CN113484274A - 一种红外微流控芯片液体池以及制备方法以及一种活细胞的ftir分析方法 - Google Patents

一种红外微流控芯片液体池以及制备方法以及一种活细胞的ftir分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种红外微流控芯片液体池及其制备方法以及一种活细胞的FTIR分析方法，包括：S1：提供一种既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料，超声清洗，氮气吹干，作为基片和盖片；S2：使用光刻胶在基片上进行均匀旋转涂覆，配合光刻掩膜版，在一定温度下曝光一段时间，使用显影液进行显影形成光刻微图形；S3：采用热压键合或可逆键合，将盖片与基片在光刻微图形处进行封接，该红外微流控芯片液体池可为活细胞提供长时间稳定、且精确可控的生存环境，用于活细胞的傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。本发明克服了红外材料微加工困难，紫外光刻工艺难度大，键合难度高的问题，实现了活细胞的FTIR分析。

Description

一种红外微流控芯片液体池以及制备方法以及一种活细胞的 FTIR分析方法
技术领域
本发明涉及微流控领域和傅里叶变换红外光谱分析领域，更具体地涉及一种红外微流控芯片液体池及其制备方法以及一种活细胞的FTIR分析方法。
背景技术
傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术可用于细胞和组织等生物样品的分析。而且，红外光的光子能量低，不会损伤生物样品。所以FTIR技术是一种无损无需标记的表征方法。由于单个细胞的尺寸大多在几微米到几十微米之间，结合FTIR技术、同步辐射(SR)红外光源和红外显微镜，可以进行单细胞级别的红外显微研究。细胞中生物大分子在中红外区域均有典型的红外吸收峰，其中最重要的区域在600～1700cm-1范围内，包含典型的蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带(1500～1700cm-1)和指纹区(600～1450cm-1)。高波数区域的红外峰(2550～3500cm-1)主要包含脂类等物质中C-H，S-H，N-H和O-H等的伸缩振动。
但是，目前大多数FTIR方法针对细胞的研究是对化学固定或者风干的细胞进行的测试。这种情况下，细胞被固定在死亡时的状态。固定或风干会对红外光谱引入人为干扰，比如细胞脱水后，酰胺带、磷酸、核酸等的红外特征峰位置、强度等可能发生变化。所以针对活细胞在正常生理状态下的FTIR研究具有重要意义。FTIR技术难以实现活细胞的测试，主要是由于活细胞生存条件要求水溶液的营养基质。然而，水在中红外区域有严重的吸收，水在红外光路中如果达到一定厚度，它的特征红外吸收峰会将细胞的特征红外吸收峰覆盖。
微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。微流控芯片已经和多种检测技术结合在一起，如激光诱导荧光检测、紫外吸收光度检测等等，并广泛应用于细胞学研究中。微流控芯片加工方法主要有光刻法，模塑法，热压法，激光烧蚀等方法；常用的微流控芯片材料有硅材料，玻璃石英，有机聚合物等。
因此，如果能将微流控芯片技术和FTIR技术结合起来，制作红外微流控芯片液体池将有望精确控制水的厚度，为活细胞提供稳定和精确可控的生存环境，并实现活细胞的FTIR研究。但是，常用的微流控芯片材料有各种问题，无法用于红外微流控芯片液体池的加工，用于红外显微与成像研究的红外微流控芯片材料必须同时能够透过可见光和红外光。传统微流控芯片材料，比如硅材料可见光透过率低，无法实现红外显微观测，且厚度较高的硅片，红外透过率低；玻璃石英在红外区域透光范围窄，不能用于细胞的红外光谱测量；有机聚合物在中红外区域有强吸收，不透红外光。用于这些材料的微加工工艺不适用红外材料的微加工。