CN109722387A - 一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，由流动层与玻璃层构成；流动层上设有浓度梯度结构生成区，浓度梯度结构生成区设有六边形的流体通道，六边形的流体通道上设有3个进样口，六边形的流体通道的外周设有6个第一微通道，第一微通道的出液端均连通有第一微环圆圈通道；第一微环圆圈通道出液端连通有环形通道，环形通道上设置12个第二微通道，第二微通道出液端均连通有第二微环圆圈通道；第二微环圆圈通道出液端均连通有缓冲通道，缓冲通道出液端连通有细胞培养腔。本发明通过不同微管道网络的布局可以同时实现针对两种不同细胞使用相同药物治疗，通过形成药物浓度梯度作用于同种或不同细胞，从而达到细胞分选药物筛选的目的。

Description

一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用。

背景技术

众所周知，细胞在生命体内的微环境是高度精准的，为了解体内微环境的瞬间变动，学者们已研制出众多体外浓度生成器。主要包括Dunn腔、Zigmomd腔、生物凝胶等技术。但随之而来的是上述方法无法维持长久的浓度梯度，无法扩大到多种生物类别共用一种设备，也无法精确生成所需单一浓度或混合浓度等。此外，目前一些抗恶性肿瘤药物对于癌细胞的研究需要花费大量的时间、设备，同时还伴有巨大的试剂消耗，并且传统细胞培养方法无法模拟体内血液流动以及药液的连续供给。针对这些问题，急需设计出一种新的装置，以解决上述问题。

近些年，微流控手段已被用于研究生物、分子等方向。与此同时，基于微流控芯片产生药物浓度的研究也如雨后春笋一般发展迅速，包括模拟人体器官的浓度梯度操控、控制细胞行为及其生长状态、药物对伤口愈合和炎症消除的探究、药物传递、癌细胞转移等。微流控芯片(Microfluidic device)技术是在微全分析系统(micro total analysissystem,μTAS)的基础上构建起来的。微流控芯片指的是将微流体应用于一种特定芯片的控制方法，它泛指用μm级的管道处理或者作用于痕量(10^-9到10^-18升)流体的一个科学系统。随着生物化学等相关学科的快速发展，细胞生物学结合微流控芯片的相关研究对揭示疾病机理、筛选药物、研制新型药物等各个层面显现出重要的现实意义，对生命内在运行机理的探索发现成为当下一个热门的研究领域。它能够将样品预处理、生物化学分析及定性定量检测等多功能集成在一块极小的材料里，具有微型化、分辨率高、成本低等特点，因此，将其用于药物筛选和细胞分选，以解决现有技术中存在的问题，无疑是一种新的思路和方法。

发明内容

本发明提供了一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，适于细胞培养，且可以形成并提供长时间稳定的药物浓度梯度，还实现了两种药物的不同配比的最优选择，适用于药物筛选和细胞分选。

本发明的第一个目的是提供一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，由上层的流动层与下层的玻璃层构成；所述流动层上设有浓度梯度结构生成区，所述浓度梯度结构生成区设有六边形的流体通道，所述六边形的流体通道上等间距设置有3个进样口，所述六边形的流体通道的外周等间距设置有6个第一微通道，且每个所述进样口均与其中一个第一微通道进液端位置相对，每个所述第一微通道的出液端均连通有第一微环圆圈通道，每个所述第一微环圆圈通道内均设置有第一螺旋式微混合器；每个所述第一微环圆圈通道的出液端均连通有同一个环形通道，所述环形通道上等间距设置有个第二微通道，每个所述第二微通道的出液端均连通有第二微环圆圈通道，每个所述第二微环圆圈通道内均设置有第二螺旋式微混合器；

