JP7235509B2 - 植え込み可能な生きた電極およびその製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年4月14日に出願された米国仮出願第62/322,434号の優先権を主張し、その内容は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる。
ブレインマシンインターフェース(BMI)は、神経変性に関連する欠損を緩和するため、または末梢プロステーシスを駆動するために、神経系が外部デバイスと直接通信できるようにする。貫入型微小電極アレイおよび光遺伝学的戦略を使用して大幅な進歩があった。しかし、これらのアプローチは、非有機電極/オプトロード(optrode)を脳内に配置することに一般的に依存しており、記録および刺激の量を最終的に減少させる炎症性異物応答に必然的に繋がる点で限界がある。現在のBMI戦略は、非永続性、非特異性、および/または植え込まれたときの重大な異物応答という難点がある。
一局面では、本発明は、実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた1つまたは複数のニューロンを含む、植え込み可能な生きた電極を含み、該1つまたは複数のニューロンは、植え込み可能な生きた電極の第1端の近位にある1つまたは複数の光遺伝学的または磁気遺伝学的磁気遺伝学的(magnetogenetic)ニューロンを含む。
[本発明1001]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた1つまたは複数のニューロン
を含む、植え込み可能な生きた電極であって、
該1つまたは複数のニューロンが、植え込み可能な生きた電極の第1端の近位にある1つまたは複数の光遺伝学的または磁気遺伝学的(magnetogenetic)ニューロンを含む、前記植え込み可能な生きた電極。
[本発明1002]
二方向刺激および二方向記録が可能である、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1003]
一方向刺激および一方向記録が可能である、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1004]
一方向刺激および二方向記録が可能である、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1005]
前記ニューロンが、異なる波長の光を使用して刺激および記録される、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1006]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアが、約10μm~約20μm、約25μm~約50μm、約50μm~約100μm、約100μm~約150μm、約150μm~約200μm、約200μm~約250μm、約250μm~約300μm、約300μm~約400μm、約400μm~約500μm、約500μm~約700μm、および約700μm~約1000μmからなる群より選択される最大断面寸法を有する、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1007]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアを同軸性に囲むハイドロゲルの鞘
をさらに含む、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1008]
前記ハイドロゲルの鞘が、約20μm~約50μm、約50μm~約100μm、約100μm~約200μm、約200μm~約250μm、約250μm~約300μm、約300μm~約350μm、約350μm~約400μm、約400μm~約450μm、約450μm~約500μm、約500μm~約600μm、約600μm~約800μm、および約800μm~約1200μmからなる群より選択される最大断面寸法を有する、本発明1007の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1009]
約100μmから10cmまたはそれよりも大きな長さを有する、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1010]
前記1つまたは複数のニューロンが、複数の標的を標的とする複数の異なる表現型、および別個の波長の光に応答するまたはそれを発するための複数の異なる光遺伝学的または磁気遺伝学的表現型を含む、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1011]
前記1つまたは複数のニューロンが、初代大脳皮質ニューロン、後根神経節ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ペプチド作動性ニューロン、視床由来ニューロン、線条体由来ニューロン、海馬由来ニューロン、黒質由来ニューロン、末梢神経系由来ニューロン、および脊髄運動ニューロンからなる群より選択される1つまたは複数を含む、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1012]
初代大脳皮質ニューロンが、皮質第I層由来のニューロン、皮質第II層由来のニューロン、皮質第III層由来のニューロン、皮質第IV層由来のニューロン、皮質第V層由来のニューロン、皮質第VI層由来のニューロン、視覚皮質由来のニューロン、運動皮質由来のニューロン、感覚皮質由来のニューロン、および嗅内皮質由来のニューロンからなる群より選択される1つまたは複数を含む、本発明1011の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1013]
内皮細胞、筋細胞、筋芽細胞、星状膠細胞、嗅神経鞘細胞、乏突起膠細胞、またはシュワン細胞からなる群より選択される1つまたは複数の非ニューロン細胞をさらに含む、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1014]
前記ニューロンが幹細胞に由来する、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1015]
前記ニューロンがニューロン前駆細胞に由来する、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1016]
前記ハイドロゲルの鞘がアガロースを含む、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1017]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた1つまたは複数のニューロンが、強制的な細胞凝集を経て形成される、本発明1001の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1018]
本発明1001~1015のいずれかの1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
適合性の刺激装置を、該1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つの近位に配置する段階
を含む、方法。
[本発明1019]
脳活動を活性化または興奮させるために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
宿主のシナプス活動を活性化または興奮させるために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
ニューロン活動を活性化または興奮させるために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1022]
神経ネットワーク活動を活性化または興奮させるために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1023]
脳活動を抑制するために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1024]
宿主のシナプス活動を抑制するために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1025]
ニューロン活動を抑制するために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1026]
神経ネットワーク活動を抑制するために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1027]
宿主のシナプス活動をモデュレートするために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1028]
ニューロン活動をモデュレートするために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1029]
神経ネットワーク活動をモデュレートするために、適合性の刺激装置を制御して前記植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを作動させる段階
をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1030]
前記1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つが、対象の中枢神経系、末梢神経系、大脳皮質、線条体、海馬、脊髄、および/または末梢神経に植え込まれる、本発明1018の方法。
[本発明1031]
大脳皮質ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1032]
ドーパミン作動性ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1033]
後根神経節ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1034]
本発明1001~1015のいずれかの1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
適合性のセンサーを該1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つの近位に配置する段階
を含む、方法。
[本発明1035]
興奮性ニューロンの活動を報告する段階をさらに含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
抑制性ニューロンの活動を報告する段階をさらに含む、本発明1034の方法。
[本発明1037]
興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンの活動を同時に報告する段階をさらに含む、本発明1034の方法。
[本発明1038]
本発明1001~1015のいずれかの1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ペプチド作動性ニューロン、視床由来ニューロン、線条体由来ニューロン、海馬由来ニューロン、黒質由来ニューロン、末梢神経系由来ニューロン、脊髄運動ニューロン、大脳皮質ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、および後根神経節ニューロンからなる群より選択される1つまたは複数を選択的に興奮させるまたは抑制するために、該植え込み可能な生きた電極に刺激を加える段階
