CN103789255A - 一种在体外形成可灌注微血管网络的方法及其培养灌注设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在体外形成可灌注微血管网络的方法及其培养灌注设备。该方法包括：将包括能够萌发的细胞类型的细胞接种（1300）到基质的通道中，以根据接种密度激活细胞萌发形成微血管的能力（1304）。所述基质通道被灌注培养基，以形成并活化亲代血管（1324）。培育并灌注所述亲代血管和基质以使微血管形成萌芽进入周围基质（1328）。萌发的亲代血管生长直至形成网络（1332）。本发明克服了现有血管生成模型的局限性，提供了通过将用于在三维细胞外基质中生成侵入的、管状的微血管萌芽的已验证方法与用于构建将成为内腔流动源头的组织工程化亲代血管的新方法相结合的方法和系统。

Description

一种在体外形成可灌注微血管网络的方法及其培养灌注设备

本申请为申请日为2008年9月24日、申请号为200880108494.8、名称为“生成可灌注微血管体系的方法”的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请是Neumann于2007年09月24日提交的标题为“生成可灌注微血管系统的方法”的共同未决申请US11/860,471的部分系列申请，并在此基础上要求了优先权。而上述申请US11/860,471是Neumann于2006年03月24日提交的申请号为US11/388,920的部分系列申请。Neumann的申请U.S.11/388,920和U.S.11/860,471被引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及用于研究生理的和病理的血管生长以及响应促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生长的方法。

背景技术

在正常的血管生长的过程中（例如，月经周期、胎盘形成、发胖、创伤愈合、炎症），新血管的生成是被调控的并最终停止。值得关注的是，血管生长失去调控是病理学上的一个关键因素。例如，肿瘤的生长、糖尿病性视网膜病变、关节炎和牛皮癣涉及直接促成病理状态的血管过度增殖。相反，作为老年个体的特征，血管生长的削弱危害了创伤愈合以及由损伤或疾病导致的缺血组织的血管再生（revascularization）。因此，对指导组装新血管的机制以及启动和终止血管生长的过程的理解，是控制疾病中的血管形成的策略发展的核心。

在新血管的生长过程中（血管生成（angiogenesis）），萌芽（sprout）源自血管内皮细胞，该血管内皮细胞排列成毛细血管和后毛细血管（postcapillary）的内腔（lument）-血管系统的最小分枝。血管生成是一个复杂的，多步骤的过程。尽管公开了数以千计的关于血管生成的研究，但是，对介导和调控血管生成的生长和形态发生的细胞机制了解甚少。

由于大部分组织的不透明性，很难在体内实时地观察血管生成萌芽态的具体情况。很难在三维空间重建组织切片，且无法与血管生长的动态性质相联系。此外，很难在组织切片中发现接近血管生成萌芽的尖端的区域（控制血管侵入（vascular invasion）和形态发生的关键区域）。为了克服传统组织学的局限性，开发出了多种体内的和体外的血管生成“模型”。

体内的血管生成模型：为了克服活体组织的不透明性，研究者通过活体动物体内的“窗口”或专门的观察腔来观察血管生成，所述动物体内的“窗口”包括两栖类幼虫的天然透明的尾（Clark and Clark1939），所述专门的观察腔可以植入到兔的耳朵（Clark and Clark1939）、小鼠的皮肤（Algire，Chalkley et al，1945）和仓鼠的颊囊（cheek pouches）（Greenblatt and Shubi1968）中，或者由兔角膜囊袋（Gimbrone，Cotran et al.1974）或鸡胚绒毛尿囊膜（Ausprunk，Knighton et al.1974）发展而来。从这些早期的，大量描述性的研究中，得出了对肿瘤诱导的血管化学趋向性的中心范例的验证，以及能促进血管生长的可扩散的肿瘤衍生分子的相关发现。体内血管生成的新实验，检测了血管向聚合海绵体或皮下植入至啮齿动物的凝胶基底膜蛋白栓塞中的向内生长（Passaniti Taylor et al.1992；Andrade，Machado et al.1997；Akhtar，Dickerson et al.2002；Koike，Vernon et al.2003）。由于下述原因，体内的方法难以实施：(1)动物之间血管生成反应的种内变异；(2)缺乏从一个物种到另一个物种的结果转译；(3)购买和饲养动物的花费高；(4)公众不赞成以研究为目的使用动物；以及(5)在动物手术和可视化方面以及结果的评估上遇到的复杂性。

体外血管生成的二维（2D）模型：在努力了解血管生成的分子力学的过程中，将从较大的血管中分离出的内皮细胞置于平板培养皿中培养，直至它们形成汇合的（confluent）、平铺状（pavement-like）的单细胞层，该单细胞层模拟了血管内层（lining）内皮细胞层（Jaffe，Nachman et al.1973；Gimbrone1976）。尽管可以用作在大血管中对内皮损伤的增生性响应的模型（Gimbrone，Cotran et al.1974；Fishman，Ryan et al.1975；Madri and Stenn1982；Madri and Pratt1986；Jozaki，Marucha et al.1990；Rosen，Meromsky etal.1990），但是，在模拟血管生成的过程中，在刚性基质上内皮细胞的单层培养物并不典型地组织成毛细血管样的管状。然而，在1980年，在成功地长期培养毛细管内皮细胞后（Folkman，Haudenschild et al1979），据报道，培养牛或人类毛细血管内皮细胞20-40天后，在汇合的单层细胞的上部形成二维的细胞网络，这个过程被称为“体外血管生成”（Folkman，Haudenschildet al1980）。内皮细胞网络呈现为填充有纤维状/无定形物质的“管”和“内腔”，所述纤维状/无定形物质被认为是内源合成的“轴芯”网络，细胞在轴芯上组织起来。后续的研究报道了类似的二维网络的形成，该二维网络是由源自大血管的内皮细胞（Maciag，Kadish et al.1982；Madri1982；Feder，Marasa et al.1983）和接种在基底膜蛋白的延展性水凝胶（例如：

）顶部的内皮细胞形成的（Kubota，Kleiman et al.1988）。

尽管血管发育的二维模型仍沿用至今（基于

的测试（Kubota，Kleinman et al.1988）是商业上可获得的），该模型不具备真正的血管生成的以下5个特点：

1，侵入(invasion)-二维模型中的内皮细胞在细胞外基质的顶部形成网络并显示出很小的向下进入细胞外基质的倾向（Vernon，Angeilo et al.1992，Vernon，Lara et al.1995）。

2，方向性-在二维模型中，在体外形成的内皮细胞网络或多或少会同时遍及预置细胞的区域，而体内血管生成包括通过多级分枝使纤维状萌芽分叉而向细胞外基质的定向（vectorial）侵入。

3，正确的极性-尽管二维模型使单细胞管与毛细血管非常类似（Maciag，Kadish et al.1982；Feder，Marasa et al.1983；Sage and Vernon1994），但是，它们的极性是“由内向外的”，即它们将基底膜物质沉积在它们的内腔表面，并且使它们的凝血酶原表面向外面向周围的培养基（Maciag，Kadish et al.1982；Feder，Marasa et al.1983）-这与体内的情形相反。

4，内腔形成-二维模型生成具有专属内腔的内皮细胞（EC）管的证据不足。通常，内皮细胞管具有“内腔”空间，该内腔空间填充有细胞外基质（外源的或由细胞合成的）（Maciag，Kadish et al.1982；Madri1982；Feder，Marasaet al.1983；Sage and Vernon1994；Vernon，Lara et al.1995）。存在专属内腔时，专属内腔通常以由内皮细胞细胞质的厚壁所分隔的缝隙状或狭窄的圆柱形空间的形式出现-与体内典型的毛细管的膨胀的、薄壁内皮细胞管具有显著的不同。

5，细胞特性-二维模型中的细胞网络通过机械过程生成，该机械过程可以由非内皮细胞型来实现（Verrton，Angello et al.1992；Vernon，Lara et al.1995）。当然，数学建模显示出，任何能够使具有延展性的二维细胞外基质（内源合成的或提供的（例如

凝胶））具有张力的附着细胞型，均能在最佳条件下生成网络（Manoussaki，Lubkin et al.1996）。

体外血管生成的三维（3D）模型：对三维细胞外基质中发生的体内血管生成的认识已经得出多种模型，其中，在体外的三维细胞外基质凝胶中诱导萌芽。在早期的三维模型中，内皮细胞分散于由芯和管的网络（Elsdale andBard1972）形成的胶原质凝胶中（Montesano,Orci et al.1983）。尽管内皮细胞管显示出正确的极性，但是缺乏侵入和方向性的特性（内皮细胞被预先植入并均匀地分散在细胞外基质中）。虽然如此，已经证明这个方法在研究内腔形成（Davis and Camarillo1998）和内皮细胞对生长因子的响应方面是有用的（Madri，Pratt et al1988；Merwin.Anderson et al.1990；Kuzuya and Kinsella1994；Marx，Perlmutter et al.1994；Davis and Camarillo1996）。

在一个可选的方法中，将1毫米大鼠主动脉片段(环状)植入三维的血浆凝块中会生成有分枝的吻合（anastomosing）管（Nicosia，Tchao et al.1982）。源自动脉环的萌芽显示出类似于血管生成的侵入以及除了极性以外的方向性。利用源自大鼠的主动脉环或源自小鼠的微血管片段的移植模型，已经被用于研究肿瘤、生长因子、多种细胞外基质载体、和衰老的情况对血管生成的影响（Nicosia，Tchao et al.1983；Mori，Sadahira et al.1988；Nicosia andOttinetti1990；Nicosia，Bonanno et al.1992；Villaschi and Nicosia1993；Nicosia，Bonanno et al.1994；Nicosia，Nicosia et al，1994；Nicosia and Tuszynski1994；Hoying.Boswell et al.1996；Arthur，Vernon et al.1998）。

多种现存的模型诱导纯化的内皮细胞（如单细胞层或聚集体）萌发侵入至三维细胞外基质凝胶的下面或周围（Montesano and Orci1985；Pepper，Montesano et al.1991；Montesano，Pepper et al.1993；Nehls and Drenckhahn1995；Nehls and Herrmann1996；Vernon and Sage1999；Vernon and Gooden2002）。每一种模型都具有特殊的局限性，包括很难用肉眼观察萌芽形成，受限制的萌芽，切片法（sectioning）的要求，或者缺乏特定类型的内皮细胞的效力。

Wolverine和Gulec公开了一种三维血管生成系统（US2002/0150879A1），包括将肿瘤组织片段植入基质中。可表征出微血管的向外生长以分析该组织的血管生成潜能。但是，这个方法不能提供微血管的内腔灌注。

Neumann（本发明人）等，在2003年公开了在体外包括在人工组织中生成可灌注的微血管是可能的。Neumann等人在2003年教导，使用127微米的尼龙钓鱼线作为用于制造微血管的轴芯，该轴芯被收缩管材（shrinktubing）夹持。由植入到琼脂中的大鼠主动脉平滑肌细胞制造血管。这些微血管具有试探性的性质，并不适合于产生人类血管移植物。

体外血管生长的二维模型不能形成前述列出的血管生成的定义性特征，然而，现有的三维模型重建了其中一些或多数的特征。重要的是，现今的三维模型中没有一个模型能重建包含有压力的、流动的、循环流体的亲代血管。所以，现有的体外三维模型中没有一个模型能够进行关于内腔压力和流动对血管生长和形态生成的贡献方面的研究。

发明内容

本发明公开了一种在体外生成可灌注微血管的方法。将细胞接种到基质内的通道中。激活能够萌发的细胞由亲代血管萌发微血管的能力。所述细胞的萌发能力由接种密度触发。以培养基灌注所述通道而形成亲代血管。培育并灌注所述亲代血管以保持活力（viability）并实现微血管形成萌芽而进入周围基质。萌发的亲代血管生长直至形成网络。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种在体外形成可灌注微血管网络的方法，其中，该方法包括以下步骤：

将至少一种能够萌发的细胞类型的细胞接种到基质内的至少一个通道中；

激活至少一种细胞类型由亲代血管萌发微血管的能力，其中，所述萌发的能力是由接种密度触发的；

使用至少一种培养基灌注所述至少一个通道，使所述至少一种细胞类型形成至少一个亲代血管；

培育并灌注所述至少一个亲代血管以维持活力并从所述至少一个亲代血管向周围基质萌发微血管；

使萌发的微血管生长，直至所述微血管形成了网络。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种在培养灌注设备中在体外形成可灌注微血管网络的方法，其中，该方法包括以下步骤：

在所述培养灌注设备的腔内的轴芯周围注入基质；

去除所述轴芯，在所述基质内形成通道；

将导管连接在至少一个入口和出口上；

通过所述导管将至少一种细胞类型接种到所述通道中；

使所述细胞在所述通道内分布；

通过充入所述入口并充满至少一个入口和出口来灌注所述培养灌注设备；

培育所述培养灌注设备以形成亲代血管，其中，当接种密度足以触发萌发时，由所述亲代血管萌发微血管；以及

通过培育所述培养灌注设备，形成可灌注微血管网络。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选促血管生成产物和抗血管生成产物的方法，其中，该方法包括以下步骤：

