CN104388310A - 一种细胞联合培养芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞联合培养芯片，包括壳体、载体、微结构和灌流系统；所述壳体与载体封接而成，所述微结构位于壳体内表面，所述微结构包括营养液灌流单元、多个细胞培养单元、生物胶灌注单元，所述灌流系统包括进液柱、营养液灌流单元和负压吸引装置依次连接；本发明的微流控芯片，可把多种细胞成份集中在一个微缩芯片上进行联合培养，多种细胞产生的生物因子可弥散至整个微缩平台，同时保证了异种细胞间相互不接触，最大限度的模拟了离体细胞在体内的生长微环境。

Description

一种细胞联合培养芯片
技术领域
本发明涉及一种适于多种细胞联合培养的芯片，属生物医学研究领域。
背景技术
细胞生物学研究正从对单种细胞的观察和研究，发展到对两种甚至多种细胞相互作用的观察和研究。对于复杂的生物学体系，多种细胞同时存在的体系才能更好的模拟真实存在的细胞微环境，从而更全面深入的探索细胞之间的复杂网络以及介导它们之间相互作用的信号通路等。细胞联合培养是目前研究细胞与细胞之间相互作用比较常用的方法。
目前，常规的细胞混合培养，虽可解决离体状态下多细胞间相互作用问题，同时起到了一定的模拟体内环境的作用，但当前，基于细胞培养的微流控芯片多限于两种细胞联合培养，或一种目标细胞与其他多种细胞混合培养，此状态下，离体细胞表型与离体前差异大，限制了对微环境中各细胞组分进行观察，针对此状态下的细胞进行化疗药物的敏感性检测，也限制了对结果判定的准确性。另外，当前用于药筛的微流控芯片的培养室灌流通道多为两条相对独立平行的通道，限制了通道与细胞培养室的接触面积；细胞营养液灌流中多采用微量泵来维持，限制了在临床上的大规模应用。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提出了一种多种细胞联合培养，且异种细胞不接触联合培养芯片，使得细胞的生长环境更接近于体内的生长环境，且操作方便，便于临床应用。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种细胞联合培养芯片，包括壳体、载体、微结构和灌流系统；所述壳体与载体封接而成，所述微结构位于壳体内表面，所述微结构包括营养液灌流单元、多个细胞培养单元、生物胶灌注单元，所述灌流系统包括进液柱、营养液灌流单元和负压吸引装置依次连接；所述生物胶灌注单元包括多个外部U型生物胶灌注单元和多个内部直线形生物胶灌注单元；所述相邻的细胞培养单元结构位于直线形生物胶灌注单元的两侧；所述营养液灌流单元位于微结构外圈，所述U型生物胶灌注单元位于营养液灌流单元与细胞培养单元之间；所述生物胶灌注单元包括胶体流道，所述多个直线形生物胶灌注单元的交接部位设有中心池，所述胶体流道两侧及中心池周边上分别设有微桥，所述营养液灌流单元与细胞培养单元之间、以及细胞培养单元之间通过微桥连通；所述细胞培养单元包括细胞培养池，所述细胞培养池内设有6-8个支撑柱，呈两排弧形分布。
进一步的，所述壳体的材料为聚二甲基硅氧烷，所述载体的材料为玻璃，所述壳体的厚度为3-5mm。
进一步的，所述细胞培养单元、U型生物胶灌注单元、直线形生物胶灌注单元的数量相同，为3-5个。
进一步的，所述微桥长为80-120μm、宽为30-60μm、间距为150-250μm。
进一步的，所述中心池为圆形，直径为1-1.5mm。
进一步的，所述中心池的中心部位设有通孔，所述通孔的直径为0.5-0.9mm。
进一步的，所述进液柱为上口宽下口窄的瓶体，容量为200-300ul，所述瓶体的下口直径为0.8-1mm，上口直径为4-6mm，瓶体高度为40-45mm，灌液时进液柱的液面高度为25-35mm。
进一步的，所述负压吸引装置为负压吸引微量注射器。