を含む、方法。
[本発明1039]
シナプス入力の量を制御する段階
をさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアを同軸性に囲むハイドロゲルの鞘;
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアとハイドロゲルの鞘との間に配置された、電極、オプトロード(optrode)、磁気アクチュエーター、加熱プローブ、冷却プローブ、または化学物質アプリケーターからなる群より選択される1つまたは複数;および
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた1つまたは複数のニューロン
を含む、植え込み可能な生きた電極。
[本発明1041]
実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた複数の凝集したニューロン
を含む、植え込み可能な生きた電極。
[本発明1042]
前記複数の凝集したニューロンが、ドーパミン作動性ニューロンを含む、本発明1041の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1043]
前記細胞外マトリックスコアが、コラーゲン-ラミニンを含む、本発明1041の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1044]
前記凝集したニューロンが、角錐状ウェル中での遠心分離によって形成される、本発明1041の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1045]
別個のニューロン本体部および別個の軸索部を含む、本発明1041の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1046]
一方向性または二方向性の植え込み可能な生きた電極である、本発明1041の植え込み可能な生きた電極。
[本発明1047]
本発明1041の生きた電極を患者の黒質に植え込む段階を含む、患者におけるパーキンソン病を処置する方法。
[本発明1048]
細胞外マトリックスコアを提供する段階;および
該細胞外マトリックスコアの少なくとも一端を複数の凝集したニューロンと接触させる段階
を含む、植え込み可能な生きた電極を製造する方法。
[本発明1049]
細胞外マトリックスコア内またはそれに沿った軸索の成長を促進する条件下で植え込み可能な生きた電極を維持する段階をさらに含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
少なくとも1つの細胞外マトリックスコアを接触させる段階の前に、複数の凝集したニューロンを予備形成する段階をさらに含む、本発明1049の方法。
本発明は、以下の定義を参照して最も明確に理解される。
本発明の局面は、先進のマイクロ組織加工技術を利用して、長期的なBMIおよび/またはニューロモデュレーションのための最初の生きた生物学的電極を創出するものである。新規なマイクロ組織工学神経回路網(マイクロTENN)は、一般的に微小管状ハイドロゲル内に含有される長い軸索路によって接続された別個のニューロン集団から構成される生きた電極として作用する。これらの生きたミクロンスケールの構造体は、局所ニューロン/軸索との統合のために所定の深さまで脳に貫入することが可能であり、後ろの部分は脳表面上に外在したままであり、そこで次世代光および電気インターフェースを使用して機能的情報が入力/制御および/または出力/収集される。
ここで図2A~2Cを参照すると、電極(100)は、多様な直径および/または厚さを有することができる複数の層(102、104、206)を含むことができる。
本発明の態様は、光感受性イオンチャンネルを発現するように遺伝的に改変された細胞を生きた組織中で制御するために、光の使用を可能にする光遺伝学的ニューロンを含むことができる。例えば、ニューロンは、チャンネルロドプシン、ハロロドプシン、およびアーキオロドプシン(archaerhodopsin)ならびに/またはカルシウム(例えば、エクオリン、カメレオン(Cameleon)、GCaMP)、塩化物(例えば、クロメレオン(Clomeleon))もしくは膜電圧(例えば、マーメイド(Mermaid))に対する1つもしくは複数の光遺伝学的センサーなどの1つまたは複数の光遺伝学的アクチュエーターを発現することができる。
本明細書記載の構造は、生体適合性であることができる。例えば構造は、植え込まれたときに、対象に有害な慢性の免疫原性または炎症性応答を発生すべきでない。ある特定の態様では、構造の1つまたは複数の要素は経時的に分解し、それにより、被包された軸索路を対象内に残す。一態様では、生きた電極は、同種ニューロンを使用して発生される。同種ニューロンは、明白な免疫原性または炎症性応答を誘起すべきでない。一態様では、生きた電極は、患者自身の幹細胞(例えば、人工多能性幹細胞、または嗅上皮、舌、脳室上位、もしくは歯状回に見られる幹細胞などの内因性幹細胞集団)に由来する自己ニューロンを使用して発生される。
ハイドロゲルは、一般的に多量の液体を吸収することができ、平衡時に典型的には、約60%よりも大きい液体および約40%未満のポリマーから構成される。好ましい態様では、ハイドロゲルの水分含量は約80~99.9%である。ハイドロゲルは、架橋ポリマーネットワークの固有の生体適合性が原因で特に有用である(Hill-West, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5967-5971)。ハイドロゲルの生体適合性は、親水性および大量の生物学的液体を吸う能力のせいであるとすることができる(Preparation and Characterization of Cross-linked Hydrophilic Networks in Absorbent Polymer Technology, Brannon-Peppas and Harland, Eds. 1990, Elsevier: Amsterdam, pp 45-66; Preparation Methods and Structure of Hydrogels in Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Peppas, Ed. 1986, CRC Press: Boca Raton, Fla., pp 1-27)。
ここで図3を参照すると、本発明の別の局面は、方法(300)を提供する。
本発明の別の態様は、異なる束/軸索へのより大きなアクセスを提供する末梢神経インターフェース(PNI)電極および技法を提供する。マクロ組織工学神経回路網(マクロTENN)は、より大きく、PNS適用のために特異的に改変されている。本発明の態様は、神経束にマクロTENNの内表面周囲に広がらせるように軸索の再生を導く。分離は、束および/または軸索を分離して、以前の技法では利用不可能であった神経選択性レベルを得ることが可能であるという機能的有用性を有する。
本発明の別の局面は、実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアおよび該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた複数の凝集したニューロンを含む凝集物性TENNを提供する。
本発明の態様は、感覚受容器を本明細書記載の生きた電極内に統合して、刺激を検出することおよび対応するシグナルを対象の神経系または外部システムに伝達することの両方を行うことができる一体型センサーを提供することができる。例えば、生きた電極は、感覚後根神経節細胞ならびに/または圧受容器、化学受容器(例えば、I型/グロムス細胞およびII型グリア様細胞)、電磁受容器(例えば、赤外線受容器、光受容器、紫外線受容器)、電気受容器、水受容器(hydroreceptor)、磁気受容器、機械受容器、侵害受容器、匂い受容器、浸透圧受容器、固有受容器、味覚受容器、温度受容器などの専門化されたセンサーを有する細胞を含むことができる。生きた電極は、蝸牛および/または前庭有毛細胞も含むことができる。
本発明の態様は、外部センサーから対象の神経系または外部システムにシグナルを伝達するためにも利用することができる。例えば、人造センサーは、圧力、温度、位置、力、音、匂い、光などの条件を指し示す、電気、光、および/または磁気シグナルを発生することができる。本明細書記載の生きた電極構造の態様は、これらのシグナルを受信し、シグナルを対象の神経に伝達/変換することができる。
本発明のいくつかの態様が、本明細書記載の生きた電極に隣接し得るがそれと別個であり得る、表面オプトロードなどの外部電気機械デバイスに関連して記載されるものの、本発明の他の態様は、そのようなデバイスを生きた電極内に組み入れることができる。例えば、電気接触は、生きた電極内で成長させるまたはその中に挿入することができる。同様に、オプトロード、電磁デバイス、熱電式(ジュール-トムソン抵抗)加熱器、熱電式(ペルチェ)冷却器、および/または化学物質アプリケーターを生きた電極内で成長させるまたはその中に挿入することができる。例えば、神経伝達物質、ニューロンが応答するリガンド、および/または電気シグナルに応答するイオンを放出するように化学物質アプリケーターを適応および設定することができる。
生物学的多重化は、電気通信に使用される種類のチャンネル選択、多重化および逆多重化の生物学的バージョンを包含すると広く定義することができる。いくつかの態様では、生物学的多重化は、集束および発散シグナル伝達の両方を含み、構造体の多数のニューロン内のシグナル処理は、単一の宿主実質標的に集束することができ、1つの構造体ニューロンは、多数の宿主実質ニューロンを標的とするために軸索を発散的に分岐させることができる(図21、パネルA~C)。同様に、宿主脳内のニューロンは、それ自体、内因性神経回路網に包埋しているので、生きた構造体が軸索出力をこれらの宿主ニューロンの1つに送る能力は、内因性神経回路網の特異的で安定な活性化を可能にする。1つの軸索は、原則的に数千の標的ニューロン上にシナプス形成することができるので、構造体内のニューロンの相対的に小さな集団は、広範囲に渡る効果を達成することもできる。マイクロパターン形成技法を配備することによって、生きた電極をインビトロで作り、インビボで植え込んだときにきめ細かい時分割多重化を可能にすることができる(図21、パネルD)。
その様々な局面および態様では、本発明の組成物は、幹細胞から生成され得る。様々な態様では、有害な免疫応答が、患者由来の自己細胞の使用により緩和され得る。ニューロン、乏突起膠細胞、星状膠細胞、およびシュワン細胞は、ヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および脂肪由来幹細胞から分化させることができる。幹細胞の直接インビボ送達が、失われた細胞に取って代わり、栄養因子の放出により神経再生を助長し得るものの、それらが神経系を刺激するメカニズムは、不明のままであり、それらは、望ましくない表現型に分化する潜在性を有し、および/または腫瘍形成を招く。比較すると、生きた電極内で分化したニューロンを使用する顕著な利点がある。幹細胞を皮質投射ニューロン、介在ニューロン、ドーパミン作動性A9ニューロン、脊髄運動ニューロンなどの、特異的ニューロンサブタイプに分化させる既存のプロトコールを、特異的なニューロン組成を有する生きた電極を加工するために使用することができる。ニューロンは、最終分化しておりかつ加工された構造体の3D構成によって物理的に束縛されているので、このアプローチは、腫瘍形成のリスクがより少ない可能性がある。様々な態様では、再生応答を強化するために、分化したニューロンを遺伝的に改変することができる。以前の研究は、移植された細胞の低い生存率が、変成性のまたは「敵対的な」損傷環境内への送達が原因である可能性があると示唆している。様々な態様では、分化したニューロンの耐久性および再生能は、トランスフェクション技法またはウイルストランスダクションを使用することによる栄養因子の過剰発現により増強され得る。このアプローチは、操作された組織を、神経変性疾患の基礎をなす病態生理に対して耐性にし得る。
