CN106754317B - 一种微流体细胞药物浓度梯度生成器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微流体细胞药物浓度梯度生成器，包括四组进液孔，通过微通道相连通，以在微通道中构成不同体积比例的药物与培养基层流组合；一组具有微混合功能的微通道，保证不同体积比例的药物与培养基层流组合能够充分混合，最终形成不同浓度，与直接从进液孔引出的两个通道中的液体浓度，共同构成九个浓度梯度；一组腔室与上述微混合通道相连，用于细胞培养以及与药物相互作用研究，九个腔室相互独立。本发明浓度梯度生成器在浓度梯度的生成过程中几乎不受进液速度的影响，可形成良好的线性浓度梯度，结构简单，为细胞药物的筛选、检测提供了全新的平台。

Description

一种微流体细胞药物浓度梯度生成器

技术领域

本发明涉及设计微流控芯片领域，尤其涉及一种用于细胞药物浓度梯度生成器。

背景技术

药物筛选，作为新药研究的最初过程和关键步骤，是从天然或合成的化合物中筛选出高效的新药或先导化合物，对可能作为药物使用的物质进行生物活性、药理作用及药用价值的评估过程[1]。随着细胞生物学技术的迅速发展，其具有的微量化、超高通量化的优点，使其为基于细胞水平的高通量新药筛选提供了途径[2]。基于细胞模型的高通量筛选，能够在群体细胞水平或单细胞水平[3]，通过单次实验，监测和定量分析多种细胞事件，为药物的初步筛选提供可靠信息。传统高通量筛选利用光学仪器，在微量滴定板小孔内分析群体细胞的荧光信号。这类方法需要繁琐的样品预处理过程和机械化的溶液交换操作，且成本昂贵，不能适应大规模样品的同时筛选[4]。微流控芯片凭借其样品及试剂消耗少、分析速度快、效率高、操作模式灵活多变、集成化优势明显等特点，为细胞水平高通量药物筛选提供了一个优秀的实验技术平台[5]。

浓度梯度微流控芯片由于可以在内部建立起稳定的浓度梯度，且可以与细胞培养技术相结合，因此越来越受到关注，被广泛地用于细胞水平的药物筛选[6]。最经典的微流体浓度梯度生成器是在2000年由Whiteside课题组提出的“圣诞树”模型[7]，该模型基于控制低雷诺数层流流动的溶液的扩散混合，从而在微流体通道网络中形成组分梯度。基于该模型的微流体梯度生成器一直沿用至今。Wang等人[8]构建了单个微流体装置用于生成了氧气和药物的浓度梯度，并用于研究肿瘤细胞-药物在动态缺氧微环境下的相互作用。基于该装置，成功地进行了低氧肿瘤细胞治疗的靶向生物学研究，以及研究了低氧特异性和常氧依赖性抗肿瘤药物对不同类型的肿瘤细胞的抗肿瘤作用。类似地，Chang等人[9]开发了一种PDMS-PC材料结合的氧气和药物浓度梯度生成器微流体芯片，并基于该装置演示了基于细胞的药物测试以及细胞迁移实验。Xu等人[10]开发了一种新型的具有稳定浓度梯度的微流体平台进行芯片上细胞培养与筛选测定。该芯片在梯度生成器的基础上，将静态的细胞培养区域与动态的细胞营养物质供给结构相结合，细胞可以稳定地与外部液体环境发生交换。Hong等人[11]设计制备了基于纸张的浓度梯度发生器，通过纸纤维内的扩散和混合产生药物阿霉素的梯度浓度，并结合3D细胞培养阵列，用于监测药物阿霉素对肿瘤细胞的毒性反应，降低了分析成本。