另外，常见的红外材料存在着易碎，易溶解于水，与光刻胶结合力较弱等各种问题，所以紫外光刻和键合难度很大，目前没有针对红外材料成熟的微加工工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种红外微流控芯片液体池及其制备方法以及一种活细胞的FTIR分析方法，从而解决现有技术中红外材料微加工困难、无法实现活细胞的傅里叶变换红外光谱分析的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种红外微流控芯片液体池的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1：提供一种既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料，超声清洗，氮气吹干，所得材料作为基片和盖片；S2：采用紫外光刻工艺在基片上形成光刻微图形，包括：使用光刻胶在基片上进行均匀旋转涂覆，配合光刻掩膜版，在一定温度下曝光一段时间，然后使用显影液进行显影，从而在基片上形成光刻微图形，其中，光刻掩膜版根据所设计的微流控芯片图形制作；S3：采用热压键合或可逆键合，将盖片与基片在光刻微图形处进行封接，形成具有至少一个样品室的红外微流控芯片液体池，该红外微流控芯片液体池可为活细胞提供长时间稳定、且精确可控的生存环境，用于活细胞的傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。
优选地，基片所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石、Low-E玻璃或者金镜中的一种，盖片所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石中的一种。
当基片材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠时，适用于中红外区域，透射模式下的傅里叶变换红外光谱分析。当基片材料为金刚石时，适用于中红外和远红外区域，透射模式下的傅里叶变换红外光谱分析。当基片材料为Low-E玻璃或者金镜时，适用于中红外区域，反射模式下的傅里叶变换红外光谱分析。
根据本发明的一个优选方案，当使用的光刻胶为负胶时，紫外光刻工艺包括：在115～125℃条件下，烘烤基片4～6分钟，优选5分钟，然后，取在常温下放置0.8～1.2小时，优选1小时的光刻胶负胶，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：500rpm，5s；5000rpm，30s(即，在500rpm的转速下进行动态滴胶5秒，然后在5000rpm的高转速下匀胶30秒)；前烘95℃下3-8分钟；硬接触hard模式曝光2～7秒；后烘95℃下3～8分钟；使用显影液进行显影1分钟。
根据本发明的一个优选方案，当使用的光刻胶为负胶时，热压键合的工艺包括：0-10分钟，温度从25℃线性升温至65℃；从10分钟开始，在65℃下维持20分钟；30-45分钟，线性降温至25℃，45-55分钟维持温度在25℃；0-7分钟，压力从0bar线性升至15bar；7-20分钟，维持在15bar压力下；21-50分钟，压力维持在50bar下；50-55分钟，压力线性降低至0bar。
优选地，光刻胶为负胶SU-8，显影液为TOK(SU-8)显影液，基片和盖片所使用的红外材料为抛光的氟化钙晶片。
可选地，所述使用负胶SU-8的紫外光刻工艺中，前烘95℃下时间为4分钟，硬接触hard模式曝光3s；后烘95℃下4分钟。
可选地，所述使用负胶SU-8的紫外光刻工艺中，前烘95℃下时间为4分钟，硬接触hard模式曝光4s；后烘95℃下4分钟。在该参数下，能够实现光刻胶与氟化钙的粘附力良好。
使用以上工艺条件可实现红外材料与光刻胶负胶的紫外光刻加工，得到的微图形光刻胶与红外材料结合良好，光刻图形精度高，微图形中最小结构单元直径4μm，间距4μm，光刻胶厚度为4～13μm之间，精确可控。
