JP2019122335A - 人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高い信頼性で経内皮電気抵抗の測定及びバリア機能の評価が可能となる人工三次元組織のバリア機能測定システムを提供する。【解決手段】所定方向に延びる灌流流路を有する管腔部１５と、管腔部の外側に配置された組織部１０と、灌流流路に培地を供給する供給装置と、灌流流路に配置された流路電極７０と、組織部に配置された組織電極８０と、流路電極及び組織電極を介して経内皮電気抵抗を測定する測定装置９０と、を備える。【選択図】図８

Description

本発明は、人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法に関する。

近年、薬剤の開発において血管の壁面におけるバリア機能、例えば、中枢神経系をターゲットとして脳血管の壁面におけるバリア機能である血液脳関門（blood-brain barrier, BBB）のモデルが必要とされている。上記のバリア機能を評価する指標としては、管腔側と管腔外側との間の電気抵抗である経内皮電気抵抗(trans endothelial electrical resistance: TEER)が広く用いられている。

非特許文献１には、一面側に血管内皮細胞を配置し、他面側に神経細胞（astrocytes）を配置した平面状の多孔質膜を挟んだ両側に電極を配置し、電極間の電気抵抗を測定する技術が開示されている。

Y.Wang,et al,Biotechnology and Bioengineering (2017)

非特許文献１に記載された技術は、血管内皮細胞及び神経細胞が二次元的に配置されているため、血管内皮細胞側を流動する培地の流れが不均一になりやすい。そのため、測定された電気抵抗が培地の流動方向で不均一になり、結果として、得られた経内皮電気抵抗及びバリア機能の評価に対する信頼性が低下する可能性がある。

本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、高い信頼性で経内皮電気抵抗の測定及びバリア機能の評価が可能となる人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様に従えば、所定方向に延びる灌流流路を有する管状の管腔部と、前記管腔部の外側に配置された組織部と、前記灌流流路に培地を供給する供給装置と、前記灌流流路に配置された流路電極と、前記組織部に配置された組織電極と、前記流路電極及び前記組織電極を介して経内皮電気抵抗を測定する測定装置と、を備えることを特徴とする人工三次元組織のバリア機能測定システムが提供される。

本発明の第２の態様に従えば、所定方向に延びる灌流流路を有する管状の管腔部と、前記管腔部の外側に配置された組織部と、を有する人工三次元組織を形成することと、前記灌流流路に培地を供給することと、前記灌流流路に配置した流路電極及び前記組織部に配置した組織電極を介して経内皮電気抵抗を測定することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織のバリア機能測定方法が提供される。

本発明の第３の態様に従えば、本発明の第２の態様の測定方法で人工三次元組織のバリア機能を測定することと、薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を測定することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法が提供される。

本発明によれば、信頼性が高い経内皮電気抵抗及びバリア機能が得られる人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することができる。

本発明の実施の形態に係る人工三次元組織１を模式的に示した斜視断面図である。 人工三次元組織を形成（培養）する前段階の灌流デバイス４０の外観斜視図である。 流路形成部材４３を長さ方向に含む面で灌流デバイス４０を切断した断面図である。 流路形成部材４３を移動させた後の灌流デバイス４０断面図である。 係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。 図５におけるＡ−Ａ線視断面図である。 測定部９０に流路電極７０及び組織電極８０が接続された図である。 人工三次元組織１の概略的な構成図である。 人工三次元組織１の製造手順を示す図である。 人工三次元組織１の製造手順を示す図である。 人工三次元組織１の製造手順を示す図である。 人工三次元組織１の製造手順を示す図である。 人工三次元組織１における培養時間と経内皮電気抵抗（TEER）との関係を示す図である。

以下、本発明の人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法の実施の形態を、図１ないし図１３を参照して説明する。

なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。

（バリア機能測定システム）
まず、本発明に係るバリア機能測定システムについて、図１を参照して説明する。
図１は、バリア機能測定システム１００の概略的な構成図である。
図１に示すように、バリア機能測定システム１００は、灌流デバイス（デバイス）４０、培養皿５０、ポンプ（供給装置）６０、培地リザーバー６１、フィルター６２、流路電極７０、組織電極８０及び測定部９０を備えている。

培養皿５０の内部空間には、灌流デバイス４０が載置される。培地リザーバー６１は、培地Ｍを貯留する。ポンプ６０は、培地リザーバー６１に貯留された培地Ｍを配管６３を介して灌流デバイス４０に培地Ｍを供給する。灌流デバイス４０から排出された培地Ｍは、フィルター６２によって異物が除去された後に灌流デバイス４０に供給される。ポンプ６０としては、一例として、ペリスタルティックポンプが用いられる。

