CN104789634B - 一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法 - Google Patents

一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法，该方法包括如下步骤：1）制备图案化纤维电纺接收板，利用光刻蚀技术和直流磁控溅射技术，制备具有图案化金属银层的接收板；2）制备图案化电纺纤维，利用步骤1）所得物进行静电纺丝；3）制备PDMS腔体；4）将步骤2）和步骤3）所得物用等离子处理进行连接；5）将原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，再将药物泵入,于药物泵入后20天内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行刷选。本发明实现了细胞在较小腔体内的正常生长的同时还具备筛选药物和重复使用的效果，具有高精确度和高重复性。

Description

一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法
技术领域
本发明属于药物筛选领域，具体涉及一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法。
技术背景
药物筛选是从天然或合成的化合物中筛选出高效的新药或先导化合物。药物筛选的过程是对化合物进行药物活性实验的过程，而对化合物的活性实验已从早期的验证性实验逐渐转变成筛选性实验，是现代药物开发过程中测试和获取特定生理活性化合物的一个重要步骤。
在现有技术中，双杂交药物刷选技术、重组受体药物刷选技术以及转基因动物模型药物筛选技术均存在技术步骤繁杂、检测成本高和准确度差的缺点。
近年来，芯片药物筛选技术日益受到研究者的亲睐，其具有集成化、自动化、灵敏度高和效率高的优点。然而，现有技术中的芯片均具有加工难度高、所用原料稀缺或原料成本高昂的问题，使得药物筛选芯片一直难以得到广泛应用。
特别的，利用电纺纤维制备药物筛选体系，尤其是芯片筛选体系，一直以来都面临着电纺纤维难以制备出特定阵列，以及电纺纤维难以与芯片尺寸贴合的技术问题。另外，如何保证电纺纤维制备的芯片具有高度重复性和高筛选精确性同时，还能使其具备所用试剂少以及具备长期检测能力，成为本领域人员所急切研究的。
尤其是，为了使得电纺纤维制备的芯片的筛选结果更加贴近于实际情况，需得利用细胞作为检测载体。因此如何确保细胞在芯片中的狭小空间中正常生存并具备长期检测药物的能力，成为本领域研究人员首要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明提供了一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法，该方法包括如下步骤：
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为折线状，折线宽度为 20 μm-100 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备折线状图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为200-400 nm；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；
3）将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为40-300μm、高为30-100μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
3）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 或N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
4）将3×106-8×106个原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.1-0.3 ml/h；再将0.1-1000μM的药物泵入,于药物泵入后20天内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行筛选；
所述药物包括奎尼丁、红霉素、甲磺胺心定、氟哌啶醇中的一种。
如本发明的一个实施例所示，选用直径为200-400 nm的电纺纤维，并将电纺纤维膜的图案设置为折线状时，原代小鼠心肌细胞可以在电纺纤维膜上进行正常生长。发明人还惊奇的发现，在此图案的电纺纤维上，原代小鼠心肌细胞可以在宽为50-300μm、高为20-50μm的长方体腔体中正常生长。更为重要的是，药物筛选实验结束后，将药物洗脱，小鼠原代心肌细胞还可以恢复用药前的生长状态。上述令人惊奇的实验结果，为本发明的开发提供了重要基础。本领域技术人员还需理解的是，本发明中所列举的药物只是证明本发明具有高精度药物筛选的功能，不能理解为所列举药物对本发明的适用范围有限定作用，应理解本发明还适用于其他药物的筛选。
同时，本发明可以使得图案化纤维膜与玻璃基底紧密贴合，以及可以使得不同图案化纤维膜与PDMS腔体的大小完全吻合，使得培养基和药物完全的与细胞接触，避免其从纤维与腔体的缝隙流过，造成检测的误差以及纤维膜与基底发生位移，确保了检测的精确性和可重复性。
因此，值得指出的是，任何在本发明的基础上，利用本领域的常识，对纤维材料和纤维膜的图案进行可预期的替换，均不背离本发明的精神，均属于本发明的保护范围。
