間定電流又は定電圧電流を該第一及び第二電気伝導基質に適用することにより該モノマーを該生物学的に適合した電極の周囲に重合させる、
    ことにより形成される第一電気伝導性基質及び少なくとも一つの生物学的要素と隣接して接触している伝導性ポリマーを含む生物学的に統合された電極装置。

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