（灌流デバイス４０）
図２は、人工三次元組織を形成（培養）する前段階の灌流デバイス４０の外観斜視図である。
灌流デバイス４０は、培養槽４１、コネクタ（支持部）４２、流路形成部材４３及び組織電極８０を備えている。培養槽４１は、側壁４４に囲まれた上部が開口する培養空間４５と、底壁４６に設けられた底板４７を備えている。側壁４４は、平面視で矩形状に設けられている。底板４７は、培養槽４１に取り付けおよび取り外し自在である。底板４７は、培養槽４１の底壁４６に設けられた開口部を開閉可能である。

コネクタ４２は、対向する側壁４４のそれぞれに貫通孔４２ｄが同軸となる位置に複数対（図２では６対）装着される。３対のコネクタ４２は、第１方向に沿って配置され、他の３対のコネクタ４２は、第１方向とで水平方向で直交する第２方向に沿って配置されている。コネクタ４２のうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域には、細胞外マトリックス成分１１（後述；図６、図８参照）に対する親液化処理が施されている。親液化処理としては、例えば、Ｏ_２プラズマ処理を採用できる。

本実施形態では、６対のコネクタ４２のうち、隣り合う２対のコネクタ４２のうちの一方に流路形成部材４３及び流路電極７０を挿通させ、他方に組織電極８０を挿通させる場合について説明する。以下では、組織電極８０は、コネクタ（第１支持部）４２Ａに挿通されて支持され、流路形成部材４３及び流路電極７０は、コネクタ（第２支持部）４２Ｂに挿通されて支持されるものとして説明する。

図３は、流路形成部材４３を長さ方向に含む面で灌流デバイス４０を切断した断面図である。
図３に示すように、コネクタ４２Ａ、４２Ｂは、装着部（筒部）４２ａ、接続部４２ｂ、係合部４２ｃおよび流路形成部材４３の延びる方向（側壁４４を貫通する方向）に内部を貫通する貫通孔４２ｄを有している。装着部４２ａは軸状に形成され培養槽４１の側壁４４を貫通して装着されている。接続部４２ｂは、装着部４２ｂの一端に設けられている。接続部４２ｂは、培養槽４１の外側に配置された配管６４に接続可能である。

人工三次元組織を形成（培養）する前段階において、コネクタ４２Ｂの貫通孔（挿通孔）４２ｄには、流路形成部材４３が長さ方向に移動可能に挿通し培養空間４５に懸架されている。流路形成部材４３は、一例として外径が０．５ｍｍの軸状に形成されている。流路形成部材４３は、端部がコネクタ４２Ｂ（接続部４２ｂ）から突出する長さに形成されている。流路形成部材４３の一端には、流路電極７０の一端が連結されている。

図４は、流路形成部材４３を移動させた後の灌流デバイス４０断面図である。
図４に示すように、流路形成部材４３を長さ方向の他端側（図４中、左側）に移動させることにより、流路電極７０が培養空間４５に懸架される。

図３及び図４に示すように、配管６４には、測定部９０に接続される流路電極７０が挿通される挿通孔６５ａを有する挿通部６５と、流路電極７０が培養空間４５に懸架されたときに、図１に示したように、配管６３を介して培地が供給される供給孔６６ａを有する培地供給部６６とに分岐された二股構造になっている。

なお、図３及び図４においては、配管６４は、流路形成部材４３及び流路電極７０が懸架される対向するコネクタ４２の一方のみに接続されているが、実際には対向するコネクタ４２Ａ、４２Ｂの両方にそれぞれ接続されている。

係合部４２ｃは、装着部４２ｂの他端に設けられている。係合部４２ｃは、培養槽４１の培養空間４５に側壁４４と隙間をあけて配置されている。図５は、係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。図６は、図５におけるＡ−Ａ線視断面図である。図５および図６に示すように、係合部４２ｃは、装着部４２ａの外周面と隙間をあけて同軸で配置された第２筒部４２ｅと、装着部４２ａの周方向に間隔をあけて配置された複数のリブ部４２ｆとを備えている。リブ部４２ｆは、装着部４２ａの外周面と第２筒部４２ｅの内周面とを接続する。リブ部４２ｆは、９０度間隔で４つ設けられている。装着部４２ａ、第２筒部４２ｅおよびリブ部４２ｆで囲まれた隙間４２ｇは、係合部４２ｃを軸方向に貫通している。

