CN110193384B - 一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置及应用，通过有效利用三维空间，将用于装载多种样品的、体积大小不同的样品沟槽以平行方式分布在上、下两块基片上，通过一步滑动使装置由进样状态切换到反应状态实现多个样品沟槽的重叠从而可快速得到含有多种物质的浓度梯度阵列。该三维浓度梯度阵列装置有望广泛用于多种生化反应的大规模条件筛选，如蛋白质结晶，抗癌药物筛选，生物体对化学物质的趋向性研究等。

Description

一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置及应用
技术领域
本发明属于微流控生化分析领域，具体涉及一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置及应用，本发明提供的装置能形成三种化学物质的浓度梯度阵列，可广泛用于涉及到多条件筛选的各种生化反应。
背景技术
生化分子的浓度梯度广泛涉及到各种生化反应，如材料合成、粒子自组装、药物筛选、酶动力学研究、细胞刺激以及蛋白质结晶等领域。微流控芯片以其微型化、集成化、自动化和高通量为特色，已被广泛用于化学和生物等领域中样品的制备、反应、分离和检测。基于微流控芯片的浓度梯度装置具有以下特点：样本消耗小，时空可控，易于实现高通量，可获得静态或动态的浓度梯度。
目前，基于微流控芯片的浓度梯度发生器已有许多报道，主要可分为基于流体动力学进行组分分配的装置(如经典的圣诞树结构)，基于水油双相流的液滴装置，基于微阀的装置，以及基于滑移芯片的装置。所述前三种装置能够产生线型(线性或非线性)的浓度梯度，但大多数只能只针对一种或者两种物质的线型组合。基于滑移芯片形成两种物质的浓度梯度阵列(双浓度梯度阵列)装置已有报道。然而，可同时实现三种物质的组合，从而得到三维浓度梯度阵列的装置并未见报道。前文中提到的各种生化反应常会涉及到多种物质多种浓度条件的筛选，比如蛋白质结晶，涉及到蛋白质浓度，沉淀剂组分和浓度，添加剂组分和浓度，pH值，离子强度等条件的筛选，多达成百上千种组合。相比线型浓度和双浓度梯度阵列装置，一个简单而高通量的多物质浓度梯度装置在筛选效率上可提高一到两个数量级，大大节省时间、人力成本和样本消耗，因此显得尤为重要而必要。
发明内容
本发明的目的是克服现有线型浓度梯度装置或双浓度梯度阵列装置在多物质多水平条件筛选时的局限，提供一种结构简单，操作简易，样品消耗量少且能实现多种物质浓度组合的三维浓度梯度阵列装置。
本发明的另一个目的是提供了一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置的应用，利用该装置，可快速获取多物质的浓度梯度，简单的实现生化条件地高通量筛选。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种三维浓度梯度阵列装置，包括上基片和下基片，其特征在于，上基片设置有N个进样口，与N个进样口对应的，设置有N个出样口；上基片中设置有不连通的样品通道；下基片上设置有不连通的样品通道；上基片在样品通道间设置有1个样品的样品沟槽，下基片在样品通道间设置有N-1个样品的样品沟槽，上基片和下基片的样品沟槽均不与样品通道连接；当上下基片结合时，上下基片的通道成为连通的样品通道，样品通道与对应的样品沟槽连接，连通后的样品通道对应相应的出样口和进样口；当移动上基片时，上基片上的样品沟槽完全覆盖下基片的样品沟槽，所有的样品通道之间断开，样品通道与样品沟槽断开，使得所有的样品沟槽中的样品完全混合，进行反应；
以上所述的阵列装置，N为大于等于2的自然数。
以上所述的方案中，优选的，N为3，在上基片中，设置有3个进样口和3个出样口，上基片中设置有不连通的样品通道；下基片上设置有不连通的样品通道；上基片在样品通道间设置有1个样品的样品沟槽，下基片在样品通道间设置有2个样品的样品沟槽，上基片和下基片的样品沟槽均不与样品通道连接；当上下基片结合时，上下基片的通道成为连通的样品通道，样品通道与对应的样品沟槽连接，连通后的样品通道对应相应的出样口和进样口；当水平平移上基片时，上基片上的样品沟槽完全覆盖下基片的样品沟槽，所有的样品通道之间断开，样品通道与样品沟槽断开，使得所有的样品沟槽中的样品完全混合，进行反应；
