CN105648069A - 基于适体的靶向激活循环放大spr检测蛋白质的方法 - Google Patents

基于适体的靶向激活循环放大spr检测蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，本文基于适体与靶分子的结构互变性质，构建了靶向激活双重循环放大的SPR检测系统用于溶菌酶的检测。将靶分子与适体的特异性识别作用转化成双重循环放大反应的切入点，从而引发靶分子的聚合替换源头放大和DNA链的聚合剪切放大反应，提高了反应的放大效率及选择性，以溶菌酶作为目标分析物，生物功能化的量子点探针为信号标记，利用表面等离子共振检测技术实现了溶菌酶的快速、灵敏检测，检测限可达76fM。并成功应用于人血清实际样品中溶菌酶的分析。该方法适用范围广、选择性强、操作便捷，在蛋白质分析及临床诊断方面具有广阔的应用前景。

Description

基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法。
背景技术
核酸适体是人工合成的，利用SELEX技术筛选出来的能够与目标分子特异性识别和高亲和力结合的DNA和RNA单链寡核苷酸。与未修饰的RNA组成的适体容易被血清中的核糖核酸酶消化相比，DNA适体与靶分子的结合活性具有较宽的适用范围。除此之外，与传统的抗体技术相比，适体在合成，标记，传递信号，放大等方面展现的独特的优越性使其在生物检测分析中得到广泛的应用。
迄今为止，基于适体的生物分析在生命科学和工业分析领域已经得到广泛的关注。一些研究小组利用适体与靶分子结合产生的构象转变作为切入点设计了新型的检测探针和信号检测机理用于光学和电化学分析系统中。然而，由于适体与其靶分子之间相对较低的结合常数，利用传统的转换机理难以设计高灵敏的检测探针。因此，对于基于适体技术的生物传感系统，研制相应的信号放大机理来进一步提高检测灵敏度是至关重要的。
在DNA循环放大技术中，链替代聚合反应(strand-displacementpolymerization，SDP)，作为一种等温核酸循环放大技术在适体分析系统中已经引起了高度的注意。在这一循环体系中，在靶分析物的作用下，引物能够与模板链互补杂交，随后利用聚合酶的作用，引物在模板链上发生聚合生长反应，将靶分析物从模板链上替换下来，释放出的靶分析物又会引发循环的放大过程，从而不断的放大靶分析物的识别绑定单元。在链替代聚合为基础的适体传感分析系统中包含两种反应机理：核酸链替代聚合反应(nucleicacidstrand-displacementpolymerization，NDP)和靶分子替代聚合反应(targetmolecule-displacementpolymerization，TDP)。在NDP反应中，核酸链能够通过循环的聚合反应替换下来，而在TDP反应中，发生循环替代反应的是靶分子，如蛋白质、小分子等。
溶菌酶是生物体内普遍存在的一种蛋白质，它能够催化细菌多糖壁上的乙缩醛基团的裂解。在正常的生理条件下，人体组织和分泌物中的溶菌酶浓度较低。而据文献报道，血清、尿液和细胞中溶菌酶浓度的改变与白血病、肾脏疾病及脑膜炎等疾病具有密切的联系。因此，溶菌酶的特异性识别和高灵敏检测在基础研究及临床医学中具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，步骤如下：
(1)基底上发夹结构的检测探针DNAS1既含有靶蛋白的适体序列，又具有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与DNAS1上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNAS1上3’端的茎部暴露出来；
(2)纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚合反应引物的DNAS2，所述DNAS2与步骤(1)打开的发夹探针互补杂交后，以发夹探针为模板链复制，将靶蛋白质从DNAS1上替换下来，替换下来的靶蛋白与其他的发夹探针结合，引发新的靶分子的替换聚合反应，同时，由于发夹结构的检测探针上还具有剪切酶的识别序列，当引物沿模板链聚合生长形成双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处在模板链对应的互补序列上形成缺口，随后再在DNA聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模板链聚合生长，将形成缺口的另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板链互补的序列，也能和其他的发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的核酸链替代聚合反应，结合靶分子的替换聚合循环放大，形成了双重循环放大体系；
