CN110452803A - 一种核酸快速扩增检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCR快速扩增检测装置，所述快速扩增检测装置依次包括样本管、毛细管芯片加热装置、可调速蠕动泵、毛细管荧光混合区、毛细管检测区和荧光显色观测装置，所述毛细管芯片加热装置包括多个温区的加热模块和毛细管芯片组成，所述毛细管芯片包括毛细管反应区，所述可调速蠕动泵与毛细管反应区相连，所述毛细管反应区与毛细管荧光混合区和毛细管检测区通过三通装置连接，所述荧光显色观测装置包括荧光激发光源和荧光显色观察或采集装置。本发明还公开了一种采用所述的装置进行核酸的快速扩增检测方法。本发明提供的检测装置，耗能低，成本低廉，结构简单，反应速度快，特别具有便携、操作简便的优势，非常适合作为临床或野外现场快速检测设备。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种核酸快速扩增检测方法及装置。
背景技术
游离核酸是存在于人类或动物血液、尿液及体液中的一类核酸物质，主要由细胞代谢产生或外源性的病原微生物入侵后引入。对游离核酸进行检测不但可以进行特定基因位点的分析，还能够进行病原微生物感染情况的确定。特别是近年来环境污染、食品安全相关的微生物以及造成人类和动物的传染性疾病的微生物给人类社会造成巨大的损失，同时也严重威胁人类的健康，对其快速高效的检测分析意义重大。
目前游离核酸的检测方法大都需要从血浆或血清中进行DNA或RNA的提取与分离纯化，然后经PCR扩增或其他检测方法对目的核酸进行检测分析。其中游离核酸的提取是限制其检测灵敏度与准确性的主要因素之一。血浆需求量高，游离核酸的提取质量低，不同提取方法获得的游离核酸质量差异大等原因使检测结果存在很大的偏差，一种不依赖于核酸提取的游离核酸检测方法对于其在临床和相关领域的广泛应用至关重要。
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法。其以特异性强、灵敏度高、操作简便等优点成为了分子生物学领域最为常规而又关键的技术，在核酸相关研究中发挥着不可替代的作用，也极大的推动了生命科学各个领域的发展。定量 PCR以及数字PCR等是在PCR的基础上发展起来的能够更加精确的对核酸分子进行定量分析的技术，但是需要昂贵的荧光定量PCR仪，而且不具有便携性，这大大限制了其在临床上广泛应用，对于现场检测(POCT)更是无能为力。
虽然目前POCT技术得到了长足的发展，但是上述存在的一些问题仍然难于从根本上解决。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种PCR快速扩增检测装置。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种采用所述的装置进行核酸的快速扩增检测方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种PCR快速扩增检测装置，所述快速扩增检测装置依次包括样本管、毛细管芯片加热装置、可调速蠕动泵、毛细管荧光混合区、毛细管检测区和荧光显色观测装置，所述毛细管芯片加热装置包括多个温区的加热模块和毛细管芯片组成，所述毛细管芯片包括毛细管反应区，所述可调速蠕动泵与毛细管反应区相连，所述毛细管反应区与毛细管荧光混合区和毛细管检测区通过三通装置连接，所述荧光显色观测装置包括荧光激发光源和荧光显色观察或采集装置。其中，所述多个温区的加热模块为独立隔开的两个温区或三个温区加热模块，所述独立隔开的两个温区的加热模块由一块恒定温度的加热块与一块可调温度的加热块组成，所述独立隔开的三个温区的加热模块由两块独立隔开的恒定温度的加热块和一块温度可调的加热块组成。
