JP7308525B2 - 管状組織作製デバイス、管状組織作製キット及び管状組織の作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、管状組織作製デバイス、管状組織作製キット及び管状組織の作製方法に関する。なお、本出願は日本国特許庁に２０１７年１２月１１日に出願した特願２０１７－２３６７４６号を基礎とする優先権を主張する出願であり、参照によってその明細書全体が本明細書中に取り込まれる。

近年、再生医療や薬物応答組織モデルへ利用することを目的として、細胞を用いた三次元的な組織、臓器を作製する技術が開発されている。従来、接着性細胞の多くは生体外では二次元的（平面）にしか培養できなかった。しかし、生体の多く組織は、細胞が三次元的に積みあがることで構築されたものであり、より生体内の状態に近づけるためには、細胞を三次元的に構築する技術が求められていた。

細胞を三次元的に構築する試みとしては、例えば、細胞をスキャフォールドと呼ばれる足場に播種して三次元的に組織を構築して移植する方法や、臓器・組織を脱細胞化し、残存したマトリックスを足場として細胞を播種して三次元化する方法、シート状に剥離した細胞シートを三次元的に積層して組織を構築する方法などが開発されている。これらはいずれも再生医療分野や創薬分野での応用が期待される技術であり、早期の実用化が待ち望まれている。

細胞シートを作製するために、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０～８０℃であるポリマーを培養基材表面に被覆した細胞培養皿（温度応答性培養皿）が開発されている（特許文献１）。当該細胞培養皿を用いて、培養皿表面に被覆されたポリマーの上限臨界溶解温度未満又は下限臨界溶解温度以上にて細胞培養し、細胞がコンフルエントになる状態まで培養した後に上限臨界溶解温度以下又は下限臨界溶解温度未満にすると、細胞をシート状かつ非侵襲的に回収することができる。

細胞シートを作製する方法が確立されたことにより、細胞治療の技術は劇的に変化を遂げた。しかしながら、細胞移植では治療効果を示さないと考えられる重篤な患者に対しては、依然として臓器移植が有効な治療手段のままである。ところが、臓器移植を必要とする患者の数に対して、供給される臓器の数は圧倒的に少なく、生体外で臓器又は組織を構築し、供給する技術の開発が求められている状況である。こうした課題に対しても細胞シート工学の技術が応用されており、細胞シートを積層することで厚みをもった三次元生体組織を構築する試みが行われている。例えば、血管床上に細胞シートを段階的に積層し、血管網を付与した組織を作製する方法が開発されている（特許文献２）。また、平面の組織だけではなく、管状の血管に心筋細胞シートを巻き付けることにより、ポンプ機能を付与する試みも行われている（非特許文献１）。

特開平０２－２１１８６５号公報 国際公開第２０１２／０３６２２４号

Ｓｅｋｉｎｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｓａｔｉｌｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｔｕｂｅｓ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６ Ｊｕｌ ４；１１４（１ Ｓｕｐｐｌ）：Ｉ８７－９３．

シート状組織（例えば、細胞シート等）積層することで厚みをもった三次元生体組織を作製する試みが行われているが、シート状組織は非常に薄く、脆いために、所望の形状に積層するためには、操作者の熟練した技術を必要とするものであった。特に、管状組織の内壁にシート状組織を積層することは困難であり、操作者の技量に依存することがなく、より簡便なシート状組織を積層する新たな方法が必要であった。このような課題に対し、本発明は、簡便かつ安定して管状組織を作製する方法を提供することを目的とする。また、当該方法を実施するための管状組織作製デバイス及び管状組織作製キットを提供することを目的とする。

上記課題に対し、本発明者らが鋭意検討を行ったところ、管状支持体に陰圧を印加することにより、非接触状態で管状支持体を膨張させることができ、操作者の手技の熟練度に依存せずに簡便かつ安定して管状組織を作製することを可能とする、管状組織作製デバイス、管状組織作製キット及び管状組織の作製方法を開発するに至った。すなわち、本発明は以下を含む。