根据本发明的另一优选方案，当使用的光刻胶为正胶时，紫外光刻工艺包括：取在常温下放置0.4～0.6小时，优选0.5小时的光刻胶正胶，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：以500r/(min·s)的加速度到达500rpm转速下，动态滴胶15s；以3000r/(min·s)的加速度到达4000rpm转速下，匀胶60s(即，在500rpm的转速下进行动态滴胶15秒，然后在4000rpm的高转速下匀胶60秒)；前烘95℃下1-6分钟；Low vac模式曝光5～9秒；显影液与水的比例为3:2，显影1-3分钟。
根据本发明的另一优选方案，当使用的光刻胶为正胶时，热压键合的工艺包括：0-15分钟，温度从25℃线性升温至75℃；15-35分钟，在75℃下维持20分钟；35-50分钟，线性降温至25℃；0-15分钟，压力从0bar线性升至15bar；15-40分钟，维持在15bar压力下；40-50分钟，压力线性降低至0bar。
优选地，光刻胶为正胶ARP3200或X-ARP3100/10，显影液为ARP专用显影液，基片和盖片所使用的红外材料为抛光的氟化钙晶片。
可选地，使用正胶ARP3200的紫外光刻工艺中，前烘95℃时间为2分钟，Low vac模式曝光7秒，显影时间为2分钟。
使用以上工艺条件可实现红外材料与光刻胶正胶的紫外光刻加工，得到的光刻胶与红外材料结合良好，光刻图形精度高，光刻胶厚度为5～8μm之间，并且可精确到5.3μm，光刻图形最小尺寸6-7μm，误差在±5％范围内。
可选地，所述紫外光刻工艺中，对氟化钙晶片表面使用增粘剂进行处理，然后再进行光刻流程。处理条件为120℃，处理时间10分钟，然后再进行光刻流程。可提高光刻胶与氟化钙表面的粘附性。该参数下，能够实现光刻胶ARP3200与氟化钙的粘附良好。
可选地，所述红外材料，基片的上表面和盖片的下表面进行镀膜处理，镀膜为10～50nm厚度的多晶硅膜，或金刚石薄膜中的一种。进行镀膜处理后可提升红外材料与光刻胶粘附性，更易键合。
可选地，使用所述热压键合方法加工的微流控芯片，盖片材料使用皮秒激光的方式进行通孔加工，用于微流控芯片的进液孔和出液孔。位置与基片上进液孔和出液孔对应。使用皮秒激光进行打孔可实现800μm精度的通孔加工，适用于易碎的红外材料的通孔加工。克服了纳秒激光对红外材料进行打孔时，基片断裂的问题。
还应当理解的是，本发明中的可逆键合就是指使用夹具将盖片与基片和光刻胶形成的光刻微图形进行压紧封接。该夹具的具体结构为中间带有凹槽和圆形镂空的两个金属环形圆盘，两圆盘通过四个沉头螺丝固定夹紧，中间圆形镂空部分直径30mm，微流控芯片置于中间凹槽内。该夹具整体厚度小于11mm，直径约为10cm。此时，用于微流控芯片的盖片材料不带孔，盖片和基片以及光刻胶形成的微图形通过可逆键合方式结合。这种封接方式具有可灵活拆卸的优点，在基片以及光刻胶形成的微图形中的样品室直接培养活细胞。通过这种方法，无需进行营养介质的连续循环交换，也可实现在24小时内对大量活细胞的红外分析。
根据本发明的第二方面，提供一种根据上面所述的制备方法制备得到的红外微流控芯片液体池，包括：基片，使用光刻胶采用紫外光刻工艺形成于基片上的光刻微图形，以及覆盖于基片上将光刻微图形封闭的盖片；该基片和盖片通过既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料制成；该红外微流控芯片液体池包括至少一个样品室，作为活细胞的培养区域和红外测量区域。
根据本发明的优选方案，在基片上形成的光刻微图形选自以下四种中的任意一种：图形一包括：若干小样品室；图形二包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的进液孔、出液孔，将进液孔与样品室连接的进液流道，将样品室与出液孔连接的出液流道，以及背景采集室，样品室与进液流道和出液流道之间还设有多条缓冲流道；图形三包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的第一进液孔、第一出液孔，围绕样品室布置的两个缓冲室，分别位于缓冲室两侧的第二进液孔、第二出液孔，以及四个背景采集室，第一进液孔和第一出液孔通过微流道与样品室相连，第二进液孔和第二出液孔通过微流道与缓冲室相连，缓冲室与样品室之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔；图形四包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的第一进液孔、第一出液孔，围绕样品室布置的两个缓冲室，分别位于缓冲室两侧的第二进液孔、第二出液孔，以及四个背景采集室和第三进液孔，第一进液孔和第一出液孔通过微流道与样品室相连，第二进液孔和第二出液孔通过微流道与缓冲室相连，缓冲室与样品室之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔，第三进液孔通过微流道与其中一个缓冲室相连，用于补充添加物。
