JP2010539938A - 灌流可能な微小血管システムを作製するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2006年3月24日に出願されたNeumannの米国出願第11/388,920号の一部継続出願である「灌流可能な微小血管システムを作製するための方法」という表題の、2007年9月24日に出願されたNeumannの同時係属米国出願第11/860,471号の優先権を主張し、その一部継続出願である。Neumannの米国出願第11/388,920号および米国出願第11/860,471号は参照により本明細書に組み込まれている。
生体組織の不透明性を回避するために、研究者らは両生類幼虫の天然に透明な尾部を含む生きた動物の「窓」(ClarkとClark、1939)、あるいはウサギの耳(ClarkとClark、1939)、マウスの皮膚(Algire、Chalkleyら、1945)もしくはハムスターの頬袋(GreenblattとShubi、1968)に植え込まれた、またはウサギの角膜ポケット(Gimbrone、Cotranら、1974)もしくはニワトリ絨毛尿膜(Ausprunk、Knightonら、1974)から開発された特殊な観察室を通じて血管新生を観察してきた。これらの初期の大部分が記述的な研究により、腫瘍誘導血管走化性の中核的パラダイムが確証され、これに対応して血管増殖を促進する拡散性腫瘍由来分子が発見された。より最近のインビボでの血管新生のアッセイでは、げっ歯類の皮下に植え込まれたゲル状基底膜タンパク質からなる重合体のスポンジまたはプラグへの血管の内部成長が測定される(Passaniti、Taylorら、1992; Andrade、Machadoら、1997; Akhtar、Dickersonら、2002; Koike、Vernonら、2003)。その正確さの一方で、インビボでのアプローチは、(1)動物による血管新生応答の種内変動;(2)ある種から別の種への結果の移行の欠如;(3)動物の購入および維持の高コスト;(4)研究目的のための動物使用に対する国民の不支持;および(5)動物手術ならびに結果の視覚化および評価において直面する複雑さによって困難になる。
血管新生の分子動態を理解することを目指して、大血管から単離した内皮細胞が、血管の内膜をシミュレートするコンフルエントな舗道様単層を形成するまで平皿で培養された(Jaffe、Nachmanら、1973; Gimbrone 1976)。これは大血管中の内皮障害に対する増殖応答のモデルとしては有用であるが(Gimbrone、Cotranら、1974; Fishman、Ryanら、1975; MadriとStenn 1982; MadriとPratt 1986; Jozaki,Maruchaら、1990; Rosen、Meromskyら、1990)、硬い基層上での内皮細胞の血管新生のシミュレーションでは、ほとんどの場合、単層培養物が毛細血管様の管に組織化されることはない。しかし、1980年、毛細血管内皮細胞の長期培養の成功に続いて(Folkman、Haudenschildら、1979)、ウシまたはヒト毛細血管内皮細胞の20〜40日培養物がコンフルエント細胞単層上に2D細胞ネットワークを発生させたこと(これは「インビトロ血管新生」と呼ばれるプロセスである)が報告された。(Folkman、Haudenschildら、 1980)。このネットワークを構成する内皮細胞は、原繊維/アモルファス物質で充填された「内腔」を持つ「管」のようであった。これは、内生的に合成された、その上に細胞が組織化する「マンドレル」のネットワークであると解釈された。その後の研究により、大血管由来の内皮細胞による(Maciag、Kadishら、1982; Madri 1982; Fader、Marasaら、1983)および基底膜タンパク質の展性水和ゲル(たとえば、Matrigel(登録商標)ゲル)上に播種された内皮細胞による(Kubota、Kleinmanら、1988)類似の2Dネットワーク形成が報告された。
1.浸潤:2Dモデルの内皮細胞は細胞外マトリックス上にネットワークを形成し、細胞外マトリックスに潜り込む傾向をほとんど示さない(Vernon、Angelloら、1992; Vernon、Laraら、1995)。
2.方向性:2Dモデルでは、内皮細胞のネットワークは、予め位置決めした細胞のフィールド全体でほぼ同時にインビトロで形成されるが、インビボでの血管新生は、複数レベルの枝分かれにより分岐するフィラメント状の芽による細胞外マトリックスの方向性を伴う浸潤を伴う。
3.正しい極性:2Dモデルは、毛細管に著しく類似する単細胞管を作る(Maciag、Kadishら、1982; Feder、Marasaら、1983; SageとVernon 1994)が、その極性は「裏返し」になっている、すなわち、2Dモデルは基底層物質をその内腔面に沈着させ、その血栓形成表面を周囲の培地に外側に向けており(Maciag、Kadishら、1982; Feder、Marasaら、1983)、これはインビボでの状況とは正反対である。