［１］ 管状支持体を収容するためのチャンバと；
前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第１支持部と；
前記チャンバの内部空間の圧力を制御するための加減圧手段と、
を備え、
ここで第１支持部は、前記管状支持体の第１開口部を固定し、前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通し、かつ、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離するための第１支持部である、
管状組織作製デバイス。
［２］ 前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第２支持部をさらに備え、
ここで前記第２支持部は、前記管状支持体の第２開口部を固定し、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの外とを連通し、かつ、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離するための第２支持部である、［１］に記載のデバイス。
［３］ 前記チャンバに、前記チャンバの内外を連通する流体注出入口をさらに備え、
ここで前記加減圧手段が前記流体注出入口に接続されている、［１］又は［２］に記載のデバイス。
［４］ 前記加減圧手段が、シリンジである、［３］に記載のデバイス。
［５］ 前記加減圧手段と前記流体注出入口との間に、バルブ機構を備える、［３］又は［４］に記載のデバイス。
［６］ 前記チャンバに、前記管状支持体を備える、［１］～［５］のいずれか１項に記載のデバイス。
［７］ 前記管状支持体が、生体組織由来の管状支持体である、［１］～［６］のいずれか１項に記載のデバイス。
［８］ 前記チャンバの内外と連通し、培地供給流路と接続した動脈接続部と、
前記チャンバの内外と連通し、培地排出流路と接続した静脈接続部と
をさらに備えた、［１］～［７］のいずれか１項に記載のデバイス。

［９］ ［１］～［８］のいずれか１項に記載のデバイスと、
シート状組織移送デバイスと、
を含む、管状組織作製キット。
［１０］ 前記シート状組織移送デバイスが、膨縮手段を有する、［９］に記載のキット。

［１１］ 管状組織の作製方法であって、
管状支持体を収容するためのチャンバと；
前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第１支持部と；
前記チャンバの内部空間の圧力を制御するための加減圧手段と、
を備える、管状組織作製デバイスを用い、
（１）前記第１支持部に管状支持体の第１開口部を固定することにより前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通させる工程、
（２）前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離させる工程、
（３）前記加減圧手段によって、前記チャンバの内部空間を減圧し、前記管状支持体を膨張させる工程、
（４）前記第１支持部の外端開口より、シート状組織を担持したシート状組織移送デバイスを挿入し、前記管状支持体の内壁に前記シート状組織を貼付する工程、
を含む、方法。
［１２］ 前記管状組織作製デバイスが、前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第２支持部をさらに備え、
ここで前記工程（２）は、前記第２支持部に前記管状支持体の第２開口部を固定することにより前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通させる工程、である、
［１１］に記載の方法。
［１３］ 前記工程（４）の後に、さらに、
（５）前記加減圧手段によって、前記チャンバの内部空間を加圧し、前記管状支持体を収縮させる工程、
を含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］ 前記シート状組織移送デバイスが、膨縮手段を有する、［１１］～［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］ 前記工程（３）及び（４）を任意の回数繰り返す、［１１］～［１４］のいずれか１項に記載の方法。

本発明によれば、形状が複雑である管状支持体であっても、その内壁に、簡便かつ安定してシート状組織を貼付及び積層することを可能とする。これにより、厚みをもった管状組織を簡便かつ再現良く提供可能となる。

一実施形態における、管状組織作製デバイスの斜視図を示す。以下の図２～５に示す管状組織作製デバイスの概略図は、同一平面Ｐの断面図を表している。 一実施形態における、管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 一実施形態における、管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 一実施形態における、管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 一実施形態における、管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 一実施形態における管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 一実施形態における管状組織作製デバイスを示す概略断面図である。 本発明の管状組織作製デバイスにおいて、減圧前後の小腸を示す図である。（Ａ）減圧前の小腸、（Ｂ）減圧後の小腸。 本発明の管状組織作製デバイスを用いて作製した管状組織切片像を示す図である。管状組織切片における細胞核（青、Ｈｏｅｃｈｓｔ）及び心筋トロポニンＴ（緑、ｃＴｎＴ）染色像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。 本発明の管状組織作製デバイスを用いて作製した管状組織切片像を示す図（拡大図）である。（Ａ）ＨＥ染色像、（Ｂ）細胞核（青、Ｈｏｅｃｈｓｔ）及び心筋トロポニンＴ（緑、ｃＴｎＴ）染色像を示す。スケールバーは１００μｍを示す。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではなく、また実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

本明細書において、「管状組織」とは、管状支持体にシート状組織を貼付することにより得られる構造体をいう。

本明細書において、「管状支持体」とは、管腔構造を有する構造体であり、特に生体組織由来の管腔構造体をいう。管状支持体としては、例えば、腸管（小腸、大腸など）、食道、胃などの消化管、血管、リンパ管、胆管、尿管、膀胱、尿道、気管、子宮、卵管などを用いることができる。従来、このような管状支持体は、収縮した状態のものが多く、内側にシート状組織を貼付しようとする場合、所望の部位に到達する前にシート状組織が脱落し、貼り付けることが困難であった。本発明を適用することにより、管状支持体であっても簡便かつ安定的にシート状組織を貼付することが可能とする。