进一步地，所述加热模块是由两块独立隔开的恒定温度的加热块(95～98℃和 68～72℃)和一块温度可调的加热块(50℃～68℃)组成或者由一块恒定温度(95～98℃) 与一块可调温度的加热块(50℃～68℃)组成，从而能够实现三温或两温PCR扩增反应。
其中，所述毛细管芯片是毛细管在载玻片表面盘成S型或回字型得到，制成的毛细管芯片大小与加热块大小一致，能够与三块或两块温控加热块紧密接触，实现反应体系的高效热循环；表面平整，与加热块紧密接触，毛细管一端伸出芯片表面与样本管连接，毛细管另一端伸出芯片与可调速蠕动泵相连接。
其中，所述毛细管荧光混合区通过三通装置的一个接口与注射器/注射泵相连。
其中，可调速蠕动泵或注射器/注射泵的调速能力最低可达2微升/分钟，以保证特殊目标基因的有效扩增。
其中，可调速蠕动泵、注射器/注射泵和加热模块(温控加热模块)均由低功耗装置组成，体积小，供电系统可由220V直流电路控制，非常适合用于搭建便携式检测装置。
本发明所用的微型温控加热模块，热稳定性好，控温精确，由于扩增反应时间短，一般无需散热装置。
其中，所述快速扩增检测装置还可以包括供电模块、和/或中央控制电路、和/或与中央控制电路相连的温度控制装置、和/或时间调节装置和/或定时模块。
本发明的中央控制电路还可以包括控制信息输入装置。时间设置及空都设置的装置也可以整合到控制信息输入的装置中，其他如反应过程中是否温控时间精度，可调速蠕动泵的流速等信息的输入都可以从信息控制输入装置中输入到中央控制电路，或者直接事先写入中央控制电路的程序中去。控制反应的进程的时间、温度条件、液体流流动速度等信息均可以实现写入中央控制电路的程序中，相应的程控反应类型可以在控制信息的输入装置上选择。中央控制电路接受到控制信息和反馈信息后，调节相应装置的工作。
其中，本发明所述毛细管荧光混合区、毛细管检测区和毛细管反应区的毛细管是由透光性好、耐热超过120℃的材料做成，如四氟乙烯等，能够满足PCR扩增及产物荧光信号的检测需求。
其中，所述PCR扩增的毛细管，即毛细管反应区的内径小于等于300微米，外径小于等于600微米。其中，所述的反应区的毛细管，其长度为三块或两块加热块宽度的 10倍以上，可实现10个以上的循环扩增反应，为兼顾检测灵敏度和扩增速度，本发明所用的PCR扩增的毛细管，其芯片内长度控制在在60cm-150cm，可以实现10-25个循环的PCR扩增，具体应用可以根据目标基因的情况选择不同长度的毛细管芯片。
其中，所述PCR扩增的毛细管，其管壁厚度小于150微米，可以高效的进行热传导，进一步缩短了PCR的扩增时间。
其中，所述的PCR扩增的毛细管，其中反应体系流动的速度由可调速蠕动泵控制，扩增的时间亦由此决定。
其中，所述荧光显色观测装置是带或者不带滤镜的观察窗；荧光采集装置为图像采集或光电转换数据采集分析装置；激发光源照射毛细管中的反应液，荧光显色观察或采集装置观测毛细管中反应液发出的荧光信号。
其中，荧光显色观测装置优选观测窗方式，及肉眼即可判断。激发光源的波长及滤镜过滤波长根据具体使用的荧光染料或合成材料的激发波长及发射荧光波长所决定。本发明所涉及的SYBR Green I荧光染料，其主要特征是在488nm被激发，发射荧光波长为520nm。
本发明内容还包括一种采用所述的装置进行核酸快速扩增检测方法，所述快速扩增检测方法包括将含有的核酸或者血浆/血清的反应体系加入样本管，血浆/血清用量小于反应总体积的15％即可，启动可调速蠕动泵，反应体系进入到毛细管芯片中，依次经过不同的温区进行快速PCR扩增反应，反应结束后进入到毛细管荧光混合区，加入荧光试剂进行混合，混合后调整可调速蠕动泵进行多次的正反循环，实现荧光试剂与反应产物的混匀，随后继续前行至毛细管检测区，静止5分钟后即打开荧光激发光源照射毛细管进行荧光显色信号的观察或采集。
其中，所述荧光试剂为SYBR Green I、Syto9、LC Green或能够特异性的与双链DNA结合后发荧光的化学类物质或合成材料类物质中的一种或几种。