由激活的具有萌发能力的亲代血管生成可灌注微血管网络，其中，在灌注设备的基质内植入所述微血管网络；

将候选物加到所述基质内；

灌注并培育所述灌注设备；

检测与所加候选物相关的微血管网络的三维生长。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于在体外生成可灌注微血管网络的培养灌注设备，其中，该设备包括：

用于将至少一种能够萌发的细胞类型接种到基质内的至少一个通道中的装置，其中，所述至少一个通道与灌注装置是流通的；

用于激活所述至少一种细胞类型由亲代血管萌发微血管的能力的装置，其中，所述萌发的能力是由接种的密度触发的；

灌注装置，该灌注装置用于将至少一种培养基灌注至所述至少一个通道以使所述至少一种细胞类型形成至少一个亲代血管，其中，所述灌注装置位于培育装置中；

用于培育并灌注至少一个亲代血管以维持活力并使所述至少一个亲代血管向周围基质萌发微血管的装置；以及

用于通过所述培育装置使萌发的微血管生长直至所述微血管形成网络的装置。

本发明克服了现有血管生成模型的局限性，提供了通过将用于在三维细胞外基质（ECM）中生成侵入的、管状的微血管萌芽的已验证方法与用于构建将成为内腔流动源头的组织工程化亲代血管的新方法相结合的方法和系统。通过灌注液，可以将调节血管生成的化合物施用于已知存在特定靶受体的内皮细胞的内腔表面。

营养培养基内腔流体的存在将会充分地增加体外毛细管的存活时间和稳定性。内腔灌注已显示出对血管生长和成熟具有积极影响（Frerich,Zuckmantel et al.2008）。这意味着内腔灌注的血管会更稳定。而且，平滑肌细胞或外周（pericytes）细胞、内皮祖细胞、甚至是干细胞参与亲代血管的形成会辅助血管成熟过程的部分功能。

公开的血管生成系统可以用于评估多种实验性参数，包括缺氧/氧过量、特定的可溶性或不溶性生物活性化合物的测试、经过基因修饰（geneticallymodified）的细胞的使用、以及经病毒转染/转导的基因传递。检测同型（homophilic）或异型（heterotypic）细胞间相互作用、细胞与基质的相互作用、细胞与生长因子的相互作用、以及机械化流动，作为诱导最终激活细胞的整体表型行为（例如在亲代血管萌发微血管中所观察到的表型行为）的细胞信号的刺激。

此外，可评估来自于高密度接种的物理力对萌发能力表型的贡献。不受特定理论的限制，例如高密度接种内皮细胞会导致物理挤压使内皮细胞在此过程中挤成一团。在开始接种期间不可能使内皮细胞在血管形成中呈典型的横向（laterally）伸展，因为此时细胞被紧密地挤在一起。因而向基质内的生长优先触发萌发表型。此外，在单位内腔表面面积中具有更多数量的细胞，通过细胞的简单迁移和聚结（coalescence）而不是细胞分裂可以更快地形成萌芽。可解释在血管形成中调控这种细胞表型的基因和基因产品的贡献。该系统还可以用于与创伤修复、衰老、癌症、牛皮藓、糖尿病性视网膜病变、炎症、中风和动脉粥样硬化相关的血管生成的研究。

重要的是，本发明教导的下述模型可以适用于提供能够并入生物工程化人工组织的功能齐全的血管系统。

本发明也提供了新型方法，包括用于生成微血管、从内皮细胞中生成微血管、以及生成大血管（例如，具有冠状动脉大小的血管）的多支管设计。例如，这些和其它重要的新教导包括一种生成微血管网络的方法，该方法是以下述说明书和权利要求书的描述为依据的。

附图说明

图1A、图1B和图1C示意性地描述了亲代血管生成的实例。

图2A、图2B、图2C和图2D示意性地描述了已知的热收缩过程的实例。

图3A示意性地描述了已知的安装培养/灌注设备的设计图。

图3B示意性地描述了安装培养/灌注设备的制备方法所用的设计图。

图4A和图4B示意性地描述了培养/灌注设备的多支管的制造。

图5A、图5B和图5C示意性地描述了微装配的培养/灌注设备的可选设计图。

图6示意性地描述了细胞接种程序。

图7示意性地描述了两个生物人工亲代血管之间的毛细管网络。

图8a示意性地描述了在体外接种平滑肌细胞后的多个轴芯的图例。

图8b示意性地描述了灌注的肌板（muscle plate）的实例。

图9示意性地描述了CPD的可选实施方式。

图10描述了单个亲代血管生长形成萌芽进入周围基质。

图11描述了一个亲代血管通过萌芽网络与另一亲代血管连接。

图12描述了通过将细胞接种至胶原基质通道中而生成亲代细胞的可选方法。

图13A描述了激活细胞和亲代血管萌发能力的方法。

图13B示意性地描述了CPD的一个实施方式。

图13C示意性地描述了在以胶原充满基质腔之前和细胞接种之前的CPD。

图13D示意性地描述了胶原接种、回收轴芯、和通过轴芯接种细胞之后的CPD。

图13E示意性地描述了灌注期间的CPD。

图14A示意性地描述了在高密度接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的基质内的通道的实例。

图14B示意性地描述了在接种HUVECs且细胞密度导致通道栓塞的基质内的通道。

图14C示意性地描述了灌注之后去除未附着的HUVECs的通道。

图15A描述了胶原基质中的空通道。

图15B描述了在高密度接种后具有附着细胞的图15A中的通道。

图15C示意性地描述了图15B所描述的接种通道的横截面。

图16描述了在高密度梯度接种内皮细胞之后的第1天的基质通道（上面版块）。也描述了在灌注12天之后的相同通道（下面版块）。萌发的诱导与细胞密度相关是显而易见的（下面版块）。

图17描述了已生长一周和三周并吻合（anastomosis）形成复杂微血管网络的两个有萌发能力的亲代血管。

图18描述了从第1天至第8天亲代血管的生长和相关微血管的萌发。

图19描述了微血管以标记的麦胚凝集素染色来显示血管结构和以荧光染料DAPI来显示核。

图20A示意性地描述了初始细胞接种密度对沿亲代微血管的位置的图。

图20B描述了在具有细胞密度重叠区的初始细胞接种密度下亲代微血管的萌发图。

图20C描述了接种24小时之后亲代微血管的萌发图。

图20D描述了接种48小时之后亲代微血管的萌发图。

图20E描述了接种72小时之后亲代微血管的萌发图。

图20F描述了接种96小时之后亲代微血管的萌发图。

图21A示意性地描述了平均萌芽长度（微米）对沿亲代微血管的位置（mm）的图。

图21B示意性地描述了平均萌芽长度（微米）对初始接种密度（每平方毫米的细胞数量）的最佳拟合图。

图22描述了以细胞示踪绿（暗的）染色的人脐带内皮细胞（HUVECs）和可收缩的围绕在HUVECs血管周围位置的大鼠平滑肌细胞（明显的/亮的）的复合萌发图。

图23示意性地描述了为微血管萌发试验将细胞高密度接种至基质通道中并形成亲代血管。

图24A示意性地描述了在CPD中存在较高量的具有促血管生成特性的细胞、产物和组织的微血管萌发试验。

图24B示意性地描述了在CPD中存在较高量的具有促血管生成特性的细胞、产物和组织的微血管萌发试验。

图25A示意性地描述了在CPD中存在较高量的具有抗血管生成特性的细胞、产物和组织的微血管萌发试验。

图25B示意性地描述了在CPD中存在较低量的具有抗血管生成特性的细胞、产物和组织的微血管萌发试验。

图26A描述了来自CPD2600的两个胶原通道的明视图，一个接种了已形成萌发亲代血管的HUVECs，而第二个接种了BT474细胞系的乳腺癌细胞2608。

图26B描述了来自图26A中的CPD的相同接种的胶原通道的相应荧光显微镜图。

具体实施方式

本文列出实施例的目的是为了进一步了解本发明。这些实施例是示例性的，本发明并不仅限于这些实例性的实施方式。本发明的方法可以用于研究生理学和病理学的血管生长和响应促血管生成因子或抗血管生成因子的血管生长。其它有益的应用是评估癌组织血管生成的可能和对抗血管生成药物的响应方法。进一步应用和方法是用于血管萌发的生理学或病理学的基础研究。此外，本发明的方法可用于构建多种创伤愈合设备以及用于组织工程化构建的血管形成。

在一个实施例中，公开了一种用于生成可灌注的三维微血管网络的方法和设备。此处所用“EC”指内皮细胞，“SME”指平滑肌细胞，以及“CAS”指冠状动脉替代物。

一般来说，用于培养和灌注微血管网络的设备由可在中心处容有一个或多个轴芯的腔室构成（最好如图1所示）。该腔室能够通过使用许多技术由任何生物相容性的材料制得，例如，通过使激光切割的框架形成夹层、通过在硅酮（silicone）板上钻孔和通道、或通过成模技术。以可收回的（retractable）方式将轴芯装在腔室中。这可以通过将轴芯的端部固定在管中来实现，例如，通过热收缩（如图2所示）。轴芯的直径取决于期望的血管管径。可改变设置以适应单个血管、两个血管、或直至二维或三维中的整体血管阵列（arrays）。轴芯可以是多种材料，例如，聚合纤维、玻璃纤维、线材等。

通过将细胞接种在轴芯上，刺激细胞在所述轴芯周围增殖，当细胞形成管壁后取出所述轴芯，从而生成微血管。随后将血管植入基质中。依赖于培养的条件、基质的组成、以及血管生成刺激的存在（例如，生长因子），亲代血管将形成萌芽而进入周围的基质中。所述萌芽将会相互连接而形成微细管网络。在除去所述轴芯后，将设备连接到灌注系统上，向血管中注入内腔液体流。

现在参考图1A、图1B和图1C，图中描述了生成亲代血管的示意性实例。图1A显示了在生长培养基100中的内皮细胞1，被接种在轴芯2上，轴芯2由设备主体3中的收缩管4支撑。图1B显示了所述细胞1增殖并形成细胞套筒（sleeve）102形式的环状层。图1C显示了在细胞外基质（ECM）凝胶110中取出轴芯2后，所述细胞套筒被灌注生长培养基100。

本发明公开的方法包括对用于组织工程化应用和研究模型的可灌注生物人工血管结构进行工程化。公开的方法的基本原理包括培养细胞而在被紧固在薄壁管或其它固定物上的可去除轴芯的周围环绕细胞层。一旦细胞层达到期望的壁厚度，即取出轴芯，并在灌注系统的帮助下向由此生成的生物人工血管（BAVs）中灌注培养基、血液、血液替代物、或其它流体。公开的方法可以用于生产大量制造的或常规生成的血管、体外灌注的血管生成模型、创伤愈合设备、组织成分、整个组织和器官、以及研究模型。

培养/灌注设备的制造

现在参考图2A、图2B、图2C和图2D，图中描述了已知的热收缩过程的示意性实例。特别如图2A所示，每个培养/灌注的设备（CPD）可以包括一个或多个装在支撑框架12内的轴芯2。轴芯2的直径为期望的血管口径，轴芯2的末端与医药级收缩管片段4紧密配合。轴芯2可以包括生物相容性纤维（例如，聚合物纤维、玻璃纤维、线材、或等同物），根据待模拟的血管尺寸，轴芯2的直径可以为几微米到几毫米。在一个实施例中，采用含有光学纤维的微毛细管作为轴芯。

更详细的描述如图2B所示，每个收缩管片段4的中间部位14在一个轴芯2的周围热收缩。随后，特别如图2C所示，轴芯2被收回，并将管切断。图2D示出了重置轴芯以便将该轴芯的两端封闭在正切断并分离的收缩管片段4中之后的情况。可以使用多种材料和工艺构建框架12。可以改变设置以适应单独的生物人工血管或生物人工血管阵列。同样地，通过将轴芯阵列分层放置，由血管网络可以生成厚的、可灌注的组织。

灌注腔室的制造

现在参考图3A，描述了已知的用于灌注多个轴芯/收缩管组件（assemblies）11的设置。框架20可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾压制成。分配腔室30可以包括在设计中，这样可以允许同时灌注多个生物人工血管。包含轴芯2的一套线程（thread）的末端被收集在硅管23中。

聚酯膜框架的激光切割

现在参考图3B，示意性地描述了用于安装培养/灌注设备的制造方法的新设计。单血管设计（CPD70）可以便利地通过将轴芯2夹在两个激光切割的

框架22之间而生成，所述轴芯2由热收缩管4支撑。一个环状的环氧多支管21可以方便地用于支撑轴芯/收缩管组件11，该多支管的构成将在下面说明。

将轴芯/收缩管组件夹在两个聚酯膜等（例如）的框架之间，并将粘着的侧面压在一起，这样每个轴芯通过在端部的两个收缩管片段4’悬挂在框架窗口76中。通过在框架22中包括至少一根细稳固线材26，并通过封装在圆柱形的环氧多支管中，来稳定并强化两个收缩管4’，所述环氧多支管是通过使用硅酮管的模具，环绕着收缩管和至少一根细的稳固线材26而铸成的。所述两个收缩管片段4’最后将变成CPD70的流入口和流出口。

