JP2021023826A - 創傷被覆用シート、及び創傷被覆方法 - Google Patents

Abstract

【課題】操作性が良く、創傷部へ安定した状態で生着し得る創傷被覆用のシートを提供すること。【解決手段】本技術では、創傷部へ移植することにより、創傷の被覆に用いるシートであって、漿膜と、該漿膜の移植面側に積層された細胞シートと、からなる、創傷被覆用シートを提供する。本技術に係る創傷被覆用シートは、細胞シートと、漿膜と、が積層されているため、適度な厚みと強度を備える。そのため、操作性が安定し、移植し易い。また、創傷部位から流動することもなく、必要であれば、縫合又は吻合等により創傷部位への固定も可能であるため、創傷部へ安定した状態で生着させることができる。【選択図】なし

Description

本技術は、創傷被覆用シートに関する。より詳しくは、創傷部へ移植することにより、創傷の被覆に用いるための創傷被覆用シート、及び該創傷被覆用シートを用いた創傷被覆方法に関する。

悪性腫瘍等の各種内臓疾患の治療のために、病変部を含む周囲の組織を切除する場合、病変部を切除後は、臓器の残存部を縫合又は吻合する手術が必要となる。その際、問題となるのが縫合不全である。例えば、消化管の進行癌では、悪性腫瘍が組織の深層もしくは周囲組織に浸潤し、病変が広範に及んでしまっているために、病変部を含む周囲の組織を切除する必要が生じる。病変部の切除後は、消化管の残存部を縫合又は吻合する必要がある。その際、問題となるのが消化管術後縫合不全である。

消化管術後縫合不全とは、消化管吻合後の吻合部が治癒せず、一部若しくは全体が離開してしまう状態のことで、腸管内容物が胸腔内や腹腔内に漏出し、重篤な感染症を起こして、時に致死的な状態になる可能性のある消化管術後の合併症の一つである。縫合不全が起こると、ＱＯＬの低下（発熱、腹痛、食事開始期間の延長による栄養障害・筋力低下）、腸閉塞や新たな合併症の発症、入院期間延長による医療経済的な問題、予後（septic shockなどでの術後死亡、再発のリスク）など様々な影響がある。

縫合不全は、吻合部組織の治癒過程（修復期）が妨げられることで起こるが、修復期の治癒過程を妨げる要因としては、術前の低栄養状態やステロイドなどの薬剤投与、慢性疾患（糖尿病、肝・腎障害等）による全身的な要因と吻合部周囲の血行障害や過緊張、感染症などの局所的な要因が挙げられる。

縫合不全を予防するために、多くの外科医は、患者の術前の全身状態をより良い状態に改善して手術に臨む努力や、自動吻合機の開発、部位・状況に応じた適切な前処置や吻合法の選択、吻合部の緊張の低減、的確な血流の確保、ドレーンの挿入、減圧など技術や器械の向上など最大限の努力を払ってきた。それでもなお、縫合不全は、３〜１４％と比較的高率に生じている。特に、癌が低位であればある程、縫合不全の発生のリスクも高い。また、最近では術前の化学放射線療法を行う症例も増加しており縫合不全のリスクになり得る。消化管縫合不全の予防策として、ＱＯＬの低下と引き換えにやむを得ず、一時的人工肛門造設術を行う症例も少なくない。

この課題を解決する手段として、組織の創傷治癒を促進する作用のある間葉系幹細胞や脂肪由来幹細胞を用いた動物実験の報告がなされているが、その移植方法の大部分は静脈注射や局所注射などの細胞注入法であった。一般に消化管吻合部の創傷治癒の過程は、術後３〜４日までの炎症期と、術後７日程までの修復期に分けられる。術後３〜４日までの炎症期には、吻合部粘膜下組織の再構築のために、既存のコラーゲンを炎症細胞由来のコラゲナーゼが分解し、その後の修復期で線維芽細胞が増殖し、コラーゲンが産生されて増加し、術後７日程まで組織の連続性と物理的抗張力が維持される。そのため、吻合部位に細胞を注入する移植法では、細胞がその場に保持されにくいだけでなく、注入した細胞が炎症期のタンパク質分解酵素であるコラゲナーゼに暴露されるため、コラゲナーゼの細胞傷害により組織修復能が低下する可能性があった。