4.内腔形成:2Dモデルが中空状の内腔をもつ内皮細胞(EC)管を生み出している証拠は弱い。典型的に、2Dモデルで得られる内皮細胞管は(外因性であれ細胞により合成されようと)細胞外マトリックスで充填されている「内腔」空間を有する(Maciag、Kadishら、1982; Madri 1982; Feder、Marasaら、1983; SageとVernon 1994; Vernon、Laraら、1995)。また、中空状の内腔が形成されたとしても、通常、内皮細胞細胞質の厚い壁に隣接する細隙状のまたは狭い円筒空間のようになっており、インビボで形成された毛細管(内皮細胞の薄い壁を持った膨らんだ管状である)とは全く異なっている。
5.細胞特異性:2Dモデルでの細胞ネットワークは、非EC細胞型により実現されることがある機械的プロセスにより生み出される(Vernon、Angelloら、1992; Vernon、Laraら、1995)。実際、数学モデリングによれば、張力を展性のある2D細胞外マトリックス(内因的に合成されるものでも、供給される(たとえば、Matrigel(登録商標)ゲル)ものでも)に適用することができるどんな接着細胞型も最適条件下でネットワークを生み出すことができることが明らかにされている(Manoussaki、Lubkinら、1996)、
である。
インビボでの血管新生が3D細胞外マトリックス内で起こることが認識されたことにより、出芽をインビトロでの細胞外マトリックスの3Dゲル内で誘導する種々のモデルが作られてきた。初期の3Dモデルでは、コラーゲンゲル内に分散された内皮細胞(Montesano、Orciら、1983)が索および管のネットワークを形成した(ElsdaleとBard 1972)。その内皮細胞管は正しい極性を示したが、浸潤および方向性という特徴が欠けていた(内皮細胞は細胞外マトリックス中に予め埋め込まれ、均一に分散されていた)。それにもかかわらず、このアプローチは、内腔形成について(DavisとCamarillo 1996)および増殖因子に対する内皮細胞の応答について(Madri、Prattら、1988; Merwin、Andersonら、1990; KuzuyaとKinsella 1994; Marx、Perlmutterら、1994; DavisとCamarillo 1996)の研究では有用であることが判明していた。
図2A、図2B、図2Cおよび図2Dには、既知の熱収縮工程の例となる概略図が示されている。図2Aに具体的に示されるように、それぞれの培養/灌流装置(CPD)は、支持フレーム12により保持される1つまたは複数のマンドレル2を含んでいてもよい。目的の血管内径の径のマンドレル2が、その両末端を医療グレード収縮管セグメント4にぴったり入れて収まっている。マンドレル2は、得ようとする血管の大きさにより数マイクロメートルから数ミリメートルまでの径を有する、生体適合性繊維(たとえば、高分子、ガラス、ワイヤーまたは同等物)を含んでいてもよい。一例では、光ファイバーを含む微小毛細管をマンドレルとして用いた。
図3Aには、いくつかのマンドレル/収縮管集合体11の灌流のための既知の装置が示されている。フレーム20は、ポリカーボネートまたは同等の材料を圧延することが好ましい。分配チャンバー30が装置の構造に含まれてもよく、これにより多くのバイオ人工血管の同時灌流が可能になる。マンドレル2を含む一組の糸の末端はシリコン管23に集められる。
図3Bには、取付け培養/灌流装置の製造法で使用される新規な構造が図式的に示されている。単一の血管の場合、CPD70は、2枚のレーザー切断Mylar(登録商標)フレーム22間に熱収縮管に保持されたマンドレル2を挟むことにより作製することができる。下に詳述される通りに構築された円筒状エポキシ樹脂多岐管21を、マンドレル/収縮管集合体11を保持するために使用することができる。
図5A、図5Bおよび図5Cには、微細加工された培養/灌流装置の別の構造が図式的に示されている。図5Aは、スリーブ56を有しているフレーム中の小穿孔54を通じて取り込まれる一組のマンドレル2を示している。ここでは、スリーブが収縮管の代わりになる。図5Bは、フレーム壁52中にはめ込まれた一組のマンドレル2を含む細胞播種前のCPDを示している。
図6には、細胞播種法が図式的に示されている。細胞播種のためのCPD70を準備するために、CPD70は先ず洗浄され、次に紫外線殺菌される。無菌条件下で、CPDは表面、たとえば、ペトリ皿72の底に固定される。次に、CPDフレーム集合体70の内部ウィンドウ76(図3Bに示されている)をラミニン1などの接着タンパク質および同等物を含有する溶液で満たす。1つまたは複数のスペーサー77を必要に応じて使用してもよい。インキュベーションの後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に、培養液中の目的の細胞型(たとえば、平滑筋細胞、内皮細胞、およびいくつかの場合には、周皮細胞、および線維芽細胞、または幹細胞を含む前駆細胞型)の懸濁液をCPD70のウィンドウ76に移す。
培養装置を先ず洗浄し、次に30分間、両側から紫外線暴露により無菌化する。無菌条件下で、装置を無菌条片でペトリ皿の底に固定する。