现在参考图4A和图4B，图中示意性地描述了一种生成用于培养增殖（profusion）设备的多支管的方法。图4A特别描述了通过例如硅酮管50的套管被拉出的多个收缩管/轴芯组件11。注入环氧胶水40以填充硅酮管50并使它硬化（harden）。

图4B特别描述了环氧胶40硬化后以及硅酮管50被切开并被移开之后的情况。剩下的是硬化的环氧棒44。将轴芯收回至切点之后，切断环氧棒44，留下由收缩管形成的通道42。多个收缩管的端部46可以被整合，以形成多支管21。叠加单个的CPDs或CPD框架集合可用于生成三维血管阵列。

可选择的方法

现在参考附图5A、图5B和图5C，示意性地描述了用于微组装的培养/灌注设备的可选设计图。图5A特别描述了通过小孔（perforations）54将一套轴芯2引入框架，所述小孔具有套筒56，它们用于替代收缩管。图5B特别描述了细胞接种前的CPD，包括安装在框架壁52上的一套轴芯2。

图5C特别描述了一个可选实例，该实例为具有血管62的培养/灌注设备，其中微组装多支管64可以在框架52外面联接在套管56上。如这里所示，血管62在轴芯上生长，并在轴芯被移除后而被保留下来。可以使用微组装的方法（例如微成型）来大量生产这样的CPD框架组件。

血管生成和灌注

现在参考图6，这里示意性地描述了细胞接种程序。为了制备用于细胞接种的CPDs70，首先对它们进行清洗并用紫外线灭菌。在无菌条件下，将CPDs被固定在一个表面上（例如彼得里（Petri）盘72的底部）。随后在CPD框架组件70的内部窗口76（如图3B所示）中填充含有附着蛋白（例如层粘连蛋白-1）的溶液。根据需要，可以使用一个或多个衬垫（spacer）77。在培育期后，将含有附着蛋白的溶液除去，然后将培养基中含有期望类型细胞（例如平滑肌细胞、内皮细胞、和在某些情况下外周细胞和成纤维细胞，以及包含干细胞的前体细胞类型）的悬浮液转移至所述CPD70的窗口76中。

通过将一定体积的细胞悬浮液填充在窗口中来进行细胞接种，翻转CPD框架集合70使它的上部向下，因此产生了悬滴（hanging droplet）80。在大约为45分钟的培育期内，大量细胞将附着在位于CPD框架组件中的轴芯/收缩管组件上。过量的细胞将沉到悬滴的端部，并可以很容易的被收集和除去。然后将包括一个或多个CPD框架组件的彼得里（Petri）盘恢复到朝上的位置，填充培养基直到CPD框架组件被浸没，并进行培养。在一个实施例中的培养条件包括：环境中CO₂含量为5％，温度为37℃。附着在轴芯/收缩管组件上的细胞，将向外延伸并增殖，形成同轴的单细胞层（例如内皮细胞）或150微米或更厚的多细胞层（例如平滑肌细胞）。

达到期望的壁形状或厚度时，取出轴芯从而制得空心细胞管。较薄的壁需要通过在取出轴芯前在细胞套管的周围涂覆凝胶（例如琼脂糖、胶原蛋白、凝胶基底膜蛋白等等）进行保护，以防止破裂。然后将CPD框架组件的多支管连接到灌注系统上，灌注选择的流体，例如生长培养基。

在另一个实施方式中，一种由人血管内皮细胞（HUVEC）生成内皮“亲代”血管的方法包括下述步骤，其中：

首先清洗培养设备，并用紫外线从各个侧面照射灭菌30分钟。在无菌条件下，将设备固定在具有无菌条（sterile strip）的彼得里（Petri）盘的底部。

然后，用层粘连蛋白-1附着蛋白溶液填充所述设备的内部窗口。也可用其它的附着蛋白代替，例如纤连蛋白（fibronectin）、玻连蛋白（vitronectin）、纤维蛋白（fibrin）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序（RGD）蛋白、RGD-肽、明胶（gelatin）、胶原、不同亚型胶原和等同物。

培育过夜后，除去含有附着蛋白的溶液，并将培养基中的人血管内皮细胞的悬浮液转移至所述设备的窗口中。

翻转彼得里（Petri）盘使上部向下，在所述设备的窗口中产生了细胞-培养基悬浮液的悬滴。在细胞培养箱中（CO₂含量为5％，温度为37℃）培育45分钟后，大量细胞将附着到所述设备中的轴芯/收缩管组件上。

然后将彼得里（Petri）盘回转到朝上的位置，在其中填充用于人血管内皮细胞的生长培养基，直到设备被浸没。

未附着在轴芯上的细胞将落下并被吸出和除去。

然后将所述彼得里（Petri）盘放置在培养箱（CO₂含量为5％，温度为37℃）中。附着在所述轴芯上的细胞将向外扩散并增殖，形成同轴的人血管内皮细胞的单细胞层。

除去所述彼得里（Petri）盘中的培养基。在培养设备的窗口中装入胶原溶液并使其凝固（solidify），并包围带有细胞层的轴芯。

人血管内皮细胞将形成萌芽而进入胶原凝胶中。然后将轴芯慢慢地取出，留下可灌注的人血管内皮细胞的“亲代”微血管。

然后，将所述设备的多支管连接到灌注系统，并灌注人血管内皮细胞的生长培养基。

灌注系统

CPDs可以以线性模式或循环模式联接在灌注系统上。线性设置可以由重力流系统形成，或者由商业可获得的或常规构建的注射泵形成。在注射器中装满灌注培养基并将其安装在注射器泵上，通过气密管材与CPDs的上游端连接。CPDs可以储存在无菌条件的培养箱中，或在CDPs内部建立无菌的细胞培养环境。将CPDs的下游多支管连接到收集灌注液的蓄水池的末端。可以通过使用蠕动泵构建循环系统。所述线性系统和循环系统均可以被固定在气体交换设备上。气体的浓度、灌注的压力、流程、温度、和营养物及代谢副产物的浓度可通过传感器进行测量。所收集的数据进入反馈回路，以严格控制所需的参数。

特定应用

用于与血管生成相关研究的模型

现在参考图7，图7示意性地描述了在两个生物人工亲代血管200、202之间的微血管网络。通过减少流体（f）流入“静脉”亲代血管202，并增加在“动脉”亲代血管200上的阻力R，使流动的灌注液204通过毛细管206改道。从而，驱动灌注液204从具有较高压力的血管进入具有较低压力的血管，以模拟从毛细管床的动脉端到静脉端的自然血流。例如，在一个具体实施方式中，以相同速度灌注两个亲代血管并保持出口阻力一致。如果流体增加进入第一血管，同时流体减少进入第二血管，灌注液会改道从第一血管进入第二血管。在其它实施方式中为了进一步促进改道，可增加第一血管下游端的阻力并降低第二血管的阻力。这可以通过提高或降低背压实现。在可选的实施方式中，第一血管的下游端和第二血管的上游端会完全封闭；然后灌注液通过第一血管进入，并通过微血管网络进入第二血管，再通过第二微血管亲代血管的下游端离开。

轴芯法也可以用于血管生成研究、白细胞附着试验模型的开发，或作为用于药物测试以及在创伤愈合、衰老、癌症、牛皮藓、糖尿病性视网膜病变、炎症、中风和和动脉粥样硬化的研究上的需要。只采用内皮细胞，或者内皮细胞、平滑肌细胞、和外周细胞的结合，能够环绕微米直径的轴芯来培养亲代生物人工微血管（BMVs），并植入到细胞外基质的载体凝胶中。在某些情况中可使用其它细胞类型包括成纤维细胞、祖细胞、干细胞和等同物。然后将所述轴芯取出，将亲代内皮细胞管留在细胞外基质凝胶210中。轴芯的取出可以手动完成，或者借助于自动化设备，可以使用从极慢到极快的不同速度进行。其它变化可以包括在冷冻状态下从生物人工微血管中取出轴芯，用热反应性聚合物涂覆轴芯，或牵拉轴芯的任一端使它变细直至断裂。

化合物可以诱导亲代血管形成萌芽而进入凝胶210中，所述化合物例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、和佛波酯、12-肉豆蔻酸-13-佛波乙酯（PMA），它们被加入到凝胶和/或灌注液（例如生长培养基）中。其它可用于诱导萌发的生长因子包括长R³胰岛素样生长因子（R³IGF-1）、胰岛素样生长因子（例如IGF-1）、白介素-8（IL-8）和人表皮生长因子（hEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF）、血管生成素（angiopoietins）、胎盘生长因子、细胞因子，多种趋化因子（例如SDF-1α）、TGF-β、和可溶性有丝分裂原。此外，细胞接种密度也可以诱导萌发能力表型。

可以通过在两个相邻的亲代生物人工微血管间形成压力差来生成复杂的微细管网络222，从而模拟动脉和静脉血流。液体流将改向，从“动脉”生物人工微血管通过相互连接的萌芽进入“静脉”生物人工微血管。

有利地，所述灌注液可以含有含氧细胞生长培养基，不含血清、和促血管生成或抗血管生成的物质。在另一个实施例中，所述灌注液可以是补充了血清和/或影响血管生成的化合物的含氧细胞生长培养基。而在另一个实施方式中，所述灌注液可以是含氧的生理盐溶液。在某些情况中该培养基是在生理范围内有缓冲能力的。在另一个实施例中，所述灌注液可以包括含氧血液、血液组分、或血液替代品。在另一个实施方式中，所述灌注液可以是不含氧的，并通过基质扩散来实现系统的充氧。而在另一个实施方式中，可以在灌注液中加入促血管生成或抗血管生成的化合物。

在一个实施方式中，在所述基质中加入促血管生成的化合物或抗血管生成的化合物等。而在另一个实施方式中，所述细胞包括基因修饰的细胞，该细胞能够向灌注液中或基质中释放产物。而在另一个实施方式中，所述基质可以优选含有纤维蛋白、胶原、基底膜基质、细胞外基质成分和明胶。一种可用的基质是

凝胶。在另一个实施方式中，所述基质可以包括琼脂、琼脂糖、藻酸盐或硅胶。

在另一实施方式中，基于基底膜的基质可以包括IV型胶原、基底膜蛋白多糖（perlecan）、层粘连蛋白、整联蛋白（integrin）、巢蛋白（enactins），营养不良蛋白聚糖（dystroglycans）、VII型胶原纤维和VII型胶原微原纤维（microfibrils）。在另一个实施方式中，基于细胞外的基质可以包括蛋白聚糖、糖胺聚糖（glycosaminoglycans）、硫酸肝素蛋白聚糖（heparin sulfateproteoglycans）、硫酸软骨蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans）、硫酸角质素蛋白聚糖（keratin sulfate proteoglycans）、透明质酸、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白。

在一个实施方式中，所述细胞可以选自由内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、成纤维细胞、祖细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、真核细胞、基因工程化细胞、基因修饰的细胞、病态细胞、病毒感染的细胞和癌细胞所组成的组中。类似地，细胞可以位于所述基质中，所述细胞可以选自由内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、成纤维细胞、祖细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、真核细胞、基因工程化细胞、基因修饰的细胞、病态细胞、病毒感染的细胞和癌细胞所组成的组中，它们分散在整个基质中，或者局部集中。在一些情况下，健康或病态组织（例如癌组织）的片段被植入到基质中。在其它情况下，病毒感染的或基因工程的组织被植入基质中。

源自亲代血管的萌芽可以在体外以切片材料或整体标本（whole-mount）的形式进行显微镜研究。以荧光溶液（例如荧光右旋糖酐）灌注生物人工微血管可以辅助分析萌芽直径、萌芽内腔的开放（patency）、和吻合（anastomization）的程度。萌芽形态的三维重建可以通过将由共聚焦显微镜得到的荧光图像的z轴重叠来实现。可以通过使用抗层粘连蛋白和IV型胶原的第一抗体和荧光或过氧化物酶标记的第二抗体的免疫标记在整体标本和组织（石蜡）切片对通过萌芽220的细胞外周基底膜基质的合成进行监控。

在复合的EC/SMC萌芽中，可以通过使用人CD31（克隆P2B1-Chemicon公司）的FITC单克隆抗体（MAb）或FITC-UEA1凝集素（一种用于人类内皮细胞的特异性标记物）标记内皮细胞，对两种细胞型之间的空间关系进行检测。可以用人的α-SM肌动蛋白的单克隆抗体并随后用RITC抗小鼠第二抗体对平滑肌细胞进行标记。内腔结构的细节以及内皮细胞和平滑肌细胞之间的相互作用，可以从用前述试剂标记的石蜡切片中获得。

所描述的构建方法是具有高重复性的，可作为商业上大量生产血管生成设备的基础。经过适当的保存（例如冷冻保存），研究人员能够以现货的方式获得预生长的亲代血管或整个微血管网络。

冠状动脉的替代品

为了生成冠状动脉的替代品，挑选具有一定外径的轴芯来制备冠状动脉替代品，该冠状动脉替代品具有内径约为4-5.5毫米的血管内腔。可选地，所述轴芯可以是空心管，其可被灌注且它的渗透性足以满足在冠状动脉的替代品的生长期间的营养物质和气体的交换。冠状动脉的替代品可以只由平滑肌细胞生长得到，因此，生成的结构类似于血管中的中膜层，或可以由两种或三种细胞型形成复合结构。

