CN105004870B - 一种可用于评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的生物芯片及其评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于药物、生物材料以及医疗器械神经毒性评价的生物芯片及其评价方法，涉及微加工与神经毒性评价技术领域。该生物芯片由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔的微通道为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔。本发明的生物芯片及其评价方法，能够在体外实现高通量、高灵敏度的评价药物、生物材料或医疗器械的神经毒性。

Description

一种可用于评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的生 物芯片及其评价方法

技术领域

本发明涉及微加工和神经毒性评价技术领域，具体涉及一种可用于评价药物、生物材料及医疗器械神经毒性的生物芯片及其评价方法。

背景技术

目前神经毒性的金标准是经济合作与发展组织制定的OECD TG 426。尽管动物行为模型可有效筛选神经毒物，但由于动物体内通常一个通路有多个并行通路，一个通路受损，其他通路仍可替代它继续正常工作，单靠动物行为显然无法排除化学物质的潜在神经毒性。另一方面，由于体内情况复杂，不利于研究发育神经毒物的毒性作用机制。而且，动物实验与体外细胞研究相比，还有其固有弱势，如周期长、成本高、动物试验带来的伦理问题等。因此，亟待建立更有效的神经毒性体外检测方法，弥补动物实验的不足之处。

神经突生长法是目前使用最广泛的体外神经毒性评价方法，该方法基于传统的细胞培养方法，将细胞随机接种于培养皿或培养板，无法精确模拟神经元在体内复杂的化学和物理拓扑结构引导下的路径选择，所以只能以神经突长度及生长率等基本参数评价化学物质的神经毒性，无法研究化学物质对神经元在特定拓扑结构引导下的轴突路径选择的抑制作用，而正确的轴突路径选择过程在神经系统发育过程是至关重要的。

在神经系统发育过程中，正确的神经网络的建立包含了一系列复杂的步骤，这些步骤必须在时间和空间上高度协调一致才能形成正确的神经元连接，其中包括轴突与目标神经元的正确路径选择、突触形成以及突触功能活性初始化。多种神经毒性相关的功能障碍与神经网络中神经元之间的错误连接密切相关，如自闭症，帕金森病及老年痴呆症等。有研究表明长期接触甲基汞和铅等发育神经毒物可导致这些神经系统疾病，同时有研究指出，在自闭症和精神分裂症等发育神经系统疾病患者体内发现毒素可导致神经细胞连接错误。

至今，动物行为模型仍是研究神经连接错误导致神经毒性的唯一方法。但因体内系统复杂，动物实验不能在细胞和分子水平反映神经毒物导致神经系统疾病的微妙变化，而且常常不能揭示毒性机制。因此，仅依赖于动物行为模型，无法排除毒物存在的在个体发育过程中造成不明显临床症状，却可在晚年导致神经系统退行性变的潜在风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于评价药物、生物材料及医疗器械神经毒性的生物芯片及其评价方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种可用于评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的生物芯片，由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔11的微通道14为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔12和13。

作为上述生物芯片的进一步改进，微单元的拐角A为：0º< A≤90º，其中，拐角A定义为微单元的两个连接引导微孔的微通道之间的夹角的1/2。

作为上述生物芯片的进一步改进，微孔直径D为10～100µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微通道宽度W为1～40µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微结构整体深度H为2～60µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微通道长度L为10～1000µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，通过在微单元表面接枝聚赖氨酸和L1蛋白，可改善生物芯片的活性。

由于研究对象不同，微结构各部分尺寸参数并不唯一固定，以上为微结构各部分尺寸可能有效的参数范围。

一种评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的方法，包括如下步骤：

1)通过激光引导细胞微排列系统将单个神经元放置于生物芯片的目标微孔中；

2)实验组：先用含药物、生物材料或医疗器械浸提液的细胞培养液进行培养，再洗去原培养液，用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态；

3)对照组：用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态；

4)对比神经元轴突路径选择情况，评价药物、生物材料或医疗器械的神经毒性。

其中，引导微孔中的一个放置有轴突吸引或排斥微球。

其中，对于步骤4）中的神经元轴突路径选择情况，正确的轴突路径选择被定义为：（1）引导微孔中有轴突吸引微球时，神经元轴突转向吸引微球；（2）引导微孔中有轴突排斥微球时，神经元轴突转向排斥微球反方向；（3）引导微孔中无轴突吸引或排斥微球，轴突转向任意一侧或分叉至两侧。

本发明的有益效果是：

本发明的生物芯片，可以精确模拟神经元在体内复杂的化学和物理拓扑结构引导下的路径选择。通过接枝聚赖氨酸和L1蛋白，可以很好促进轴突的生长。

本发明方法，在体外构建了一种基于单神经元轴突路径选择的神经毒性评价模型，与传统的动物实验及神经突生长法相比，具有高通量、高灵敏度等显著优点，排除了低剂量神经毒物的潜在风险。

附图说明

图1 生物芯片及整个评价系统结构示意图。

图2 实施例中的PDMS生物芯片局部放大图。

图3 实施例中的Y型微单元结构示意图。

图4 实施例中的T型微单元结构示意图。

图5 实施例中的微单元表面不接枝L1分子和接枝L1分子神经元生长情况对照图。

图6 实施例中Y型微单元和T型微单元中神经元轴突路径选择结果图。

图7 实施例中生物芯片的评价结果与传统神经突生长法的评价结果对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

一种可用于评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的生物芯片，由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔11的微通道14为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔12和13。

