CN111378573A - 微管道核酸扩增系统 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种微管道核酸扩增系统，包括油浴控温装置、由多个子管道通过相应微阀门串联而成的微管道、流体驱动装置和控制器。油浴控温装置包括油浴槽和设置在油浴槽底部的半导体制冷器，用于通过控制半导体制冷器升降温以实现油浴槽内填充油的高低温循环；微管道设置在油浴槽的底部，油浴槽的填充油高度高于微管道在油浴槽内的最大高度，以使微管道浸泡在填充油中；控制器用于通过控制流体驱动装置驱动流体运动和各微阀门的开闭以对微管道进行分区间的样本处理和温度控制。本申请可实现微管道的准确控温，以满足原位PCR扩增与检测需求。
Description
技术领域
本申请涉及定量即时聚合酶链锁反应技术领域，特别是涉及一种微管道核酸扩增系统。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)为一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，通过模拟天然DNA分子的复制过程可将微量的DNA在生物体外大幅增加；从而可将原来低于检测线目标基因扩增到可以分析的级别以进行定性分析，该技术操作简单，灵敏度高，被广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction，定量即时聚合酶链锁反应)为一种在DNA扩增反应中，以荧光染剂侦测每次PCR循环后产物总量的方法技术，作为当今最为重要的分子生物学检测手段，可以快速识别样本中细菌、病毒、微生物的类型与耐药性突变，分析灵敏度远远超过其他检测手段。仅需要二三十分钟的极短时间，就可以准确检测不同微生物种群数量，因此在食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、科研实验室、食品安全、化妆品检测、环境卫生等几乎所有的生命科学领域都有重要应用前景。
定量PCR分为dPCR(Digital Polymerase Chain Reaction，数字PCR)以及qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System，实时荧光定量核酸扩增检测系统)两种，这两种技术均需要依赖dPCR或qPCR分析仪完成。无论常规的dPCR还是qPCR分析仪，在进行分子诊断的过程中往往由于存在操作过程复杂、对操作人员的专业技能要求高、测试过程容易被污染的弊端而导致测试失败，检测结果容易出现“假阳性”结果等。
为了解决上述问题，PCR芯片技术应用而生，该技术实现过程简单，不依赖操作人员的专业技术，且可避免测试过程被污染。PCR芯片技术的核心是实现待测样本从95度到55度左右反复的升温降温过程，即循环温控。伴随着PCR芯片技术的问世，在POCT(point-of-care testing)现场快速原位检测领域起到了至关重要的作用，即在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，是可以快速得到检验结果的一类新方法。所有面向于POCT(point-of-care testing，即时检验)现场原位快速检测的技术，其核心是如何实现在原位环境之下完成待测微生物，例如细菌真菌等微生物或植物的细胞壁裂解，从而释放核酸；并在后续的核酸扩增过程中实现快速与小型化的检测模式。
但是，对于PCR芯片技术，特别是其主流技术的连续流动PCR芯片技术，虽然可以实现重量轻能耗低的技术构建，但是对于微管道准确控温一直是难点，这也造成对于这一技术往往只能实现对细菌质粒等已处理过的核酸样本的原位扩增，而对于细菌真菌的微生物样本，即便是细胞壁比较薄的大肠杆菌，也难以通过高温的方式直接对细胞壁进行裂解与核酸释放，以满足原位PCR扩增与检测需求。
