JP6137301B2 - マイクロチップ、ｄｎａ解析方法及びｄｎａ解析システム - Google Patents

マイクロチップ、ｄｎａ解析方法及びｄｎａ解析システム Download PDF

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Description

［関連出願についての記載］
本発明は、日本国特許出願：特願２０１３−０５９１０６号（２０１３年 ３月２１日出願）に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、マイクロチップ、ＤＮＡ解析方法及びＤＮＡ解析システムに関する。特に、反応槽の間を微細な流路で連通したマイクロチップ、そのマイクロチップを使用したＤＮＡ解析方法及びＤＮＡ解析システムに関する。
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、イオン、低分子化合物等を解析の対象とした電気泳動が行われている。とりわけ、ＤＮＡを用いた個人識別は、犯罪捜査において、効率的に捜査対象を絞り込む際に有効な手段であることから、ＤＮＡを対象とした電気泳動の必要性が増している。
ここで、特許文献１〜５において、一枚のチップ上に充填容器や微細流路を設けたマイクロチップが開示されている。特許文献１〜５が開示するマイクロチップは複数のプレートを積層して構成される多層構造を備え、複数のプレートの一部を貫通させることで試料槽や反応槽を形成する。さらに、これらの試料槽や反応槽に対して、外部から圧力を加え、試料槽と反応槽の間の微細流路に液体を押し出すことで、液体の移送を制御する。
また、非特許文献１において、マイクロチップ上でＤＮＡ解析に必要な工程を実施するＤＮＡ解析装置が開示されている。
国際公開第２００８／１０８４８１号 国際公開第２００９／０３５０６１号 国際公開第２００９／０３５０６２号 国際公開第２００９／０３８２０３号 国際公開第２００９／１１９６９８号
日本電気株式会社、"ＤＮＡを用いた個人識別とその技術"、２０１０年９月、［online］、［平成25年1月23日検索］、インターネット〈URL：http://www.nec.co.jp/techrep/ja/journal/g10/n03/100307.pdf〉
なお、上記先行技術文献の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。以下の分析は、本発明者らによってなされたものである。
上記の先行技術文献に開示の技術には解析精度が低いという問題点があった。すなわち、ＤＮＡを用いた個人識別は犯罪捜査にも使用されるため、高い解析精度が要求される。しかしながら、上記先行技術文献に開示の技術では、ゴーストピークを検出してしまい、要求される解析精度を満足できないことがあった。
本発明は、ＤＮＡの解析精度向上に寄与するマイクロチップ、ＤＮＡ解析方法及びＤＮＡ解析システムを提供することを目的とする。
本発明の第１の視点によれば、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅するＰＣＲ部と、ＰＣＲ部で増幅したアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性する変性部と、前記アンプリコンを塩基配列長に応じて分離する電気泳動部と、を備えたマイクロチップが提供される。
本発明の第２の視点によれば、マイクロチップ上で、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅し、増幅したアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性し、そして前記アンプリコンを塩基配列長に応じて分離するＤＮＡ解析方法が提供される。
本発明の第３の視点によれば、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅するＰＣＲ部と、ＰＣＲ部で増幅したアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性する変性部と、前記アンプリコンを塩基配列長に応じて分離する電気泳動部と、を備えたマイクロチップと、前記ＰＣＲ部におけるＰＣＲと、前記変性部における変性処理と、前記電気泳動部における電気泳動処理を制御して、ＤＮＡ解析を実行するＤＮＡ解析装置と、を含むＤＮＡ解析システムが提供される。
本発明の各視点によれば、ＤＮＡの解析精度向上に寄与するマイクロチップ、ＤＮＡ解析方法及びＤＮＡ解析システムが、提供される。
一実施形態の概要を説明するための図である。 第１の実施形態に係るＤＮＡ解析装置１０の構成を示す斜視図である。 マイクロチップ１００の構成の一例を示す図である。 図３に示すＡ−Ａ間の断面図の一例である。 ＰＣＲのプログラムの一例を示すフローチャートである。 テーブル１２の領域であって、温度調整ユニット１３を含む領域の平面図の一例である。 図６に示すＢ−Ｂ間の断面図の一例である。 テーブル１２の領域であって、温度調整ユニット１４を含む領域の平面図の一例である。 テーブル１２の領域であって、電気泳動ユニット１５を含む領域の平面図の一例である。 図９に示すＣ−Ｃ間の断面図の一例である。 ＰＴＣヒータ１５３の平面図の一例を示す図である。 ＰＴＣヒータ１５３の電極配線１５８ａ及び１５８ｂとマイクロチップ１００内部のキャピラリ１１６との位置関係を説明するための図である。 ＰＴＣヒータ１５３の平面図の一例を示す図である。 ＰＴＣヒータ１５３の平面図の一例を示す図である。 ＤＮＡ解析装置１０の動作の一例を示すフローチャートである。