図７は、測定部９０に流路電極７０及び組織電極８０が接続された図である。
図７に示すように、流路電極７０は、第１流路電極７１及び第２流路電極７２を有している。第１流路電極７１と第２流路電極７２とは、互いに撚り合わされた第１撚り線７３を形成している。組織電極８０は、第１組織電極８１及び第２組織電極８２を有している。第１組織電極８１と第２組織電極８２とは、互いに撚り合わされた第２撚り線８３を形成している。第１撚り線７３の最大外径は、流路形成部材４３の外径よりも小さく形成されている。

第１流路電極７１、第２流路電極７２、第１組織電極８１及び第２組織電極８２としては、Ａｇ、ＡｇＣｌ、白金、金、カーボン等で形成された金属線材を用いることができる。第１撚り線７３を構成する第１流路電極７１及び第２流路電極７２のうち、第２流路電極７２は、外周面が絶縁被覆されている。第２流路電極７２の端面は、金属線材が露出している。第２撚り線８３を構成する第１組織電極８１及び第２組織電極８２のうち、第２組織電極８２は、外周面が絶縁被覆されている。第２組織電極８２の端面は、金属線材が露出している。これにより、第１流路電極７１と第２流路電極７２との短絡、及び第１組織電極８１と第２組織電極８２との短絡を抑制できる。第２流路電極７２及び第２組織電極８２の外周面は、一例として、ポリパラキシリレン（以下、パリレンと称する）によって絶縁被覆されている。

（人工三次元組織）
次に、図８を参照して人工三次元組織について説明する。図８は、人工三次元組織１の概略的な構成図である。
図８に示すように、人工三次元組織１は、灌流流路１３を有する管状の管腔部１５と、管腔部１５の外側に配置された組織部１０とを含む。本実施形態における組織部１０は、細胞外マトリックス成分１１で形成されている。

細胞外マトリックス成分１１としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。

灌流流路１３は、培地が灌流する流路であり、組織部１０の内部を貫通し第１方向に延びている。管腔部１５は、灌流流路１３に臨む組織部１０の表面に血管系細胞１４を用いて形成されている。血管系細胞１４としては、例えば、内皮細胞を用いることができる。

血管系細胞としては、血管上皮細胞、血管内皮細胞等が挙げられ、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、 ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：HUAEC） 、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：HCAEC）、 ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：HSaVEC）、 ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：HPAEC）、 ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：HAoEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：HDMEC）、 ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：HDBEC）、 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：HDLEC）、 ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：HPMEC）、 ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：HCMEC）、 ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：HBdMEC）、 ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：HUtMEC）、ヒト脳微小血管内皮細胞等が挙げられる。

（人工三次元組織製造方法）
次に、人工三次元組織１の製造方法について、図９乃至図１２を参照して説明する。
本発明に係る人工三次元組織１の製造方法は、側壁４４に囲まれた培養空間４５を有する培養槽４１と、対向する側壁４４を貫いて培養空間４５に所定方向に沿って懸架された流路形成部材４３及び組織電極８０とを備えた灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス、デバイス）４０を準備することと、培養空間４５で細胞外マトリックス成分１１を培養して、流路形成部材４３及び組織電極８０が貫く組織部１０を形成することと、組織部１０から流路形成部材４３を抜去して組織部１０を貫通する灌流流路１３を形成することと、灌流流路１３に流路電極７０を配置することと、灌流流路１３に臨む組織部１０の表面に血管系細胞を播種して管腔部１５を形成することを含む。

以下、人工三次元組織の製造方法について詳細に説明する。
図９乃至図１２においては、適宜、灌流デバイス４０のみを図示し、培養皿５０、ポンプ６０等の図示を省略している。

（灌流デバイス４０の準備）
灌流デバイス４０の準備としては、図２及び図９に示すように、上記の培養槽４１の対向する側壁４４に貫通孔４２ｄが同軸となるようにコネクタ４２Ａ、４２Ｂを装着する。同軸となっているコネクタ４２Ｂの貫通孔４２ｄに流路形成部材４３を挿通し、コネクタ４２Ａの貫通孔４２ｄに組織電極８０を挿通し、培養空間４５に流路形成部材４３及び組織電極８０を懸架させる。