其中，具有图形一的红外微流控芯片液体池，盖片和基片以及光刻胶形成的微图形通过可逆键合方式结合。这种封接方式具有可灵活拆卸的优点，在基片以及光刻胶形成的微图形中的样品室直接培养活细胞。通过这种方法，无需进行营养介质的连续循环交换，也可实现在24小时内对大量活细胞的红外分析。
具有图形二～图形四的红外微流控芯片液体池，进液孔和出液孔对应的盖片位置使用皮秒激光打孔技术进行打孔，连接进液和出液管道，可用于向缓冲室和样品室输送营养液，并保持营养液持续的注入和流出，持续更新循环，保证了活细胞的48小时及以上的存活时间。
根据本发明的第三方面，提供一种活细胞的傅里叶变换红外分析方法，所述方法包括：提供一种如上面所述的红外微流控芯片液体池，使用具有图形一的微流控芯片液体池时，细胞直接培养在样品室中，测量时使用夹具将盖片和基片可逆键合在一起，使用图形二～图形四的微流控芯片液体池时，将液体池的进液孔和出液孔分别与进样装置和出样装置相连；样品进入样品室后，持续地进行营养液的注入和流出，保证了活细胞的48小时及以上的存活时间，以实现活细胞的傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。
在进行红外光谱分析时，为去除营养液和水对活细胞红外光谱的影响，使用如下校正公式计算得出活细胞的红外光谱：活细胞红外光谱＝细胞的原始红外光谱—营养液的光谱×系数，其中，所述系数的选择依据如下：以将2100cm-1处的水的组合频区域变平为基线作为基准。
可选地，所述活细胞的傅里叶变换红外分析方法中，使用同步辐射红外光源，可以实现衍射极限空间分辨的红外成像研究。实验时最小光阑孔径为5×5μm2，最小步长1μm，可用于亚细胞级别的红外成像。
正如本发明的背景技术部分所述，常见的红外材料存在着易碎，易溶解于水，与光刻胶结合力较弱等各种问题，因此紫外光刻和键合难度很大，到目前为止，现有技术中都还没有针对红外材料成熟的微加工工艺。本发明的创造性即主要在于，首次提供这样一种基于紫外光刻工艺的红外微流控芯片液体池的制备方法，并通过摸索获得优化的紫外光刻工艺和键合工艺。这些特别的参数需要大量探索，不容易实现。根据本发明所制得的微流控芯片为一种新型的红外液体池，可以为活细胞提供长时间稳定，且精确可控的生存环境，严格控制红外光在液态水中的光程长，所以可用于活细胞的傅里叶变换红外研究，尤其适用于单细胞级别的同步辐射红外显微与成像研究。克服了传统液体池容易漏液，无法精确控制液体厚度，无法进行营养液体循环交换的问题。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明将微流控技术与傅里叶变换红外技术结合起来，提供了一种红外微流控芯片液体池，实现了活细胞的傅里叶变换红外测量，克服了目前大多数FTIR方法针对细胞的研究中，均是对化学固定或者风干的干燥细胞进行测试的问题，可以实时获得活细胞内真实的光谱信息；
2)根据本发明提供的一种红外微流控芯片液体池的制备方法，克服了目前红外材料微加工困难，紫外光刻工艺难度大、键合难度高、通孔加工难度大的问题，获得了高精度微流控芯片图形结构；
3)根据本发明提供的活细胞的傅里叶变换红外分析方法，可实现较长时间活细胞的红外分析，以及细胞与其他物质相互作用的分析，并使用校正公式进一步克服了水对活细胞红外光谱的影响；
4)根据本发明提供的活细胞的傅里叶变换红外分析方法，可实现活细胞高空间分辨的红外显微与成像研究，可以达到衍射极限的空间分辨率，实现单细胞和亚细胞级别的研究。