初めに、図１を用いて一実施形態の概要について説明する。なお、この概要に付記した図面参照符号は、理解を助けるための一例として各要素に便宜上付記したものであり、この概要の記載はなんらの限定を意図するものではない。
一実施形態に係るマイクロチップは、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅するＰＣＲ部１１２と、増幅したアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性する変性部１１４と、アンプリコンを塩基配列長に応じて分離する電気泳動部１１５とを備える。
すなわち、図１に示すように、ＤＮＡの変性処理を行った後に電気泳動を行っているので架橋構造（図１（ｂ））、バルジループ構造（図１（ｃ））、ヘアピン構造（図１（ｄ））の発生に起因するゴーストピークの発生が解消され、解析精度が向上する。
以下に具体的な実施の形態について、さらに詳しく説明する。
［第１の実施形態］
第１の実施形態について、図面を用いてより詳細に説明する。
図２は、本実施形態に係るＤＮＡ解析装置１０の構成を示す斜視図である。
図２を参照すると、台座１１にテーブル１２が配置され、テーブル１２には温度調整ユニット１３及び１４が埋め込まれている。なお、温度調整ユニット１４は温度調整部とも称される。また、テーブル１２には電気泳動ユニット１５が配置されている。さらに、台座１１と蓋１６は、ヒンジ１７を介して接続されており、蓋１６の開閉が可能である。
本実施形態に係るＤＮＡ解析装置１０が使用するマイクロチップ１００は、特許文献５が開示するように、複数のプレートを積層して構成される多層構造を備えている。マイクロチップ１００は、複数のプレートの一部を貫通させることで試料槽や反応槽を形成する。ＤＮＡの解析に使用するマイクロチップ１００は、テーブル１２に設けられたピン１８ａとピン１８ｂに、マイクロチップ１００に設けられたピン穴１９ａと１９ｂを合致させることで、所定の位置に設置される。マイクロチップ１００をテーブル１２に配置した状態で、蓋１６を閉じると、マイクロチップ１００の所定の領域が、温度調整ユニット１３及び１４と接触する。また、蓋１６を閉じることで、マイクロチップ１００の所定の領域が電気泳動ユニット１５の表面と接触すると共に、電極２０がマイクロチップ１００に設けられた電極槽に挿入される。
蓋１６には、複数の加圧穴２１が設けられている。これらの加圧穴２１に対応する蓋１６の領域は貫通しており、蓋１６に設けられた加圧穴２１はチューブ２２を介して電磁弁２３に接続されている。また、蓋１６を閉じることで、蓋１６に設けられた加圧穴２１と、マイクロチップ１００上の所定の領域が接触する。
畜圧器２４には圧縮空気等が封入されており、コントローラ２５が電磁弁２３を制御することで、蓋１６に設置された加圧穴２１から圧縮空気等が放出される。なお、畜圧器２４の内部圧力は、図示しない圧力センサ及びポンプ等により、所定の圧力を維持するように制御される。なお、本実施形態に係るマイクロチップ１００は、例えば、特許文献５が開示する流路開閉機能を備えている。コントローラ２５は、電磁弁２３を制御することで、蓋１６の加圧穴２１からマイクロチップ１００の一部を加圧することで、マイクロチップ１００が備える反応槽から流路に液体を押しだし、目的とする反応槽に移送する。例えば、反応槽Ａから反応槽Ｂへ液体を移送する場合には、反応槽Ｂから先の流路の一部には圧力を加え、反応槽Ａ及びＢの間の流路には圧力を加えない。このような状態で、反応槽Ａに圧力を加えれば、反応槽Ａが蓄えている液体は反応槽Ａと反応槽Ｂを繋ぐ流路に押し出される。反応槽Ｂから先の流路には圧力が加わっているため、押し出された液体は反応槽Ｂに留まる。このようにして、反応槽間の液体移送を実現する。
さらに、蓋１６には電磁石２６が配置されており、電磁石２６は電源部２７から電力の供給を受けることで、マイクロチップ１００上の所定の領域に磁場を発生させることができる。なお、コントローラ２５は、電源部２７に対して、電磁石２６への電力の供給及びその停止を指示することで、電磁石２６の励磁を制御する。
温度調整ユニット１３及び１４は、予め定めたマイクロチップ１００の所定の領域の温度を制御する。温度調整ユニット１３及び１４の詳細は、後述する。
電極２０及び電気泳動ユニット１５は、マイクロチップ１００における電気泳動を実施する際に用いられる。より詳細には、コントローラ２５は、マイクロチップ１００において電気泳動を実施する工程において、電源部２７を介して電極２０に直流電圧を印加する。電極２０に直流電圧が印加されると、帯電したＤＮＡはキャピラリ内を移動する。また、電気泳動ユニット１５には、レーザを照射する手段と当該レーザ照射による励起によって発光した蛍光を受光する手段と、が含まれる。電気泳動ユニット１５に含まれるレーザ受光手段の出力は、ＤＮＡ解析部２８に送られ、ＤＮＡ解析部２８によるＤＮＡ長の解析（判別）に使用される。なお、電気泳動ユニット１５の詳細は、後述する。
次に、マイクロチップ１００の構成について説明する。図３は、マイクロチップ１００の構成の一例を示す図である。
［マイクロチップの構成］
図３に示すように、マイクロチップ１００は、サンプル溶液注入部１０１、洗浄バッファ注入部１０２、ＰＣＲ試薬注入部１０３、ホルムアミド注入部１０４、泳動ポリマ注入部１０５、排水口１０６、ＤＮＡ抽出部１１１、ＰＣＲ部１１２、秤量部１１３、変性部１１４、電気泳動部１１５、キャピラリ１１６及び各部分を連通する流路２００を有する。