これに対し、例えば、特許文献１では、間葉系幹細胞を含む細胞シート組成物を管腔臓器の創傷部に貼付することで、管腔臓器の創傷部からの漏出を治癒又は予防する技術が開示されている。

ＷＯ２０１７／１３０８０２

前述の通り、近年、細胞シートを管腔臓器の創傷部に貼付することで、管腔臓器の創傷部からの漏出を治癒又は予防する技術が開発されているが、細胞シートは柔らかくて薄くて脆いため、実臨床では移植時に操作性に乏しいのが現状である。特に、大腸の待機的手術では、昨今、全国的に腹腔鏡手術が一般的になってきており、鉗子操作でその脆弱な細胞シートを移植するのは非常に困難である。

また、細胞シートを創傷部に移植した場合、数日経過すると、細胞シートが創傷部位から流動してしまう場合があり、管腔臓器の創傷部からの漏出を治癒又は予防効果が低下する場合があった。

そこで、本技術では、操作性が良く、創傷部へ安定した状態で生着し得る創傷被覆用のシートを提供することを主目的とする。

本願発明者らは、上記課題を解決するために、創傷被覆用のシートの構造について鋭意研究を行った結果、特定の生体膜と組み合わせることにより、創傷部へ安定した状態で生着し得る創傷被覆用のシートを得ることに成功し、本技術を完成させるに至った。

即ち、本技術では、まず、創傷部へ移植することにより、創傷の被覆に用いるシートであって、
漿膜と、
該漿膜の移植面側に積層された細胞シートと、
からなる、創傷被覆用シートを提供する。
本技術に係る創傷被覆用シートに用いる前記漿膜としては、腹膜を用いることができる。
本技術に係る創傷被覆用シートは、縫合又は吻合された創傷部に用いることができる。
また、本技術に係る創傷被覆用シートは、管腔臓器の創傷部に用いることができる。
この際、本技術に係る創傷被覆用シートは、前記管腔臓器の外壁に移植することができる。

本技術では、次に、漿膜と、
該漿膜の移植面側に積層された細胞シートと、
からなる、創傷治療用シートを、創傷部へ移植することにより創傷を被覆する、創傷被覆方法を提供する。
本技術に係る創傷被覆方法では、前記創傷治療用シートを、創傷部へ縫合することにより移植することができる。
本技術に係る創傷被覆方法に用いる前記漿膜としては、腹膜を用いることができる。
本技術に係る創傷被覆方法を用いれば、縫合又は吻合された創傷部の被覆をすることができる。
また、本技術に係る創傷被覆方法を用いれば、管腔臓器の創傷部の被覆をすることができる。
この際、前記創傷被覆用シートは、前記管腔臓器の外壁に移植することができる。

本技術に係る創傷被覆用シートは、細胞シートと、漿膜と、が積層されているため、適度な厚みと強度を備える。そのため、操作性が安定し、移植し易い。また、創傷部位から流動することもなく、必要であれば、縫合又は吻合等により創傷部位への固定も可能であるため、創傷部へ安定した状態で生着させることができる。

創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した直後の背筋の写真である。 創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した３日後の背筋の写真である。 創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した７日後の背筋の写真である。 手術後３日目及び７日目に摘出した組織切片を、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。 手術後３日目及び７日目に摘出した組織切片を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）染色の結果を示す顕微鏡写真である。 手術後３日目及び７日目に摘出した組織切片を、カルレチニン染色の結果を示す顕微鏡写真である。

以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。

本技術に係る創傷被覆用シートは、創傷部へ移植することにより、創傷の被覆に用いるシートであって、（１）漿膜と、該漿膜の移植面側に積層された（２）細胞シートと、からなる。本技術に係る創傷被覆用シートは、細胞シートと、漿膜と、が積層されているため、適度な厚みと強度を備える。そのため、操作性が安定し、移植し易い。また、創傷部位から流動することもなく、必要であれば、縫合又は吻合等により創傷部位への固定も可能であるため、創傷部へ安定した状態で生着させることができる。

