CN104745446A - 一种pcr和毛细管电泳集成的微流控芯片及采用该芯片的病原菌快速检测装置 - Google Patents
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Abstract
一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，与采用该芯片的细菌快速检测装置，包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起；所述下层基板上设有一PCR反应通道和一CE分离通道，所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽；所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔。与常规的基因分析流程相比，运用PCR和CE集成微流控芯片及其检测装置进行细菌的检测，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本，提高了分析过程的自动化程度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物检测技术领域，尤其涉及病原菌的检验。
背景技术
以特定的基因序列（片段）作为检测目标进行生物或组织的检测与识别，已成为生物学、生物化学、医学、环境与食品等领域中的重要技术手段，得到广泛的运用。常规基因分析过程通常需要使用如离心机、温度循环仪、平板凝胶电泳仪、荧光成像分析仪或毛细管电泳仪等多个设备。这对实验室的硬件条件和实验人员的操作水平都提出了比较高的要求，而且操作流程也比较繁琐，不易降低检测过程中发生的试剂和人工成本。样品在多个设备间转移，也增加了操作失误和样品污染的可能性。1990年，微全分析系统（μTAS）的概念被提出，为分子生物的检测分析开辟了新的发展方向。微全分析系统以微流控技术为基础，促进了分析检测设备的小型化、集成化和自动化，不仅可以降低设备的购置成本、试剂成本和人工操作成本，也为检测监控的实时化和现场化提供了技术途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，用微流控芯片的方式实现PCR和CE的集成。
本发明的目的还在于提供采用上述芯片的病原菌快速检测装置，可对病原菌进行快速检测。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于，包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起；
所述下层基板上设有一PCR反应通道和一CE分离通道，所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽；
所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔。
所述PCR反应通道是一条曲折通道，包含直线部分和弯曲部分；
所述直线部分包括平行排布的复数条直线通道，所述弯曲部分包括复数个弧形通道，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连。
以位于所述PCR反应通道的起始端的凹槽作为进样池，以位于所述PCR反应通道的末端的凹槽作为废液池。
所述CE分离通道，是一条直线通道，或者是如所述PCR反应通道式的曲折通道。以位于所述CE分离通道的起始端的凹槽作为分离液池，以位于所述CE分离通道的末端的凹槽作为废液池。
作为一种优选方式，连接所述PCR反应通道的末端的直线通道与所述CE分离通道交叉。可以是十字交叉，或双T形交叉。
所述上层基板、所述下层基板均可以是玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）等，基板要求具有一定的机械强度和较好的光学透过率。
采用PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片的病原菌快速检测装置，包括一原菌快速检测装置主体，包括一数据处理与控制模块，所述数据处理与控制模块连接一温控模块、一荧光检测模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，其特征在于，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起，所述下层基板上设有一PCR反应通道和一CE分离通道，所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽，所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔；
