CN109097277B - 一种细胞毒性实验用芯片的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞毒性实验用芯片的使用方法，其特征在于：第一步，实验准备；第二步，细胞培养；第三步，实验加样；第四步，取样检测；第五步，清洗保存。本发明有益效果是，芯片操作方法简便、实验搭配组合自由；实验方法能够适应多样化的实验要求，使得实验反应与结果检测一体化，方便快捷。

Description

一种细胞毒性实验用芯片的使用方法

技术领域

本发明提供了一种实验用微流控芯片的使用方法，具体讲是为了检测多种重金属离子对细胞的影响，一种利用循环系统与细胞培养相结合的，适用于实验工作、科研工作的微流控芯片的使用方法。

技术背景

重金属对生物的危害不言而喻。但是一些毒害机理、危害浓度的最高阈值等，需要通过一些活细胞实验，检测活细胞处在重金属离子环境下，所受到的影响的量化实验数据来解决。这些实验，有的要求同时完成同种细胞在多种重金属离子环境下的生长状况，有的要求多种细胞在同种重金属离子环境下的生长状况。而活细胞培养的复杂和多样性的情况对实验的同一要求很高，为完成这些实验的技术要求，通过微流控芯片技术，开发设计一款芯片及其使用方法，解决确定活细胞的重金属毒害实验难题，实现检测重金属对活细胞危害的实验目的是很有必要的。

因此本发明希望能够通过微流控芯片技术解决当前技术的难题，开发设计一种细胞毒性实验的微流控芯片的使用方法，以减少实验需求的时间成本和原料成本的消耗。

发明内容

本发明的形状结构，目的在于提供一种细胞毒性实验的微流控芯片的使用方法，以减少实验需求的时间成本和原料成本的消耗，确保多条件下实验的同一性，确保实验结果的可比性。

本发明的技术方案为：一种细胞毒性实验用芯片的使用方法，所使用的芯片分为上层基片和下层基片两部分。所述上层基片呈圆形或矩形，在其中心位置加工有一个圆形凹槽的中心进样口，中心进样口在圆周均匀分布有4个以上的分流通道；每个分流通道的底部高度一致，高于中心进样口的圆形凹槽的底面高度；每个分流通道都连接到一个均匀分布在上层基片上的细胞培养区。细胞培养区数量是4个以上。细胞培养区是由加工成的凹槽和中间留下圆柱体的细胞培养柱组成。细胞培养区凹槽深度接近上层基片的厚度，细胞培养柱的顶面高度与分流通道的底部高度一致。每个细胞培养区凹槽底面均加工有一个排液口。每个细胞培养区内都加工有通过细胞培养区的2条以上的离子溶液通道。每条离子溶液通道在细胞培养区内的长度尺寸一致。每条离子溶液通道的高度是细胞培养柱高度的一半。每条离子溶液通道在细胞培养区的上部加工造成的开口都用用阳离子交换膜封闭，保证离子溶液通道的溶液与细胞培养区的溶液不能够相混合。所述上层基片上加工的2条以上的离子溶液通道，每条都至少穿过上层基片上的4个以上的细胞培养区的其中一个，或依次全部穿过细胞培养区；每条离子溶液通道都加工有独立的进样口和出样口。

所述下层基片是与上层基片的不同规格对应加工的，形状同对应的上层基片呈圆形或矩形，下层基片是与上层基片之间密闭结合。出样口能够在下层基片与上层基片的对应位置处上下贯通芯片。下层基片对应上层基片的排液口位置，加工有贯通下层基片的待检液出口。在待检液出口处加工安装有带有插片开孔的插片。插片能够水平移动，使插片开孔对齐待检液出口或不对齐由插片封堵住待检液出口。在每个待检液出口处下层基片的下底部，加工有卡环凹座，卡环凹座侧壁上加工有比色皿卡槽。比色皿卡槽与比色皿卡环上的卡环凸扣相配合。比色皿卡环能够插入紧固住比色皿。其特征在于，使用方法包含如下步骤。

第一步，实验准备。根据实验要求，选择合适数量的细胞培养区的上层基片规格，以及与离子溶液通道的连接方式；实验前，对选好的芯片进行杀菌消毒处理，保证细胞培养的无菌无毒环境。移开插片的插片开孔与待检液出口对齐的位置，将待检液出口关闭。