その結果、例えば、縫合又は吻合された創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、細胞シート単独で創傷部に移植した場合に比べて、縫合不全の予防効果を向上させることができる。また、例えば、管腔臓器の創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、細胞シート単独で管腔臓器に移植した場合に比べて、管腔臓器の創傷部からの漏出を予防又は治療する効果を向上させることができる。

本技術に係る創傷被覆用シートは、（１）漿膜と、（２）細胞シートと、が積層されていればよく、その積層方法は、本技術の効果を損なわない限り、特に限定されない。例えば、（１）漿膜と、（２）細胞シートと、をそのまま積層させる方法、（１）漿膜と、（２）細胞シートと、の間に、接着性を有する物質を介して積層させる方法、（１）漿膜の上で、目的の細胞を培養することにより、（１）漿膜上で細胞シートを作製する方法、等を挙げることができる。

また、本技術に係る創傷被覆用シートは、予め、採取された漿膜と、細胞シートと、を積層して形成することもできるが、手術中に被術者から漿膜を採取して、自家の漿膜を用いることも可能である。例えば、本技術に係る創傷被覆用シートを管腔臓器の創傷部に用いる場合、手術中に採取した腹膜等の漿膜と、予め用意しておいた細胞シートと、を積層して、創傷被覆用シートをその場で形成した上で、手術中に創傷部への移植を行うことも可能である。

本技術に係る創傷被覆用シートを移植する部位は創傷部であればよく、好ましくは、縫合又は吻合された創傷部である。縫合又は吻合されている部位であれば、創傷によって炎症をおこした組織同士が密接し、そこに本技術に係る創傷被覆用シートが移植されることで、治癒効果が高まる。本技術に係る創傷被覆用シートが移植されることによって、創傷部のコラーゲン等の産生能が高まり、創傷部周辺の再構築が促進され、創傷部の治癒が促進される。

本技術において、「創傷」とは、組織又は臓器が傷ついた状態を広く意味し、例えば、熱傷、褥瘡、挫傷、切創、擦過傷、潰瘍、手術創、銃創、爆傷、刺創、杙創、咬創等が含まれる。本技術において、「創傷」とは、好ましくは、臓器の切創、手術創、刺創、杙創、咬創であり、より好ましくは、手術創である。本技術において、「手術創」とは、外科手術の結果として形成される創傷を表し、例えば、メス、ハサミ、医療用レーザ、鉗子、スネア等を使用して形成される創傷であるが、外科手術で通常使用される器具によって形成される創傷であればよく、限定されない。本技術において、「創傷部」とは、組織又は臓器において、創傷部位を含むその周辺組織をいい、例えば、創傷部位を中心として半径１０ｃｍ以内、８ｃｍ以内、５ｃｍ以内、３ｃｍ以内、２ｃｍ以内である。創傷部の範囲、形状は、創傷の形状によって変わるため、限定されない。

本技術に係る創傷被覆用シートは、管腔臓器の創傷部に好適に用いられる。本技術に係る創傷被覆用シートを、管腔臓器の創傷部へ用いることで、管腔内部の圧力上昇にも耐えうる程、創傷部の治癒効果を得ることができる。その結果、管腔臓器の創傷部からの漏出を予防又は治療する効果を得ることができる。

本技術に係る創傷被覆用シートを移植する部位は、管腔臓器の内壁及び／又は外壁であってもよく、外科手術時の移植のしやすさの点からは外壁のみであってもよい。

本技術において、「管腔臓器」とは、管腔構造を有する臓器であって、例えば、消化管、血管系、膀胱、膣などが挙げられるが、好ましくは、消化管である。本発明において、消化管とは、口腔から肛門までを貫通している器官であって、例えば、食道、胃、小腸、大腸である。

本技術において、管腔臓器の創傷部からの「漏出」とは、管腔臓器の内容物が、管腔臓器の外側へ漏れ出すことをいい、例えば、管腔臓器が消化管である場合、食物やその消化物等の固形物、胃液、唾液等の液体、空気等の気体が、創傷部から胸腔内又は腹腔内へ漏れ出すことをいう。