此外，同样地基于扩散混合的原理，许多新颖的微流体浓度梯度生成器被报道。Wu等人[12]开发了一种简单且通用的微流体细胞密度梯度生成器用量子点细胞毒性测定。该微流体密度梯度发生器由八个平行通道构成，每个通道分别含有1-8个微孔，细胞通过重力落入微孔中，细胞密度取决于微孔数。Kilinc等人[13]构建了一种微流体双梯度发生器，进行基于细胞的药物组合测定。该发生器能够产生彼此正交地对准的多种溶质的线性浓度梯度，能够对组合药物对细胞的作用效果进行监测。为了研究细胞梯度的主动控制对生物系统和组织重建的影响。Li等人[14]提出了一种由多个细胞梯度组装而成的三维微流体通道。将同源细胞悬浮液装载到3D阶梯形PDMS微通道中，在10分钟内通过沉降以产生细胞梯度。细胞梯度可以通过精确控制制造过程中每层的高度来实现。Li等人[15]还开发了一种多功能梯度发生器的微流体装置用于高通量的单细胞多药耐药性分析。梯度曲线可以由分配微通道的长度确定，而不受流速和压力的影响，且具有良好的稳定性以及能显着减少冗余的微流体通道结构。

稳定的微流体浓度梯度生成器为细胞在不通药物浓度下的筛选，提供重要的保障，经典的基于“圣诞树”结构的浓度梯度生成器在许多研究中被采用，然而此类型的生成器对液体流速有较高的要求(通常在1μl/min左右最佳，速度越快产生的梯度效果越差)，这无疑限制了药物筛选的效率，而且无法探究药物流速对细胞作用的影响，复杂的微通道结构也会造成试剂残留；其他多数新颖的梯度生成器设计方案基本都是基于液体之间的混合扩散原理，且无不需要精密的制备技术、操作技术，受流体速度的影响极大。经典的“圣诞树”浓度梯度生成模型[7]，基于分流的形式形成浓度梯度，将不同浓度的液体进行组合，充分混合后再分流，最后在下游管道，形成浓度梯度。因为浓度的数量＝层数+2，如要得到不同的浓度，所需要的层数将会很多，这样会导致芯片通道冗长、结构复杂。如此使得其扩展能力较差，难以实现高通量的生物分析。此外，流速对浓度梯度的稳定性影响巨大(流速在0.001m/s-0.01m/s时能够形成良好的梯度，当流速大于0.01m/s时，梯度显著变化)，只适用于超低速下的细胞分析。因此有必要开发一种结构简单，梯度产生受速度影响小，且易于同时产生多种稳定梯度的微流体浓度梯度生成器用于细胞的药物筛选过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种微流体细胞药物浓度梯度生成器。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种微流体细胞药物浓度梯度生成器，包括多组进液孔；每组进液孔包括两个通过第一微通道连通的进液孔；所述第一微通道与第二微通道连通；其中至少两根第一微通道竖直设置，且与该两根第一微通道连通的两根第二微通道水平设置并连通后，形成公共微通道，该两根第一微通道各与一根折弯微通道连通；其余的第一微通道水平设置，与这些第一微通道连通的第二微通道均与所述公共微通道连通；所述公共微通道与多根微混合通道连通；所有的微混合通道、折弯微通道均各与一个腔室连通。

所述进液孔数量为8个；利用4组进液孔，基于分流的形式形成浓度梯度，将不同浓度的液体进行组合，充分混合后再分流，最后在下游管道，形成浓度梯度。比传统的依靠扩散实现浓度梯度产生的设计结构更加简单，不受进液速度的影响，浓度梯度生成效率高。

所述微混合通道为蛇形，能够保障层流液体充分地混合。

所述第一微通道、第二微通道、微混合通道、折弯微通道横截面宽度为50-100微米，长度为15-40微米，能够满足多数加工工艺的要求。

第一组进液孔的第一个进液孔、第二组进液孔的第一个进液孔、第三组进液孔的第一个进液孔、第四组进液孔的第一个进液孔的进液种类相同，能够同时产生同一种混合液体的多个浓度梯度。

所述微混合通道为五到八个方波周期以上，能够保证层流液体混合均匀。

与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：本发明克服了浓度梯度生成器中液体流速对浓度梯度产生的限制，解决了现有浓度生成器通道结构复杂的缺点，同时获得了多种稳定的浓度梯度；将浓度梯度产生、细胞培养、药物检测与分析集成到一块结构简单的微流体芯片上，能够提高药物的利用率，浓度产生快，提高药物与细胞作用过程的效率，为研究肿瘤细胞在抗肿瘤药物的多种浓度梯度下的凋亡情况，筛选目标药物提供了一种新型的平台。