第二步，细胞培养。在每个细胞培养区的细胞培养柱上，涂抹一层相同活细胞的或不相同细胞的细胞悬液，待细胞贴壁后，在中心进样口加入细胞培养基液。液体高度不超过细胞培养柱，保证细胞处于溶液环境中，盖上盖子，在37℃环境下培养过夜。

第三步，实验加样。在每个进样口根据实验要求，分别连续不断的通入含有相同重金属离子的或不相同重金属离子的溶液，溶液经离子溶液通道流经细胞培养区的阳离子交换膜后，由于通道内外浓度梯度差使重金属离子经阳离子通道交换膜进入细胞培养区中。根据实验设计，持续保持重金属离子的流动速度和时间长度。

第四步，取样检测。将比色皿插入比色皿卡环固定，将比色皿卡环上的卡环凸扣对齐比色皿卡槽，将比色皿卡环插入卡环凹座，到底后旋转比色皿卡环，卡环凸扣便将比色皿卡环卡住。移动插片到插片开孔与待检液出口对齐位置，将待检液出口打开。细胞培养区内的待检液经排液口和待检液出口流出，流出的待测液流进插入在比色皿卡环的比色皿中，移动插片关闭待检液出口。反方向旋转比色皿卡环，使卡环凸扣对齐比色皿卡槽，拔下比色皿卡环。取下比色皿进行光度法的测定，通过计算得出重金属离子对活细胞的细胞毒性影响。发明的新型微流控芯片能够完成多种重金属离子与细胞溶液高通量混合影响的实验要求。

第五步，清洗保存。实验结束后，取下盖子，按程序清洗微流控芯片，晾干保存。

上述技术方案中，所述每条离子溶液通道在细胞培养区内的长度按能够长度尺寸最长排布。所述比色皿卡环内部是具有弹性的表面，即能够夹持紧比色皿，又能够拔出比色皿，同时不伤害比色皿。

与现有的技术相比，本发明具有下列有益效果，该微流控芯片结构的阳离子通道与阳离子交换膜相结合，连续不断的通入离子溶液，保证在细胞培养区阳离子浓度的不变的同时，阳离子交换膜有效的屏蔽了其他离子的干扰，整个芯片设有溶液回流装置，实现了在实验过程中的严密性。芯片底面配有安装有比色皿卡槽的第二层结构，待测液可以直接流进比色皿用于光度法测定，使得实验反应与结果检测一体化，方便快捷。

附图说明

图1为本发明的一种离子溶液通道依次串联细胞培养区的上层基片的俯视示意图。

图2为本发明图1的从中心A-A 剖视示意图。

图3为本发明的一种一个细胞培养区域俯视放大结构示意图以及局部剖视图。

图4为本发明的一种下层基片与比色皿装配示意图。

图5为本发明的一种下层基片的俯视结构示意图和主视示意图。

图6为本发明的一种比色皿和比色皿卡环结构示意图。

图7为本发明的一种下层基片的主视剖视示意图。

图8为本发明的一种下层基片比色皿的卡环凹座的仰视示意图。

图9为本发明的一种离子溶液通道串联2个细胞培养区的上层基片的俯视示意图。

图10为本发明的一种离子溶液通道单独对应单个细胞培养区的上层基片的俯视示意图。

图中：1.进样口；2.出样口；3.离子溶液通道；4.排液口；5.上层基片；6.分流通道；7.细胞培养柱；8.中心进样口；9.细胞培养区；10.阳离子交换膜；11.下层基片；12.比色皿；13.待检液出口；14.插片开孔；15.插片；16.比色皿卡槽；17.卡环凸扣；18.比色皿卡环；19.卡环凹座。

