CN111838025B - 一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片、系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片、系统及其应用。本发明中的微流控芯片，片内由多个具有特殊设计的微型结构阵列组成，每一个微型结构中都具有进出液通道及斑马鱼幼鱼反应通道通连而成。本发明旨在通过微流控芯片，可以对斑马鱼幼苗进行精准微操作，部分固定以及生理信息采集，同时实现多种生理信息的记录，以实现对动物系统的深入研究和药物的全面评价。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片、系统及其应用。
背景技术
传统的药物筛选方法大多是基于细胞或分子靶标的体外检测，但由于细胞或分子数量的有限性以及难以完全模拟特定系统的微环境(比如中枢神经系统)，使得药物筛选的效率极其低下。目前，基于整体动物，如斑马鱼卵、线虫和果蝇等的在体药物筛选方法的出现，为提高药物筛选的成功率带来了新的方向。
斑马鱼胚胎(鱼卵)因其透明性高、渗透性强，体积小、易操作等特点已被广泛使用于基于单个胚胎的生命系统研究当中。但斑马鱼卵也存在着不具备自由活动的能力，无法观察药物对生物体的活动能力以及活动相关的生理功能的影响，使可适用筛选的药物范围受到了极大的限制。而且，目前绝大部分已研发的微流控芯片只适用于斑马鱼鱼卵的操控，主要也是因为鱼卵基本不具备自由活动的能力，较容易进行运输和固定；相对而言，在技术层面，要利用微流控芯片实现斑马鱼幼苗的大规模，高通量，半固定式筛选，仍旧需要从根本上解决如何对具备自由活动能力的幼苗的精确操控问题。
现有技术中，斑马鱼在进行药物筛选以及生命系统研究中为复杂疾病的治疗做出了巨大贡献，但传统的方法不仅对斑马鱼的人为操控过于繁琐导致费时费力，还普遍存在通量低且非常容易引入的个体差异等问题，如人工地利用水凝胶对斑马鱼进行包埋固定、对斑马鱼进行麻醉处理等，均会不同程度影响到对斑马鱼生理系统的研究以及药物功能的评估。而基于人工操作以及现有的自动化方法或系统都只能提供单种生理信息的记录，这阻碍了进一步完全反映动物体内系统的相互作用，以及评估药物功能的有效性和副作用。而且，市面上大多微流控芯片的结构和外部系统不仅相对复杂，而且很难同时完成多种生理信息记录(比如尾巴摆动，鱼鳍划动以及嘴巴开合等动物行为学信息，心跳信息，血流信息、脑电信息等)。对于传统做法中，利用手工切除凝胶的方法实现部分固定斑马鱼幼苗，其不仅耗时长，成功率低，且无法实现高通量。
因此，为了解决上述所存在的诸多缺陷，开发一种可进行高通量、自动化、多信息记录的斑马鱼幼鱼筛选系统对药物性能的评估和疾病的研究与治疗有重大的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片；
本发明的另一目的在于提供上述微流控芯片的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种装置；
本发明的另一目的在于提供一种生理信息采集筛选系统；
本发明的另一目的在于提供上述的生理信息采集筛选系统在药物筛选中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片，其特征在于，包括微流控基片和置于所述微流控基片下的微流控底片；
上述微流控基片具有进液通道、出液通道及若干反应通道，上述反应通道设于上述进液通道与出液通道之间；
上述反应通道顺应流体流动方向依次设置有固定腔、限制通道和活动腔，上述限制通道的宽度小于上述固定腔及上述活动腔的宽度。
其中，各上述反应通道的深度为500-600μm。
上述微流控基片的材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、玻璃、明胶中的至少一种；
上述微流控底片的材料包括玻璃、PDMS、明胶中的至少一种，其材料的选择在于颜色透明，易于观察，且不影响试验操作以及各项检测。