特に、管腔臓器、例えば、消化管に生じた癌が深層部まで浸潤している場合、消化管の一部を切除する必要がある。その場合、残った消化管を縫合又は吻合する必要がある。上述のように、消化管の縫合又は吻合された部分は、種々の事由により、内容物が漏出してしまう縫合不全が生じる場合がある。本技術では、管腔臓器、特に消化管において、縫合又は吻合された創傷部に、本技術に係る創傷被覆用シートを移植することにより、該創傷部の治癒が促進され、縫合不全が予防又は治癒される効果をもたらす。

また、本技術に係る創傷被覆用シートを用いることにより、細胞シート単独で管腔臓器に移植した場合と比較して、有意に高い耐圧強度を示し、種々の要因により吻合部組織の治癒過程（修復期）が妨げられて起こる消化管縫合不全に対して、組織修復能を最大限に発揮し、縫合不全を予防又は治癒する画期的な効果をもたらす。これによって、縫合不全により生じる人工肛門、腸瘻造設などの追加治療による患者ＱＯＬの著しい低下や、多くの医療資源の投入などの社会的損失の軽減に貢献できる。

本技術に係る創傷被覆用シートは、前述の通り、創傷部位から流動することもなく、必要であれば、縫合又は吻合等により創傷部位への固定も可能であるため、創傷部へ安定した状態で生着させることができる。本技術に係る創傷被覆用シートを創傷部へ縫合又は吻合する場合、その縫合又は吻合の方法については、従来外科手術で用いられる方法であれば、特に限定されない。本技術に係る創傷被覆用シートを創傷部へ縫合又は吻合する時に用いられる縫合糸は、溶解性又は非溶解性のいずれでも良いが、侵襲性の観点からは、溶解性の縫合糸の方が好ましい。縫合糸の太さは、創傷の大きさ、部位等によって適宜選択すればよい。

以下、（１）漿膜、及び、（２）細胞シートについて、詳細に説明する。

（１）漿膜
本技術に係る創傷被覆用シートに用いる漿膜は、本技術の効果を損なわない限り、生体から採取可能な漿膜を、創傷部の位置等に応じて、自由に選択して用いることができる。例えば、腹膜、胸膜、心膜等の漿膜を、本技術に係る創傷被覆用シートに用いることができる。

本技術において、漿膜を採取する動物種の由来は、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本技術に係る創傷被覆用シートをヒトの治療に用いる場合はヒト由来、ブタの治療に用いる場合はブタ由来、サルの治療に用いる場合はサル由来、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の漿膜を用いる方が好ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した漿膜であってもよく（自家移植）、他人から採取した漿膜を用いてもよい（他家移植）。

（２）細胞シート
本技術に係る創傷被覆用シートに用いる細胞シートは、本技術の効果を損なわない限り、一般的な細胞シートを、創傷部の位置等に応じて、自由に選択して用いることができる。より具体的には、細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる１層又は複数層のシート状の細胞群からなるシートを用いることができる。

細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材にて細胞を培養し、細胞培養基材の端部から物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。好ましい形態としては、刺激応答性培養基材として、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材を用いる方法が挙げられる。温度応答性培養基材上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで細胞を培養し、細胞をシート状に剥離して回収する方法である。その際、細胞は０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養基材上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養する。その温度域とは通常、細胞を培養する温度、例えば３３℃〜４０℃であることが好ましい。本技術に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。

刺激応答性高分子、特に温度応答性高分子としてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を用いた場合を例（温度応答性培養皿）に説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集して白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本技術では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆されて固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に固定されているため、培養基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着し、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できない表面となる。そのため、該基材を３１℃以下に冷却すると、細胞が基材表面から剥離する。細胞が培養面一面にコンフルエントになるまで培養されていれば、該基材を３１℃以下に冷却することによって細胞シートが回収できる。温度応答性培養皿は、同一の効果を有するものであれば限定されるものではないが、例えば、セルシード社が市販するＵｐＣｅｌｌ（登録商標）などが挙げられる。