鉴于此，如何实现微管道的准确控温，以满足原位PCR扩增与检测需求，是所属领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种微管道核酸扩增系统，可实现微管道的准确控温，以满足原位PCR扩增与检测需求。
为解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：
本发明实施例提供了一种微管道核酸扩增系统，包括油浴控温装置、由多个子管道通过相应微阀门串联而成的微管道、流体驱动装置和控制器；
其中，所述油浴控温装置包括油浴槽和设置在所述油浴槽底部的半导体制冷器，用于通过控制所述半导体制冷器升降温以实现所述油浴槽内填充油的高低温循环；
所述微管道设置在所述油浴槽的底部，所述油浴槽的填充油高度值大于所述微管道在所述油浴槽内的最大高度值，以使所述微管道浸泡在所述填充油中；
所述控制器用于通过控制所述流体驱动装置驱动流体运动和各微阀门的开闭以对所述微管道进行分区间的样本处理和实时温度控制。
可选的，还包括用于存储原菌液样本的样本存储装置；所述样本存储装置设置第一孔和第二孔，所述第一孔插入裂解液输送子管道，所述第二孔插入混合液输送子管道；
所述样本存储装置与细胞壁裂解液存储试剂盒通过所述裂解液输送子管道相连接，以通过所述流体驱动装置将所述细胞壁裂解液存储试剂盒的裂解液推入至所述样本存储装置；
所述样本存储装置与PCR扩增子管道通过所述混合液输送子管道相连，以将所述原菌液样本和所述裂解液的混合液体推入至所述PCR扩增子管道中进行PCR扩增。
可选的，还包括设置在所述PCR扩增子管道和所述混合液输送子管道之间、且体积可控的裂解混合子管道；
所述流体驱动装置控制所述原菌液样本和所述裂解液的混合液体在所述裂解混合子管道的管道内在预设温度区间内进行往返运动。
可选的，所述微管道中还包括微球输入子管道；
所述微球输入子管道的一端与微球存储装置相连，另一端与所述裂解混合子管道相连接；所述流体驱动装置驱动所述微球存储装置中的微米级惰性微球颗粒通过所述微球输入子管道进入所述裂解混合子管道中。
可选的，还包括设置在所述裂解混合子管道和所述PCR扩增子管道之间的过滤装置；
所述过滤装置包含微米级滤筛，用于过滤大于预设尺寸阈值的颗粒杂质、破壁后的细胞器官或细胞壁片段。
可选的，所述微管道包括PCR扩增子管道，还包括与所述PCR扩增子管道相连的基因分析装置、与所述基因分析装置相连的光学检测装置；
所述基因分析装置用于对扩增后的原菌液样本进行指纹分析；所述光学检测装置用于对指纹分析结果进行基因序列片段分析。
可选的，所述基因分析装置包括毛细管电泳和电压升压装置；
所述毛细管电泳为在所述PCR扩增子管道后端填充电泳凝胶的玻璃二氧化硅或硅基材质的毛细电泳管。
可选的，还包括设置在所述微管道上的光学成像与分析系统；
所述光学成像与分析系统用于对所述原菌液样本在PCR扩增过程中进行荧光定量分析，以计算得到所述原菌液样本的初始浓度。
可选的，所述油浴控温装置包括填充二甲基硅油的铝箔油浴槽、温度传感器、散热片和风扇；
所述温度传感器设置在所述铝箔油浴槽内、且与所述微管道的距离不大于预设距离阈值；所述散热片设置在所述半导体制冷器底部，所述风扇设置在所述散热片的下方。
可选的，所述微管道为内径为0.8mm、外径为1.6mm、管长为10cm的铁氟龙管。
本申请提供的技术方案的优点在于，将微管道设置在油浴控温装置的油浴槽底部，油浴控温装置为微管道内的原菌液样本的PCR扩增提供合适的温度，油浴控温装置通过简单便携的单一半导体制冷器的升降温控制油浴槽内填充油的高低温循环，油浴可提供更均匀的受热环境，使微管道内的原菌液样本试剂整体受热更均匀，反应更充分，实现更稳定可控的温度循环，从而实现对微管道的准确控温，以满足原位PCR扩增与检测需求。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本公开。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或相关技术的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的基于连续流动模式实现温度循环的系统结构图；