进一步的，所述生物胶灌注单元内灌注基质胶；所述基质胶为温度敏感型生物胶。
进一步的，所述细胞培养单元内灌注稀释胶和细胞的混合物，所述稀释胶是使用完全培养液将基质胶稀释4-8倍后得到的。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
本发明的细胞联合培养芯片，可把离体组织中的多种细胞成份集中在一个微缩芯片上进行联合培养，多种细胞产生的生物因子可弥散至整个微缩平台，同时利用生物胶灌注单元内基质胶的选择透过性，保证了异种细胞间相互不接触，最大限度的模拟了离体细胞在体内的生长微环境；应用此芯片可以对各种细胞的表型进行实时观测，免去了应用大型设备进行异种细胞分离，节省人力物力。
本发明所述的微流控芯片，采用异种细胞不接触联合培养，替代细胞混合培养中多种细胞分离鉴定步骤。灌流系统简单，采用半圆形及U型设计，增加了灌流通道与细胞培养室的接触面积，灌流不需要微量泵，操作简单；内部直线形生物胶灌注单元采用中央池加通孔设计，生物胶灌注过程稳定、易行，益于大规模临床应用。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1本发明芯片的微结构示意图；
图2本发明芯片的营养液灌流单元示意图；
图3本发明芯片的生物胶灌注单元和细胞培养单元示意图；
图4本发明芯片的整体结构图；
图5本发明芯片的中心池的示意图；
图中标注：1.营养液灌流单元，11.进液口，12.液体流道，13.缓冲流道，14.出液口，2.U型生物胶灌注单元，21.进胶口，22.胶体流道，23.出胶口，3.十字形生物胶灌注单元，31.进胶口，32.胶体流道，34.中心池，35.通孔，4.进液柱，5.负压吸引装置，6.细胞培养单元，61.进细胞口，62.细胞流道，63.细胞培养池，64.出细胞口，65.支撑柱，7.微桥，8.壳体，9.载体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合附图和实施例，对本发明作进一步详细说明。
一种细胞联合培养芯片，包括壳体8、载体9、微结构和灌流系统；所述壳体8与载体9封接而成，所述微结构位于壳体内表面，所述微结构为腔道，所述腔道的高度为50-100μm，所述微结构包括营养液灌流单元1、多个细胞培养单元6、生物胶灌注单元，运用微尺度加工技术制作而成。所述壳体材料为聚二甲基硅氧烷，载体材料为玻璃，所述壳体的厚度为3-5mm。所述聚二甲基硅氧烷PDMS具有可塑性好、理化性质稳定、无毒、无味、透明、透气性良好的优良性能，适宜作为本发明的壳体材料。
所述灌流系统包括进液柱4、营养液灌流单元1和负压吸引装置5依次连接；所述营养液灌流单元1位于芯片微结构的外圈，包括进液口11、液体流道12、缓冲流道13和出液口14；为了方便进液和出液，所述进液口和出液口均穿过壳体将腔道与外界连通，即进液口和出液口的高度与壳体的厚度相同；所述液体流道与缓冲流道位于壳体和载体之间；所述液体流道的形状是围绕其内部的细胞培养单元和生物胶灌注单元所形成的形状而定，本发明采用半圆形及U型交替的形状，增加了灌流通道与细胞培养室的接触面积。
为了配合芯片的微结构，最好采用负压灌流装置向营养液灌流单元中灌注营养液，所述负压灌流装置包括进液柱8和负压吸引装置9，将进液柱8与进液口11连接，将负压吸引装置9与出液口14连接。开始灌液时所述负压吸引装置9提供负压，使得进液柱8内的液体开始流动，当液体从进液口经液体流道进入出液口时，取下负压吸引装置9，此时进液柱内的液体会由自身液面高度差的重力作用持续流动，达到持续灌流的目的。所述负压吸引装置可以是负压吸引微量注射器。所述缓冲通道13为多个S型弯道，可以起到缓冲负压压力的作用，防止营养液流动过快，保证营养物质充分弥散至细胞培养单元6。