将平滑肌细胞接种在轴芯上，并生长至300-400微米的环形层。为了加速冠状动脉替代物的生成，可以用下述方式操纵SMC表型：在初始的生长阶段，使细胞进入高度增殖的表型；然后在血管壁达到期望的厚度后转换成分化状态。表型转换（switch）将导致平滑肌细胞的生长速率显著地减缓，并诱导细胞外基质蛋白质（例如胶原和弹性蛋白）的产生，这些蛋白影响血管的机械性能。可以通过控制特定基因的表达实现表型的转换。例如，在四环素反应性启动子的帮助下，基因表达（例如弹性蛋白）受到抑制直到管壁达到期望的厚度（Clontech Laboratories Inc.）。从生长培养基中除去四环素，可以激活插入的基因。例如，弹性蛋白的过度表达，将进一步抑制细胞的增殖以及执行管壁内的结构功能和信号功能。机械调节（例如动脉流）可以用于强化冠状动脉替代品，并诱导细胞的生理排列（physiological alignment）。

也可以使用其它外部或内部的“表型转换”。例如通过重组DNA技术对内皮和平滑肌特异基因或其它候选基因进行改造使其可以通过天然的、细胞或组织特异性的、可诱导的、和异源启动子介导表达。此外，先进的慢病毒转导体系能够使在所期望启动子的转录控制下的目的基因整合到静止或其它细胞类型中（Clontech Laboratories Inc.,Invitrogen Corp.）。这些方法可实现对基因数量、表达水平、突变分析、和调节的操作，所有这些都可以控制细胞表型的转换。

在取出轴芯后或在平滑肌细胞的调整（conditioning）和重建后，可以直接将内皮细胞接种在SMC套管上。内皮细胞的接种可以通过将内皮细胞悬浮液灌注到SMC套管中来完成。然后停止流动一段时间，以实现内皮细胞的适当附着。如果需要，为了促进内皮细胞平均分布，可以旋转或重复地上下倒转血管。

可选地，可以先将内皮细胞接种在轴芯上。在这种情况下，平滑肌细胞被接种在汇合的内皮细胞层上。使用这个方法，需要防止内皮细胞向富含氧气和养分的冠状动脉代替品的外围迁移。

如果期望，在SMC套管外面接种成纤维细胞能够形成动脉外膜层。在某些情况下，为了血管的生长可以接种外周细胞，它们有利于基底膜的形成。在其它情况下，为了血管的生长也可以接种祖细胞和/或干细胞。

用于生成冠状动脉替代品的细胞可以源自自体同源的（autologous）、异源的、或异种的材料。所述细胞可以是干细胞、前体细胞、或分化细胞。所述细胞可以进行基因修饰，以获得特定的表型或降低宿主生物体的免疫应答。

本发明公开的CPD方法提供了用于大量生产可现货供应的血管替代品或为受体定制设计的血管替代品的选择。本发明公开的CPD方法还适用于组织工程化的冠状动脉替代品模型的开发，动脉粥样硬化、动脉生成的研究，不同的血管细胞类型彼此之间以及与细胞外基质组分之间的相互作用的研究，一氧化氮效应的研究，和多种药物的研究。

不同大小或类型的血管和淋巴管

本发明公开的CPD方法还可以用于生成在直径和类型上不同于冠状动脉的血管。轴芯直径的改变将改变血管的直径。在某些情况下，轴芯可以从大约20微米至大约500微米，接近更小血管的大小。在其它情况下，轴芯可从大约200微米至大约5.5毫米，接近中等至更大的血管。可以通过细胞的表型和/或抑制细胞增殖的时间点来改变血管的类型（例如动脉、静脉、淋巴管）。例如静脉仅含有小的平滑肌细胞层。

其它管状组织

本发明公开的CPD方法可以被用于其它管状组织的工程化，例如胆管、泪管、咽鼓管（pharyngotympany tube）、输卵管、输精管、输尿管、尿道、肺气管等。本发明公开的CPD方法也证明可用于由包括胶质细胞在内的不同类型细胞生成神经导管，并指导神经的生长和修复。

用于工程化组织的BAV系统

本发明公开的CPD方法可以用于通过使用可去除的轴芯阵列作为骨架的组织和器官的工程化。将期望的组织/器官（肌肉、肝脏、肾脏、肺、皮肤等）的细胞接种到涂覆有附着蛋白的轴芯上。这些轴芯可由固体纤维或线材制成，或可选地由可灌注的、渗透性的管制成，例如纤维素。所述轴芯以允许结合单细胞套管的精确间距相互分离。使用这个方法可以形成片状或块状的组织。然后取出轴芯（或以不同方法去除），通过灌注系统的帮助向生物人工组织进行内部灌注。

创伤愈合设备

预制的生物人工血管系统可以用于帮助创伤愈合，例如糖尿病人的慢性溃疡（ulcers）。生物人工微血管网络可以被植入片状的载体材料中（例如来自富含血管生成生长因子的细胞外基质凝胶中），并放置在创伤处。用含氧的营养液进行自动灌注，所述生物人工血管将会促进供体血管和皮肤的萌发。可选地，这样的生物人工血管修复片段可以夹在创伤和皮肤移植物之间，并促进移植物的向内生长。

基因治疗设备

生物人工血管可以用于植入式给药设备。从病人体内取得的细胞，能够在体外进行基因修饰以生成特定的蛋白（激素、酶等）。使用上述方法，可以使这些细胞生长成生物人工血管或血管网络。重新植入到宿主中，所述细胞可以继续产生目标物质并将它释放到局部或全身。

人工组织和器官

如上所述，组织工程化的血管网络可以用于生成组织或乃至整个器官。一个方法是生成一个或多个体外可灌注的亲代血管。将从期望的组织或器官中得到的实质（parenchymal）细胞接种在所述亲代血管的周围，例如，在凝胶中。也可加入不同的基质细胞类型（例如免疫细胞、炎症细胞、外周细胞、成纤维细胞、或内皮细胞）。通过亲代血管给实质细胞供应养分和氧气。随着实质细胞的增殖，养分和氧气的需求量将增加。所述细胞释放血管生成因子，并刺激血管萌发。血管系统以与组织生长相同的速率萌发，其非常类似于自然生长。因此，这个系统也将是一个用于发育生物学研究的良好模型。

另一个方法利用平行排列的轴芯阵列作为基质细胞的骨架。随着基质细胞的增殖，环绕轴芯形成细胞层。最终，所有轴芯之间的空间被实质细胞充满，生成了片状组织。在取出轴芯后，该组织可以通过在轴芯处留下的通道进行灌注。通过内腔接种，这些通道能够变成内皮状。该方法不限于在二维空间。可以堆积多个片状组织，或使用三维骨架。本发明的发明人使用了用于肌肉组织的工程化的二维阵列和三维阵列。

而在另一个方法中，能够独立地生成组织层和血管网络层，然后间歇地进行堆积。所有的这些方法能够生成具有一种或两种细胞型的简单模型，或者能够生成含有多个细胞型的复合构型。

在植入后，以这些方法工程化的组织或器官可直接与血流接触，或通过灌注系统持续灌注直至宿主脉管系统生长进移植物中。

灌注组织工程化肌肉结构的实施例

现在参考图8a，描述了在体外接种平滑肌细胞后的多个轴芯的图片。多个轴芯与收缩管单元M被夹持在

框架中。轴芯M之间的距离可以调整到约100微米。所有收缩管片段的末端结合在一个上游多支管和一个下游多支管中（图中未示出）。所述Mylar框架是经过灭菌的，内腔被覆盖并使用每毫升5×10⁶个的大鼠动脉平滑肌细胞SM（RASMCs）的悬浮液进行接种。所述SM细胞附着在每个单独的轴芯M上并增殖，因而形成了环状层。10天后，独立的层结合到一起并最终形成了平滑肌细胞的厚片或厚盘。在生长培养基中再放置7天后，向培养基中补充50U/毫升的肝素（heparin），并再培养7天。然后，取出所有的轴芯，并用肝素培养基以10毫升/天的速度对组织进行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝素培养基的100毫米Petri盘的底部。对SMC盘灌注11天。灌注结束后，通道CH的功能仍被保留，并在体外清晰可见（如图8b所示）。

现在参考图8b，描述了灌注肌板MP的实例。所示的灌注流体通过管道末端（T）进入由除去的轴芯留下的通道（CH）中。

现在参考图9，示意性描述了CPD的可选实施方式。在一个实施例中，CPD900包括并列放置在第一载玻片904和第二载玻片920之间的一层902。该层902的厚度适宜于植入以通道922相接的多个流通口。所述多个流通口包括细胞悬浮液口914、多个入口912和多个出口918。以通道922相接的口可以流通并类似地分享流体功能。排布了多个口（例如口912）以提供多个出入点。优选地，其它应用可采用带流体腔和以微流体材料形成的口的微流体设计。同样地，所述层可含有硅酮或适宜用于显微镜或微流体应用的其它材料。胶原腔906优选由一对空的、柔韧的毛细管916或等同物定位用于出入。所用毛细管的数量从一到远大于二，这由CPD的大小和生成血管的数量所调节。通过管入口940A、940B可由一个或多个注射泵通过层出入每个口和腔，其中所述注射泵依附在具有针的注射器上。虽为了简化附图只显示两个注射泵管入口940A、940B，但可以理解的是根据情况可采用分离的注射泵、注射器或等同物来注入或抽取材料至每个腔和/或口。在一个实施方式中，所述注射泵与气密注射器连接。

描述了可选实施方式CPD900的特征，可帮助理解本发明现在要描述的构建CPD的方法。在一个实施例中，层902采用硅酮层，在硅酮层上钻孔得到洞和通道的模型，并以粘合顶层943和粘合底层945覆盖硅酮层。然后，以空心针刺穿所述硅酮，之后将它用于指引聚酰亚胺涂覆的熔融石英毛细管916进入胶原腔906以及进入一个入口912。以小口径管910支撑两个毛细管，引导从主腔进入出口908。然后在粘合层的帮助下将所述硅酮层902夹持在两个载玻片之间。然后将CPD900高压灭菌并保存备用。为获得准备生成血管的腔906，制备胶原溶液，通过注射针直接将该溶液注入胶原腔906中，并在培养箱中过夜形成凝胶。再通过将注射针插入两个入口将CPD900与注射泵相接。

依次将注射针与气密管相接，形成两个气密注射器，充入调节好pH的生长培养基，并安装注射泵。以相似的方式将两个出口908A、908B与废液储池相接。然后按操作灌注泵一样打开注射泵，由此充进入口继而填充入口、毛细管和出口。当所有空气被排出体系时，以镊子夹取每个毛细管，将伸入胶原腔的端部通过胶原凝胶往回拉直至毛细管端部到达基质腔中。按这个程序，在胶原凝胶中形成了两个可灌注通道。为了将细胞接种至胶原通道中，将高度浓缩的内皮细胞悬浮液注入到细胞悬浮液口中。然后关掉注射泵，其它毛细管端部被拉回至含有细胞的小储池914R中，这导致大量细胞立即回流进入所述胶原通道。通过废液储池的高度，可严密控制细胞的流动速率。在某些情况下，所述流动速率可以调节到接近天然毛细血管和血管的体内流动速率。然后将CPD在培养箱中放置45分钟，使细胞附着到胶原通道的壁上。可将CPD倒转几次或以其它操作使细胞呈最佳分布。最后，毛细管被拉出细胞储池进入作为入口的一部分的储池，打开注射泵并设定期望的灌注速率。过量的细胞被洗出。这个接种程序可在生长一段时间之后获得具有同源单细胞层的两个亲代血管，其中注入了更加高度浓缩的细胞数会使所需时间更短。应注意的是依据所用的轴芯类型，可通过抽取和/或降解从基质中去除轴芯。

现在参考图10，描述了单个亲代血管1050生长萌发1052进入周围基质1054中。当将人脐带静脉细胞（HUVECs）接种至胶原通道中时，生成的亲代血管开始形成萌芽进入胶原中。这些萌芽延伸并开始分枝。最终这些分枝与来自另一亲代血管的分枝相吻合，从而形成血管网络。

现在参考图11，描述了第一亲代血管1102通过萌芽1106网络与第二亲代血管1104相接。所述萌芽1106具有内腔并且是可灌注的。

生成亲代血管的方案

现在参考图12，描述了通过在胶原基质的通道中接种来生成亲代血管的可选方法。已经描述了采用硅酮层的可选CPD，将描述用于生成微血管系统的应用的特定实施例以促进本领域技术人员理解本发明。

将CPD在高压灭菌锅中灭菌，并保存在无菌环境中备用。制备胶原溶液并在冰上保存。将胶原充入小注射器中。在注射器中固定30G的注射针，并通过注射针将胶原溶液注入胶原腔中直至腔中完全充满了胶原1002。从该腔的对面插入第二注射针作空气出口。

然后通过将注射针插入两个入口，将CPD与注射泵相连1004。依次将注射针与气密管相接，形成两个气密注射器，充入调节好pH的生长培养基，并安装注射泵。以相似的方式将两个出口与废液容器相接（即将注射针插入出口，该注射针带有引导至废液容器的管）1006。

