CN114260034B - 一种模式动物无麻醉定向包埋方法及其系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种模式动物无麻醉定向包埋方法及其系统，该系统包括斑马鱼微流控芯片和液滴阵列芯片，所述斑马鱼微流控芯片包括微流控芯片基片和盖片；所述微流控芯片基片和盖片以非永久性结合的方式连接。所述微流控芯片仅需要简单的降温冷却即可以实现斑马鱼胶囊的制备，得到的斑马鱼胶囊与无固定斑马鱼的活力无差异，成活率高。所述斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统构建简单，系统小型化，使用方便成本低，无需外围设备辅助，药物筛选实验用量从mL级降低至μL级，实现了真正意义上的高通量、多表型、低消耗。
Description
技术领域
本发明属于模式动物包埋技术领域，具体涉及一种模式动物无麻醉定向包埋方法及其系统。
背景技术
相关技术中，利用斑马鱼进行药物筛选技术的主流手段之一为微流控芯片技术，微流控芯片利用连续性的逆向水流，结合其特别的微结构设计，可以对斑马鱼进行固定，微流控芯片的使用以及其在模式动物固定方面的用途大大降低了斑马鱼的损伤。但相关技术中的微流控芯片需要持续性供水，从而导致不断的投放或准备大量的药物溶液，以实现药物筛选试验的严谨性，而在药物研发过程中，一般的待筛选药物价格均较为昂贵或产出量较小，无法长期维持大规模试验的需求，甚至在一定程度上不能满足高通量的使用需求，这对药物筛选的准确性和试验周期带来了巨大的挑战，因此，亟需开发新的技术以降低药物筛选用量。
传统的琼脂糖包埋固定技术虽然在一定程度上避免了药物的浪费，但是这种包埋方法无法做到斑马鱼方位的精准定向，从根本上无能满足特定器官的精确成像，而且人工琼脂糖包埋固定费时费力，模式生物耗损率高，难以进行高通量的筛选，筛选效率极其低下。而且，即便采用手动方式成功调整斑马鱼方位，其也容易在特定器官进行观察时对斑马鱼造成不可逆的伤害，且这种手动调整的精准度也存在不可预期性，无法实现真正意义上的比对要求。
因此亟需开发一种低成本、小型化、简单化、快速的定向固定斑马鱼的技术，并同步实现微量药物投入的药物筛选系统对于模式动物药物筛选领域具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种模式动物无麻醉定向包埋方法及其系统，能够快速无麻醉的定向包埋斑马鱼，其基于流体动力学原理实现斑马鱼的定向固定包埋并同时保证其具有较好的生命活力；结合微液滴技术，该系统还可以实现基于定向固定包埋的斑马鱼进行药物筛选，减少药物使用量，完成大规模低成本的药物检测。
本发明的第一个方面，提供一种斑马鱼微流控芯片。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述斑马鱼微流控芯片包括微流控芯片基片和盖片；所述微流控芯片基片和盖片以非永久性结合的方式连接。
在本发明的一些优选实施方式中，所述微流控芯片基片的材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。所述盖片的材料包括玻璃。
在本发明的一些实施方式中，非永久性结合的方式是指区别于PDMS和玻璃基底结合后无法再分开的“永久性结合”。
“永久性结合”和“非永久性结合”在操作上的差别在于：前者需要对两个接触面都进行表面处理(等离子)且后续需要在接触面边缘再旋涂一圈PDMS进行永久性封装；而后者只需要对玻璃基底进行表面处理，PDMS的接触面不需要，这种结合方式既可以满足在向微流体通道装载斑马鱼时不会渗水或者溢出，又可以使得本发明中微流控芯片的PDMS层能够在一个相对很轻的力的作用下即可掀开。
所述非永久性结合的方式根据具体微流控芯片基片和盖片的材料选择，会产生多种不同的非永久性结合方式，包括非永久性键合。
在本发明的一些优选实施方式中，所述微流控芯片基片的材料为PDMS，所述盖片的材料为玻璃，非永久性结合为非永久性键合，具体键合方法为：将PDMS微流控芯片基片等离子处理4min后，将玻璃盖片上贴合在PDMS微流控芯片基片上，只需要对玻璃基底进行表面处理，PDMS的接触面不需要。由于PDMS层这种贴合方式是非永久性键合，因此，在后面的步骤中能够实现将PDMS层从玻璃基底上的剥离。