图2为本发明实施例提供的直接将微管道放置于平板热循环仪循环的系统结构图；
图3为本发明实施例提供的微管道核酸扩增系统的一种具体实施方式结构框架示意图；
图4为本发明实施例提供的油浴控温装置的一种具体实施方式结构示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”“第四”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述特定的顺序。此外术语“包括”和“具有”以及他们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可包括没有列出的步骤或单元。
为了解决常规dPCR和qPCR分析仪在进行分子诊断的过程中往往由于存在操作过程复杂、对操作人员的专业技能要求高、测试过程容易被污染的弊端而导致测试失败，检测结果容易出现“假阳性”结果等的问题，Cepheid公司生产的GeneXpert qPCR分析仪，成为世界上第一个也是唯一的一个将样品准备、扩增与检测完全整合的定量PCR仪。但是，GeneXpert qPCR分析仪整个系统控制异常复杂，需要依赖复杂的电路系统以及机械系统，而且只是集成了样本预处理与实时荧光定量PCr的功能，并不包含后续的基因指纹分析等关键功能，且样本预处理方面也不包括对于一些需要升温的裂解液的集成与应用。
为了解决上述现有技术的一些弊端，PCR芯片技术应运而生。伴随着PCR芯片技术的问世，在采样现场即刻分析样本成为可能，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，从而提高检验结果效率。但是，PCR芯片技术难以实现微管道的准确控温，从而造成对于这一技术往往只能实现对细菌质粒等已处理过的核酸样本的原位扩增，无法直接对样本进行处理。例如，本申请发明人近期就基于连续流动PCR模式成功研究出能耗少，重量轻，体积小的便携式PCR平台，可以应用于多种核酸的准确分析，从而达到小型便携、操作简单、即时报告等特点。但是所采用的分析样本并不是现场取样所得到的完整细菌，而是经过DNA提取处理后的样本。而且通过实验，发现如果将样本从核酸变成细菌或真菌就很难以实现原位扩增需求。另外，本申请发明人也通过调研发现，几乎所有基于连续流动式PCR芯片的基因扩增，基本都是面向细菌质粒或已经预先在芯片外部完成核酸的提取分离与纯化才最终实现在微管道中扩增的目标。
本申请发明人构建了多种不同微管道形式的连续流动式PCR平台从而进一步验证管道中原位扩增细菌的可行性。经过多次实验研究发现，对于连续流动PCR技术，例如图1所示基于连续流动模式实现温度循环的传统方法，即便是对于细胞壁比较薄的一些细菌或者真菌，例如大肠杆菌，也无法在内部直接通过95度的高温，破壁最终实现成功的扩增；另外通过将微管道直接放在通过帕尔提升降温计制的平板PCR仪器，如图2所示结构，同样无法实现直接针对于细菌的原位扩增过程。
本申请发明人分析这些实验失败的主要原因是微管道与加热板之间往往都是通过空气进行传热，而且微管道因为自身圆形的横截面也造成与加热板之间受热的不均匀性以及对于微管道内部的PCR试剂温度控制的准确性较差，很难以达到很准确的温度控制，结果导致不合理的退火温度，变性温度以及延伸温度，因此近年来研究微管道中PCR原位扩增的相关技术中，都不是直接采用原菌进行检测，而是会采用在现场取样后还需要回到实验室后进行微生物DNA的提取后，再配制试剂以实现微管道之中PCR检测。以上这些方法的DNA提取过程操作复杂，耗费时间过长，无法实现当场的即时检测。因此如何在芯片管道中实现细菌真菌等病原体原位PCR扩增，是多年来的难题。另外由于连续流动PCR芯片有非常长的管道距离，以及非常大的比表面积可能也是造成失败的间接原因。
