CN101360986A - 亚微米表面等离子体激元谐振传感器系统 - Google Patents

亚微米表面等离子体激元谐振传感器系统 Download PDF

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Abstract

用于检测测试流体中目标分析物、配体或分子的存在的传感器，包括透光性基体、安装在其上的一系列表面等离子体激元谐振(SPR)元件、经设置以将光线导入该SPR元件的光源、和经设置以检测透射通过该SPR元件的光的检测器。该SPR元件可以包括具有约150nm厚度的金涂层的约770nm球形直径的介电聚苯乙烯球。该SPR元件和该基体的界面构成了直径小于导入该元件的光的波长的针孔，以在该微尺寸的SPR元件中产生近场耦合模式。该SPR元件包含在模制的PDMS芯片中，其可以加入微流体元件，例如泵和阀门，用于控制测试流体越过该SPR元件的流动。

Description

亚微米表面等离子体激元谐振传感器系统
相关申请的交叉参考
本申请要求2005年12月16日提交的名称为“Sub-micron CavitySurface Plasmon Sensors and Their Micro-fluidic Applications”的共同未决的临时申请号60/750872的优先权，在此将其全部内容通过引用结合进来。
政府利益
本发明的开发过程中的部分工作得到了授权号为IBM-0083653的来自National Science Foundation和授权号为NAG2-1619的来自NASA的政府支持。依照这些授权，美国政府在此处公开的发明中享有一定的权利。
发明背景
医学中的显著趋势是引入即时检验(point of care，POC)器械用于快速的床侧诊断。这些器械能够由第一响应者或医务人员快速诊断用于时间危急的诊断，例如用于指示患者是否存在心脏症状。还开发了用于其它指示的测试，例如传染病、药物滥用、脑血管疾病，其用于防止常规室内实验室化验伴随的过长的处理时间和高的费用。目前的POC器械仅仅具有单一用途。尽管这对于很多应用而言是合适的，但还不能满足持续监控器械的需要。
最初的临床需求是能够监控和检测重病看护患者中感染的存在。目前，很多重病看护患者产生的感染没有快速检测到，通常导致败血症或休克，导致高的死亡率。对于能够连续跟踪患者血流中例如指示感染的特定蛋白质标记物的浓度的器械存在显著的需求。
能够检测选定化学物质或生物物质存在的器械包括生物传感器，其直接与样品分子相互作用以提供鉴别测试分子的信号。生物传感器通常经过化学官能化，使其具有选择性。读数可以是电化学的，对于小分子(例如葡萄糖)而言常常如此，或者对于例如蛋白质或DNA可以使用荧光或其它光学技术。典型的生物传感器通常可以在连续读数模式下操作，或者可以使用多次。这与需要大量试剂处理通常仅产生一次测试结果的常规实验室测定是不同的。
与常规实验测定相比生物传感器提供的最小化可能性暗示着即时测试(POC)能够提供显著改善的诊断能力。POC测试的优点包括：有助于治疗决策的快速转向；快速向患者发布测试结果，由此降低医师的工作负担并提高患者的满意度；减少书面工作和简化样品跟踪；降低对特殊技师的需求。以一组实验对象形式管理的POC测试提供了其它显著的优点。例如，几种心脏病标记物的同时筛选节约了时间，并提供了有效的其它数据。各种类型的流感的筛选与仅对单一菌株进行的更有限制性的测试相比，将有助于诊断。
生物传感器的新兴应用包括例如食物和水的测试、药物的滥用、生物防御和“白粉”的检测，以及兽医测试。这些应用中的一些具有独特的需求，例如与生物防御手段相关的对超快响应时间的需求，或在食物或水的测试中用于检测非常低数量的大肠杆菌菌落形成单元所需的高灵敏性。典型的水测试产品使用必须在烧瓶中培养18～24小时或更长时间的试剂，改变颜色表明存在病原体。尽管这些产品都是非常有效地，但其长的24小时培养时间会存在问题。当污染的水位于公用自来水时，在检测病原体问题之前，该水可能长期使用。连续监控水质的产品可以在实际污染的几分钟内提供警报。
随着政府和军事机构研究快速和交互式检测炭疽热、肉毒杆菌中毒、疟疾、埃博拉病毒、蓖麻病毒和其它潜在的恐怖试剂的方法，生物防护呈现独特的问题。目前US Postal Service使用昂贵的测试套件，其引入了实时PCR，用于放大和分析来自空气或包裹和信封上的可疑“白粉”的粗试样。
新品种的生物传感器使用由光和金属表面相互作用产生的现象。该现象被称作“表面等离子体激元谐振(Surface Plasmon resonance)”，具体化为电荷密度(电子云)振动，其可能存在于两种具有不同介电常数或相反信号的介电常数的介质的界面处。这种情况通常在介电质(玻璃)和金属(通常为金或银)的界面处会遇到。电荷密度波(电子云)与电磁波(进入的光子)有关，这种耦合在界面处达到最大值，指数性衰减进入到两种介质中。实际上，这种耦合是表面边界等离子体激元波(SPW)。
这种耦合不能直接在平坦的金属-介电界面处通过入射光子激发，因为SPW的传播常数总是高于波在介电质中传播的常数。因此为了提高该耦合，使用了衰减的全反射(ATR)、棱镜耦合器和光波导管，或在衍射光栅表面处的衍射。由于光子对SPW的激发导致能量谐振转移进入SPW，因此表面等离子体激元谐振(SPR)通过光子能量的谐振吸收而本身得以体现。由于介电质中的电磁场的强度高(比使用介电波导的典型渐逝场传感器中高数量级)，因此SPW的传播常数以及由此形成的SPR对与支持SPW的金属层相邻的介电质的光学性质(即可由SPR的光询问确定的介电质的折射系数)的变化非常敏感。敏感区域的厚度随着施加能量的波长而变化，但通常对于可见光范围内的波长约为500nm。表面处材料或杂质的存在改变了折射系数。这是可以用于高精度确定材料或杂质的基本效应。
金属是可以提供负信号介电常数的材料。其具有在由适当波长的电磁辐射激发时组成电子产生谐振的谐振模式。特别是金具有在510nm附近的可见波长处具有谐振的光谱。在棱镜耦合器中的衰减全反射的情况下，衰减波对与介质接触的金属表面在约200～400nm表面内是敏感的，通过表面等离子体激元波的存在得以提高。这种材料有效地改变了折射系数，因此改变了临界衰减全反射的精确角。因此可以探测结合基体和样品之间的相互作用，测定在最大SPR产生处反射角的微小变化。
这种效应可用于研究分子之间(例如蛋白质、RNA和/或DNA之间)或者蛋白质和病毒或细菌之间的结合。例如，用特异性抗体官能化的表面将仅探测一种抗原(例如抗原A)并将特异性结合与非特异性结合区分开。即，将检测抗原A，但可以区分结合到表面上的官能化蛋白质与另一抗原(即抗原B)之间较弱的相互作用。通常，需要几毫度的角分辨率来区分选择性和非选择性结合。因此可以实现稀释到1pg/ml的溶液中的蛋白质A的检测。此外，可以解释表面蛋白质和抗原A之间结合的反应动力学。
大多数商业SPR仪器包括样品引入器械或传感器，所述器械或传感器包括涂覆有贵金属(例如Au或Ag)的薄层(50nm)的半球形介电棱镜。该金属涂层进而涂覆有将特异性结合目标分析物的分子。这些商用器械进一步包括在测角器上的光源、阵列检测器和各种校准和过滤光学仪器，一般如图1中所示。
使用半球形棱镜，在介电/空气界面处的入射角与第一空气/介电界面处相同，在此处来自光源的射线进入该棱镜。在光与金属膜中的非辐射衰减波(表面等离子体激元)相结合的精确入射角，膜的反射率大致降低90％，产生位于远离玻璃的金属表面处的衰减等离子体激元场。该衰减波的性质取决于与传感器的自由金属表面接触的介质(例如生物分子)的性质。介质(例如与表面上的分子吸收相关的那些)折射指数的精细改变，会引起表面等离子体激元谐振角Φ的可检测到的改变。然后SPR仪器调节检测器位置以发现这一新角度，由此测定SPR角度的改变。
这些类型的SPR器械具有多个固有局限，包括敏感性、样品尺寸、复杂性和费用。现有的商业仪器需要大的复杂的和脆弱的运动部件，以使入射光束和检测器位置最优化。例如，光源的测角器相对较大和较重，但易碎。而且，光源本身必须提供偏振光。通常敏感性的极限是约为10-6折射率单位，其通常足以检测具有1pg/mm2浓度的吸附分子和尺寸为至少200Da的目标物，但灵敏性不足以提供对某些政府标准需要的对浓度为0.01ppb的生物恐怖物质试剂的有效检测。通常的平坦传感器底座(footprint)在数mm2范围内(在Biacore Flexichip中为1/16thmm2，在Biacore 3000中为2.2mm2)，这对于使这些传感器最小化的能力上产生了技术限制。较大的传感器面积意味着必须提供更多的测试流体以在该平坦传感器上流动。而且，精确度的限制也需要更多的测试流体以提供足够的待检测的分子或微颗粒。由于SPR传感器的宏观尺寸，因此对于分析综合所用的大多数技术而言，用于多元分析的传感元件的阵列需要的样品体积过大。所有这些传统平坦传感器的限制都降低了该传感器的通量容量。
此外，大多数目前的SPR传感器需要ρ-偏振光(即电矢量分量平行于入射平面)及其光学元件的精确对准，其复杂性可与桌面分光计相当。这就导致费用高，通常约为数十万美元。
附图描述
图1是现有技术的平坦基体SPR传感器的操作示意图。
图2是依照本发明的一种实施方案的SPR传感器的放大示意图。
图3是依照本发明制造的SPR珠子传感器的电子显微镜图像。
图4是使用依照本发明的SPR传感器的微流体芯片的示意图。
图5是用于评估依照本发明的SPR传感器的性能的实验装置的示意图。