每个所述第二微环圆圈通道的出液端均连通有缓冲通道，每个所述缓冲通道的出液端均连通有细胞培养腔，每个细胞培养腔均设有细胞注入口。

优选的，所述细胞培养腔的纵截面为长方形，且尺寸为700μm×3mm。

优选的，所述第一微环圆圈通道、所述第二微环圆圈通道以及所述缓冲通道的宽度均为150μm。

优选的，所述六边形的流体通道、第一微通道、第一微环圆圈通道、环形通道、第二微通道、第二微环圆圈通道、缓冲通道、细胞培养腔、细胞注入口的高度均为50μm。

本发明的第二个目的是提供一种上述用于药物筛选的集成化微流控芯片在药物筛选中的应用，具体包括如下步骤：

步骤1，将细胞悬浮液通过各细胞注入口注入各细胞培养腔中，待各细胞培养腔注满后，将所述微流控芯片置于细胞培养箱中培养；

步骤2，培养至细胞贴壁后，通过各细胞注入口将细胞培养液注入各细胞培养腔中，待各细胞培养腔注满后，将微流控芯片再置于细胞培养箱中培养；

步骤3，培养48-72h后，在微流控芯片置于细胞培养箱的条件下，往其中一个进样口或两个进样口中分别持续注入待测药物溶液，另外一个进样口中持续注入所述细胞培养液，48-72h后停止注入所述待测药物溶液和细胞培养液，再从细胞注入口注入洗涤溶液，对细胞进行洗涤；

步骤4，洗涤完毕后，往细胞注入口注入染色溶液，对细胞进行染色处理；

步骤5，对染色处理后的微流控芯片进行检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明将药物浓度梯度生成、细胞培养、药物对细胞作用结果集成在一张芯片上，并通过缓冲通道实现浓度梯度生成结构区和细胞培养区的独立工作和整体运行，实现各功能的灵活切换，避免不同结构区的互相干扰。

采用本发明的微流控芯片研究临床药物诱导肿瘤细胞凋亡坏死作用，与传统的孔板技术相比，省去了配置不同药物溶液的繁冗操作，大大简化了细胞接种、受激、洗涤和染色等操作过程，显著降低了细胞数量和试剂耗量，同时该芯片通过形成12个不同浓度梯度的细胞培养腔，可以实现通过不同浓度梯度的药物来达到验证药物浓度对细胞的影响的目的；通过不同的微管道网络的布局可以同时实现针对两种不同细胞使用相同浓度药物治疗，达到细胞分选的目的；与此同时，我们还实现了使用不同浓度药物作用同种细胞或不同种细胞，以实现药物筛选的目的。

附图说明

图1为本发明微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明微流控芯片中流动层的结构示意图；

图3为本发明微流控芯片的流动层中六边形的流体通道的结构示意图；

图4为实施例3和实施例4中明场下肝肿瘤HepG2细胞和乳腺肿瘤MCF-7细胞的生长状态图；

图5为实施例5中进样口和细胞培养腔的编号位置关系图；

图6为实施例5中AO/PI染色后荧光显微镜下培养24、48、72h后肝肿瘤HepG2细胞和乳腺肿瘤MCF-7细胞形态图；

图7为实施例5中药物对肝肿瘤HepG2细胞和乳腺肿瘤MCF-7细胞的细胞活力影响图；

图8是实施例6中加入两种药物后芯片内形成的不同浓度梯度表征图；

图9为实施例6中加入两种药物治疗后MCF-7的生长活性折线图。

附图标记说明：

1-流动层，2-玻璃层，3-六边形的流体通道，4-进样口，5-第一微通道，6-第一微环圆圈通道，7-环形通道，8-第二微通道，9-第二微环圆圈通道，10-缓冲通道，11-细胞培养腔，12-细胞注入口。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述各实施例中使用的螺旋式微混合器为现有设备，与王瑞金2006年7月发表在中国机械工程第17卷第13期的论文《一种新型螺旋式微混合器及其流场的数值研究》中所使用的螺旋式微混合器的结构和功能相同；

DDP、DXR购买自北京索莱宝生物公司，灭活胎牛血清购买自美国GIBCO实验室；DMEM培养液的品牌为GIBCO，购买自北京亚米生物科技有限公司，货号为C11330500BT；MCF-7人源性乳腺癌细胞株和HepG2人源性肝癌细胞株均购买自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；AO吖啶橙和PI碘化丙啶均购买自美国Sigma公司；其他试验方法和材料，如无特殊说明，均为常规方法和常规市售材料。

实施例1

一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，为PDMS单层芯片，具体如图1-3所示，由上层的流动层1与下层的玻璃层2构成，其中流动层1为PDMS材质的流体通道，其与下层的玻璃层2通过薄PDMS层粘连成流体通道单元；流动层1上设有浓度梯度结构生成区，液流在其中交叉分流从而产生相应浓度梯度，浓度梯度结构生成区设有六边形的流体通道3，六边形的流体通道3上等间距设置有3个进样口4，每个进样口4均开设于六边形的流体通道3的一个顶点处；进样口4用于待测药物溶液以及细胞培养液的进样。