综上所述，根据本发明提供的一种红外微流控芯片液体池及其制备方法以及一种活细胞的FTIR分析方法，不仅克服了红外材料微加工困难，紫外光刻工艺难度大，键合难度高的问题，还实现了活细胞的傅里叶变换红外测量，以及活细胞高空间分辨的红外显微与成像研究。
附图说明
图1是根据本发明的一个优选实施例提供的红外微流控芯片液体池的结构示意图；
图2是根据本发明的一个优选实施例提供的光刻微图形一的结构示意图；
图3是根据本发明的另一优选实施例提供的光刻微图形二的结构示意图；
图4是根据本发明的又一优选实施例提供的光刻微图形三的结构示意图；
图5是根据本发明的再一优选实施例提供的光刻微图形四的结构示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
如图1所示，是根据本发明的一个优选实施例提供的红外微流控芯片液体池，该红外微流控芯片液体池包括：基片1，使用光刻胶采用紫外光刻工艺形成于基片1上的光刻微图形2，覆盖于基片1上将光刻微图形2封闭的盖片3，该基片1和盖片3通过既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料制成。
其中，基片1所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石、Low-E玻璃或者金镜中的一种，盖片3所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石中的一种。
根据本发明，还提供了四种不同的光刻微图形，从而提供四种具有不同光刻微图形的红外微流控芯片液体池，详细说明如下：
如图2所示，是根据本发明的一个优选实施例提供的光刻微图形一，该微图形一包含多个小的圆形样品室11，样品室11的上方和下方均没有光刻胶，四周由光刻胶环绕形成。样品室11为空时可以作为背景采集区域，在样品室11中可直接培养活细胞，然后使用夹具通过可逆键合的方式将盖片与基片密封，进行活细胞的同步辐射红外傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。
如图3所示，是根据本发明的另一优选实施例提供的光刻微图形二，该微图形二包括：居中布置的一个大的圆形样品室21，分别位于样品室两侧的进液孔22、出液孔23，将进液孔22与样品室21连接的进液流道24，将样品室21与出液孔23连接的出液流道25，以及两个背景采集室26，样品室21与进液流道24和出液流道25之间还设有多条缓冲流道27。样品室21为活细胞的培养区域和红外测量区域。进液孔22和出液孔23对应的盖片位置使用皮秒激光打孔技术进行打孔，连接进液和出液管道。背景采集室26用于红外光谱的背景采集，采集时为空。其中，进液孔22、出液孔23、进出液流道、缓冲流道27、样品室21、背景采集室26的上方和下方均没有光刻胶。
如图4所示，是根据本发明的又一优选实施例提供的光刻微图形三，该微图形三包括：居中布置的一个大的圆形样品室31，分别位于样品室31两侧的第一进液孔32、第一出液孔33，围绕样品室31布置的两个缓冲室34，分别位于缓冲室34两侧的第二进液孔32’、第二出液孔33’，以及四个背景采集室35。进液孔32，32’和出液孔33，33’对应的盖片位置使用皮秒激光打孔技术进行打孔，连接进液和出液管道。第一进液孔32和第一出液孔33通过微流道与样品室31相连，可用于向样品室31输送细胞悬浮液，实现进样；第二进液孔32’和第二出液孔33’通过微流道与缓冲室34相连，可用于向缓冲室34和样品室31输送营养液，并保持营养液持续的注入和流出，持续更新循环。背景采集室35用于红外光谱的背景采集，采集时为空。缓冲室34与样品室31之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔，该柱体起到半透膜的作用，一方面，营养液流入样品室前经过缓冲区域，减小高压营养液对细胞的剪切应力伤害，另一方面，半透膜结构保证营养液可以通过，细胞不会通过。