管状支持体は、貼付するシート状組織が壊死しないように、動脈及び静脈が結合した状態で採取したものを用いることができる。また、管状支持体は、公知の方法によって、脱細胞化した管状支持体を用いることができる。

本発明に用いられる管状支持体は、少なくとも１つの開口を有している。本明細書において、「開口部（第１開口部及び第２開口部）」とは、当該開口とその周辺部分を含む意味で用いられる。管状支持体の開口部は、本発明の管状組織作製デバイスに設けられている支持部（第１支持部又は第２支持部（後述））」に固定され、管状組織作製デバイスのチャンバの外部空間と連通される。本発明に用いられる管状支持体の開口部は、メスやハサミなどをもちいて人為的に形成したものであってもよい。

本明細書において、「シート状組織」とは、任意の細胞を含む１層又は複数層のシート形状の組織をいう。シート状組織は、生体組織から回収したシート状組織であってもよく、細胞とハイドロゲルとを混合して、培養することにより得られたものであってもよく、細胞シートであってもよい。

シート状組織の作製に用いられる細胞の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。また、シート状組織の作製に用いられる細胞種、細胞数、含まれる細胞の割合等については、用途に応じて適宜選択、又は調整すればよい。

本明細書において、「細胞シート」とは、細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる１層又は複数層の細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材にて細胞を培養し、細胞培養基材の端部から物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。好ましい形態としては、刺激応答性培養基材として、０～８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材を用いる方法であり、例えば、セルシード社（日本、東京）から市販されているＵｐＣｅｌｌ（登録商標）を用いることにより、簡便に細胞シートを得ることができる。

本発明に用いられる管状支持体、シート状組織は、目的に応じて適宜組み合わせを選択することが可能であり、限定されない。シート状組織に含まれる細胞についても、目的に応じて適宜選択することが可能である。

１．管状組織作製デバイス
図１は、本発明の一実施形態にかかる管状組織作製デバイス１の外観（図１は、後述の管状組織作製デバイス１ｃの外観）の斜視図を示す。図２～５の管状組織作製デバイス１の図は、図１で示される管状組織作製デバイス１の同一平面Ｐの断面図を示している。

１－１．第１形態
図２で示される本発明の一実施形態において、管状組織作製デバイス１ａは：
管状支持体２０を収容するためのチャンバ１０と；
前記チャンバ１０の内外を連通し、前記管状支持体２０を固定するための第１支持部１１と；
前記チャンバ１０の内部空間Ｓ１の圧力を制御するための加減圧手段１５と、
を備え、
ここで第１支持部１１は、前記管状支持体２０の第１開口部２０ａを固定し、前記管状支持体２０の内腔Ｓ２と前記チャンバの外とを連通し、かつ、前記管状支持体２０の前記内腔Ｓ２と前記チャンバ１０の前記内部空間Ｓとを隔離するための第１支持部１１である。

図１に示すように、チャンバ１０は、チャンバ本体１０ａとチャンバ蓋体１０ｂを備える。チャンバ本体１０ａとチャンバ蓋体１０ｂと組み合わせることで、チャンバ１０の内外の空間を分離することができる。チャンバ本体１０ａとチャンバ蓋体１０ｂが密着する縁部分には、それぞれを密着させるためのシール部材（例えば、Ｏリング、パッキン等）を備えている。チャンバ本体１０ａとチャンバ蓋体１０ｂは、チャンバ固定具１０ｄにより、固定される。チャンバ固定具１０ｄとしては、例えば、複数のスナップ錠によって固定することができる。チャンバ蓋体１０ｂの一部には、チャンバ１０の内部を視認できるように窓部１０ｃが設けられている。

チャンバ１０の一部には、チャンバ１０の内外を連通し、管状支持体２０を固定するための第１支持部１１が設けられている。第１支持部１１がチャンバ１０の内外を連通していることにより、管状支持体２０とチャンバ１０の外部空間との圧力を同一にすることが可能となる。第１支持部１１は、チャンバ１０の内側に突出して設けられており、これにより管状支持体２０の第１開口部２０ａを固定することができる。第１支持部１１は、円筒形状を有しており、チャンバ１０の内外の空間を連通させる役割を果たす。第１支持部１１の形状は、円筒形状に限らず、中空の角柱（三角柱、四角柱、六角柱等）であってもよい。第１支持部１１の径は、用いられる管状支持体２０の径によって適宜変更することができる。チャンバ１０の第１支持部１１の外側部分（第１支持部の第１外端部１１ａ）は、図２のように突出した形状であってもよいが、チャンバ１０の外壁から突出せずに、第１外端開口１１ｂのみを有する形状であってもよい。