(3)将步骤(2)反应结束后得到的基底进行表面等离子共振检测。
优选：所述步骤(1)中待测系统中的PBS缓冲溶液的pH为6.5-8.5，更优选7.4。
所述步骤(2)中双重循环放大反应的反应温度为20-50℃，更优选37℃；反应的时间为10-150min，更优选90min。
所述步骤(1)发夹结构探针的浓度为5.0×10-8M-1.0×10-5M，更优选5.0×10-7M。
所述步骤(2)纳米金生物条码探针上S3/S2为1:1-50:1，更优选20:1。
所述步骤(2)中DNA聚合酶的用量为0.05UμL-1-0.5UμL-1，更优选DNA聚合酶的用量为0.3UμL-1。
所述步骤(2)内切酶的用量为0.05UμL-1-0.5UμL-1，切刻内切酶的用量为0.3UμL-1。
所述步骤(3)具体为：将基底固定在SPR检测仪上，通入DNA功能化的量子点信号探针，进行表面等离子共振检测，所述量子点信号探针上固定的DNAS4能够与双重循环放大反应的产物互补杂交，增强检测信号。
所述靶蛋白为溶菌酶。
一种利用表面等离子共振检测蛋白质的试剂盒，基底上发夹结构的检测探针、纳米金生物条码探针，所述基底上发夹结构的检测探针DNAS1既含有靶蛋白的适体序列又具有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与发夹结构的检测探针DNAS1上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNAS1上的3’端的茎部暴露出来；所述纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚合反应前体的DNAS2，核酸链替代聚合反应体系和靶分子替代聚合反应体系。
当使用上述方法检测溶菌酶时，所述S1、S2、S3、S4的序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。优选：S1、S2、S3、S4如下表：
DNAS1既包含靶蛋白的适体序列又包含了剪切酶的识别序列，其中加粗的部分是指溶菌酶适体序列，斜体部分是指切割酶的识别序列)
本发明的有益效果：
本发明提出了一种基于靶向激活双重循环放大的SPR检测溶菌酶的新方法。基于适体与靶分子结合产生构象转变的性质，设计了检测探针，将靶分子与适体的特异性识别作用转化成双重循环放大的切入点，从而引发靶分子的聚合替换源头放大和DNA链的聚合剪切放大反应，提高了反应的放大效率，以生物功能化的量子点探针为信号标记，利用表面等离子共振检测技术实现了溶菌酶的快速、灵敏检测。而且通过对人血清样品中溶菌酶的检测进一步证实了该方法的实际应用性能，适于复杂样品的检测。该生物传感系统灵敏度高、选择性强、设计简单、操作便捷等特点使其在蛋白质分析及临床诊断方面展现了广阔的应用前景。
将靶向激活的双重循环放大体系用于SPR检测蛋白质的方法中，以同一个检测探针为放大模板，基于靶蛋白质对于适体的特异性识别作用引发循环的靶分子聚合替换及链聚合剪切反应，实现双重放大效果，提高了检测灵敏度,检测限可达76fM。
基于靶与适体结合的结构互变性质引发的循环放大反应对于复杂生物样品的检测具有较好的选择性的。
附图说明
图1为基于靶向激活循环放大的SPR检测溶菌酶示意图；
图2为金纳米粒子的透射电镜图片；
图3为紫外-可见吸收光谱图：(a)DNAS2；(b)DNAS3；(c)金纳米粒子；(d)纳米金生物条码探针；
图4为基于靶向激活循环放大体系SPR检测对照实验：(a)空白实验；(b)无聚合酶；(c)无核酸内切酶；(d)溶菌酶、聚合酶、核酸内切酶存在；溶菌酶浓度，1.0×10-11M；
图5为缓冲溶液pH值的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图6为循环反应温度的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图7为捕获探针浓度对SPR响应信号的影响，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图8为纳米金生物条码探针比例的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图9为循环反应时间的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图10为聚合酶用量的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图11为剪切酶Nb.BbvCI用量的优化，溶菌酶浓度，1.0×10-12M；