次に、装置の内部ウィンドウをラミニン1の接着タンパク質溶液で満たす。フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸モチーフ(RGD)タンパク質、RGDペプチド、ゼラチン、コラーゲン、異なるコラーゲンサブタイプおよび同等物などの他の接着タンパク質も使用してよい。
一晩インキュベーション後、接着タンパク質含有溶液を取り除き、次に培養液中のヒト血管内皮細胞の懸濁液を装置のウィンドウに移す。
次に、ペトリ皿を逆さまにひっくり返し、このようにして装置のウィンドウに細胞培養懸濁液の懸滴を作り出す。細胞培養インキュベーター中(5%CO2、37℃)での45分間のインキュベーション時間後、多数の細胞が装置内のマンドレル/収縮管集合体に付着することになる。
次に、ペトリ皿の上下をもとに戻し、装置が沈むまでヒト血管内皮細胞用の増殖培養液で満たす。
マンドレルに結合していない細胞は浮き上がり、吸引して破棄することができる。
次に、ペトリ皿をインキュベーター中(5%CO2、37℃)に入れる。マンドレルに付着した細胞は広がり増殖し、ヒト血管内皮細胞の同心円状の単層を形成する。
次に、培養液をペトリ皿から取り除く。コラーゲン溶液を培養装置のウィンドウに満たし、固化させ、このようにして細胞層が結合したマンドレルを埋め込む。
ヒト血管内皮細胞がコラーゲンゲル中に芽を形成することになる。次に、マンドレルをゆっくり引き抜き、後にヒト血管内皮細胞の灌流可能な「親」微小血管が残る。
次に、装置の多岐管は灌流システムに繋がれ、ヒト血管内皮細胞増殖培養液で灌流される。
CPDは、灌流システムに貫流様式でまたは循環様式のいずれで繋いでもよい。貫流配置は、重力フローシステム、または市販のもしくは特注の注射器ポンプを付けて作製してよい。注射器は灌流培養液で満たし、注射器ポンプに取り付け、ガス気密管を介してCPDの上流末端に繋がれる。CPDは無菌条件下でインキュベーターに保存してもよいし、無菌細胞培養環境をCPD内に確立してもよい。CPDの下流多岐管は、灌流液を回収する末端貯蔵容器に繋がれる。循環システムを、蠕動ポンプを使用することにより作製してもよい。貫流システムにも循環システムにもガス交換用の装置を取り付けてよい。ガス濃度、灌流圧、流量、温度、ならびに栄養分および代謝副産物の濃度は、センサーで測定する。集めたデータはフィードバックループに送って、目的のパラメータの厳格な制御を可能にしてもよい。
血管新生関連研究のためのモデル
図7には、2つのバイオ人工親血管200、202間の微小血管ネットワークの概略図を示している。液体灌流液204は、「静脈」親血管202への流量(f)を減少し、「動脈」親血管200での抵抗(R)を増加することにより毛細管206を通して経路を変更される。したがって、灌流液204は圧力の高い血管から圧力の低い血管へと送られ、動脈末端から毛細血管床の静脈末端への自然な血流を模擬する。たとえば、一実施形態では、両方の親血管は同一速度で灌流され、出口での抵抗は同一に維持される。第1血管への流量が増加され、同時に第2の血管への流量が減少されれば、灌流液は第1血管から第2血管へ経路を変更されると考えられる。他の実施形態において経路変更をさらに促進するためには、第1血管の下流末端での抵抗を増加させ、第2血管では減少させることができるであろう。これは、背圧を上げるまたは下げることにより実施できるであろう。別の実施形態では、第1血管の下流末端および第2血管の上流末端を完全に閉鎖すれば、灌流液は第1血管に入って、続けて微小血管ネットワークを通って第2血管に入り、第2微小血管の下流末端を通って親血管を離れることになるであろう。
冠動脈代用物の作製のために、内径がほぼ4mmから5.5mmの血管管腔を有する冠動脈代用物を生じるように外径が選択されたマンドレル。代わりに、マンドレルは、灌流され、冠動脈代用物の増殖期間中に栄養素とガスの交換を可能にするくらいの透過性のある中空管でもよい。冠動脈代用物は、平滑筋細胞のみから血管中の中間層に類似する構造物を増殖するか、または、2つもしくは3つの細胞型から複合構造物として作製されてもよい。
本明細書に開示するCPD法を使用して、冠動脈以外の径と種類の血管を作製してもよい。マンドレルの径を変えれば、血管の径も変わることになる。いくつかの場合、マンドレルは、比較的細い血管のサイズに近似する約20ミクロンから約500ミクロンまでが可能である。他の場合には、マンドレルは、中型から比較的大きな血管までに近似する約200ミクロンから約5.5mmまででもよい。血管の種類(たとえば、動脈、静脈、リンパ管)は、細胞の表現型、および/または細胞の増殖が阻害される時点によって変えることができる。たとえば、静脈は薄い平滑筋細胞のみからなる層を含有する。
本明細書に開示するCPD法は、胆管、涙管、耳管、卵管、輸精管、尿管、尿道、肺気道、等などの他の管状組織の工学のために使用してもよい。本明細書に開示するCPD法は、神経増殖および修復の誘導のための、グリア細胞を含む様々な細胞型からの神経導管の作製にも有用であることを示している。