通过操作作为灌注泵的注射泵来灌注CPD，由此充进入口继而填充入口、毛细管和出口1008。当所有空气被排出体系时（例如以小口径注射针充当可去除的空气出口），然后以镊子夹取每个毛细管，将伸入胶原腔的端部通过胶原凝胶往回拉直至毛细管端部到达基质腔中。按这个程序，在胶原凝胶中形成了两个可灌注通道1010。

为了将细胞接种至胶原通道中，将高度浓缩的内皮细胞悬浮液注入到细胞悬浮液口中1012。然后关掉注射泵，其它毛细管端部被拉回至含有细胞的小储池中，这导致大量细胞立即通过毛细管回流进入胶原通道1014。通过背压（废液储池的高度）可严密控制细胞的流动速率。然后将所述毛细管进一步拉回进入与入口相接的储池中。

再将CPD在培养箱中放置45分钟，使细胞附着到胶原通道的壁上1016。可将CPD倒转几次或以其它操作使细胞呈最佳分布。

最后，打开注射泵并设定期望的灌注速率1020。过量的细胞被洗出。这个接种程序可获得具有同源单细胞层的两个亲代血管1022。通过灌注如上所述的亲代血管可生成一个或多个微血管网络。

可选地，用于生成亲代血管的程序也可包括将轴芯植入胶原基质中，抽取轴芯，将细胞注入至轴芯留下的通道中，也可以如上所述参照图1A-1C和其它将细胞接种在轴芯上。两种方法的组合可实现不同细胞类型形成层。

激活萌发能力表型的方案

在另一实施例方法中，高密度接种细胞类型激活了细胞由亲代血管萌发成微血管的能力。除非另外注明，如上所述以CPD900实施该方法。下列的图像是采用标准技术和试剂由明视野或共聚焦荧光显微镜拍摄的。激活萌发能力表型所特有的特征是突出的，可帮助本领域技术人员理解本发明。

参考图13A，描述了形成有萌发能力的细胞和亲代血管的方法。以高密度接种细胞类型（例如人脐带内皮细胞（HUVECs））1300，其中在通道三维空间中大部分细胞是直接接触或非常接近邻近细胞的。一组细胞是与通道壁的基质相接触。

高密度接种可激活细胞的萌发能力1304。不受特定理论的约束，认为这种表型来自于细胞间的接触，当高密度接种细胞时，激活了由细胞之间的同型接触1308诱导的细胞信号。还预期不同细胞类型之间的异型相互作用也有助于激活萌发能力表型。

此外，细胞与通道壁的基质成分之间的接触有助于激活萌发能力1312。而且，与细胞接触的可溶性生长因子对激活萌发能力有贡献1316。例如，之前显示了存在于灌注液培养基中的生长因子可以诱导萌发（例如图7所示）。在接种和灌注细胞过程中还可能存在细胞对灌注液流动的机械感应的贡献1320。

据对细胞的观察，细胞信号传导事件可能会激活萌发状态1304。当细胞被灌注到基质通道中时，它们会生长或由于细胞迁移而形成具有连续内腔的亲代血管1324。灌注并培育所述亲代血管使其存活并萌发微血管进入基质1328。萌发能力表型的触发开始表现为与接种密度相关的一种现象，但目前进行的分析会揭示这种表型是否可被进一步调节。进一步生长会形成复杂的三维微血管网络1332。在一些实施方式中，来自于不同亲代血管的微血管网络通过吻合而合为一体。

不受特定理论的限制，一种假设是萌发能力表型是由介导取决于接种密度的细胞信号的接触总和所驱动的。此外，可评估来自于高密度接种的物理力对萌发能力表型的贡献。例如高密度接种内皮细胞会导致物理挤压使内皮细胞在此过程中挤成一团。在开始接种期间不可能使内皮细胞在血管形成中呈典型的横向伸展，因为此时细胞被紧密地挤在一起，生长进入基质可能更有利于触发萌发表型。。

现在参考图13B，描述了可选的细胞灌注设备CPD1350。CPD1350通过单个流通入口1354和单个流通出口1392提供长期连续灌注，以增强灌注的功能和效率。采用氧等离子体将硅酮层1366密封在第一载玻片1370和第二载玻片1374内，并表示为封条1362。得到的封条1362在长期灌注形成的压力下是不漏水的。

所述单个流通入口1354通过注入填充腔1378内可以允许高密度灌注和接种细胞。在胶原基质腔1390内，导管1382与玻璃毛细管轴芯1384相连。胶原可被注入到基质腔1390内，并在胶原腔1390中的玻璃毛细管轴芯1384周围形成基质。通过导管1382去除玻璃毛细管轴芯1384，在胶原基质内部提供了通道1388。流动的灌注液培养基1394输入流通入口1354，通过导管1382进入通道1388，并穿过基质腔1390进入第二填充腔1378，到出口1392，再进入废液储池1396。在可选的实施例CPDs中可存在多于一个的通道。

现在参考图13C至图13E，示意性地描述了CPD的接种。在图13C中示意性地描述了可选CPD1350的顶视图。注意方向与图13B相反。所示的CPD1350在可填充胶原的基质腔1390中具有轴芯1384。该CPD含有以氧等离子体密封在两个载玻片1370/1374之间的硅酮层1366。现在参考图13D，将胶原1391或等效基质注入到所述基质腔1390中，并使其在轴芯1384周围形成凝胶。通过导管1382去除所述轴芯，留下通道1388。将细胞1（例如HUVECs和其它细胞类型）以高密度接种到灌注液培养基1394中。可通过适宜方式（例如通过注射器）注入细胞。

通过泵或等同设备维持灌注液流动，该设备将细胞1移动到通道1388中，在通道中暂时停止流动约45分钟，以使细胞附着到通道壁上。通过培养箱或等同设备的方式使细胞生长，从而在通道内形成萌发的亲代血管（未画出）。现在参考图13E，描述了CPD1350被配置为一旦恢复灌注，可以从细胞1形成亲代血管。此处，描述了入口1354与出口1396都在CPD底部的同一侧，这有利于该设备的操作，但如图13C和图13D中入口1354在右边位置也具有相似的功能。培养箱使萌发的微血管进一步生长，直至微血管形成网络。

下面的实施例采用CPD（例如CPD1350）、等同设备进行，或为示意性描述。现在共同参考图14A、图14B和图14C，示意性地描述了在基质通道中高密度接种的方法。在图14A中，描述了胶原基质1400与通道1404在一起的实施例。通道直径可以制成用于血管生成研究或血管生长的任何期望的尺寸。在特定流动速率的灌注液培养基1412中，将细胞1408（例如人脐静脉内皮细胞（HUVECs））单独或与其它细胞类型（例如，SMC、外周细胞、成纤维细胞和前体细胞）混合，以高密度接种到通道中。在某些实施方式中，内皮细胞或等同物是以每平方毫米约250个细胞的最小高密度值至每平方毫米约2000个细胞的最大高密度值而存在，测得的平均细胞大小约为18.0微米直径，系统修正因子为约2.5。因而细胞是高度浓缩的，并表现出降低流动的特性。灌注液培养基1412的流动速率是由注射泵或等同设备所设定的，并可被调节以提供特定流动速率和给定通道的压力。在特定实施方式中，采用了2毫升/分钟的流动速率，其对应了1.2dyn/cm²的剪应力。在生理学和代表性附加实施方式中报道了0.75-30dyn/cm²的剪应力值。在其它实施方式中，流动速率也可被调节以产生正常限度之外的剪应力，用于形成病理状态。

在图14B中，在某些实施方式中，浓度足够高以使细胞在通道中的流动明显减慢或停止，就如在给定流动速率1424下天然发生栓塞1420一样。在许多情况中，细胞的栓塞是暂时的，不需加大流动速率或压力即可解决。在其它情况中，可加大流动速率和压力以消除细胞栓塞。在特定实施例中，细胞的流动在栓塞1420处停止大约1或2秒，然后无需由泵调节流动速率即恢复1425。在其它实施例中，只在形成细胞栓塞之前或之后略微增加流动速率。在代表性实施方式中，再通过切断泵大约30-45分钟来中断流动，以使细胞附着到通道壁上。认为在高密度接种时细胞的浓度足够高以使细胞流动减慢。

此外，证据显示有物理应力（physical stresses）作用于细胞，所述物理应力来自灌注液的流动和压力，以及来自细胞之间的接触，和来自细胞与通道壁之间的接触。这些物理力对细胞产生了刺激和胁迫，这在形成细胞栓塞暂时停止流动时尤其明显。根据细胞浓度、压力和流动速率的变化，累积的物理刺激可变化、增强或降低。尽管大家认为在体外的萌发表型是经与高密度接种相关的机制介导的，但在某些情况中，可增加灌注液培养基的粘度以给予（impart）进一步的物理应力作用。同样地，大家认为累积刺激有助于或启动介导激活萌发表型的细胞事件。此外，灌注压力表现出随时间影响生长速率和萌芽成熟。应该注意的是在体内萌发是不依赖于接种密度或呈球形的细胞。在体内由扁平细胞发生萌发且不依赖于细胞密度。预期一组正确的血管生成因子、ECM、和灌注液会刺激正常扁平内皮细胞或等同物在我们的体外模型中萌发，类似于在体内所观察到的。

现在参考图14C，描述了整个通道的侧视图。在培育使细胞附着到通道壁1404上之后，灌注液培养基的流动速率被增加1432至大约每分钟2毫升，以从通道1428中清除未附着到通道壁1404上的细胞。清除之后，细胞层排列在所述通道壁1404上。大部分细胞汇合并与其它细胞和基质相接触。用于图示的目的，整个通道侧面的示意图描述了如灰色阴影1434所示的排列在远侧的细胞，而以黑色轮廓1436、1438示意性地描述出那些在通道顶部和底部的细胞。在某些区域，细胞可以是两层或多层厚1436，但大部分细胞是以单层1438而存在。在某些情况中，细胞可以不与其它细胞接触1440，起初是半汇合的直至后来增殖形成亲代血管。

现在参考图15A，以顶壁1530和底壁1534描述了具有大约150μm直径的代表性通道1510的胶原基质1500的实施例。如图14A-C所述的，将HUVECs高密度接种到该通道1510中。形成了终浓度大约3mg/ml的胶原基质。在可选实施方式中可使用更高或更低浓度的胶原或等同物。在一些实施例中，可使用可选或杂合基质组合物。

现在参考图15B，描述了以附着人脐静脉内皮细胞1520、1540、1544（HUVECs）接种的相同的基质1500和通道1510。在这个实施例中，以每平方毫米通道大约1000-2000个细胞将细胞接种到通道内，其中细胞看上去是极限填充的。

在接种期间，灌注液停止流动大约一秒天然形成的栓塞，这无需改变流动速率继续灌注即可解决。在此时关掉泵停止灌注大约30-45分钟，以使细胞到通道壁上，然后进行灌注。随后，将泵开在2毫升/分钟的速率，用于清除未附着细胞，使细胞以一层1520或两层或更多1540层的厚度排列在通道上。在某些情况中，如果需要促进流动和清除细胞，可采用更高的灌注液流动设置。在顶部1540或底部1520的细胞是清晰的且表现出更强折射性。在中心部分1544看见的细胞稍微有些模糊，表示附着在通道近侧和远侧的细胞。

在图15C中，示意性地描述了图15B中的通道1510（通道的端视图）。这表示了清除未结合细胞之后的通道。大部分细胞1520、1540、1544直接相互接触或与通道壁1530/1534接触，形成汇合的细胞套筒，大多数情况中该套筒是一层厚。某些区域可含有两层或多层细胞1540。在某些情况中，可存在细胞接近与其它细胞接触而成半汇合1550的区域。随后在亲代血管生长时的细胞增殖通常会覆盖这些区域。

现在参考图16，描述了激活细胞（HUVECs）萌发能力的实施例。上面版块描述了胶原基质内的通道1610，该通道中以细胞密度梯度1630接种多个细胞1620。通过提前停止流入细胞形成细胞梯度，从而在通道1604的上游端每通道体积中的细胞较少，在下游端1608的细胞浓度较大。使细胞附着大约45分钟，然后进行灌注。通常很快地在几分钟内在完整内腔中形成亲代血管，几乎在高密度浓度接种细胞时立即形成。然后当细胞附着并伸展时形成完整单细胞层，通常在大约30-60分钟发生。当采用较低细胞浓度时，要更久才能形成完整单细胞层。

由亲代血管萌发微血管也取决于接种密度。在高密度接种的亲代血管中，几小时之后就可见第一个微小萌芽，其似乎仅仅是细胞前突。更大的萌芽通常在接种后的头2-3天期间出现。

细胞密度梯度的中段1600是明显的萌发表型首先被激活并可观察到的地方。在上面版块可以看到在生长的第1天，在通道的三维空间内，大部分（但不是全部）细胞1634与邻近细胞接触。细胞1620也与通道壁接触。