第１支持部１１と、管状支持体２０の第１開口部２０ａは、第１シール部材１７ａにより固定される。第１シール部材１７ａは、例えば、縫合糸などであってもよく、シリコーンゴム、天然ゴム、樹脂または金属などからなるパイプクリップであってもよい。また、第１シール部材１７ａは、フィブリンゲルなどの生体接着物質を用いるものであっても良く、第１開口部２０ａと第１支持部１１との間を密着させる機能を有するものであれば適用することができる。第１支持部１１の一部には、溝が設けられていても良く、これにより、第１シール部材１７ａが食い込み、管状支持体２０の第１開口部２０ａをより密着して固定させることができる。

チャンバ１０には、チャンバ１０の内部空間Ｓ１の圧力を制御するための加減圧手段１５が設けられている。加減圧手段１５は、図２（Ａ）に示されるように、チャンバ１０の内外を連通する流体注出入口１３と第１流路１４を介して接続されている。加減圧手段１５は、例えば、シリンジやポンプなど、公知の手段を用いることができる。簡素な機構であり、加減圧の微妙な調節も可能であることから、加減圧手段１５としてシリンジは好ましい。加減圧手段１５は、チャンバ１０のチャンバ本体１０ａに設けられていても良く、チャンバ蓋体１０ｂに設けられていてもよい。

他の実施形態において、加減圧手段１５と流体注出入口１３との間の第１流路１４には、バルブ機構１６をさらに備えている。バルブ機構１６は、例えば、二方活栓や、クリップなどを用いることができる。バルブ機構１６のコック１６ａを回転させることによって、加減圧手段１５によって加圧又は減圧したチャンバ１０の内部空間Ｓ１の圧力を一定に保つことが可能となる。

本実施形態の管状組織作製デバイス１ａを用いる場合、管状支持体２０は、第１開口部２０ａ以外の開口部（例えば、図２（Ａ）の第２開口部２０ｂ）を有する場合は、開口部閉鎖手段２０ｄなどによって閉鎖する必要がある。これにより、管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバ１０の内部空間Ｓ２とを隔離することができる。この状態で、加減圧手段１５によりチャンバ１０の内部空間Ｓ２を減圧すると、図２（Ｂ）のように、管状支持体２０の内外に圧格差が生じ、管状支持体２０が膨張する。これにより、従来、管状の支持体の内側にシート状組織を貼付する場合、管状支持体が収縮して潰れているために、シート状組織を損傷させることなく貼り付けることが困難であったが、簡便かつ安定的にシート状組織を貼付することが可能となる。

１－２．第２形態
図３（図３－１～図３－３）で示される本発明の一実施形態において、管状組織作製デバイス１ｂは、管状組織作製デバイス１ａの各部材に加えて、チャンバ１０の一部に：
チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第２支持部１２、を備えている（図３）。

第２支持部１２は、管状支持体２０の第２開口部２０ｂを固定し、管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバ１０の外とを連通し、かつ、管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバの内部空間Ｓ１とを隔離する。第２支持部１２がチャンバ１０の内外を連通していることにより、管状支持体２０とチャンバ１０の外部空間との圧力を同一にすることが可能となる。第２支持部１２は、チャンバ１０の内側に突出して設けられており、これにより管状支持体２０の第２開口部２０ｂを固定することができる。第２支持部１２は、円筒形状を有しており、チャンバ１０の内外の空間を連通させる役割を果たす。第２支持部１２の形状は、円筒形状に限らず、中空の角柱（三角柱、四角柱、六角柱等）であってもよい。第２支持部１２の径は、用いられる管状支持体２０の径によって適宜変更することができる。チャンバ１０の第２支持部１２の外側部分（第２支持部の第２外端部１２ａ）は、図３のように突出した形状であってもよいが、チャンバ１０の外壁から突出せずに、第２外端開口１２ｂのみを有する形状であってもよい。