一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置的应用，可利用该装置进行多物质浓度梯度组合，从而用于生化反应条件或药物的筛选。
以上所述的应用中，其应用过程包括：阵列装置的上下基片通过油进行组合密封，组合后的装置上下基片间可以相互滑动，从而可在进样状态和反应状态下相互切换；在进样状态，组合后的上下基片能通过样品通道将样品沟槽连接形成多组相连通的通道，在各组通道中分别注入不同的化学物质；为进入反应状态，保持下基片不动，滑动上基片，可以让每条通道上本来连通的样品沟槽断开，同时让含有多种物质的多个样品沟槽重叠构成一个独立的单元，每个独立的单元里的多个样品沟槽的体积大小比都不同，三种物质通过扩散就可以形成不同的浓度比值，最后得到一个含有多种物质的浓度梯度阵列。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提出了一种能实现三种物质的浓度梯度阵列装置，通过有效利用三维空间，将用于装载三种样品的、体积大小不同的样品沟槽以平行方式分布在上下两块基片上，通过一步滑动使装置由进样状态切换到反应状态实现三个样品沟槽的重叠从而可快速得到含有三种物质的浓度梯度阵列。该三维浓度梯度阵列装置有望广泛用于多种生化反应的大规模条件筛选。
附图说明
图1可产生24组筛选条件的三维浓度梯度阵列装置上、下基片微通道结构示意图；
图1中(a)为上基片微通道结构示意图，包括样品入口、样品出口、样品通道和用于装载一种溶液的样品沟槽；
图1中(b)为下基片微通道结构示意图，包括样品通道和用于装载另外两种溶液的样品沟槽。
图2可产生24组筛选条件的三维浓度梯度阵列装置组装图；
图2中(a)为上下基片组装后的进样状态示意图，样品沟槽通过连接通道在水平方向连接成多组平行的结构分别用于三种物质的装载；
图2中(b)为阵列装置反应状态示意图，三种物质的样品槽重叠构成24个独立的反应单元，每个单元里的三个反应槽的体积比都各不相同，最后得到的三种物质的浓度在每个单元里都不一样。图中细黑色线条所示为上基片，粗灰色线条所示为下基片。
图3可产生24组筛选条件的三维浓度梯度阵列装置实物图；
图3中(a)为A,B,C三种颜色的食物色素进样图；
图3中(b)为上基片沿水平方向滑动一定距离后使样品槽里的溶液混合进入扩散反应状态；
图3中(c)为扩散反应完全状态，红色色素从左至右颜色递减，绿色色素从左至右颜色递增，蓝色色素从上至下颜色递减。
图4可产生104组筛选条件的三维浓度梯度阵列装置上、下基片微通道结构示意图；图4中(a)为上基片微通道结构示意图，包括连通通道和用于装载一种溶液的样品沟槽；图4中(b)为下基片微通道结构示意图，包括连通通道和用于装载另外两种溶液的样品沟槽。
图5三种化学物质在104组筛选条件的三维浓度梯度阵列装置上的浓度分布示意图；
其中：(a)装载了三种染料(模拟三种化学物质)的芯片装置。芯片的四个角分别定义为α,β,γ和δ。
(b-d)不同角度所见的浓度分布柱状图。
(e)三种物质在芯片上沿不同方向的浓度变化趋势。
图6三维浓度梯度阵列装置上对lysozyme与trypsin两种蛋白质结晶条件的筛选示意图；
(a)和(d)分别为lysozyme与trypsin蛋白晶体的显微图像；(b)和(e)白光和偏振光下两种蛋白晶体的显微图像；(c)和(f)X射线下两种晶体的衍射图。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。本发明实施例以3种物质进样混合为例进行说明，更多种物质的混合也可以以相同的方式进行，也为本发明的保护范围。在本发明中，无论是样品通道还是样品沟槽，均是在基片表面蚀刻的具有一定深度的凹槽。
实施例1：
一种三维浓度梯度阵列装置，包括上基片和下基片；在上基片中，设置有3个进样口和3个出样口，上基片中设置有不连通的样品通道(图1中(a))；下基片上设置有不连通的样品通道；上基片在样品通道间设置有1个样品的样品沟槽，下基片在样品通道间设置有2个样品的样品沟槽(图1中(b))，上基片和下基片的样品沟槽均不与样品通道连接，样品沟槽的大小根据筛选的需要设置有不同；当上下基片结合时(通过硅油或氟化油进行组装密封)，上下基片的通道成为连通的样品通道，样品通道与对应的样品沟槽连接，连通后的样品通道对应相应的出样口和进样口(图2中(a))；当水平平移上基片时，上基片上的样品沟槽与下基片的样品沟槽重叠，组成24个独立的单元，所有的样品通道之间断开，样品通道与样品沟槽断开，使得所有的样品沟槽中的样品完全混合，进行反应(图2中(b))，由于不同单元中样品沟槽的大小有差别；因此不同单元中各样品的浓度不同，可用于反应条件的筛选。