様々な態様では、本明細書記載の生きた電極は、生きた電極ニューロンの、したがって軸索のプログラム細胞死を駆動する制御された「殺滅スイッチ」を含むように操作され得る。実際に、移植された構造体にプログラム細胞死を誘導するために異なる戦略を採用できることは、生きた電極の安全性を強化するための潜在的に重要な方法である。生きた電極構造体に包埋することができる開発中の複数の自殺遺伝子技法がある。これらの自殺遺伝子は、プロドラッグ、ならびに2つの臨床的に検証された構造体、iCasp9およびHSV-TKの導入によって活性化されるまで生物学的に不活性であり、様々な態様で適切であり得る迅速なアポトーシスに対する緩徐なアポトーシスにそれぞれ基づく異なる状況に十分に適している。
様々な態様では、生きた電極は、従来型のニューロモデュレーションを強化もしくは置換するために配備され得る、またはより遠くまで及ぶ薬物送達適用のために適用され得る。例えば、生きた電極は、特異的接続の強度に影響する重要な位置に正確に送達される場合がある。様々な態様では、大きすぎる影響を及ぼしておりかつ有害な機能的効果を引き起こしている経路をモデュレートするために、例えばてんかん様活動を示している回路網において過同期活動を弱めるために(下により詳細に説明する)、生きた抑制性(例えばGABA作動性)電極がシナプスを形成するように設計され得る。逆に、いくつかの態様では、興奮性(例えばグルタミン酸作動性)の生きた電極が、例えば変性経路の標的でグルタメートを放出している構造体由来の軸索とシナプスを形成して、弱い経路を強化し得る。様々な態様では、生きた電極は、緊張性(自己ペース/連続的)活動を介するか、宿主から生きた電極ニューロン細胞体/樹状突起への入力に応答することによるか、または外部に置かれたハードウェアもしくはコンピューターから制御されたかのいずれかの、軸索末端での神経伝達物質の大量放出によっても作用する場合がある。
フリードリヒ運動失調の大部分の例では、染色体9q13上のフラタキシン遺伝子の両方の対立遺伝子のイントロン1におけるトリヌクレオチド(GAA)リピートのエクスパンションが、遺伝子の転写低下(すなわち、サイレンシング)、遺伝子産物フラタキシンの発現減少、および後柱経路の最終的な破壊に繋がる。結果として患者は、末梢からの自己受容性および識別性シグナルの不在下で重症の運動不全を発生する。様々な態様では、生きた電極は、人工の感覚アーク(sensory arc)を提供することもできる。末梢から(四肢全ての関節に装着されたひずみ計、加速度計およびジャイロスコープ、または末梢神経の植え込み型カフ記録などから)のシグナルに打ち込むことによって、一次感覚皮質に植え込まれた生きた電極は、感覚フィードバックを提供することもでき、改善された随意運動および機能的独立性を可能にする。グルタミン酸作動性ニューロンと共に成長させた後、これらの生きた電極を中心後回の第IV層に終止するように植え込むこともでき、生きた電極自体が極めて小さいので、様々な態様では、異なる関節に対応する複数の構造体を植え込むこともできる(例えば、左膝からのジャイロが感覚皮質右内側部に植え込まれた生きた電極を駆動し、左肘および肩が感覚皮質右外側部に向かい、右上下肢および左半球についてその逆である)。
脳幹卒中、脊髄損傷、筋ジストロフィーおよび筋萎縮性側索硬化症では、随意運動制御の基質(一次運動皮質)が骨格筋から(およびある特定の場合には、延髄性-咽頭筋からも)機能的に離断するので、人々は麻痺する。神経運動プロステーシスは、脳から直接記録し、この記録された活動を環境中の制御デバイスに送って解読し、ロボットアクチュエーターをトリガーするか、または植え込まれた神経筋刺激装置を駆動することによってこの麻痺を克服しようとするブレイン-コンピューターまたはブレイン-マシンインターフェースのクラスを含む。いくつかのヒト治験が、このアプローチの安全性および有効性を示したとはいえ、患者は、純粋に視覚フィードバックにより制御を成し遂げる。運動ニューロン疾患または筋疾患を有するある特定の患者において感覚アークが保持され得るとはいえ、それは、脊髄完全離断では失われており、外部ロボットを使用する場合、全ての患者には利用不可能である。いくつかのグループが、触覚シグナルを、一次感覚皮質に植え込まれたマクロおよびマイクロ電極によって提供される電気刺激に連結することによって触覚フィードバックを提供することを試みた。この種類の人工触覚フィードバックは、非ヒト霊長類において有効であるように見えるが、ヒトではまだ試験されていない。フリードリヒ運動失調を有する小児および成人と同様に、生きた電極は、感覚皮質に直接植え込まれることにより、感覚アークを反復し広げるのに有望である(図20、パネルB参照)。外部装着されたセンサーによって駆動される態様に加えて、他の態様では、生きた電極活動を、ロボットアーム、動力付きのロボット外骨格装具、車いす部品および他の介助デバイスに搭載されたセンサーによってトリガーすることもできる。このように、麻痺した患者は、自分自身の肢およびこれらのデバイスの「肢」を事実上「感じて」、強化された随意制御を促進することもできる。追加的に、内部に植え込まれたマイクロプロセッサーを通ってルーティングされる運動皮質および感覚皮質の両方への二方向性インターフェースを提供することによって、様々な態様では、生きた電極は、リアルタイムの閉ループで皮質間通信をモデュレートして、運動機能および感覚/固有受容フィードバックを回復することもできる。
様々な態様では、特別仕様の生きた電極は、疼痛減衰回路への入力をモデュレートするために有用であり得る。様々な態様では、エンドルフィンまたはエンケファリンを分泌しているペプチド作動性ニューロンを使用して生きた電極を創出し、次にそれを脊髄、中脳水道灰白質、腹後側視床または前帯状皮質の膠様質に植え込むこともできる。様々な態様では、これは、脊髄および脳電気刺激装置の非特異的アプローチと置き換わる。様々な態様では、このニューロモデュレーションの制御は、ユーザー依存性(例えば、全身医薬ポンプと類似)であることもできるので、オピエートまたは他のペプチドを直接注入するマイクロフルイディクスと異なり、そして標的体積を非特異的にモデュレートする電極と異なり、ニューロンから構成される生きた電極は、それ自体、上方調節および下方調節を受け、したがって、耐性、乱用または離脱の発生に対する追加的な予防法を提供する。
アルツハイマー病(アミロイド-タウオパチー)およびレビー小体認知症(アルファ-シヌクレイン病)の両方の特質は、前脳基底核におけるコリン作動性ニューロンの喪失である。これらのニューロンは、海馬の形成を含む内側側頭葉構造と相互に連結しており、エピソード記憶を形成するために必要である。様々な態様では、コリン作動性ニューロンを使用して築かれた生きた電極を、中隔核または他の隣接する前脳基底核、例えばマイネルト基底核またはブローカ対角帯に植え込むこともできる。様々な態様では、前脳基底部に定位的に植え込まれ、脳サービスに(脳弓柱路をたどって)半外在化された生きた電極は、外部コンピューターを用いた閉ループ制御を可能にすることもできる。偶発的符号化を強化するために側頭葉に植え込まれた別々の生きた電極の活動から解読された記憶干渉局所電場電位のシグネチャーの検出に応じて、生きた電極内のニューロンの異なる亜集団(コリン作動性、GABA作動性、グルタミン酸作動性)を、光遺伝学的および骨内固定導波管を介して差次的にトリガーすることもできる。同様に、他の態様では、外部合図(例えば、スマートフォンのリマインダー、および使用者がトリガーするプッシュボタンのフラグ立て)を使用して、前脳基底部活動をモデュレートして保持および再生を強化することもできる。様々な態様では、第2の生きた電極を嗅内皮質および海馬に植え込み、次に、前脳基底部に植え込まれた生きた電極に、外部コンピューターを介して連結して、二方向性脳弓中隔海馬経路を機能的に再インスタンス化(re-instantiate)することもできる。
別の局面では、優位半球の下前頭回を冒す前頭側頭認知症性タウオパチーである失文法性原発性進行性失語症のために、ブローカ野を前運動皮質および一次運動皮質と連結(して、運動性失語症を代償し、運動代替ジェスチャーを可能に)する、およびブローカ野を人工弓状束としてウェルニッケ野と連結する両方のために、生きた電極を植え込むこともできる。行動障害型前頭側頭認知症(TDP-43オパチー、時にタウオパチー)に向けた態様では、変性眼窩前頭皮質を無傷の背外側前頭前、前頭極、および前帯状皮質と連結する構造体が、行動抑制および自己調節を再インスタンス化することもできる。意味性認知症変異型のFTD(TDP-43またはタウ)に向けた態様では、側頭葉の前頭腹側面の変性が起こり、それが意味的知識貯蔵庫の喪失ならびに多様な読解および知覚障害に繋がる場合がある。様々な態様では、紡錘状回の視覚性単語形成野に植え込まれた、生きた興奮性グルタミン酸作動性電極は、この領野において残存機能をブーストする場合があり、生きた電極を一次および二次視覚皮質領野を腹側側頭葉に連結する補助的軸索束として作って、失われた「腹側-何か」経路を再創出し、意味処理を回復することもできる。自閉症スペクトラム障害および行動障害型前頭側頭認知症の両方では、社会的知覚および相互作用が損なわれる。様々な態様では、表面および左背外側前頭前皮質内のグルタミン酸作動性ニューロンならびに視床下部の視索上核および傍室核に並置されたオキシトシン作動性ニューロンを用いて築かれた生きた電極は、行動の脱抑制を消失させ、社会的行動を回復することもでき、眼鏡フレーム、補聴器、腕輪または他の装いに控えめに搭載したマイクロホンおよびマイクロカメラから解読された社会的合図をトラッキングする外部コンピューターによって、表面皮質集団をトリガーすることもできる。
虚血性脳卒中および出血性脳卒中の両方は、局所性脳組織破壊および多様な炎症度を招く。虚血性脳卒中では、組織を囲む周縁部は機能的であり続けると同時に、さらなる発作(血圧低下または低酸素からのものなど)に代謝的に脆弱な場合がある。子宮内でまたは周産期に起こったとき、脳卒中(例えば、胚マトリックス出血)は、脳の残りが周りで正常に発達しようとする静的な発作に繋がる可能性があり、ある特定の場合には、様々な程度の運動および認知機能障害を有する脳性麻痺に繋がる。脳の領野が損傷された場合、2面の機能、すなわち局所灰白質の「計算」およびまた軸索の(限局的内在性線維およびまた通過する交叉線維も)「接続性」が失われる。様々な態様では、マイクロTENNは、計算および接続性の両方を直接回復し、脳の不可逆的損傷片のための、ならびに代謝的、電気的および機能的に復活し、周囲の境界域を支持するための、「取り替え部品」として役立つ。中大脳動脈閉塞を用いた脳卒中の動物モデルにおいて、光遺伝学的移植片は、機能的移動性を回復することが示された。この移植片が外部レーザーによって「駆動された」のに反して、機能付与された生きた電極は、脳の無傷領域および身体センサーまたはコンピューター作動リハビリテーションによってトリガーされる外部モデュレーションの両方に「駆動」を行わせて、境界域内の活動ならびに脳卒中後の機能的移動性および行動を回復することもできる。