第２支持部１２と、管状支持体２０の第２開口部２０ｂは、第２シール部材１７ｂにより固定される。第２シール部材１７ｂは、例えば、縫合糸などであってもよく、シリコーンゴム、天然ゴム、樹脂または金属などからなるパイプクリップであってもよい。また、第２シール部材１７ｂは、フィブリンゲルなどの生体接着物質を用いるものであっても良く、第２開口部２０ｂと第２支持部１２との間を密着させる機能を有するものであれば適用することができる。第２支持部１２の一部には、溝が設けられていても良く、これにより、第２シール部材１７ｂが食い込み、管状支持体２０の第２開口部２０ｂをより密着して固定させることができる。

第２支持部１２は、第１支持部１１と径が同一ものであってもよく、径が異なるものでもあってもよい。第１支持部１１と第２支持部１２は、図１のようにチャンバ１０の両端に対向するように配置されている。これにより、管状支持体２０を均一に膨張させることができる（図３－１（Ｂ））。

１－３．第３形態
図４で示される本発明の一実施形態において、管状組織作製デバイス１ｃは、管状組織作製デバイス１ａ又は管状組織作製デバイス１ｂの加減圧手段１５として、チャンバ１０の少なくとも一部に弾性部材１５ａを有している。さらに、チャンバ１０の一部には、逆止弁ｂを備えている。弾性部材１５ａには、弾性部材１５ａに力を加えるための把持部１５０ａを備えている。弾性部材１５ａを押し込むと（図４の弾性部材１５ａ’）、チャンバ１０の内部空間Ｓ１の体積が小さくなり、内部空間Ｓ１に存在していた流体が、逆止弁１５ｂよりチャンバ１０の外へと排出される。その後、把持部１５０ａを引くことで弾性部材１５ａが元の形状又はさらに凸形状へと変化させる。この時、チャンバ１０の内部空間Ｓ１へは、再度流体が供給されないまま内部空間Ｓ１の体積が大きくなるために、内部空間Ｓ１の圧力が下がる。その結果、管状支持体２０の内外に圧格差が生じ、管状支持体２０が膨張する。これにより、従来、管状の支持体の内側にシート状組織を貼付する場合、管状支持体が収縮して潰れているために、シート状組織を損傷させることなく貼り付けることが困難であったが、簡便かつ安定的にシート状組織を貼付することが可能となる。

１－４．第４形態
図５で示される本発明の一実施形態において、管状組織作製デバイス１ｄは、管状組織作製デバイス１ａ、管状組織作製デバイス１ｂ又は管状組織作製デバイス１ｃの各部材に加えて、チャンバ１０の一部に：
チャンバ１０の内外と連通し、培地供給流路１９ａと接続した動脈接続部１８ａと、
チャンバ１０の内外と連通し、培地排出流路１９ｂと接続した静脈接続部１８ｂと、をさらに備えている。

管状支持体２０が、動脈２１及び静脈２２を有する管状支持体２０である場合、その動脈２１及び静脈２２をそれぞれ、動脈接続部１８ａ及び静脈接続部１８ｂへと接続させることができる。

動脈接続部１８ａは、培地供給流路１９ａと連通し、さらに培地供給手段（図示しない）と接続されている。これにより、培地供給手段に含まれる培地を管状支持体２０へと供給することができ、管状組織を構築中であっても、貼付されるシート状組織が虚血になることを防止することができる。

静脈接続部１８ｂは培地排出流路１９ｂと連通し、さらに培地排出層（図示しない）と接続されている。これにより、培地供給手段から供給され、管状支持体２０で消費された培地を、効率的にチャンバ１０の外へと排出することができる。

２．管状組織作製キット
一実施形態において、本発明は、上述の管状組織作製デバイス１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）と、シート状組織移送デバイス３０とを含む、管状組織作製キットを提供する。

シート状組織移送デバイス３０は、シート状組織ＳＴを載せて、シート状組織ＳＴを管状支持体２０の内壁２０ｃの任意の部位に貼付する機能を有するものを用いることができ、例えば、特開２００８－７９７８３号公報や、国際公開第２０１７／０４３６００号に記載のデバイスを用いることができる。簡単に述べると、図３－２（Ｃ）に示すように、シート状組織移送デバイス３０は、流体供給管３２と、その先端に設けられた筒状部３３と、筒状部３３の外周面に膨縮可能に設けられた膨縮手段３１とを有している。膨縮手段３１にはシート状組織ＳＴが巻き付けられている。上述の管状組織作製デバイス１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）によって膨張させ、第１支持部１１の第１外端開口１１ｂより、シート状組織ＳＴを担持したシート状組織移送デバイス３０を挿入する。その後、流体を、流体供給管３２を介して膨縮手段３１へと送り込み、膨縮手段３１を膨張させる。これにより、シート状組織ＳＴを管状支持体２０の内壁２０ｃに密着させることができ、シート状組織ＳＴを管状支持体２０の内壁２０ｃに貼付することができる。