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道；所述进液通道和出液通道的宽度均为800～900μm；所述进液通道的高度高于所述出液通道的高度；所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；所述进液通道与所述固定腔、所述出液通道与所述限制通道的连接处均为圆角；所述固定腔靠近进液通道一端的宽度和高度均为800～850μm，长度长于斑马鱼体长；所述固定腔的另一端顶面为弧形结构，高度由800～850μm缩低至200～250μm，所述弧形结构的长度为1～1.2mm；所述限制通道的高度顺流体流动方向由250μm缩低至150μm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述进液通道和出液通道的宽度均为800μm；固定腔靠近进液通道的部分宽度和高度均为800μm；弧形结构的高度由800μm缩低至210μm，弧形结构的总长度为1mm。
限制通道高度顺流体流动方向由250μm缩低至180μm，然后进一步缩低至150μm，以形成高度差，250μm缩低至180μm保证了斑马鱼不会随着水流继续向前游动，同时也保证了琼脂糖送入芯片后能够将多余的液体排出通道，实现斑马鱼被有效定向封装在琼脂糖内。
弧形结构主要用于固定斑马鱼，在利用该微流控芯片固定斑马鱼时，斑马鱼会以顺流体流动方向头部在前的姿态进入固定腔室，因此，将固定腔顺流体流动方向的末端设计成弧形结构，从而使其与斑马鱼头部的生理结构相吻合，能够确保把鱼的头部固定在弧形结构内，实现了斑马鱼的定向固定，且对斑马鱼没有伤害。
在本发明的一些优选实施方式中，所述进液通道的高度为800～900μm，所述出液通道的高度为120～180μm。在本发明的一些更优选实施方式中，所述进液通道的高度为800μm，所述出液通道的高度为150μm。
为避免尖锐拐角对鱼造成不可逆转的伤害，固定腔与进液通道的连接处被设计为圆角，圆角半径为1mm，限制通道另一端与出液通道连接，连接处的圆角半径为150μm。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述斑马鱼微流控芯片可采用基于高精度计算机数控(CNC)加工或者3D打印等本领域常规技术制备得到。
在本发明的一些优选实施方式中，所述斑马鱼微流控芯片是利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)从模具上复制并使用打孔器开孔制备得到的。具体制备方法为：使用CNC数控机床在金属板(比如普通铜板)上进行加工，制作微流控芯片模具。将制作完成的模板彻底清洗，保证缝隙处没有污渍后，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对其进行浇注。浇注完成后放置在真空泵内完全去除气泡，然后80℃环境下烘烤4-6h。待PDMS完全固化后，取出并冷却至室温，再将其从模具上脱下来，根据入口和出口的位置均采用1.6mm的打孔器进行打孔，得到PDMS微流控芯片基片。按照设计的微流控芯片尺寸，采用本领域常规方法制备玻璃微流控底片；用等离子处理PDMS微流控芯片基片和玻璃盖片的结合面后，将二者非永久性结合在一起，完成微流控芯片的制备。
现有技术中所有报道的包埋技术均无法实现无麻醉处理及特定方向调控。传统的固定斑马鱼方法是利用琼脂糖通过手动的方式对其进行直接包埋固定，可是这种方法固定的斑马鱼身体朝向往往不统一，更无法按照需求实现定向固定。若想实现某一特定器官的观察，实验者需要人工调整斑马鱼身体朝向，这种直接触碰调整极易对幼苗造成不可逆的伤害，且人工固定的方式费时费力。而本发明则是通过微流控芯片的特殊结构化设计，实现了斑马鱼快速无麻醉定向包埋以平行的方式快速制备大量的“斑马鱼胶囊”，以便进行后续的基于斑马鱼的实验和观察。
本发明第二个方面，提供一种斑马鱼胶囊的制备方法，包括如下步骤：
将斑马鱼输送至本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片中，并确保斑马鱼以头部向前的姿态朝向流体流动方向固定于斑马鱼微流控芯片固定腔的弧形结构内，注入胶囊液，固化形成斑马鱼胶囊。
根据本发明第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述胶囊液包括琼脂糖溶液和Gel-Ma(水凝胶)。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他生物相容性好、透气透水性好且受温度调控的水凝胶或者琼脂糖作为胶囊液使用。
在本发明实施例中，为了实现对斑马鱼的活体包埋，其可选择的包埋琼脂糖温度不可过高，因此，必须选用低凝胶温度的琼脂糖完成斑马鱼胶囊的制备。