上述微流控基片和微流控底片的材料还包括其他本领域常规替代性材料。
上述固定腔用于固定斑马鱼幼鱼头部，上述限制通道仅可以容斑马幼鱼鱼尾部能通过，上述活动腔用于斑马鱼幼鱼尾部活动。
其中，斑马鱼幼鱼为3-8dpf(days post fertilization，受精后的天数)，主要考虑这个阶段的幼鱼具备自由移动的能力，各器官系统发育相对完善，也适合进行各项生理参数的监测和采集。
斑马鱼作为一种优秀的模式动物，易操作(外部胚胎发育)，低成本(强大的繁殖能力、短暂的发育周期)以及适用于人类病理模型(约70％的人类基因至少有一种明显的斑马鱼直系同源物，斑马鱼和哺乳动物大脑之间的相似结构区域和神经化学特征)等显著优势，使其在药物体内筛选和复杂疾病研究方面中的应用越来越重要。而斑马鱼幼苗，具备有与斑马鱼鱼卵一样的光学透明性，使体内光学成像成为可能；而且斑马鱼幼苗的发育更加完备(幼苗阶段的器官发育的完备情况是鱼卵阶段无法比拟的)，为采集多生理信号提供了更多的可能；幼苗的体型小，也为其在微流控芯片上实现大规模、高通量的筛选奠定了基础。
上述反应通道适用的鱼种还包括本领域中其他鱼类的幼苗，比如金鱼、青鱼等。
上述反应通道是基于流体动力学的原理来控制斑马鱼幼体的自动装载和固定。
固定腔是根据斑马鱼头部的生理特征设计的，以便在此对整个斑马鱼大部分的器官系统进行信息采集，其中器官系统包括大脑，心脏，肝脏，血管等。
进一步地，上述进液通道和上述反应通道的连接处、上述出液通道与上述反应通道的连接处均为圆角，上述圆角半径为100-150μm。
入口设计成半径为100-150μm的圆弧，主要是用于确保幼鱼能更顺利地进入每一个固定腔，并避免急锐的转弯或转角造成幼鱼身体的划伤或其他损伤。
进一步地，上述固定腔包括直线部和锥形部，上述锥形部的尖端与上述限制通道相连，上述直线部和上述进液通道连接，上述直线部的宽度为900-1000μm。
进液通道及其与上述反应通道的连接处，以及上述出液通道及其与上述反应通道的连接处的通道宽度为900-1000μm；在本发明的实施例中，优选地，通道宽度为900μm。
通道宽为900-1000μm，可以保证幼鱼(3-8dpf)能畅通无阻地通过。
进一步地，上述活动腔呈扇形结构，上述活动腔的角端和上述限制通道连接，上述活动腔的半径为2.3-2.7mm。
在本发明的实施例中，优选地，活动腔的半径为2.5mm。
限制通道后的宽敞扇形腔(活动腔)，它是用来采集斑马鱼的行为学信息，发明人发现，半径为2.5mm的扇形腔室足够让斑马鱼在此处展现各种不同的运动状态。
本发明中的微流控芯片的重要部分是固定腔及扇形腔室(包括或不包括限制通道)的结合联用，使其不仅能够半固定式地进行斑马鱼幼苗的装载，并能够采集斑马鱼的多种生理信息(比如尾巴摆动，鱼鳍划动以及嘴巴开合等动物行为学信息，心跳信息，血流信息、脑电信息等)。
进一步地，上述出液通道及其与上述反应通道的连接处的通道宽度为900-1000μm。
进一步地，上述限制通道的长度为300-450μm，宽度为200-300μm。
优选地，限制通道的长度为420μm，宽度为260μm。
该限制通道刚好只能允许幼鱼的尾部通过，其对斑马鱼的固定和后续药物的装载都是至关重要的。
该微流控芯片可以包括两个或以上上述反应通道，至少包括两个或以上固定腔及扇形腔室(包括或不包括限制通道)的结合联用结构。其反应通道或结合联用结构的阵列或排列并不限于实施例所示的设计。其总的原则是采用该结合联用结构，尽可能多地进行阵列式分布，实现高通量、多生理信息采集的斑马鱼幼苗筛选。
本发明的第二个方面，提供：
上述微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
按照上述描述设计并制备微流控芯片基底模具；
在模具中加入聚二甲基硅氧烷，真空以除尽聚二甲基硅氧烷中的气泡；
烘干，待聚二甲基硅氧烷固化后，冷却，脱模，得到微流控芯片基片；
制备微流控底片；
接合上述微流控芯片基片和上述微流控底片，即得微流控芯片。
上述接合具体步骤包括：
将上述微流控底片置于上述微流控芯片基片下；
通过粘结剂或其他接合方式将上述微流控底片固定于上述微流控芯片基片上。