如图5所示，是根据本发明的再一优选实施例提供的光刻微图形四，该微图形四包括：居中布置的一个大的圆形样品室41，分别位于样品室41两侧的第一进液孔42、第一出液孔43，围绕样品室41布置的两个缓冲室44，分别位于缓冲室44两侧的第二进液孔42’、第二出液孔43’，以及四个背景采集室45和第三进液孔42”。第一进液孔42和第一出液孔43通过微流道与样品室41相连，可用于向样品室41输送细胞悬浮液，实现进样。第二进液孔42’和第二出液孔43’通过微流道与缓冲室44相连，可用于向缓冲室44和样品室41输送营养液，并保持营养液持续的注入和流出，持续更新循环。背景采集室45用于红外光谱的背景采集，采集时为空。缓冲室44与样品室41之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔。第三进液孔42”通过微流道与进样方向的缓冲室44相连，用于补充添加物。
应当理解的是，微图形四与微图形三具有大致相似的结构，其主要区别在于，微图形四增加了一个第三进液孔42”以及对应流道，以便于向营养液中输入添加物，比如化学物质、药物等等，用于实现物质对细胞的作用研究。
实施例1
根据该实施例，制备了一种基于紫外光刻工艺的红外微流控芯片液体池。使用的光刻胶为负胶SU-8，芯片材料为抛光的氟化钙晶片。该工艺详细流程如下：首先，使用丙酮、异丙醇、乙醇依次对氟化钙晶片进行超声清洗，各五分钟。然后使用氮气吹干晶片。然后，在120℃条件下，烘烤氟化钙晶片五分钟。然后，取在常温下放置1小时的光刻胶SU-8，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：转速500rpm(5s)/5000rpm(30s)；前烘95℃下4分钟；硬接触hard模式曝光4秒；后烘95℃下4分钟；使用TOK(SU-8)显影液进行显影1分钟。最后，使用热压键合的方法将盖片与基片和光刻胶形成的微结构进行封接。键合过程如下：0-10分钟，温度从25℃线性升温至65℃；从10分钟开始，在65℃下维持20分钟；30-45分钟，线性降温至25℃，45-55分钟维持温度在25℃。0-7分钟，压力从0bar线性升至15bar；7-20分钟，维持在15bar压力下；21-50分钟，压力维持在50bar下；50-55分钟，压力线性降低至0bar。光刻图形如图3所示。盖片3在键合之前使用皮秒激光的方式进行通孔加工，通孔位置与基片1上的进液孔位置对应。
实施例2
根据该实施例，制备了一种基于紫外光刻工艺的红外微流控芯片液体池。芯片材料为抛光的氟化钙晶片，光刻前对氟化钙晶片表面使用增粘剂进行处理，处理条件为120℃，处理时间10分钟。所述紫外光刻工艺，使用的光刻胶为正胶X-ARP3100/10。该工艺详细流程如下：首先，使用丙酮、异丙醇、乙醇依次对氟化钙晶片进行超声清洗，各五分钟。然后使用氮气吹干晶片。然后，取在常温下放置30分钟的光刻胶X-ARP3100/10，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：转速500rpm(15s)/4000rpm(60s)；加速度500/3000；前烘95℃下4分钟；Low vac模式曝光5秒；ARP专用显影液与水的比例为3:2，显影3分钟。光刻图形如图2所示。最后，使用可逆键合的方法将盖片与基片和光刻胶形成的微结构进行封接。使用夹具将盖片3与基片1和光刻微图形2进行压紧，实现可逆键合。
实施例3
根据该实施例，制备了一种基于紫外光刻工艺的红外微流控芯片液体池。芯片材料为抛光的氟化钡晶片，基片的上表面和盖片的下表面进行镀膜处理，镀膜为20nm厚度的多晶硅膜。所述紫外光刻工艺，使用的光刻胶为正胶ARP3200。该工艺详细流程如下：首先，使用丙酮、异丙醇、乙醇依次对氟化钙晶片进行超声清洗，各五分钟。然后使用氮气吹干晶片。然后，取在常温下放置30分钟的光刻胶ARP3200，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：转速500rpm(15s)/4000rpm(60s)；加速度500/3000；前烘95℃下2分钟；Low vac模式曝光7秒；ARP专用显影液与水的比例为3:2，显影2分钟。匀胶厚度为8μm。最后，使用热压键合的方法将盖片3与基片1和光刻微图形2进行封接。热压键合过程如下：0-15分钟，温度从25℃线性升温至75℃；15-35分钟，在75℃下维持20分钟；35-50分钟，线性降温至25℃。0-15分钟，压力从0bar线性升至15bar；15-40分钟，维持在15bar压力下；40-50分钟，压力线性降低至0bar。光刻图形如图5所示。所述盖片在键合之前使用皮秒激光的方式进行通孔加工，通孔位置与基片上的进液孔位置对应。