薬物療法、精神療法および電気けいれん療法に対して難治性の重度臨床的うつ病は、帯状回を含む辺縁系構造における破壊されたグルコース取り込みを含む神経代謝性撹乱によって特徴づけられる。様々な態様では、マイクロTENNを植え込んで、前頭極皮質と前帯状部との間の接続性を高める、または膝上前帯状皮質を膝下前帯状皮質に連結し、その結果、前者が後者をモデュレートして、正常な代謝活性を回復し、症状を緩和することもできる。同様に、様々な態様では、ドーパミン作動性ニューロンが播種された場合、側座核に植え込まれた生きた電極を配備して、カテコールアミンのトーンの動的相変化を提供し、したがって、思考および知覚の気分的サリエンス標識を変化させて、リバウンドした不快気分または耐性のシナプス後上方調節を引き起こさずに、うつ症状を緩和することもできる。
てんかんのための適用は、生きた電極の先進の機能性が、既存のアプローチでは不可能な形で処置目標を達成することもできる2つの方法を示す。最初に、生きた電極を模造することができ、それにより、標的野に最も近いニューロン集団が標的領域に広く抑制性神経伝達物質GABAを分泌した。分泌は、構成的または早期てんかん様活動の測定に基づき脳表面から誘発されて(下記)のいずれかであった。このアプローチでは、生きた電極は、GABAリザーバーおよび送達システムとして効果的に役立つ(図20、パネルC参照)。色々な態様では、生きた電極に、ニューロリギンで装飾された細胞外マトリックス中の興奮性グルタミン酸作動性ニューロンを播種して、局所内因性GABA作動性ニューロンと同軸性にシナプス形成させることもできる。どちらのアプローチも、過同期活動の破壊を実現し、したがって、脳内の標的野からの病的発作の発生または伝播を停止し得る。脳内のてんかん様ネットワーク中のニューロンが、構造体内のニューロンから広がる樹状突起上にシナプスを形成する場合があるので、色々な態様が、焦点性閉ループ自己減衰回路を実現する場合があり、その結果、焦点性てんかん様活動は、生きた抑制性電極によって媒介されるこの自己抑制ループを介してそれ自体消失する。多焦点性てんかんに向けた態様では、生きた電極を、2つ以上のてんかん発生焦点(例えば、頭蓋内表面および深部記録によって特定されたもの)に植え込むこともできる。様々な態様では、従来の電極では不可能であった方法で発作の伝播を先制して停止させるために、センサー(例えば、継続中の局所電場電位を捕捉する骨内または帽状腱膜下リード)を使用して、発作前または発作活動のシグネチャーをピックアップし、表面から外在化した光遺伝学的修飾マイクロTENNの光刺激をトリガーすることもできる。
さらなる局面では、本発明は、パーキンソン病の処置のためのマイクロTENN組成物および方法を提供する。一局面では、本発明は、実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた1つまたは複数のニューロンを含み、その際、ニューロンはドーパミン作動性ニューロンである。別の局面では、本発明は、ドーパミン作動性マイクロTENNを患者のSNpc中に植え込む段階を含む、パーキンソン病を処置する方法を含む。
全ての供給品は、特に断りのない限り、Invitrogen、BD Biosciences、またはSigma-Aldrichからのものとした。マイクロTENNは、軸索が成長できるシリンダー内に成形されたアガロースECMヒドロゲルを含んだ。外側ヒドロゲル構造は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中1%アガロースから構成した。毛細管現象を介して毛細管(Drummond Scientific)にアガロース溶液を吸引することによって、外径398μmのアガロースシリンダーを生成した。内側カラムを生産するために、アガロースを充填した毛細管の中心に鍼灸針(径:160μm)(Seirin)を挿入した。硬化したマイクロカラムを毛細管から押し出して、DPBS中に入れ、そこで、これらを6~12mm長に切り出し、UV光下で滅菌した(1時間)。適切なECMカクテル5μLを各マイクロカラムに加えた。ECMカクテルは、以下を含んだ:1.0mg/mLラット尾1型コラーゲン;1.0mg/mlマウスラミニンと混合した1.0mg/mlラット尾I型コラーゲン;1.75mg/mlマウスラミニン;ならびに、11.70mM N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボイミド塩酸塩、4.3mM N-ヒドロキシスクシンイミド、および35.6mM一塩基性リン酸ナトリウム中1.0mg/mLラット尾1型コラーゲン。次いで、これらのマイクロカラムを37℃で15~30分間インキュベートし、その後、DPBSをペトリディッシュに加えた。
雌のSprague-Dawleyラット(Charles River)を、初代腹側中脳ニューロン(ドーパミン作動性ニューロンが豊富にあると過去に示された中脳領域)の供給源とした(Weinert et al. 2015, Isolation, culture and long-term maintenance of primary mesencephalic dopaminergic neurons from embryonic rodent brains, Journal of visualized experiments : JoVE, (96))。二酸化炭素を使用して時期指定妊娠ラット(胎生14日目)を安楽死させ、その後、子宮を摘出した。脳をハンクス平衡塩類溶液(HBSS)に取り出し、そして、腹側中脳を単離した。腹側中脳を、アクターゼ(accutase)中、37℃で10分間解離させた。細胞を、相対遠心力(RCF)200で5分間遠心分離し、NEUROBASAL(登録商標)培地+2% B27+1%ウシ胎児血清(Atlanta Biologicals)+2.0mM Lグルタミン+100μMアスコルビン酸+4ng/mLマウス塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)+0.1%ペニシリン-ストレプトマイシンから構成される標準培地中に1~200万個の細胞/mLで再懸濁した。高濃度成長培地は、NEUROBASAL(登録商標)培地+2% B27+1%ウシ胎児血清(Atlanta Biologicals)+2.0mM Lグルタミン+100μMアスコルビン酸+0.1%ペニシリン-ストレプトマイシン+12ng/mLマウスbFGF+10ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)+10ng/mLグリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)+10ng/mL毛様体神経栄養因子(CNTF)+10ng/mLカルジオトロフィンから構成した。ドーパミン作動性ニューロン凝集物を、Ungrin MD, Joshi C, Nica A, et al. 2008, Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates, PloS one, 3 (2): e1565から改作されたプロトコールに基づいて作製した。逆角錐状ウェルの注文製のアレイを、3Dプリント製鋳型から鋳造したポリジメチルシロキサン(PDMS)(SYLGARD(登録商標)184, Dow Corning)を使用して製作し、12ウェルプレート内に設置した。細胞溶液12μLを各角錐状ウェルに移し、そして、12ウェルプレートを1500rpmで5分間遠心分離し、その後、標準培地2mLを各アレイの上部に入れた。遠心分離は、ニューロンの強制凝集をもたらした(1凝集物当たりおよそ3,200個の細胞)。次いで、ウェルを一晩インキュベートした。プレーティングをする時点で、マイクロカラムを含有するディッシュからDPBSを除去し、培地交換した。鉗子を使用して、凝集物をマイクロカラムの一端(一方向)または両端(二方向)に挿入し、そして、培養物をインキュベーターに入れた(ドーパミン作動性ニューロンで作製された合計のマイクロTENN:n=300)。
マイクロTENNを、4%ホルムアルデヒド中で35分間固定し、0.3% Triton X100プラス4%ウマ血清を使用して60分間透過処理した。一次抗体(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+4%血清中)を4℃で12時間加えた。一次抗体は、以下のマーカーとした:(1)β-チューブリンIII(1:500, Sigma-Aldrich, cat #T8578)、ニューロンにおいて主に発現される微小管エレメント;(2)チロシンヒドロキシラーゼ(TH;1:500, Abcam, cat #AB113)、ドーパミンの産生に関与する酵素;(3)微小管関連タンパク質2(MAP-2)(1:500, Millipore, cat #AB5622)、樹状突起に見いだされる微小管関連タンパク質;(4)ドーパミンおよびcAMP調節ニューロンリンタンパク質(DARPP-32)(1:250, Abcam, cat #AB40801)、線条体中型有棘ニューロンに見いだされるタンパク質;ならびに(5)シナプシン1(1:1000, Synaptic Systems, cat #106001) 、中枢神経系のシナプス小胞で発現されるタンパク質。適切な蛍光二次抗体(Alexa-488、-594および/または-649、PBS+30nM Hoechst+4%血清中1:500)を18~24℃で2時間加えた。
雄のSprague-Dawleyラット(325~350g)にイソフルランで麻酔をかけ、定位固定フレームに装着した。頭皮をベタダイン(betadine)で清浄し、ブピバカインを切開線に沿って注射し、そして、正中切開を行って前頂測定点(Bregma landmark)を露出させた。5mmの頭蓋骨切除を、前頂に対して以下の座標を中心に行った:+4.8mm(AP)、2.3mm(ML)。マイクロTENNを、定位固定アーム上に装着されたハミルトンシリンジに取り付けられた針(OD:534μm、ID:420μm;Vita Needle, Needham, MA)に装填した。定位固定アームを水平面に対して34°に位置付け、硬膜を開き、そして、脳内に針を深さ11.2mmまで下ろした。針を所定の位置で10秒間維持し、その時点で、ハミルトンシリンジのプランジャーと接触するように固定アームを位置付けた。次いで、マイクロTENNを含有する針を脳から引き抜いた。頭皮を縫合して閉じ、そして、術後鎮痛用にブプレノルフィンを与えた。マイクロTENNを受けた動物を1週間(n=5)または1か月(n=5)のいずれか生存させた。屠殺時に、動物に麻酔をかけ、そして、ヘパリン加生理食塩水、続く10%ホルマリンによる経心腔的灌流を受けさせた。
4%パラホルムアルデヒド中での固定の24時間後、パラフィン処理または凍結切片化のいずれかのために脳を調製した。脳を矢状に切断し、パラフィンに通して処理するかまたは飽和まで30%スクロースに入れて凍結した。切片を8μm(パラフィン)または35μm(低温切片)に切り出し、スライドに載せ、そして、免疫組織化学用に処理した。
インビトロ分析のために、マイクロTENNを、NIKON(登録商標)ECLIPSE(登録商標)Ti-S顕微鏡で位相差蛍光を使用して撮像し、画像収集は、NIKON(登録商標)ELEMENTS(商標)ソフトウェアと接続されたQICLICK(登録商標)カメラを使用した。神経突起の侵入の長さを決定するために、各マイクロTENN中の最長の観察可能な神経突起を、固定後のニューロン凝集物の近位端から測定した。インビトロ免疫細胞化学分析のために、NIKON(登録商標)A1RSIレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して培養物およびマイクロTENNを蛍光撮像した。全てのマイクロTENN共焦点再構成は、全厚zスタック(z-stacks)からとした。脳へ移植した後のマイクロTENNの分析のために、NIKON(登録商標)A1RSIレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してマイクロTENNを蛍光撮像した。各切片を分析して、マイクロTENNニューロン/神経突起の存在、構成、および伸長/統合を評価した。