本技術において、細胞シートに用いられる細胞の動物種の由来は、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物などの哺乳類動物、鳥類、爬虫類、両生類、両生類、魚類、昆虫等が挙げられる。本技術に係る創傷被覆用シートをヒトの治療に用いる場合はヒト由来、ブタの治療に用いる場合はブタ由来、サルの治療に用いる場合はサル由来、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の細胞を用いる方が好ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家細胞）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（他家細胞）、市販の細胞株であってもよい。

本技術において、細胞シートに用いられる細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられる。

本技術では、間葉系幹細胞を用いることが好ましい。間葉系幹細胞は、生体内においては、骨髄、脂肪組織、臍帯血、歯髄、滑膜、胎盤等の組織から単離される細胞であって、公知の方法を用いて単離することができる。

例えば、骨髄由来間葉系幹細胞は、骨髄から採取した骨髄液を、密度勾配遠心法にて血球系細胞を分離し、プラスチック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。

脂肪組織由来間葉系幹細胞（脂肪組織由来幹細胞；Ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、採取した脂肪組織を細分化（ミンス（ｍｉｎｃｅ））し、コラゲナーゼタイプＩＩによって、３７℃で１時間処理をして組織を消化し、培地を加えて遠心分離する。その後、沈殿した細胞を基礎培地で洗浄し、セルストレーナー等のメッシュにてろ過し、プラスチック培養皿に播種して、３７℃、５％ＣＯ_２環境で培養することで、接着する細胞として単離することが可能である。その他の組織由来の間葉系幹細胞を単離する方法については、公知の方法を用いればよく、限定されない。

間葉系幹細胞は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた間葉系幹細胞であってもよい。本技術において、多能性幹細胞とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、体を構成するあらゆる細胞を形成する能力（ｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔ）を備える細胞をいう。自己複製能とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を２つ作る能力のことをいう。本技術で用いられる多能性幹細胞には、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）などが含まれる。

本技術に使用される間葉系幹細胞の由来は限定されないが、採取方法、分離方法が広く確立されている骨髄又は脂肪組織が好ましい。また、脂肪組織由来の方が、骨髄由来と比較して、採取される間葉系幹細胞の数が多いため、好ましい。

本技術において、間葉系幹細胞を用いた細胞シートを使用する場合、間葉系幹細胞以外の細胞を含んでいてもよい。例えば、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、線維芽細胞、上皮系細胞、間質細胞等、移植する部位、目的によって適宜選択して、間葉系幹細胞と併用することができる。また、間葉系幹細胞を採取した組織由来の細胞が含まれていても良い。

本技術において、細胞シートに含まれる細胞の数は、被覆する創傷部の大きさ、度合いによって変化させることができる。また、細胞シートに含まれる細胞の割合も限定されないが、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上とすることができる。細胞シートに含まれる細胞の割合が高ければ高いほど、創傷部の被覆効果が高くなる。例えば、縫合又は吻合された創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、縫合不全の予防効果を向上させることができる。また、例えば、管腔臓器の創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、管腔臓器の創傷部からの漏出を予防又は治療する効果を向上させることができる。

本技術において、細胞シートを作製するために播種する細胞数は動物種や細胞種によって異なるが、例えば、０．３×１０^４〜１０×１０^６個／ｃｍ^２であってもよく、０．５×１０^４〜８×１０^６個／ｃｍ^２であってもよく、０．７×１０^４〜５×１０^６個／ｃｍ^２であってもよい。本技術においては、細胞シートを温度応答性培養基材から剥離して回収するためには、細胞が付着し、コンフルエント又はサブコンフルエント状態となった培養基材の温度を、被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることで得られる。その際、細胞シートの作製は、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞シートをより早く、高効率に剥離、回収するために、培養基材を軽くたたいたり揺らしたりする方法、ピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独又は併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は常法に従えばよい。例えば、使用する培地については公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、無血清培地を用いてもよい。

本技術において、細胞シートを作製する際の細胞培養基材の形状は、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、又は平膜状などの形状のものを用いることができる。細胞培養基材の材料としては、通常、細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の化合物や、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。