其中，毛细管中的反应体系中需要加入终浓度为1～10％BSA溶液，特别是终浓度为2～5％的BSA溶液来保证Taq DNA聚合酶的活性，为进一步提高加热效率，可以选择在反应体系前加入5微升的石蜡油进行封闭。其中，所述的反应体系，其体积可以在 5微升到100微升间调节，为了降低成本，本发明所用的反应体系25微升。
本发明还可以通过自动化装置进行优化并控制反应体积，流动速度，等反应液体流到毛细管末端时，反应及结束，同时控制荧光试剂与之混合，反应体系在毛细管末端与荧光试剂混合后，经由蠕动泵抽吸两次，混匀的同时也完成的荧光染料与双链扩增产物的有效结合，随后即可进行荧光信号的检测。
本发明所述荧光检测是荧光染料或合成材料在激发光照射下产生荧光后采用肉眼观察或者采用照相或者光电传感器进行图像或数据的采集分析。
本发明的扩增方法包括在一段可温控的毛细管中利用PCR技术对血浆或者血清中的游离核酸进行直接扩增，扩增结束后与事先准备好的荧光试剂混合，进行荧光信号的采集与检测。
本发明的血浆或血清中的游离核酸包括人类或动物细胞释放的DNA、RNA或者人类或动物感染的微生物所携带的DNA或RNA。
本发明的待检测的血浆或血清样本无需进行核酸提取，可直接加入到扩增反应体系中进行核酸的扩增检测，血浆或血清占总反应体积的15％以下。
有益效果：本发明提供的快速检测装置是将PCR扩增、毛细管微流控、血浆/血清直扩和荧光技术结合起来，在反应结束后利用荧光检测核酸扩增产物。本装置的最大优点有如下几点：
1、本发明是直接将血浆或血清加入到反应体系中，反应无需要DNA、RNA的提取，在一个可温控的毛细管中利用PCR技术进行游离核酸的直接扩增检测，反应结束后，与荧光试剂混合后进行荧光信号的检测。该方法可以在由温控加热块和毛细管及蠕动泵构成的快速扩增装置中进行，该装置结构简单、成本低廉，操作简单，能够作为游离核酸或病原微生物核酸的现场快速检测装置。
2、PCR扩增反应是在毛细管中完成，速度快，效率高，反应结束后直接与荧光试剂混合后进行荧光信号检测，扩增反应与检测反应偶联进行，不需要传统的凝胶电泳等复杂的检测手段，避免了产物取出及检测是可能带来的污染。
3、本发明提供的检测装置，耗能低，成本低廉，结构简单，反应速度快，特别具有便携操作的优势，非常适合作为临床或野外现场快速检测设备。
4、本发明可以提供三温、两温和等温设置的恒温加热块，扩增循环数可由毛细管的长度来灵活调整，快速、高效、特异性好的PCR扩增技术能够适用于各种类型的基因扩增检测。这种基于毛细管的快速PCR扩增可以广泛的应用于生物医学领域的基础研究与生物分析、病原微生物检测，疾病的快速诊断等领域。
附图说明
图1实施例1的PCR检测扩增装置；1-1、样本管或洗液管，2-1、毛细管连接器， 3-1、毛细管芯片与加热块，4-1、可调速蠕动泵，5-1、注射器/注射泵，6-1、三通接头， 7-1、毛细管检测区，8-1、紫外光源，9-1、CCD相机，10-1、废液收集器；
图2毛细管芯片结构示意图；
图3加热块组成示意图；
图4检测装置的结构图，其中1、样本管、3、加热模块、4、蠕动泵进样器、8、 Led光源、9、信号观测窗、11、洗液、12、供电模块(直流/交流电源)；
图5毛细管芯片与加热块示意图；
图6毛细管扩增产物荧光信号检测图；
图7普通PCR与毛细管快速PCR的扩增产物比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规试剂和常规方法。
本发明实施例中的可调速蠕动泵为保定兰格BT100-1F，毛细管为北京豫维科技有限公司内径300微米，外径600微米的聚四氟乙烯管，加热块为靖恺电子科技有限公司的PTC恒温发热块，Eppendorf的高速冷冻离心机，凝胶成像系统购买于上海勤翔科学仪器有限公司。
实施例1 PCR快速扩增检测装置及工作过程