六边形的流体通道3的外周等间距设置有6个第一微通道5，且每个进样口4均与其中一个第一微通道5进液端位置相对，这种设置方式，当从该进样口4加入待测药物溶液时，其所正对的第一微通道5中形成该待测药物溶液的最大浓度。

每个第一微通道5的出液端均连通有第一微环圆圈通道6，每个第一微环圆圈通道6内均设置有第一螺旋式微混合器；每个第一微环圆圈通道的出液端均连通有同一个环形通道7，环形通道7上等间距设置有12个第二微通道8，每个第二微通道8的出液端均连通有第二微环圆圈通道9，每个第二微环圆圈通道9内均设置有第二螺旋式微混合器；第一螺旋式微混合器和第二螺旋式微混合器的设置目的是为了使进入其中的药液混合物或药液与细胞培养液的混合物能够混合均匀。

每个第二微环圆圈通道9的出液端均连通有缓冲通道10，每个缓冲通道10的出液端均连通有细胞培养腔11，细胞培养腔11的纵截面为长方形，且尺寸为700μm×3mm，相邻的两个细胞培养腔11之间的间隔为3.5mm；每个细胞培养腔11均设有细胞注入口12。

本发明中，为了确保在每个细胞培养腔11内所形成的药物化学浓度是均匀一致的，每个第一微环圆圈通道6和每个第二微环圆圈通道9的总长大致为12.8mm，这样就能保证不同浓度的液流均匀混合。

第一微环圆圈通道6与第二微环圆圈通道9、缓冲通道10的宽度均为150μm。

需要说明的是，第一微环圆圈通道6、第二微环圆圈通道9以及缓冲通道10的宽度均为150μm；六边形的流体通道3、第一微通道5、第一微环圆圈通道6、环形通道7、第二微通道8、第二微环圆圈通道9、缓冲通道10、细胞培养腔11、细胞注入口12的高度均为50μm。

实施例2

实施例1中用于药物筛选的集成化微流控芯片的制备方法如下：

步骤1，设计并打印结构：通过AutoCAD软件设计微流控芯片的结构，然后通过印刷技术打印到透明的掩膜上；

步骤2，制作芯片模板：将硅片用体积比为1:3的双氧水和浓硫酸的混合溶液清洗15min以上，然后按照无水乙醇、丙酮和超纯水的顺序将硅片依次洗净；清洗之后的硅片通过加热板进行烘干，随后使用六甲基二硅氧烷对硅片表面进行修饰进而令光刻胶稳定、不易被洗掉，之后将已经修饰好的硅片放置在甩胶机内，并向硅板正中心倾倒Az-50XT光刻胶，用2000rpm的转速将光刻胶甩至适合的高度，然后进行紫外曝光，即将已经处理好的硅片和掩膜均放置在具有紫外线的光刻机内部，此时打印在掩膜上的黑色图像就会遮挡紫外线的照射，而其他未被遮挡的部分则会通过紫外线照射被刻蚀，此时在硅片上会留下掩膜中黑色部分的图案；将处理后的硅片清洗后晾干，即完成芯片模板的制作；

步骤3，制作芯片：在制作芯片模板前，对硅片表面修饰至少3min(用三甲基硅烷蒸汽)，之后用匀胶机将PDMS预聚物混匀，再将其倒入用锡箔纸包好的放有芯片模板的培养皿中，用连有真空泵的真空干燥箱除去PDMS预聚物的气泡，然后放置于80℃下加快发生聚合反应，30min后，待预聚物凝固，轻轻将锡箔纸剥去，用刀片小心取出芯片模板，此时，芯片模板上的构建好的芯片结构就已经被软刻蚀在凝固后的PDMS上了，得到PDMS芯片，用刀片切掉多余的PDMS部分，最后使用打孔器将PDMS芯片上的出口和入口打通；

与此同时，将1g的PDMS预聚物在混胶机中充分混匀，得到胶液，然后使用匀胶机将胶液均匀旋涂在载玻片的表面，在60℃的烘箱内烘1h后，将PDMS芯片贴在处理好的载玻片上，然后放置在80℃的烘箱内过夜，即得到用于药物筛选的集成化微流控芯片。