下面版块描述了在同一通道1610中灌注生长12天之后的亲代血管1640。从亲代血管的中间区域1644可观察到微血管明显萌发的开始。这个区域对应由上面版块的线条1600所示的细胞密度。在更上游1612处观察到更明显的萌发，而对应更低细胞密度的亲代血管下游端未出现萌发1660。微血管持续萌发，且增殖随细胞接种密度的增加1650而增加。在静止域和萌发域1664之间的分界是清晰的，且与接种密度密切相关。在大多数情况中，低密度接种导致不会增殖和萌发微血管的静止亲代血管。这种现象表明接种密度的阈值触发所述表型。

在定量实验中进一步估算了触发细胞激活的细胞密度（例如，参见图20A-F和图21A-B）。

在此密度之下接种细胞可能会保留减少的萌发微血管的能力。除了细胞间接触触发，认为灌注液的组成也影响萌发的能力。灌注液培养基中存在的生长因子可与细胞接触信号协同作用，以介导所述表型。此外，细胞与基质接触也有助于所述表型。而且，来自灌注液流动和压力的物理力和来自栓塞形成的应力也有助于激活细胞萌发能力。但是，细胞间接触触发似乎明显有助于激活萌发能力表型。

现在参考图17，描述了两组纵列（tandem）的由高密度接种经过吻合形成复杂三维微血管网络的亲代血管。将单个CPD灌注培育一段时间并在最长5周结束的时间点处理。在大部分实验中通道距离大约500微米，但也要检测其它结构。没有测定微血管可交叉的通道之间的最大距离。但是，微血管应该能够朝距离超过500微米至约几毫米的其它亲代血管生长。

描述了在一周1700和三周1740之后，由导管1704生长的亲代血管1710、1720。在生长一周1700之后，观察到第一血管1710和第二血管1720直径膨大且它们的相关微血管1730萌发形成两个血管之间的微血管网络。在一个类似试验1740中，三周之后微血管网络1750经吻合而合并，并保存活性且可以灌注。可以看到亲代血管1760、1770，但它们几乎完全合并到微血管网络中。在一些实施例中，微血管网络合并到形成洞穴的程度，但是该网络仍能够通过微血管灌注。

经吻合而使微血管网络合并所需的培育时间取决于通道之间的原始布置和距离。灌注纵列的亲代血管导致萌芽和复杂三维微血管网络的形成。由亲代血管在整个三维中生长萌发微血管。如果亲代血管原来是紧邻的，萌发的微血管网络通常吻合形成较大的保持活性并具有灌注能力的合并的微血管网络。

对长达五周的连续灌注过程进行了检测。以活/死荧光活性染色检测，整个亲代血管和复杂且扩展的微血管网络中的大部分细胞保持活性。可用的染料例如活/死染料是商业上可获得的（例如Carlsbad CA的InvitrogenCorp.）。总之，萌发随时间而减慢，这可能反映了HUVEC原代细胞培养物在体外培养受限。

萌发的微血管可能生长也可能退化，这取决于营养物质、细胞信号和培养条件（例如，存在或缺乏血清和特定生长因子）。通过本发明的方法采用内皮细胞和其它细胞类型，可以评估新形成微血管的稳定性和向更成熟血管的成熟。已显示出通过培养条件和支持细胞的存在，会使含有内皮细胞的复合微血管稳定。已显示例如无血清条件下的生长因子（如VEGF、IGF-1）会促进血管生成并增强体外毛细管状网络的短期稳定性（French,Lindemannet al.2001）。同样地，已显示添加血管周细胞（例如外周细胞和平滑肌细胞）可稳定这种新形成的毛细管并帮助它们成熟（French,Lindemann et al.2001）。添加其它细胞类型（例如内皮（血管）祖细胞或干细胞），并结合确定的灌注液培养条件，也可有助于复合微血管的稳定和成熟。

现在参考图18，在几个邻近版块中描述了内腔灌注1-8天之后亲代血管的生长，以图示说明其它生长特征。对用于生长亲代血管的每个CPD做类似操作，并对每个亲代血管1800、1810、1820和1830在所示天数做成像处理。从在一些版块中可见的导管1804灌注每个亲代血管。第一版块显示灌注一天之后的仅初生萌发微血管1808的亲代血管1800。在下一版块中显示灌注五天之后茂盛萌发微血管1840的血管1810。亲代血管1814直径的可见增长也是明显的。下一版块显示灌注六天之后亲代血管1820增长达到了原有150微米直径的两倍。显然亲代血管细胞的增殖包含生长到导管1804的端部1824。最后一个版块显示灌注八天之后亲代血管1830继续萌发微血管1840，并且直径持续略微增长。血管生长至导管1804的端部也是明显的1834。

据信每个亲代血管直径的膨大是来自细胞在胶原基质内的侵入和生长，和来自血管对灌注液流动压力的响应。观察到细胞增殖和萌发的程度随时间而继续，但在培育几周之后有些减慢了。生长和萌发的减慢可能是由于HUVECs在体外有限的寿命。

参考图19，描述了代表性微血管网络的共聚焦三维重建图像。采用之前描述的高密度接种方法来生长微血管网络1900。以罗丹明标记的麦胚凝集素来标记萌发的微血管，使微血管中内皮细胞的膜结构可见，并以荧光DNA染色4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）来显示核。

在A版块中，可以看到基于三维管结构和灌注，微血管1910分枝具有完整通畅的专用内腔。在B版块中，描述了具有完整管状血管结构的微血管1920的高倍放大图。也显示了该样品中单个内皮细胞的核1930。来自微血管的分枝是明显1940具有完整通畅的专用内腔和核。经染色和灌注能力的评估，该微血管的结构是有活性的。

萌发的定量分析

现在共同参考图20A至图20F和图21A至图21B，进行了一系列定量图像分析试验以确定触发所述萌发能力表型以及萌芽生长方面的最小和最大接种密度。如前所述，在CPD1350中接种内皮细胞并培育以形成萌发的亲代血管。在接种后按小时（h）的时间点检测样品，以检测较短期和较长期培育对萌发的影响。在长达96h的培育实验中对接种后的0、24h、48h、72h和96小时（h）进行数据分析，以分析萌发的亲代微血管的生长。测定了提供萌发的最小和最大细胞接种密度，以及沿亲代微血管位置测量平均萌芽长度。

通过沿血管长度分析视频影像数据的平均灰度值（GSV）进行细胞接种密度的测量。采用具有4x0.10NA物镜的转换暗视野显微镜获得分析的图像。沿血管长度每100象素选择100象素宽的目标区（ROI），以在每个盒内取样平均GSV。为补偿不均衡的背景照明，采用另一类似的ROIs在血管周围取样背景。将修正背景的平均GSV对沿血管的位置作图。为计算细胞接种密度，在给定的ROI内建立了细胞数量和平均灰度值之间的关系。发现在所测量的细胞计数范围内细胞接种和GSV之间的关系大约呈线性（数据未示出）。最佳拟合线的斜率用于以平均GSV计算细胞接种密度。

现在参考图20A，描述了初始细胞接种密度对沿亲代血管的位置的图2000。通过以萌芽长度对细胞接种密度作图得到最小细胞接种密度，其中在该图的最佳拟合线中萌芽长度等于零时是真实的最小细胞接种密度。这些值是24h的每平方毫米362个细胞，48h的每平方毫米340个细胞，每平方毫米317个细胞，和96h的每平方毫米293个细胞。在细胞接种密度实验中实际接种最小值通常比以上举例的值（例如96h的293个细胞/平方毫米）和图21B所作出的值更大。

现在共同参考图20B至图20F，在图20A（上方）中摘录了短期生长实验中萌发的亲代微血管的显微镜图像。在图20B中，描述了在细胞接种密度重叠区2012的初始细胞接种2008。在图20C中描述了接种后培育24小时之后萌发的亲代微血管2016。在亲代微血管2018的中间部分显示出代表性的萌芽。通过白线2020指示最低密度区域的活性萌芽。显示了24h2024、72h2032和96h2040之后的同一亲代血管。对于每个2028（48h）、2036（72h）、2044（96h），也通过白线显示发现活性萌芽的最小初始接种密度。通过每个亲代微血管2026（48h）、2034（72h）、2042（96h）中间的代表性萌芽可看出整体萌芽长度随时间增长。在图20F中，在活性萌芽的最小密度的白线2044左边可见到气泡。可以看出在萌发明显的区域中萌发是相当不均匀的。

由来自短期生长实验的数据建立了萌发所需的最小接种密度，萌发的最小值是大约250个附着细胞/平方毫米。这个最小值与大约1000-2000个细胞/平方毫米的峰值相对，其中接种期间细胞看上去被最大程度地充满在导管或通道内。测得的1000-2000个细胞/平方毫米符合理论最大值。

现在参考图21A和图21B，也测定了从0-96小时亲代血管生长的平均萌芽长度。在图21A中，描述了24h2116、48h2108、72h2112和96h2116的萌芽长度2100。萌芽长度与显微镜图像的直接测量值相当契合。

现在参考图21B，描述了平均萌芽长度对初始接种密度的图2120。也描述了对每个分析时间点24小时2124、48小时2128、72小时2132、以及96小时2136的最佳拟合线。从最佳拟合线与X轴的交叉点可得到最小细胞密度值，即初始接种密度（每平方毫米的细胞数量）。放大图显示了交叉点是24小时的每平方毫米362个细胞，48小时的每平方毫米340个细胞，每平方毫米317个细胞，以及96小时的每平方毫米293个细胞的值。

应该注意到关于萌芽长度的测量可能存在误导因子。微血管的内直径变大，这一点并没有考虑到目前的分析中。因而，所述萌芽长度值包括直径的任意变化。

现在参考图22，检测了含有HUVECs和大鼠主动脉平滑肌细胞（RASMCs）的复合亲代血管。以荧光染料（细胞示踪绿）标记HUVECs，并按照本发明的上述方法将该细胞高密度接种，其中增长的萌发表型是明显的。生长大约24h之后，HUVECs形成萌发的亲代血管，以生长培养基对该亲代血管进行灌注。将RASMCs接种到HUVEC亲代血管中，并观察到该细胞附着在微血管壁上，随后通过微血管壁迁移到血管周位置。在图22中，描述了代表性复合HUVEC和RASMC的萌发的亲代微血管的荧光和明视野图的叠加图2200。以暗染色2210观察亲代微血管，而血管周RASMCs显示清晰2220。RASMCs迁移至围绕在HUVEC亲代微血管的血管周位置，符合已知的它们在血管成熟和稳定中的支持角色。

血管生成研究的试验和目标

显著激活HUVEC萌发能力表型的能力，增加了对灌注液、基质内促血管生成的或抗血管生成的产品，或来源于正常、病态（例如：癌症、病毒感染）、或工程化细胞和组织的产品的筛选能力。监测微血管网络提供了有效的测量，其中增加的萌发和微血管生长指示促血管生成效应，而减少的萌发和微血管生长指示抗血管生成效应。同样，也可以对内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、和成纤维细胞与前体细胞和干细胞在血管形成和功能的其它方面的贡献进行检测。此外，通过将癌细胞悬浮在基质中检测它们的血管生成潜能。以目前可用的改良的血管形成可更好地检测复合组织的发育和生长。萌发的微血管的大幅增长提供了敏感的试验体系。

通过检测已知的在同型内皮细胞粘附中促进细胞信号的候选基因和它们的基因产品，可以检验细胞-细胞介导的信号主要负责激活萌发表型的假设。也可测定细胞-基质介导的信号、生长因子-细胞介导的信号、和与灌注液流动相关的机械感应介导的信号的贡献，以确定在血管形成中整体细胞表型和行为。此外，对调控激活萌发表型的能力的预期为血管生成模型和研究提供了额外益处。

内皮特异性标记

通过重组DNA方法可对内皮细胞的靶基因做基因修饰，以检测它们对细胞表型的贡献，细胞表型包括但不限于激活萌发能力表型。内皮细胞中表达的特异性标记基因对采用本发明方法的试验的操作和测试是有吸引力的靶点。还可检测内皮衍生的细胞系（例如那些来源于大血管和微血管的细胞系）。内皮细胞在体内显示出明显异质性（heterogeneity）（Aird2007）。已鉴定了大量在动脉内皮或静脉内皮中优先表达的基因。已显示动脉内皮细胞会特异性表达几个基因，包括ephrinB2（Gale,Baluk et al.2001）、δ样4（DII4）（Krebs,Xue et al.2000）、活化素（activin）受体样激酶（Alk1）（Seki,Yunet al.2003）、内皮PAS结构域蛋白（EPAS1）（Tian,McKnight et al.1997）、Hey1（Nakagawa,Nakagawa et al.1999）、Hey2（Nakagawa,Nakagawa et al.1999）、神经菌毛素（neuropilin）1（NRP1）（Mukouyama,Gerber et al.2005）和孕酮（progesterone）诱导的蜕膜蛋白（decidual protein，Depp）（Shin andAnderson2005)。已显示静脉内皮细胞特异性表达几个基因，包括EphB4（Gerety,Wang et al.1999）、神经菌毛素2（NRP2）（Yuan,Moyon et al.2002）、COUP-TFII（You,Lin et al.2005）和静脉瓣尖端的III型β-微管蛋白（Kang andLee2006）。