1、毛细管芯片的准备
本发明中采用的毛细管芯片为内径300微米，外径600微米的四氟乙烯毛细管，可以很容易的在载玻片表面或者相当大小的硅片及其他平整的固体支持物表面进行特定形状的盘绕，最常用的就是S型盘绕和同心圆盘绕，如图5所示，正好可以盘成15个循环的毛细管扩增芯片。并且与加热块紧密贴合，用卡槽或夹子固定，芯片外两端各留 5厘米的长的毛细管用于样本的吸取与荧光试剂的加入与混合及检测。
PCR的扩增循环数由盘绕的S型毛细管与加热块的大小共同决定，在加热块大小确定以后，明确盘绕次数即明确扩增的循环数，而且还可以根据待检目的基因的情况进行变温区和延伸区域的适当延长，以提高扩增效率。毛细管芯片的入口和出口处由密封接头与进样区、混合区及检测区通过蠕动泵或注射泵与之相连。毛细管芯片可重复使用，也可一次性使用。若想重复使用，在检测反应结束后用洗液进行彻底清洗即可，洗液成分主要包括0.1％SDS和0.2×SSC洗液(20×SSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)。
2、PCR快速扩增检测装置
如图1，该PCR快速扩增检测装置依次包括样本管1-1、毛细管连接器2-1、毛细管芯片加热装置3-1、可调速蠕动泵4-1、注射器5-1、三通接头6-1、毛细管荧光混合区、毛细管检测区7-1、紫外光源8-1和CCD照相机9-1和废液收集器10-1；毛细管芯片加热装置3-1包括两个温区的加热模块和毛细管芯片组成，两个温区的加热模块包括一块恒定温度的加热块(例如98℃)和一块温度可调的加热块(50℃～68℃)；该毛细管芯片加热装置3-1还可以包括三个温区的加热模块和毛细管芯片组成，三个温区的加热模块包括两块恒定温度的加热块(95～98℃和68～72℃)和一块温度可调的加热块(50℃～68℃)；毛细管芯片是毛细管在载玻片表面盘成S型得到，制成的毛细管芯片大小与加热块大小一致，表面平整，与加热模块紧密接触，毛细管一端伸出芯片表面与样本管 1-1连接，毛细管另一端伸出芯片与可调速蠕动泵4-1相连接，从蠕动泵4-1伸出的毛细管处设置三通接头6-1，三通接头6-1的一个接口与注射器5-1相连，用于注射荧光试剂，三通接头6-1的另一个接口与毛细管检测区7-1相连，紫外光源8-1照射从毛细管检测区7-1在防紫外玻璃下进行肉眼观察，随后利用普通的照相机9-1对荧光信号进行拍照采集。
本发明的工作过程：
1、接通电源，使加热块预热并达到恒定的温度，将毛细管芯片卡入加热块上的空槽中。
2、将缓冲液管放到样本管架上，启动高速蠕动泵模式，对流路进行检查和清洗，随后排空流路；
3、更换样本管，启动可调速蠕动泵开启反应模式，设定蠕动泵流速为16微升/分钟，即960微升/小时，开始PCR扩增反应(两温循环为例)，反应体系在蠕动泵的带动下依次经过98℃，68℃，循环往复，经过98℃温区时，核酸双链解开，实现PCR过程中的变性，随后进入68℃温区，经过该温区的毛细管长度是98℃温区的两倍，从而能够充分的进行复性和延伸反应，很好的实现了两温循环PCR扩增，三温循环PCR亦是如此。当反应体系全部通过毛细管反应区流出时，即完成了10-25次循环的PCR扩增。
4、定时结束，核酸扩增结束时，控制荧光试剂的注射器将荧光试剂与反应体系混合，随后自动混匀，混匀后混合液继续前行流动至检测区域，整个反应结束，液体在毛细管中停留待检，直至下一次毛细管清洗时排空；利用注射器加入的产物指示剂有SYBR GreenI，Syto 9，LC Green或者可以与双链DNA特异性结合后发荧光的试剂，等反应结束与PCR产物混合后与双链DNA特异性的结合，而且部分化学合成材料还对长链目标DNA有更高的亲和力，可以很好的去除二聚体导致的非特异性结果。
5、生化反应结束，打开紫外光源8-1，微调后聚焦于毛细管中的反应产物上，通过观测窗进行荧光产生情况的观察并采用CCD照相机9-1对反应管中的信息进行采集分析。