附图说明

图1为本发明微流体浓度梯度生成器设计示意图。

图2为本发明微流体梯度生成器设计原理图。

图3(a)～图3(d)为本发明微流体浓度梯度生成器浓度分布云图；图3(a)进液速度0.007m/s；图3(b)进液速度0.07m/s；图3(c)进液速度0.1m/s；图3(d)进液速度0.5m/s。

图4为本发明不同进液速度情况下的浓度梯度曲线。

具体实施方式

如图1，本发明实施例包括四组进液孔；每组进液孔包括两个通过第一微通道11连通的进液孔；所述第一微通道11与第二微通道12连通；其中两根第一微通道11竖直设置，且与该两根第一微通道连通的两根第二微通道12水平设置并连通后，形成公共微通道13，该两根第一微通道各与一根折弯微通道14连通；其余的第一微通道11水平设置，与这些第一微通道11连通的第二微通道均与所述公共微通道14连通；所述公共微通道14与多根微混合通道9连通；所有的微混合通道9、折弯微通道14均各与一个腔室10连通。

基于扩散混合的微流体浓度生成器主要依赖于在低雷诺数条件下，液体之间的混合扩散的原理，所以当速度增大，层流增强，扩散减弱，产生的浓度梯度会大大减少。因此，为了克服该效应，我们拟通过采用四组进液口，按照不同的微通道长度，在速度较高的时候，搭配产生有序的层流，经过充分的混合后以获得不同的最终浓度，这种方案相比圣诞树结构通道设计简单，操作简易(如图1)。例如，如图2所示微通道截面，在微通道中两种液体(蓝色代表浓度为0，红色代表浓度为1)的层流体积各占通道的50％，则完全混合好后的浓度为0.5；而若浓度为0的液体在层流中体积占30％，而浓度为1的液体在层流中体积占70％，最终的混合好的浓度应为0.7；同理，浓度为0的液体在层流中体积占70％，而浓度为1的液体在层流中体积占30％，最终的混合好的浓度应为0.3。因此，可按照此规律将两种不同的液体以不同的层流体积组合好，再通过一种高效的微混合器实现充分混合，即可同时获得多种稳定的浓度。此外，在一定范围内，液体流速越快，越易于产生层流，因此，增大的流速对于浓度梯度的产生几乎没有影响，也就克服了传统浓度梯度生成器只能在低雷诺数条件下适用的限制，提高了浓度梯度产生的效率。

为了实现细胞在药物的多种浓度梯度作用下的细胞状态研究，在微混合器的末端连接了细胞培养室，将细胞悬液加入芯片细胞入口端，调整液面差，利用静压力缓慢进样，待细胞培养小室内充满大量细胞后，调整液面差，终止进样，待细胞贴壁生长，适时给芯片换液，去除细胞废液，保持新鲜培养液连续灌注，使得细胞在培养瓶内正常生长。随后即可利用该梯度生成器将药物与培养基注入，观察细胞在不同浓度药物作用下的形态变化，以筛选目标浓度药物。

微混合通道包括至少五到八个方波周期(15)，本发明中所指的周期，是指图1中所示的底面朝向同一侧的U形的个数。

为了验证拟采取的方案的可行性，采用AutoCAD进行微流体浓度梯度生成器的建模，通道横截面(通道横截面为矩形)宽度为80微米，长度为30微米，采用gambit软件划分均匀地六面体网格后，采用计算流体力学软件fluent进行仿真模拟，结果如图3所示，可以观察到明显的梯度浓度云图。此外，为了验证在不同流速下的，产生的浓度梯度的效果，分别测试模拟速度在0.007m/s、0.07m/s、0.1m/s以及0.5m/s，(对应体积速度为1μl/min、10μl/min、14.3μl/min以及71.4μl/min)时的浓度分布，如图4所示，浓度梯度的线性度随速度的增大而增强(接近于1)，只有当速度极低(1μl/min)，产生的浓度梯度曲线的线性度稍有下降。因此，本发明克服了传统的浓度梯度生成器只能在低雷诺数条件下产生浓度梯度的限制，提高了浓度梯度产生的效率，且可以在稳定的浓度梯度下测试药物流速等条件对细胞作用的影响。

参考文献

1.Junwei Shi,E.W.,Joseph P Milazzo,Zihua Wang,Justin B Kinney,Christopher R Vakoc,Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9screeningof protein domains.Nature Biotechnology,2015.33:p.661-667.