图12不同浓度溶菌酶的SPR检测曲线，从a到g分别为0，1.0×10-13，5.0×10-13，1.0×10-12，5.0×10-12，1.0×10-11，5.0×10-11M；
图13不同浓度溶菌酶SPR检测的标准工作曲线，溶菌酶浓度范围1.0×10-13-5.0×10-11M；
图14为溶菌酶检测的选择性研究，实验中所用溶菌酶的浓度，1.0×10-12M，其它蛋白质浓度，1.0×10-10M；
图15为金基底上发夹结构的检测探针。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
1实验部分
1.1试剂
E.ColiDNA聚合酶Klenow(大连宝生物工程有限公司)；磷酸三氯乙基酯(TCEP，98％，AlfaAesar公司)；Nb.BbvCI切刻内切酶(10000UmL-1，美国NEB公司)；碲粉(天津申泰化学试剂有限公司)；硼氢化钠(天津市海纳川科技有限公司)；1–(3–二甲氨基醛)–3–乙基二亚胺盐酸盐(EDC，天津市巴斯夫化工有限公司)；脱氧核苷三磷酸dNTPs(大连宝生物工程有限公司)；羟基琥珀硫亚氨(NHS，Sigma-Aldrich公司)；盐酸(HCl，烟台三和化学试剂品有限公司)；咪唑(远洋化学试剂公司)；柠檬酸三钠(trisodiumcitrate，天津博迪化工有限公司)；四氯金酸(HAuCl4·4H2O，AR，上海化学试剂公司)；实验中所用的试剂均为分析纯，实验时未进行进一步提纯直接使用。
磷酸盐(NaH2PO4-Na2HPO4)缓冲溶液(PBS):0.01M，pH7.4；实验中所用到的溶液均为超纯水配制，使用的玻璃器皿均用铬酸洗液浸泡过夜，并洗涤烘干后使用。
实验中所用到的DNA(上海生工生物工程有限公司)的碱基序列如下表1所示：
表4-1实验中所用的DNA序列
1.2仪器
表面等离子共振仪(芬兰BioNavis公司)；紫外可见分光光度计(Cary50UV–Vis–NIR，美国Varian公司)；透射电子显微镜(JEM-2000EX/ASID2，日本Hitachi公司)；TDL-16B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；电热恒温水箱(HHW21型，天津泰斯特仪器有限公司)；KQ-50B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；202-1AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；pH计(pHS-25型，上海精科雷磁有限公司)；电子天平(北京赛多利斯科技仪器有限公司)；1～10μL，20～200μL，100～1000μL可调式移液器(上海热电仪器有限公司)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)。
1.3CdTe量子点及DNA功能化的CdTe量子点的制备
CdTe量子点的制备方法，取80mg碲粉加入小试管中，再加入50mg硼氢化钠，通入氮气排除反应体系的空气，加入2ml的水，继续通氮气，用橡胶塞密封，至黑色碲粉消失生成四硼酸钠，用注射器抽取上层清液250微升备用。
取18mg氯化镉水合物，加入20微升乙硫醇，加入63毫升水，在三口烧瓶中，磁子搅拌，用0.1MNaOH调至pH在8.0-8.2之间，通入氮气，30min，迅速加入20微升碲氢化钠，加热回流4h。
向制得的量子点中加入0.1M的EDC和0.025MNHS各20微升，于30℃摇床中反应1h，加入100微升DNAS4，振荡过夜。10000r离心20min，弃去未反应的DNA，得到DNA功能化的CdTe量子点，分散到1毫升二次水中待用。
1.4纳米金的制备
金纳米颗粒的制备方法，采用柠檬酸钠-氯金酸还原法制得。具体操作如下：实验前先将制备金纳米颗粒所需的器皿，包括250ml三口烧瓶、回流冷凝管、转子、空心塞以及棕色细口瓶用铬酸溶液浸泡过夜，然后用清水冲洗干净后再用大量二次水洗净，晾干备用。
实验时配制1％的柠檬酸钠溶液和50mL0.01％氯金酸溶液，用微孔过滤器将配制好的两种溶液过滤，然后将50mL过滤的氯金酸溶液置于100mL的三口烧瓶中，加入转子，放入磁力搅拌加热套中，固定好球形回流冷凝管，加热搅拌并冷凝回流。当溶液开始沸腾时，快速加入过滤好的柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸20min，再停止加热并自然冷却至室温。制得的金纳米颗粒移至棕色细口瓶中，4℃下保存备用。
1.5纳米金生物条码探针的制备