与基于微管道的原位PCR扩增技术相对应，本申请发明人还对比了基于帕尔贴效应、通过h桥正反电路系统以及pwm脉冲调控，实现温度循环控制的传统PCR扩增仪器。只需要将200微升的离心管放在仪器设备之中，可以实现对细胞壁较薄的大肠杆菌原位扩增。这也主要是因为传统的PCR仪器可以给PCR离心管更大的受热面积，从而保证广泛更准确的温度控制条件。而且PCR离心管比表面积比较小也可以间接提升原位细菌扩张效率。
虽然传统的PCR扩增仪器在细胞壁比较薄的大肠杆菌的扩增方面满足原位扩增的需求，但是对于细胞壁比较厚的细菌，例如革兰士阳性菌，细胞壁往往较厚，约20～80纳米肽聚糖构成，仅仅通过高温无法实现细胞壁裂解要比以脂多糖为主要成分的细胞壁的革兰士阴性菌裂解与核酸释放。所以对于大部分革兰士阳性菌，均需要先通过裂解液及化学手段实现对细胞壁的解离，然后再通过PCR系统进行核酸扩增。
但是，由于传统的PCR扩增仪器都是采用封闭的PCR管，无法在原位的情况下与裂解液充分的分混合、破壁以及DNA提取等复杂的过程，因此难以满足致病性更高的革兰士阳性病原菌在内的所有微生物原位破壁裂解扩张的需求。而恰恰与传统的PCR技术相反，基于微管道的PCR技术的优势就是更容易与复杂的前后端功能的整合。但是，一方面由于微管道中做PCR的扩增效率较低，并且造成现状就是这一类微管道中的PCR技术与传统的PCR仪器一样，基本上在PCR扩增之前没有前端的细胞壁裂解进行整合，从而无法应用于包括革兰士阳性病原菌等细胞壁较厚的所有病原菌检测的技术；另一方面，PCR扩增之后也没有相关的核酸纯化或者通过毛细管电泳的基因指纹分析等相关的后续功能整合的技术，就大大限制了这一类技术普遍性在即时检验场景中被应用的前景。从而导致在微管道之中实现多功能整合的相关技术非常少。
为了解决上述一系列问题，本申请以基于POCT现场快速病原菌检测、在微管道中实现病原菌裂解液充分混合原位破壁、PCR扩增高效率为目标的多功能集成的微管道核酸扩增系统，针对于一些细胞壁比较厚的真菌或者细菌直接通过高温裂解的方式难以实现细胞壁原位裂解和问题，在本申请的整个体系中引入裂解液，并通过程序化流体传输与控制技术实现裂解液与病原菌在微管道之中高效率的混合实现核酸的释放，进一步通过微滤筛结构实现核酸之外的一些细胞成分分离与纯化，并且进一步通过温控优化的控制准确、且比表面积低的微管道实现核算原位高效率扩增，解决当前所有PCR扩散仪器普遍面临的难点，即因为放一个封闭的PCR离心管内部实现且因为离心管是一个封闭体系，无法与上下游的功能单元整合的弊端；以及传统的微管道PCR技术控温不准确造成反应效率低的弊端。在疾控、防疫、生化等领域的重要应用价值，包括炭疽邮件等生化防护、军队细菌病毒战、医院传染病检测、埃博拉等突发性重大公共安全卫生事件领域起到重大作用。
在介绍了本发明实施例的技术方案后，下面详细的说明本申请的各种非限制性实施方式。
首先参见图3，图3为本发明实施例提供的微管道核酸扩增系统在一种实施方式下的结构框架示意图，本发明实施例可包括以下内容：
微管道核酸扩增系统可包括油浴控温装置1、微管道2、流体驱动装置3和控制器4。
其中，油浴控温装置1可包括油浴槽10和设置在油浴槽底部的半导体制冷器11。油浴控温装置1用于通过控制半导体制冷器升降温以实现油浴槽内填充油的高低温循环。油浴槽的体积和材质可根据实际需求和应用场景进行确定，为了提高油浴槽的导热性能，油浴槽可为铝箔油浴槽。油浴槽内填充一定体积的油相液体，可为任何一种矿物油，也可为其他类型的油相液体，本申请对此不作任何限定。由于低粘度的二甲基硅油(100CS)具有很好的耐热性与热稳定性，油浴槽内填充的油相液体可为二甲基硅油，可以更好的保证温度的稳定均匀。由于微管道2设置在油浴槽的底部，油浴槽10的填充油高度要高于微管道2在油浴槽内的最大高度，以使微管道2全部浸泡在填充油中。