本技術において、細胞シートを作製する際に用いる細胞培養基材としては、細胞が接着する領域と細胞が接着しない領域の両方とを同一培養面上に備えた細胞培養基材を用いてもよい。例えば、複数の円形の細胞接着領域と、それ以外の細胞を接着しない領域とを同一培養面に備えた細胞培養基材を用いることで一度に複数の細胞シートを作製することが可能である。この場合、細胞接着領域の形状は円形、正方形、三角形、長方形等、目的に応じて所望の形状であってよく、その大きさも適宜変更することができる。細胞が接着しない領域を設ける方法としては特に限定されないが、例えば、細胞と親和性の低い細胞非付着性高分子である、ポリ−Ｎ−アクリロイルモルホリン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース等の親水性高分子、又はシリコーン高分子、フッ素高分子等の強疎水性高分子等を被覆する方法等が挙げられる。

本技術において、細胞シートを作製する際の細胞培養基材からの剥離方法は、本技術の効果を損なわない限り、特に限定されない。例えば、酵素を用いて剥離・回収する方法等の一般的な方法を用いることができるが、刺激応答性基材で細胞を培養して損傷をほとんど与えずに剥離する方法を用いることが好ましい。

本技術に係る創傷被覆用シートに用いる細胞シートは、複数の細胞シートを積層した積層化細胞シートを用いても良い。本技術において、積層化細胞シートを用いた場合、貼付する細胞数が多くなり、創傷部の被覆効果を向上させることができる。例えば、縫合又は吻合された創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、縫合不全の予防効果を向上させることができる。また、例えば、管腔臓器の創傷部に本技術に係る創傷被覆用シートを用いる場合、管腔臓器の創傷部からの漏出を予防又は治療する効果を向上させることができる。

積層化細胞シートを得る方法としてはピペット等によって培養液中に浮かんでいる細胞シートを培養液ごと吸い取り、別の培養皿の細胞シート上に放出し、液体培地の流れによって積層する方法、細胞移動治具を用いて積層する方法等が挙げられる。本技術においては、細胞移動治具を用いる方法の方が、細胞シートを損傷させることなく積層することが可能となるため、好ましい。細胞移動治具は、細胞シートを捕捉できる機能を有するものであればよく、例えば、材料としては、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコーン樹脂、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリンゲル等を用いることができる。細胞移動治具の形状としては、例えば、スタンプ型、膜状、多孔膜状、不織布状、織布状の形状で使用される。本技術の実施形態では、細胞移動治具は細胞シートを破損することなく回収し、別の細胞シートに積層する機能を有していればよく、細胞接着性タンパク質、細胞接着性ペプチド、又は親水性ポリマーの１種、若しくは２種以上からなる細胞付着部を有する培養細胞移動治具であることが好ましい。例えば、細胞付着部を有したスタンプ型の培養細胞移動治具が好ましい。該スタンプ型の培養細胞移動治具は、その細胞付着部によって細胞シートを破損することを防止し、細胞シートが培養皿から剥離するときに起こる細胞シートの縮みを防止しながら回収を可能とする。該細胞移動治具により、細胞シートを別の細胞シート上に容易に移動させつつ、細胞シートを縮ませることなく積層することができる。細胞シートを縮ませずに積層することにより、細胞シート同士が隙間なく積層され、高密度な三次元構造を有する積層化細胞シートを得ることができる。

本技術では、細胞シートを作製する際に、さらに、アスコルビン酸を添加した培地で培養してもよい（参考：Ｋａｔｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｈｅｅｔ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｗｉｔｈ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｋｉｎ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ａ Ｒａｔ Ｗｏｕｎｄ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１５ Ａｕｇ；６４（８）：２７２３−３４）。アスコルビン酸を添加した培地で培養することによって得られた細胞シートは、添加せずに培養して得られた細胞シートよりも強度が高く、破れにくい細胞シートが得られる。これにより、より、移植に適した細胞シートが得られる。