具体实施例

参照图1至图10中的形状结构，一种细胞毒性实验用芯片的使用方法，使用的芯片分为上层基片5和下层基片11两部分。所述上层基片5呈圆形或矩形，在其中心位置加工有一个圆形凹槽的中心进样口8，中心进样口8在圆周均匀分布有4个以上的分流通道6。每个分流通道6的底部高度一致，高于中心进样口8的圆形凹槽的底面高度。发明的中心进样口8的进样凹槽通道的底面高度，低于分流通道6的底面高度。当滴加样品时，样品先填满进样凹槽，利用液体溢出效果，使得流入到分流通道6中的样品流量保持相同，利用溶液溢出的效果保证了进入每条通道溶液流量的等同。控制了实验时的进样量成为不变量。每个分流通道6都连接到一个均匀分布在上层基片5上的细胞培养区9。细胞培养区9数量是4个以上。细胞培养区9是由加工成的凹槽和中间留下圆柱体的细胞培养柱7组成；细胞培养在圆柱体的细胞培养柱7四周，圆柱体结构的设计有利于溶液的流动，保证了重金属阳离子充分与细胞接触。细胞培养区9凹槽深度接近上层基片5的厚度，细胞培养柱7的顶面高度与分流通道6的底部高度一致。细胞培养区9的深度低于溶液分流通道6，可防止溶液的回流。每个细胞培养区9凹槽底面均加工有一个排液口4。每个细胞培养区9内都加工有通过细胞培养区9的2条以上的离子溶液通道3；每条离子溶液通道3在细胞培养区9内的长度尺寸一致；每条离子溶液通道3的高度是细胞培养柱7高度的一半。每条离子溶液通道3在细胞培养区9的上部加工造成的开口都用用阳离子交换膜封闭10，保证离子溶液通道3的溶液与细胞培养区9的溶液不能够相混合。发明通过离子溶液通道3的通道壁与阳离子交换膜相结合，控制重金属阳离子进入细胞培养区9。使用时，进样口1连续不断的通入重金属阳离子溶液，与出样口2的排出相结合，使得重金属阳离子在细胞培养区9的浓度基本保持不变，保证了进入细胞培养区9的重金属阳离子浓度的恒定，提高实验的准确度。

所述上层基片5上加工的2条以上的离子溶液通道3，每条都至少穿过上层基片5上的4个以上的细胞培养区9的其中一个，或依次全部穿过。发明对于进样口1的加样，能够根据不同的实验情况选择不同的重金属阳离子溶液，以及培养不同种类的细胞，发明的芯片是科学研究的首选。每条离子溶液通道3都加工有独立的进样口1和出样口2。本发明细胞培养区里有细胞培养柱7、待测液出样口13、离子溶液通道3和阳离子交换膜10。使用时，将待测的细胞配成细胞悬液涂于细胞培养柱7上，使细胞正常生长。利用阳离子交换膜10，结合细胞培养的多通道的形状结构，阳离子交换膜10能够提供细胞培养区相同浓度的阳离子，实现了实验中的重金属离子浓度保持不变，有效的提高了细胞实验的准确性。

所述下层基片11是与上层基片5的不同规格对应加工的，形状同对应的上层基片5呈圆形或矩形，下层基片11是与上层基片5之间密闭结合。芯片制作时，上层基片5与下层基片11分别进行加工，加工好后，将待检液出口13与排液口4位置对齐，然后进行粘连固定。出样口2能够在下层基片11与上层基片5的对应位置处上下贯通芯片。下层基片11对应上层基片5的排液口4位置，加工有贯通下层基片11的待检液出口13。在待检液出口13处加工安装有带有插片开孔14的插片15。插片15能够水平移动，使插片开孔14对齐待检液出口13或不对齐由插片15封堵住待检液出口13。在每个待检液出口13处下层基片11的下底部，加工有卡环凹座19，卡环凹座19侧壁上加工有比色皿卡槽16。比色皿卡槽16与比色皿卡环18上的卡环凸扣17相配合。其特征在于，使用方法包含如下步骤。

第一步，实验准备。根据实验要求，选择合适数量的细胞培养区9的上层基片5规格，以及与离子溶液通道3的连接方式。实验前，对选好的芯片进行杀菌消毒处理，保证细胞培养的无菌无毒环境。移开插片15的插片开孔14与待检液出口13对齐的位置，将待检液出口13关闭。

第二步，细胞培养。在每个细胞培养区9的细胞培养柱7上，涂抹一层相同活细胞的或不相同细胞的细胞悬液，待细胞贴壁后，在中心进样口8加入细胞培养基液。液体高度不超过细胞培养柱7，保证细胞处于溶液环境中，盖上盖子，在37℃环境下培养过夜。

第三步，实验加样。在每个进样口1根据实验要求，分别连续不断的通入含有相同重金属离子的或不相同重金属离子的溶液，溶液经离子溶液通道3流经细胞培养区9的阳离子交换膜后，由于通道内外浓度梯度差使重金属离子经阳离子通道交换膜进入细胞培养区中。根据实验设计，持续保持重金属离子的流动速度和时间长度。