另外，还需指出的是，本发明PDMS腔体的尺寸的设置，只是为了获得较好技术效果，不应理解为对所预期技术效果获得与否的限定，应理解为利用其它尺寸的腔体所得的技术效果要差一些而已。
优选的，所述步骤1）中沉积的金属银的形状为折线形，折线宽度为 20 μm-100 μm。
当金属银的形状为折线形时，所得电纺纤维膜的形状也为折线形。如本发明的一个实施例所示，当电纺纤维膜的形状为折线形时，细胞的生长行为最好，对药物的筛选效果也最好。
所述步骤2）中，进行电纺时，电压为15-25 KV，流速为0.5-1.0 ml/h。
优选的，所述步骤2）中，纤维的直径为300 nm。当纤维的直径为300 nm时，细胞的生长行为最好，对药物的筛选效果也最好。
优选的，所述步骤2）中的医用高分子聚合物为聚己内酯，所述有机溶剂为丙酮。当纤维为聚己内酯纤维时，细胞的生长行为最好，对药物的筛选效果也最好。
优选的，所述步骤3）中的模具的宽为100μm，高为70μm。
更优选的，所述步骤3）中的模具的宽为50μm，高为100 μm。当模具的宽为50μm，高为100 μm时，进行药物筛选时，所需要的试剂更少，所需芯片的体积更小，更加利于检测成本的降低。
值得指出的是，目前现有技术中，是很难想象出可以在宽为50μm，高为100 μm的腔体内，用电纺纤维膜来进行药物筛选。在如此小的腔体内进行药物筛选，是本发明对本领域技术的一个更为重大的贡献。
优选的，所述步骤5）中，用于接种的原代小鼠心肌细胞的数目为6×106个。
优选的，所述步骤5）中，培养基的流速为0.2 ml/h。
本发明的有益效果：
1、通过对纤维尺寸、纤维膜图案的选择，实现了细胞在较小腔体内的正常生长的同时还具备筛选药物和重复使用的效果，具有高精确度和高重复性的技术优点；
2、本发明方法实施条件简单、所用原料易得、所用技术成熟易行，具有较大市场实用价值，为药物筛选的集成化、简易化作出了重大贡献。
附图说明
图1为本发明所得图案化纤维；
图2为利用本发明图案化纤维共培养心肌细胞表达的肌钙蛋白，其中troponin 1为肌钙蛋白1；
图3为利用本发明图案化纤维共培养心肌细胞表达的连接素-43蛋白及α-肌动蛋白的免疫染色荧光图；
图4为在本发明中心肌细胞在多次药物作用和洗脱后的跳动曲线图，其中“At day10”意为“在第十天”，“At day 20”意为“在第二十天”，“Add haloperidol”意为“加氟哌啶醇”，“After 5min”意为“五分钟后”，“After 15min”意为“15分钟后”，“After 10min”意为“十分钟后”，“Wash out”意为“洗脱药物”，其中“a、b、c、d、e、f、g、h”代表操作顺序，由a开始至h进行操作。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
实施例1
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为折线状，图案宽度为 80 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为400nm；
所述医用高分子聚合物为聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为100μm、高为70μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）通过等离子处理：打开设备真空室，装入前面制备好的沉积有图案化电纺纤维的玻璃片和PDMS腔体，开启射频驱动源灯丝电源，开启O2 气瓶瓶阀，等离子体处理30秒后，将步骤2）和步骤3）所得物紧密贴合，使其连接；
5）将8×106个原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.3 ml/h；再将0.1-1000 μM的药物泵入,于药物泵入后60分钟内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行刷选。筛选的药物为奎尼丁。
实施例2
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为折线状，图案宽度为 40 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为300nm；
所述医用高分子聚合物为聚己内酯，所述有机溶剂为丙酮和二甲基甲酰胺（9:1v/v）；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为50μm、高为100 μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）通过等离子处理：打开设备真空室，装入前面制备好的沉积有图案化电纺纤维的玻璃片和PDMS腔体，开启射频驱动源灯丝电源，开启N2气瓶瓶阀，等离子体处理1分钟后，将步骤2）和步骤3）所得物紧密贴合，使其连接；
5）将6×106个原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.2 ml/h；再将0.1-1000 μM的药物泵入,于药物泵入后60分钟内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行刷选。筛选的药物为红霉素。
实施例3
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为折线形，图案宽度为 20 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为200nm；