图6a和6b是图5中所示实验装置中SPR传感器的光谱性能的图表。
图7a和7b是在进一步试验条件下本发明的SPR传感器的光谱性能的图表。
图8是依照本发明的另一实施方案的微流体SPR传感器的示意图。
图9是与本发明的SPR传感器的金层进行磺基-DSP反应用于SPR传感器官能化的图示。
图10a和10b是使用碳二亚胺耦合剂进行官能化反应的图示。
图11是安装在本发明的微流体SPR传感器上的微流体部件的图示。
图12是具有微流体过滤和预浓缩模块的本发明的微流体SPR传感器的图示。
图13是具有用于检测多种分子、配体或分析物的映射官能化(mapped functionalization)的本发明的微流体SPR传感器的图示。
图14是依照本发明的微流体SPR传感器系统的部件的图示。
图15是能够同时评估多种化学物质的依照本发明的传感器的示意图。
发明概述
使用SPR技术用于例如生物分子相互作用分析的衰减波传感器提供了一些优点，例如非侵入性、实时监控目标分析物、配体或分子的结合、以及无标记的状态。用于提高SPR传感器的敏感性同时降低传感器的尺寸的机理会是非常合意的，特别是在医疗诊断、药物筛选、生物医学研究和生物分析领域中。另一个合意的目标是消除通常易碎的机械和光学部件，其会增加传感器的体积、增加响应时间和降低敏感性。依照本发明的一个方面，使用驻波代替该传递的等离子体激元波，或者换言之，通过增加形状谐振提高SPR传感器的敏感性。这种驻波将多次越过活性表面，所述次数次数与谐振的品质因数成正比，因此提高了波和粘合剂之间相互作用的可能性。
在高度对称的微结构内部光的循环通常包括这种形状谐振。对于尺寸为10～100μm的介电球，发生特定等级的谐振，已知称作耳语廊模式。该术语源自和微弱的声音沿London的St.Paul′s Cathedral的走廊壁的圆周引导现象的类似性。生物分析和分光应用可以利用在介电微球形和液滴内部的耳语廊模式的强表面定域和高品质因数的优点。然而，随着微球形尺寸的降低，该耳语廊模式逐渐损失其表面定域性质，通常使得耳语廊模式在微球环境中无效。
对于亚微米尺寸(即直径小于1μm)，用于保持光约束(lightconfinement)的一种途径是用支持表面等离子体激元(SP)的金属膜涂布该球形。这种涂布有金属膜的微球的一个特征是在某些直径，与腔室模式相关的全内反射角可以与金属膜的SPR角相一致，由此导致在几何对称表面上更有效形式的SP激发。这一特征消除了对现有传感器中发现的偏振光源、光学校准和机械扫描的需求，使得施加于平坦传感器的严格的几何条件降低。
本发明包括新型的传感器，其可以最优化地与微流体系统结合使用。对有限空间(例如微流体器械)内部(生物)化学浓度和反应动力学的测定是非常难的。本发明考虑了覆盖有支持表面等离子体激元的金属(例如Au、Ag、Cu)的亚微米介电珠子。由于传感器元件的几何形状以及金属壳中诱导的表面等离子体激元相结合产生的周期边界条件，因此该SPR显示大大提高了特定波长的透射。本发明的传感器对传感器的极其表面处(即在约300nm范围内)材料的折射系数的小变化是敏感的，比现有技术的远场传感器和检测技术敏感得多。
因此，本发明考虑了微腔室器械，其使用由几何或形状谐振提高的表面等离子体激元谐振。为了本发明，该器械在此将称作微腔室表面等离子体激元谐振(MSPR)传感器。在如下描述中，已经选择了球形腔室谐振器，但我们理解也可以使用其它能够维持用于等离子体激元谐振驻波(stationary plasmon resonance wave)越过活性表面运行的边界条件的其它对称几何形状。
因此，在本发明的一个方面，该MSPR用越过传感器元件的活性表面运行的驻波代替与传统SPR传感器相关的传播性等离子体激元波。为了实现这种近场耦合，该介电腔室谐振器用特定厚度的SPR支持金属涂布。该金属层和该腔室谐振器材料的折射系数一起确定了腔室谐振器传感器元件的谐振频率(一个或多个)。然后与该谐振频率相关确定该传感器元件的尺寸。特别地，在一个方面，该传感器元件的尺寸约为谐振频率的波长。
依照本发明，该传感器元件或珠子安装在透光性基体(例如玻璃)上。该基体和珠子用SPR支持材料(例如金)涂布。在本发明的另一特征中，在珠子和没有涂布材料的基体之间的界面处限定了针孔。该针孔的尺寸也校准到传感器的谐振波长，使得该针孔直径小于该波长。该MSPR传感器进一步包括朝向可操作以诱导SPR响应的传感器珠子的光源。因此，该光源为传感器提供谐振波长的光，可以优选为所需波长的单色光。该光可以朝向珠子的涂覆表面或针孔，检测器定位以接受通过MSPR传感器珠子的透射光。
由于其小尺寸，本发明的MSPR传感器可以结合到微流体器械中，为了获得关于在微流体通道内发生的(生物)化学的信息。这些器械将可以制造可以使用小试样体积快速检测和定量多种(生物)化学物质、病毒和细菌以及其浓度的紧凑的一次性传感器。因此，本发明的MSPR传感器将在医疗诊断和治疗(特别是败血症的诊断和治疗)中、在监控化学反应的实验室仪器中以及在检测生物化学物质和生物危害物(例如生物恐怖物质或污染物)中具有重要的应用。
总的来讲，本发明的MSPR传感器可以应用于其中和(生物)化学物质的反应改变与传感器表面接触的松散介质(bulk media)的折射指数的应用中。在官能化的探测器的情况下，本发明可以应用于其中化学相互作用造成覆盖该传感器珠子的表面并可以与分析物或配体发生化学相互作用的自组装单层的厚度或致密性发生改变的应用中。本发明的MSPR传感器的一些通常(非限定性)应用包括：
1.官能化微流体器械内的检测器的方法。
2.检测微流体通道内部分子物种相互作用的应用。
3.检测小分子物种的应用。
4.检测分子之间的特异性结合。
5.测定特定分子对(例如配体-受体对、配体-抗体对)的亲和常数和离解常数。
6.测定微流体器械内部分析物的化学浓度。
7.测定有限几何空间中化学物质的扩散系数。
8.实时检测和定量体液(例如血浆和尿液)中的分子物种。
9.实时检测和定量空气和水中的(生物)化学物质或生物有害物。
10.实时检测用于控制治疗试剂发射的分子物种，例如用于控制疾病状态。
11.实时检测空气或水中的有害废物或工业化学物质。
12.实时检测血浆和其它体液中的病毒。
13.确定人体和兽医应用中的血液化学。
14.检测爆炸物或爆炸物/火器的残余物。
15.检测DNA和/或RNA，或在大约单个细胞或至多几个细胞的水平上检测DNA/RNA与某些蛋白质的结合。
16.化学或生物化学工业过程的工艺分析和/或控制。
本发明的一个优点是排除了常规平坦传感器所需的复杂光学仪器。例如，本发明的MSPR传感器可以使用来自低成本的光源的漫射光。该光不必经过偏振、过滤或导向。本发明排除了对易碎的但体积大的光学校准部件的需求，例如现有技术中的测角计。
本发明的MSPR传感器的另一个优点在于其能够整合到小包装或芯片中的能力。本发明的MSPR传感器可以将光源和光检测器定位于非常接近传感器珠子阵列，由此与现有技术的平坦传感器相比显著降低本发明的MSPR传感器的体积。
本发明的一个目的是提供能够检测目标分析物、配体或分子在流体中存在的微传感器。另一个目的是提高该微传感器的敏感性和检测速度。
本发明的另一个目的是提供可以在微环境中提供高通量检测的传感器。本发明的其它目的和优点将从以下的描述中变得显而易见。
优选实施方案
为了促进对本发明的原理的理解，现在参考附图中示出和以下说明书中描述的实施方案。应该理解并不旨在由此对本发明的范围进行限定。应该进一步理解本发明包括对所示实施方案的任意改变和变体，并且包括本发明的原理的进一步应用，这是本发明所属领域的技术人员通常会想到的。
依照本发明的一种实施方案，谐振微腔室传感器(MSPR)包括负载在基体12上的球形介电微颗粒10，如图2所示。该微颗粒涂覆有SPR支持材料(例如金)的层14，其通过微颗粒和基体之间限定的近场针孔16激发。从该涂覆的微颗粒上散射的光具有强的与表面等离子体激元模式的耦合有关的光谱谐振。这些谐振可以用于传感目的，类似于用于研究在平坦表面等离子体激元传感器上的分子结合的表面等离子体激元谐振，但具有微球形谐振器的亚微米底座和高质量因素的优点，产生与需要光学校准的现有技术传感器相比100倍的提高。
这些与现有的平坦传感器相比显著的改进的实现部分是因为本发明的传感器依赖于光透射而不是反射。已知纳米范围内的反射光在反射性基体的表面的远侧产生近场衰减波光。在微颗粒10和基体12之间的界面处的针孔16具有小于导向基体表面的光的波长的直径，因此只有近场衰减波光将通过该针孔。然而，通过针孔的光本身不足以使传感器起作用。因此，依照本发明，在针孔上方的球形谐振腔室的增加将这种近场光转化为能够容易感应或观察到的远场光。在针孔上方的该对称形状的微颗粒可使光透过针孔进入谐振腔室以在微颗粒上面产生容易观察到的光透射。在特定的实施方案中，激光二极管提供波长为590nm的光，因此针孔16具有小于该波长的直径，更优选地，直径小于300nm。在此处所述的某些实施例中，对于直径为771nm的介电微颗粒，在SPR珠子和玻璃基体之间的接触处建立的针孔直径在150～200nm范围内。我们考虑了对于更小的介电微颗粒直径，将产生更小的针孔直径。
如上所述，本发明的MSPR传感器不需要与依赖沿平坦基体表面传播的表面等离子体激元波的现有技术的SPR器械相关的复杂光学仪器。特别地，图2中所示的MSPR传感器不需要与类似图1中所示器械的现有技术器械有关的用于测定SPR角度改变的测角计或校准器或滤光仪器上的光源。相反，本发明的MSPR传感器可以由与基体12基本垂直透入MSPR传感器珠子的光照射。而且，与图1中的现有技术器械相比，该光源可以位于基体的任一侧，下面将更为详细地解释。