キャピラリ１１６はマイクロチップ１００の内部に設けられ、図３に示す第１の方向に延伸する。図４は、図３に示すＡ−Ａ間の断面図の一例である。図４に示すように、複数のキャピラリ１１６が、マイクロチップ１００の内部を延伸する。また、マイクロチップ１００は、平面形状を有しており、マイクロチップ１００の厚みは、その幅や奥行きに対して薄い。さらに、電気泳動部１１５は、電極槽１１７を備えており、ＤＮＡの解析時に、蓋１６に取り付けられた電極２０が電極槽１１７に挿入される。電極槽１１７は、正電極の挿入を受ける電極槽と、負電極の挿入を受ける電極槽と、が存在し、いずれもキャピラリ１１６と接続されている。
サンプル溶液注入部１０１は窪み状の構造を有し、ユーザによってサンプル溶液が注入される。サンプル溶液は、リシスバッファ（例えば、ＳＤＳ／ＬｉＯＡｃ溶液（ドデシル硫酸ナトリウム／酢酸リチウム溶液））に被験者から採取した細胞（例えば、口腔内粘膜、血液、体液など）を懸濁した溶液である。
洗浄バッファ注入部１０２も窪み状の構造を有し、ユーザによって洗浄バッファが注入される。洗浄バッファは、例えば、Ｔｒｉｓバッファであり、ＤＮＡのシリカへの結合を維持するために高塩濃度に調製される。
ＰＣＲ試薬注入部１０３も窪み状の構造を有し、ユーザによってＰＣＲ試薬が注入される。ＰＣＲ試薬は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、マグネシウムなどを含み、シリカからＤＮＡを溶出する溶出バッファとしての役割も果たすため、低塩濃度に調製される。
ホルムアミド注入部１０４も窪み状の構造を有し、ユーザによってホルムアミド溶液が注入される。ホルムアミド溶液は、ＤＮＡを一本鎖状態に保持する保持剤である。すなわち、変性処理中のＤＮＡは、二本鎖状態から一本鎖状態に変性するデナチュレーション（融解、乖離とも称される）と、一本鎖状態から二本鎖状態に変性するハイブリダイゼーション（アニーリング、結合とも称される）とを繰り返す。ここで、ホルムアミドはＤＮＡを一本鎖状態に保持するため、結果的にホルムアミドは二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させるように作用する。このように、本願において、「保持」と「変性」とは互換的に使用される場合がある。また、ホルムアミド溶液は、蛍光色素で標識されたｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）サイズマーカーも含む。
泳動ポリマ注入部１０５も窪み状の構造を有し、ユーザによって電気泳動のためのポリマが注入される。
なお、リシスバッファ、洗浄バッファ、ＰＣＲ試薬、ホルムアミド、ｓｓＤＮＡサイズマーカー及びポリマは商業的に入手可能であるし、必要に応じて組成を改変して調製することもできる。また、洗浄バッファ、ＰＣＲ試薬、ホルムアミド溶液及びポリマはユーザが注入するのでは無く、マイクロチップ１００に予め封入しておくこともできる。
ＤＮＡ抽出部１１１は、サンプル溶液からＤＮＡを抽出するために設けられた反応槽である。なお以下では、サンプル溶液から抽出されるＤＮＡを、テンプレートＤＮＡとも称する。
ＤＮＡ抽出処理について具体的に説明すると、ＤＮＡ解析装置１０は、ＤＮＡ抽出部１１１に対向するように電磁石２６を有し、ＤＮＡ抽出部１１１にはシリカでコーティングされた磁性ビーズが予め封入される。ＤＮＡ解析装置１０は、サンプル溶液注入部１０１に注入されたサンプル溶液をＤＮＡ抽出部１１１に移動させて、ＤＮＡ抽出部１１１に封入された磁性ビーズ（シリカ）にサンプルＤＮＡを吸着させる。そして、洗浄バッファ注入部１０２内の洗浄バッファで磁性ビーズを洗浄することでテンプレートＤＮＡを抽出する。なお、ＤＮＡ解析装置１０は、サンプル溶液及び洗浄バッファを排水口１０６から排出するが、その際に電磁石２６に磁性ビーズを吸着させることで、サンプル溶液及び洗浄バッファと一緒に磁性ビーズが排出されることを防止する。
なお、磁性ビーズを用いたＤＮＡ抽出方法としては、例えば、東洋紡社：MagExtractor（登録商標）、タカラバイオ株式会社：NucleoMag（登録商標）などが知られている。また、ＤＮＡ抽出方法のプロトコルは、例えば、洗浄の回数を増やすなど、必要に応じて改変することもできる。また、ＤＮＡ抽出方法は、磁性ビーズを用いた方法に限定されるものでは無く、シリカビーズカラムを用いてテンプレートＤＮＡを抽出しても良い（例えば、キアゲン社：QIAampなどを参照）。
ＰＣＲ部１１２は、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅するＰＣＲを実行するために間に設けられた単数又は複数の反応槽であり、各々、温度調整ユニット１３と当接するように配置される。そして、各ＰＣＲ部１１２には、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅するように設計されたプライマーセットが封入される。
プライマーセットは、例えば、マイクロサテライト（ＴＰＯＸやＦＧＡなど）を含む領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーであり、各プライマーの何れか又は両方は蛍光色素（フルオレセインなど）の標識を有する。このようなプライマーはプロメガ（登録商標）社などから商業的に入手可能であるし、必要に応じて設計することもできる。なお、１つのＰＣＲ部１１２に、複数のプライマーセットを封入することもできる。