2.Hyun,K.-A.and H.-I.Jung,Advances and critical concerns with themicrofluidic enrichments of circulating tumor cells.Lab on a Chip,2014.14(1):p.45-56.

3.Lecault,V.,et al.,Microfluidic single cell analysis:from promise topractice.Current Opinion in Chemical Biology,2012.16(3-4):p.381-390.

4.E.Claire Markway,S.N.B.,A Review of the Methods,Interpretation,andLimitations of the Urine Drug Screen.Orthopedics,2011.34:p.877-881.

5.Min-Hsien Wu,S.-B.H.,Gwo-Bin Lee,Microfluidic cell culture systemsfor drug research.Lab Chip,2010.10:p.939–956.

6.Folch,T.M.K.a.A.,Biomolecular gradients in cell culture systems.LabChip,2008.8:p.34–57.

7.Noo Li Jeon,S.K.W.D.,Daniel T.Chiu,Insung S.Choi,Abraham D.Stroock,and George M.Whitesides,Generation of Solution and Surface Gradients UsingMicrofluidic Systems.Langmuir 2000.16:p.8311-8316.

8.Wang,L.,et al.,Construction of oxygen and chemical concentrationgradients in a single microfluidic device for studying tumor cell-druginteractions in a dynamic hypoxia microenvironment.Lab on a Chip,2013.13(4):p.695-705.

9.Chang,C.-W.,et al.,A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybridmicrofluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygengradients for cell culture studies.Lab on a Chip,2014.14(19):p.3762-3772.

10.Xu,B.-Y.,et al.,A novel microfluidic platform with stableconcentration gradient for on chip cell culture and screening assays.Lab on aChip,2013.13(18):p.3714-3720.

11.Hong,B.,et al.,A concentration gradient generator on a paper-basedmicrofluidic chip coupled with cell culture microarray for high-throughputdrug screening.Biomedical Microdevices,2016.18(1).

12.Wu,J.,et al.,A simple and versatile microfluidic cell densitygradient generator for quantum dot cytotoxicity assay.Lab on a Chip,2013.13(10):p.1948-1954.

13.Kilinc,D.,et al.,A microfluidic dual gradient generator forconducting cell-based drug combination assays.Integrative Biology,2016.8(1):p.39-49.

14.Li,Y.,et al.,Assembly of multiple cell gradients directed bythree-dimensional microfluidic channels.Lab on a Chip,2015.15(15):p.3203-3210.

15.Li,Y.,et al.,High-throughput single cell multidrug resistanceanalysis with multifunctional gradients-customizing microfluidicdevice.Sensors and Actuators B-Chemical,2016.225:p.563-571.

Claims (6)

1.一种微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，包括多组进液孔；每组进液孔包括两个通过第一微通道（11）连通的进液孔；所述第一微通道（11）与第二微通道（12）连通；其中两根第一微通道（11）竖直设置，且与该两根第一微通道连通的两根第二微通道（12）水平设置并连通后，形成公共微通道（13），该两根第一微通道各与一根折弯微通道（14）连通；其余的第一微通道（11）水平设置，与这些第一微通道（11）连通的第二微通道均与所述公共微通道（13）连通；所述公共微通道（13）与多根微混合通道（9）连通；所有的微混合通道（9）、折弯微通道（14）均各与一个腔室（10）连通。

2.根据权利要求1所述的微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，所述进液孔数量为8个。

3.根据权利要求1所述的微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，所述微混合通道（9）为蛇形。

4.根据权利要求1所述的微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，所述第一微通道（11）、第二微通道（12）、微混合通道（9）、折弯微通道（14）横截面宽度为50-100微米，长度为15-40微米。

5.根据权利要求2所述的微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，第一组进液孔的第一个进液孔、第二组进液孔的第一个进液孔、第三组进液孔的第一个进液孔、第四组进液孔的第一个进液孔的进液种类相同。

6.根据权利要求1所述的微流体细胞药物浓度梯度生成器，其特征在于，所述微混合通道（9）为五到八个底面朝向同一侧的U形。