在本发明的一些优选实施方式中，所述胶囊液为A0701琼脂糖溶液(购自Sigma)，该琼脂糖与普通琼脂糖相比，成胶温度低，在30℃时仍为液态，能够像培养液一样流入芯片内部将斑马鱼包埋。当然，本领域技术人员也可以采用其他性质等同的物质用于替代A0701。
在本发明的一些优选实施方式中，所述斑马鱼胶囊的制备方法具体为：
取本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片，将斑马鱼以头部向前的姿态朝向流体流动方向送入芯片的固定腔内，然后注入30℃、浓度为2％w/v的液态低凝胶温度的A0701琼脂糖将斑马鱼包裹，然后将芯片放在22℃冷却台冷却1min，等待芯片内液态琼脂糖凝固。待琼脂糖凝固完全后，揭开PDMS微流控芯片基片，剥离玻璃盖片使其与PDMS微流控芯片基片分离，用两个平行的刀片将粘在玻璃盖片的包裹有斑马鱼的琼脂糖的多余部分切除，修剪为合适大小，即得斑马鱼琼脂糖胶囊。
需要注意的是，在制备斑马鱼胶囊前，需要通过芯片的入口先注水使其充满整个通道以充分除去芯片内的气泡。然后再通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼运输的控制系统相连。连接时，软管内应排空气体，并在软管出口处设置液封，以避免将气体引入芯片通道内。根据流体动力学的原理，通过运输控制系统将斑马鱼从芯片入口送入，按照头部在前的朝向进入固定腔室后，被芯片固定腔的弧形结构挡住，实现斑马鱼的有序装载。斑马鱼装载完成后，便可进行下一步操作。
本发明的第三个方面，提供一种斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统，所述斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统包括本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片和液滴阵列芯片。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述液滴阵列芯片包括亲水性基板和疏水性条带，所述疏水性条带在所述亲水性基板表面形成独立的闭合图形，将亲水性基板切割为多个独立的亲水性区域。
在本发明的一些实施方式中，所述亲水性基板包括等离子处理后的玻片、石英或PMMA。所述疏水性条带为使用紫外激光对玻片进行激光刻蚀得到的磨砂部分，并仅商用疏水试剂改性得到。
在本发明的一些实施方式中，所述闭合图形为闭合圆环，所述圆环内径为6～7mm，外径9～11mm。
在本发明的一些优选实施方式中，所述液滴阵列芯片的制备方法为：
使用激光打标机的紫外激光对玻片进行激光刻蚀，在玻片上雕刻出内径为6～7mm，外径9～11mm的磨砂圆环。加工完成后，将玻片放入等离子清洗机中清洗4min，使得玻片表面获得亲水性，再使用商用疏水试剂涂抹在玻片的磨砂圆环部分，让其对玻片表面上的磨砂圆环进行表面改性，烘干。等待疏水试剂干燥后，磨砂的环形区域获得疏水性形成超疏水边界，获得疏水性。
处理后的液滴阵列芯片上，其磨砂圆环上为疏水性，磨砂圆环内为亲水性，玻片表面具有两种截然相反的特性。当移液器以匀速移动、连续推出液体时，液体会在磨砂的疏水界面被截断，从而在亲水的圆形区域形液滴，得到液滴阵列。不同的移动速度会形成不同的液滴大小，由于本发明的微液滴芯片具有超强的亲疏水特性，所形成的液滴体积最大可至300μL，水的接触角范围在100～110°内。
本发明实施例中的液滴阵列芯片可以通过使用移液工具人工操作或者基于计算机控制的注射泵和电动移动平台均可以非常容易的生成分离的液滴阵列，具有较好的广泛适用性。
现有技术中的微液滴阵列芯片均只局限于细胞或动物卵的应用，而对于斑马鱼等活体生物的液滴阵列芯片设计尚未公开过。本发明基于微流控芯片实现斑马鱼的定向固定，以连续的逆向水流以抵消斑马鱼自由向前移动的趋势，无需外围设备辅助。而且斑马鱼胶囊与微液滴阵列芯片的结合避免了正常使用微流控系统进行药物筛选时药物用量过大的问题，避免了原方案中不可避免的浪费。而且系统构建难度低，无需繁杂的外部系统，极大的降低了损耗和成本，实现了真正意义上的高通量、多表型、低消耗的药物筛选系统。