本申请的微管道2可由多个子管道通过相应微阀门串联，原菌液样本以连续流动微管道为载体，并以电磁阀等微阀门划分为多个功能区域，一个子管道对应一个功能区域，不同子管道实现不同的功能，各子管道通过微阀门开启和关闭来实现原菌液样本在微管道的流动位置。通过可编程流体驱动装置控制原菌液样本于每一个功能区域内在控制器4的计算机程序控制下进行程序化移动、停留与孵育时间控制，并且将微管道2浸泡于油浴控温装置1之中，可满足各个功能单元不同温度需求与程序化控温。微管道2可为铁氟龙管道，还可为利用PMMA、PC、PVC等材料所构成的管道，这均不影响本申请的实现。
在本发明实施例中，流体驱动装置3可为注射泵、恒压泵或者旋转泵等任何一种单泵或是多个单泵组合成多泵装置，本申请对此均不做任何限定。控制器4用于通过控制流体驱动装置驱动流体运动和各微阀门的开闭以对微管道进行分区间的样本处理和温度控制。也就是说，控制器4控制微管道2分区间的往复进样方法主要解决连续流动微管道2之中，多个功能单元依次顺序进样以及每一个功能单元不同的样本处理与温控的程序化调节可以达到每一步的要求。而每一个功能单元之间都通过连续流动的微管道进行串联，在微管道之间配备由控制器4控制的电磁阀通过计算机程序实现程序化的开关控制，此外，原菌液样本的进样、正反运动以及每一个功能单元的时间控制同样由控制器4通过控制注射泵或者是恒压泵的正反运动/正负压强的转换以及压力的控制来驱动相应的流体方向运动以及相应的频率以达到充分所需效果，或者是控制每一个功能单元内部的停留时间或孵育时间以确保每一个功能单元操作充分完成。控制器4可为智能终端的内嵌计算机程序或者是嵌入式单片机自动化软件，可根据当前应用场景预先编制好的计算机程序，在其他应用场景中，只需更改相应参数即可。
在本发明实施例提供的技术方案中，将微管道设置在油浴控温装置的油浴槽底部，油浴控温装置为微管道内的原菌液样本的PCR扩增提供合适的温度，油浴控温装置通过简单便携的单一半导体制冷器的升降温控制油浴槽内填充油的高低温循环，油浴可提供更均匀的受热环境，使微管道内的原菌液样本试剂整体受热更均匀，反应更充分，实现更稳定可控的温度循环，从而实现对微管道的准确控温，以满足原位PCR扩增与检测需求。
鉴于细胞壁较厚的细菌无法直接在高温情况下破壁，需要加入裂解液，以实现原菌液样本和裂解液的充分混合并进行原菌液细胞壁的裂解，还可包括用于存储原菌液样本的样本存储装置。样本存储装置设置第一孔和第二孔，第一孔插入裂解液输送子管道，第二孔插入混合液输送子管道；样本存储装置与细胞壁裂解液存储试剂盒通过裂解液输送子管道相连接，以通过流体驱动装置将细胞壁裂解液存储试剂盒的裂解液推入至样本存储装置；样本存储装置与PCR扩增子管道通过混合液输送子管道相连，以将原菌液样本和裂解液的混合液体推入至PCR扩增子管道中进行PCR扩增。样本存储装置例如可为一次性使用的200微升的离心管或者1.5毫升的离心管。在离心管的顶部可设置两个小型的孔道，中间插入铁氟龙管道或者硅胶管道的并实现密封。样本存储装置在每一次样本处理完成之后可以在系统内置换，而添加原菌液样本之后，可以通过两个管道分别连接于细胞壁裂解液存储试剂盒，另外一个管道则连接于破壁条件温控单元即油浴控温装置1或者病原菌样本与裂解液的反复混合单元。也就是说，还包括设置在PCR扩增子管道和混合液输送子管道之间、体积可控的裂解混合子管道；裂解混合子管道作为在预设温度区间内通过流体驱动装置控制原菌液样本和裂解液的混合液体在管道内进行往返运动的容器。同时在样本存储装置前端，微管道2中可包含多个换向的阀门，以实现不同介质顺序通过样本存储装置并且与后端的裂解混合子管道耦合。举例来说，首先与细胞壁裂解液存储试剂盒，例如chelex100以及蛋白酶k的混合溶液转向阀门打开，通过3流体驱动装置如注射泵或者恒压泵从入口位置推或者从出口位置吸的方式将裂解液推入到样本存储装置中进行简单的混合，然后此阀门关闭同时打开存储油(或者空气)的阀门，进而将样本推到后续的裂解混合子管道。当原菌液样本与裂解液的缓冲溶液的混合液进入到裂解混合子管道之中，通过对流体驱动装置3的程序化脉冲式正反向运动，促使混合溶液在裂解混合子管道之中往返运动，并且根据不同裂解液的属性合理调整控温的时间与程序。