其中，上述制备方法还包括在脱模后打孔。
当然，可以在设计模具的时候把孔道(柱状)加高，在浇注模具填料的时候，使PDMS的高度低于柱状高度，脱模后的微流控芯片基片无需打孔，直接形成有孔道。
其中，上述微流控底片可由玻璃制成，其接合微流控芯片基底后可以使微流控芯片内部结构不直接暴露于空气中。形成仅可以通过进液通道和出液通道进出的半封闭空间。
优选地，在接合前，可以采用等离子或其他替代性方式处理上述微流控芯片基片和上述微流控底片表面，以便于接合或提高接合效果或作用。
当然，本发明中的微流控芯片的制备方法不仅限于上述的制备方法，还包括本领域中常规使用的制备方法，包括3D打印、PMMA雕刻或者玻璃板雕刻等。
本发明的第三个方面，提供：
一种装置，该包括上述的微流控芯片。
本发明的第四个方面，提供：
一种生理信息采集筛选系统，该系统包括上述装置、装载装置、药物注射系统、采集分析装置；
其中，上述采集分析装置用于收集和/或分析上述生理信息采集筛选系统中的实验体的生理信息。
本发明的第五个方面，提供：
上述的生理信息采集筛选系统在药物筛选中的应用。
当然，根据实际需求，本发明中的生理信息采集筛选系统可应用于本领域中的生物医学基础研究中。
本发明的有益效果是：
1、针对目前大多数利用斑马鱼进行生理系统研究或者药物筛选的方法只能提供单个生理信息的记录，使得全面动物体内复杂系统的功能和评估药物的功效及副作用受到极大限制。本发明旨在通过微流控芯片的微结构设计和流体力学计算优化，对斑马鱼幼苗进行精准微操作，部分固定以及生理信息采集，同时实现多种生理信息的记录，包括尾巴摆动，鱼鳍划动以及嘴巴开合等动物行为学信息、心跳信息、血流信息、脑电信息等，以实现对动物系统的深入研究和药物的全面评价。
2、针对目前对斑马鱼的微操控和固定基本都实施了琼脂糖包埋或麻醉处理，操控过程过于繁琐导致费时费力，甚至由于人为操控，琼脂糖固化温度以及麻醉处理等处理导致对实验结果引入过多误差及不确定性。本发明旨在提供一个在不进行凝胶或麻醉处理的情况下，能够实现对斑马鱼的自动化操控的微流控系统。
3、针对传统的微流控芯片结构和外部系统都相对复杂，使其大规模的商业化生产和实际使用受到限制，并且也阻碍了高通量的实现。本发明旨在提供一个简单的微流控芯片制作方法及其芯片外操控系统，实现高通量、自动化以及多表型记录的斑马鱼筛选系统。
附图说明
图1为微流控芯片的设计示意图(1进液通道入口，2出液通道入口)；
图2为本发明的微流控芯片的实物照片；
图3为微流控芯片的流体动力学仿真；
图4为斑马鱼幼鱼自动装载过程示意图；
图5为斑马鱼幼鱼被固定在微流控芯片中的照片；
图6为斑马鱼暴露在L-精氨酸下的行为学信息统计结果；
图7为斑马鱼在芯片内结合光学成像进行脑部信息采集的图例；
图8为PTZ(戊四唑)在芯片内诱导斑马鱼幼苗成为癫痫疾病模型并进行药物初筛。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
本发明实施例中使用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)购自广州晨生生物制品有限公司(DOW CORNING SYLGARD 184)，包括预聚物A和交联剂B两部分。
实施例1一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片
本实施例中的用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片，包括微流控基片和置于微流控基片下的微流控底片；
所述微流控基片上设置有由底面向上凹陷500μm的反应通道；
所述微流控基片周边设置有与所述反应通道相通的进液通道和出液通道；
所述反应通道顺应流体流动方向依次设置有用于固定斑马鱼幼鱼头部的固定腔、仅斑马幼鱼鱼尾部能通过的限制通道和用于斑马鱼幼鱼尾部活动的活动腔；
所述微流控基片由聚二甲基硅氧烷制成；
所述微流控底片由玻璃制成。
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径为150μm。