第四步，取样检测。将比色皿12插入比色皿卡环18固定，将比色皿卡环18上的卡环凸扣17对齐比色皿卡槽16，将比色皿卡环18插入卡环凹座19，到底后旋转比色皿卡环18，卡环凸扣17便将比色皿卡环18卡住。移动插片15到插片开孔14与待检液出口13对齐位置，将待检液出口13打开。细胞培养区9内的待检液经排液口4和待检液出口13流出，流出的待测液流进插入在比色皿卡环18的比色皿12中，移动插片15关闭待检液出口13。反方向旋转比色皿卡环18，使卡环凸扣17对齐比色皿卡槽16，拔下比色皿卡环18。取下比色皿12进行光度法的测定，通过计算得出重金属离子对活细胞的细胞毒性影响。发明的新型微流控芯片能够完成多种重金属离子与细胞溶液高通量混合影响的实验要求。

第五步，清洗保存。实验结束后，取下盖子，按程序清洗微流控芯片，晾干保存。

上述技术方案中，所述每条离子溶液通道3在细胞培养区9内的长度按能够长度尺寸最长排布。所述离子溶液通道3在芯片上是全程密闭的通道，光刻后加工的通道上部加工口是用贴片贴合密闭的，或是用成型毛细管加工安装的。发明保证离子溶液通道3内的溶液能够不停的连续流动，或加压流动。所述上层基片5的上表面是敞开光刻加工的形状，对应有相同形状的一个盖子，能够盖住整个芯片，以便于细胞培养。所述比色皿卡环18内部是具有弹性的表面，即能够夹持紧比色皿12，又能够拔出比色皿12，同时不伤害比色皿12。

实施例一

实验前，选取图1规格的2个芯片，一个做对照组，一个做实验组。先对整个微流控芯片进行杀菌消毒处理，保证细胞培养的无菌无毒环境。

参照图1与图8中的形状结构，先在细胞培养柱7上涂抹一层成骨细胞细胞悬液，此时插片15未取出，保证溶液不会流出。在中心进样口8加入细胞培养基液保证细胞处于溶液环境中，盖上盖子，在37℃环境下培养过夜。在实验组的芯片的进样口1分别连续不断的通入含重金属离子的Mn²⁺和Pb²⁺溶液，溶液流经阳离子交换膜后，由于通道内外浓度梯度差使Mn²⁺和Pb²⁺经阳离子通道交换膜进入细胞培养区中。成骨细胞膜在重金属离子的影响下，会发生破裂，胞内流出碱性磷酸酶。在通入重金属离子溶液24小时、48小时、72小时的时间段，拔出插片17，使得含有碱性磷酸酶的待测液流入事先插好的比色皿12中，比色皿12采用凹槽固定，使用时直接向上插入到比色皿卡环18连接处凹槽位置，避免比色皿12发生移动、旋转或者脱落。取下比色皿12，利用分光光度计在450nm处测得混合溶液吸光值，通过计算得出重金属离子Mn²⁺和Pb²⁺对成骨细胞的细胞毒性影响。实验结束后，取下盖子，清洗微流控和芯片，晾干保存。

实施例二

实验前，选取图1规格的2个芯片，一个做对照组，一个做实验组。先对整个微流控芯片进行杀菌消毒处理，保证细胞培养的无菌无毒环境。

参照图1与图8中的形状结构，先分别不同细胞培养区9的在细胞培养柱7上涂抹一层成骨细胞、上皮细胞，骨髓间充质干细胞、平滑肌细胞的细胞悬液。此时插片15未取出，保证溶液不会流出。在中心进样口8加入细胞培养基液保证细胞处于溶液环境中，盖上盖子，在37℃环境下培养过夜。在实验组的芯片的进样口1分别连续不断的通入含重金属离子的Cd²⁺和Pb²⁺溶液，溶液流经阳离子交换膜后，由于通道内外浓度梯度差使Cd²⁺和Pb²⁺经阳离子通道交换膜进入细胞培养区中。其余操作参照实施例一，用光度法的不同波长测得混合溶液吸光值，通过计算得出重金属离子Cd²⁺和Pb²⁺对成骨细胞的细胞毒性影响。实验结束后，取下盖子，清洗微流控和芯片，晾干保存。