群の試料サイズを事前に決定するために使用する方法はなかった。実験群間で明らかな目視による相違があるため、ほとんどの場合、研究者は、実験またはデータ評価中処置群に対して盲検下でなかった。インビボ移植研究のために、この実験での使用にラットを無作為に割り当てた。全てのデータの正規性を調べ、そして、非正規データについて調整を行った。対応のないパラメトリック両側t-検定を実施して、ドーパミン作動性末端標的を含有する一方向マイクロTENN対二方向マイクロTENN間で軸索伸長に統計的に有意な差があったかどうかを判定した。対応のない非パラメトリック両側マンホイットニー検定を実施して、以下の処置ペア間で軸索伸長に統計的に有意な差があったかどうかを判定した:解離細胞対凝集細胞、高い成長因子濃度対通常の成長因子濃度、および線条体末端標的を含有する一方向マイクロTENN対二方向マイクロTENN。対応のない非パラメトリック両側マンホイットニー検定を実施して、コラーゲンI内部コア対コラーゲンI-ラミニンカクテル内部コアの全軸索長に対する百分率としてのTH+軸索長間で統計的に有意な差があったかどうかを判定した。ANOVAを細胞外マトリックス研究のために実施した。群間で差が存在したとき、テューキーの事後ペアワイズ比較を実施した。全ての統計検定について、有意性にはp<0.05が求められた。データを平均±標準偏差として提示する。
神経細胞の単離および培養プロトコールは、公開されている研究のプロトコールと同様である。簡単に述べると、時期指定妊娠ラットを安楽死させ、そして、子宮を取り出した。胎生18日目の胎児を子宮から冷HBSSに移し、ここで、脳を摘出し、そして、顕微解剖を介して立体鏡下で大脳皮質半球体を単離した。皮質組織を0.25%トリプシン+1mM EDTA中37℃で解離させ、その後、トリプシン/EDTAを除去して、HBSS中0.15mg/ml DNaseに交換した。解離組織+DNaseを3000RPMで3分間遠心分離した後、DNaseを除去し、そして、NEUROBASAL(登録商標)+B27(登録商標)+Glutamax(商標)(ThermoFisher)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンから構成されるニューロン培養培地中に細胞を再懸濁した。
マイクロTENNを三相プロセスで構築した(図29)。最初に、指定の形状(外径(OD)、内径(ID)、および長さ)のアガロースマイクロカラムを特注設計のアクリル型で形成した(図29、パネルA)。鋳型は、鍼灸針(Seirin, Weymouth, MA)がチャネル内で同心円状に位置合わせされるような針の挿入を可能にする、円筒形チャネルのアレイである。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)中の溶融アガロースを鋳型-針アセンブリに注ぎ、放冷した(アガロース:3%重量/体積)。アガロースが凝固したら、針を除去して鋳型を解体し、チャネルのサイズに等しい特定の外径および針の外径に等しい内径を有する中空アガロースマイクロカラムを得た。マイクロカラムを、UV光を介して30分間滅菌し、脱水を防止するためにDPBS中に必要となるまで保存した。これらの研究のために、鋳型チャネルを398μm径とし、そして、鍼灸針を180μmとし、結果として398μm ODおよび180μm IDを有するマイクロカラムが得られた。マイクロカラムを、2ミリメートルまたは5ミリメートルのいずれかの長さに切り出した。次に、初代皮質ニューロンを強制的に細胞凝集物にした(図29、パネルB)。これらの凝集物は、マイクロカラムの長さに及ぶ長い軸索束の成長に必要な構成を提供する。細胞を、特注設計の3Dプリント製鋳型から鋳造したPDMS(SYLGARD(登録商標)184, Dow Corning)製の逆角錐状ウェルのアレイに移した(図29、パネルB)。解離皮質ニューロンを、100万~200万個細胞/mlの密度で懸濁し、ウェル中にて200gで5分間遠心分離した。この遠心分離は、1凝集物/球体当たりのニューロンの数が正確に制御された、ニューロン(または任意の他の細胞タイプ)の強制凝集をもたらした(1ウェル当たり細胞懸濁液12μL)。角錐状ウェルおよび強制凝集プロトコールをUngrin等から改作した。最後に、マイクロカラムをDPBSから取り出し、そして、マイクロピペットを介して過剰のDPBSをマイクロカラム内部から除去した。次いで、マイクロカラムに、1.0mg/mlラット尾コラーゲン+1.0mg/mlマウスラミニン(Reagent Proteins, San Diego, CA)から構成される細胞外マトリックス(ECM)を充填した(図29、パネルC)。一方向マイクロTENNまたは二方向マイクロTENNに、立体鏡下で細鉗子を使用して、それぞれマイクロカラムの一端または両端に凝集物を慎重に設置することによって播種し、37℃、5% CO2で45分間付着させた。解離マイクロTENNを作製するために、解離皮質ニューロンを、先の研究で詳述した通りマイクロピペットを介してECM充填マイクロカラムに移した。次いで、インビトロで2日(DIV)毎に新鮮な培地に交換しながら、マイクロTENNをニューロン培養培地中で成長させた。
培養中のマイクロTENNの位相差顕微鏡検査画像を、1、3、5、8、および10 DIVに、QIClick(登録商標)カメラおよびNIS Elements BR 4.13.00と組み合わせたNIKON(登録商標)Eclipse Ti-S顕微鏡を使用して10×の倍率で取得した。マイクロTENNを製作して、次の4群のうちの1群に分類した:解離/2mm長(LEDISS,2mm)(n=7)、一方向凝集物/2mm長(LEUNI,2mm)(n=6)、二方向凝集物/2mm長(LEBI,2mm)(n=9)、または二方向凝集物/5mm長(LEBI,5mm)(n=7)。特定の時点における各群の成長速度を、最新の時点と前の時点の間の日数で割った最長の同定可能な神経突起長の変化として定量した。最長の神経突起を、MATLABのImage Processing Toolbox(MathWorks, MA)からの機能を使用して各位相画像内にて手動で同定し、そして、起点の凝集物から神経突起先端への長さを測定した。より正確な分析のために全時点にわたって同一の開始マイクロTENNおよび開始点を使用した。平均成長速度を、指定の時点で群毎に見いだして、二元配置分散分析(ANOVA)で比較し、事後解析は必要に応じてボンフェローニ手順を用いて実施した(有意性にはp<0.05が求められる)。全てのデータを平均±s.e.m.として提示した。マイクロカラム全体にわたる凝集物特異的成長を同定するために、皮質ニューロン凝集物を、アデノ随伴ウイルス1(AAV1)形質導入(Penn Vector Core, Philadelphia, PA)を介して、緑色蛍光タンパク質(GFP)または赤色蛍光タンパク質mCherryのいずれかで標識した。簡単に述べると、角錐状ウェル中の凝集物を遠心分離した後、ヒトシナプシン-1プロモーターをパッケージングしたAAV1 1μLを、凝集物ウェルに加えた(終濃度:1凝集物当たり約3×109個のウイルスコピー)。凝集物を、37℃、5% CO2で一晩インキュベートした後、培地を二回交換し、その後、形質転換凝集物をマイクロカラムに、各々、1つのGFP+および1つのmCherry+凝集物で、上記の通りプレーティングした(合計n=4)。複数DIVにわたって、NIS-Elements(登録商標)AR 4.50.00ソフトウェアと組み合わせたNIKON(登録商標)A1RSIレーザー走査型共焦点顕微鏡でマイクロTENNの画像を取得した。z-面での10~20μmの連続スライスを蛍光チャネル毎に収集した。提示される全ての共焦点画像は、共焦点z-スライスの最大値投影である。
ニューロン生存率を評価するために、ポリスチレン上にプレーティングされた5mm長の一方向(LEUNI)構築物および二方向(LEBI)構築物ならびに作製からの時間が一致する平板培養物を、10および28 DIVにカルセイン-AM/エチジウムホモダイマー-1(EthD-1)アッセイ(ThermoFisher)で染色した。代謝的に活性な細胞は、膜透過性カルセインAMをカルセインに変換し、これは緑色の蛍光(λexc約495nm;λem約515nm)を発するが、一方で、EthD-1は、膜損傷細胞に侵入し、核酸に結合すると赤色の蛍光(λexc約495nm;λem約635nm)を発する。簡単に述べると、培養物をDPBS中で穏やかにすすいだ。DPBS中のカルセイン-AM(1:2000希釈;終濃度約2μM)およびエチジウムホモダイマー-1(1:500;約4μM)の溶液を各培養物に加え、続いて、37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。インキュベートに続いて、培養物を新鮮DPBS中で2回すすぎ、NIS-Elements(登録商標)AR 4.50.00ソフトウェアと組み合わせたNikon(登録商標)A1RSIレーザー走査型共焦点顕微鏡にて10×の倍率で撮像した。ImageJ(National Institutes of Health, MD)を使用して、カルセイン-AM陽性およびエチジウムホモダイマー陽性の両細胞の全面積に対するカルセイン-AM陽性細胞の全面積の比率として生存率を定量した。各群の試料サイズは以下の通りであった:LEUNI,5mm(n=4、4);LEBI,5mm(n=7、4);平板培養物(n=9、5)、それぞれ10および28 DIV。全てのデータを平均±s.e.m.として提示した。
マイクロTENN凝集物接続性を調査するための概念実証として、凝集物に、遺伝的にコードされたカルシウムレポーターGCaMP6fまたはRCaMP1b(Penn Vector Core, Philadelphia, PA)を形質導入した。角錐状ウェル中の凝集物を遠心分離した後、ヒトシナプシン-1プロモーターをパッケージングしたAAV1 1μLを、凝集物ウェルに加えた(終濃度:1凝集物当たり約3×109個のウイルスコピー)。凝集物を、37℃、5% CO2で一晩インキュベートした後、培地を二回交換し、その後、形質転換凝集物をマイクロカラムに上記の通りプレーティングした。7~10 DIV後にANDOR Neo/Zylaカメラ(登録商標)およびNikon(登録商標)Elements AR 4.50.00と組み合わせたNIKON(登録商標)Eclipse Ti(登録商標)顕微鏡を使用してマイクロTENNを撮像し、その後、記録からのカルシウム移行を、NIKON(登録商標)Instruments(登録商標)Elements AR 4.50.00で同定した。マイクロTENNの選択した関心対象領域(ROI)の強度を、バックグラウンド(細胞本体または軸索なしのROIとして定義される)に対して経時的にプロットした。