シート状組織移送デバイス３０は、少なくともシート状組織を載置することができ、第１支持部１１の第１外端開口１１ｂを通過可能な形状であれば採用することができる。シート状組織ＳＴを管状支持体２０の内壁２０ｃに簡便かつ均一に貼付することができる点においては、膨縮手段３１を有することが好ましい。膨縮手段３１としては、例えばバルーンを用いることができる。

３．管状組織の作製方法
本発明は、上記の管状組織作製デバイス１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）と、シート状組織移送デバイス３０とを用いる、管状組織の作製方法を提供する。なお、管状組織作製デバイス１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）と、シート状組織移送デバイス３０の説明は、上述のものが適用される。

一実施形態において、管状組織の作製方法は、
管状支持体２０を収容するためのチャンバ１０と；
前記チャンバ１０の内外を連通し、前記管状支持体２０を固定するための第１支持部１１と；
前記チャンバ１０の内部空間Ｓ１の圧力を制御するための加減圧手段１５と、
を備える、管状組織作製デバイス１ａを用い、
（１）前記第１支持部１１に管状支持体２０の第１開口部２０ａを固定することにより前記管状支持体２０の内腔Ｓ２と前記チャンバ１０の外とを連通させる工程、
（２）前記管状支持体２０の前記内腔Ｓ２と前記チャンバ１０の前記内部空間Ｓ１とを隔離させる工程、
（３）前記加減圧手段１５によって、前記チャンバ１０の内部空間Ｓ１を減圧し、前記管状支持体２０を膨張させる工程、
（４）前記第１支持部１１の第１外端開口１１ｂより、シート状組織ＳＴを担持したシート状組織移送デバイス３０を挿入し、前記管状支持体２０の内壁２０ｃに前記シート状組織ＳＴを貼付する工程、
を含んでいる。

管状組織作製デバイス１ａを用いる場合であって、管状支持体２０が、第１開口部２０ａ以外の開口部（例えば、図２（Ａ）の第２開口部２０ｂ）を有する場合は、開口部閉鎖手段２０ｄなどによって閉鎖する必要がある。これにより、管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバ１０の内部空間Ｓ２とを隔離することができる（工程（２））。

他の実施形態において、管状組織の作製方法は、
チャンバ１０の内外を連通し、管状支持体２０を固定するための第２支持部１２をさらに備える管状組織作製デバイス１ｂを用いるものであってもよい。この場合、工程（２）は、第２支持部１２に管状支持体２０の第２開口部２０ｂを固定することにより管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバ１０の外とを連通させる工程、を実施することにより、管状支持体２０の内腔Ｓ２とチャンバ１０の内部空間Ｓ２とを隔離することができる。

他の実施形態として、工程（４）の後に、さらに、
（５）前記加減圧手段１５によって、前記チャンバ１０の内部空間Ｓ１を加圧し、前記管状支持体２０を収縮させる工程、を実施することができる（図３－３）。

図３－３（Ｅ）で示されるように、加減圧手段１５によってチャンバ１０の内部空間Ｓ１を加圧し、管状支持体２０を収縮させることにより、管状支持体２０の内壁２０ｃとシート状組織ＳＴとを、より密着させることができる。これにより、貼付されるシート状組織ＳＴが管状支持体２０に生着することを促進させることができる。

他の実施形態として、工程（３）及び（４）を任意の回数繰り返すことにより、シート状組織を、任意の枚数積層することが可能となる。これにより、厚みをもった管状組織が簡便かつ安定的に提供可能となる。

本発明の管状組織作製デバイス１（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）の加減圧手段（加減圧手段１５、弾性部材１５ａ）による減圧及び／又は加圧の程度は、使用する管状支持体２０の性質によって適宜調整されるものであり、管状支持体２０の膨張及び／又は収縮の程度を観察しながら適宜調節することができる。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。なお、本実施例における実験は、早稲田大学並びに東京女子医科大学の生物実験安全管理規程施行細則に従い、両大学に設置された動物実験審査委員会において承認された。

＜使用した動物、細胞、試薬等＞
本実施例において、以下の動物、細胞、試薬等を使用した。
・ラット（ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ）
・心筋細胞（ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７）
・温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標））（セルシード社）
・ＦＢＳ（ジャパンバイオシーラム社、Ｓ１６５０－５００）
・ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ、Ｄ６４２９）
・ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５１４０－１２２）
・４％パラホルムアルデヒド固定液（武藤化学社、３３１１－１）
・抗ラット心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＭＳ－２９５－Ｐ１）
・２次染色抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、Ａ１１０１９）
・Ｈｏｅｃｈｓｔ（同仁化学研究所、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５）