側壁４４へのコネクタ４２Ａ、４２Ｂの装着部の隙間、および底壁４６への底板４７の取付部の隙間をシールするために、シール材で培養空間４５に臨む培養槽４１の表面を被膜する。シール材としては、細胞外マトリックス成分１１に悪影響を与えない材料、一例として、ポリパラキシリレン（以下、パリレンと称する）が蒸着等の成膜方法により成膜される。シール材の膜厚としては、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／１００〜１／１０であることが好ましい。また、シール材の膜厚は、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／５０〜１／１０であることが好ましく、１／５０〜１／２０であることがより好ましい。本実施形態では、約５０μｍの隙間に対して２μｍの膜厚（１／２５）でシール材を成膜した。

コネクタ４２Ａ、４２Ｂのうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域に親液化処理を施す。親液化処理は、培養槽４１に装着する前にコネクタ４２Ａ、４２Ｂに実施してもよいし、側壁４４に装着したコネクタ４２Ａ、４２Ｂに対して実施してもよい。

（組織部１０の形成）
灌流デバイス４０の準備が完了すると、組織部１０を形成する。組織部１０の形成は、図９に示すように、細胞外マトリックス成分１１の溶液を培養槽４１の培養空間４５に注ぎ込む。細胞外マトリックス成分１１は、流路形成部材４３及び組織電極８０が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分１１としてコラーゲン、１０倍濃度のＰＢＳ及び細胞培養液の混合液を用いており、混合比は、９：１：５である。細胞培養液としては、例えば血管内皮細胞用の培養液であるEGMを用いる。また、混合比はコラーゲン溶液がゲル化される範囲であれば、必ずしも前記比率でなくともよい。

細胞外マトリックス成分１１が培養槽４１に注ぎ込まれると、所定条件で培養（インキュベーション）する。培養条件は、一例として、３７℃の温度下で３０〜６０分間行った。

培養によって細胞外マトリックス成分１１はゲル化する。細胞外マトリックス成分１１がゲル化して培養が完了することにより、内部を流路形成部材４３が貫く組織部１０が形成される。また、組織部１０においては、部分平面断面図である図１１に示されるように、流路形成部材４３と間隔をあけて平行に組織電極８０が貫いている。

なお、細胞外マトリックス成分１１に細胞が含まれている場合、さらに培養を継続することで細胞外マトリックス成分１１は収縮する。細胞外マトリックス成分１１は収縮時に係合部４２ｃに係合しているため、積層方向の収縮は拘束されないが、第１方向および第２方向の収縮は拘束される。より詳細には、図６に示されるように、細胞外マトリックス成分１１は、培養空間４５の中心とは逆側から係合部４２ｃの第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆに係合しているため、第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆが障壁となって中心側への収縮が抑制される。また、細胞外マトリックス成分１１が収縮する場合には、積層方向への収縮により、第２筒部４２ｅの外周面、装着部４２ａの先端側の外周面に圧着されることになる。従って、細胞外マトリックス成分１１と係合部４２ｃとの間の摩擦力が大きくなり、第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。特に、本実施形態では、係合部４２ｃが細胞外マトリックス成分１１に対する親液化処理が施されているため、細胞外マトリックス成分１１は、より大きな密着力で係合部４２ｃに密着し第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。従って、細胞が含まれている場合等、細胞外マトリックス成分１１が収縮する条件で培養を行っても、細胞外マトリックス成分１１を安定して支持できる。

（灌流流路１３および管腔部１５の形成）
次に、コネクタ４２Ｂに支持されている流路形成部材４３を抜去する。具体的には、流路電極７０が連結された一端側とは逆側（図１０中。左側）に流路形成部材４３を移動させる。流路形成部材４３が他端側へ移動することにより、組織部１０には流路形成部材４３の外径に応じた直径で直線状に延びる空洞である灌流流路１３が形成される。このとき、組織部１０は、両端部において係合部４２ｃに係合しているため、流路形成部材４３の抜去時にコネクタ４２Ｂから脱離することなく安定してコネクタ４２Ｂに支持される。

また、流路形成部材４３が他端側へ移動することにより、灌流流路１３には、図１２に示すように、流路形成部材４３の一端側に連結された流路電極７０が挿通される。また、流路形成部材４３に連結されていた流路電極７０の一端側は、流路形成部材４３と切り離されて、例えば、コネクタ４２Ｂの貫通孔４２ｄに配置される。