本明細書に開示するCPD法は、取り外し可能なマンドレルの列をスカフォールドとして使用することにより、組織および器官の工学のために使用してもよい。目的の組織/器官(筋肉、肝臓、腎臓、肺、皮膚、等)の細胞は、接着タンパク質被膜マンドレル上に播種される。これらのマンドレルは、固形線維もしくはワイヤーから、または、代わりにセルロースなどの灌流可能な透過性管から作製してもよい。マンドレルは、単一の細胞スリーブを合併させる正確な間隙をおいて互いに分離される。この方法を使用して、シート状またはブロック状の組織を形成してもよい。次に、マンドレルを同時に引き抜き(または、別々に取り除き)、灌流システムを用いてバイオ人工組織の内部を灌流する。
あらかじめ製造したバイオ人工血管システムを使用して、糖尿病患者の慢性潰瘍のためなどの創傷治癒に役立ててもよい。バイオ人工微小血管ネットワークを(たとえば、血管新生増殖因子で強化された細胞外マトリックスゲルから)パッチ状の支持材料に埋め込み、創傷上に置くことができる。酸素添加栄養溶液を自律的に灌流すれば、バイオ人工血管はドナーの脈管構造および皮膚の出芽を促進すると考えられる。代わりに、そのようなバイオ人工血管パッチを創傷と植皮間に挟み込めば、移植片の内部成長を促進することができると考えられる。
バイオ人工血管は、植込み式薬剤送達装置に使用することができると考えられる。細胞は、患者から採取して、インビトロで遺伝子改変すれば、ある種のタンパク質(ホルモン、酵素、等)を産生することができると考えられる。次に、これらの細胞を、上述の方法を使用して、バイオ人工血管または血管網に増殖させてもよい。宿主に再移植すれば、細胞は標的物質を産生し、局所的にまたは全身的にその物質を放出し続ける。
上記したような組織工学による血管網は、組織の作製または全臓器の作製のためにも使用してよい。1つの方法としては、1つまたは複数のインビトロ灌流親血管を作製することがある。目的の組織または器官由来の実質細胞を、たとえば、ゲル中の親血管の周囲に播種する。異なった間質細胞型(たとえば、免疫細胞、炎症細胞、周皮細胞、線維芽細胞、または内皮細胞)も同様に添加することができる。実質細胞は、親血管を介して栄養分と酸素を供給される。実質細胞の増殖は栄養分と酸素に対する要求を増加する。細胞は血管新生因子を放出し、血管を出芽するように刺激する。組織が成長するに従って、血管系は、同一速度で出芽する。これは自然増殖にきわめて類似している。したがって、このシステムは発生生物学の研究のための優れたモデルにもなると考えられる。
図8aには、平滑筋細胞を播種した後の複数のマンドレルの例のインビトロ画像が示されている。複数のマンドレルと収縮管ユニットMは、Mylar(登録商標)フレームに挟み込んだ。マンドレルM間の距離はほぼ100μmに調整した。収縮管セグメントの末端は、1つの上流多岐管と1つの下流多岐管に結合させた(示されていない)。Mylarフレームは無菌化し、ラミニンでコーティングし、5×106ラット大動脈平滑筋細胞SM(RASMC)/mlの懸濁液を播種した。細胞SMは、個々のマンドレルMのそれぞれに付着し、増殖して環状層を形成した。10日後には、個々の層は合併し、1つの厚いシート状のまたはプレート状の平滑筋細胞を生じた。増殖培養液中にさらに7日間置いた後、培養液に50U/mlヘパリンを補充して、さらに7日間置いた。その後、マンドレルをすべて引き抜き、組織を10ml/日の速度でヘパリン培養液で灌流した。灌流チャンバーは、ヘパリン培養液で満たした100mmペトリ皿の底に固定したままにした。SMCプレートは11日間灌流した。期間中、チャネルCHは機能的な状態のままであり、インビトロではっきりと目に見えた(図8bにもっともよく示されている)。
図12には、コラーゲンマトリックス内のチャネルに播種することにより親細胞を作製するための別の方法が示されている。シリコーン層を使用したCPDの一例は記載済みなので、当業者による本開示の理解を促進するために、微小血管システムを作製するための適用の具体例をここで記載することにする。
別の例となる方法では、細胞型を高密度で播種すれば、親血管からの微小血管として出芽する細胞の能力が活性化される。このプロセスは、別段に述べられていなければ、CPD900に関して以前論じられた通りに実施される。下に提示される画像は、標準的技術および試薬を使用して、明視野または共焦点蛍光顕微鏡を介して撮影される。当業者による本開示の理解を助けるために、出芽可能表現型の活性化に特異的な特色を特に記載する。
図20A〜図20F、および図21A〜図21Bには、出芽可能表現型や芽増殖の様々な側面を誘発する最小および最大播種密度を決定するために、定量的画像解析を使用して一連のアッセイを実施した。内皮細胞をCPD1350において前述の通りに播種し、インキュベートして出芽親血管を形成した。出芽に対する短期と長期両方のインキュベーション効果を調べるために、時間(h)で測定される播種後の時点で試料を調べた。最長96時間からのインキュベーション実験について、出芽親微小血管の増殖を解析し、データは播種後0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間(h)で解析した。出芽を与えた最小および最大細胞播種密度を、親微小血管位置に沿った平均出芽長の測定と一緒に決定した。