本技術に係る創傷被覆用シートに用いる細胞シートには、さらに血管新生を誘導する因子を添加してもよい。血管新生を誘導する因子としては、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、アンジオポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＶＥ−カドヘリン、エフリン、プラスミノーゲンアクチベータ、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）等である。これらが細胞シートに含まれることによって、移植部位における血管新生もより促進されることとなる。

以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、本実施例における実験プロトコールは、東京女子医科大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」（１９９６年改定版）に沿って実施された。

＜使用した動物・試薬・キット＞
・ＧＦＰトランスジェニックラット（三協ラボサービス）
・ＳＤ系ラット（三協ラボサービス）
・ペニシリン・ストレプトマイシン（富士フィルム和光純薬株式会社、＃１６８−２３１９１）
・ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ライフテクノロジーズ社、＃１０２７０−１０６）
・Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｘ１）（富士フィルム和光純薬株式会社、＃２０８−１７２５１）
・Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物（和光純薬社、＃０１３−１９６４１）
・ポピドンヨード（イソジン（登録商標）、明治製菓社、＃５０４００）
・コラゲナーゼ（ＳＥＲＶＡ社、＃１７４６５ ＮＢ ４Ｇ Ｐｒｏｖｅｄ Ｇｒａｄｅ）
・蒸留水（大塚製薬社）
・ＲＮｅａｓｙ（登録商標） Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、＃７４７０４）
・マイトマイシンＣ（和光純薬工業社、＃１３４−０７９１１）
・Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｈｅａｐａｐｏｉｅｔｉｎ Ａ， Ｓｃａｔｔｅｒ Ｆａｃｔｏｒ）（ＨＧＦ） ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｏｎｌｉｎｅ．Ｃｏｍ社、＃ＡＢＩＮ３６７４１２）
・ＦＧＦ ｂａｓｉｃ Ｐｉｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（アブカム社、＃ａｂ１５６４６７）
・Ｄ−ＭＥＭ（高グルコース）（富士フィルム和光純薬株式会社、＃０４３−３００８５）

＜使用した器材＞
・７５ｃｍ^２フラスコ（ＢＤファルコン社、＃３５３８１０）
・３．５ｃｍ（３５ｍｍ）温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標））（セルシード社、＃ＣＳ３００７）

１．脂肪由来幹細胞の分離培養および細胞シートの作製
（１）脂肪由来幹細胞の分離
脂肪由来幹細胞の分離はＷａｔａｎａｂｅ Ｎ．らの論文（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ／Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｍｉａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ−Ｂａｓｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１３ Ｍａｒ；２４（３）：２８３-２９４．）に記載の方法に従った。

ＧＦＰトランスジェニックラットの鼠径部の皮下脂肪を、局所麻酔下になるべく血球成分が入らないようにして２０ｇ採取した。その後、採取した脂肪組織はポピドンヨードで殺菌消毒を行い、抗生剤入り培地（１％ ペニシリン・ストレプトマイシン入りＤ−ＭＥＭ）で２回洗浄した。洗浄後、ディッシュの上でハサミを用いて組織片を細かくした。４ｇずつ５０ｍＬチューブに入れ抗生剤入り培地を３５ｍＬ加え、０．２７ ｐｚｕ／ｍＬの濃度のコラゲナーゼを１ｍＬずつ加えた。３７℃、１３０ｒｐｍで１時間振盪した。その後４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。３０秒間チューブを用手的に振盪した。再度、４℃、３００Ｇで５分間遠心した。チューブ表面に浮遊する大型の組織片を除去し、１００μｍのセルストレーナー（ＢＤ 日本ベクトン・ディッキンソン社、＃３５２３６０）に通した。その後、４０μｍのセルストレーナー（ＢＤ 日本ベクトン・ディッキンソン社、＃３５２３４０）に通した。４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去しペレットを１０％ＦＢＳ入り培地で懸濁し、７５ｃｍ^２フラスコ５枚に播種し３７℃インキュベーターで培養した。