此外，从现有技术器械的光学约束中获得的这种自由可使本发明的MSPR传感器使用广泛范围频率的广泛范围的光源。对于本说明书，提及“光”并不限定于可见光波长。因此，该光源(或更宽泛地，该能量源)可以提供紫外、可见和红外光谱范围的光。尽管在UV和IR范围之外的波长目前并不已知用于表面等离子体激元传感器，但本发明并不排除观察到本发明的等离子体激元谐振特征的任何后发现的能量波长。
实施例1：制备MSPR珠状传感器
以下是图2中所示MSPR传感器的一种实验室制备方法的描述。认识到对于特定应用可以使用其它制备技术。另外认识到以直接下面的描述主要用于适用于研究应用而不是商业应用的传感器，尽管可以应用相同原理来制备有商业前景的传感器。
用金刚石对30×24mm，156μm厚的显微镜盖玻片第1号划线，并将其分为四等份。还将25m×75mm的显微镜载玻片划线，并将其分为两等份。使用公知的RCA清洁方案的改性形式(H2O2∶H2O∶NH4OH＝2∶1∶2，加温到70℃)清洗该载玻片和盖玻片(在图2和4中分别为物体12、62和64)，然后在DI水中冲洗并用N2干燥。经清洗过的盖玻片放置在钟形罩中的干燥气氛中，其可以与机械泵连接以在内部产生低真空。预先制备直径为360nm、480nm和770nm的约104珠子/μL的聚苯乙烯微球的稀溶液，在各片盖玻片上分配50μL各溶液。由于清洗溶液的作用，该玻璃的表面变为亲水性。在钟形罩中的真空(～1托)下暴露2～3小时之后，液体变干，珠子保持固定在该盖玻片上，形成珠子的不规则的单分散层。浓度的选择使得相邻珠子之间的平均距离足够大(至少20～50μm)以避免光学串扰。通过将其暴露于氩等离子体八分钟，用150nm的金层溅射涂布这些样品。
表3中示出了在玻璃基体上溅射涂覆有150nm金的771nm聚苯乙烯珠子的电子显微镜图像。认识到溅射涂布能够在珠子10和玻璃基体12之间产生针孔界面——换言之，该针孔基本不含该涂布物质。在用来自该珠状传感器下面的白光照射时，本发明的MSPR传感器发射的光线是透过相同厚度的平坦金层的光的约100倍强。
实施例2：制备具有MSPR传感器的微流体芯片
依照本发明的另一实施方案，提供了在微流体芯片(例如图4中所示的芯片50)中本发明的传感器的制备方法。相同方案的变化将可以制备更复杂的传感器。在该方法中，该MSPR传感器安装在外壳内，在优选的实施方案中，该外壳具有微芯片的形式。MSPR传感器的微芯片格式可使该传感器容易整合到微系统(例如此处所述的微流体芯片)中。
依照该实施方案，使用光刻技术和在聚二甲基硅氧烷(PDMS)中的芯片重复模制来制备流体芯片。使用底片色调(negative-tone)光致抗蚀剂SU-8作为用于铸造PDMS通道结构的母版来制备该流体器械。该母版基体是50mm×50mm载玻片。在HCl∶HNO3(3∶1)中清洗该基体，用去离子水漂洗，用N2干燥，在甲醇和丙酮(2∶1)中超声，再次用N2干燥。用约100μm厚的一个SU-8 2070光致抗蚀剂层制备母板。将光致抗蚀剂以3000rpm在玻璃基体上旋涂30秒，梯度为120rpm/sec。在65℃在热板上预烘干15分钟和在95℃预烘干90分钟后，然后将该光致抗蚀剂暴露于365nm波长的UV光中。该UV暴露系统装有过滤以通过360±45nm的高压Hg弧光灯，暴露剂量为300mJ/cm2。将经暴露的光致抗蚀剂在相同的加热板上在65℃后烘干10分钟以及在95℃后烘干30分钟，冷却到室温。然后将该母版显影10分钟，用2-丙醇漂洗，用N2干燥。
通过使用AutoCAD2004 LT绘制且印刷在透明物上的光掩模将流体图案转印到该光致抗蚀剂上。在该示出的实施方案中的流体图案表现为具有两个相同通道(输入通道56和输出通道58(5mm宽，10mm长))的矩形流体腔室54(15mm×10mm)。该流体腔室深度由用于分析该传感器的60X浸油显微镜物镜的景深(depth-of-field)来限定。该流体腔室必须能够容纳图2中所示的固定着覆盖有金层14的珠子10的基体12(本实施例中为156μm厚)。为了提供约300μm深的流体腔室，通过结合一片与固定该珠子的物体相同的玻璃基体62来改变该母版的流体腔室部分。优选地，基体12和62具有基本相同的光学性质和厚度。
该硅弹性体套件(kit)包含以10∶1比例混合5分钟的聚合物基底和固化剂。在该模具周围放置胶带隔层以保持该弹性体混合物，将该弹性体浇在该母版上。模具中的PDMS在低真空(～1托)下放置一小时以提高流体图案的复制，通过在120℃加热固化二十分钟。然后将该PDMS基体与该母版分开，通过该弹性体用16G针冲出用于和通道流体连接的出入孔。
在PDMS芯片50的流体腔室的底部，固定覆盖有金的珠子的基体12附着在具有PDMS滴(50μL)的PDMS芯片50的流体腔室的顶板上。放置该基体，使该传感器背离该PDMS模具并暴露于该流体腔室的内部。在90℃焙烧10分钟后完成结合。
然后在接触之前在空气等离子体中暴露40秒之后，将制备的PDMS基体和25mm×50mm第1号盖玻片62永久结合。为了提高芯片50的刚性，以及为了消除流动中的机械紊乱，使用相同的空气等离子体技术将一半显微镜载玻片64(25mm×38mm)永久结合在芯片的顶部。在该实施例中，在一种特定的实施方案中，流体腔室的深度估计小于50μm，使得该传感器可以进入具有200μm操作距离的60X油浸物镜的焦距内。
实施例3：微流体MSPR传感器芯片的操作
在一种使用该微流体芯片50(图4)的方法中，使用1.6mm OD聚丙烯管子进行流体芯片与流体储存器(例如注射器或流体泵)的流体连接。通过相对于与出口通道58连接的储存器的高度调节与输入通道56连接的储存器的高度，或者通过流体泵，来控制流动，以实现约1μL/s的稳定流动。在将芯片与储存器连接之后，将其放置在能够在所有三个方向上(3D)运动的压力驱动台上，其可以将该传感器芯片以精确度10nm在空间定位。整个集合体放置在倒置显微镜下，使用40X和60X的显微镜物镜来收集和分析来自单一传感器的信号。
可以使用图5中所示的实验装置来评估MSPR传感器50的功能和敏感度。在一种实验中，测试了该传感器对蒸气的敏感度。将保持传感器的基体放置在可以将传感器以精确度10nm在空间定位的3D压电驱动台上。将整个集合体放置在倒置显微镜的试验台下，使用40X的显微镜物镜来收集和分析来自单一传感器的信号。将来自传感器的光通过并行通道输入由数据获得接口单元驱动的单色器中。可以在具有2nm分辨率和1秒检测器积分时间的PC记录可见范围400nm～800nm的光谱。
依照一种实施方案，该实验装置包括和传感器附近放置的起泡器相连的管子，将N2吹扫通过水∶200标准乙醇(2∶1)溶液。将蒸气周期性打开和关闭，以检测传感器对刺激的感应。记录干传感器和湿传感器发射的光的光谱，如图6a所示。优选选择对蒸气浓度最敏感的峰用于记录透射光的时间序列，如图6b所示。(两个图的横坐标都等于SPR珠子和该珠子周围的平坦膜之间的光强度之比)。图6a中的图显示了由于水(实线对应于大气压下50％的湿度)和乙醇蒸气的吸附(虚线对应于蒸气通道开启的75～80％湿度)，透射通过771nm Au涂布的珠子的光的光谱移动。图6b中的图显示测定的传感器对在50％～80％之间变化的循环湿度的响应(波长＝715nm)。箭头表示当蒸气通道开启(向下)或关闭(向上)时的瞬间。
为了进一步证实传感器确实对表面改性是敏感的，可以使用链烷硫醇从乙醇吸附作为探针。已知单一单层的形成在10mM浓度下发生在～100分钟内。在图7a中提供了该光谱与相同条件下平坦金膜的光谱透射的对比。通过平坦膜的光谱透射的移动小于球形腔室SPR传感器所期望记录的信号。因此本发明的球形腔室传感器比现有技术中的平坦膜传感器的敏感性更高。在用纯乙醇冲洗该十二烷硫醇溶液之后仍会保持图7a中的光谱移动，这表明发生了链烷硫醇的不可逆吸附。因此这种移动是由于在金表面上形成了单层所致。一旦测定吸附动力学并用一阶指数衰减进行拟合(图7b)，发现在100mM十二烷硫醇浓度膜形成的时间常数为382±7s。请注意尽管图7b中的信号对应于约1.5nm厚的单一单层，但其信噪比很好，足以检测单层中部分的结合。
实施例4-可替代的MSPR传感器构造
在上述实施例1中，该传感器对通过针孔16(图2)的激发响应。在可替代的实施方案中，该传感器经构造用于通过传感器阵列的头部激发，如图8中所示。在该实施方案中，使用24mm×50mm且厚度为160μm的盖玻片第1号作为基体。在甲醇中约104珠子/μl的浓度制备NIST标准聚苯乙烯780±5nm直径的珠子(在该实施例中选择甲醇是因为其与水相比具有非常低的表面张力系数，因此能制备适合的无规则单分散珠子阵列)。在该实施例中，在各盖玻片上分配70μl的珠子溶液，得到约5000珠子/mm2的珠子密度。在1托真空下干燥1小时之后，在约10mm长和3mm宽的遮蔽区域内用140～150nm金层溅射涂覆该基体。在空气等离子体中将该基体燃烧约3分钟，以确保该传感器清洁。在接触之前将基体和PDMS模具暴露在空气等离子体中45秒。