所述温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；
所述荧光检测模块包括一激发光源，激发光源产生较窄光谱带宽的激发光，并照射CE通道上，激发含有荧光分子的DNA片段发出荧光；
所述电源驱动模块包括一PCR驱动电源和一CE驱动电源，所述PCR驱动电源与两个分别放置在PCR反应通道的起始端和末端的电极相连接，所述CE驱动电源与两个分别放置在CE分离通道的起始端和末端的电极相连接。
所述半导体温控片可以贴合在微流控芯片的单面或两面，单面的数量为2～3个，半导体温控片的排列方向与PCR反应通道的直线通道的排列方向垂直。每一个半导体温控片都横跨PCR通道的所有直线部分，PCR通道的每一个直线部分都被所有温控片加热成为温度不同的几个温度区，用于PCR反应的变性、延伸和退火。
激发光源可以是发光二极管、激光二极管、宽谱带光源与窄带滤光片的组合等。
所述荧光检测模块还包括一光学传输单元，用于传输激发光和收集荧光，并滤除波长等于小于激发光的散射光。光学传输单元可以是由自由空间、光波导（例如光纤）和透镜构成。
所述荧光检测模块还包括一光电检测器，光电检测器将荧光信号转换成电信号，传输到数据处理和控制模块。光电检测器可以是光电二极管、光电三极管、光电倍增管、电荷耦合器件等。
所述数据处理与控制模块实现温控模块、荧光检测模块、电源驱动模块的控制与协调。包括：控制温控模块的半导体温控片对PCR通道加热，同时从温度传感器接受温度测量信号，产生反馈控制信号，使得温控模块在达到设定温度前对PCR通道持续加热，在达到设定温度后保持PCR通道的温度恒定；控制电源驱动模块中的PCR驱动电源，使DNA分子及其PCR扩增产物连续流过PCR通道；当PCR扩增后的DNA片段已经过CE通道的交叉部分，停止PCR驱动电源，开启CE驱动电源，使扩增后的DNA片段流过CE通道；控制荧光检测模块采集CE通道检测窗口处的荧光信号，并对获得的信号进行处理和存储。
所述显示与接口模块用于显示检测数据，或者与闪存设备、硬盘设备、电脑等其他设备连接，输出检测数据。
使用所述细菌快速检测装置时，在微流控芯片的PCR反应通道中填充PCR反应液，在CE分离通道中填充分离液；取适量含有样本DNA的试剂（例如1μL）注入微流控芯片的进样池；将微流控芯片插入检测装置，使电源驱动模块的电极放置在微流控芯片的槽孔中；开启本装置，然后本装置将在数据处理与控制模块的控制下自动完成包括PCR、CE、检测和数据输出在内的所有后续步骤。首先，数据处理和控制模块开启温控模块，使各温控片加热然后保持设定温度，在PCR通道中形成2～3个不同的温度区；然后，开启电源驱动模块的PCR驱动电源，驱动样本DNA及其PCR扩增产物连续流过PCR通道，完成PCR反应，并经过CE通道的交叉部分；接着，自动切换到CE驱动电源，驱动DNA片段电泳；同时开启荧光检测模块，检测CE通道的荧光信号；信号作为数据被显示和保存，并可输出到其他设备上。
本发明的有益效果在于：与常规的基因分析流程相比，运用PCR和CE集成微流控芯片及其检测装置进行细菌的检测，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本，只需一台设备就可完成检测；提高了分析过程的自动化程度，提高工作效率；避免试样在不同设备之间的转移，简化了人工操作，降低了试样污染的风险；微流控芯片减少了样品和试剂的消耗，降低了运行成本；本发明的装置体积小，可形成便携式设备，满足实时化、现场化的检测需要。
附图说明
图1是本发明装置的框图，其中，1－数据处理与控制模块，2－电源驱动模块，3－微流控芯片，4－荧光检测模块，5－温控模块，6－显示与接口模块。
图2是PCR与CE集成微流控芯片的结构示意图，其中，7－芯片基板，8－PCR通道，9－分离液池，10－废液池，11－芯片进样池，12－CE通道，13－温控片。
图3是运用病原菌快速检测装置检测牙龈卟啉菌（PorphyromonasGingivalis，Pg）的结果，其中，（a）是PCR反应的引物产生的信号，（b）是197bp的Pg细菌特异性序列产生的信号。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。
一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，由两片基板键合封接而成。基板的材料具有一定机械强度和较好的光学透过率，例如玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）等。下层基板上包含有PCR反应通道和CE分离通道，通道的端口有凹槽结构，用作试剂池。上层基板上包含有孔结构，位置与下层基板的凹槽结构对应，用于填充试剂和安置电极。其中：所述下层基板上，PCR反应通道是一条曲折的通道，包含直线部分和弯曲部分。通道的直线部分是平行排列的，通道的弯曲部分位于直线部分的两端，连接两个相邻的直线部分。所述PCR反应通道的起始端有凹槽结构，用作进样池；PCR反应通道的末端有凹槽结构，用作废液池。