組織電極８０における第２組織電極８２は、絶縁被覆されているが、端面が露出しているため、組織部（コラーゲン）１０と接触した状態となる。また、流路電極７０における第２流路電極７２は、絶縁被覆されているが、流路形成部材４３と切り離された端面が露出し、灌流流路１３と連通する貫通孔４２ｄに配置される。

次に、図１２に示すように、コネクタ４２Ｂの貫通孔４２ｄを介して、灌流流路１３に臨む組織部１０の表面に血管系細胞１４として上述したHUVECを注入（播種）し、一例として、３７℃、５％のＣＯ_２雰囲気下で一定時間培養することにより、管腔部１５を形成する。血管系細胞１４の培養時には、図１に示したフィルター６２の下流の配管６３の端部を、培養槽４１の外側に配置された配管６４における培地供給部６６と接続する。また、培地排出側の配管６４については、ポンプ６０に導入される側の配管６３の端部を接続する。

そして、図１に示したポンプ６０を駆動することにより、培地リザーバー６１に貯留された培地Ｍは、フィルター６２を経た後に灌流流路１３に供給される。また、灌流流路１３から排出された培地Ｍは、配管６３に戻されフィルター６２で異物等を除去された後に灌流流路１３に供給されて循環する。使用された培地Ｍは、管腔部１５が、例えば、７０〜９０％に集密するまで２〜３日毎に交換する。これにより、灌流流路１３は、管腔部１５に囲まれた状態となり、管腔部１５の外側に組織部１０が配置された人工三次元組織１が形成される。

（バリア機能測定）
次に、形成された人工三次元組織１のバリア機能を測定する方法について、図１３を参照して説明する。

上述したように、組織電極８０における第１組織電極８１は、露出した状態で組織部１０に配置され、流路電極７０における第１流路電極７１は、灌流流路１３及び培地Ｍ内に露出した状態で配置されている。測定部９０は、灌流流路１３に培地Ｍが灌流する状態で第１組織電極８１及び第１流路電極７１を介して電流値を測定する。

また、組織電極８０における第２組織電極８２は、露出した端面が貫通孔４２ｄに配置され組織部１０と接触し、流路電極７０における第２流路電極７２は、露出した端面が貫通孔４２ｄに配置され培地Ｍと接触している。測定部９０は、灌流流路１３に培地Ｍが灌流する状態で第２組織電極８２及び第２流路電極７２を介して電圧値を測定する。測定部９０における内部インピーダンスは、管腔部１５の電気抵抗（経内皮抵抗）と比較して十分に大きな内部インピーダンスを有している。

そして、測定部９０は、第１組織電極８１及び第１流路電極７１を介して測定した電流値と、第２組織電極８２及び第２流路電極７２を介して測定した電圧値とを用いた４端子法により、組織部１０と灌流流路１３における培地Ｍとの間の電気抵抗値（経内皮抵抗値）を測定する。

例えば、第１組織電極８１及び第１流路電極７１を介して２端子法で電気抵抗値を測定した場合は、電極自体の抵抗及び組織部１０、培地Ｍとの接触抵抗による電圧降下が誤差として含まれる電気抵抗値を測定することになる。これに対して、測定部９０における内部インピーダンスが大きいことから、第２組織電極８２及び第２流路電極７２にはほとんど電流が流れない。そのため、電極自体の抵抗及び組織部１０、培地Ｍとの接触抵抗による電圧降下の影響を受けることなく高精度に電圧値を測定可能になる。

図１３は、上記の人工三次元組織１において、血管系細胞１４を注入（播種）し、ほぼ一日経過後から培地の灌流を実施して培養した場合（perfused）と、培地の灌流を実施しないで培養した場合（non-perfused）の、培養時間と経内皮電気抵抗（TEER）との関係を示す図である。

図１３に示されるように、血管系細胞１４を播種後、培地の灌流を開始するまで経内皮電気抵抗が上昇した。これは、血管系細胞１４が増加して、灌流流路１３に臨む組織部１０の表面を覆ったためと考えられ、観察結果と一致する。

そして、播種後、一日経過した後には、培地の灌流の有無により経内皮電気抵抗に差が生じた。これは、培養時に培地の灌流による栄養供給と、非灌流による栄養供給遮断との差により、血管系細胞１４の成長状態の差に応じて生じたと考えられる。
すなわち、本実施形態では、管腔部１５における血管系細胞１４の成長状態の差に伴って生じる経内皮電気抵抗の差を測定できることを確認できた。

（評価方法）
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の人工三次元組織１を用いた薬剤の組織部１０に対する刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の組織部１０に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。