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：polymerase chain reaction）について具体的に説明すると、ＤＮＡ解析装置１０は、テンプレートＤＮＡを含むＰＣＲ試薬をＤＮＡ抽出部１１１から複数のＰＣＲ部１１２に移動させ、温度調整ユニット１３の伝熱材を介して予めプログラムされたようにＰＣＲ部１１２を温度制御する。ＰＣＲのプログラムの一例を挙げると、ＤＮＡ解析装置１０は、図５に示す温度、時間設定の温度制御によってＰＣＲを実行する。なお、ＰＣＲの温度条件やサイクル数は、Ｔｍ値（melting temperature）や単位複製配列の長さに基づいて変更可能である。以下では、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをアンプリコンと称し、アンプリコンを含むＰＣＲ試薬を反応サンプルと称する。
秤量部１１３は、反応サンプルの一部を廃棄するために設けられた反応槽、特に、ＰＣＲ部１１２よりも容量が小さい反応槽である。秤量処理について具体的に説明すると、ＤＮＡ解析装置１０は、秤量部が満杯になるまで反応サンプルをＰＣＲ部１１２から秤量部１１３へ移動させて、残りのＰＣＲ試薬を排水口１０６から排出する。
変性部１１４は、アンプリコンを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変性するために設けられた反応槽であり、温度調整ユニット１４と当接するように配置される。変性処理について具体的に説明すると、ＤＮＡ解析装置１０は、温度調整ユニット１４を介して変性部１１４を予め設定された温度（例えば６０℃）に保持する。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、ホルムアミド注入部１０４に注入されたホルムアミドをＰＣＲ部１１２及び秤量部１１３を経由させて変性部１１４へ移動させる。そのため、ＰＣＲ部１１２で増幅したアンプリコンが保持剤（ホルムアミド）と共に変性部１１４へ流入するので、アンプリコンと保持剤を別々に変性部１１４に流入させるよりも、アンプリコンと保持剤とをよりよく混合させることができる。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、予め設定された反応時間、反応サンプルを変性部１１４に保持する。
電気泳動部１１５は、分子ふるい効果によって、アンプリコンを塩基配列長に応じて分離するための構成であり、後述するＰＴＣヒータに当接するように配置される。具体的には、電気泳動部１１５はキャピラリ１１６を含み、特にキャピラリ１１６の温度が一定に保たれるようにＰＴＣヒータに対して当接する。
電気泳動処理について具体的に説明すると、ＤＮＡ解析装置１０は、泳動ポリマ注入部１０５内のポリマをキャピラリ１１６に充填し、ＰＴＣヒータによって電気泳動部１１５を予め設定された温度（例えば、５０℃）に保持する。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、変性部１１４から電気泳動部１１５へ反応サンプルを移動させて、各キャピラリ１１６に反応サンプルをインジェクションする。インジェクション方法としては、いわゆるクロスインジェクション法（特開２００２−３１０８５８号などを参照）を採用することができる。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、受光手段によるピーク検出を開始する際に、キャピラリ１１６に接続された電極槽１１７を介して直流電圧を印加する。
続いて、温度調整ユニット１３及び１４について説明する。
温度調整ユニット１３は、コントローラ２５からの指示に基づいて、マイクロチップ１００上のＰＣＲ部１１２の温度制御を担う手段である。
図６は、テーブル１２の領域であって、温度調整ユニット１３を含む領域の平面図の一例である。図７は、図６に示すＢ−Ｂ間の断面図の一例である。
上述したように、温度調整ユニット１３はテーブル１２の領域に埋め込まれて配置されている。図６を参照すると、テーブル１２の表面に伝熱材１３１が露出し、伝熱材１３１の中心に温度センサ１３２が配置されている。
図７を参照すると、温度センサ１３２は、コントローラ２５に接続されている。また、伝熱材１３１の一面と、ペルチェ素子１３３の温度印加面と、が接触している。さらに、ペルチェ素子１３３の温度放熱面と、放熱板１３４の一面と、が接触している。ペルチェ素子１３３の電源線は、コントローラ２５に接続されている。コントローラ２５は、温度センサ１３２からＰＣＲ部１１２の温度を取得し、取得した温度に基づいてペルチェ素子１３３に供給する電流の方向を決定することで、ペルチェ素子１３３の発熱又は冷却を制御し、ＰＣＲ部１１２の温度制御を実現する。
温度調整ユニット１４は、コントローラ２５からの指示に基づいて、マイクロチップ１００上の変性部１１４の温度を一定に保持する手段である。図８は、テーブル１２の領域であって、温度調整ユニット１４を含む領域の平面図の一例である。図８に示すように、温度調整ユニット１４の構成は、温度調整ユニット１３の構成と同一とすることができる。但し、温度調整ユニット１４の構造を限定する趣旨ではなく、ヒータ等を用いて温度調整ユニット１４を構成することも可能である。
続いて、電気泳動ユニット１５について説明する。
図９は、テーブル１２の領域であって、電気泳動ユニット１５を含む領域の平面図の一例である。図１０は、図９に示すＣ−Ｃ間の断面図の一例である。なお、図９において点線で示すキャピラリ１１６は、電気泳動ユニット１５に存在するのではなく、マイクロチップ１００の内部に位置するものである。また、電極２０を挿入するための電極槽１１７（図９におて点線の円により図示）もマイクロチップ１００に設けられている。これらは、理解の容易のため、図９に図示している。