在该实施方案中，该MSPR传感器定位于微流体结构中，其可使流体流动穿过无规则的珠子阵列，如图8所示。该结构可以构造为T形，具有两个50μm宽且20μm深的微流体通道，其与100μm宽且20μm深的共用通道相连。该MSPR传感器位于该共用通道内。将该微流体结构模制到PDMS弹性体中，在该弹性体中形成用于访问两个流动通道的孔。该流动通道与两个位于不同高度的相应储存器相连。在该实施例中，因此通过通道的流动是简单通过静水压力实现的，约为100μm/sec。当然，在其它实施方案或商业形式中，通过该微流体结构的流体流动可以以任何方式实现，例如通过流体泵。
在该实施例中，在该微流体器械的共用通道的底部安装多个MSPR传感器，再次如图8中所示。该传感器并不是通过针孔照亮(如前述实施例中所示)，而是通过该器械的头部照亮，即通过该珠子的球形表面。发现该实施例的传感器表现出与图2中所述的实施例中的传感器相似的谐振响应，只是图8的实施方案具有较高的信噪比。
图8的实施方案的一个优点在于便于该微流体芯片的封装。为了封装(enclose)本发明的微流体芯片，将玻璃基体和PDMS模具暴露于空气等离子体激元中，其将化学结构改性以将两种介质相结合。由于MSPR传感器非常小，而且珠子之间的间距在10～100μm范围内，因此施加金层(例如通过溅射涂覆)存在问题。特别地，很难仅将金层施加到珠子上而不施加到玻璃基体上。另一方面，金与玻璃基体的结合并不好。本发明的实施方案可以在传感器珠子和该传感器的底部玻璃基体上涂覆连续的致密金层。可以在玻璃基体中添加对玻璃和金都具有亲和性的材料层。在特别的实施方案中，该材料可以是以约1～5nm的厚度施加的铬。可替代地，可以将该基体经过化学处理以提高仅和基体之间的粘附性。然后可以施加PDMS，PDMS通过传感器之间的微通道的流动良好。在80～100℃下将PDMS模具进行后焙烧过夜使得聚合物固化，除去任何挥发性物质或松散的聚合物链，否则其可能渗入玻璃基体上溅射的金层中。
实施例5-MSPR传感器的官能化
图2和8中所示的传感器的金表面上的共价官能化使得该传感器可以涂布有不同的目标分析物、配体或分子，特别是具有较高兴趣的生物分子。为了本发明，术语“目标物”应当用于一般性地表示传感器希望检测的目标分析物、配体或分子。理解这些“目标物”可以包括生物分子，例如蛋白质、RNS、DNA和酶，以及非生物分子的成分，例如病毒、细菌、非生物化学物等。然而，理解这些“目标物”具有与本发明的MSPR传感器上提供的其它分子相结合的能力，而且以影响传感器的谐振特征的方式进行。
依照本发明的某些实施方案，在该实施例中金层的官能化是通过两种不同的化学物质以对蛋白质成共价活性的各自单层的形式实现的。第一种化学物质是二硫代双(N-琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP，DTSP)，也称作Lomant′s试剂，其是均双官能(homobifunctional)的、硫醇可解理(thiol-cleavable)的交联剂，通过二硫基团吸附在金表面上。DPS是可溶于二甲亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)的高度疏水性化合物。使用水溶性的交联剂磺基-DPS(DTSSP)避免DMSO或DMF和金表面之间发生相互作用。官能化反应如图9中所示。特别地，二硫键断裂，与金表面反应。
DTSSP是半稳定的胺活性NHS酯，其是蛋白质活性的。在该实施例中，使用两种不同的工作缓冲液(磷酸盐缓冲液pH5.8和DI水)来评估反应。反应动力学使得以105±8秒的时间常数产生281.52Da和约0.6nm厚的单层分子，信噪比为5.5。
用于MSPR传感器官能化的第二种化学物质包括碳二亚胺耦合剂。涉及该化学物质的反应在三个步骤中发生。第一步骤是零交联剂(zerocross-linker)与金表面的反应，如图10a所示。在该第一步骤中，交联剂为3，3′-二硫代二丙酸(DTDPA)，其具有二硫键，在金存在下容易断裂。该交联剂以允许碳二亚胺耦合的羧基封端。该DTDPA反应动力学在传感器表面产生仅104Da的分子和0.5nm的分子单层。使用碳二亚胺介体1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)容易地与亲核试剂反应。该EDC溶液是在乙醇中制备的，因为EDC会非常快速地发生水解。同一溶液还包含胺活性的酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。在图10b中所示的络合反应中，EDC和NHS促进碳二亚胺耦合反应，将羧酸转化为活性中间体，所属中间体容易受到胺的攻击。因此，最终产物是胺活性的，容易将蛋白质结合到该MSPR传感器的表面。
发现该第二种化学物质的反应动力学以28.5±0.9秒的估算时间常数在零交联剂的顶部上以16.2的信噪比形成了98.1Da和约0.5nm厚的单层。
实施例6-蛋白质与官能化的SPR传感器的结合
本发明的传感器的一个重要应用是作为生物传感器。因此，可以使用以实施例5中所述的方式官能化的传感器来检测能够与该官能化的化学物质相结合的某些蛋白质分子。两种重要的生物分子是葡糖氧化酶(Gox)和葡萄糖(Glu)。
Gox是有两个相同的子单元制成的非常大的分子，具有160000Da的总MW。因此，Gox提供了很好的用于评估该MSPR传感器和微流体器械对大分子的结合响应的能力的测试。已知Gox以特定的方向与金结合，并以不同的方向与EDC/NHS活化金表面结合。在该实施例中，一旦用胺活性NHS-酯基活化该MSPR传感器的金表面，如上所述，与蛋白质的反应就是简单的，但反应时间常数将取决于蛋白质的尺寸。对于DTSSP官能化的传感器，发现反应时间常数为562±35秒，信噪比为3.85。该反应在该传感器的表面上涂覆了约10nm厚的单层。在该反应中，确定本发明的MSPR传感器表现出42zepto-moles/SPR传感器的敏感度，或者以覆盖传感器的Gox质量表示的可检测性为6.7毫微微克/MSPR传感器。实施该程序的变体以监控在PBS 1X中100mM的β-D+葡萄糖的流动，或PBS 1X中1mM的Glu的流动(用于模拟人体血液中的正常葡萄糖浓度)或L-葡萄糖的流动，或2-脱氧-D-葡萄糖(2-DxGlu)的流动的影响下的Gox活性。本实施例的器械能够检测在100mM和1mM的β-D+葡萄糖存在下的Gox的酶活性(除了在后一种情况下响应慢很多之外)，但对于暴露于L-葡萄糖或2-DxGlu的Gox没有记录到酶活性响应。
上述实施例显示了本发明的MSPR传感器和微流体特征在检测大的和小的目标物(包括生物分子，例如重要的蛋白质)中的效能。特别地，本发明的MSPR传感器可以经构造为小于1μm的底座，仍能够检测未标记的目标物的zeptomoles的特异性结合。依照本发明，光学装置中的光源可以是激光二极管。在这些实施例中，选择的激光二极管在590nm波长处谐振；然而，预期，在其它波长处可以使用其它小的激光二极管。相信在632.8nm波长处谐振的激光二极管可以有助于优化本发明的SPR传感器的性能。
预期可以使用除上述激光二极管之外的光源。例如，在某些可替代的实施方案中，光源可以导入滤光器，其可操作用于将透射光限定到所需的波长。该滤光器可以在MSPR传感器安装时调节到特定的谐振频率。可替代地，该滤光器可以位于传感器的检测器侧。
光学检测器的选择可以提高本发明的MSPR传感器的功能和效率。在一种特定的实施方案中，该检测器可以是弱暗电流硅雪崩光电二极管(APD)光子计数检测器。可替代地，为了平行检测多个目标物，可以使用CCD照相机或其它像素取向器械。该检测器和相关电子仪器可以确定MSPR传感器的基线谐振峰，用于校准该传感器。在使用中，检测器可以确定该谐振峰是否移动(红移或蓝移)，这是目标物与该MSPR传感器的谐振表面相结合的直接指示。
本发明考虑了定性的检测器(即仅检测特定目标物的存在)或定量的检测器(即检测目标物的含量或含量变化)。在后一种情况中，定量分析可以特别有用地测定分析物浓度随时间的变化。例如，可以监测病人血液中某些毒素的变化，而不只是离散的瞬时水平，因此便于有害医疗状态的及早诊断。此处关于败血症检测的实施例可以获益于这种定量方法。同样地，在家庭中可以使用血糖水平的定量监控来及早检测糖尿病状况。
在上述实施方案中，将金层溅射涂覆在MSPR珠子和玻璃基体上。由于金和玻璃的粘合性差，因此该制造方法可以包括在添加金层之前在玻璃上溅射铬的薄层，这是由于铬与玻璃结合良好而且金与铬也结合良好。为了高产量的制备，可以通过双头溅射涂覆机涂覆两层，以避免需要破坏基体周围的真空。
在上述实施例中，通过微流体器械的流体流动是仅由静水压力完成的。可替代地，该微流体传感器芯片可以结合微阀门和蠕动泵以控制流体流动和样品运送。该微流体技术的使用也可以使本发明的微流体传感器处理小的样品体积，约2μl。因此，本发明的一种实施方案中的微流体MSPR传感器可以构造如图11所示。该传感器70包括MSPR基体72，在其上安装有T形微流体结构74。该T形结构74以上述方式操作以将流体从该结构的通道75a、75b越过MSPR传感器引到共用通道76中。该微传感器70的第二级包括流体控制部件。特别地，在共用通道76的排出端提供微流体泵78。在特定的实施方案中，该泵可以是蠕动、热或压电驱动的。各个通道75a、75b具有响应微阀门79a、79b以控制通过各自通道进入共用通道76的流体流动。在单一分析物检测传感器中，例如图11中所示的微传感器70，一个通道75a和阀门79a控制样品进入共用通道的流动，而另一个通道75b和阀门79b控制官能化溶液的流动。