可以获得这些已知基因并对其进行基因改造，采用本发明所列的方法检测过表达、基因剂量、突变、或功能缺失对血管生成中内皮细胞功能的影响。可从NIH Genbank基因序列数据库获取每个基因的序列数据，以利于这些分析。Genbank是所有公众可获得的DNA序列的有注释的集合（Benson,Karsch-Mizrachi et al.2008）。

内皮细胞系

对来自特定来源的或已建立的内皮衍生细胞系的内皮细胞亚群的检测推动了对血管生成和调节血管生长的理解。例如，可采用CPDs和本发明的方法，选择由大动脉血管或微动脉血管来源衍生的内皮细胞系形成微血管。具有延长寿命的或永生的候选细胞系可额外具有正常核型和非致瘤表型，以及粘附蛋白和凝结分子的表达模式的特征（Bouis,Hospers et al.2001）。具有延长寿命的由人脐静脉制成的内皮细胞系（HUVEC）以变化程度表征，但又不是永生的，现存的包括ESV233、ESVSF108、ESV2010（INS/EGF）、ESV2010-GF（Hohenwarter,Jakoubek et al.1994）。现存的且被充分表征的几种永生内皮细胞系包括大血管衍生的细胞系EA.hy926（Edgell,McDonald etal.1983）、大血管衍生的细胞系EV304（Takahashi,Sawasaki et al.1990）和微血管衍生的细胞系HMEC-1（Ades,Candal et al.1992）。此外，也可生成现存的细胞系和新细胞系用于研究。

可采用本发明的方法检测具有延长寿命的或永生的内皮细胞系在形成血管和血管生成中的功能。使用候选内皮细胞系的实践优势是它们在体外的寿命延长、已报道的稳定核型和相关表型。此外，这种细胞系可被进一步基因修饰或工程化以开发它们现有的细胞表型。而且，可从病人中分离内皮细胞，采用本发明的方法检测它们在个体化用药方式中对特定药物如何反应。对于癌细胞也是同样。

此外，本发明的方法中可利用淋巴组织衍生的类似细胞和细胞系。

细胞附着和信号通路

激活的萌发表型诱导从亲代血管萌发的微血管的增殖。这种表型可能与细胞对增殖信号的响应有关。在血管生成期间，从较大的含有接触抑制细胞的血管生长出毛细管萌芽。

来自与接触抑制相关的附着和信号通路的基因和它们的蛋白产物可候选通过本发明的方法进行检测，以探索血管形成和血管生成。

以HUVECs观察的萌发能力的激活取决于可能来自细胞-细胞接触的接种密度。细胞-基质接触以及细胞-生长因子接触，甚至接种和灌注液流动的机械信号的贡献也可能参与激活萌发能力。所有这些刺激源参与信号，并可被整合以介导整体细胞表型和行为。

在内皮细胞之间的附着连接对细胞生长的接触抑制和对循环溶质和白细胞的细胞旁路（paracellular）渗透性发挥重要作用。紧密连接还参与细胞附着并负责调控屏障功能和极性（Wheelock and Johnson2003;Bazzoni andDejana2004）。此外，在内皮细胞间连接中发现的其它附着蛋白（例如血小板内皮细胞附着分子，PECAM-1）参与细胞附着和细胞信号。

内皮细胞形成独特的细胞间附着连接，该附着连接含有内皮特异性钙粘蛋白（VE-钙粘蛋白，VE-cadherin）。内皮细胞也表达N-钙粘蛋白、T-钙粘蛋白、称为VE-钙粘蛋白-2的相关蛋白。在内皮细胞中表达的VE-钙粘蛋白和其它钙粘蛋白通过与细胞骨架蛋白和信号分子的复杂网络的作用在细胞内传递信息。VE-钙粘蛋白与β-连环蛋白（β-catenin）、斑珠蛋白（plakoglobin）、和p120连环蛋白形成复合物，并在结构上可能接触到类似于附着连接的激动蛋白细胞骨架。内皮附着连接的形成、维持和解离是血管形成和功能的重要调控点。

与内皮附着连接相关的信号通路包括wnt通路、Rho GTP酶和通过受体酪氨酸激酶的信号，它们可候选用于进一步研究萌发能力表型的激活。除了附着连接的组分VE-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、T-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白-2，以及VE-钙粘蛋白和β-连环蛋白、斑珠蛋白、和p120连环蛋白的相互作用蛋白，以及PECAM-1以外，来自上述这些信号通路的基因和蛋白产物是用于本发明微血管网络试验中操作和检测的候选物。而且，采用本发明的微血管试验和方法可解释未知的下游事件。

紧密连接的组分也是已知的，包括跨膜附着蛋白、细胞内分子和信号通路。密封蛋白（occludin）、封闭蛋白（claudin）（例如claudin1和2，和其它claudin家族成员）、连接附着分子（例如JAM-A、JAM-B、JAMC）参与了紧密连接的附着功能。紧密连接的细胞内组分包括膜结合鸟苷酸激酶家族成员（MAGUK），包括ZO-1、和相关ZO-2、和ZO-3，还有非MAGUK蛋白AF-6/afadin、Par-3/ASIP、和MUPP-1（Bazzoni and Dejana2004）。对紧密连接组分的操作可产生有关激活萌发能力的重要信息，并有助于确定这些血管的屏障功能。此外，采用本发明的微血管试验和方法可解释未知的下游事件。

无需过度的努力即可分离附着连接和紧密连接或相关信号组分的每个已知基因，并对它们进行基因工程化以检测过表达、基因剂量、突变、或功能缺失在采用本发明所列方法的血管生成中对内皮细胞功能的影响。可从NIH Genbank基因序列数据库中获取每个基因的序列数据，以利于这些分析。

在血管生成和血管发生中内皮细胞的形态发生

内皮细胞形态发生包括由现有血管形成血管的血管生成（angiogenesis），以及由组织中或来自循环传递的内皮细胞（EC）或EC前体和祖细胞形成血管的血管发生（vasculogenesis）。内皮细胞形态发生也包括基于信号输入和调节的微血管退化的情况。

激活的萌发表型诱导由亲代血管萌发的微血管的增殖。这种表型也可能与来自内皮细胞之间接触以及内皮细胞和细胞外基质（ECM）接触的内皮细胞形态发生有关。已显示在新形成血管中内皮细胞形态发生受基质-整联蛋白-细胞骨架（MIC）信号通路的影响（Review,Davis,Bayless et al.2002）。

这个MIC通路由通过细胞间连接接触的细胞之间的相互作用和细胞与细胞外基质成分之间的相互作用启动。整联蛋白（例如α2β1、α1β1、αvβ3、α5β1、α6β1）的参与和细胞外基质的相互作用，细胞骨架元件（例如：肌动蛋白、微管、和中间丝细胞骨架）和下游信号和调节分子（例如Rho GTP酶、Rho A、Rac1、Cdc42、PAK-1、侧向抑制因子、ECM降解蛋白酶)的参与全都有助于内皮细胞在形态发生期间形成管状结构、萌发和分枝成新的微血管的能力。

降解ECM的膜型基质金属蛋白酶（MT-MMPs）被假定参与内皮细胞形态发生（Hiraoka,Allen et al.1998）;（Hotary,Allen et al.2000）。用于研究和操作的候选物是MMP-1、MMP-2、MMP-9，以及其它等同的MT-MMPs（Davis,Bayless et al.2002）。此外，已显示当内皮细胞悬浮在胶原中时，阻遏MT-MMPs的抑制因子（例如蛋白TIMP-2，和化学的MMP抑制子GM6001）会阻遏内皮细胞形态发生（未公开数据，Davis,Bayless et al.2002）。TIMP-2抑制内皮细胞增殖，它是天然金属蛋白酶抑制因子的TIMP家族成员。化学药品GM6001是胶原酶的抑制剂并可由Millipore提供。

侧向抑制是细胞亚类产生抑制邻近细胞的因子的现象，该现象会导致选择性分化。这种抑制因子在内皮萌发密度中发挥作用（Davis,Bayless et al.

2002）。例如，调节侧向抑制的分子是Notch配体Jagged和Delta（Lindsell,Boulter et al.1996;Zimrin,Pepper et al.1996;Bell,Mavila et al.2001）。此外，已显示在内皮细胞中存在Notch1和Notch4受体（Zimrin,Pepper et al.1996;Uyttendaele,Closson et al.2000;Lindner,Booth et al.2001）。这些因子是用于研究和操作的候选物，以确定它们对内皮形态发生的整体作用。

在本发明方法中，操作MIC组分和检测来自MIC和下游通路的单个产物是可行的。已知许多与MIC信号和内皮细胞形态发生相关的基因和基因产物，且可在微血管试验中评估它们对萌发能力和血管生成的贡献。

无需过度的努力即可分离已知的MIC通路基因或相关信号和调节组分，并对它们进行基因工程化，以检测过表达、基因剂量、突变、或功能缺失在采用本发明所列方法的血管生成中对内皮细胞功能的影响。可从NIHGenbank基因序列数据库获取每个基因的序列数据，以利于这些分析。

影响血管生成的产物的筛选

现在参考图23，示意性地描述了筛选影响亲代血管、微血管萌发和微血管网络形成的细胞（C）、产物（P）和组织（T）的试验。利用CPD（例如CPD1350、CPD900、或等同物）和高密度接种以激活萌发能力表型的方法，可检测微血管萌发的响应以及微血管网络的形成。微血管网络可用于通过监测微血管网络的形成而筛选基质或灌注液培养基中的促血管生成和抗血管生成因子，其中该网络生长的增长指示促血管生成因子，该网络生长的减慢指示抗血管生成因子。

检测了分布在整个基质中或局部集中的候选物，包括细胞（C）、产物（P）和组织（T）。可选地，将细胞（C）和产物（P）加入到灌注液培养基中。在许多实施方式中，可检测从不同的要检测的候选物中释放的生物活性产物。生物活性是指候选物以某些可辨别的方式影响萌发微血管的生长，例如通过提供在生长上的可测量的差异。

细胞可以是内皮细胞、平滑肌细胞、外周细胞、成纤维细胞、祖细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、真核细胞、基因工程化细胞、基因修饰的细胞、病态细胞、病毒感染细胞、和癌细胞。产物可以包括生长因子（例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、佛波酯（例如12-肉豆蔻酸-13-佛波乙酯（PMA））、血小板衍生生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、肝素结合生长因子（HB-EGF）、白介素-8（IL-8）、长R³胰岛素样生长因子（R³IGF-1）、胰岛素样生长因子（例如IGF-1）、人上皮生长因子（hEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）、肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF）、细胞因子、血管生成素、胎盘生长因子、多种趋化因子（例如SDF-1α）、TGF-β、可溶性有丝分裂原、细胞附着蛋白（例如纤连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序（RGD）蛋白、RGD-肽、明胶、胶原、和不同亚型胶原）、合成肽、和等同生物活性化合物。组织可以是健康的、癌症的、病毒感染的、或基因修饰或工程化的。

通过导管2308可以将至少一种细胞类型2304高密度接种2313到在CPD2300的基质2312内的通道2316中。至少一种细胞类型可以是HUVECs,或细胞类型的组合（例如SMC、外周细胞、祖细胞、干细胞），它们中的一些能够通过细胞-细胞、细胞-基质、细胞-生长因子和灌注液流动的物理接触来激活由亲代血管2328萌发微血管的能力。可选地，所述细胞2336可以是基因修饰的或工程化的以释放生物活性产物。培育经接种的通道进一步使亲代血管发育成汇合的细胞层2331。

第一灌注液培养基2320可去除培育大约45分钟之后未附着到通道基质壁2316的细胞2304。依据实验条件，可以大大缩短或省略培育时间。第一灌注液培养基2320或第二灌注液培养基2332也可以使亲代血管2328的生长。

在不同实施方式中，所述灌注液培养基可以是相同的组合物或按需要的不同配方组合物。细胞（C）、产物（P）、或组织（T）2311可被局部集中或分散地接种到基质2312的不同位置上。可选地，可以将细胞（C）或产物（P）2314加入到灌注液培养基2320、2332中。产物（P）（例如促血管生成和抗血管生成生物活性化合物）也可由亲代血管2328的细胞所分泌。

现在共同参考图24A和图24B，示意性地描述了在高密度接种细胞之后，微血管萌发和网络形成对添加候选细胞（C）、候选产物（P）和候选组织（T）的响应。为图示目的仅描述了单个亲代血管的一部分。在一系列CPDs中，在不同实施方式中分析了单个、俩个或复杂阵列的亲代微血管。

在图24A和图24B中，示意性地描述了两个具有不同量的候选物的CPDs，所述候选物包括局部集中的候选细胞（C）、候选产物（P）或候选组织（T）。在图24A中，显示CPD2400包括具有较高量的候选细胞（C）、候选产物（P）或候选组织（T）的基质2404。类似地，可在灌注液2416中加入较高量的细胞（C）或产物（P）2412。以灌注液培育之后，通过测量2428新萌芽2420、2424的长度可评估加入候选细胞（C）、产物（P）或组织（T）的作用。局部集中的候选物的促血管生成作用会导致靠近被检测候选物的萌发增加并更茂盛2420，远离候选物的萌芽会表现出生长减慢2424。预期在灌注液中加入更高量的细胞（C）或产物（P）2412会使亲代血管向所有侧面的萌芽的生长增加（未画出）。在图24B中，CPD2430含有局部集中的较低量的候选细胞（C）、产物（P）或组织（T），或类似地具有加入到灌注液2416中的较低量的候选细胞（C）或产物（P）2438。相对于具有较高量2400的CPD，靠近被检测候选物的萌芽2442预期会生长较慢2450。在一些情况中，靠近2442和远离2446候选物的萌芽的大小类似。通过检测候选物量的宽范围，可以根据新萌芽相对于对照的生长增长的程度来确定促血管生成作用。