本发明的第四个方面，提供一种药物筛选方法，包括如下步骤：使用本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片制备斑马鱼胶囊；将斑马鱼胶囊置于本发明第三个方面中所述的液滴阵列芯片的亲水性区域内，投加待筛选药物，根据药物性质观察斑马鱼生理信号(心率、大脑神经信号等)以及体征或形态变化，判断药物是否符合筛选要求。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述投加待筛选药物的具体方法为：根据本发明的第三个方面提及的液滴阵列芯片，磨砂环形区域以形成超疏水边界，光滑的中间圆形区域极度亲水，基于两处表面具有完全相反的亲疏水特性，通过手动简单地使用移液工具或者计算机控制注射泵和电动的移动平台，每个被推至移液器底部的斑马鱼胶囊即可一个接一个地被固定在液滴阵列中从而得到斑马鱼胶囊液滴芯片。以同样的方式，可以得到药物液滴阵列。将药物液滴阵列芯片翻转180°。使用机械臂固定，并对两块芯片进行自动校准对正，对准位置后，使得上下两块芯片的液滴充分接触从而完成了药物的三明治式添加。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片或本发明第三个方面所述的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统在制备模式动物胶囊中的应用。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述模式动物包括斑马鱼。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述的斑马鱼微流控芯片或本发明第三个方面所述的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统在药物筛选中的应用。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述药物筛选的试验对象为模式动物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药物筛选的试验对象为斑马鱼。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的微流控芯片基于未永久键合的组合方式以及其内部特殊的结构实际，仅需要简单的降温冷却即可以实现斑马鱼胶囊的制备，得到的斑马鱼胶囊与无固定斑马鱼的活力无差异，成活率高。
2.本发明中的斑马鱼胶囊的制备方法可以高通量大规模制备斑马鱼胶囊，实现了斑马鱼快速无麻醉定向包埋，成功率相对传统人工包埋存在巨大优越性。
3.本发明中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统构建简单，系统小型化，使用方便成本低，无需外围设备辅助，有效减少了药物的耗损(药物筛选实验用量从mL级降低至μL级)，实现了真正意义上的高通量、多表型、低消耗的药物筛选系统。
附图说明
图1为本发明实施例中的斑马鱼微流控芯片的结构示意图(a)和实物图(b)；
图2为本发明实施例中的斑马鱼胶囊实物图；
图3为本发明实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋的步骤流程图；
图4为本发明实施例中的液滴阵列芯片实物图；
图5为本发明实施例中的液滴阵列芯片添加液滴示意图；
图6为本发明实施例中的斑马鱼胶囊液滴芯片实物图(a)和药物液滴芯片(b)；
图7为使用移动平台操作添加药物实物图；
图8为基于本发明实施例中的液滴阵列芯片的三明治式添加方法示意图；
图9为本发明实施例中的添加1μM、10μM、100μM氯氮平和1μM、10μM、100μM舍曲林的斑马鱼脑图谱；
图10为本发明实施例中的100μM氯氮平和100μM舍曲林作用下斑马鱼心率波动统计图；
图11为本发明实施例中的斑马鱼胶囊(a)与传统琼脂糖包埋技术(b)的斑马鱼包埋实物对比图；
图12为本发明实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统(FC)、传统包埋的斑马鱼(Manual)以及正常未固定的斑马鱼(control)进行对比统计图，其中，a为存活率对比，b为异常率(畸形率)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一种斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统
本实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统包括：斑马鱼无麻醉定向包埋和微液滴药物筛选两部分组成。
(1)斑马鱼无麻醉定向包埋：
本实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋主要基于可拆卸的微流控芯片。
该斑马鱼微流控芯片的结构设计图和实物图分别如图1中的a、b所示。
该斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道。