考虑了微流体部件可以用电控制以以预设顺序操作，用于使MSPR传感器阵列官能化和分析流体样品。特别地，阀门79a可以关闭，而阀门79b开启，以允许通过通道75b引入官能化溶液，例如上述的官能化组合物。一旦SPR传感器经过官能化，可以通过通道75b引入缓冲溶液。然后可以关闭阀门79b，开启阀门79a，以通过通道75a接收流体，以接触完全官能化的SPR传感器阵列。当然，考虑了官能化步骤可以发生在远离样品分析的位置，即在预包装的生物微传感器的制备中。
此外，可以根据需要控制泵和微阀门，以确保在官能化的MSPR传感器上形成目标物的单层。例如，在上述的Gox实施例中，用约562秒的时间常数检测形成约10nm厚的160000Da单层。因此，测试流体通过微流体腔室的流动必须足以确保形成显著的和可检测到的目标物单层。
本发明的传感器的流体元件的另一方面取决于评估的流体试样的性质。特别地，复杂试样需要在分析之前清洁和预浓缩以确保准确的检测结果。这种复杂试样包括人体血液(其可以如上官能化实施例中所述的方式评估特定的蛋白质)和天然水(例如来自正评估是否存在危险性病原体的河流的水)。生物样品的预清洁和预浓缩可以发生在引入到MSPR传感器系统之前。例如，可以使用离心法清洁流体试样，但离心机并不适用于微流体环境。大规模的试样测试(例如饮用水纯度监测器)可以承受这种规模的预清洁和预浓缩。然而，本发明的一个特征是其非常适用于微流体应用，其中在单一的小芯片上存在整个传感器和相关的样品流体。
因此，本发明考虑了添加微流体过滤和预浓缩模块，将其整合到MSPR传感器芯片上。因此，如图12所示的系统80可以在MSPR传感器芯片(例如图11中所示的芯片70)的上游引入微流体过滤模块82和预浓缩模块84。在该实施方案中，上游模块与流体样品通道75a和阀门79a相连。
在特定的实施方案中，微流体过滤器82包括夹在相对的PDMS模具之间的多孔膜。该过滤器的流动面积取决于测试的流体样品，例如，对于低体积过滤(例如至多1ml的血液)，约2.5cm2的过滤面积就足够了。对于更高的体积，或更高的流速取样，则可能需要更大的过滤面积。
总的来讲，过滤除去了需要检测的目标物中的一些。例如，很多蛋白质非特异性结合到过滤膜上。因此，在一些情况下，可如在过滤器模块82和微流体传感器芯片的样品通道75a之间插入预浓缩模块84。各种预浓缩方法都是可以接受的，例如电泳、毛细分离、官能化的磁性小珠、等速电泳、柱分离或光活化聚碳酸酯(PPC)微流体芯片。
本发明的MSPR传感器芯片的小尺寸和准确性允许制备具有通量和整体平行处理能力大大超过目前的传感器和生物传感器的能力的传感器。特别地，本发明的MSPR传感器可以经构造用于检测成千上万甚至成百万的目标物，所有都在单一的小传感器芯片上。如图13中所示，该传感器芯片包括在单一芯片上的许多MSPR珠子，其可以以无规则的单分散阵列排列或以规则的阵列排列。可以使用光刻和/或全息光学镊子或任何其它适用于将显微尺寸的小物体放置在玻璃基体上的技术制备该MSPR传感器的阵列。然而，本发明的一个特征是可以使用目前可得到的技术将成百万的微米尺寸MSPR珠子完全无规则分散在基体上。如下所述，尽管MSPR珠子的分散是无规则的，但依照本发明的这种实施方案制备的传感器可以完全官能化用于检测大量的目标物。
为了满足检测多种目标物的需求，目前的平面SPR传感器技术需要均匀分布的SPR元件，以确保足够的用于多个目标物的检测能力。这些目前的传感器的相对较低的敏感性必需足够量的SPR元件与预设的“位点”有关，其中所有元件都官能化以针对特定的目标物。然而，精确设置均匀分布的SPR元件的能力是非常有限的，通常不超过100×100格的元件。这种限定以及目前平面传感器的精确度限制最终将可以检测的离散目标物的数量限制在小于约1000，其最终严重地限制了这些传感器的应用范围。例如，基因治疗和人类基因组绘制工程产生了成百万的测试目标物。使用目前的平面技术，对于该自然界的工程将需要成千上百的大传感器。
另一方面，能力在于无规则分散在本发明的传感器中所用的微珠。然而，直至本发明为止，还没有利用该能力将成百万的SPR元件组装在传感器基体上而且各自都能够单独或按位点分组官能化的方法。依照本发明，实现这种离散官能化的一种方法是通过使试剂在使用微流体的传感器芯片的特定带上流动以操作传感器组。换言之，如图13中所示，该芯片72可以分成多个带，例如四个长度方向的带86a-d。然后将微流体系统将特定的试剂沿每个带流动以通常使沿该带的各MSPR传感器官能化。这种方法将官能化的程度限制到芯片上带的数量，在该带上可以精确流动各种试剂。在一种特定的实施方案中，可以将该MSPR芯片分成约20个带，各自具有不同的官能化，使得同样数量的目标物可以标记用于检测。
在另一方法中，可以精确选择各自的MSPR传感器用于特定的官能化。实现这种单独官能化的一种方法可以是使用光激活结合的交联剂，例如光敏生物素。然而，这种方法本身很慢，由于一次可能只有很少的SPR传感器被官能化。另一种更通用的方法是使用微测位仪(microspotter)以与现有的喷墨打印机相同的方式制备SPR珠子传感器的微阵列。一些微测位仪打印机能够放置墨滴到600×600dpi的分辨率，点尺寸在30μm范围内，间距45μm，体积仅为10pl。甚至更精确的喷墨打印机能够达到4800×4800dpi的分辨率，各墨滴具有仅5μm的直径。该打印技术可以适用于官能化选定的MSPR传感器或传感器组，产生官能化的位点，例如图13中所示的位点88。各位点可以属于不同的目标物。
在另一种方法中，可以使用多针测位仪实现离散的多个目标物官能化。这种多针测位仪可以精确地将交联剂或试剂直接涂覆到且仅在MSPR珠子上。特别官能化的珠子可以在整个MSPR珠子场范围内成簇或不规则分布。
在另一种非常适用于整体并行处理的官能化方法中，可以使用掩模对MSPR珠子官能化。该掩模将交联剂或试剂的应用限制到设置在基体上位点88内的MSPR珠子。考虑了官能化的位点将包括在明显大于珠子自身面积的阵列上任意数量的无规则分散的MSPR珠子。因此，在特定的实施方案中，该官能化的位点可以占据直径约为30μm的区域，然而MSPR珠子具有约770nm的直径。能够以低至10pl的量分散试剂的微测位仪可以用于对各位点中的珠子进行官能化。该传感器芯片可以包括条形码86或一些其它可阅读的标记，表明不同的官能化以及对应各官能化的位点。如下所述，该条形码86也可以包含与检测器90产生的响应信号相对应的校准信息(图14)。
使用如上所述的传感器构造，多个无规则分散的MSPR珠子集中在基体上，通常将珠子的集合官能化以构成位点88。在图13中所示的特定实施例中，描述了18个这样的位点；然而，预期在给定的传感器芯片上可以限定几百、几千以及甚至几百万个这种位点。操作的传感器芯片需要光源和一些类型的传感器，以感应各位点处的谐振响应。因此，依照本发明的一种实施方案，可以存在如图14中所示的构成微传感器的堆积，MSPR传感器芯片72夹在检测器90(其可以是CCD阵列)和光源96(其可以是LED)之间。理解各种光学调节元件可以与光源和/或检测器整合在一起，例如用于改进信噪比的滤光器。该光学调节元件也可以包括波长滤波器或与特定位点88或各自MSPR珠子相对应的不同的离散波长滤波器。
依照一种特征，该检测器或CCD阵列可以映射入栅格92中，栅格的各像素93包含能够感应光透射通过MSPR传感器芯片72且构造以产生指代用于后续处理的光透射的信号的CCD。该映射的栅格92覆盖该传感器芯片，如图14所示，或者可替代地，该位点88可以被认为投影到映射的栅格上，如图13所示。最优地，该检测器栅格足够精细，使得各位点88可以投影到该栅格的多个像素93上。期望各像素可以覆盖一些MSPR珠子，尽管由于珠子在基体上的无规则分布使得与各像素对应的珠子的数量将是变化的。
首先通过确定从各位点88中阅读透射数据的最优像素(一个或多个)来进行检测器的校准。因此，在特定的实施例中，特定的位点可以完全包括四个像素93，而且部分包括五个另外的像素。用光源96照射该MSPR芯片，评估在对应该位点的各像素处的测量强度。记录最大响应的像素被选作对应特定位点的像素，其进而对应于特定的官能化。相对于其它像素，该选定的像素同样映射到最大数量的MNPR珠子，因此与其它像素相比其响应更大。在该选定的像素内CCD的输出数据可以关于光源96的强度和/或波长进行校准。对所有其它官能化的位点88重复相同的过程。因此，在该特定的实施例中，对于18个官能化位点(图13)，可以确定在检测器90的映射栅格92上的18个像素93，以评估各个像素的校准输出值。这种校准输出之可以写入到内存储器上，或传输到外存储器和/或处理器中。可以将具有各映射像素的校准数据的校准表保持在存储器中，并用外处理器访问。因此该条形码86可以提供用于从存储器中储存的多个表中提取适当的校准表的标识符。该校准表可以确定从检测器中阅读哪个像素，以及如何解释来自各像素的输出信号。该应用校准数据的外部设备可以经构造以从全局数据库获得需要的数据，例如通过网络连接。
考虑了另外的像素也可以与特定的位点相结合，对相应的输出响应的校准进行适当的改变。应当认识到在一些情况下，给定像素的输出响应可能来自仅通过一个在给定位点内存在且与给定像素对准的MSPR珠子的光透射，而对于另一像素，光透射可以通过几个MSPR珠子进行测定。珠子的无规则排列是指用于产生与各官能化位点相应的输出信号的MSPR珠子的数量也是无规则的。然而，上述的校准步骤可以确保该目标物可以迅速并准确地检测。本发明的MSPR传感器中的各MSPR珠子的高敏感性是指甚至单一的MSPR珠子对于特定的官能化位点和检测器阵列像素也是足够的。