实施例2PCR快速扩增检测装置
如图4，该PCR快速扩增检测装置基本和实施例1中的PCR快速扩增检测装置一样，所不同的在于，该装置还包括一个供电模块12以及洗液11，所述供电模块12用以给整个装置供电，所述洗液11用于给装置进行清洗，紫外光源8-1替换为Led光源8， CCD相机9-1替换为了信号观测窗9。
实施例3人类血浆DNA的快速PCR扩增
1、本发明试剂：
无核酶水，厂家：Ambion，货号：AM9932
BSA，厂家：NEB，货号：B9001
人类基因组看家基因GAPDH扩增引物序列，厂家：上海生工
forward primer：5’-ctccctctttctttgcagcaa-3’
reverse primer：5’-cagctctcataccatgagtcct-3’
Sybr Green I荧光试剂，厂家：赛默飞，货号：S7563
PCR扩增试剂，厂家：宝生物公司，货号：R045Q
2、本发明实验仪器：
Eppendorf高速冷冻离心机
凝胶成像系统，厂家：上海勤翔科学仪器有限公司
可调速蠕动泵，厂家：保定兰格BT100-1F
毛细管，聚四氟乙烯管，内径300微米，外径600微米，北京豫维科技有限公司加热块，PTC恒温发热块，靖恺电子科技有限公司
3、人类血浆DNA的快速PCR扩增
3.1人类血浆样本的采集
选择来自于东南大学校医院的普通人的血液样本一份，静脉采血2mL，EDTA抗凝，然后4℃，1600g离心10min，吸取上清于2mL的离心管中，4℃，16000g离心10min，小心转移上清至新的洁净的2mL离心管中保存备用。
3.2反应体系的准备
3.3快速PCR扩增反应及信号检测
采用实施例1的PCR快速扩增检测装置(两温区)，分别设定加热块的温度为98℃和68℃，接通电源，预热加热块使其分别达到设定温度，启动可调速蠕动泵，设定液体流动速度为16μL/分钟，将反应体系缓缓的注入到毛细管芯片中，依次经过98℃，68℃两个温区，如此反复循环，实现传统PCR的变性、退火与延伸步骤，约6分钟后，反应体系全部经过毛细管芯片进入到毛细管荧光混合区，利用注射器加入5μl sybr green I 荧光试剂，混合后调整可调速蠕动泵进行三次的正反循环，实现荧光试剂与反应产物的混匀，随后继续前行至毛细管检测区，静止5分钟后即可进行荧光信号的观察，打开紫外灯，照射毛细管，在防紫外玻璃下进行肉眼观察，随后利用普通的照相机对荧光信号进行拍照采集。毛细管中反应体系直接进行紫外照射并拍照的结果如图6所示，该PCR 扩增区所用毛细管长度为90厘米，可反复循环15次，即进行了15个循环的扩增，因为蠕动泵驱动流速为16μl/分钟，且液体在该毛细管中填充的体积大约为1μl/cm，则流速相当于16cm·min-1，因此总的反应时间为25微升反应体系全部流经扩增区的时间，即90cm/16cm·min-1＝5.625分钟。图6所示为检测区毛细管中反应产物流经时采集的图像，左半段为混合的荧光的扩增产物，显示出很强的荧光信号，右半段为对应的空白毛细管，无荧光信号，说明PCR扩增成功，特异性较好。
凝胶电泳对比实验
利用相同的反应体系，在普通PCR仪上进行25个循环数的扩增(25个循环，总时间约58分钟)，扩增产物与毛细管扩增的产物一起进行凝胶电泳检测，观察两者的区别，确定扩增效率。如图7所示，lanel，lane2为普通PCR扩增的结果，lane3是毛细管扩增的结果，结果显示毛细管扩增结果条带稍弱，但是特异性强，反应时间短，不到 6分钟(90/16＝5.625min)时间就获得了相当的扩增结果，非常适合用现场快速检测。由于检测模板为血浆，无需额外的核酸提取与复杂的预处理，更加适合于POCT的应用。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种快速的核酸扩增检测方法及装置