出芽可能表現型のためにHUVECを劇的に活性化する能力は、灌流液マトリックス内の血管新生のもしくは血管新生抑制の産物、または正常な、病原性の(たとえば、癌の、ウイルス感染した)もしくは工学的に操作された細胞および組織由来の産物についてスクリーニングする高い能力を提供する。微小血管ネットワークをモニターすることにより、出芽および微小血管増殖が増加すれば血管新生効果を示し、出芽および微小血管増殖が減少すれば血管新生抑制効果を示しているという、効率的な尺度が提供される。内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞および線維芽細胞ならびに前駆細胞および幹細胞の寄与も、追加された血管形成および機能の局面においてアッセイすることができる。その上、癌細胞は、癌細胞をマトリックス中に懸濁させることにより、その血管新生潜在能力について試験することができる。複雑な組織の発生および増殖は、利用可能になった改良された血管新生を使えばもっとよく試験することができる。微小血管の出芽の増加は、感度のよいアッセイシステムを提供する。
組換えDNA法を介して内皮細胞内の標的遺伝子を遺伝子改変することにより、出芽可能表現型の活性化を含む(ただしこれに限定されることはない)細胞表現型へのその寄与を調べることができる。内皮細胞で発現される特異的マーカー遺伝子は、本開示の方法を使用したアッセイにおける操作および試験のための魅力的な標的である。大血管由来および微小血管由来の細胞系統などの、内皮由来細胞系統も試験することができる。内皮細胞はインビボにおいて著しい不均一性を示す(Aird、2007)。動脈内皮または静脈内皮のいずれかで優先的に発現される多数の遺伝子が同定されている。動脈内皮細胞は、エフリンB2(Gale、Balukら、2001)、Delta−様4(Dll4)(Krebs、Xueら、2000)、アクチビン受容体様キナーゼ(AIk1)(Seki,Yuriら、2003)、内皮PASドメインタンパク質(EPAS1)(Tian、McKnightら、1997)、Hey1(Nakagawa、Nakagawaら、1999)、Hey2(Nakagawa、Nakagawaら、1999)、ニューロピリン1(NRP1)(Mukouyama、Gerberら、2005)、およびプロゲステロンにより誘導される脱落膜タンパク質(Depp)(ShinとAnderson、2005)を含むいくつかの遺伝子を特異的に発現することが明らかにされている。静脈内皮細胞は、EphB4(Gerety,Wangら、1999)、ニューロピリン2(NRP2)(Yuan、Moyonら、2002)、COUP−TFII(You、Linら、2005)、および静脈弁の先端におけるクラスIIIβチューブリン(KangとLee、2006)を含むいくつかの遺伝子を特異的に発現することが明らかにされている。
特定の供給源由来の内皮細胞または樹立内皮由来細胞系統の亜集団をアッセイすれば、血管新生の理解および血管増殖の調節に進歩をもたらすことができる。たとえば、動脈大血管または微小血管供給源のいずれか由来の内皮細胞系統を、本開示のCPDおよび方法を使用して微小血管を形成するのに選択することができる。寿命の長いまたは不死化されている候補細胞系統を、正常核型および非腫瘍形成性表現型、さらには接着タンパク質および凝固分子の発現パターンについて、さらに特徴づけることができると考えられる(Bouis、Hospersら、2001)。ESV233、ESVSF108、ESV2010(INS/EGF)、ESV2010−GFを含む、長い寿命を有し、様々な程度に特徴づけられているが、不死化されていないヒト臍帯静脈(HUVEC)から作製した内皮細胞系統が存在する(Hohenwarter、Jakoubekら、1994)。大血管由来系統EA.hy926(Edgell、McDonaldら、1983)、大血管由来系統EV304(Takahashi、Sawasakiら、1990)、および微小血管由来系統HMEC−1(Ades、Candalら、1992)を含む、よく知られているいくつかの不死化内皮細胞系統が存在する。さらに、研究のための細胞系統が存在し、新しい系統も作製することができると考えられる。
活性化出芽表現型は、親血管から出芽する微小血管の増殖を誘導する。この表現型はおそらく、増殖シグナルに対する細胞応答に関連している。血管新生中、毛細管芽は、接触阻害された細胞を含有する比較的大きな血管から増殖する。接触阻害に関連する接着およびシグナル伝達経路由来の遺伝子およびそのタンパク質産物を本開示の方法を介してアッセイすることで、血管形成および血管新生に対する洞察を得ることができる可能性がある。
内皮細胞形態形成には、血管が既存の血管から形成される血管新生のほかにも血管が組織中の内皮細胞(EC)もしくはEC前駆体および前駆細胞からまたは循環を介した送達から形成される脈管形成が含まれる。内皮細胞形態形成には、微小血管がシグナル伝達入力および調節に基づいて退行する場合も含まれる。