实施例3

将实施例2制备出的用于药物筛选的集成化微流控芯片用于乳腺肿瘤MCF-7细胞培养，具体包括以下步骤：

选取实施例2中微流控芯片，使用精密注射泵将2μL细胞密度为1×10⁶ml^-1的乳腺肿瘤MCF-7细胞悬浮液通过其中一个细胞注入口12注入相对应的细胞培养腔11中，并利用精密注射泵施加驱动力，使细胞悬浮液的注入速度为2.0μl·min^-1；待MCF-7细胞悬浮液注满细胞培养腔11后，移走精密注射泵，使细胞培养腔11中的细胞悬浮液处于静止状态，然后将微流控芯片置于CO₂细胞培养箱中培养；培养12h后细胞贴壁，然后对细胞进行照片拍摄以观察细胞的生长状态，具体结果见图4。

实施例4

将实施例2制备出的用于药物筛选的集成化微流控芯片用于肝肿瘤HepG2细胞培养，具体步骤同实施例3，不同之处在于将实施例3中的乳腺肿瘤MCF-7细胞替换为肝肿瘤HepG2细胞，具体结果见图4。

实施例3和实施例4分别采用实施例2制备出的微流控芯片对MCF-7细胞和HepG2细胞进行了培养，从图4可以看出，MCF-7细胞和HepG2细胞灌注后均匀分布于细胞培养腔11中，随着时间的推移，细胞的生长状况也较好，基本上均匀的贴壁，细胞形态也很正常，未出现凋亡、自噬、空泡等非正常状态的细胞，并且细胞量也越来越多，这说明我们试验中用到的两种细胞株均可以正常地生长于本发明制备出的微流控芯片中，为后续的试验奠定了基础。

实施例5

将实施例2制备出的用于药物筛选的集成化微流控芯片用于药物筛选，在试验之前，我们首先对每个进样口4和每个细胞培养腔11进行编号，具体见图5，其中编号为Inlet1的进样口4位置与编号为Chamber1的细胞培养腔11位置相对应，编号为Inlet2的进样口4位置与编号为Chamber9的细胞培养腔11位置相对应，编号为Inlet3的进样口4位置与编号为Chamber5的细胞培养腔11位置相对应；

具体操作步骤如下：

步骤1，选取实施例2中微流控芯片，使用精密注射泵向Chamber1-Chamber4的细胞培养腔11内灌注2μL浓度为1×10⁶ml^-1的乳腺肿瘤MCF-7细胞悬浮液；再使用精密注射泵向Chamber6-Chamber9的细胞培养腔11内灌注2μL浓度为1×10⁶ml^-1的肝肿瘤HepG2细胞悬浮液；Chamber5细胞培养腔11作为空白对照组；

待各细胞悬浮液注满各细胞培养腔11后，移走精密注射泵，使细胞培养腔11中的细胞悬浮液处于静止状态，然后将微流控芯片置于CO₂细胞培养箱中培养；

步骤2，培养12h后细胞贴壁，细胞培养腔11内细胞可以达到60-80％的汇合率，这个生长状态下的细胞非常适合进行抗肿瘤细胞药物检测；

用含有10％质量份灭活胎牛血清的DMEM培养液(以下简称10％灭活胎牛血清的DMEM培养液)轻轻地冲洗掉未能贴壁的细胞，再用精密注射泵经由各细胞注入口12往各细胞培养腔11中注入含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液，注入速度为2.0μl·min^-1，待各细胞培养腔11注满后，将微流控芯片再置于CO₂细胞培养箱中于37℃下培养；

步骤3，培养48h后，在微流控芯片置于CO₂细胞培养箱的条件下，往Inlet1的进样口4处注入浓度为60ng·ml^-1的DXR，往Inlet2的进样口4处注入浓度为60ng·ml^-1的DXR；往Inlet3的进样口4处注入含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液，以对药液起稀释作用，形成浓度梯度；使用精密注射泵同步施加驱动力，使得溶液注入速度为2.0μl·min^-1，并保持溶液从浓度梯度结构生成区流向阵列式细胞培养区；