図９を参照すると、電気泳動ユニット１５は、伝熱板１５１を含んで構成されており、伝熱板１５１には、ＤＮＡ長の測定に使用するレーザを通す測定用穴１５２が設けられている。さらに、図１０を参照すると、伝熱板１５１の底面に、伝熱板１５１と貼り合わせるようにＰＴＣ（Positive Temperature Coefficient；正温度係数）ヒータ１５３が配置されている。なお、ＰＴＣヒータ１５３にも測定用穴１５２が設けられている。
レーザ出力部１５４は、レーザダイオードを含んで構成され、測定用穴１５２に向かってレーザ光を照射する。レーザ出力部１５４によるレーザ光の照射は、コントローラ２５からの指示に従い、そのオン／オフが制御される。また、受光部１５５は、電気泳動部１１５の測定用穴１５２に相当する箇所を通過するＤＮＡが発光した蛍光を受光する。受光部１５５は、例えば、光電子倍増管（フォトマルチプライヤー）を含んで構成される。受光部１５５は、電気泳動により、ＤＮＡがキャピラリを移動し、測定用穴１５２の上に到達した際にＤＮＡにより反射した光を電気信号に変換して、ＤＮＡ解析部２８に出力する。あるいは、受光部１５５は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）のような撮像素子を含み、反射光の輝度を測定し、ＤＮＡが測定用穴１５２の上方を通過するのを検出してもよい。
なお、図９に図示する電気泳動ユニット１５は、マイクロチップ１００の下方からレーザを照射する構成（図２のテーブル１２から蓋１６に向かう方向にレーザを照射する構成）である。しかし、電気泳動ユニット１５のレーザ照射は、マイクロチップ１００の下方からの照射に限定されない。例えば、蓋１６に電気泳動ユニット１５を装着すれば、マイクロチップ１００の上方からレーザを照射することになる。この場合には、伝熱板１５１に設けた測定用穴１５２は不要である。
図１１は、ＰＴＣヒータ１５３の平面図の一例を示す図である。ＰＴＣヒータ１５３は、伝熱板１５１と同一形状を持つ樹脂１５６の上に、ＰＴＣ素子１５７、正電極配線１５８ａ及び負電極配線１５８ｂを配する面状発熱体である。ＰＴＣヒータ１５３は、キャピラリ１１６に熱を供給し、且つ、キャピラリ１１６の温度を均一にするように配置されている。また、樹脂１５６は、マイクロチップ１００の電気泳動部１１５に適合する大きさとなっており、電気泳動部１１５と実質的に同じ大きさである。この樹脂１５６の一面であって、伝熱板１５１と接する側にＰＴＣ素子１５７と電極配線１５８ａ及び１５８ｂが配置されている。電極配線１５８ａ及び１５８ｂに直流電圧を印加することで、ＰＴＣ素子１５７に電流が流れる。ＰＴＣ素子１５７に電流が流れると、ＰＴＣ素子１５７が発熱し、伝熱板１５１を介して、キャピラリ１１６に熱を供給する。
ここで、ＰＴＣ素子１５７は、電流が流れることでＰＴＣ素子１５７が特定の温度に達すると電気抵抗が急激に低下する特性を備えている。即ち、ＰＴＣ素子１５７は、電流が流れると、自己発熱によって抵抗値が増大し、 電流が流れにくくなる性質を持つ電流制限素子として機能する。ＰＴＣ素子１５７に流れる電流が低下すれば、ＰＴＣ素子１５７での消費電力もまた低下し、結果として発熱温度が低下する。このように、ＰＴＣ素子１５７を利用したＰＴＣヒータ１５３は、予め定めた所定の温度を維持する自己温度制御機能を備えている。ＰＴＣヒータ１５３の電極配線１５８ａ及び１５８ｂは、それぞれ電源部２７に接続される。コントローラ２５は、電源部２７を介して、ＰＴＣヒータ１５３の動作を制御する。コントローラ２５は、ＰＴＣヒータ１５３を利用して電気泳動部１１５を所定の温度に維持したい場合に、電源部２７に対し、ＰＴＣヒータ１５３への電力供給を指示する。上述したように、ＰＴＣヒータ１５３には自己温度制御機能が備わっており、マイクロチップ１００の電気泳動部１１５は伝熱板１５１を介して所定の温度に維持される。
次に、ＰＴＣヒータ１５３の構成について説明する。
上述のように、ＰＴＣヒータ１５３は、樹脂１５６の一面の伝熱板１５１と接する側にＰＴＣ素子１５７と電極配線１５８ａ及び１５８ｂが配置されている。より詳細には、マイクロチップ１００の内部をキャピラリ１１６が延伸する第１の方向（長手方向）に、正電圧が印加される正電極配線１５８ａと接地電圧が印加される負電極配線１５８ｂが配線され、これらの電極配線は、樹脂の上を交互に配線される。
図１２は、ＰＴＣヒータ１５３の電極配線１５８ａ及び１５８ｂとマイクロチップ１００内部のキャピラリ１１６との位置関係を説明するための図である。図１２は、図１１に示す領域１５９を切り出し、拡大した図である。また、図１２には、キャピラリ１１６を点線により図示している。図１２を参照すると、正電極配線１５８ａと負電極配線１５８ｂは、これらのほぼ中間に、キャピラリ１１６が位置するように配線されていることが理解できる。このように、正電極配線１５８ａと負電極配線１５８ｂでキャピラリ１１６を挟む構成とすることで、その上方に位置するキャピラリ１１６の第１の方向の温度を均一にできる。上述したように、ＰＴＣ素子１５７は自己温度制御機能を備えている。さらに、キャピラリ１１６を挟む電極配線１５８ａ及び１５８ｂの間の領域には、一面に渡り、ＰＴＣ素子１５７が配置されているため、この領域の温度は実質的に同じであるとみなせる。キャピラリ１１６を挟む領域の温度が同じであれば、伝熱板１５１を介してキャピラリ１１６に供給する熱も同じとみなせるためである。即ち、第１の方向におけるキャピラリ１１６の温度むらが解消できる。