図23には、親血管、微小血管出芽、および微小血管ネットワーク形成に影響を与える細胞(C)、産物(P)、および組織(T)のスクリーニングのためのアッセイが図式的に示されている。CPD1350、CPD900、またはこれらの同等物などのCPDおよび出芽可能表現型を活性化するための高密度播種の方法を利用することにより、微小血管出芽の応答及び微小血管ネットワークの形成を試験することができる。微小血管のネットワークを使用して、微小血管ネットワークの形成をモニターすることにより、マトリックスまたは灌流培養液中の血管新生および血管新生抑制因子についてスクリーニングすることができ、ここでネットワークの増殖が増加すれば血管新生因子を示し、ネットワークの増殖が減少すれば血管新生抑制因子を示す。
図26Aおよび図26Bには、細胞誘導血管新生を再現する実施形態が示されている。図26Aでは、CPD2600からの2つのコラーゲンチャネルの明視野画像が示されていて、一方がHUVECを播種されて出芽親血管2604を形成しており、他方がBT474細胞系統の乳癌細胞2608を播種されている。HUVEC親血管は、乳癌細胞に向かって増殖している芽2610、2620、2630、2640を示しており、癌細胞から放出されている可能性のある生理活性産物がもたらす血管新生潜在力を表している。図26Bでは、同一微小血管の対応する蛍光顕微鏡画像が示されている。播種前に、HUVECは染料2650で染色され、乳癌は、異なる細胞染色で染色された細胞2660であった(それぞれ細胞トラッカーグリーンCMFDAおよび細胞トラッカーオレンジCRMA、色は描かれていない)。したがって、HUVEC親血管から増殖している芽2610、2620、2630、および2640は内皮起源であり、血管新生および血管新生抑制効果についてモニターすることができる。
Claims (53)
- インビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを形成するための方法であって、
出芽することができる少なくとも1つの細胞型の細胞をマトリックス内の少なくとも1つのチャネルに播種する(1300)工程と、
播種密度から誘発される、親血管から微小血管として少なくとも1つの細胞型が出芽する能力を活性化する(1304)工程と、
少なくとも1つのチャネルを少なくとも1つの培養液で灌流して、少なくとも1つの細胞型が少なくとも1つの親血管を形成することを可能にする(1324)工程と、
少なくとも1つの親血管をインキュベートおよび灌流して、生存を維持し、周囲にあるマトリックス中への少なくとも1つの親血管からの微小血管の出芽をもたらす(1328)工程と、
ネットワークを形成するまで出芽微小血管を増殖させる(1332)工程と
を含む方法。 - 少なくとも1つの細胞型が出芽する能力が細胞間の接触から活性化される細胞シグナル伝達から生じる(1308)、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が出芽する能力が、細胞間の接触(1308)からと細胞とマトリックス間の接触(1312)の両方から活性化される細胞シグナル伝達から生じる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が出芽する能力が、細胞−細胞媒介接触(1308)、細胞−マトリックス媒介接触(1312)、および増殖因子−細胞媒介接触(1316)からなるグループから選択される細胞シグナル伝達から生じる、請求項1に記載の方法。
- 大多数の細胞が互いに細胞間接触している(1308)、請求項1に記載の方法。
- 大多数の細胞が互いにほぼ細胞間接触している(1308)、請求項1に記載の方法。
- 細胞(1)がチャネル1平方mmあたり少なくとも細胞250個の密度を有する、請求項1に記載の方法。
- 細胞(1)がチャネル1平方mmあたり細胞250個〜2000個の密度を有する、請求項1に記載の方法。
- 親血管から出芽する微小血管が吻合して微小血管ネットワークを形成する(1332)、請求項1に記載の方法。
- 親血管が、マトリックス(2312)内に埋め込まれた組織(2311)の少なくとも1つの細胞型の増殖を支持する、請求項1に記載の方法。
- 親血管が親血管の3Dの列である、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が、内皮細胞(1)、ならびに平滑筋細胞、線維芽細胞、周皮細胞、前駆細胞、幹細胞、実質細胞、間質細胞、筋肉細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、真核細胞、遺伝子操作細胞、遺伝子改変細胞、患部細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞およびその組合せからなるグループから選択される追加の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 内皮細胞(1)が内皮細胞系統由来である、請求項12に記載の方法。
- 内皮細胞系統が、個体に由来する微小血管内皮細胞系統、大血管内皮系統、および内皮細胞系統からなるグループから選択される、請求項13に記載の方法。
- 細胞が灌流培養液(2332)に生物活性産物を放出する、請求項12に記載の方法。