例如对于chelex100系统，往往需要在50度到60度之间进行过夜的孵育时间，然后需要将整个温控装置调高到接近于100度10分钟以上，实现蛋白酶k的充分降解，而在整个温控过程之中，都不断的对整个原菌液样本进行正反向的混匀控制以确保每一个功能单元混合与裂解的充分性。上述处理过程还有另外一种实施方式，那就是当裂解液在样本存储装置中与原菌液样本进行充分混合之后，可以通过阀门推动空气在样本存储装置中产生大量的气泡也可以实现混合的功能，这样的情况下，只需要对整个样本存储装置进行温控即可，例如用200微升的离心管，只需要将200毫升的离心管进行程序化温控亦可以达到上述要求，但是为了防止液体在升温过程中长时间造成了挥发，可在离心管内部添加少量的矿物油，这样在整个孵育时间内，可以很好的防控裂解液的挥发。而对于其他的裂解液，则根据相应的处理温度与时间的控制，适当的调整在整个裂解过程之中的控制参数已达到充分裂解的目的。
此外，为了进一步确保原菌液样本成功进行PCR扩增，还可包括设置在裂解混合子管道和PCR扩增子管道之间的过滤装置；过滤装置包含微米级滤筛，用于过滤大于预设尺寸阈值的颗粒杂质、破壁后的细胞器官或细胞壁片段。也就是说，可在裂解混合子管道的末端连接一个包含有微米级滤筛的过滤装置而过滤装置后端则连接于同样置于油浴之中的PCR扩增子管道，以确保原菌液样本之中的一些尺寸较大的颗粒杂志以及破壁之后较大的细胞器官或者细胞壁片段不进入到下一步的PCR扩增子管道之中。整个裂解过程完全结束之后，流体驱动装置3会推动整个裂解混合液体通过过滤筛进入到下一个功能单元，而一些尺寸较大的杂质为过滤筛阻挡无法进入下一个功能单元。
可选的，作为另外一种可选的实施方式，为了进一步提高裂解液和原菌液样本的充分混合，微管道中还包括微球输入子管道；微球输入子管道的一端与微球存储装置相连，另一端与裂解混合子管道相连接，用于通过流体驱动装置驱动微球存储装置中的微米级惰性微球颗粒。例如对于Chelex 100，本身就是有一种微米级尺寸的微球所构成，这种微球结构在上述的两种混合模式中，会强化混合的效果。对于不是由微球构成的裂解液，则可以在上述混合装置中人为添加微米级的惰性微球，辅助进行混合。而这些微球结构同样会再进入下一个功能单元也就是PCR扩增子管道之前会被过滤筛阻隔，从而保证只有释放的核酸分子等小分子进入下一功能单元进行温度循环反应以及核酸扩增。
可以理解的是，若想实现原菌液样本的PCR反应，需要试剂充分的接触，需要稳定的温度循环以及均匀的受热性。基于以上特性，若原菌液样本和裂解液的混合液体在裂解混合子管道进行充分混合，则微管道2可采用更粗的管道以实现试剂更充分的接触，例如微管道2可为内径为0.8mm、外径为1.6mm、管长为10cm的铁氟龙管。当然，微管道2的各个子管道的尺寸和材质均可不同，也即裂解混合子管道的内径可比其他子管道的内径大。
为了提高温度循环的稳定性和受热的均匀性，油浴控温装置1的结构图可如图4所示，油浴控温装置1可包括填充二甲基硅油0的铝箔油浴槽10、半导体制冷器11、温度传感器12、散热片13和风扇14。温度传感器12可设置在铝箔油浴槽10内、且与微管道2的距离不大于预设距离阈值；散热片13可设置在半导体制冷器11底部，风扇14可设置在散热片的下方。采用更简单便携半导体制冷器加热方式可实现更稳定可控的温度循环，微管道2的入口20和出口21设置在油浴控温装置1外。举例来说，可将50微升原菌液样本通入到0.8*1.6Teflon管(管长10cm)内，并在试剂两侧填充矿物油以防止挥发。将该管道放置在铝箔油浴槽10内，并在油浴槽内填充可以没过管道高度的二甲基硅油，最后在管道旁边放置一个温度传感器12，温度传感器12例如可为热敏电阻温度传感器，通过控制半导体制冷器升降温来实现油浴槽内硅油的高低温循环，从而实现原菌液样本的PCR反应。