作为上述生物芯片的进一步改进，微单元的拐角A为：0º< A≤90º，其中，拐角A定义为微单元的两个连接引导微孔的微通道之间的夹角的1/2。

作为上述生物芯片的进一步改进，微孔直径D为10～100µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微通道宽度W为1～40µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微结构整体深度H为2～60µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，微通道长度L为10～1000µm。

作为上述生物芯片的进一步改进，通过在微单元表面接枝聚赖氨酸和L1蛋白，可以很好促进轴突的生长，改善生物芯片的活性。

由于研究对象不同，微结构各部分尺寸参数并不唯一固定，以上为微结构各部分尺寸可能有效的参数范围。

细胞培养液为业内公知的，可以根据需要进行相应的调整，以保证神经元的正常生长。

生物芯片的制备：

一种可用于评价药物、生物材料及医疗器械神经毒性的生物芯片的制造方法，包括：

1)在衬底材料上通过光刻技术制作微单元阵列模板；

2)使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；

3)将PDMS芯片贴附于盖玻片上，完成PDMS弹性芯片与玻璃基底的集成；

4)PDMS芯片的亲水性及生物活性后处理。

步骤1）在衬底材料上通过光刻技术制作微单元阵列模板，包括：

涂胶，将光刻胶SU-8 2025漓在衬底材料上，利用涂胶机完成涂胶；软烘焙，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；光刻，利用光刻机制作出微单元阵列模板；光刻后烘焙，对曝光后的衬底材料进行两级加热；显影，利用显影液将硬烘焙后的衬底材料上的光刻胶中没有固化的光刻胶去除；硬烘焙，显影后衬底材料再加热，使模板更坚固。

其中，所述涂胶机的转速为4000 rpm，所述涂胶机的转动时间为60 s，涂覆光刻胶的厚度为20 µm；所述两级加热包括：60～70℃温度下烘焙5分钟，90～100℃温度下烘焙10分钟；所述光刻时间为20 s；所述显影液为SU-8显影液；所述硬烘焙温度为135℃。

步骤4）PDMS芯片的亲水性及生物活性后处理，包括：

灭菌处理，120℃高温高压灭菌30分钟；亲水性处理，氧等离子体处理10分钟；聚赖氨酸接枝，浸于1 ml的0.1 mg/ml的聚赖氨酸溶液中常温过夜；聚赖氨酸清洗，去离子水洗三遍，最后一遍去离子水保留过夜；表面接枝L1蛋白，吸除前次清洗的去离子水，浸入1ml25µg/ml的L1蛋白溶液，37℃作用4小时，最后接种细胞前将L1蛋白吸除并加入全培养液。

其中，全培养液为含10% FBS、2% B27、1% 双抗、100 ng/ml NGF 7s的M199培养基。

生物芯片的评价：

对上述生物芯片进行不同剂量甲基汞溶液神经毒性评价的方法，包括：

1)将单个鸡胚前脑神经元（E6-E8）经激光引导细胞微排列系统放置于目标微孔中，两侧引导微孔中不放置轴突吸引或排斥微球；

2)实验组：鸡胚前脑神经元接种16小时后，吸除原来的全培养液，并用不含甲基汞的M199溶液洗一次，洗去原来培养液中的血清残留，加入不同浓度甲基汞M199溶液作用4小时后，用M199培养液洗一次，洗去甲基汞溶液残留，然后换回全培养液，细胞恢复48小时后，光学显微镜下观察、统计目标微孔中神经元轴突路径选择状态；

3)对照组：鸡胚前脑神经元接种后，直接用全培养液培养，光学显微镜下观察、统计目标微孔中神经元轴突路径选择状态；

4)将实验组神经元轴突路径选择成功率与对照组进行对比，评价药物、生物材料及医疗器械的神经毒性。

评价结果：

图5为实施例中的微单元表面不接枝L1分子和接枝L1分子神经元生长情况对照图，其中：（A）不接枝L1分子；（B）接枝L1分子。

图6为实施例中Y型微单元和T型微单元中神经元轴突路选择结果图，其中：（A）T型，分叉至双侧；（B）T型，转向单侧；（C）Y型，分叉至双侧；（D）Y型，转向单侧。

图7为实施例中生物芯片的评价结果与传统神经突生长法的评价结果对比图，其中：（A）传统神经突生长法评价结果；（B）生物芯片评价结果（*p<0.05，卡方检测）。由图7可知，传统神经突生长法对甲基汞神经毒性的检测下限是50nM，而具有单神经元轴突路径选择模型的生物芯片对甲基汞神经毒性的检测下限是5nM，可见本发明所述的生物芯片及其评价方法，比传统神经毒性评价方法灵敏度更高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种评价药物、生物材料以及医疗器械神经毒性的方法，包括如下步骤：

1）通过激光引导细胞微排列系统将单个神经元放置于生物芯片的目标微孔中；

2）实验组：先用添加有待测物或待测物浸提液的细胞培养液进行培养，再洗去原培养液，用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态；

3）对照组：用全培养液培养，观察记录目标微孔中单神经元轴突路径选择状态；

4）对比神经元轴突路径选择情况，评价药物、生物材料或医疗器械的神经毒性；

其中，所述生物芯片由具有不同拐角的微单元阵列组成，微单元由三个微孔及连接三个微孔的微通道组成，微单元以连接目标微孔的微通道为对称轴左右对称，两侧微孔为引导微孔，微通道长度L为10～1000µm，微单元拐角A为0º<A≤90º，微孔直径D为10～100µm，通道宽度W为1～40µm，微结构整体深度H为2～60µm，微单元表面接枝有聚赖氨酸和L1蛋白，引导微孔中的一个放置有轴突吸引或排斥微球。