48h后停止注入DXR及含10％灭活小牛血清的DMEM培养液，从细胞注入口12加入PBS(磷酸盐缓冲液，0.01M，pH＝7.4)，使用精密注射泵施加驱动力，使磷酸盐缓冲液以2.0μl·min^-1对细胞进行洗涤；

步骤4，洗涤完毕后，往细胞注入口12处注入10μg·ml^-1的AO/PI染液，精密注射泵施加驱动力，使AO/PI染液以2.0μl·min^-1对细胞进行染色，染色完毕后在37℃的CO₂细胞培养箱中；

然后每24h拍摄一组每个细胞培养腔11内的照片，持续72h，用于后续的细胞活力的检测。

实施例5研究了DXR对MCF-7细胞和HepG2细胞的分选，为了说明实施例5的效果，我们选择有代表性的Chamber12细胞培养腔11内的细胞对其活力进行检测，以说明芯片内细胞活力，结果见图6和图7，图6中，每一行的第一张图片为AO染液染色后拍摄的细胞形态图，第二张图片为PI染液染色后拍摄的细胞形态图，第三张图片为前两张图片叠加之后得到的细胞形态图，由图6可知，随着药物作用时间的增加，呈现亮荧光的细胞个数随之增多，即发生凋亡的细胞数增多，通过软件对所得荧光图像做进一步分析，计算出各实验组细胞的坏死凋亡率，并绘制给药组对HepG2和MCF-7影响的曲线，如图7所示，由图7可知，给药组对人肝肿瘤细胞和乳腺肿瘤细胞均有一定的促凋亡作用，并且随着给药浓度的增加及作用时间的延长，抑制作用增强，呈现出一定的剂量关系。

实施例6

将实施例2制备出的用于药物筛选的集成化微流控芯片用于药物筛选，具体包括以下步骤：

步骤1，选取实施例2中微流控芯片，使用精密注射泵将2μL细胞密度为1×10⁶ml^-1的乳腺肿瘤MCF-7细胞悬浮液通过各细胞注入口12注入各细胞培养腔11中，并利用精密注射泵施加驱动力，使细胞悬浮液的注入速度为2.0μl·min^-1；待细胞悬浮液注满各细胞培养腔11后，移走精密注射泵，使细胞培养腔11中的细胞悬浮液处于静止状态，然后将微流控芯片置于CO₂细胞培养箱中培养；

步骤2，培养12h后细胞贴壁，细胞完成贴壁后，用含有10％灭活胎牛血清的DMEM培养液轻轻地冲洗掉未能贴壁的细胞，再用精密注射泵经由各细胞注入口12往各细胞培养腔11中注入含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液，注入速度为2.0μl·min^-1，待各细胞培养腔11注满后，将微流控芯片再置于CO₂细胞培养箱中于37℃下培养；

步骤3，培养72h后，在微流控芯片置于CO₂细胞培养箱的条件下，往Inlet1进样口4处注入浓度为60ng·ml^-1的DXR，往为Inlet2进样口4中注入浓度为60ng·ml^-1的DDP(顺铂)，Inlet2进样口4中注入含10％灭活小牛血清的DMEM培养液；使用精密注射泵同步施加驱动力，使得溶液注入速度为2.0μl·min^-1，并保持溶液从浓度梯度结构生成区流向阵列式细胞培养区；

72h后停止注入DXR及含10％灭活小牛血清的DMEM培养液，Chamber1-Chamber4的细胞培养腔11内形成了60ng·ml^-1、45ng·ml^-1、30ng·ml^-1、15ng·ml^-1的DXR药液浓度，Chamber6-Chamber9的细胞培养腔11内形成了15ng·ml^-1、30ng·ml^-1、45ng·ml^-1、60ng·ml^-1的DDP药液浓度，Chamber10-Chamber12细胞培养腔11内分别形成三个总浓度都为60ng·ml^-1的两种混合药液，浓度比分别是是1:3、1:1、3:1，Chamber5细胞培养腔11作为空白对照。

从细胞注入口12加入PBS(0.01M，pH＝7.4)，使用精密注射泵施加驱动力，使磷酸盐缓冲液以2.0μl·min^-1对细胞进行洗涤；

步骤4，洗涤完毕后，往细胞注入口12处注入10μg·ml^-1的AO/PI染液，精密注射泵施加驱动力，使AO/PI染液以2.0μl·min^-1对细胞进行染色，染色完毕后在37℃的CO₂细胞培养箱中；