实施例4
根据该实施例，提供了一种活细胞的红外分析方法。使用实施例3中所制作的微流控芯片液体池，将液体池的所有进液孔和出液孔分别通过管道与进液精密注射泵和出液精密注射泵连接。置于可控制温度的温控样品架上；整体置于红外显微镜全自动样品台上。使用精密注射泵通过第一进液孔42将肝癌细胞HepG2悬浮液输入样品室，达到所需细胞密度，多余悬浮液通过第一出液孔43流出，停止进样。通过第二进液孔42’匀速输入营养液，营养液通过第二出液孔43’匀速流出，持续的进行营养液的注入和流出。通过第三进液孔42”，输入药物阿霉素溶液。在背景采集室45进行背景光谱采集，光阑孔径设置为20×20μm2。然后在样品室采集单个细胞的原始红外显微光谱。并在细胞附近的区域采集营养液的光谱。使用如下校正公式计算得出活细胞的红外光谱：【活细胞红外光谱＝细胞的原始红外光谱—营养液的光谱×系数】。
实施例5
根据该实施例，提供了一种活细胞的红外分析方法。使用实施例3中所制作的微流控芯片液体池，将液体池的所有进液孔和出液孔分别通过管道与进液精密注射泵和出液精密注射泵连接。置于可控制温度的温控样品架上；整体置于红外显微镜全自动样品台上。使用精密注射泵通过第一进液孔42将肝癌细胞HepG2悬浮液输入样品室，达到所需细胞密度，多余悬浮液通过第一出液孔43流出，停止进样。通过第二进液孔42’匀速输入营养液，营养液通过第二出液孔43’匀速流出，持续的进行营养液的注入和流出。通过第三进液孔42”输入药物阿霉素溶液。在背景采集室45进行背景光谱采集，光阑孔径设置为5×5μm2，步长1μm，对单个细胞进行红外Mapping成像。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种红外微流控芯片液体池的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：提供一种既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料，超声清洗，氮气吹干，所得材料作为基片和盖片；
S2：采用紫外光刻工艺在基片上形成光刻微图形，包括：使用光刻胶在基片上进行均匀旋转涂覆，配合光刻掩膜版，在一定温度下曝光一段时间，使用显影液进行显影，从而在基片上形成光刻微图形，其中，光刻掩膜版根据所设计的微流控芯片图形制作；
S3：采用热压键合或可逆键合，将盖片与基片在光刻微图形处进行封接，形成具有至少一个样品室的红外微流控芯片液体池，该红外微流控芯片液体池可为活细胞提供长时间稳定、且精确可控的生存环境，用于活细胞的傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，基片所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石、Low-E玻璃或者金镜中的一种，盖片所使用的红外材料为氟化钙、氟化钡、硒化锌、溴化钾、氯化钠、金刚石中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当使用的光刻胶为负胶时，紫外光刻工艺包括：在115～125℃条件下，烘烤基片4～6分钟，然后，取在常温下放置0.8～1.2小时的光刻胶负胶，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：500rpm转速下动态滴胶5s；5000rpm转速下匀胶30s；前烘95℃下3-8分钟；硬接触hard模式曝光2～7秒；后烘95℃下3～8分钟；使用显影液进行显影1分钟。