＜管状支持体（小腸）の回収方法＞
実施例において使用した管状支持体（小腸）は、以下のようにして採取した。
ラットをイソフルラン濃度３%の麻酔下において、腹部を正中切開し回腸を露出させた。ハサミを用いて回腸と回腸動静脈を分離し、回盲口から回腸側に５ｃｍ切り取ることで回腸を単離した。

＜心筋細胞シートの作製方法＞
心筋細胞は、Ｍａｔｓｕｕｒａらの方法（Ｋａｔｓｕｕｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４２５，２０１２．）に従って作製した。具体的には回転式のバイオリアクター内でヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導させ回収した。分化誘導の際、アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を５０μｇ／ｍｌ、Ｌ－グルタミンを２ｍＭ、１－チオグリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を４００μＭの濃度で混合したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地を基本培地とし、この培地に以下の成長因子を添加して用いた。

（１）Ｄａｙ０～１：０．５ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａ ｐｏｉｌｓ，ＭＮ）；
（２）Ｄａｙ１～４：１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、３ｎｇ／ｍｌ ａｃｔｉｖｉｎＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）；
（３）Ｄａｙ４～６：４μＭ ＩＷＲ－１（Ｗａｋｏ）；
（４）Ｄａｙ６～１６：５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ。

培地はＤａｙ１、４、６、８、１０、１２及び１４に交換した。

Ｄａｙ１６においてバイオリアクターから回収した細胞を、１．０×１０^７細胞／１０ｃｍディッシュの濃度で播種した。この際の培地は１０％ＦＢＳ、および１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭを用いた。播種の翌日からピューロマイシンを１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように混合し、５％ＣＯ_２、飽和水蒸気下の３７℃インキュベーター内で培養した。Ｄａｙ１、３、５、７、１０、１２で培地交換を行い、Ｄａｙ１４にてＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を回収した。温度応答性の３５ｍｍ培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）、セルシード社）上に、回収した細胞及びヒト皮膚線維芽細胞をそれぞれ１００万細胞／培養皿の濃度にて播種し、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリンストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで１週間５％ＣＯ_２、飽和水蒸気下の３７℃インキュベーター内で培養した。その後、２０℃で保温することで、細胞シートとして回収した。

＜ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、免疫染色＞
回収した組織をパラフィン固定し５μｍの厚さで薄切した後、ＨＥ染色や免疫染色をすることで積層組織の形態を評価した。

＜実施例１＞
小腸内壁への心筋細胞シートの積層方法

管状の小腸の両端の開口部を、チャンバ外と通じているシリコーンチューブ（図６の第１支持部１１及び第２支持部１２に相当）に接続した。これにより、小腸の内腔が常に大気圧に保たれることになる。密閉チャンバの蓋にはシリコーンチューブを介して大気開放してある箇所が存在しており、その部分からチャンバ内部の空気を引いた。これにより、チャンバ内の圧力が低下していき、大気圧に保たれている小腸内腔との間に圧格差が生じる。この時生じる圧格差によって小腸が拡張しきるまでチャンバ内圧力を低下させた。小腸が完全に拡張した状態で大気開放箇所を遮断し、チャンバを密閉空間にすることで内部圧力を維持した。これにより小腸が拡張した状態で維持することが可能であり、その拡張した小腸にシート状組織移送デバイスを挿入し、細胞シートを小腸内壁に貼付した（図６）。

＜実施例２＞
減圧及び小腸内壁への心筋細胞シートの積層結果

本発明で用いた管状組織作製デバイスにて、減圧して小腸を拡張したところ、圧格差によって小腸が拡張した（図６）。拡張した小腸にシート状組織移送デバイスを挿入し、心筋細胞シートを内壁に積層したところ、小腸内壁に貼付された細胞シートを確認することができた（図７）。また、貼付された心筋細胞シートは小腸の形状に合わせて積層されていることが確認できた（図８）。これは、本発明の管状組織作製デバイスを用いた積層により心筋細胞シートが小腸に圧着されていることによるものであると考えられる。また、本発明の管状組織作製デバイスを用いて加圧することで心筋細胞シートと小腸の圧着の程度を調整することが可能である。