现在共同参考图25A和25B，示意性地描述了两个CPDs具有不同量的局部集中的候选细胞（C）、产物（P）或组织（T）候选物。在图25A中，描述了CPD2500包括具有较高量的候选细胞（C）、产物（P）或组织（T）2508的基质2504。类似地，可在灌注液2516中加入较高量的细胞（C）或产物（P）2512。以灌注液培育之后，通过测量2528新萌芽2520、2524的长度可评估加入候选细胞（C）、产物（P）或组织（T）的作用。局部集中的候选物的抗血管生成的作用会导致靠近被检测候选物的萌发减少或甚至不萌发2520，而远离候选物的萌芽会表现出一些或甚至正常的生长2524。预期在灌注液中加入较高量的细胞（C）或产物（P）2512会使亲代血管向所有侧面的萌芽的生长减慢（未画出）。在图25B中，CPD2530含有局部集中2534的较低量的候选细胞（C）、产物（P）或组织（T），或类似地具有加入到灌注液2516中的较低量的细胞（C）或产物（P）2538。相对于具有较高量2500的CPD，靠近被检测候选物的萌芽2542预期会表现出更正常的生长2450。在一些情况中，靠近2542和远离2546候选物的萌芽的大小类似，这表明候选物的抗血管生成作用较小或无作用。通过检测候选物量的宽范围，可以根据新萌芽相对于对照的生长抑制程度来确定抗血管生成作用。

在可选实施方式中，可在单个CPD中检测局部集中候选物量的增加。此外，在微血管形成试验以不同实施方式检测多种组合物。例如，在示意图中仅描述一个亲代血管，但不同实施方式可具有两个或多个亲代血管，所述亲代血管在基质不同位置上具有局部集中或分散的细胞（C）、产物（P）或组织（T）。在可选的实施方式中，也可在微血管萌发之前和之后的不同时间加入细胞（C）、产物（P）或组织（T）。此外，可在一个或多个亲代血管之间形成复杂微血管网络之前和之后加入细胞（C）、产物（P）或组织（T）。在另外实施方式中，可在一个通道中接种内皮细胞以形成亲代血管，而在第二通道中接种用于组织模型或组织工程化的癌细胞或实质细胞或基质细胞。而且，应当理解广泛混合的通道可接种多种要检测的细胞类型（例如ECs-动脉、ECs-静脉、淋巴ECs、来自肝或其它组织的实质细胞）。

血管生成试验

现在共同参考图26A和图26B，描述了模拟细胞诱导的血管生成的实施方式。在图26A中，描述了来自CPD2600的两个胶原通道的明视图，一个通道接种了已形成萌发亲代血管2604的HUVECs，而第二个通道接种了BT474细胞系的乳腺癌细胞2608。HUVEC亲代血管显示了朝乳腺癌细胞生长的萌芽2610、2620、2630、2640，这代表了可能从癌细胞释放的生物活性产物具有促血管生成的潜能。在图26B中，描述了同一微血管的相应荧光显微镜图像。在接种之前，HUVECs以染料2650染色，而乳腺癌细胞是具有不同细胞染料2660的染色细胞(分别是细胞示踪绿CMFDA和细胞示踪橙CRMA，颜色未画出)。因而，由HUVEC亲代血管生长的萌芽2610、2620、2630和2640是内皮来源的，可检测促血管生成和抗血管生成效应。

本发明在这里所描述的相当多的细节是为了遵守专利法，并为本领域技术人员实施本发明的新原理而提供信息，并构建和使用所需要的这些示例性的和专门的组分。但是，应该理解的是，本发明可以通过不同的专用设备和装置以及构建法则进行实施，在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下，可以进行包括具体设备和操作程序在内的多种改变。

说明书中所引用的所有参考文献的全文在此一并引入作为参考。如果发生其它方面的不可调和的冲突，以本说明书为准。

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Claims (53)

1.一种在体外形成可灌注微血管网络的方法，其中，该方法包括以下步骤：

将至少一种能够萌发的细胞类型的细胞接种到基质内的至少一个通道中（1300）；

激活至少一种细胞类型由亲代血管萌发微血管的能力，其中，所述萌发的能力是由接种密度触发的（1304）；

使用至少一种培养基灌注所述至少一个通道，使所述至少一种细胞类型形成至少一个亲代血管（1324）；

培育并灌注所述至少一个亲代血管以维持活力并从所述至少一个亲代血管向周围基质萌发微血管（1328）；

使萌发的微血管生长，直至所述微血管形成了网络（1332）。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型的萌发能力来自由细胞之间的接触（1308）所激活的细胞信号。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型的萌发能力来自由细胞之间的接触（1308）和由细胞与基质之间的接触（1312）所激活的细胞信号。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型的萌发能力来自选自由细胞-细胞介导的接触（1308）、细胞-基质介导的接触（1312）、以及生长因子-细胞介导的接触（1316）所组成的组中的细胞信号。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，大部分细胞处于相互的细胞与细胞之间的接触（1308）。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，大部分细胞几乎处于相互的细胞与细胞之间的接触（1308）。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞（1）是以每平方毫米的通道至少250个细胞的方式存在。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞（1）是以每平方毫米的通道250-2000个细胞的方式存在。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，由所述亲代血管萌发的微血管吻合以形成微血管网络（1332）。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲代血管支持植入在所述基质（2312）内的组织（2311）的至少一种细胞类型的生长。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述亲代血管是三维的亲代血管阵列。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型选自由内皮细胞（1）、平滑肌细胞、成纤维细胞、外周细胞、祖细胞、干细胞、实质细胞、基质细胞、肌细胞、肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、人细胞、动物细胞、真核细胞、基因工程化细胞、基因修饰的细胞、病态细胞、病毒感染的细胞和癌细胞所组成的组中。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述内皮细胞（1）来自内皮细胞系。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述内皮细胞系选自由微血管内皮细胞系、大血管内皮细胞系、以及个体衍生的内皮细胞系所组成的组中。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述细胞释放生物活性产物进入所述灌注液培养基（2332）。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述细胞释放生物活性产物进入所述基质（2312）。

17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述细胞释放基因工程化生物活性产物进入所述灌注液培养基（2332）。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，监测所述微血管网络（2428）以用于筛选所述基质（2404）中的促血管生成因子和抗血管生成因子，其中，所述网络生长的增加用以指示促血管生成因子，所述网络生长的减慢用以指示抗血管生成因子。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，监测所述微血管网络（2428）以用于筛选所述灌注液培养基（2416）中的促血管生成因子和抗血管生成因子，其中，所述网络生长的增加用以指示促血管生成因子，所述网络生长的减慢用以指示抗血管生成因子。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型包括动脉内皮组织的含有基因工程化分子标记的内皮细胞（1）。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型包括淋巴内皮组织的含有基因工程化分子标记的内皮细胞（1）。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种细胞类型包括静脉内皮组织的含有基因工程化分子标记的内皮细胞。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种是使用选自由内皮细胞（1）、平滑肌细胞、外周细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、以及干细胞所组成的组中的细胞进行的。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种是使用内皮细胞（1）进行的。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种是使用内皮细胞（1）和平滑肌细胞进行的。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种是使用内皮细胞（1）、平滑肌细胞和外周细胞进行的。

27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种是使用内皮细胞（1）、平滑肌细胞、外周细胞和成纤维细胞进行的。

28.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一个通道中生长有内皮细胞（1），而至少一个通道中生长有至少一种非内皮细胞类型。

29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质中的至少一个通道是由轴芯（2）形成的。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，通过抽取而去除所述轴芯（2）。

31.根据权利要求29所述的方法，其中，通过降解而去除所述轴芯（2）。

32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个通道的接种（1300）是通过选自由以下方法所组成的组中的方法进行的：向所述基质通道中注入细胞、将细胞预先附着到所述轴芯上、以及将细胞预先附着到所述轴芯上和向所述基质通道中注入细胞的组合。

33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质中的至少一个通道的直径是20微米-500微米。

34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质中的至少一个通道的直径是500微米-5.5毫米。

35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质（1391）含有选自由纤维蛋白、胶原、亚型胶原、明胶、凝胶的基底膜、琼脂、琼脂糖、藻酸盐、基底膜蛋白、细胞外基质蛋白、硅胶和细胞所组成的组中的物质。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述基底膜蛋白选自由IV型胶原、基底膜蛋白多糖、层粘连蛋白、整联蛋白、巢蛋白、营养不良蛋白聚糖、VII型胶原纤维和VII型胶原微原纤维所组成的组中。

37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述细胞外基质蛋白选自由蛋白聚糖、糖胺聚糖、硫酸肝素蛋白聚糖、硫酸软骨蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、透明质酸、胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白和层粘连蛋白所组成的组中。

38.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质还含有生长因子。

39.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基质（1391）中生长有选自由内皮细胞（1）、平滑肌细胞、外周细胞、成纤维细胞、祖细胞、干细胞、肌细胞、肝细胞、肺细胞、皮肤细胞、上皮细胞、人细胞、动物细胞、植物细胞、真核细胞、实质细胞、基质细胞、基因工程化细胞、基因修饰的细胞、病态细胞、病毒感染的细胞和癌细胞所组成的组中的细胞。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，微血管网络（2428）生长的增加用以指示所述细胞正在分泌促血管生成因子（2412），而微血管网络（2528）生长的减慢用以指示所述细胞正在分泌抗血管生成因子（2512）。

41.根据权利要求1所述的方法，其中，至少一种组织（2311）被植入到所述基质中。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种组织（2311）选自由健康组织、病态组织、癌症组织、以及基因工程化组织所组成的组中。

43.根据权利要求41所述的方法，其中，微血管网络（2428）生长的增加用以指示所述组织正在分泌促血管生成因子，微血管网络（2528）生长的减慢用以指示所述组织正在分泌抗血管生成因子。

44.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种灌注液培养基的流动与体内的毛细管的流动相似。

45.根据权利要求1所述的方法，其中，通过减少向一个亲代血管（202）的流入并增加在另一亲代血管（200）上的阻力，使所述至少一种灌注液培养基（204）优先流经连接亲代血管的所述微血管网络。

46.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种灌注液培养基含有细胞生长培养基，该细胞生长培养基中补充了选自由促血管生成因子、抗血管生成因子、血清、佛波酯、以及生长因子所组成的组中的成分。

47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述至少一种灌注液培养基的充氧基本上是通过所述基质（1391）的扩散完成的。

48.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种培养基含有生长因子。

49.一种在培养灌注设备（1350）中在体外形成可灌注微血管网络的方法，其中，该方法包括以下步骤：

在所述培养灌注设备（1350）的腔（1390）内的轴芯（1384）周围注入基质（1391）；

去除所述轴芯（1384），在所述基质（1391）内形成通道（1388）；

将导管（1381）连接在至少一个入口（1354）和出口（1392）上；

通过所述导管（1382）将至少一种细胞类型接种到所述通道（1384）中；

使所述细胞在所述通道（1388）内分布；

通过充入所述入口（1354）并充满至少一个入口（1354）和出口（1392）来灌注所述培养灌注设备（1350）；

培育所述培养灌注设备（1350）以形成亲代血管（1393），其中，当接种密度足以触发萌发时，由所述亲代血管萌发微血管；以及

通过培育所述培养灌注设备（1350），形成可灌注微血管网络。

50.一种筛选促血管生成产物和抗血管生成产物的方法，其中，该方法包括以下步骤：

由激活的具有萌发能力的亲代血管（2328）生成可灌注微血管网络，其中，在灌注设备（2300）的基质（2312）内植入所述微血管网络；

将候选物（2311）加到所述基质内；

灌注并培育所述灌注设备；

检测与所加候选物（2311）相关的微血管网络（2428）的三维生长。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述候选物选自由细胞、产物、以及组织（2311）所组成的组中。

52.根据权利要求50所述的方法，其中，将所述候选物加到所述灌注液培养基（2332）中，而不是所述基质（2312）中。

53.一种用于在体外生成可灌注微血管网络的培养灌注设备，其中，该设备包括：

用于将至少一种能够萌发的细胞类型接种到基质内的至少一个通道中的装置，其中，所述至少一个通道与灌注装置是流通的；

用于激活所述至少一种细胞类型由亲代血管萌发微血管的能力的装置，其中，所述萌发的能力是由接种的密度触发的；

灌注装置，该灌注装置用于将至少一种培养基灌注至所述至少一个通道以使所述至少一种细胞类型形成至少一个亲代血管，其中，所述灌注装置位于培育装置中；

用于培育并灌注至少一个亲代血管以维持活力并使所述至少一个亲代血管向周围基质萌发微血管的装置；以及

用于通过所述培育装置使萌发的微血管生长直至所述微血管形成网络的装置。

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