本发明的进液柱8、营养液灌流单元1和负压吸引装置9依次连接共同构成灌流系统，所述灌流系统具有高通量，最大限度贴近细胞的正常生长状态，操作简便易行，仅采用进液柱便可维持灌流液在该系统持续稳定灌流，不需微量泵维持，减少了细胞培养过程中污染的几率，适合临床上细胞联合培养的大规模应用。
所述进液柱8为上口宽下口窄的瓶体，容量为200-300ul，所述瓶体的下口直径为0.8-1mm，上口直径为4-6mm，瓶体高度为40-45mm，灌液时进液柱的液面高度为25-35mm。
所述生物胶灌注单元包括多个外部U型生物胶灌注单元2和多个内部直线形生物胶灌注单元3，包括进胶口21和31、胶体流道22和32、出胶口23；所述多个直线形生物胶灌注单元的交接部位设有中心池34，所述中心池为圆形，直径为1-1.5mm，优选为1.2mm；所述中心池可以在灌胶过程起缓冲作用。进一步的，为了维持灌胶过程中的压强平衡，在所述中心池34的中心部位设有通孔35，与外界连通，通孔的直径为0.5-0.9mm，优选为0.5mm。
所述多个细胞培养单元6结构相同，相邻两个细胞培养单元位于直线形生物胶灌注单元3的两侧；所述细胞培养单元包括进细胞口61、细胞流道62、细胞培养池63和出细胞口64；所述进胶口、出胶口、进细胞口、出细胞口、通孔的结构与进液口相同，同样的，胶体流道、中心池、细胞流道与细胞培养池位于壳体和载体之间。
为了支撑细胞培养池63，防止其塌陷，可以在细胞培养池内设置6-8个支撑柱65，直径为0.05-0.1mm，为了确保支撑柱的支撑强度，支撑柱的直径优选为0.1mm，高度和腔道的高度相同。所述支撑柱的另一重要作用是在细胞接种过程中起到疏导细胞培养液流向的作用，使细胞培养液充满整个细胞培养池，因此支撑柱在细胞培养池中呈两排弧形分布，靠近中心孔的一排，即内侧设有2-3个，靠近U型生物胶灌注单元的一排，即外侧设有4-5个，间距为0.8-1.2mm。
所述U型生物胶灌注单元2位于营养液灌流单元1与细胞培养单元6之间；在U型生物胶灌注单元的胶体流道22上，且与液体流道12和细胞培养池63相邻的地方，分布有6-10对微桥7，附图中为7对，使得营养液灌流单元1与细胞培养单元6连通，使得营养液灌流单元中持续流动的营养液及药物能够弥散至细胞培养池中。同样的，在直线型生物胶灌注单元的胶体流道32上，且与两侧细胞培养池63相邻的地方，分布有6-10对微桥，使得相邻两个细胞培养单元6连通，使得相邻细胞培养池进行细胞间的相互作用。同样的，所述中心池34与每个细胞培养室63之间分别通过2-3对微桥连通，可以增加细胞培养室之间的弥散作用。
在生物胶灌注单元中灌注基质胶，所述基质胶为温度敏感型生物胶，在0-4℃时为液体状态，此时灌注于生物胶灌注单元中，使其充满胶体流道、中心池及各个微桥，在37℃维持8-12h，开始呈凝胶状，具有一定的强度。所述基质胶的浓度以及微桥的长度、宽度以及胶体流道的长度、宽度设计，均为了保证基质胶可以刚好充满微桥，由于表面张力的作用，基质胶不会溢出微桥。因此，设置微桥长为90-110μm、宽为40-60μm，两个微桥的间距为150-250μm，胶体流道的宽度为150-250μm，能够满足要求，优选的，微桥长为100μm、宽为50μm、间距为200μm，胶体流道的宽度为200μm。凝胶状的基质胶可以允许营养液灌流通道中的小分子营养物质及化疗药物通过，而不允许细胞通过，从而可以充分保障营养物质和化疗药物弥散至细胞培养池中；也可以允许细胞因子通过，如细胞代谢产生的生物蛋白、小分子有机物及无机物，使得不同细胞培养池内的不同细胞相互影响。
在所述细胞培养池63内灌注稀释胶和细胞的混合物，所述稀释胶是使用完全培养液将基质胶稀释4-8倍后得到的，所述稀释胶使得细胞处于三维培养状态，细胞在稀释胶内的浓度为106-107/ml。所述多个细胞培养池中可以培养多种细胞，实现细胞的联合培养，使得在芯片上培养细胞更接近于体内环境。