（２）脂肪由来幹細胞の培養と細胞シートの作製
細胞播種後３日目に培地交換を行い、５日目に０．２５％トリプシンで細胞を剥がした後に１０枚の７５ｃｍ^２フラスコに継代した。継代後は２〜３日後で再度継代を行った。２〜３日後に再度０．２５％トリプシンで細胞を剥がし、細胞カウントを行った後に、２．３×１０^６個の細胞を２ｍＬの培地に懸濁し、３５ｍｍ ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）に播種し、３７℃で２日間培養した。２日後に１６．４μｇ／ｍＬアスコルビン酸入り培地で培地交換を行った。更に２日後にアスコルビン酸入り培地で培地交換を行い、細胞シート移植直前に２０℃のインキュベーターで２０〜３０分インキュベートすることで細胞をシート状に回収した。

（３）創傷被覆用シートの作製
ＳＤ系ラットから、腹膜を採取し、前記で作製した細胞シートと積層させて、創傷被覆用シートを作製した。

２．創傷被覆用シート及び細胞シートの移植
ＳＤ系ラットの中央背部の筋膜を除去し、筋肉を露出させた。前記で作製した創傷被覆用シートを、背筋に４回縫合することにより移植した。また、比較のために、細胞シートのみ、及び、腹膜のみを背筋に貼付することにより移植した。

３．肉眼的評価
手術直後、手術後３日目、及び手術後７日目に、移植後の背筋の様子を観察した。図１は、創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した直後の背筋の写真である。図２は、創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した３日後の背筋の写真である。図３は、創傷被覆用シート、細胞シートのみ、及び腹膜のみを移植した７日後の背筋の写真である。

図２に示す通り、手術後３日目には、創傷被覆用シートを移植した部位、及び、細胞シートのみを移植した部位、共に、細胞シートが残存していたが、細胞シートのみを移植した部位では、わずかに細胞シートが流動していることが確認された。

図３に示す通り、手術後７日目には、腹膜と細胞シートからなる創傷被覆用シートを移植した部位では、細胞シートはそのままの形状を保って残存していたが、細胞シートのみを移植した部位では、細胞シートがほとんど流動してしまっていることが確認された。また、腹膜のみを移植した部位に比べて、腹膜と細胞シートからなる創傷被覆用シートを移植した部位の方が、安定して生着していることが確認された。

４．組織学的評価
手術後３日目及び７日目に摘出したサンプルをコンパウンドに包埋後、液体窒素で凍結し組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）染色、カルレチニン染色を行った。図４は、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。図５は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）染色の結果を示す顕微鏡写真である。図６は、カルレチニン染色の結果を示す顕微鏡写真である。

細胞シートは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）染色及びカルレチニン染色に陽性である。図５及び図６に示すように、手術後７日目においても、腹膜と細胞シートからなる創傷被覆用シートを移植した部位では、細胞シートが安定して生着していることが確認された。

Claims (11)

1. 創傷部へ移植することにより、創傷の被覆に用いるシートであって、
   漿膜と、
   該漿膜の移植面側に積層された細胞シートと、
   からなる、創傷被覆用シート。
2. 前記漿膜は、腹膜である、請求項１に記載の創傷被覆用シート。
3. 前記創傷部は、縫合又は吻合された創傷部である、請求項１又は２に記載の創傷被覆用シート。
4. 前記創傷部は、管腔臓器の創傷部である、請求項１から３のいずれか一項に記載の創傷被覆用シート。
5. 前記管腔臓器の外壁に移植される、請求項１から４のいずれか一項に記載の創傷被覆用シート。
6. 漿膜と、
   該漿膜の移植面側に積層された細胞シートと、
   からなる、創傷治療用シートを、創傷部へ移植することにより創傷を被覆する、創傷被覆方法。
7. 前記創傷治療用シートを、創傷部へ縫合することにより移植する、請求項６に記載の創傷被覆方法。
8. 前記漿膜は、腹膜である、請求項６又は７に記載の創傷被覆方法。
9. 前記創傷部は、縫合又は吻合された創傷部である、請求項６から８のいずれか一項に記載の創傷被覆方法。
10. 前記創傷部は、管腔臓器の創傷部である、請求項６から９のいずれか一項に記載の創傷被覆方法。
11. 前記創傷治療用シートを、前記管腔臓器の外壁に移植する、請求項１０に記載の創傷被覆方法。