所述下层基板上，CE分离通道是一条直线通道，或者是由弯曲通道连接起来的几条直线通道。CE分离通道的起始端有凹槽结构，用作分离液池；CE分离通道的末端有凹槽结构，用作废液池。
所述PCR反应通道末尾的最后一个直线部分与CE分离通道交叉（例如，可以是十字交叉，或双T形交叉）。所述上层基板上包含有孔结构，孔的位置与下层基板的凹槽相对应，用于填充试剂和放置电极。
一种运用所述PCR和CE集成微流控芯片的细菌快速检测装置，包含微流控芯片，温控模块，荧光检测模块，电源驱动模块，数据处理与控制模块，显示与接口模块。其中：
所述温控模块包含半导体温控片与温度传感器。半导体温控片用于改变PCR反应通道的温度。温度传感器用于测量PCR反应通道的温度，将温度转换为电信号。电信号传输到数据处理和控制模块，按照预先设定的算法由温度的电信号产生半导体温控片的反馈控制信号，使得温控片能够保持PCR反应通道处于恒定的设定温度。所述半导体温控片可以贴合在微流控芯片的单面或两面，单面的数量为2～3个，温控片的排列方向与PCR反应通道的直线部分的排列方向垂直。每一个温控片都横跨PCR通道的所有直线部分，PCR通道的每一个直线部分都被所有温控片加热成为温度不同的几个温度区，用于PCR反应的变性、延伸和退火。
所述荧光检测模块包含激发光源，光学传输单元和光电检测器。激发光源产生较窄光谱带宽的激发光，并照射CE通道上的检测窗口，激发含有荧光分子的DNA片段发出荧光。激发光源可以是发光二极管、激光二极管、宽谱带光源与窄带滤光片的组合等。光学传输单元用于传输激发光和收集荧光，并滤除波长等于小于激发光的散射光。光学传输单元可以是自由空间、光波导（例如光纤）和透镜。光电检测器将荧光信号转换成电信号，传输到数据处理和控制模块。光电检测器可以是光电二极管、光电三极管、光电倍增管、电荷耦合器件等。
所述电源驱动模块包含PCR驱动电源和CE驱动电源。PCR驱动电源与两个电极相连接，分别放置在PCR反应通道的起始端和末端，用于驱动DNA分子及其PCR扩增产物连续流过PCR通道。CE驱动电源与两个电极相连接，分别放置在CE分离通道的起始端和末端，用于驱动扩增后的DNA片段流过CE通道。
所述数据处理与控制模块实现温控模块、荧光检测模块、电源驱动模块的控制与协调。包括：控制温控模块的半导体温控片对PCR通道加热，同时从温度传感器接受温度测量信号，产生反馈控制信号，使得温控模块在达到设定温度前对PCR通道持续加热，在达到设定温度后保持PCR通道的温度恒定；控制电源驱动模块中的PCR驱动电源，使DNA分子及其PCR扩增产物连续流过PCR通道；当PCR扩增后的DNA片段已经过CE通道的交叉部分，停止PCR驱动电源，开启CE驱动电源，使扩增后的DNA片段流过CE通道；控制荧光检测模块采集CE通道检测窗口处的荧光信号，并对获得的信号进行处理和存储。
所述显示与接口模块用于显示检测数据，或者与闪存设备、硬盘设备、电脑等其他设备连接，输出检测数据。
使用所述细菌快速检测装置时，在微流控芯片的PCR反应通道中填充PCR反应液，在CE分离通道中填充分离液；取适量含有样本DNA的试剂（例如1μL）注入微流控芯片的进样池；将微流控芯片插入检测装置，使电源驱动模块的电极放置在微流控芯片的槽孔中；开启本装置，然后本装置将在数据处理与控制模块的控制下自动完成包括PCR、CE、检测和数据输出在内的所有后续步骤。首先，数据处理和控制模块开启温控模块，使各温控片加热然后保持设定温度，在PCR通道中形成2～3个不同的温度区；然后，开启电源驱动模块的PCR驱动电源，驱动样本DNA及其PCR扩增产物连续流过PCR通道，完成PCR反应，并经过CE通道的交叉部分；接着，自动切换到CE驱动电源，驱动DNA片段电泳；同时开启荧光检测模块，检测CE通道的荧光信号；信号作为数据被显示和保存，并可输出到其他设备上。
本发明的有益效果在于：与常规的基因分析流程相比，运用PCR和CE集成微流控芯片及其检测装置进行细菌的检测，减少了设备的数量，降低了硬件购置成本，只需一台设备就可完成检测；提高了分析过程的自动化程度，提高工作效率；避免试样在不同设备之间的转移，简化了人工操作，降低了试样污染的风险；微流控芯片减少了样品和试剂的消耗，降低了运行成本；本发明的装置体积小，可形成便携式设备，满足实时化、现场化的检测需要。
实施例1.一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片
PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片长76mm，宽22mm，厚2mm，由上下两层PDMS基板键合封接而成。上、下层基板厚度均为1mm，下层基板上包含PCR反应通道、CE分离通道和凹槽结构，上层基板包含孔结构，位置与下层基板的凹槽结构对应。
其中，下层基板7的结构如图2所示。PCR通道8的横截面尺寸为0.1mm×0.1mm，每两个相邻的直线部分为一组，可完成一次PCR反应，共有30组。CE通道12的横截面尺寸为0.1mm×0.1mm，总长16mm。PCR通道尾端的直线部分与CE通道十字交叉，交叉点位置据CE通道起始端1.3mm。芯片进样池15为圆形凹槽，直径5mm，深0.5mm。分离液池9为圆形凹槽，直径4mm，深0.5mm。废液池10和11均为圆形凹槽，直径4mm，深0.5mm。二步法PCR使用两个温控片13和14，其中，温控片13温度较高，用于变性，温控片14温度较低，用作延伸和退火。
工作时，微流控芯片的PCR通道8中填充有PCR反应液，CE通道12填充有分离液，芯片插入检测装置。将含有样本DNA的试剂1μL注入芯片进样池15，开启检测装置，装置自动完成所有后续步骤。首先，数据处理与控制模块1命令温控模块5加热温控片13和14，使温控片13的温度达到95℃，温控片14的温度达到65℃，之后由温控模块5保持温控片13和14的温度恒定；然后，数据处理与控制模块1命令电源驱动模块2的PCR驱动电源部分，在芯片进样池15和废液池10之间施加电压，芯片进样池15为负极，废液池10为正极；15分钟后，数据处理与控制模块1命令电源驱动模块2切换至CE驱动电源部分，在分离液池9和废液池11之间施加电压，分离液池9为负极，废液池11为正极；在CE驱动电源启动的同时，数据处理和控制模块1也命令荧光检测模块4启动，检测CE通道12的荧光信号；荧光信号传输到数据处理和控制模块1进行处理和保存，并可通过显示与接口模块6显示结果，或与其它设备连接。
实施例2.运用微流控芯片和检测装置快速检测牙龈卟啉菌（Porphyromonas Gingivalis，Pg）。
使用吸潮纸尖（天津达雅鼎医疗器械有限公司）擦拭龈沟，取得含有口腔细菌的龈缝液。将吸潮纸尖上沾有龈缝液的尖端部分浸泡在裂解液PBS（美国Sigma-Aldrich公司）中3分钟。在微流控芯片的PCR通道8填充PCR反应液SpeedSTAR HS DNA Polymerase（日本TAKARA公司），CE通道12填充分离液（羟乙基纤维素溶液）。将芯片插入检测装置，在芯片进样池15注入含有口腔细菌DNA的裂解液1μL，开启装置，自动完成后续步骤。在数据处理与控制模块1的命令下，温控模块5使温控片13达到95℃并保持恒定，使温控片14达到65℃并保持恒定；然后启动电源驱动模块2的PCR驱动电源，使DNA分子及其PCR扩增产物沿着PCR通道8连续流动，反复经过95℃的变性区和65℃的延伸退火区，完成PCR扩增反应；15分钟后，自动切换至CE驱动电源，在CE通道12的两端施加电场强度为200V/cm的分离电压，同时荧光检测模块4开启检测；当被分离后的DNA片段经过检测点，即激发产生荧光，通过检测和处理后，显示为以时间为横轴，以荧光强度为纵轴的电泳谱，如图3所示。图中，出现在约0.75分钟的信号（a）来自于PCR液中的引物；出现在约1.4分钟的信号（b）是来自于Pg细菌的197bp的特异性序列，表明样本中存在Pg细菌。本实施例中，从口腔取样开始，到获得检测结果，所需时间在20分钟以内；整个检测过程所需的试剂仅约200μL。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于，包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起；
所述下层基板上设有一PCR反应通道和一CE分离通道，所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽；
所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔。
2.根据权利要求1所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：所述PCR反应通道是一条曲折通道，包含直线部分和弯曲部分；
所述直线部分包括平行排布的复数条直线通道，所述弯曲部分包括复数个弧形通道，一个直线通道的左端通过一个弧形通道与相邻的下一个直线通道的左端相连，右端通过一个弧形通道与相邻的上一个直线通道的右端相连；
以位于所述PCR反应通道的起始端的凹槽作为进样池，以位于所述PCR反应通道的末端的凹槽作为废液池。
3.根据权利要求2所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：所述CE分离通道，是一条直线通道；以位于所述CE分离通道的起始端的凹槽作为分离液池，以位于所述CE分离通道的末端的凹槽作为废液池。