进液通道和出液通道的宽度可为800～900μm(在本实施例中为800μm)。
进液通道的高度可为800～900μm(在本实施例中为800μm)；出液通道的高度可为120～180μm(在本实施例中为150μm)。
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道(固定腔和限制通道)的连接处均为圆角。
固定腔与进液通道连接，为避免尖锐拐角对鱼造成不可逆转的伤害，固定腔与进液通道的连接处被设计为圆角，圆角半径为1mm。
固定腔靠近进液通道的部分宽度和高度均为800～850μm(在本实施例中均为800μm)，长度至少长于斑马鱼体长。固定腔尾部顶面被设计成弧形结构，高度由800～850μm(在本实施例中均为800μm)缩低至200～250μm(在本实施例中为210μm)，弧形结构的总长度为1mm。该结构主要用于固定斑马鱼，在利用该微流控芯片固定斑马鱼时，斑马鱼会以顺流体流动方向头部在前的姿态进入固定腔室，因此，将固定腔顺流体流动方向的末端设计成弧形结构，从而使其与斑马鱼头部的生理结构相吻合，能够确保把鱼的头部固定在弧形结构内，实现了斑马鱼的定向固定，且对斑马鱼没有伤害。
固定腔尾部连接有限制通道，限制通道高度顺流体流动方向由250μm缩低至180μm，然后进一步缩低至150μm，以形成高度差，250μm缩低至180μm保证了斑马鱼不会随着水流继续向前游动，同时也保证了琼脂糖送入芯片后能够将多余的液体排出通道，实现斑马鱼被有效定向封装在琼脂糖内。
限制通道另一端与出液通道连接，连接处的圆角半径为150μm。
该斑马鱼微流控芯片可基于上述参数在三维建模软件上构建模型并完成仿真后，使用CNC数控机床在金属板(比如普通铜板)上进行加工或者直接进行模具3D打印，制作微流控芯片模具。将制作完成的模板彻底清洗，保证缝隙处没有污渍后，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)对其进行浇注。浇注完成后放置在真空泵内完全去除气泡，然后80℃环境下烘烤4-6h。待PDMS完全固化后，取出并冷却至室温，再将其从模具上脱下来，根据入口和出口的位置均采用1.6mm的打孔器进行打孔，得到PDMS微流控芯片基片。按照设计的微流控芯片尺寸，采用本领域常规方法制备玻璃微流控底片；用等离子处理PDMS微流控芯片基片和玻璃盖片的结合面后，将二者非永久性结合在一起，完成微流控芯片的制备。
在本实施例中，非永久性结合为非永久性键合，具体操作为：将已打孔的PDMS微流控芯片基片放入等离子清洗机内清洗4min后，将玻璃盖片上贴合在PDMS微流控芯片基片上，由于PDMS层这种贴合方式是非永久性键合，因此，在后面的步骤中能够实现将PDMS层从玻璃基底上的剥离。
斑马鱼无麻醉定向包埋的具体步骤为：
取本实施例中制备得到的斑马鱼微流控芯片，将斑马鱼以头部向前的姿态朝向流体流动方向送入芯片的固定腔内，然后注入30℃、浓度为2％w/v的液态低凝胶温度的琼脂糖(A0701，Sigma)将斑马鱼包裹，然后将芯片放在22℃冷却台冷却1min，等待芯片内液态琼脂糖凝固。待琼脂糖凝固完全后，揭开PDMS微流控芯片基片，剥离玻璃盖片使其与PDMS微流控芯片基片分离，用两个平行的刀片将粘在玻璃盖片的包裹有斑马鱼的琼脂糖的多余部分切除，修剪为合适大小，即得斑马鱼琼脂糖胶囊(如图2所示)。
斑马鱼无麻醉定向包埋的步骤流程图如图3所示。
用吸管吸取足量水，将玻璃基底上的斑马鱼胶囊冲入培养皿内进行收集，使其能够保持生命活力以便进行下一步实验。
需要注意的是，在制备斑马鱼胶囊前，需要通过芯片的入口先注水使其充满整个通道以充分除去芯片内的气泡。然后再通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼运输的控制系统相连。连接时，软管内应排空气体，并在软管出口处设置液封，以避免将气体引入芯片通道内。根据流体动力学的原理，通过运输控制系统将斑马鱼从芯片入口送入，按照头部在前的朝向进入固定腔室后，被芯片固定腔的弧形结构挡住，实现斑马鱼的有序装载。斑马鱼装载完成后，便可进行下一步操作。
在本实施例中，为了实现对斑马鱼的活体包埋，其可选择的包埋琼脂糖温度不可过高，因此，选用低凝胶温度的琼脂糖(A0701，Sigma)完成斑马鱼胶囊的制备。该琼脂糖与普通琼脂糖相比，成胶温度低，在30℃时仍为液态，能够像培养液一样流入芯片内部将斑马鱼包埋。当然，本领域技术人员也可以采用其他性质等同的物质用于替代A0701。
(2)微液滴药物筛选：
微液滴药物筛选主要基于液滴阵列芯片，如图4所示。