蛍光カルシウム記録を上記の通り収集して、マイクロTENN活動のtiffスタックを作成した。各tiffスタックは、1秒当たり20フレームで記録した120秒の活動から構成された(合計2400フレーム)。機能分析を、3つのMATLAB(登録商標)ソフトウェアツールボックス-FluoroSNNAP、MATLAB(登録商標)ソフトウェア統計ツールボックス、およびEEGLAB用のSIFTを使用して実施した。FluoroSNNAPは、カルシウムイメージングに基づくニューロンのネットワーク分析をインビトロで実施するためのMeaney等によって設計されたインタラクティブソフトウェアパッケージである。簡単に述べると、時間平均画像をtiffスタックから生成し、その後、およそ20μm径のROIを手動で選択した。FluoroSNNAPを使用して、ROIの強度を抽出および正規化して、二方向マイクロTENN内の機能的接続性パターンを評価した;具体的には、正規化されたピアソン相互相関および正規化された位相同期マトリクスを、ROIのカルシウム移行パターンから作製した。追加的に、マイクロTENN全体にわたる情報フローを評価するために、SIFTツールボックスを使用して多変量自己回帰(MVAR)モデルに適合させ、これを使用して、正規化されたDirect Transfer Function(nDTF)接続性マトリクスを作成した。nDTFは、文献においてEEG活動の方向および周波数成分を決定するために使用されている19,20。ここで、これを適用して、二方向マイクロTENNにおけるある凝集物から別の凝集物への情報フローを検出した。数値的に安定した10次MVARモデルを使用して、スライドウィンドウ80秒および時間ステップ40秒でnDTF推定値を得た。ナイキストリミットによりnDTF係数を1~9Hzで得た。
マイクロTENNを、4、10、および28 DIVに4%ホルムアルデヒド中で35分間固定した。次いで、マイクロTENNを1×PBS中ですすぎ、PBS中0.3% Triton X100+4%ウマ血清で60分間透過処理した後、一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、軸索を標識するTuj-1/ベータ-IIIチューブリン(T8578, 1:500, Sigma-Aldrich)およびシナプス前部分化(presynaptic specializations)を標識するシナプシン-1(A6448, 1:500, Invitrogen)とした。一次抗体とのインキュベートに続いて、マイクロTENNをPBS中ですすぎ、蛍光標識二次抗体(1:500;Life Technologies、Invitrogen、およびJackson ImmunoResearchから供給)と18~24℃で2時間インキュベートした。最後に、Hoechst(33342, 1:10,000, ThermoFisher)を18~24℃で10分間加えた後、PBS中ですすいだ。NIS Elements AR 4.50.00と組み合わせたNIKON(登録商標)A1RSIレーザー走査型共焦点顕微鏡でマイクロTENNを撮像した。z-面での10~20μmの連続スライスを蛍光チャネル毎に収集した。提示される全ての共焦点画像は、共焦点z-スライスの最大値投影である。
マイクロTENNのインビボ挙動の概念実証として、GFP+ニューロン/軸索ありの予め形成されたマイクロTENNを、先行研究の説明と類似の定位マイクロインジェクションを介して脳へ送達した12,13。体重325~350グラムの雄のSprague-Dawleyラットに、イソフルランで1分当たり1.0~2.0リットルにて麻酔をかけ(吸入:5.0%、維持:1-5~2.0%)、定位固定フレームに装着した。メロキシカム(2.0mg/kg)およびブピバカイン(2.0mg/kg)を、それぞれ頸の基部におよび切開線に沿って皮下に与えた。その領域を剃ってベタダイン溶液で清浄し、その後、感覚皮質にかけて小開頭を行った(座標:+4.8mm AP、±2.3mm ML)。二方向マイクロTENN(5mm長)を、ハミルトンシリンジに接続された針に装填し、正確な設置のため定位固定アーム上に装着した。強制的な排出なしで構築物を脳に送達するために、針を皮質に6mmの深さまでゆっくり挿入した。次いで、ハミルトンシリンジのプランジャーを固定し、一方で、マイクロTENNを含有する針をおよそ1.5mm/分にて手動で5mm上昇させた。このプロセスで、低力のマイクロTENN送達が可能となり、深部視床構造である後内側腹側核(VPM)とウイスカーバレル皮質を接続できる。
植え込み後の7日目および28日目に、ラットを安楽死させ、冷ヘパリン加生理食塩水および10%ホルマリンで灌流した。頭部の一晩の固定の後、脳を採取して、マイクロTENNの生存および宿主/マイクロTENNシナプス統合を評価した。簡単に述べると、脳を矢状に切断し、凍結切片化用に40μmのスライスに切り出した。凍結切片について、スライスを30分間風乾し、3分間エタノールで2回処理し、3分間PBS中で2回再水和した。切片を0.1% Triton-x/PBS中5%正常ウマ血清(ABC Universal Kit, Vector Labs, cat #PK-6200)で30~45分間ブロッキングした。一次抗体を、2%正常ウマ血清/Optimax緩衝液中の切片に室温で2時間アプライした。一次抗体は、ヤギ抗GFAP(1:1000)、ウサギ抗IBA1(1:1000)、ニワトリ抗MAP2(1:1000)、およびマウス抗Tuj1(1:1000)とした。切片を5分間PBSで3回すすぎ、その後、二次抗体(1:1000)を、2%正常ウマ血清/PBS中に室温で1時間アプライした。切片を、DNA特異的蛍光Hoechst 33342で10分間対比染色し、次いで、PBSですすいだ。免疫染色後、スライドをFluoromount-G封入剤でカバーガラス上に封入した。
ヒドロゲルマイクロカラムを、ニューロン生存および軸索の有向成長を支持するようインビトロで最適化した。マイクロカラムは、5~30mm長であり、軸索伸長が中心細胞外マトリックス(ECM;内径150~400μm)を通るように方向付ける中空アガロース管(外径350~500μm)から構成した。解離ニューロンをマイクロカラムの一端または両端でタンパク質性マトリクスに送達し、軸索伸長の所望の長さに基づいてインビトロで7~42日間(DIV)培養した(図4)。電気刺激およびCa2+感受性色素を二方向マイクロTENNにおいて使用して、一方のニューロン集団を刺激してその結果生じた活動電位が軸索領域を渡って他方の集団に移動できることを実証した。マイクロTENNを、初代大脳皮質ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、および後根神経節ニューロンを含む複数のニューロンサブタイプを使用して作製した(図5)。
マイクロTENNを、定位マイクロインジェクションを介して脳に送達し、別個の解剖領域を再接続する生きた軸索の架橋を提供した。インビボ送達のために、ヒドロゲル外皮は、輸送および移植の間に微小組織を保護する構造支持体を提供した。さらに、小さいサイズは、神経系の繊細な領域への低侵襲性の植え込みを可能にする。所望の長さのマイクロTENNを針に吸引し、皮質にゆっくり挿入し、そして、プランジャーを使用して排出した。皮質のバレル野と視床構造を接続するようマイクロTENNを定位的に挿入して、構築物の生存および統合を評価した。
生きた電極は、脳深部から脳の表面で情報をニューロンへ/ニューロンから伝えるための生物学的導管として使用される。表面では、デバイスのアレイを使用して、マイクロTENNの表層端部を記録または刺激する。これらのアレイは、マイクロTENNの表層端部と正確な時間的および空間的様式で連動することができる特異的で広範なアレイを作製する、電気的、光学的、磁気的、化学的、音響学的、または他のモダリティを含むこともできる。これらのアレイを、脳の表面(硬膜下)、硬膜の上部(硬膜外)、頭蓋骨欠損内部(骨内または骨周囲)、帽状腱膜の下の頭蓋骨外部(帽状腱膜下)、または皮膚外部(頭皮上で非侵襲的)に設置することができる。これらのアレイを、マイクロエレクトロニクスに連結または組み込むことができる。これらは、電力バッテリー、高周波および/もしくは赤外線誘導コイル、光源、マルチプレクス/デマルチプレクス回路、ヒートシンクを利用した脳脊髄液流もしくは血管床、ならびに/または埋込導波路を含むことができる。
図8は、従来の電極およびオプトロードと比べた生きた電極の利点を記載しており、生きた電極のシナプス統合に起因する増強された特異性を強調している。
図12に示す通り、生きた電極を脳に植え込みして連動させ、神経系の特定の機能または機能障害(すなわち、パーキンソン病、肥満、炎症、片頭痛、糖尿病、てんかんなど)の処置のためにまたは診断としてニューロンを記録または刺激することができる。例えば、パーキンソン病患者では、ドーパミン作動性の生きた電極は、脳表面の活性化を制御しながら脳深部構造(例えば、線条体)へのドーパミン入力を回復させる。てんかん患者にとっては、GABA作動性の生きた電極を使用することで、早期てんかん様活動の検出時に活性化して発作焦点を抑制することもできる(例えば、抑制性の生きた電極は、発作前神経活動の最も早い兆候で多量のGABAを直接的に焦点に正確に送達することができる)。
出願人は、初代後根神経節ニューロンをマクロTENN構築物においてインビトロで7日(DIV)かけて成長させた。この期間に続いて、細胞を固定し、細胞核用マーカー(DAPI)およびその軸索用マーカー(ベータ-チューブリン-III/Tuj-1)で免疫標識した。次いで、構築物を共焦点顕微鏡にて撮像した。画像を再構築してつなぎ合わせ、全ての面で構築物の詳細な外観を提供した(図14)。画像が示したものは、図14のパネルDに絵で最も良く表され、それは、構築物のy方向で見た(すなわち、構築物の長さを見下ろした)再構成を表す(図14のパネルEに描写される)。図14のパネルDおよびEは、軸索が、管の内面に沿ってのみ成長し、構築物のコアを満たす細胞外マトリックス内では成長しないことを描写している。より小さい構築物では、軸索は、ここで見られる通り界面だけではなく、構築物の断面全体を通って成長する。構築物を上から見て、図14のパネルA~Cは、一番下(A)から開始して一番上(C)までの共焦点画像の連続スライスを示す。図14のパネルCでは、軸索は側壁に沿ってのみ成長し、一方で、図14のパネルBでは、構築物の底部で、軸索は底部の全面に沿って広がる。
マクロTENNの内面でのみ軸索が再成長することを示す知見に基づいて、出願人は、図15A~15Cに描写する通りの代表的な電極を作製することを提案する。このデバイスの展開は、(シーブ電極とは逆に、)妨げるもののないチャネルを通る軸索の成長を可能にするだろう。チャネルは、神経と同じサイズであっても、特定の神経およびその束のさらなる広がりおよび脱神経束を提供するようより大きくてもよい。電極を末梢に沿ってかつ構築物の長さに沿って設置することもでき、選択的な刺激および記録が可能になる(図15Aおよび15B)。構築物を神経よりも大きなサイズにした場合、構築物は、近位端および遠位端で先細となり、選択した神経の縫合および付着が可能になる(図15C)。より大きな断面積は、有利なことに、軸索/束がさらに広がることを可能にし、それによってより高い選択性を提供する。