本発明の評価方法は、例えば、薬剤を人工三次元組織１と接触させること、及び、薬剤の接触による刺激に対する応答を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、経皮電気抵抗を測定すること等によって行うことができる。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及び有機化合物等が挙げられる。

また、上記のバリア機能測定システム１００及びバリア機能測定方法を用いることにより、薬剤を管腔部（血管）１５内に流動させたときに組織部１０に透過する量を測定するに際して、人工三次元組織１における経内皮電気抵抗を生体における経内皮電気抵抗に対して評価することができる。あるいは、上記のバリア機能測定システム１００及びバリア機能測定方法を用いることにより、管腔部（血管）１５のバリア機能に影響を与える薬剤を管腔部１５に流動させた際にバリア機能の変動を測定することができる。
また、上記のバリア機能測定方法を用いることにより、バリア機能測定システム１００における管腔部においてバリア機能が十分に構築されているかどうかバリデートすることができる。

以上説明したように、本実施形態では、管状の管腔部１５の外側に組織部１０が配置された人工三次元組織１を用いて経内皮抵抗値及びバリア機能の指標を測定しているため、二次元的に配置された組織を用いて電気抵抗値を測定した場合のように、培地の流れが不均一になることで、得られた経内皮抵抗値の信頼性が低下することを抑制できる。そのため、本実施形態のバリア機能測定システム１００及び測定方法では、信頼性が高い経内皮電気抵抗が得られ、バリア機能を高い信頼性で評価することが可能となる。

また、本実施形態では、経内皮抵抗値を測定する際に、第１流路電極７１、第２流路電極７２、第１組織電極８１及び第２組織電極８２の４つの電極を用いた４端子測定を行っているため、電極自体の抵抗及び組織部１０、培地Ｍとの接触抵抗の影響を抑えることができ、より高精度、高信頼性で経内皮抵抗値の測定及びバリア機能の評価が可能となる。

さらに、本実施形態では、流路電極７０を構成する第１流路電極７１及び第２流路電極７２が第１撚り線７３を形成し、組織電極８０を構成する第１組織電極８１及び第２組織電極８２が第２撚り線８３を形成しているため、流路電極７０のハンドリング性及び組織電極８０のハンドリング性が向上し、バリア機能を評価の指標する際の作業性が向上する。また、第１撚り線７３を形成する第２流路電極７２の外周面及び第２撚り線８３を形成する第２組織電極８２の外周面に絶縁被覆を施しているため、第１撚り線７３及び第２撚り線８３のそれぞれで電極同士が短絡することを防止することができる。

加えて、本実施形態では、流路形成部材４３の一端側に流路電極７０を連結しているため、流路形成部材４３を他端側に抜去することにより、流路電極７０を容易に灌流流路１３に配置することができる。また、本実施形態では、コネクタ４２Ｂに装着される配管６４が、流路電極７０が挿通される挿通孔６５ａと培地が供給される供給孔６６ａとを有しているため、測定部９０に接続された状態の流路電極７０が配置された灌流流路１３への培地供給を容易に実施することが可能である。

また、本実施形態では、コネクタ４２Ａ、４２Ｂが設けられた側壁４４に対向する面を有する係合部４２ｃに細胞外マトリックス成分１１が係合することにより、細胞外マトリックス成分１１の収縮を抑えながら組織部１０を形成するため、細胞外マトリックス成分１１の収縮が大きい場合でも、灌流流路１３を保持することで、高品質の人工三次元組織１を安定して製造することが可能である。

以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。

例えば、上記実施形態では、血管系細胞１４を培養して管腔部（血管）１５を形成する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、食道、腸等の管腔臓器系の細胞を培養して管腔部１５を形成してもよい。

また、上記実施形態では、細胞外マトリックス成分１１を培養して組織部１０を形成する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、神経細胞、脳血管内皮細胞、星状膠細胞、血管周皮細胞を含む細胞外マトリックス成分１１を培養して組織部を形成してもよい。この場合には、上記のバリア機能測定システム１００を用いて経内皮電気抵抗を測定することにより、血液脳関門透過性を評価することが可能になる。
ヒトの脳から細胞を採取することは困難であるから、血液脳関門モデルを構築する際に必要な細胞は、ｉＰＳ細胞から分化させた細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞へ初期化する際に用いられる細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、血液細胞、線維芽細胞等が挙げられる。