本实施例中的液滴阵列芯片的制备方法为：
使用激光打标机的紫外激光对玻片进行激光刻蚀，在玻片上雕刻出内径为6～7mm(本实施例为7mm)，外径9～11mm的磨砂圆环(本实施例中为9mm)，实物图如图4所示。加工完成后，将玻片放入等离子清洗机中清洗4min，使得玻片表面获得亲水性，再使用商用疏水试剂(主要成分为硅聚合物，本实施例中使用MesoPhobic-2000，购自MesoBioSystem)涂抹在玻片的磨砂圆环部分，让其对玻片表面上的磨砂圆环进行表面改性，烘干。等待疏水试剂干燥后，磨砂的环形区域获得疏水性形成超疏水边界，获得疏水性。
处理后的液滴阵列芯片上，其磨砂圆环上为疏水性，磨砂圆环内为亲水性，玻片表面具有两种截然相反的特性。当移液器以匀速移动、连续推出液体时，液体会在磨砂的疏水界面被截断，从而在亲水的圆形区域形液滴，得到液滴阵列。不同的移动速度会形成不同的液滴大小，由于本发明的微液滴芯片具有超强的亲疏水特性，所形成的液滴体积最大可至300μL，水的接触角范围在100～110°内，如图5所示。
本实施例中的液滴阵列芯片可以通过使用移液工具人工操作或者基于计算机控制的注射泵和电动移动平台均可以非常容易的生成分离的液滴阵列，具有较好的广泛适用性。
(3)斑马鱼琼脂糖胶囊与液滴阵列芯片的结合：
取两块步骤(2)中制得的液滴阵列芯片，通过手动简单地使用移液工具或者计算机控制注射泵和电动的移动平台，每个被推至移液器底部的斑马鱼胶囊即可一个接一个地被固定在液滴阵列中从而得到斑马鱼胶囊液滴芯片，如图6a所示。当移液器以匀速移动、连续推出液体时，液体会在磨砂的疏水界面被截断，从而在亲水的圆形区域形液滴，得到药物液滴芯片，如图6b所示。药物添加完成后，将药物液滴阵列芯片翻转180°。使用机械臂固定(如图7所示)，并对两块芯片进行自动校准对正，对准位置后，使得上下两块芯片的液滴充分接触从而完成了药物的三明治式添加(原理图如图8所示)。
斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的实际应用效果
为了充分说明上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的实际使用效果，在本实施例中，发明人分别使用一定浓度梯度(1μM、10μM、100μM)的氯氮平(clozapine)和舍曲林(sertraline)作为待选药物进行测试，使用上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统进行测试，以验证其可行性和稳定性。
具体检测步骤如下：
取上述实施例中的斑马鱼微流控芯片，先将芯片的入口注水，使其充满整个通道，以除去芯片内的气泡。然后通过软管将微流控芯片的入口与外部用于控制斑马鱼运输的控制系统相连，连接时，软管内应排空气体且出口处设置液封，以避免将气体引入芯片通道内。放平斑马鱼微流控芯片，封闭多余的出入口，通过运输控制系统将斑马鱼幼苗从芯片入口送入，通过流体的作用，将幼苗依次有序装载进固定腔内。当幼苗全部装载完毕后，将流体更换为液态琼脂糖注射进芯片内部，实现斑马鱼幼苗的包覆，待其冷却凝固后，揭开PDMS微流控芯片基片，剥离玻璃盖片，切除斑马鱼胶囊的多余部分。按照上述实施例中步骤(2)准备好斑马鱼胶囊液滴芯片和有一定浓度梯度(1μM、10μM、100μM)的药物液滴芯片，包括氯氮平和舍曲林。按照上述实施例中步骤(3)完成药物添加。使用荧光显微镜对Elavl3:GCaMP6f转基因斑马鱼(购自中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心)绘制大脑活动图(由于大脑中钙离子浓度的变化将会引起荧光强度的变化，从而可以反映出神经元的活动状态)。在记录斑马鱼大脑活动时，先记录10min的未添加药物时的斑马鱼脑部活动情况作为对照组，然后记录使用三明治方法添加药物后的情况。药物添加完成后，等待药物完全渗透斑马鱼胶囊并作用于斑马鱼，渗透过程时长10min，这期间不记录脑部活动。渗透完成后，记录10min的脑部活动情况。针对记录的数据进行分析，得到如图9所示的斑马鱼脑图谱。
氯氮平是一种抗癫痫药物，在使用过程中会出现心动过速等现象。而舍曲林是一种抗抑郁的药物，会导致心动过缓。从图9中可以看出，两种药物在100μM时作用效果最明显，且氯氮平和舍曲林分别对视顶盖和左半球有显著的神经抑制作用。为评估100μM的氯氮平和100μM舍曲林对斑马鱼心率波动影响情况，在药物添加后20min内连续记录心脏跳动情况，然后根据图像强度变化分析计算心率变化情况。