作为一种可选的实施方式，微管道核酸扩增系统还可包括设置在微管道2上的光学成像与分析系统。光学成像与分析系统用于对原菌液在PCR扩增过程中进行荧光定量分析，以计算得到原菌液的初始浓度。也即通过设置光学成像与分析系统可满足荧光定量PCR，荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
为了提升微管道核酸扩增系统的适用性，系统中还包括与PCR扩增子管道相连的基因分析装置、与基因分析装置相连的光学检测装置。
基因分析装置用于将扩增后的原菌液样本进行指纹分析；光学检测装置用于对指纹分析结果进行基因序列片段分析。其中，基因分析装置例如可包括毛细管电泳和电压升压装置；毛细管电泳为在PCR扩增子管道后端填充电泳凝胶的玻璃二氧化硅或硅基材质的毛细电泳管。也就是说，对于PCR反应之后扩增片段，通过流体驱动装置3程序性进样控制，进一步将扩增之后的核酸片段推到最后一个功能单元，也就是基因分析单元。PCR扩增子管道后端可填充电泳凝胶的玻璃二氧化硅或硅基材质的毛细电泳管，通过十字交叉的微管道可进一步实现核酸跑胶功能。考虑到毛细管电泳往往需要较高的几千伏电压才可以实现核酸跑胶的功能，可将整合小型化的电压升压装置，实现便携式的几千伏电压需求的毛细管电泳分离以及相应的指纹分析。关于片段的长短可以通过跑胶距离以及跑胶时间来确定、也可以通过平行泳道以及跑胶用的标准核酸样品平行跑来确定。
最后，还需要说明的是，控制器4可以包括一个或多个处理核心，比如4核心处理器、8核心处理器等。控制器可以采用DSP(Digital Signal Processing，数字信号处理)、FPGA(Field－Programmable Gate Array，现场可编程门阵列)、PLA(Programmable LogicArray，可编程逻辑阵列)中的至少一种硬件形式来实现。控制器也可以包括主处理器和协处理器，主处理器是用于对在唤醒状态下的数据进行处理的处理器，也称CPU(CentralProcessing Unit，中央处理器)；协处理器是用于对在待机状态下的数据进行处理的低功耗处理器。在一些实施例中，控制器可以在集成有GPU(Graphics Processing Unit，图像处理器)，GPU用于负责显示屏所需要显示的内容的渲染和绘制。一些实施例中，控制器还可以包括AI(Artificial Intelligence，人工智能)处理器，该AI处理器用于处理有关机器学习的计算操作。
微管道核酸扩增系统中包括存储数据及计算机程序的存储器，存储器可以包括一个或多个计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质可以是非暂态的。存储器还可包括高速随机存取存储器，以及非易失性存储器，比如一个或多个磁盘存储设备、闪存存储设备。本实施例中，存储器至少用于存储以下计算机程序，其中，该计算机程序被处理器加载并执行之后，能够实现前述任一实施例公开方法的相关步骤。另外，存储器所存储的资源还可以包括操作系统和数据等，存储方式可以是短暂存储或者永久存储。其中，操作系统可以包括Windows、Unix、Linux等。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
专业人员还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
以上对本申请所提供的一种微管道核酸扩增系统进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本申请进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本申请权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种微管道核酸扩增系统，其特征在于，包括油浴控温装置、由多个子管道通过相应微阀门串联而成的微管道、流体驱动装置和控制器；