また、神経系細胞の他に、線維芽細胞、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織であってもよい。さらに、肝細胞を用いた肝臓組織、膵臓系細胞を用いた膵臓組織であってもよい。このような組織に本発明を適用する場合には、上記実施形態で用いた細胞外マトリクスは必ずしも存在していなくてもよく、各種細胞のみを集積したものであってもよい。

また、上記実施形態では、４端子測定にて経内皮電気抵抗を測定する構成を例示したが、この構成に限定されず２端子測定で経内皮電気抵抗を測定する構成であってもよい。２端子測定を実施する場合は、電極自体の抵抗及び組織部１０、培地Ｍとの接触抵抗を補正値として実験やシミュレーション等により予め求めておき、測定された経内皮電気抵抗を上記の補正値で補正すればよい。

また、上記実施形態では、第１流路電極７１及び第２流路電極７２が第１撚り線７３を形成し、組織電極８０を構成する第１組織電極８１及び第２組織電極８２が第２撚り線８３を形成する構成を例示したが、この構成に限定されず、互いに間隔をあけて配置されている構成であってもよい。

また、上記実施形態で示した電圧参照極である第２流路電極７２及び第２組織電極８２が配置された位置、すなわち、第２流路電極７２及び第２組織電極８２の露出した各端面が配置される位置（測定位置）は一例であり、第２流路電極７２の測定位置は灌流流路１３のどの位置でもよく、第２組織電極８２の測定位置は組織部１０のどの位置であってもよい。

また、上記実施形態では、流路形成部材４３の一端に流路電極７０を連結し、流路形成部材４３を他端側に移動させることにより、流路電極７０を灌流流路１３に引き込む構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、筒状の流路形成部材４３の内部空間に流路電極７０を挿通し、流路形成部材４３を抜去したときに流路電極７０が灌流流路１３に露出する構成であってもよい。

また、上記実施形態では、管腔部１５が直線状に形成される構成を例示したが、途中で分岐するＹ字状に形成される構成であってもよい。この場合、流路形成部材４３は、側壁４４の一方と直交する基部と、基部の一端から分岐して側壁４４の他方に延び、基部に対して分離可能な二つの分岐部とからなる構成とし、基部を側壁４４の一方側に移動させ、分岐部を側壁４４の他方側に移動させることにより、Ｙ字状の灌流流路１３を形成することができる。この構成を採る場合には、基部及び分岐部を上述したように、それぞれ筒状に形成し、基部及び分岐部の内部空間に流路電極７０を挿通すればよい。

本発明によれば、高い信頼性で経内皮電気抵抗の測定及びバリア機能の評価が可能となる人工三次元組織のバリア機能測定システム、人工三次元組織のバリア機能測定方法及び人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供できる。このため、本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。

１…人工三次元組織、 １０…組織部、 １１…細胞外マトリックス成分、 １３…灌流流路、 １４…血管系細胞、 １５…管腔部、 ４０…灌流デバイス（デバイス）、 ４１…培養槽、 ４２…コネクタ（支持部）、 ４２Ａ…コネクタ（第１支持部）、 ４２Ｂコネクタ（第２支持部）、 ４２ｃ…係合部、 ４２ｄ…貫通孔（挿通孔）、 ４３…流路形成部材、 ４４…側壁、 ４５…培養空間、 ６０…ポンプ（供給装置）、 ７０…流路電極、 ７１…第１流路電極、 ７２…第２流路電極、 ８０…組織電極、 ８１…第１組織電極、 ８２…第２組織電極、 ９０…測定部、 １００…バリア機能測定システム、 Ｍ…培地

Claims (20)