また、伝熱板１５１及びＰＴＣヒータ１５３には測定用穴１５２が設けられている。すると、測定用穴１５２の周囲では、熱の拡散が生じる。そのため、ＰＴＣヒータ１５３を熱源として用いるのではなく、例えば、ニクロム線を熱源として用いると、測定用穴１５２の周囲の温度が、他の領域よりも低くなる問題が生じる。しかし、熱源としてＰＴＣヒータ１５３を用いれば、ＰＴＣ素子１５７の自己温度制御機能が働き、測定用穴１５２が存在することで、その周囲の温度が低下したとしても、その低下を補うように動作する。即ち、測定用穴１５２の周囲の温度と、他の領域の温度と、を実質的に同一にすることが可能であり、キャピラリ１１６の温度むらを解消できる。
なお、電極配線１５８ａ及び１５８ｂの配線は、図１１の態様に限定されない。例えば、図１３に示すように、樹脂１５６の第２の方向（短手方向）に電極配線１５８ａ及び１５８ｂを配線してもよい。あるいは、図１４に示すように、対となる電極配線１５８ａ及び１５８ｂを樹脂１５６の両端に配線し、樹脂１５６の中心領域には電極配線１５８ａ及び１５８ｂを配線しない形態であってもよい。
ここで、キャピラリの温度を一定にするという目的を鑑みれば、図１１に示す構成も図１４に示す構成も、その効果には大差がない。しかし、図１４に示す構成では、図１１に示す構成と比較して、高い電圧を正電源配線１５８ａに印加する必要がある。一方、図１１に示す構成では、ＰＴＣ素子１５７が存在する領域が電源配線１５８ａ及び１５８ｂにより細分化されているため、正電源配線１５８ａに印加する電圧を抑えることができる。このように、電源配線１５８ａ及び１５８ｂの配線形態により、ＰＴＣヒータ１５３に印加する電圧が異なる。
また、図１３に示す構成では、図１１に構成と異なり、ＰＴＣヒータ１５３を上方から視認した場合に、キャピラリ１１６と電極配線１５８ａ及び１５８ｂが交差している。キャピラリ１１６と電極配線１５８ａ及び１５８ｂが交差する領域には、ＰＴＣ素子１５７は配置されていないので、当該領域から熱が供給されない。従って、この領域とその周辺の領域とでは温度むらが生じ、結果としてキャピラリ１１６の温度を一定にできない可能性がある。しかし、図１１に示す構成では、キャピラリ１１６と電極配線１５８ａ及び１５８ｂが重ならないように（キャピラリ１１６が電極配線１５８ａ及び１５８ｂの中間となるように）、マイクロチップ１００やＰＴＣヒータ１５３の形状を設計する必要がある。一方、図１３に示す構成では、マイクロチップ１００やＰＴＣヒータ１５３の形状を設計する際に注意を要することもない。さらに、図１３に示す構成において、第２の方向に延伸する電極配線１５８ａ及び１５８ｂの幅を細くすれば、キャピラリ１１６の温度分布に与える影響はほぼ無視できると考える。このように、ＰＴＣ素子１５７と電極配線１５８ａ及び１５８ｂの配置の形態には短所及び長所が存在する。そのため、ＰＴＣ素子１５７と電極配線１５８ａ及び１５８ｂをどのように配置するかは、ＰＴＣ素子１５７に電力を供給する電源や設計の容易さ等を総合的に考慮し、決定するのが望ましい。
次に、ＤＮＡ解析を実行する際のユーザによる操作と、ＤＮＡ解析装置の動作について説明する。
［ユーザによる操作］
ユーザは、サンプル溶液注入部１０１、洗浄バッファ注入部１０２、ＰＣＲ試薬注入部１０３、ホルムアミド注入部１０４及び泳動ポリマ注入部１０５に各溶液を注入し、マイクロチップ１００をＤＮＡ解析装置１０にセットする。そして、ユーザは、ＤＮＡ解析装置１０を駆動してＤＮＡ解析を開始させる。
［ＤＮＡ解析装置による一連の動作］
図１５は、ＤＮＡ解析装置１０の動作の一例を示すフローチャートである。ユーザによってマイクロチップ１００がセットされ、処理開始指示を受け付けると、ＤＮＡ解析装置１０は準備動作を実行する（ステップＳ０１）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、温度調整ユニット１３によって変性部１１４を予め設定された温度（例えば、６０℃）に保持し、そして、電気泳動ユニット１５によって電気泳動部１１５（特にキャピラリ１１６）を予め設定された温度（例えば、５０℃）に保持する。そして、ＤＮＡ解析装置１０は泳動ポリマ注入部１０５内のポリマをキャピラリ１１６に充填する。
続いて、ＤＮＡ解析装置１０は、ＤＮＡ抽出処理を実行する（ステップＳ０２）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、サンプル溶液注入部１０１に注入されたサンプル溶液をＤＮＡ抽出部１１１に移動させて、ＤＮＡ抽出部１１１に封入された磁性ビーズ（シリカ）にサンプルＤＮＡを吸着させる。そして、洗浄バッファ注入部１０２内の洗浄バッファで磁性ビーズを洗浄することでテンプレートＤＮＡを抽出する。続いて、ＤＮＡ解析装置１０は、ＰＣＲ試薬注入部１０３に注入されたＰＣＲ試薬をＤＮＡ抽出部１１１に移動させてサンプルＤＮＡを溶出する。
次に、ＤＮＡ解析装置１０は、ＰＣＲを実行する（ステップＳ０３）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、テンプレートＤＮＡを含むＰＣＲ試薬をＤＮＡ抽出部１１１から複数のＰＣＲ部１１２に移動させ、温度調整ユニット１３の伝熱材１３１を介して予めプログラムされたようにＰＣＲ部１１２を温度制御する。
ＰＣＲが終了した後に、ＤＮＡ解析装置１０は秤量処理を実行する（ステップＳ０４）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、秤量部１１３が満杯になるまでアンプリコンを含むＰＣＲ試薬（反応サンプルと称する）をＰＣＲ部１１２から秤量部１１３へ移動させて、残りのＰＣＲ試薬を排水口１０６から排出する。