本発明のさらなる態様は、純粋な軸索路によってつながった別個のニューロン集団から構成される所望の構成のマイクロTENNをより一貫して作製する、新規の微小組織工学方法論を提供する。特に、本発明の態様は、図16のパネルC~Eに描写する通り、注文製の角錐状マイクロウェル内での「強制細胞凝集」を利用して、1凝集物/球体当たりのニューロンの数(したがって直径)が正確に制御されたニューロンの「凝集物」または「球体」を作製する。これを成し遂げるために、解離ニューロンを、特注設計の3Dプリント製鋳型から鋳造したPDMS(SYLGUARD(登録商標)184, Dow Corning)製の逆角錐状マイクロウェルのアレイを含有するチャンバーに移した。次いで、ウェルを200gで5分間遠心分離した。この遠心分離は、使用されるニューロンの密度および各ウェルに加えられる体積に基づいて1凝集物/球体当たりのニューロンの数が正確に制御されたニューロン(または望むなら任意の他の細胞タイプ)の強制凝集をもたらした。1~200万個の細胞/mLの密度の1ウェル当たり12μLのニューロン懸濁液が、マイクロカラム内に適合する適切な直径の凝集物/球体を作製するのに好適であった。次いで、凝集物/球体をマイクロカラムの一端または両端内に慎重に設置し、37℃、5% CO2で45分間付着させた。次いで、播種されたマイクロカラムを、NEUROBASAL(登録商標)培地、GLUTAMAX(商標)培地、およびB-27(登録商標)培地(ThermoFisher(商標))から構成されるニューロン成長培地中、インビトロで少なくとも数日間かけて成長させ、マイクロTENNを形成した(Laura A. Struzyna et al., “Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks”, 21(21-22): 2744-2756 Tissue Engineering Part A (2015) and J.P. Harris et al., “Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain,” 13(1) J. Neural Eng. 016019 (2016)に記載の通り)。この方法論は、規定のニューロン細胞体領域とインビトロで数日にわたる数ミリメートルの軸索伸長を有する、一方向または二方向マイクロTENNの形成をもたらした(図17)。注目すべきことに、この方法論は、マイクロカラムの一端または両端に凝集物としてのニューロン細胞体を有する定義された区域と軸索投射が長軸方向に伸びてマイクロカラムの中心部をわたる定義された区域とから構成される理想的なマイクロTENN細胞構成を一貫して生産する(図17)。この理想的な分布を免疫細胞化学および共焦点顕微鏡検査によってさらに検証し、これらの凝集物マイクロTENNを全ての軸索を認識する抗体(ベータ-チューブリンIII)および全ての細胞核を認識する抗体(Hoechst)を使用して標識し、そして、マイクロカラムを含むヒドロゲルを非特異的に標識する。また、このマイクロTENNを、マイクロTENNにおける機能的な成熟および電気化学活性を示唆するシナプスマーカー(シナプシン)についても標識した。
本発明の態様を、宿主と様々な電子デバイスとの間のインターフェースとして利用することができる。本発明の態様を、光学センサーまたは磁気センサーという状況下で記載してきたが、本発明の態様は、生きた電極内でニューロンに印可される電気インパルスを介した連動を支持することもできる。
ドーパミン作動性ニューロンを胚性ラットの腹側中脳から単離した。平板培養では、これらのニューロンは、健全なニューロン形態学、ドーパミン作動性ニューロンの存在(TH発現に基づく)、顕著な神経突起伸長(β-チューブリンIII発現に基づく)、およびネットワーク形成を28 DIVまでに示した。ドーパミン作動性マイクロTENNを作製するために、解離ニューロン懸濁液を使用した初期播種マイクロカラムを使用した。これらの解離細胞は、内腔の長さに湿潤したが、概して、内部コアの長さにわたって軸索を投射する別個の細胞本体領域の所望の細胞構成を作らなかった。
先のマイクロTENN製作法は、所望の細胞構成を確実に生成することがなかったので、ニューロンを凝集物へ機械的に集める方法を改作した(Ungrin MD, Joshi C, Nica A, et al. 2008, Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates, PloS one, 3 (2): e1565)。胚組織を単一細胞懸濁液へ解離した後、細胞をウェルの底でペレットにするためにこの溶液を逆角錐状ウェル中にて遠心分離した。ウェルをインキュベーター内で一晩放置し、その間に、ペレットの細胞は、ニューロンの凝集球体になった。形成されたら、凝集物をアガロースマイクロカラムの端部に挿入した。この方法は、別個の細胞本体領域と軸索領域とを有するマイクロTENNを一貫してもたらした。さらに、マイクロカラム内での凝集物の深さおよび配置に基づいて、外在化または内在化した細胞本体領域を示すマイクロTENNを作製可能であったことが見いだされた(図23、パネルB~D)。さらに、この技術は、THおよびβ-チューブリンIII免疫反応性に基づき実証される通り、長投射型一方向軸索路をもたらした(図23、パネルE~F)。実際に、各マイクロTENNにおける最長の神経突起長で判断される通り、凝集物から投射された軸索は、解離ニューロンを播種したマイクロカラム内の類似の軸索伸長より、およそ10倍長く成長したことが確認された(図23、パネルG)。
黒質線条体路はラットでおよそ6mmあり、それ故、少なくとも6mm長のマイクロTENNが望ましい。長さについての成長条件を最適化するために、内腔におけるECM構成要素、成長因子の存在、および伸長に対するマイクロTENNの方向性の効果を試験した。コラーゲンIとコラーゲンIおよびラミニンは、各マイクロTENNにおける最長の神経突起長で判断される通り、最長の軸索伸長をもたらしたことが見いだされた(図24)。コラーゲンIコアとコラーゲンIおよびラミニンコアについての平均軸索伸長は、それぞれ、4892±703μmおよび4686±921μmであった。対照的に、架橋コラーゲンコア(1227±481μm)、ラミニンコートコア(205±615μm)、および空のコア(約0μm)は、大幅に低減された神経突起伸長をもたらしたことが見いだされた。2つの高成長群(コラーゲンまたはコラーゲンおよびラミニンからなる管腔)について、TH+ドーパミン作動性軸索投射は、最大軸索長の少なくとも60%に達したことが確認された(図24、パネルF)。また、マイクロカラム内の軸索伸長に対する培地成長因子濃度の効果も試験した。比較的低い濃度のbFGF(4ng/mL)を含有する培地を、ドーパミン作動性ニューロンの伸長および生存を増加させると以前に示された高濃度の成長因子を含有する培地と比較した。14 DIVに、高い成長因子濃度培地は、低濃度培地と比較して、より密度の高いまたはより長い軸索伸長をもたらさなかったことが見いだされた(n=14 各群のマイクロTENN)。最後に、ドーパミン作動性細胞の標的集団の使用が軸索伸長を増加させるかどうかを調査した。マイクロカラムの両端にドーパミン作動性凝集物を挿入することによって、二方向ドーパミン作動性マイクロTENNにプレーティングした。一方で、集団間の走化性シグナル伝達が伸長を増加させるかを確認するために、2つのドーパミン作動性ニューロン集団を1.2cmで分離した。14 DIVに、二方向マイクロTENNにおける軸索伸長は、一方向マイクロTENNにおける軸索伸長以下であったことが確認された(n=14各群のマイクロTENN)。したがって、操作されたニューロン凝集物の使用および特定のECM構成要素は、軸索伸長における重要な要因であった一方で、高い成長因子培地および標的ニューロン集団の存在は、軸索伸長に影響を及ぼさなかった。注目すべきは、14 DIVの平均ニューロン凝集物長は、1165±212μmであった;それ故、コラーゲン中のドーパミン作動性凝集物を使用して達成された総マイクロTENN長(ニューロン凝集物+軸索長)は、14 DIVに>6mmであり、これはラットの黒質線条体路をつなぐのに適する。最適化研究に続いて、コラーゲンIの内部コアを有するドーパミン作動性マイクロTENNを製作し、28 DIVにわたって成長させて、軸索伸長がマイクロカラム内でさらに進行したかを突き止めた。28 DIVまでの継続した軸索伸長が、ドーパミン作動性軸索について6046±670μm、全ての軸索について7697±1085μm、総凝集物+軸索長について8914±1187μmの長さで見いだされた。いくつかの場合には、この時点での最大の総マイクロTENN長は、ラットの黒質線条体路を網羅するのに必要な長さを十分に超える10mmを上回った(図25)。
黒質線条体路を含むドーパミン作動性軸索が脳において線条体ニューロンとシナプス形成するので、組織工学によって作製された黒質線条体路が線条体ニューロンの集団とインビトロでシナプス形成する能力を探求した。ドーパミン作動性マイクロTENNを作製し、10 DIV後に、胚性ラット線条体の凝集物を、マイクロカラムの空の端部に挿入した。さらに4 DIV以降に、2つの集団間の潜在的なシナプス統合を評価するために免疫細胞化学を実施した。この分析は、2つの凝集物集団、具体的にはTH+ドーパミン作動性ニューロンとDARPP-32+中型有棘線条体ニューロンにおける、適切なニューロンサブタイプの存在を裏付けた(図26)。さらに、共焦点顕微鏡検査は、ドーパミン作動性軸索および線条体ニューロンが関与する広範な軸索樹状統合および推定上のシナプス形成を明らかにした(図26のパネルD、E、G、H)。また、免疫細胞化学は、大部分の線条体(DARPP-32+)神経突起がMAP-2+でもあったことを裏付けし、このことは、これらが樹状突起であったことを示唆している(データ示さず)。線条体集団によって生成された走化性の合図がドーパミン作動性ニューロン凝集物からの軸索伸長に影響を与えたかを判定するために、軸索伸長の長さを線条体末端標的ありとなしで定量した。線条体ニューロンの標的集団を含有するドーパミン作動性マイクロTENNにおける軸索伸長は、一方向ドーパミン作動性マイクロTENNにおける軸索伸長よりも統計的に大きいものではないことが見いだされた(n=9 各群のマイクロTENN;図26、パネルF)。
予め形成されたドーパミン作動性マイクロTENNを脳へ正確に送達する能力、ならびに植え込み後の様々な時点でのそれらの生存および構成を実証するために、コラーゲンIを含有する内腔を有するドーパミン作動性凝集物マイクロTENNを、GFPを発現するように形質導入し、14 DIV間成長させ、その後、これらを特注の針に吸引し、成体雄Sprague-Dawleyラットの黒質線条体路近くに定位的にマクロインジェクションした。1週間および1か月の時点で動物を屠殺したところ(各n=5)、マイクロTENN管腔内の生存GFP+ニューロンおよび軸索が明らかとなり、それは、アガロースマイクロカラムがこれらの時点で部分的にしか分解されなかったので黒質線条体路にわたって容易に同定された(図27)。組織切片を、軸索マーカーβ-チューブリンIIIおよびドーパミン作動性マーカーTHについて共標識したところ、ロバストなニューロン性かつドーパミン作動性の軸索集団の保存が明らかになった。特に、長軸方向に投射されているTH+軸索が存在し、このことは、脳への移植後にマイクロTENNがそれらの細胞構成を維持できたことを裏付けた(図27)。