其中，所述油浴控温装置包括油浴槽和设置在所述油浴槽底部的半导体制冷器，用于通过控制所述半导体制冷器升降温以实现所述油浴槽内填充油的高低温循环；
所述微管道设置在所述油浴槽的底部，所述油浴槽的填充油高度值大于所述微管道在所述油浴槽内的最大高度值，以使所述微管道浸泡在所述填充油中；
所述控制器用于通过控制所述流体驱动装置驱动流体运动和各微阀门的开闭以对所述微管道进行分区间的样本处理和实时温度控制。
2.根据权利要求1所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，还包括用于存储原菌液样本的样本存储装置；所述样本存储装置设置第一孔和第二孔，所述第一孔插入裂解液输送子管道，所述第二孔插入混合液输送子管道；
所述样本存储装置与细胞壁裂解液存储试剂盒通过所述裂解液输送子管道相连接，以通过所述流体驱动装置将所述细胞壁裂解液存储试剂盒的裂解液推入至所述样本存储装置；
所述样本存储装置与PCR扩增子管道通过所述混合液输送子管道相连，以将所述原菌液样本和所述裂解液的混合液体推入至所述PCR扩增子管道中进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，还包括设置在所述PCR扩增子管道和所述混合液输送子管道之间、且体积可控的裂解混合子管道；
所述流体驱动装置控制所述原菌液样本和所述裂解液的混合液体在所述裂解混合子管道的管道内在预设温度区间内进行往返运动。
4.根据权利要求3所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，所述微管道中还包括微球输入子管道；
所述微球输入子管道的一端与微球存储装置相连，另一端与所述裂解混合子管道相连接；所述流体驱动装置驱动所述微球存储装置中的微米级惰性微球颗粒通过所述微球输入子管道进入所述裂解混合子管道中。
5.根据权利要求4所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，还包括设置在所述裂解混合子管道和所述PCR扩增子管道之间的过滤装置；
所述过滤装置包含微米级滤筛，用于过滤大于预设尺寸阈值的颗粒杂质、破壁后的细胞器官或细胞壁片段。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，所述微管道包括PCR扩增子管道，还包括与所述PCR扩增子管道相连的基因分析装置、与所述基因分析装置相连的光学检测装置；
所述基因分析装置用于对扩增后的原菌液样本进行指纹分析；所述光学检测装置用于对指纹分析结果进行基因序列片段分析。
7.根据权利要求6所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，所述基因分析装置包括毛细管电泳和电压升压装置；
所述毛细管电泳为在所述PCR扩增子管道后端填充电泳凝胶的玻璃二氧化硅或硅基材质的毛细电泳管。
8.根据权利要求1至5任意一项所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，还包括设置在所述微管道上的光学成像与分析系统；
所述光学成像与分析系统用于对所述原菌液样本在PCR扩增过程中进行荧光定量分析，以计算得到所述原菌液样本的初始浓度。
9.根据权利要求1至5任意一项所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，所述油浴控温装置包括填充二甲基硅油的铝箔油浴槽、温度传感器、散热片和风扇；
所述温度传感器设置在所述铝箔油浴槽内、且与所述微管道的距离不大于预设距离阈值；所述散热片设置在所述半导体制冷器底部，所述风扇设置在所述散热片的下方。
10.根据权利要求9所述的微管道核酸扩增系统，其特征在于，所述微管道为内径为0.8mm、外径为1.6mm、管长为10cm的铁氟龙管。
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