次に、ＤＮＡ解析装置１０は、変性処理を実行する（ステップＳ０５）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、ＰＣＲ部１１２及び秤量部１１３を経由させてホルムアミド注入部１０４に注入されたホルムアミドを変性部１１４へ移動させることで、反応サンプルとホルムアミドとを混合しつつ変性部１１４へ移動させる。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、予め設定された反応時間、反応サンプルを秤量部１１３に保持して変性処理を実行する。
そして、ＤＮＡ解析装置１０は、電気泳動処理を実行する（ステップＳ０６）。具体的には、ＤＮＡ解析装置１０は、変性部１１４から電気泳動部１１５へ反応サンプルを移動させて、各キャピラリ１１６に反応サンプルをインジェクションする。そして、ＤＮＡ解析装置１０は、電気泳動ユニットに含まれる受光部１５５によるピーク検出を開始し、そして、キャピラリ１１６に直流電圧を印加して電気泳動処理を実行する。
最後に、ＤＮＡ解析装置は、ＤＮＡ解析部２８を用いてＤＮＡ長の解析を行い、その解析結果を出力する（ステップＳ０７）。
以上のように、本実施形態に係るＤＮＡ解析装置１０では、変性処理をした後に電気泳動を行っているので解析精度が向上する。つまり、アンプリコンはリピート配列を含むため、２本鎖のままではアンプリコンは架橋構造（図１（ｂ））や、バルジループ構造（図１（ｃ））を有する可能性がある。また、１本鎖であったとしてもヘアピン構造（図１（ｄ））を有する可能性がある。これらの構造は、直線状の１本鎖アンプリコンと泳動速度が異なるので、ゴーストバンドの発生の原因となる。しかしながら、第１の実施形態では変性処理を行っているので、このようなゴーストバンドの発生を回避することができ、結果として解析精度が向上する。
また、ＤＮＡ解析装置１０では、キャピラリの温度を制御するためにＰＴＣヒータ１５３を使用している。その結果、ＰＴＣヒータ１３５に接触する伝熱板１５１に生じる温度むらを抑制できる。キャピラリの周辺温度が低いと、ＤＮＡが低速に泳動され、キャピラリの周辺温度が高いと、ＤＮＡが高速に泳動されるという現象、いわゆるスマイリングが生じる可能性がある。その際、サンプル及びサイズマーカーのピークが一致する状況であったとしても、スマイリングが発生していれば、泳動速度の差によってピークがずれて検出される。これとは反対に、キャピラリ１１６の周辺温度が実質的に同じであれば、スマイリングが抑制されるので、泳動速度の差によるピークのずれが解消され、より解析精度を高めることができる。
［他の実施形態］
上記の実施形態は、好ましい一実施形態に過ぎず、必要に応じて様々に改変することができる。例えば、変性処理の条件（温度、処理時間、試薬、液量など）は任意に変更可能である。すなわち、ＤＮＡの変性処理は、様々な反応条件を適用することができる。例えば、変性部１１４は、アンプリコンを含むＰＣＲ試薬と保持剤（ホルムアミド）を、約１：２〜１：９の混合比で混合する。なお、本願発明者らの研究により、少なくとも反応サンプルとホルムアミドの混合比が１：９（１マイクロリットル：９マイクロリットル）で、６０℃であれば、十分な変性処理結果が得られることが分かっている。
ここで、変性処理の温度は、６０℃に限定されるものでは無く、二本鎖ＤＮＡであるアンプリコンが一本鎖ＤＮＡに変性する温度であれば適用可能である。すなわち、変性処理の温度は、アンプリコンの配列（Ｔｍ値）や、ホルムアミドと反応サンプルの混合比に応じて修正されるが、およそ５０℃〜９８℃である。
変性処理の処理時間は、例えば、少なくとも３０秒であるが、ユーザが許容する限度の長時間であることが望ましい。
また、ＤＮＡ変性剤は、ホルムアミドに限定されるものではなく、尿素などを使用しても良い。
また、秤量処理によって計測される反応サンプルの量、すなわち、秤量部１１３の容量は、ピーク検出に悪影響を及ぼさない限り少量であることが望ましい。すなわち、反応サンプルに対するホルムアミドの混合比が大きければ大きいほど変性処理の効率は向上するが、検出されるピークは小さくなるので必要に応じて改変が必要である。なお、変性処理の温度が高ければ、反応サンプルとホルムアミドの混合比が１：２であっても十分な変性処理結果が得られることが分かっている。
また、例えば、研究室で行う手作業では、エタノール沈殿を実行してアンプリコンを精製し、アンプリコンをホルムアミドに溶解し、アンプリコンを含むサンプルを９８℃に加熱して０℃に急冷するプロトコルが知られている。このようなプロトコルを参照して、例えば、アンプリコンを精製するための構成をＤＮＡ解析装置１０及びマイクロチップ１００に設けることができる。例えば、上記の磁性ビーズを用いたＤＮＡ抽出処理を利用して、アンプリコンを精製するようにしても良い。また、ＤＮＡ解析装置１０が、変性部１１４を９８℃に保持した後に、０℃に急冷するように温度制御するようにしても良い。このとき、温度調整ユニット１４が単独で温度制御を実行するようにしても良い。あるいは、９８℃に加熱するための空洞構造及び温度調整ユニットと、０℃に急冷するための空洞構造及び温度調整ユニットとを、別途設けても良い。
また、例えば、秤量処理を実行せずにＰＣＲ部１１２で変性処理を実行することもできる。例えば、ＰＣＲの終了後にホルムアミドを添加して、更に、ＰＣＲ部１１２を９８℃に保持した後に、０℃に急冷するように温度制御するようにしても良い。その場合には、ホルムアミドに対する反応サンプルの混合比が大きくなるため、変性効率の低下が懸念されるが、アンプリコンを精製する処理を追加することによって、変性効率の低下を改善できると考えられる。なお、このような実施形態では、温度調整ユニット１４、秤量部１１３、及び、変性部１１４が不要になるので、ＤＮＡ解析装置１０の小型化を期待することができる。