如图10所示，可以看出100μM氯氮平对心跳有促进作用，心率增加了10.8％。而100μM舍曲林是抑制作用，心率降低了10.3％，该实验结果与之前的研究结果一致，并证明了本发明中搭建的系统具有强大的药物筛选能力。
斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的包埋效果与传统琼脂糖包埋效果的对比试验
为了体现出上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的包埋效果与传统琼脂糖包埋效果的差异性，发明人分别采用两种方式对随机抽选的斑马鱼在同一环境下进行包埋操作。
其中，斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的包埋方法同上述实施例。而传统琼脂糖包埋技术的操作手法参考本领域中的斑马鱼包埋技术手册进行(包埋方法参考Westerfield M.The Zebrafish Book.A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish(Danio rerio).4th ed.,2000)。
结果如图11～12所示。
发明人发现，对比上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统的包埋效果与传统琼脂糖包埋效果，基于上述实施例中的斑马鱼微流控芯片实现了斑马鱼的定向固定，无需人工调整斑马鱼身体朝向，避免了人为的损害，且利用外围冷却设备让琼脂糖快速降温凝固，能够短时间内大批量制备(一个批次的斑马鱼胶囊的量产仅需2min)，而人工包埋时，每一条斑马鱼的包埋耗时为2min，且对操作人员的技术熟练程度要求很高，对于技术熟练程度相对不是很强的操作人员则可能花了数分钟时间都很难按照预期的朝向对斑马鱼进行包埋固定且在这过程中很容易给斑马鱼的身体带来伤害，两者差异显著。
而从实际包埋效果来看，两种技术包埋的实物图如图11所示。传统琼脂糖包埋的斑马鱼，身体朝向难以调整且调整后的固定姿态扭曲，容易造成其脊柱扭曲，而使用微流控芯片制备的斑马鱼胶囊身体姿态正常，极易调整观察。
对上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统、传统包埋的斑马鱼以及正常未固定的斑马鱼进行对比统计分析，可以发现(图12)，上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统制备的斑马鱼胶囊存活率高，包埋36h后存活率仍高达94.4％，且与对照组(正常未固定的斑马鱼)并无显著差异性。而传统的包埋方法在包埋36h存活率已经降至72.2％，且与对照组相比具有显著差异(p<0.05)，而48h后存活率已经降至61.1％，此时p<0.01。说明通过上述实施例中的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统实现的斑马鱼包埋技术，不仅达到了斑马鱼定向固定包埋的目的，而且效率更高，操作更简单，斑马鱼的损伤也极小，具有一定的应用优势。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种斑马鱼胶囊的制备方法，包括如下步骤：
将斑马鱼输送至斑马鱼微流控芯片中，并确保斑马鱼以头部向前的姿态朝向流体流动方向固定于斑马鱼微流控芯片固定腔的弧形结构内，注入胶囊液，
固化形成斑马鱼胶囊；
其中，所述斑马鱼微流控芯片包括微流控基片和盖片；
所述微流控基片和盖片以非永久性键合的方式连接；
所述斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道；
所述进液通道和出液通道的宽度均为800～900μm；
所述进液通道的高度高于所述出液通道的高度；
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；
所述进液通道与所述固定腔、所述出液通道与所述限制通道的连接处均为圆角；
所述固定腔靠近进液通道一端的宽度和高度均为800～850μm，长度长于斑马鱼体长；
所述固定腔的另一端顶面为弧形结构，高度由800～850μm缩低至200～250μm，所述弧形结构的长度为1～1.2mm；
所述限制通道的高度顺流体流动方向由250μm缩低至150μm；
所述进液通道的高度为800～900μm，所述出液通道的高度为120～180μm。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶囊液包括琼脂糖溶液和水凝胶，所述胶囊液为凝胶温度为22-25℃的琼脂糖溶液。