可以认识到图14中所示的器械可以开启用现有的传感器器械无法进行的目标物检测的领域。如上所述，单一的MSPR传感器芯片可以在小包装内针对成千上万个目标物官能化。本发明的传感器的小尺寸使得可以形成整体平行的用于DNA、RNA和蛋白质检测的传感器阵列。微流体和传感器芯片的应用使得测试流体可以连续流动越过传感器芯片70。该微流体特征有利于该整体平行的传感器阵列，且提供了化学和生物化学状态的实时精确感应的途径。
特别有利的应用是实时检测血液流中的目标物。本发明的多通道实施方案的一个重要应用是检测败血症。败血症是术后恢复和外伤患者中死亡率的主要来源。败血症的治疗大大受限于抗生素和用于支持心、肺和肾功能的缓和方法。依照2001年收集的数据，败血症综合症在美国每年感染约751000名患者，其中383000(51.1％)受到重病看护。估计全国的死亡率为215000例，随年龄增长，从儿童的10％到85岁以上的38.4％。每例的花费平均约22000美元，这意味着每年大约170亿美元。败血症的早期检测和快速干预(在发作的2～4小时内)显著降低死亡率和生还者的衰弱。然而，目前没有方法来监控病人败血症的发作。在很多情况下，由于缺乏能够连续监控患者血液中的细胞活素类含量的仪器，而导致用于败血症治疗产生的药物处理失败。
败血症综合症是身体系统对传染性刺激的炎症反应。内毒素(例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的肽聚糖和鞭毛蛋白(flagellan)、来自革兰氏阳性细菌的脂磷壁质(lipotechoic acid)、来自真菌的甘露聚糖和其它来自传染物的抗原)刺激巨噬细胞和单核细胞以释放α-瘤坏死因子(TNF-α)，然后释放细胞因子流。在败血症的第一时期过程中(特别是最初的八个小时)，过度的炎症反应会导致大量的器官损伤，特别是对肾脏和心脏，而且到达肝、肺和脑中，需要血压和换气的人工支持。这种器官损伤通常造成在败血症的急性期之后数月或数年衰弱或死亡。
促炎症介质的释放最初被认为是很大程度上无法控制的。然而，后续的研究表明TNF-α也刺激白血球释放抗炎细胞因子，包括IL-10、IL-1和β-转化生长因子(TGF-β)，其抑制促炎症细胞因子的合成，并将抗炎作用直接作用在单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞上。这种补偿性抗炎症反应综合症(CARS)用于使否则会是全身感染的无法控制的促炎症反应实现定域。不幸的是，在败血症的后期，抗炎症反应通常大于促炎症反应，导致免疫瘫痪症，即不能对另外的传染性损害产生有效的免疫反应。
因此，能够附着在所有术后和外伤后患者身上的最低限度侵入器械能够监控败血症的发作和过程，使得可以进行更早和更直接的干预，并最终降低死亡率和生还者的衰弱。依照特定的实施方案，如图15中所示，提供了微流体器械100，其可以用于同时分析一组六种在败血症中非常重要的化学物质。(然而，该微流体结构可以改进以符合同时分析更多或更少化学物质，或者可以改进用于不同的驱动流体、流速或分析装置)。败血症发作及其过程的一种诊断方法包括同时实时监控化学物质TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10、IL-13和TGF-β。因此，如图15中所示，微流体传感器100包括一组六个通道102～107(在特定实施方案中，分别50μm宽，间距100μm，11mm长)，一起会聚到微流体室110(2mm长，600μm宽)，各通道对应特定的监控化学物质。所属间距经选择使得大约20kDa的分子的扩散不会干扰相邻通道中的分子。这六个通道用于用上述化学物质的特异性抗体使传感器阵列120官能化。不同抗体通过微流体室的流动将产生一系列六个平行的抗体条纹112，使该芯片官能化。在该特定的实施方案中，该芯片100设计用于抗体最低400μm/s的流动。这种处理和特别的校准可以在使用芯片评估样品之前进行。
200μm宽的横向通道116和该微流体室110交叉。该通道较宽，以允许更粘性和更快的凝固性流体通过，例如血浆。交叉区域覆盖200μm×600μm的面积。该横向通道116包括通过其引入血液的入口117和废物出口118。类似地，该微流体室110包括废物出口111。
该传感器阵列120优选定向在室110与横向通道116的交点处，优选与该通道对准。在一种特定的实施方案中，该传感器120可以包括六个SPR珠子传感器124或传感器位点的线性阵列，各单独的传感器或传感器位点对应特定的官能化并对准相应的抗体条112。
图14中所示的微流体器械100可以使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)基体和盖玻片以下述提出的方式制备。使用底片色调光致抗蚀剂(negative-tone photoresist)SU-8作为用于铸造PDMS通道结构的母版来制备该器械。该母版基体是50mm×50mm的载玻片。在HCl∶HNO3(3∶1)中清洗该基体，用纳米纯水冲洗，用N2干燥，在甲醇和丙酮(2∶1)中超声，再次用N2干燥。用两个SU-8光致抗蚀剂层产生母版。第一下层(18～20μm厚的SU-8 2010层)用于促进通道结构与基体的粘合，第二较厚层(60～80μm厚的SU-8 2070层)的光致抗蚀剂用于产生通道结构。两层处理相同，除了第一层的暴露没有光掩模以外。将光致抗蚀剂以1000rpm在基体上旋涂30秒，梯度为40rpm/sec。在65℃在热板上预烘干1分钟和在95℃预烘干2分钟后，然后将该光致抗蚀剂暴露于UV光。通过使用AutoCAD2004 LT绘制且使用高分辨率激光打印机以8000dpi印刷在透明物上的光掩模将预期的通道设计转印到该光致抗蚀剂上。该UV暴露系统装有过滤以通过360±23nm的高压Hg弧光灯，暴露剂量为300mJ/cm2。将经暴露的光致抗蚀剂在相同的热板上在65℃二次烘干1分钟以及在95℃二次烘干3分钟。然后将该母版显影5分钟，用2-丙醇冲洗，用氮气干燥。
该硅酮弹性体套件包含以10∶1比例混合5分钟的聚合物基底和固化剂。在该模具周围放置胶带隔层，以保持该弹性体混合物，将该弹性体浇在该母版上。模具中的PDMS在低真空(～1托)下放置一小时以改善通道的复制，通过加热在120℃二十分钟固化。然后将该PDMS基体与该母版分开，通过该弹性体用16G针冲出用于和通道流体连接的出入孔。
在PDMS模具的底部，越过与横向通道116的交点处的微流体腔室110，可以使用光刻和/或全息光学镊子或任何其它适用于将显微尺寸的小物体放置在玻璃基体上的技术，比如显微操作器和激光镊子系统，制备该MSPR珠子120的线性阵列。该显微操作器装有103～102珠子/μL的精确尺寸标准珠子的溶液。该浓度的选择使得阵列120的MSPR珠子分散具有约50～100μm的间距。可以使用光学激光镊子来保持珠子就位直至液体变干，用显微操作器分散另一个珠子，用镊子保持，直至液体变干，如此反复。一旦放置了珠子124，通过位于交叉点上的1mm×1mm的窗口溅射涂覆该PDMS基体。用150nm的金覆盖珠子。然后在接触之前在空气等离子体中暴露40分钟之后，该PDMS基体和盖玻片永久结合在一起。
在一种实施方案中，败血症检测器器械可以包括与病人静脉和泵系统相连用于定期将少量血液抽取到传感器器械100中的导管。血液流动通过一次性过滤器以提取血浆，将血浆通过通道116输送到一次性传感器100中。传感器的输出提供血浆中细胞因子浓度的读数。废血液通过通道118收集在一次性的标有生物废物的废管中。本发明的MSPR传感器和传感器芯片的小尺寸使得该传感器器械100和导管可以就位，只要病人处于医疗看护下即可。蠕动泵将血液吸取到传感器芯片中的控制可以电动控制以预设间隔或响应一些其它医疗状态传感器而发生。传感器的检测器可以连接到相同的控制器上，如果检测到特定的试剂就发出警报。
IL-10、IL-13和TGF-β的含量升高表示初期败血症，而IL-10、IL-13和TGF-β的含量升高表示免疫麻痹。如果各传感器的传感时间过长，单一通道可能不能实时检测细胞因子含量。在这种情况下，可以在单一的一次性芯片上制造一系列通道检测器，以五分钟间隔在通道之间切换血液供应。可以使用可控制的微阀门来交替地将血液和清洁的无菌介质输送到传感器中以对其重新设置以用于下次测定。
已经开发了激动剂和拮抗剂药物种类用于控制败血症中包括的各种细胞因子。然而，这些药物都没有广泛应用，因此医师无法监控其效果，其根据不同的病人和随时间变化很大。结果是目前选择的治疗包括以不足或过量的剂量提供的炎症抑制剂和增强剂，两者都对患者都可能是致命的。本发明的MSPR传感器会使医师可以提供激动剂和拮抗剂的定制“鸡尾酒”，这将在感染早期抑制免疫反应，并在感染后期将其提高，同时在任何时间保持细胞因子在最佳的水平。
检测败血症状态的相同原理可以应用于其它医疗状态的交互式检测，以及作为间接治疗器械的界面。通过适当的官能化，可以使用单传感器或多传感器器械来监控病人在长期治疗中的状态。例如，可以将依照此处所述的实施方案的MSPR传感器芯片和微流体系统引入透析系统或其它为了治疗连续从患者中抽取血液或其它流体的器械中。该MSPR传感器芯片可以整合到连续血液监控系统中，用于实时检测代表即将来临的问题(例如心脏病发作、中风、肾衰竭等)的目标物。