また、ホルムアミドと反応サンプルの混合が不十分であると、変性処理効率が低下することが分かっている。そのため、必要に応じて、ＰＣＲ部１１２と変性部１１４との間で混合溶液を行き来させるなど、ホルムアミドと反応サンプルの混合処理を加えることもできる。
上記実施形態においては、ＤＮＡの解析に用いる電気泳動装置について説明したが、電気泳動装置の使用をＤＮＡの解析に限定する趣旨ではない。例えば、被解析物がイオンや低分子化合物等であってもよい。また、ＤＮＡ解析は、犯罪捜査のための個人識別に限定されるものでは無く、例えば、遺伝子欠損症の検出にも応用することができる。
上記の実施形態の一部又は全部は、以下の形態のようにも記載され得るが、以下には限られない。
［形態１］
上述の第１の視点に係るマイクロチップのとおりである。
［形態２］
前記ＰＣＲ部で増幅したアンプリコンは、保持剤と共に前記変性部へ流入することを特徴とする形態１に記載のマイクロチップ。
［形態３］
前記変性部は、予め設定された温度に保持されることを特徴とする形態１又は２に記載のマイクロチップ。
［形態４］
前記ＰＣＲ部よりも容量が小さい秤量部を備えたことを特徴とする形態１〜３の何れか一つに記載のマイクロチップ。
［形態５］
前記変性部は前記アンプリコンを含むＰＣＲ試薬と保持剤を、約１：２〜１：９の混合比で混合することを特徴とする形態１〜４の何れか一つに記載のマイクロチップ。
［形態６］
前記保持剤がホルムアミドであることを特徴とする形態１〜５の何れか一つに記載のマイクロチップ。
［形態７］
上述の第２の視点に係るＤＮＡ解析方法のとおりである。
［形態８］
上述の第３の視点に係るＤＮＡ解析システムのとおりである。
なお、引用した上記の特許文献等の各開示は、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の全開示の枠内において種々の開示要素（各請求項の各要素、各実施形態ないし実施例の各要素、各図面の各要素等を含む）の多様な組み合わせ、ないし、選択が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。特に、本書に記載した数値範囲については、当該範囲内に含まれる任意の数値ないし小範囲が、別段の記載のない場合でも具体的に記載されているものと解釈されるべきである。
１０ ＤＮＡ解析装置
１１ 台座
１２ テーブル
１３、１４ 温度調整ユニット
１５ 電気泳動ユニット
１６ 蓋
１７ ヒンジ
１８ａ、１８ｂ ピン
１９ａ、１９ｂ ピン穴
２０ 電極
２１ 加圧穴
２２ チューブ
２３ 電磁弁
２４ 畜圧器
２５ コントローラ
２６ 電磁石
２７ 電源部
２８ ＤＮＡ解析部
１００ マイクロチップ
１０１ サンプル溶液注入部
１０２ 洗浄バッファ注入部
１０３ ＰＣＲ試薬注入部
１０４ ホルムアミド注入部
１０５ 泳動ポリマ注入部
１０６ 排水口
１１１ ＤＮＡ抽出部
１１２ ＰＣＲ部
１１３ 秤量部
１１４ 変性部
１１５ 電気泳動部
１１６ キャピラリ
１１７ 電極槽
１３１、１３１ａ 伝熱材
１３２、１３２ａ 温度センサ
１３３ ペルチェ素子
１３４ 放熱板
１５１ 伝熱板
１５２ 測定用穴
１５３ ＰＴＣヒータ
１５４ レーザ出力部
１５５ 受光部
１５６ 樹脂
１５７ ＰＴＣ素子
１５８ａ 正電極配線
１５８ｂ 負電極配線
１５９ ＰＴＣヒータの一領域
２００ 流路

Claims (7)

  1. ＤＮＡ内の所望の領域を増幅するＰＣＲ部と、
    前記ＰＣＲ部の下流に配され、前記ＰＣＲ部よりも容量が小さい秤量部と、
    前記秤量部の下流に配され、前記秤量部によって秤量されたアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性する変性部と、
    前記変性部によって変性されたアンプリコンを塩基配列長に応じて分離する電気泳動部と、
    を備えたマイクロチップ。
  2. 前記秤量部によって秤量されたアンプリコンは、保持剤と共に前記変性部へ流入することを特徴とする請求項１に記載のマイクロチップ。
  3. 前記変性部は、予め設定された温度に保持されることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロチップ。
  4. 前記変性部は、前記秤量部によって秤量されたアンプリコンを含むＰＣＲ試薬と保持剤を、１：２〜１：９の混合比で混合することを特徴とする請求項１〜３の何れか一つに記載のマイクロチップ。
  5. 前記保持剤がホルムアミドであることを特徴とする請求項２又は４に記載のマイクロチップ。
  6. 請求項１〜５の何れか一つに記載のマイクロチップ上で、
    前記ＰＣＲ部において、テンプレートＤＮＡ内の所望の領域を増幅し、
    前記秤量部において、前記ＰＣＲ部によって増幅されたアンプリコンの一部を秤量し、
    前記変性部において、前記秤量部によって秤量されたアンプリコンを二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡに変性し、そして
    前記電気泳動部において、前記変性部によって変性されたアンプリコンを塩基配列長に応じて分離するＤＮＡ解析方法。
  7. 請求項１〜５の何れか一つに記載のマイクロチップと、
    前記ＰＣＲ部におけるＰＣＲと、前記秤量部における秤量処理と、前記変性部における変性処理と、前記電気泳動部における電気泳動処理を制御して、ＤＮＡ解析を実行するＤＮＡ解析装置と、
    を含むＤＮＡ解析システム。
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