3.一种斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统，其特征在于，所述斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统包括斑马鱼微流控芯片和液滴阵列芯片；
所述液滴阵列芯片包括亲水性基板和疏水性条带，所述疏水性条带在所述亲水性基板表面形成独立的闭合图形，将亲水性基板切割为多个独立的亲水性区域；
所述斑马鱼微流控芯片包括微流控基片和盖片；
所述微流控基片和盖片以非永久性键合的方式连接；
所述斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道；
所述进液通道和出液通道的宽度均为800～900μm；
所述进液通道的高度高于所述出液通道的高度；
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；
所述进液通道与所述固定腔、所述出液通道与所述限制通道的连接处均为圆角；
所述固定腔靠近进液通道一端的宽度和高度均为800～850μm，长度长于斑马鱼体长；
所述固定腔的另一端顶面为弧形结构，高度由800～850μm缩低至200～250μm，所述弧形结构的长度为1～1.2mm；
所述限制通道的高度顺流体流动方向由250μm缩低至150μm；
所述进液通道的高度为800～900μm，所述出液通道的高度为120～180μm。
4.根据权利要求3所述的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统，其特征在于，所述闭合图形为闭合圆环，所述圆环内径为6～7mm，外径9～11mm。
5.斑马鱼微流控芯片或权利要求3～4任一项所述的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统在制备模式动物胶囊中的应用；
其中，所述模式动物为斑马鱼；
所述斑马鱼微流控芯片包括微流控基片和盖片；
所述微流控基片和盖片以非永久性键合的方式连接；
所述斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道；
所述进液通道和出液通道的宽度均为800～900μm；
所述进液通道的高度高于所述出液通道的高度；
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；
所述进液通道与所述固定腔、所述出液通道与所述限制通道的连接处均为圆角；
所述固定腔靠近进液通道一端的宽度和高度均为800～850μm，长度长于斑马鱼体长；
所述固定腔的另一端顶面为弧形结构，高度由800～850μm缩低至200～250μm，所述弧形结构的长度为1～1.2mm；
所述限制通道的高度顺流体流动方向由250μm缩低至150μm；
所述进液通道的高度为800～900μm，所述出液通道的高度为120～180μm。
6.权利要求3～4任一项所述的斑马鱼无麻醉定向包埋药物筛选系统在药物筛选中的应用；
其中，所述药物筛选的试验对象为模式动物，所述模式动物为斑马鱼。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物筛选的方法包括如下步骤：
使用斑马鱼微流控芯片制备斑马鱼胶囊；
将斑马鱼胶囊置于权利要求3中所述的液滴阵列芯片的亲水性区域内，投加待筛选药物，根据药物性质观察斑马鱼体征或形态变化，判断药物是否符合筛选要求；
所述斑马鱼微流控芯片包括微流控基片和盖片；
所述微流控基片和盖片以非永久性键合的方式连接；
所述斑马鱼微流控芯片由多个微型结构单元组成，每一个微型结构单元都依次设置有进液通道、固定腔、限制通道以及出液通道；
所述进液通道和出液通道的宽度均为800～900μm；
所述进液通道的高度高于所述出液通道的高度；
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；
所述进液通道与所述固定腔、所述出液通道与所述限制通道的连接处均为圆角；
所述固定腔靠近进液通道一端的宽度和高度均为800～850μm，长度长于斑马鱼体长；
所述固定腔的另一端顶面为弧形结构，高度由800～850μm缩低至200～250μm，所述弧形结构的长度为1～1.2mm；
所述限制通道的高度顺流体流动方向由250μm缩低至150μm；
所述进液通道的高度为800～900μm，所述出液通道的高度为120～180μm。
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