所述进液通道及其与所述反应通道的连接处，以及所述出液通道及其与所述反应通道的连接处的通道宽度为900μm。
所述限制通道的长度为420μm，宽度为260μm。
所述活动腔向流体流动方向发散为扇形，所述活动腔的半径为2.5mm。
所述微流控芯片包括五个所述反应通道。
本实施例中的微流控芯片的结构的俯视图如图1所示。
本实施例中的微流控芯片的实物图如图2所示。
本实施例中的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
设计：按照上述结构设计用三维软件完成微流控芯片基片模具；
制备模具：利用CNC数控机床在铜板上进行加工；清洗模板，先把已加工好的铜板用无水乙醇浸泡一晚，然后拿镊子夹住酒精棉片轻轻擦拭铜板，去除角落和缝隙的污渍，然后超声清洗20min，并用气枪吹干，完成微流控芯片模板的制备。
将PDMS(预聚物A)和PDMS(交联剂B)按10:1的比例放入同一容器中，充分搅拌均匀后，在室温下脱去真空去除气泡。随后将混合好的PDMS倒在清洗好的铜模板上，再次抽真空完全除尽气泡。放入烘箱80℃，烘烤4-6h。待PDMS完全固化后，取出并冷却至室温，再将其从模具上脱下来，根据入口和出口的位置用打孔器进行打孔。
按照设计的微流控芯片尺寸，采用本领域常规方法制备玻璃微流控底片；
用等离子处理PDMS微流控芯片基片和玻璃盖片的结合面后，将二者结合在一起，完成微流控芯片的制备。
实施例2一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片
本实施例中的用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片，包括微流控基片和置于微流控基片下的微流控底片；
所述微流控基片上设置有由底面向上凹陷600μm的反应通道；
所述微流控基片周边设置有与所述反应通道相通的进液通道和出液通道；
所述反应通道顺应流体流动方向依次设置有用于固定斑马鱼幼鱼头部的固定腔、仅斑马幼鱼鱼尾部能通过的限制通道和用于斑马鱼幼鱼尾部活动的活动腔；
所述微流控基片由聚二甲基硅氧烷制成；
所述微流控底片由玻璃制成。
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径为100μm。
所述进液通道及其与所述反应通道的连接处，以及所述出液通道及其与所述反应通道的连接处的通道宽度为1000μm。
所述限制通道的长度为300μm，宽度为200μm。
所述活动腔向流体流动方向发散为扇形，所述活动腔的半径为2.3mm。
所述微流控芯片包括五个所述反应通道。
本实施例中的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
设计：按照上述结构设计用三维软件完成微流控芯片基片模具；
制备模具：直接进行模具3D打印。
按照设计的微流控芯片尺寸，采用本领域常规方法制备玻璃微流控底片；
用等离子处理微流控芯片基片和玻璃盖片的结合面后，将二者结合在一起，完成微流控芯片的制备。
实施例3一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片
本实施例中的用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片，包括微流控基片和置于微流控基片下的微流控底片；
所述微流控基片上设置有由底面向上凹陷600μm的反应通道；
所述微流控基片周边设置有与所述反应通道相通的进液通道和出液通道；
所述反应通道顺应流体流动方向依次设置有用于固定斑马鱼幼鱼头部的固定腔、仅斑马幼鱼鱼尾部能通过的限制通道和用于斑马鱼幼鱼尾部活动的活动腔；
所述微流控基片由聚二甲基硅氧烷制成；
所述微流控底片由玻璃制成。
所述进液通道设置在所述微流控基片的一端，所述出液通道设置在所述微流控基片的另一端；所述进液通道和出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径为150μm。