所述医用高分子聚合物为聚氨酯，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为40μm、高为20μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）通过等离子处理将步骤2）和步骤3）所得物连接；
5）将3×106个原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.1ml/h；再将0.1-1000 μM的药物泵入,于药物泵入后60分钟内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行刷选。筛选的药物为甲磺胺心定。
实施例4
利用实施例1方法，在心肌细胞培养10天后，测定心肌细胞的跳动频率，加入1 μM氟哌啶醇后作用15分钟，然后洗掉氟哌啶醇，10分钟后测定其心肌跳动频率，比较加入药物前的心肌跳动频率和洗脱药物后的心肌跳动频率。
实施例5
利用实施例2方法，在心肌细胞培养20天后，分别测定心肌跳动频率，之后加入10μM氟哌啶醇作用15分钟，然后再洗掉氟哌啶醇，10分钟后测定其心肌跳动频率，比较加入药物前的心肌跳动频率和洗脱药物后的心肌跳动频率。
实验例1
通过实施例1方法得到奎尼丁药物的EC50为 51.31 µM，该数据和将0.1-1000 μM的奎尼丁通过小鼠灌胃实验得到的EC50为57.48 µM较为接近，而采用普通的没有图案的电纺纤维膜用于奎尼丁药物的EC50为28.44 µM。
实验例2
通过实施例2方法得到红霉素药物的EC50为 45.78 µM，该数据和将0.1-1000 μM的红霉素通过小鼠灌胃实验得到的EC50为48.66 µM较为接近，而采用普通的没有图案的电纺纤维膜用于红霉素药物的EC50为20.39 µM
实验例3
通过实施例3得到甲磺胺心定药物的EC50为 105.45 µM，该数据和将0.1-1000 μM的甲磺胺心定通过小鼠灌胃实验得到的EC50为110.72 µM较为接近，而采用普通的没有图案的电纺纤维膜用于甲磺胺心定药物的EC50为75.67 µM
实验例3
利用实施例1方法，发现在第10天时，加入1 μM氟哌啶醇后，心肌细胞跳动频率在药物作用前后，分别为115次/min 和112次/min，而采用普通的没有图案的电纺纤维膜用于药物洗脱实验，心肌细胞跳动频率在药物作用前后，分别为104次/min 和63次/min。
实验例5
利用实施例2方法，在20天时，心跳频率为 110 次/min，在10 μM氟哌啶醇的作用后，心肌细胞的跳动频率为 106 次/min，而采用普通的没有图案的电纺纤维膜用于药物洗脱实验，心肌细胞跳动频率在药物作用前后，分别为98次/min 和54次/min。

Claims (9)

1.一种具有高精确性和高重复性的药物筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为折线状，折线宽度为 20 μm-100 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备折线状图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为200-400 nm；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；
3）将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为40-300μm、高为30-100μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 或N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将3×106-8×106个原代小鼠心肌细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.1-0.3 ml/h；再将0.1-1000 μM的药物泵入,于药物泵入后20天内记录心肌细胞跳动频率，得到EC50值，根据EC50值对药物进行筛选；
所述药物包括奎尼丁、红霉素、甲磺胺心定、氟哌啶醇中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中沉积的金属银的形状为折线状，折线宽度为 20 μm-100 μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，进行电纺时，电压为15-25KV，流速为0.5-1.0 ml/h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，纤维的直径为300 nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的医用高分子聚合物为聚己内酯，所述有机溶剂为丙酮。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的模具的宽为100μm，高为70μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的模具的宽为50μm，高为100μm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中，用于接种的原代小鼠心肌细胞的数目为6×106个。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中，培养基的流速为0.2 ml/h。
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