所述细胞培养单元、U型生物胶灌注单元、直线形生物胶灌注单元的数量相同，为3-5个，附图为4个，因此可以实现3-5种细胞的联合培养。将几种细胞同时接种在所述芯片上，不同类型细胞彼此间不接触，但其产生的细胞因子可以通过微桥中的基质胶，弥散到整个体系中，实现更接近实体状态下的微环境模拟，在所述营养液灌流单元不同时段内灌注营养液，并通过U型生物胶灌注单元上的微桥弥散至细胞培养池内。本芯片可以对培养过程中细胞变化进行实时观测，连续观察细胞间的相互作用，可以根据不同功能需求进行相应操作。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种细胞联合培养芯片，其特征在于：包括壳体、载体、微结构和灌流系统；所述壳体与载体封接而成，所述微结构位于壳体内表面，所述微结构包括营养液灌流单元、多个细胞培养单元、生物胶灌注单元，所述灌流系统包括进液柱、营养液灌流单元和负压吸引装置依次连接；所述生物胶灌注单元包括多个外部U型生物胶灌注单元和多个内部直线形生物胶灌注单元；所述相邻的细胞培养单元结构位于直线形生物胶灌注单元的两侧；所述营养液灌流单元位于微结构外圈，所述U型生物胶灌注单元位于营养液灌流单元与细胞培养单元之间；所述生物胶灌注单元包括胶体流道，所述多个直线形生物胶灌注单元的交接部位设有中心池，所述胶体流道两侧及中心池周边上分别设有微桥，所述营养液灌流单元与细胞培养单元之间、以及细胞培养单元之间通过微桥连通；所述细胞培养单元包括细胞培养池，所述细胞培养池内设有6-8个支撑柱，呈两排弧形分布。
2.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述壳体的材料为聚二甲基硅氧烷，所述载体的材料为玻璃，所述壳体的厚度为3-5mm。
3.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述细胞培养单元、U型生物胶灌注单元、直线形生物胶灌注单元的数量相同，为3-5个。
4.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述微桥长为80-120μm、宽为30-60μm、间距为150-250μm。
5.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述中心池为圆形，直径为1-1.5mm。
6.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述中心池的中心部位设有通孔，所述通孔的直径为0.5-0.9mm。
7.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述进液柱为上口宽下口窄的瓶体，容量为200-300ul，所述瓶体的下口直径为0.8-1mm，上口直径为4-6mm，瓶体高度为40-45mm，灌液时进液柱的液面高度为25-35mm。
8.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述负压吸引装置为负压吸引微量注射器。
9.根据权利要求1所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述生物胶灌注单元内灌注基质胶；所述基质胶为温度敏感型生物胶。
10.根据权利要求9所述的一种细胞联合培养芯片，其特征在于：所述细胞培养单元内灌注稀释胶和细胞的混合物，所述稀释胶是使用完全培养液将基质胶稀释4-8倍后得到的。
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