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctccctcttt ctttgcagca a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagctctcat accatgagtc ct 22
Claims (10)
1.一种PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述快速扩增检测装置依次包括样本管、毛细管芯片加热装置、可调速蠕动泵、毛细管荧光混合区、毛细管检测区和荧光显色观测装置，所述毛细管芯片加热装置包括多个温区的加热模块和毛细管芯片组成，所述毛细管芯片包括毛细管反应区，所述可调速蠕动泵与毛细管反应区相连，所述毛细管反应区与毛细管荧光混合区以及毛细管检测区通过三通装置连接，所述荧光显色观测装置包括荧光激发光源和荧光显色观察或采集装置。
2.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述多个温区的加热模块为独立隔开的两个温区或三个温区加热模块，所述独立隔开的两个温区的加热模块由一块恒定温度的加热块与一块可调温度的加热块组成，所述独立隔开的三个温区的加热模块由独立隔开的两块恒定温度的加热块和一块温度可调的加热块组成。
3.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述毛细管芯片是毛细管在载玻片表面盘成S型或回字型得到，制成的毛细管芯片大小与加热模块大小一致，表面平整，与加热块紧密接触，毛细管一端伸出芯片表面与样本管连接，毛细管另一端伸出芯片与可调速蠕动泵相连接。
4.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述毛细管荧光混合区通过三通装置的一个接口与注射器/注射泵相连。
5.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述快速扩增检测装置还包括供电模块、和/或中央控制电路、和/或与中央控制电路相连的温度控制装置、和/或时间调节装置和/或定时模块。
6.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述毛细管反应区的毛细管内径小于等于300微米，外径小于等于600微米。
7.根据权利要求1所述的PCR快速扩增检测装置，其特征在于，所述荧光显色观测装置是带或者不带滤镜的观察窗；荧光采集装置为图像采集或光电转换数据采集分析装置；激发光源照射毛细管中的反应液，荧光显色观察或采集装置观测毛细管中反应液发出的荧光信号。
8.一种采用权利要求1~7任一项所述的装置进行核酸的快速扩增检测方法，其特征在于，所述快速扩增检测方法包括将核酸或血浆/血清样品的反应体系加入样本管，启动可调速蠕动泵，反应体系进入到毛细管芯片中，依次经过不同的温区进行快速PCR扩增反应，反应结束后进入到毛细管荧光混合区，加入荧光试剂进行混合，混合后调整可调速蠕动泵进行多次的正反循环，实现荧光试剂与反应产物的混匀，随后继续前行至毛细管检测区，静止5分钟后即打开荧光激发光源照射毛细管进行荧光显色信号的观察或采集。
9.根据权利要求8所述的核酸快速扩增检测方法，其特征在于，所述荧光试剂为SYBRGreen I、Syto9、LC Green或能够特异性的与双链DNA结合后发荧光的化学类物质或合成材料类物质中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的核酸快速扩增检测方法，其特征在于，所述反应体系中含有终浓度为1-10%的BSA溶液。
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