图3所示为通过湿法刻蚀玻璃所得的三维浓度梯度阵列装置。将加工所得的上、下两块基片通过硅油组装后形成进样状态，可由进样口分别注入红，绿，蓝三种食物色素，如图3中(a)所示；然后水平向右将上基片滑动一定距离使装置进入图3中(b)所示的反应状态；三种色素通过扩散实现完全混合，得到一个含有三种颜色的24个浓度组合的阵列，如图3中(c)所示。本发明可以很容易扩展到更高通量的三维浓度梯度阵列，如图4所示的上基片和下基片通过组合得到的装置能产生三种物质的104个浓度梯度组合；如图5所示，将三种食物色素通入装置，最后可以让三种色素在不同方向上形成梯度组成一个含有104个浓度组合的阵列。
实施例2：
一种用于生化反应条件筛选的三维浓度梯度阵列装置的应用：
将实施例1中含有24个浓度组合的阵列装置(图2)用于lysozyme与trypsin两种蛋白的结晶条件筛选。
对于lysozyme，通入装置的三种溶液分别为：A,30％PEG 3000；B,1M NaCl；C,50mg/mL lysozyme；三种溶液均以0.1M Sodium Acetate,pH 4.6作为基本的缓冲液配制；结晶温度为295K。
对于trypsin，通入装置的三种溶液分别为：A,30％PEG 4000；0.5M ammoniumsulfate；C,80mg/mL trypsin,0.01M NaCl,0.01M benzamidine hydrocholoride；b三种溶液均以0.1M Sodium Acetate,pH 4.6作为基本的缓冲液配制；结晶温度为295K。
图6给出了两种蛋白在三维浓度梯度阵列装置中得到的晶体的显微图和X-射线衍射图，证明该装置可以成功用于蛋白质的结晶条件筛选。图6(a)和(b)分别为阵列装置中3-4单元(第三排第四列)与3-6单元中得到的lysozyme晶体；图6(d)的上、下图分别为阵列装置中2-1和3-1单元获得、生长了5天的trypsin晶体；图6(e)为阵列装置中2-1单元获得、生长了30天的trypsin晶体。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种三维浓度梯度阵列装置，包括上基片和下基片，其特征在于，上基片设置有N个进样口，与N个进样口对应的，设置有N个出样口；上基片中设置有不连通的样品通道；下基片上设置有不连通的样品通道；上基片在样品通道间设置有1个样品的样品沟槽，下基片在样品通道间设置有N-1个样品的样品沟槽，上基片和下基片的样品沟槽均不与样品通道连接；当上下基片结合时，上下基片的通道成为连通的样品通道，样品通道与对应的样品沟槽连接，连通后的样品通道对应相应的出样口和进样口；当移动上基片时，上基片上的样品沟槽完全覆盖下基片的样品沟槽，所有的样品通道之间断开，样品通道与样品沟槽断开，使得所有的样品沟槽中的样品完全混合，进行反应；
以上所述的阵列装置，N为大于等于3的自然数。
2.根据权利要求1所述的阵列装置，其特征在于：N为3，在上基片中，设置有3个进样口和3个出样口，上基片中设置有不连通的样品通道；下基片上设置有不连通的样品通道；上基片在样品通道间设置有1个样品的样品沟槽，下基片在样品通道间设置有2个样品的样品沟槽。
3.权利要求1所述的阵列装置在生化反应条件筛选中的应用。
4.权利要求1所述的阵列装置在药物筛选中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其应用过程包括：阵列装置的上下基片通过油进行组合密封，组合后的装置上下基片间可以相互滑动，从而在进样状态和反应状态下相互切换；在进样状态，组合后的上下基片通过样品通道将样品沟槽连接形成多组相连通的通道，在各组通道中分别注入不同的化学物质；为进入反应状态，保持下基片不动，滑动上基片，让每条通道上本来连通的样品沟槽断开，同时让含有多种物质的多个样品沟槽重叠构成一个独立的单元，每个独立的单元里的多个样品沟槽的体积大小比都不同，三种物质通过扩散形成不同的浓度比值，最后得到一个含有多种物质的浓度梯度阵列。
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