可以提供多个传感器阵列器械的第二种实施方案，其包括一系列包含细胞因子调节药物且由上述细胞因子检测器的输出控制的注射器管。这种器械最终将通过静脉内(IV)液滴输送控制剂量的多种细胞因子调节剂到该病人中，连续改变激动剂和拮抗剂的供应以保持患者的细胞因子处于最佳水平。在上述血液监控实施例中，例如可以使用指代心脏病开始发作的目标物的实时监控来响应该状态开始以提供瞬时实时定量给药。
在如上所述检测时，可以使用相同的介入治疗来防止败血症。在这种情况下，某些抗败血症的治疗依赖于特定蛋白质用于抑制某些目标分子产生的作用。然而，该治疗本身可能是抑制免疫的，因此该治疗必须小心管理。通过本发明的MSPR和微流体传感器进行目标物水平的实时检测可以迅速并准确地进行该抗败血症治疗。可以使用类似的方法来降低化学治疗或HIV治疗的毒性，或者用于其它产生表示出现或存在不希望的副作用的目标血生标记物的治疗。
上述一次性的MSPR传感器器械适用于很多其它应用。例如，本发明可以适用于公用和私用饮用水测试。该MSPR传感器可以经官能化用于检测各种有机物和无机污染物、毒素、细胞生物体和病毒。该传感器可以位于供水系统内部，用于连续监测水流中的选定目标物。由于本发明的器械依赖于光检测器械，例如上述的CCD阵列90，因此产生可以进行评估并用于起动预设的响应，例如可感知的警报，的电信号。
基于这些传感器的器械可以开发用于检测生物危害物、有害的化学物质、神经毒素、爆炸物、或HIV或其它血液、血浆或其它体液中的病毒或细菌。本发明可使传感器足够小，足以便携和容易丢弃。在示例的实施方案中，该传感器芯片在50mm×50mm面积之内。特定的装置可以适用于机场或国内安全使用或用于水处理装置或工厂。根据其用途，可以包括与芯片的输入储存器相连的自动化系统，可以同时和在相同的芯片上分析其它化学物质。
本发明的MSPR传感器和微流体也可以适用于监控化学反应或生物反应。本发明的微芯片可以整合到流体流线中，或直接位于化学反应器或生物反应器中，以检测该反应的一些目标产物或用于检测反应器内可能影响反应的化学条件。该MSPR传感器可以用于优化反应条件或确定反应完成的时间。该特别的实施方案可以具有有益的应用，作为药物或化学制备的工艺控制的一部分，特别用于控制最终产物的纯度。
具有本发明的亚微米腔室表面-等离子体激元生物传感器的微流体器械克服了现有的传感技术和器械中的一些缺陷。将微流体器械的性质和MSPR珠子传感器的敏感性相结合通过在微流体芯片或有限空间内部增加检测能力，延伸了“芯片上实验室(lab-on-a-chip)”理想的界限。
目前的器械使用平坦的SPR或更老的ELIZA套件监控分子的相互作用和分子动力学。为了激发在平坦金属表面上的表面等离子体激元，必须遵守某些限制。特别地，光源必须是ρ-偏振的，而且为了在入射光子和表面偏振子之间产生最大的耦合，必须得到精确的临界入射角。本发明的传感器将表面等离子体激元的敏感性和球形传感器的谐振性质相结合。除了敏感性的增强外，本发明降低了对光源的几何学和偏振的限制。而且，该传感器具有平方微米或更小的底座，这使其非常适用于小型化(具有比现有技术的SPR平坦传感器小约1000倍的活性区域)，同时敏感性得以提高，而且整合到微流体结构中的能力得以改进。此外，与以反射形式工作的现有技术SPR传感器相比，本发明的MSPR传感器是以透射形式工作的。由于这一差别，引入本发明的MSPR传感器的传感微流体芯片可以放置在光源和检测器的传感窗之间非常近，导致非常紧凑的功能强大的和廉价的手提式器械。
目前微流体器械是用于处理少量分析物(从皮升到微升的范围)和用于非常精确控制流动和梯度的最尖端的技术。其适用于多次重复模制，可以以非常低的成本制备新的通道和装置构造，使其适用于单一用途的器械。这种性能使其方便地用于很多研究领域，特别是医疗应用。其适用于化学物质的整体并行操作，其可以节约大量地时间，特别是分析非常复杂的样品，例如但不局限于血浆、体液、毒性废物、食物等。唯一的时间限制是样品中特定的分子物种和结合到官能化的MSPR检测器的表面上的受体之间的反应时间。
本发明的MSPR传感器受益于微流体器械的这些性质。由于表面等离子体激元和传感器的几何形状的结合，其比现有器械的敏感性更高。目前的SPR传感器仅仅能检测大分子，而本发明的SPR传感器可以检测大分子和小粉子都具有良好的敏感性。传感器的小型化可以在单一芯片上实现控制、检测和分析，利用微流体器械用于进行多个并行的分析的能力，其可以缩短分析时间。而且，这些器械可以是一次性的，可以廉价地制备。
在示出的实施方案中，用金涂布该微球。考虑了可以用其它金属(例如银、铜或金合金)来涂布该球。然而，目前的实验表明在透射光中的光谱谐振仅对于金涂布的球或珠子发生，这被认为是由于表面等离子体激元耦合的作用。金涂层的膜厚度可以根据特定MSPR传感器的应用而调节。然而，已经发现膜厚度的增加至少对于对称(低频)模式会造成观察到的谐振发生蓝移。相反，也已经发现高频反对称模式的频率随着膜厚度的增加而红移。而且，本发明使用的球形几何形状优先激发对称SP模式，由此使红移作用最小化。实验进一步表明一些峰(例如对于涂布有150nm金层的770nm珠子在623nm处的峰)比其它峰对金属膜厚度的敏感性要小得多。
尽管在附图和前述描述中示出并描述了本发明，同样应当理解为在性质上是示例性的，而非限定性的。应理解仅提出的优选的实施方案，所有在本发明的范围内的变化、改进和进一步的应用也希望被保护。
在示例性的实施方案中，形成MSPR传感器的微颗粒的形状是球形的，以构成球形谐振腔室。然而，对于珠子的形状，也可以使用其它对称的几何形状。例如，该珠子可以是椭圆形状或多面体，例如十二面体，只要其形状能够维持等离子体激元驻波越过珠子表面运行的周期边界条件即可。
为示例性的实施例提出的各种材料和尺寸也可以改变，同时仍保持本发明的MSPR传感器和微流体系统所实现的功能。对MSPR传感器的材料和尺寸的改变仍必须满足本发明的MSPR传感器的主要目的，即用于检测目标物。而且，该改变必须不影响用于提高该微腔室传感器的SPR谐振特征的形状或几何谐振特征。本发明的MSPR传感器的检测容量取决于目标物与本身与SPR支持涂层相结合的耦合剂层的结合，最终取决于光响应的变化。
认为对于大多数目标物和耦合剂，施加光的波长并不重要。另一方面，SPR支持层从定义而言是波长依赖性的，由于在该层中发生表面等离子体激元谐振。因此，认为对MSPR传感器的材料和尺寸的改进集中在选择SPR支持层材料及其特征波长。在该示例的实施方案中，该材料为金，其具有510nm的波长。依照本发明的某些方面，该波长确定微米颗粒或珠子10和针孔16的直径。该珠子的直径也是介电材料的折射系数的函数。
在替代性的构造中，该SPR支持涂覆材料可以是银、铜或其它非金SPR支持材料，涂覆厚度有适当的变化。由于银和铜分别具有不同的SPR特征波长，因此其任一金属选作涂层14材料将导致微颗粒10和针孔16的直径的变化。依照本发明的某些实施方案，该微颗粒直径将经尺寸设计为约为银或铜涂层的特征波长，而针孔直径将固定在小于该波长。同样地，涂覆厚度可以用微颗粒和针孔直径上发生相当的改变来改变。
就MSPR传感器指定特征波长来讲，光源和透射光检测器(例如图14中的光源96和检测器90)可以相应选择。在某些实施方案中，白光可能是可接受的，而在一些实施方案中，选择中心位于MSPR传感器特征波长的单色光源可能是所需的。优选地，将该光检测器校准到该特征波长。
关于选择用于本发明的MSPR传感器和微流体芯片的材料，上述实施例和实施方案中的材料是示例性的。尽管描述MSPR珠子是由聚苯乙烯形成的，但也可以使用其它透光性材料，例如玻璃或氧化铝。选择的材料最优选地是介电性地，具有与聚苯乙烯相似的折射系数。当然，如上所述珠子材料的折射系数会影响MSPR以及SPR支持涂层的光学响应和谐振模式。
同样地，形成该MSPR珠子和基体周围的外壳或芯片的材料也可以与示例性的实施例和实施方案中确定的PDMS材料不同。优选地，该材料为基本透明的，对MSPR传感器的光学和谐振特征仅有最小的影响。
关于本发明的MSPR传感器和微流体传感器的应用或用途，前述实施例和实施方案并不用于限定。应当理解本发明允许广泛范围的目标物的快速和精确检测，无论是以小的试样体积或以连续的流动系统。本发明还可以在单一微传感器或以整体并行的传感器阵列中同时检测成百、成千或甚至成百万的目标物。因此，正如本发明可以大大提高目前的检测技术，其同样也将通向尚未预期的新技术和分析。

Claims (62)

1.用于检测测试流体中目标分析物、配体或分子的存在的传感器，包括：
透光性基体；
安装在所述基体表面上的表面等离子体激元谐振(SPR)元件；
所述SPR元件的暴露表面，具有能够与待检测的目标物相结合的材料的表面涂层；
经设置用于将光导向所述SPR元件中的光源；和
相对于所述SPR元件设置以检测透过其的光的检测器。
2.权利要求1的传感器，其中所述SPR元件包括以能够维持用于使等离子体激元谐振驻波越过其外表面运行的周期性边界条件的几何形状形成的透光性珠子。
3.权利要求2的传感器，其中所述珠子是由介电材料构成的。
4.权利要求3的传感器，其中所述珠子具有小于1μm的最大外尺寸。
5.权利要求2的传感器，其中该几何形状是球形。
6.权利要求2的传感器，其中所述珠子涂布有SPR支持材料层。
7.权利要求6的传感器，其中所述基体涂有相同的SPR支持材料的层。
8.权利要求6的传感器，其中该SPR支持材料为金。