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当使用的光刻胶为负胶时，热压键合的工艺包括：0-10分钟，温度从25℃线性升温至65℃；从10分钟开始，在65℃下维持20分钟；30-45分钟，线性降温至25℃，45-55分钟维持温度在25℃；0-7分钟，压力从0bar线性升至15bar；7-20分钟，维持在15bar压力下；21-50分钟，压力维持在50bar下；50-55分钟，压力线性降低至0bar。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当使用的光刻胶为正胶时，紫外光刻工艺包括：取在常温下放置0.4～0.6小时的光刻胶正胶，在如下参数下进行匀胶、光刻和显影：以500r/(min·s)的加速度到达500rpm转速下，动态滴胶15s；以3000r/(min·s)的加速度到达4000rpm转速下，匀胶60s；前烘95℃下1-6分钟；Low vac模式曝光5～9秒；显影液与水的比例为3:2，显影1-3分钟。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，当使用的光刻胶为正胶时，热压键合的工艺包括：0-15分钟，温度从25℃线性升温至75℃；15-35分钟，在75℃下维持20分钟；35-50分钟，线性降温至25℃；0-15分钟，压力从0bar线性升至15bar；15-40分钟，维持在15bar压力下；40-50分钟，压力线性降低至0bar。
7.一种根据权利要求1～6中任意一项所述的制备方法制备得到的红外微流控芯片液体池，其特征在于，包括：基片，使用光刻胶采用紫外光刻工艺形成于基片上的光刻微图形，以及覆盖于基片上将光刻微图形封闭的盖片；该基片和盖片通过既可以透过可见光，同时又可以透射或反射红外光的红外材料制成，该红外微流控芯片液体池包括至少一个样品室，作为活细胞的培养区域和红外测量区域。
8.根据权利要求7所述的红外微流控芯片液体池，其特征在于，在基片上形成的光刻微图形选自以下四种中的任意一种：
图形一包括：若干小样品室；
图形二包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的进液孔、出液孔，将进液孔与样品室连接的进液流道，将样品室与出液孔连接的出液流道，以及背景采集室，样品室与进液流道和出液流道之间还设有多条缓冲流道；
图形三包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的第一进液孔、第一出液孔，围绕样品室布置的两个缓冲室，分别位于缓冲室两侧的第二进液孔、第二出液孔，以及四个背景采集室，第一进液孔和第一出液孔通过微流道与样品室相连，第二进液孔和第二出液孔通过微流道与缓冲室相连，缓冲室与样品室之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔；
图形四包括：居中布置的一个大样品室，分别位于样品室两侧的第一进液孔、第一出液孔，围绕样品室布置的两个缓冲室，分别位于缓冲室两侧的第二进液孔、第二出液孔，以及四个背景采集室和第三进液孔，第一进液孔和第一出液孔通过微流道与样品室相连，第二进液孔和第二出液孔通过微流道与缓冲室相连，缓冲室与样品室之间由直径4～8μm，间隔4μm的柱体分隔，第三进液孔通过微流道与其中一个缓冲室相连，用于补充添加物。
9.一种活细胞的傅里叶变换红外分析方法，其特征在于，提供一种根据权利要求7所述的红外微流控芯片液体池，使用具有图形一的微流控芯片液体池时，细胞直接培养在样品室中，测量时使用夹具将盖片和基片可逆键合在一起，使用图形二～图形四的微流控芯片液体池时，将液体池的进液孔和出液孔分别与进样装置和出样装置相连；样品进入样品室后，持续地进行营养液的注入和流出，保证了活细胞的48小时及以上的存活时间，以实现活细胞的傅里叶变换红外谱学和红外显微与成像研究。
10.根据权利要求9所述的活细胞的傅里叶变换红外分析方法，其特征在于，在进行红外光谱分析时，为去除营养液和水对活细胞红外光谱的影响，使用如下校正公式计算得出活细胞的红外光谱：活细胞红外光谱＝细胞的原始红外光谱—营养液的光谱×系数，其中，所述系数的选择依据如下：以将2100cm-1处的水的组合频区域变平为基线作为基准。
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