然后每24h拍摄一组每个细胞培养腔11内的照片，持续72h，用于后续的细胞活力的检测。

需要说明的是，实施例5-6中，DXR和DDP药液都是用含有10％灭活小牛血清的的DMEM培养液配制的。

对实施例6中芯片内细胞活力进行测定，具体结果见图8-9，其中图8是加入两种药物后芯片内形成的不同浓度梯度表征图，图8中标尺表示在不同培养室内形成的药物浓度百分比，由图8可以清楚的看出两种药物在芯片内的浓度分布；图9是两种药治疗后MCF-7的生长活性折线图，且图9中从左到右每一条折线分别按顺序对应从Chamber1到Chamber12细胞培养腔11的细胞活力，Chamber5空白对照组对应的折线有所不同，和其他折线有相交。由图9我们可以看出，在药物治疗相同的时间后，随着两种药物浓度的升高，细胞活力逐渐降低；而在相同浓度的药物治疗下，随着药物治疗时间的延长，对细胞的杀伤力则越强。而在相同的治疗时间下，Chamber12细胞培养腔11的药液浓度比对于细胞的杀伤效果最佳。因此，该芯片具有研究同种细胞对于不同药物治疗的筛选效果的能力，同时具有研究两种药物较好配比的作用。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，由上层的流动层(1)与下层的玻璃层(2)构成；所述流动层(1)上设有浓度梯度结构生成区，所述浓度梯度结构生成区设有六边形的流体通道(3)，所述六边形的流体通道(3)上等间距设置有3个进样口(4)，所述六边形的流体通道(3)的外周等间距设置有6个第一微通道(5)，且每个所述进样口(4)均与其中一个第一微通道(5)进液端位置相对，每个所述第一微通道(5)的出液端均连通有第一微环圆圈通道(6)，每个所述第一微环圆圈通道(6)内均设置有第一螺旋式微混合器；每个所述第一微环圆圈通道(6)的出液端均连通有同一个环形通道(7)，所述环形通道(7)上等间距设置有12个第二微通道(8)，每个所述第二微通道(8)的出液端均连通有第二微环圆圈通道(9)，每个所述第二微环圆圈通道(9)内均设置有第二螺旋式微混合器；

每个所述第二微环圆圈通道(9)的出液端均连通有缓冲通道(10)，每个所述缓冲通道(10)的出液端均连通有细胞培养腔(11)，每个细胞培养腔(11)均设有细胞注入口(12)。

2.根据权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养腔(11)的纵截面为长方形，且尺寸为700μm×3mm。

3.根据权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述第一微环圆圈通道(6)、所述第二微环圆圈通道(9)以及所述缓冲通道(10)的宽度均为150μm。

4.根据权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片，其特征在于，所述六边形的流体通道(3)、第一微通道(5)、第一微环圆圈通道(6)、环形通道(7)、第二微通道(8)、第二微环圆圈通道(9)、缓冲通道(10)、细胞培养腔(11)、细胞注入口(12)的高度均为50μm。

5.一种权利要求1所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片在药物筛选中的应用。

6.根据权利要求5所述的用于药物筛选的集成化微流控芯片在药物筛选中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将细胞悬浮液通过各细胞注入口(12)注入各细胞培养腔(11)中，待各细胞培养腔(11)注满后，将所述微流控芯片置于细胞培养箱中培养；

步骤2，培养至细胞贴壁后，通过各细胞注入口(12)将细胞培养液注入各细胞培养腔(11)中，待各细胞培养腔(11)注满后，将微流控芯片再置于细胞培养箱中培养；

步骤3，培养48-72h后，在微流控芯片置于细胞培养箱的条件下，往其中一个进样口(4)或两个进样口(4)中分别持续注入待测药物溶液，另外一个进样口(4)中持续注入所述细胞培养液，48-72h后停止注入所述待测药物溶液和细胞培养液，再从细胞注入口(12)注入洗涤溶液，对细胞进行洗涤；

步骤4，洗涤完毕后，往细胞注入口(12)注入染色溶液，对细胞进行染色处理；

步骤5，对染色处理后的微流控芯片进行检测。