1. 所定方向に延びる灌流流路を有する管腔部と、
   前記管腔部の外側に配置された組織部と、
   前記灌流流路に培地を供給する供給装置と、
   前記灌流流路に配置された流路電極と、
   前記組織部に配置された組織電極と、
   前記流路電極及び前記組織電極を介して経内皮電気抵抗を測定する測定装置と、
   を備えることを特徴とする人工三次元組織のバリア機能測定システム。
2. 前記流路電極は、前記灌流流路に配置された第１流路電極及び第２流路電極を有し、
   前記組織電極は、前記組織部に配置された第１組織電極及び第２組織電極を有し、
   前記測定装置は、前記第１流路電極及び前記第１組織電極を介して測定された電流値と、前記第２流路電極及び前記第２組織電極を介して測定された電圧値とに基づいて前記経内皮電気抵抗を測定することを特徴とする請求項１記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
3. 前記第１流路電極と外周面を絶縁被覆された前記第２流路電極とは、互いに撚り合わされた第１撚り線を形成し、
   前記第１組織電極と外周面を絶縁被覆された前記第２組織電極とは、互いに撚り合わされた第２撚り線を形成することを特徴とする請求項２記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
4. 前記人工三次元組織を培養するデバイスを備え、
   前記デバイスは、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、
   対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される前記組織電極を支持する第１支持部と、
   対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される軸状の流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する第２支持部とを有し、
   前記人工三次元組織から前記流路形成部材が抜去された空間に前記灌流流路が形成されるとともに、前記流路電極が配置されていることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
5. 前記流路形成部材の一端に前記流路電極の一端が連結され、
   前記流路形成部材を他端側に抜去した際に前記流路電極が前記灌流流路に配置されることを特徴とする請求項４記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
6. 前記第１支持部及び前記第２支持部は、前記人工三次元組織に係合して前記人工三次元組織の前記所定方向への収縮を抑える係合部をそれぞれ有することを特徴とする請求項４または５記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
7. 前記第２支持部は、前記流路形成部材及び前記流路電極が挿通される挿通孔を有し、
   前記供給装置は、前記挿通孔を介して前記灌流流路に培地を供給することを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
8. 前記管腔部は、血管系細胞を用いて形成されていることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
9. 前記組織部は、細胞外マトリックス成分を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
10. 前記組織部は、神経系細胞を含むことを特徴とする請求項９記載の人工三次元組織のバリア機能測定システム。
11. 所定方向に延びる灌流流路を有する管腔部と、前記管腔部の外側に配置された組織部と、を有する人工三次元組織を形成することと、
    前記灌流流路に培地を供給することと、
    前記灌流流路に配置した流路電極及び前記組織部に配置した組織電極を介して経内皮電気抵抗を測定することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織のバリア機能測定方法。
12. 前記流路電極は、前記灌流流路に配置された第１流路電極及び第２流路電極を有し、
    前記組織電極は、前記組織部に配置された第１組織電極及び第２組織電極を有し、
    前記経内皮電気抵抗を測定することは、前記第１流路電極及び前記第１組織電極を介して測定された電流値と、前記第２流路電極及び前記第２組織電極を介して測定された電圧値とに基づいて前記経内皮電気抵抗を測定することを特徴とする請求項１１記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
13. 前記第１流路電極と外周面を絶縁被覆された前記第２流路電極とは、互いに撚り合わされた第１撚り線を形成し、
    前記第１組織電極と外周面を絶縁被覆された前記第２組織電極とは、互いに撚り合わされた第２撚り線を形成することを特徴とする請求項１２記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
14. 側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された軸状の流路形成部材及び前記組織電極とを備えたデバイスを準備することと、
    前記培養空間で細胞を培養して、前記流路形成部材及び前記組織電極が貫く前記組織部を形成することと、
    前記人工三次元組織から前記流路形成部材を抜去して前記人工三次元組織を貫通する前記灌流流路を形成することと、
    前記灌流流路に前記流路電極を配置することと、
    前記灌流流路に臨む前記組織部の表面に血管系細胞を播種して前記管腔部を形成することと、を含むことを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
15. 前記デバイスは、前記所定方向に沿って懸架される前記組織電極を支持する第１支持部と、前記所定方向に沿って懸架される前記流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する第２支持部とを有し、
    前記第１支持部及び前記第２支持部にそれぞれ設けた係合部に、前記人工三次元組織の一部を係合させて前記所定方向への収縮を抑えながら前記組織部を形成することを特徴とする請求項１４記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
16. 前記第２支持部は、前記流路形成部材及び前記流路電極が挿通される挿通孔を有し、
    前記灌流流路に培地を供給することは、前記挿通孔を介して前記灌流流路に培地を供給することを特徴とする請求項１５記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
17. 前記灌流流路に前記流路電極を配置することは、一端に前記流路電極の一端が連結された前記流路形成部材を他端側に抜去することにより、前記流路電極を前記灌流流路に配置することを含むことを特徴とする請求項１４から１６のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
18. 前記組織部は、細胞外マトリックス成分を含むことを特徴とする請求項１１から１７のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
19. 前記組織部は、神経系細胞を含むことを特徴とする請求項１１から１８のいずれか一項に記載の人工三次元組織のバリア機能測定方法。
20. 請求項１１から１９のいずれか一項に記載の測定方法で人工三次元組織のバリア機能を測定することと、
    薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、
    前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を測定することと、
    を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法。

Images