所述进液通道及其与所述反应通道的连接处，以及所述出液通道及其与所述反应通道的连接处的通道宽度为900μm。
所述限制通道的长度为450μm，宽度为300μm。
所述活动腔向流体流动方向发散为扇形，所述活动腔的半径为2.7mm。
所述微流控芯片包括五个所述反应通道。
本实施例中的微流控芯片的制备方法如实施例1所示。
斑马鱼幼苗自动化装载实验
选取本发明实施例1的斑马鱼幼鱼的微流控芯片进行本试验，但需说明的是，本发明中其他实施例与实施例1显示出同样的效果。
构建一个高通量、多生理信息采集筛选系统，包括微流控芯片、斑马鱼自动装载和药物注射系统、与计算机相连的光学显微镜(或其他本领域的采集分析装置)。
微流控芯片是核心器件，斑马鱼装载作为实现自动化操控至关重要的部分，通过软管与微流控芯片的入口相连接，通过双通道注射泵(购自广州晨生生物制品有限公司，上海雷恩双通道注射器)控制流速来实现药物添加，光学显微镜(购自上海木森生物科技有限公司，显微镜奥林巴斯IX70)配有高清摄像头，以用于在检测过程中捕捉斑马鱼幼鱼的图像和视频。
配置好实验装置后，将微流控芯片进液通道(图1中的1)与外部用于控制斑马鱼幼鱼运输的控制系统相连，出液通道2接入循环系统或废液箱。
在斑马鱼装载之前，首先向微流控芯片入口注水并充满整个通道，除去气泡。利用流体动力学的原理(图3，颜色不同代表流速差异)，芯片将自动化地将斑马鱼幼苗有序地装载到每一个固定腔室中。在完成斑马鱼装载后，如图4所示，当持续在进液通道入口以10-20ml/h 的水流向腔室内施加一个细微的正压，以保持活着的斑马鱼能够以阵列的形式固定在正确的位置来完成后续的光学成像和行为数据采集(图5)。
斑马鱼幼苗多生理信息的采集及评估试验
本发明以利用L-精氨酸对斑马鱼幼苗进行嗅觉刺激引发其多种行为表现为例，说明本发明提供的微流控芯片可以对不同浓度的药物所引发的多生理信息进行采集及评估，得到药物作用的全方位信息。
首先，从芯片进液通道入口进行输水，使E3水(5mM NaCl；0.17mM KCl；0.33mMCaCl2； 0.33mM MgSO4；0.00001％(w/v)Methylene Blue)充满整个通道，然后利用注射泵吸入一条斑马鱼幼苗，并通过与软管(直径：1mm)相连，把幼苗注射到芯片的固定腔室中，随后把已装载好鱼的芯片放置在显微镜视野下并连接好出口至废液箱；另一入口与双通道注射泵其中一个装好E3水(对照组：CTRL)的通道相连，以10-20ml/h的流速持续10min向芯片注入E3水，同时利用显微拍照记录明场图像。对照组信息采集完成之后，切换双通道注射泵的通道向入口依次注射1mM和10mM的L-精氨酸，各10min。在10倍放大的镜头下能同时记录斑马鱼幼苗头部和尾部的运动情况；通过图像处理软件Image J，选择感兴趣的区域对所采集的所有图片进行后续的处理和分析。头部着重分析眼睛的转动和嘴巴的嚅动，尾部重点观察尾部的摆动，包括C型、L型弯曲等行为状态。由于斑马鱼的嗅觉器官有大量的嗅觉受体(ORs)，能够检测到氨基酸并且对嗅觉刺激物L-精氨酸高度敏感，当斑马鱼幼鱼在L-精氨酸的刺激下，尾巴、眼睛和嘴巴都会表现出明显的运动反应，并且随着刺激物L-精氨酸浓度的增加，运动反应越明显，而且由于L-精氨酸是嗅觉刺激物，在头部观察到的眼睛和嘴巴的运动反应比尾巴表现得更加强烈，结果如图6所示。
该结果展现出本发明提供的系统具备对斑马鱼进行的筛选能力以及其对药物在动物身上的行为学信息的评估能力，这是截止目前唯一的只通过简单的结构设计和微流动力学原理进行斑马鱼全方位行为学记录的微流控芯片系统。
药物筛选试验
本发明利用γ-氨基丁酸(简称GABA)抑制剂，戊四唑(Pentylenetetrazole，PTZ)为例，对芯片内斑马鱼幼苗进行高通量处理，并成功在芯片内引发类似动物癫痫的脑神经放电现象并伴有一定激烈程度的行为学反应，通过对一种正在研究中的神经治疗药物NNC-711的不同浓度筛选，以说明本发明提供的微流控芯片可为神经疾病的治疗药物筛选提供一个强有力的工具。
具体方案如下：