先の研究では、マイクロTENNに初代皮質ニューロンの単一の細胞懸濁液を播種し、それは、多くの場合にマイクロTENN内部全体にわたりランダムな部位にクラスターを形成した(図29、パネルC~D)。今回の世代のマイクロTENNは、マイクロカラムへのプレーティングの前に予め形成した皮質凝集物で形成され、これにより、別個の細胞体域および軸索域の所望の細胞構成のより優れた制御および再現性が可能になった(図29、パネルF~H)。この再現性はそれ自体で、生きた電極として適用する際に必要な工程であるインビトロでのマイクロTENNのロバスト解析を導く。凝集物マイクロTENNに、1凝集物当たりおよそ8,000~10,000個のニューロンをプレーティングし、マイクロカラム長を2mmおよび5mmとした。一方向(1つの凝集物を)および二方向(2つの凝集物を)の両方の2mm長マイクロTENN(LEUNI,2mmおよびLEBI,2mm)がプレーティングされ、一方で、全ての5mm長LE(LEBI,5mm)は、二方向構築物としてプレーティングされた。2mm長の解離マイクロTENN(LEDISS,2mm)にプレーティングすることによって、先行の解離マイクロTENNの成長特性を現行の凝集物に基づく構築物と比較した(表1、図30)。位相差顕微鏡検査画像の分析を通して、最初の数日内にインビトロで、健全な軸索伸長が全ての凝集物LEにわたりECMコアに沿って見いだされた(図30)。LEBI,5mm群内の凝集物LEニューロンは、1087.7±84.3ミクロン/日をピークとした急速な軸索成長速度を全ての測定DIVにわたり呈した。LEUNI,2mm群内のニューロンは、1日目に358±19.8ミクロン/日の初期ピーク軸索成長速度を示し、これは時間と共に着実に減少した。LEBI,2mm群内で、ニューロン突起は、マイクロカラムの長さを渡り、5 DIVに反対側の集団とシナプス形成し(図30、パネルA)、成長速度が同時に減少した(図30、パネルD)。LEBI,5mm群からのニューロンは、最初の3 DIV間、LEBI,2mmニューロンと類似の速度で成長したが、これらは、5 DIVまで成長速度の大幅な増加を示し、その後、シナプスが凝集物間で形成されるにつれて、軸索成長は減速した(図30、パネルC~D)。全ての凝集物マイクロTENN群における成長速度は、1 DIVに61.7±5ミクロン/日の最大成長速度に達した解離マイクロTENNの成長速度を上回った(表1)。
生/死染色および共焦点顕微鏡検査を介して、短い一方向LEおよび短い二方向LEについて10および28 DIVでの生存を定量した(図32)。作製からの時間が一致する平板培養物を対照とした。全ての染色細胞(すなわち、カルセイン-AM+細胞およびエチジウムホモダイマー+細胞の両方)の積算面積に対するカルセイン-AM陽性細胞の積算面積の比として生存率を定義した。生きた電極におけるニューロン生存が少なくとも28 DIVまで持続することを確認し、40 DIVまで生存の証拠があった(図32)。ANOVAは、DIVが有意な主効果であった(F統計量=32.21、p<0.0001)が、LE/培養群ではそうでなかった(p>0.84)ことを示した。また、相互作用効果も有意であることが見いだされ(p<0.01)、それでボンフェローニ解析を使用して各時点で群を比較した(図32、パネルC)。28 DIVでの平板培養物の生存は、10 DIVでのLEUNI(p<0.05)、LEBI(p<0.001)、および平板培養物(p<0.0001)の生存よりも統計的に低いことが見いだされた。さらに、10 DIVでの平板培養物生存率は、28 DIVでのLEUNIおよびLEBI の両方の生存率を上回った(p<0.01)。
経時的なLE構成を特性評価するために、二方向LEを、4、10、および28 DIVに固定し、免疫標識して、細胞核、軸索、およびシナプスを同定した(図33)。ニューロン細胞体は、Tuj-1で示される通り、長い軸索によってつながった凝集物にほぼ例外なく局在した(図33);軸索および樹状突起もまた、恐らくはプレーティング時かまたは直後に形成された凝集物内接続から、凝集物内に見いだされた。特定の時点間にわたるシナプシン1陽性斑点の合計面積を使用して、シナプスの存在を定性的に評価した。マイクロTENN凝集物内のシナプシンの適度な分布だけでなく、マイクロカラムの管腔内のシナプシン発現の増加も確認され、このことは、二方向マイクロTENN内のニューロンが凝集物間でコミュニケーションをとる能力を有し得ることを示唆している。
予め形成されたマイクロTENN(管状ヒドロゲルマイクロカラムに入れられたニューロン凝集物から投射された整列軸索路から構成されるよう上記の通り製作された)を、ウイスカーバレル皮質をVPMと接続することによって、反復皮質視床経路に植え込みした。齧歯動物脳への注射の1か月後、GFP+マイクロTENNが、生存したこと、および予め形成された細胞体-軸索分布の構成を維持したことが見いだされた(図34)。GFP+細胞本体の大きな高密度のクラスター(凝集物)が、背側および腹側の植え込み領域に、軸索および樹状突起がその2つの場所にまたがる管腔内に見いだされた(図34)。
特定の用語を使用して本発明の好ましい態様を記載してきたが、そのような記載は、単に例証を目的としたものであり、そして、以下の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなしに変更および変形を行ってよいことが理解されるべきである。
本明細書に引用される全ての特許、公開特許出願、および他の参考文献の全内容は、その全体が参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。
Claims (25)
- 実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部においてインビトロで成長し、かつ、該細胞外マトリックスコアに沿って軸索成長を有する複数のニューロン
を含む、植え込み可能な生きた電極であって、
該複数のニューロンが、植え込み可能な生きた電極の第1端の近位にある1つまたは複数の光遺伝学的ニューロンを含む、前記植え込み可能な生きた電極。 - 前記植え込み可能な生きた電極が、二方向刺激および二方向記録が可能である、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記植え込み可能な生きた電極が、一方向刺激および一方向記録が可能である、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記植え込み可能な生きた電極が、一方向刺激および二方向記録が可能である、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記ニューロンが、異なる波長の光を使用して刺激および記録される、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記複数のニューロンが、複数の標的を標的とする複数の異なる表現型、および別個の波長の光に応答するまたはそれを発するための複数の異なる光遺伝学的または磁気遺伝学的表現型を含む、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記複数のニューロンが、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、およびペプチド作動性ニューロンからなる群より選択される1つまたは複数のニューロンを含む、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記複数のニューロンが、初代大脳皮質ニューロンを含み、ここで、該初代大脳皮質ニューロンが、皮質第I層由来のニューロン、皮質第II層由来のニューロン、皮質第III層由来のニューロン、皮質第IV層由来のニューロン、皮質第V層由来のニューロン、皮質第VI層由来のニューロン、視覚皮質由来のニューロン、運動皮質由来のニューロン、感覚皮質由来のニューロン、および嗅内皮質由来のニューロンからなる群より選択される1つまたは複数のニューロンを含む、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 内皮細胞、筋細胞、筋芽細胞、星状膠細胞、嗅神経鞘細胞、乏突起膠細胞、またはシュワン細胞からなる群より選択される1つまたは複数の非ニューロン細胞をさらに含む、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記ニューロンが幹細胞に由来する、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記ニューロンがニューロン前駆細胞に由来する、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部において成長したニューロンの少なくとも一部が、強制的な細胞凝集を経て形成される、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。
- 実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアを同軸状に囲むハイドロゲルの鞘
をさらに含む、請求項1記載の植え込み可能な生きた電極。 - 1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
刺激装置を、該1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つの近位に配置する段階
を含む方法において使用するための、請求項1~13のいずれか一項記載の植え込み可能な生きた電極。 - 前記方法が、前記1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つを、対象の中枢神経系、末梢神経系、大脳皮質、線条体、海馬、脊髄、および/または末梢神経に植え込む段階を含む、請求項14記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記方法が、大脳皮質ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、請求項14記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記方法が、ドーパミン作動性ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、請求項14記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記方法が、後根神経節ニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制する段階をさらに含む、請求項14記載の植え込み可能な生きた電極。
- 1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
センサーを該1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極のうちの少なくとも1つの近位に配置する段階
を含む方法において使用するための、請求項1~13のいずれか一項記載の植え込み可能な生きた電極。 - 前記方法が、興奮性ニューロンの活動を報告する段階をさらに含む、請求項19記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記方法が、抑制性ニューロンの活動を報告する段階をさらに含む、請求項19記載の植え込み可能な生きた電極。
- 前記方法が、興奮性ニューロンおよび抑制性ニューロンの活動を同時に報告する段階をさらに含む、請求項19記載の植え込み可能な生きた電極。
- 1つまたは複数の植え込み可能な生きた電極を対象の脳に植え込む段階;および
グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、およびペプチド作動性ニューロンからなる群より選択される1つまたは複数のニューロンを選択的に興奮させるまたは抑制するために、該植え込み可能な生きた電極に刺激を加える段階
を含む方法において使用するための、請求項1~13のいずれか一項記載の植え込み可能な生きた電極。 - 実質的に柱体状の細胞外マトリックスコア;および
該実質的に柱体状の細胞外マトリックスコアに沿ってまたはその内部に植え込まれた複数の凝集したニューロン
を含む、植え込み可能な生きた電極。 - 細胞外マトリックスコアを提供する段階;および
該細胞外マトリックスコアの少なくとも一端を複数の凝集したニューロンと接触させる段階
を含む、植え込み可能な生きた電極を製造する方法。
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