- 細胞がマトリックス(2312)に生物活性産物を放出する、請求項12に記載の方法。
- 細胞が灌流培養液(2332)に遺伝子操作された生物活性産物を放出する、請求項12に記載の方法。
- 微小血管のネットワーク(2428)のモニタリングを使用して、マトリックス(2404)中の血管新生および血管新生抑制因子についてスクリーニングし、ネットワークの増殖が増加していれば血管新生因子を示し、ネットワークの増殖が減少していれば血管新生抑制因子を示す、請求項1に記載の方法。
- 微小血管のネットワーク(2428)のモニタリングを使用して、灌流培養液(2416)中の血管新生および血管新生抑制因子についてスクリーニングし、ネットワークの増殖が増加していれば血管新生因子を示し、ネットワークの増殖が減少していれば血管新生抑制因子を示す、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が、動脈内皮の遺伝子操作された分子マーカーを含有する内皮細胞(1)を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が、リンパ管内皮の遺伝子操作された分子マーカーを含有する内皮細胞(1)を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞型が、静脈内皮の遺伝子操作された分子マーカーを含有する内皮細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに、内皮細胞(1)、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、内皮前駆細胞、および幹細胞からなるグループから選択される細胞を播種する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに、内皮細胞(1)を播種する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに、内皮細胞(1)および平滑筋細胞を播種する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに、内皮細胞(1)、平滑筋細胞、および周皮細胞を播種する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに、内皮細胞(1)、平滑筋細胞、周皮細胞、および線維芽細胞を播種する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのチャネルに内皮細胞(1)を定植させ、少なくとも1つのチャネルに少なくとも1つの非内皮細胞型を定植させる、請求項1に記載の方法。
- マトリックス中の少なくとも1つのチャネルがマンドレル(2)で形成される、請求項1に記載の方法。
- マンドレル(2)が引き抜きにより取り除かれる、請求項29に記載の方法。
- マンドレル(2)が分解により取り除かれる、請求項29に記載の方法。
- マトリックスチャネルへの細胞の注入、およびマンドレルへの細胞の事前付着からなるグループから選択される処理、ならびにマンドレルへの細胞の事前付着とマトリックスチャネルへの細胞の注入の組合せにより少なくとも1つのチャネルへの播種(1300)を行う、請求項1に記載の方法。
- マトリックス中の少なくとも1つのチャネルが、20ミクロンから500ミクロン径である、請求項1に記載の方法。
- マトリックス中の少なくとも1つのチャネルが、500ミクロンから5.5mm径である、請求項1に記載の方法。
- マトリックス(1391)が、フィブリン、コラーゲン、コラーゲンサブタイプ、ゼラチン、ゲル状基底膜、寒天、アガロース、アルギン酸、基底膜タンパク質、細胞外マトリックスタンパク質、シリカゲル、および細胞からなるグループから選択される材料を含む、請求項1に記載の方法。
- 基底膜タンパク質が、IV型コラーゲン、パールカン、ラミニン、インテグリン、エナクチン、ジストログリカン、VII型コラーゲン線維、およびVII型コラーゲンミクロフィブリルからなるグループから選択される、請求項35に記載の方法。
- 細胞外マトリックスタンパク質が、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、およびラミニンからなるグループから選択される、請求項35に記載の方法。
- マトリックスが増殖因子をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- マトリックス(1391)に、内皮細胞(1)、ならびに平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、前駆細胞、幹細胞、筋肉細胞、肝細胞、肺細胞、皮膚細胞、上皮細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、真核細胞、実質細胞、間質細胞、遺伝子操作細胞、遺伝子改変細胞、患部細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞およびその組合せからなるグループから選択される追加の細胞を定植させる、請求項1に記載の方法。