首先，利用微流控芯片系统自动化地将带有遗传编码钙指示剂的转基因斑马鱼(elavl3:GCaMP5G，购自Champalimaud Foundation,Portugal)载入芯片内，形成斑马鱼幼苗阵列。
然后，通过与光学成像相结合，在采集行为学信息的同时，还进行实时的全脑神经成像，采集脑部神经信号并对神经元活性变化的分析(图7)。
然后，在系统中添加5mM PTZ，同样利用芯片进行神经信号及行为学信息采集。
最后，通过图像处理软件Image J，选择感兴趣的区域对所采集的所有图片进行后续的处理和分析(图8)。
如图8所示，可以发现5mM PTZ即可在芯片内引起大规模的神经放电(如图8a)，并且具备时间一致性地引起多种斑马鱼幼苗行为学反应(如图8b)；利用芯片内PTZ诱导的癫痫疾病模型阵列，向系统内引入不同浓度(1μΜ、10μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、250μΜ、500μΜ七个浓度)的NNC-711化合物，发现10μΜ及以上浓度均会抑制斑马鱼幼苗的神经癫痫放电及即时行为学表现，但仅有25μΜ既能抑制癫痫症状又不会影响其正常的行为学反应。
因此，通过本发明实施例可以看出，本发明利用不同浓度药物对斑马鱼幼苗进行高通量处理及筛选，不仅找到药物处理的有效浓度并且高效地评估出药物在动物疾病模型上的安全作用窗口。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于斑马鱼幼鱼的微流控芯片，其特征在于，包括微流控基片和置于所述微流控基片下的微流控底片；
所述微流控基片具有进液通道、出液通道及若干反应通道，所述反应通道设于所述进液通道与出液通道之间；
所述反应通道顺应流体流动方向依次设置有固定腔、限制通道和活动腔，所述限制通道的宽度小于所述固定腔及所述活动腔的宽度；
其中，所述反应通道的高度为500-600 μm；
所述固定腔包括直线部和锥形部，所述锥形部的尖端与所述限制通道相连，所述直线部和所述进液通道连接，所述直线部的宽度为900-1000 μm；
所述活动腔呈扇形结构，所述活动腔的角端和所述限制通道连接，所述活动腔的半径为2.3-2.7 mm；
所述出液通道及其与所述反应通道的连接处的通道宽度为900-1000 μm；
所述限制通道的长度为300-450 μm，宽度为200-300 μm。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述进液通道和所述反应通道的连接处、所述出液通道与所述反应通道的连接处均为圆角，所述圆角半径为100-150μm。
3.权利要求1-2中任一项所述的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤:
按照权利要求1或2设计并制备微流控芯片基底模具；在模具中加入聚二甲基硅氧烷，真空以除尽聚二甲基硅氧烷中的气泡；烘干，待聚二甲基硅氧烷固化后，冷却，脱模，得到微流控芯片基片；制备微流控底片；接合所述微流控芯片基片和所述微流控底片，即得微流控芯片。
4.一种斑马鱼生理信息采集装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1-2中任一项所述的微流控芯片。
5.一种生理信息采集筛选系统，其特征在于，所述系统包括权利要求4所述装置、装载装置、药物注射系统、采集分析装置；
其中，所述采集分析装置用于收集和/或分析所述生理信息采集筛选系统中的实验体的生理信息。
6.权利要求5所述的生理信息采集筛选系统在药物筛选中的应用。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
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| 氯丙嗪在斑马鱼胚胎和早期幼鱼发育过程中的神经毒性作用;史慧勤等;《中国比较医学杂志》;20111030;22-27 * |
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