此实验，还能够选取数量为4个的、图9规格的芯片，在每个芯片上做一种细胞的对照组和实验组的实验。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种细胞毒性实验用芯片的使用方法，使用的芯片分为上层基片和下层基片两部分；所述上层基片呈圆形或矩形，在其中心位置加工有一个圆形凹槽的中心进样口，中心进样口在圆周均匀分布有4个以上的分流通道；每个分流通道的底部高度一致，高于中心进样口的圆形凹槽的底面高度；每个分流通道都连接到一个均匀分布在上层基片上的细胞培养区；细胞培养区数量是4个以上；细胞培养区是由加工成的凹槽和中间留下圆柱体的细胞培养柱组成；细胞培养区凹槽深度接近上层基片的厚度，细胞培养柱的顶面高度与分流通道的底部高度一致；每个细胞培养区凹槽底面均加工有一个排液口；每个细胞培养区内都加工有通过细胞培养区的2条以上的离子溶液通道；每条离子溶液通道在细胞培养区内的长度尺寸一致；每条离子溶液通道的高度是细胞培养柱高度的一半；每条离子溶液通道在细胞培养区的上部加工造成的开口都用用阳离子交换膜封闭，保证离子溶液通道的溶液与细胞培养区的溶液不能够相混合；所述上层基片上加工的2条以上的离子溶液通道，每条都至少穿过上层基片上的4个以上的细胞培养区的其中一个，或依次全部穿过细胞培养区；每条离子溶液通道都加工有独立的进样口和出样口；

所述下层基片是与不同规格的上层基片配套对应加工的，形状同配套的上层基片一样呈圆形或矩形，下层基片是与上层基片之间密闭粘贴结合；出样口能够在下层基片与上层基片的对应位置处上下贯通芯片；下层基片对应上层基片的排液口位置，加工有贯通下层基片的待检液出口；在待检液出口处加工安装有带有插片开孔的插片；插片能够水平移动，使插片开孔对齐待检液出口或不对齐由插片封堵住待检液出口；在每个待检液出口处下层基片的下底部，加工有卡环凹座，卡环凹座侧壁上加工有比色皿卡槽；比色皿卡槽与比色皿卡环上的卡环凸扣相配合；比色皿卡环能够插入紧固住比色皿；其特征在于，使用方法包含如下步骤：

第一步，实验准备；根据实验要求，选择合适数量的细胞培养区的上层基片规格，以及与离子溶液通道的连接方式；实验前，对选好的芯片进行杀菌消毒处理，保证细胞培养的无菌无毒环境；移开插片的插片开孔与待检液出口13对齐的位置，将待检液出口关闭；

第二步，细胞培养；在每个细胞培养区的细胞培养柱上，涂抹一层相同活细胞的或不相同细胞的细胞悬液，待细胞贴壁后，在中心进样口加入细胞培养基液；液体高度不超过细胞培养柱，保证细胞处于溶液环境中，盖上盖子，在37℃环境下培养过夜；

第三步，实验加样；在每个进样口根据实验要求，分别连续不断的通入含有相同重金属离子的或不相同重金属离子的溶液，根据实验设计，持续保持重金属离子的流动速度和时间长度；

第四步，取样检测；将比色皿插入比色皿卡环固定，将比色皿卡环上的卡环凸扣对齐比色皿卡槽，将比色皿卡环插入卡环凹座，到底后旋转比色皿卡环，将比色皿卡环卡住；移动插片到插片开孔与待检液出口对齐位置，将待检液出口打开；细胞培养区内的待检液经排液口和待检液出口流出，流出的待测液流进插入在比色皿卡环的比色皿中，移动插片关闭待检液出口；反方向旋转比色皿卡环，使卡环凸扣对齐比色皿卡槽，拔下比色皿卡环；取下比色皿进行光度法的测定，通过计算得出重金属离子对活细胞的细胞毒性影响；

第五步，清洗保存；实验结束后，取下盖子，按程序清洗微流控芯片，晾干保存。

2.根据权利要求1所述的一种细胞毒性实验用芯片的使用方法，其特征在于：所述每条离子溶液通道在细胞培养区内的长度按能够长度尺寸最长排布；所述离子溶液通道在芯片上是全程密闭的通道；所述上层基片对应有相同形状的一个盖子，能够盖住整个芯片；所述比色皿卡环内部是具有弹性的表面，即能够夹持紧比色皿，又能够拔出比色皿，同时不伤害比色皿。

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