- 微小血管ネットワーク(2428)の増殖が増加していれば、血管新生因子(2412)が細胞から分泌されていることを示し、微小血管ネットワークの増殖が減少していれば(2528)、血管新生抑制因子(2512)が細胞から分泌されていることを示す、請求項39に記載の方法。
- 少なくとも1つの組織(2311)がマトリックス内に埋め込まれている、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの組織(2311)が、健常組織、患部組織、癌組織、および遺伝子操作組織からなるグループから選択される、請求項41に記載の方法。
- 微小血管ネットワーク(2428)の増殖が増加していれば、血管新生因子が組織から分泌されていることを示し、微小血管ネットワークの増殖が減少していれば(2528)、血管新生抑制因子が組織から分泌されていることを示す、請求項41に記載の方法。
- 少なくとも1つの灌流培養液の流動(204)が、毛細血管のインビボ流動に近似する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの灌流培養液の流動(204)が、1つの親血管(202)への流入を減少させ、別の親血管(200)での抵抗を増加させることにより、親血管同士を繋ぐ微小血管ネットワーク中を優先的に流れる、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの灌流培養液が、血管新生因子、血管新生抑制因子、血清、ホルボールエステル、および増殖因子からなるグループから選択される補充成分を有する細胞増殖培養液を含む、請求項1に記載の方法。
- 実質的にマトリックス(1391)を介する拡散により少なくとも1つの灌流培養液に酸素を添加する、請求項46に記載の方法。
- 少なくとも1つの培養液が増殖因子を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養灌流装置1350においてインビトロで灌流可能な微小血管のネットワークを形成するための方法であって、
培養灌流装置(1350)のチャンバー(1390)においてマンドレル(1384)の周囲にマトリックス(1391)を流し込む工程と、
マンドレル(1384)を取り除いてマトリックス(1391)内にチャネル(1388)を作り出す工程と、
少なくとも1つの入口(1354)および出口ポート(1392)に導管(1381)を取り付ける工程と、
導管(1382)を通してチャネル(1384)に少なくとも1つの細胞型を播種する工程と、
チャネル(1388)内に細胞を分配する工程と、
入口ポート(1354)を満たし、少なくとも1つの入口(1354)および出口ポート(1392)をプライミングすることにより、培養灌流装置(1350)を灌流する工程と、
培養灌流装置(1350)をインキュベートして親血管(1393)を形成させる工程であって、播種密度が出芽を誘発するのに十分であれば、親血管からの微小血管の出芽が起こる工程と、
培養灌流装置1350をインキュベートすることにより、灌流可能な微小血管のネットワークを形成する工程と
を含む方法。 - 血管新生および血管新生抑制産物についてスクリーニングするための方法であって、
活性化された出芽可能親血管(2328)から灌流可能な微小血管ネットワークを増殖させる工程であって、微小血管ネットワークが灌流装置(2300)中のマトリックス(2312)内に埋め込まれている工程と、
候補(2311)をマトリックス内の位置に添加する工程と、
灌流装置を灌流およびインキュベートする工程と、
添加された候補(2311)に応答した微小血管ネットワーク(2428)の3D増殖を測定する工程と
を含む方法。 - 候補が、細胞、産物、および組織(2311)からなるグループから選択される、請求項50に記載の方法。
- 候補が、マトリックス(2312)の代わりに灌流培養液(2332)に添加される、請求項50に記載の方法。
- インビトロで灌流可能な微小血管ネットワークを作製するための培養灌流装置であって、
マトリックス内の少なくとも1つのチャネルに出芽することができる少なくとも1つの細胞型を播種するための手段であって、少なくとも1つのチャネルが灌流手段と液体で連絡している手段と、
播種密度から誘発される、親血管から微小血管として少なくとも1つの細胞型が出芽する能力を活性化するための手段と、
少なくとも1つのチャネルを少なくとも1つの培養液で灌流して、少なくとも1つの細胞型が少なくとも1つの親血管を形成することを可能にするための手段であって、灌流手段がインキュベーション手段を介して含まれている手段と、
少なくとも1つの親血管をインキュベートおよび灌流して、生存を維持し、周囲にあるマトリックスへの少なくとも1つの親血管からの微小血管の出芽をもたらす手段と、
インキュベーション手段を介して、ネットワークを形成するまで出芽微小血管を増殖させるための手段と、
を含む装置。
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