１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ：管状組織作製デバイス、１０：チャンバ、１０ａ：チャンバ本体、１０ｂ：チャンバ蓋体、１０ｃ：窓部、１０ｄ：チャンバ固定具、１１：第１支持部、１１ａ：第１外端部、１１ｂ：第１外端開口、１２：第２支持部、１２ａ：第２外端部、１２ｂ：第２外端開口、１３：流体注出入口、１３ａ：コネクタ、１４：第１流路、１５：加減圧手段、１５０：ピストン、１５ａ、１５ａ’：弾性部材、１５０ａ：把持部、１５ｂ：逆止弁、１６：バルブ機構、１６ａ：コック、１７ａ：第１シール部材、１７ｂ：第２シール部材、１７ｃ：第３シール部材、１７ｄ：第４シール部材、１８ａ：動脈接続部、１８ｂ：静脈接続部、１９ａ：培地供給流路、１９ｂ：培地排出流路、２０：管状支持体、２０ａ：第１開口部、２０ｂ：第２開口部、２０ｃ：内壁、２０ｄ：開口部閉鎖手段、２１：動脈、２２：静脈、３０：シート状組織移送デバイス、３１：膨縮手段、３２：流体供給管、３３：筒状部、Ｓ１：内部空間、Ｓ２：内腔、ＳＴ：シート状組織、Ｐ：同一平面

Claims (15)

1. 管状支持体を収容するためのチャンバと；
   前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第１支持部と；
   前記チャンバの内部空間の圧力を制御するための加減圧手段と、
   を備え、
   ここで第１支持部は、前記管状支持体の第１開口部を固定し、前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通し、かつ、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離するための第１支持部であり、
   ここで前記加減圧手段は、前記チャンバのチャンバ本体に設けられている、
   管状組織作製デバイス。
2. 前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第２支持部をさらに備え、
   ここで前記第２支持部は、前記管状支持体の第２開口部を固定し、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの外とを連通し、かつ、前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離するための第２支持部である、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記チャンバに、前記チャンバの内外を連通する流体注出入口をさらに備え、
   ここで前記加減圧手段が前記流体注出入口に接続されている、請求項１又は２に記載のデバイス。
4. 前記加減圧手段が、シリンジである、請求項３に記載のデバイス。
5. 前記加減圧手段と前記流体注出入口との間に、バルブ機構を備える、請求項３又は４に記載のデバイス。
6. 前記チャンバに、前記管状支持体を備える、請求項１～５のいずれか１項に記載のデバイス。
7. 前記管状支持体が、生体組織由来の管状支持体である、請求項１～６のいずれか１項に記載のデバイス。
8. 前記チャンバの内外と連通し、培地供給流路と接続した動脈接続部と、
   前記チャンバの内外と連通し、培地排出流路と接続した静脈接続部と
   をさらに備えた、請求項１～７のいずれか１項に記載のデバイス。
9. 請求項１～８のいずれか１項に記載のデバイスと、
   シート状組織移送デバイスと、
   を含む、管状組織作製キット。
10. 前記シート状組織移送デバイスが、膨縮手段を有する、請求項９に記載のキット。
11. 管状組織の作製方法であって、
    管状支持体を収容するためのチャンバと；
    前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第１支持部と；
    前記チャンバの内部空間の圧力を制御するための加減圧手段と、
    を備え、前記加減圧手段が、前記チャンバのチャンバ本体に設けられている管状組織作製デバイスを用い、
    （１）前記第１支持部に管状支持体の第１開口部を固定することにより前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通させる工程、
    （２）前記管状支持体の前記内腔と前記チャンバの前記内部空間とを隔離させる工程、
    （３）前記加減圧手段によって、前記チャンバの内部空間を減圧し、前記管状支持体を膨張させる工程、
    （４）前記第１支持部の外端開口より、シート状組織を担持したシート状組織移送デバイスを挿入し、前記管状支持体の内壁に前記シート状組織を貼付する工程、
    を含む、方法。
12. 前記管状組織作製デバイスが、前記チャンバの内外を連通し、前記管状支持体を固定するための第２支持部をさらに備え、
    ここで前記工程（２）は、前記第２支持部に前記管状支持体の第２開口部を固定することにより前記管状支持体の内腔と前記チャンバの外とを連通させる工程、である、
    請求項１１に記載の方法。
13. 前記工程（４）の後に、さらに、
    （５）前記加減圧手段によって、前記チャンバの内部空間を加圧し、前記管状支持体を収縮させる工程、
    を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記シート状組織移送デバイスが、膨縮手段を有する、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記工程（３）及び（４）を任意の回数繰り返す、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。

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