9.权利要求8的传感器，其中该金层约为150nm厚。
10.权利要求8的传感器，其中该SPR支持材料包括对金和所述珠子和所述基体的材料都具有亲和性的材料层。
11.权利要求1的传感器，其中所述光源经设置以将基本垂直于所述基体的光线导入所述SPR元件中。
12.权利要求1的传感器，进一步包括由透光性材料形成并在所述暴露表面周围限定流体腔室的外壳，以及与所述腔室连接的流体入口和流体出口。
13.权利要求12的传感器，其中所述光源和所述探测器与所述外壳连接。
14.权利要求12的传感器，其中所述外壳由基本透明的模制聚合物构成。
15.权利要求1的传感器，其中在所述SPR元件和基体之间的界面处限定了针孔。
16.权利要求15的传感器，其中所述光源经设置以将光引导通过所述针孔进入所述SPR元件。
17.权利要求15的传感器，其中所述光源经设置以与所述针孔相反的方向将光线导入所述SPR元件中。
18.权利要求15的传感器，其中所述SPR元件和所述基体涂布有SPR支持材料层，所述层限定了在所述SPR元件和所述基体之间的界面处的所述针孔。
19.权利要求15的传感器，其中：
来自所述光源的光以预设波长提供；且
所述针孔具有小于该预设波长的直径。
20.权利要求19的传感器，其中该来自光源的光的预设波长是所述SPR元件的几何形状谐振特征的函数。
21.权利要求20的传感器，其中该来自光源的光的预设波长是所述SPR元件在所述暴露表面处的最大尺寸的函数。
22.权利要求21的传感器，其中：
所述SPR元件包括在所述暴露表面上的SPR支持材料涂层；和
该来自光源的光的预设波长是该SPR支持材料的谐振波长的函数。
23.权利要求22的传感器，其中该来自光源的光的预设波长是该SPR支持材料的所述涂层的厚度的函数。
24.权利要求22的传感器，其中该来自光源的光的预设波长是所述SPR元件的材料的光学性质的函数。
25.权利要求24的传感器，其中该来自光源的光的预设波长是所述SPR元件的材料的折射系数的函数。
26.权利要求1的传感器，进一步包括安装在所述基体上的多个所述SPR元件。
27.权利要求26的传感器，其中所述多个SPR元件的第一组彼此相邻设置以构成第一官能化位点，在所述第一官能化位点中的各SPR元件具有能够与待检测的第一分子相结合的第一表面涂层。
28.权利要求27的传感器，其中所述多个SPR元件的第二组彼此相邻设置以构成第二官能化位点，在所述第二官能化位点中的各SPR元件具有能够与和第一分子不同的待检测的第二分子相结合的第二表面涂层。
29.权利要求26的传感器，其中所述多个SPR元件包括多个元件组，各组限定了官能化位点，各官能化位点中的SPR元件具有能够与和通过其它官能化位点检测的目标物不同的待检测的相应目标物相结合的相同表面涂层。
30.用于安装在光源和检测器之间的用于检测测试流体中多种目标分析物、配体或分子的存在的传感器芯片，包括：
由透光性材料制成并限定与用于接收测试流体的流体入口和流体出口相连接的流体腔室的外壳；和对应于所述多种目标物的不同官能化的表面等离子体激元谐振(SPR)元件的阵列，所述阵列安装在设置在所述流体腔室内的共用基体上，用于接触所述腔室内的测试流体。
31.权利要求30的传感器芯片，进一步包括安装在所述外壳内用于将流体泵送通过所述腔室的微流体泵。
32.权利要求31的传感器芯片，其中所述流体入口包括微流体阀门。
33.权利要求30的传感器芯片，其中所述外壳进一步限定了至少一个与所述腔室相连接的其它流体入口。
34.权利要求30的传感器芯片，其中：
多个所述不同官能化的SPR元件设置成多个列；和
所述外壳限定了在所述多个列的每一个上的流动通道，用于流过能够对该列中的SPR元件官能化的化学物质，从而与该多种目标物的一种相结合。
35.用于检测测试流体中目标分析物、配体或分子的存在的传感器，包括：
透光性基体；
至少一个安装在所述基体上的珠子，所述珠子由透光性材料形成，并具有适于维持用于使表面等离子体激元驻波越过所述珠子的暴露表面运行的周期性边界条件的形状；和
涂布所述珠子和所述基体的暴露表面的表面等离子体激元谐振(SPR)支持材料，所述基体和所述珠子之间的界面限定了不含该SPR支持材料的针孔。
36.权利要求35的传感器，其中所述珠子在暴露表面处具有约等于该SPR支持材料的谐振波长的最大尺寸。
37.权利要求35的传感器，其中所述珠子具有小于1μm的最大尺寸。
38.权利要求35的传感器，其中所述珠子由介电材料制成。
39.权利要求35的传感器，其中该SPR支持材料选自金、银或铜。
40.权利要求39的传感器，其中该SPR支持材料是金，所述涂层约150nm厚。
41.权利要求35的传感器，其中所述针孔具有小于该SPR支持材料的谐振波长的直径。
42.用于安装在光源和检测器之间的用于检测测试流体中目标分析物、配体或分子的存在的传感器芯片，包括：
透光性基体；
安装在所述基体上的官能化表面等离子体激元谐振(SPR)元件，所述SPR元件经官能化以与目标物相结合；
由透光性材料制成且限定用于测试流体在所述SPR元件上流动的流体腔室的外壳，所述外壳进一步限定与所述腔室相连接的流体入口和流体出口；和
至少一个与所述外壳相关联且可操作以控制通过所述腔室的流体流动的微流体部件。
43.权利要求42的传感器芯片，其中所述微流体部件是微流体泵。
44.权利要求43的传感器芯片，其中所述流体入口包括微流体阀门。
45.权利要求42的传感器芯片，其中所述外壳进一步限定至少一个与所述腔室相连接的其它流体入口。
46.权利要求45的传感器芯片，其中所述其它流体入口包括微流体阀门。
47.权利要求42的传感器芯片，其中所述微流体部件包括过滤器。
48.权利要求42的传感器芯片，其中所述微流体部件包括预浓缩模块。
49.提供用于检测测试流体中两种或更多种不同目标分析物、配体或分子的存在的官能化微传感器的方法，包括：
以和每一目标物对应的两个或更多个带的形式提供安装在共用透光性基体上的表面等离子体激元谐振(SPR)元件；
限定与所述SPR元件的两个或更多个带中的每一个对应的流体流动通道；
使能够将相应带中的SPR元件官能化以与相应目标物相结合的官能化化学物质流动通过每个流体流动通道。
50.提供用于检测测试流体中两种或更多种不同目标分析物、配体或分子的存在的官能化微传感器的方法，包括：
提供安装在共用透光性基体上的多个表面等离子体激元谐振(SPR)元件；和
将每个SPR元件单独地暴露于能够使该SPR元件官能化以与相应的目标物相结合的化学物质。
51.权利要求50的方法，其中暴露每个SPR元件的步骤包括使用微测位仪来向其施加该官能化化学物质。
52.权利要求50的方法，其中暴露每个SPR元件的步骤包括在所述多个SPR元件上提供掩膜。
53.权利要求50的方法，其中暴露每个SPR元件的步骤包括形成包括多个相邻SPR元件的位点，其中在该位点中的所有SPR元件被共同官能化。
54.检测患者中败血症的方法，包括以下步骤：
提供微传感器，所述微传感器具有安装在透光性基体上的表面等离子体激元谐振(SPR)元件的阵列，至少一组一个或更多个SPR元件经官能化以检测至少一种指示败血症的相应分子，并具有光源和经设置以感应通过该SPR元件阵列的光的检测器，还具有限定在SPR元件阵列之上的流体腔室的外壳；
使患者的血液流动通过在官能化SPR元件的阵列之上的流体腔室；和
使用该SPR元件的阵列和检测器，检测该至少一种相应分子在血液中的存在。
55.权利要求54的方法，其中该流体腔室与患者体内设置的导管相连接。
56.权利要求54的方法，其中：
两组或多组SPR元件经官能化用于检测两种或更多种指示败血症的相应的不同分子；和
该检测步骤包括检测所述不同分子中一种或更多种的存在。
57.权利要求54的方法，其中该检测步骤包括定量检测相应的分子。
58.用于检测测试流体中多种目标分析物、配体或分子的存在的传感器，包括：
透光性基体；
多个无规则分布在所述基体的表面上的表面等离子体激元谐振(SPR)元件；
每个所述SPR元件的暴露表面，具有能够与待检测的相应一种目标物相结合的材料的表面涂层；
经设置用于将光导入所述SPR元件中的光源；和
相对于所述SPR元件设置以检测透过其的光的检测器。
59.权利要求58的传感器，其中所述检测器包括像素阵列，每个像素可操作以产生响应于所述像素处光检测的输出。
60.权利要求58的传感器，其中所述多个SPR元件中的两组或多组限定两个或更多个位点，组内的每一SPR元件用能够与共同的一种目标物相结合的共同表面涂层进行共同地官能化。
61.权利要求60的传感器，其中：
所述检测器包括像素阵列，每个像素可操作以响应于所述像素处的光检测产生输出；和
所述检测器相对于所述基体设置以使得至少一个像素对准所述两个或更多个位点中的每一个。
62.提供用于检测测试流体中两种或更多种不同目标分析物、配体或分子的存在的官能化微传感器的方法，包括：
在共用透光性基体上无规则分散多个表面等离子体激元谐振(SPR)元件；
在该基体上限定两个或更多个位点，其对应于所述两种或更多种目标物中的每一种并将该两个或更多个位点的每一个内的每个SPR元件官能化以检测相应的目标物；
提供具有与该基体上的多个SPR元件对准的像素阵列的检测器；和
选择对准该两个或更多个位点中的每一个的一个或更多个像素，其输出表示相应目标物的检测。
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