4.根据权利要求3所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：连接所述PCR反应通道的末端的直线通道与所述CE分离通道十字交叉。
5.根据权利要求1所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：所述上层基板、所述下层基板是玻璃、石英、聚二甲基硅氧烷中的任意一种。
6.采用权利要求1-5中任意一项所述的PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片的病原菌快速检测装置，包括一原菌快速检测装置主体，包括一数据处理与控制模块，所述数据处理与控制模块连接一温控模块、一荧光检测模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，其特征在于，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起，所述下层基板上设有一PCR反应通道和一CE分离通道，所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽，所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔；
所述温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；
所述荧光检测模块包括一激发光源，激发光源产生较窄光谱带宽的激发光，并照射CE通道上，激发含有荧光分子的DNA片段发出荧光；
所述电源驱动模块包括一PCR驱动电源和一CE驱动电源，所述PCR驱动电源与两个分别放置在PCR反应通道的起始端和末端的电极相连接，所述CE驱动电源与两个分别放置在CE分离通道的起始端和末端的电极相连接。
7.根据权利要求6所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：所述半导体温控片贴合在微流控芯片的单面或两面，单面的数量为2～3个，半导体温控片的排列方向与PCR反应通道的直线通道的排列方向垂直；
每一个半导体温控片都横跨PCR反应通道的所有直线通道，PCR通道的每一个直线通道都被所有温控片加热成为温度不同的几个温度区，用于PCR反应的变性、延伸和退火。
8.根据权利要求7所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：激发光源是发光二极管、激光二极管、宽谱带光源与窄带滤光片的组合中的任意一种；
所述荧光检测模块还包括一光学传输单元，用于传输激发光和收集荧光，并滤除波长等于小于激发光的散射光；
所述荧光检测模块还包括一光电检测器，光电检测器将荧光信号转换成电信号，传输到数据处理和控制模块。
9.根据权利要求8所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：所述数据处理与控制模块实现温控模块、荧光检测模块、电源驱动模块的控制与协调；
包括：控制温控模块的半导体温控片对PCR通道加热，同时从温度传感器接受温度测量信号，产生反馈控制信号，使得温控模块在达到设定温度前对PCR通道持续加热，在达到设定温度后保持PCR通道的温度恒定；控制电源驱动模块中的PCR驱动电源，使DNA分子及其PCR扩增产物连续流过PCR通道；当PCR扩增后的DNA片段已经过CE通道的交叉部分，停止PCR驱动电源，开启CE驱动电源，使扩增后的DNA片段流过CE通道；控制荧光检测模块采集CE通道检测窗口处的荧光信号，并对获得的信号进行处理和存储。
10.根据权利要求9所述的一种PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，其特征在于：使用所述细菌快速检测装置时，在微流控芯片的PCR反应通道中填充PCR反应液，在CE分离通道中填充分离液；取适量含有样本DNA的试剂注入微流控芯片的进样池；将微流控芯片插入检测装置，使电源驱动模块的电极放置在微流控芯片的槽孔中；开启本装置，然后本装置将在数据处理与控制模块的控制下自动完成包括PCR、CE、检测和数据输出在内的所有后续步骤。首先，数据处理和控制模块开启温控模块，使各温控片加热然后保持设定温度，在PCR通道中形成2～3个不同的温度区；然后，开启电源驱动模块的PCR驱动电源，驱动样本DNA及其PCR扩增产物连续流过PCR通道，完成PCR反应，并经过CE通道的交叉部分；接着，自动切换到CE驱动电源，驱动DNA片段电泳；同时开启荧光检测模块，检测CE通道的荧光信号；信号作为数据被显示和保存，并可输出到其他设备上。
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