纳米金生物条码的制备方法，首先，将DNAS3和DNAS2按照不同的比例(5:1，10:1，20:1，30:1，40:1，50:1)均匀混合，然后加入2.0μL10mM的TCEP在37℃的气浴恒温振荡器中避光活化2小时。再在活化好的DNA混合溶液中加入1ml新鲜制备的纳米金溶液在室温下避光轻微震荡过夜，再加10mM醋酸盐缓冲液(含0.1MNaCl)进行“老化”反应24小时。然后将“老化”后的溶液10000rpm离心30分钟，再将得到的红色油状物离心洗涤三次。这样制得的纳米金生物条码探针用PBS磷酸缓冲溶液(0.01mM，pH7.4)分散，置于4℃下储存备用。
1.6发夹适体探针修饰基底的制备
金片作为检测基底，实验前，将30％H2O2，浓氨水，二次水按1:1:5的体积比混合煮沸，再将金片置于沸腾的混合溶液中浸没10分钟，然后用二次水冲洗干净，氮气吹干。
取50μL5.0×10–7M发夹结构适体探针DNAS1加入到金片的反应池中孵育16小时，随后加入MCH封板2小时，再分别用二次水和PBS缓冲溶液冲洗金片去除过量的和非特异性吸附的DNA探针，氮气吹干。
1.7靶向激活循环放大反应
取等体积不同浓度的溶菌酶，Klenow聚合酶(0.2UμL-1)，切刻内切酶Nb.BbvCI(0.4UμL-1)，dNTPs(1mM)以及纳米金生物条码探针混合均匀，一起加入到固定了发夹DNAS1的金片上反应池中，发生链置换循环放大反应，反应结束后用PBS缓冲溶液(0.01M，pH＝7.4)洗涤3遍，除去未反应的和非特异性吸附的DNA，氮气吹干。
1.8表面等离子共振在线检测
将靶向激活链替换反应后的金片放入表面等离子共振检测池中，以50μLmin-1的流速通入PBS缓冲溶液直到基线平稳，再向流通池内通入DNA功能化的量子点探针，通过量子点上的DNAS4与纳米金上的捕获DNAS3互补杂交，捕获量子点，产生SPR检测信号，最后再用缓冲溶液将未绑定和非特异性吸附的量子点探针冲洗掉，直至获得稳定信号。利用测得的角度变化信号，绘制分析物浓度-共振角变化工作曲线，进行溶菌酶的定量分析。
2结果与讨论
2.1基于靶向激活循环放大的SPR检测溶菌酶的实验原理
基于等温循环聚合反应的寡核苷酸探针能够将均相分析模式，等温信号放大，基于适体的靶分子识别以及发夹结构的DNA探针等多种功能元素集成于生物传感系统中。在传统的循环链替代聚合反应中，一条核酸链既是聚合反应的引发链又是一个被取代的序列，DNA探针的设计在一定程度上功能比较简单。相比较而言，对于适体传感探针，靶分析物是聚合反应的“引发器”，而被取代的元素是普通的DNA序列，这就需要一个转换机制，能够将靶与适体的结合转换成等温循环聚合反应，这样就使适体探针的设计过程具有一定的难度。目前文献报道的这样的适体探针还非常少，本文将适体识别与两种等温链替换放大反应相结合，提出了新的等温聚合反应模式。
实验原理如图1所示，金基底上发夹结构的检测探针既含有溶菌酶的适体序列，又具有剪切酶的识别序列。当在反应系统中加入溶菌酶时，通过溶菌酶与发夹探针上的适体序列的特异性结合，发夹探针被打开，探针上的3’暴露出来，这样，纳米金上的引物探针就能够与打开的发夹探针互补杂交。随后，以发夹探针为模板链，在聚合酶和dNTPs的作用下从模板链的3’开始聚合生长。双链扩增产物的形成使发夹探针完全伸展，而且随着聚合反应的进行将靶蛋白质-溶菌酶从适体链上替换下来，从而与其他的发夹探针结合，引发新的等温聚合反应。这样就形成了基于靶蛋白质结合/替换循环的聚合反应模式。同时，由于发夹结构的检测探针上还具有核酸内切酶的识别序列，核酸内切酶识别双链但仅切割单链，当引物沿模板链聚合生长形成双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处会在模板链对应的互补序列上形成缺口，随后再在聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模板链聚合生长，将形成缺口的另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板链互补的序列，也能够和其他的发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的等温DNA链聚合剪切反应，结合靶分子的聚合替换循环放大，形成了双重循环放大体系。在整个循环体系中，发夹结构的检测探针既作为识别元素，又作为聚合反应的模板，而靶蛋白质充当循环聚合反应的引发器。由于靶分子和聚合剪切释放出的单链DNA都能够通过聚合反应被替换下来从而引发循环的聚合反应，因此能够实现靶分析物的放大检测，即使样品中少量的靶分子也能够产生明显的检测信号。因此，以DNA功能化的量子点为信号标记，通过监测共振角的变化，实现靶分子的高灵敏检测。
2.2金纳米粒子的表征
利用透射电子显微镜(TEM)对合成的金纳米粒子(AuNPs)进行表征。如图2所示，AuNPs分散性良好，颗粒均匀，粒径约为41.5nm。
2.3DNA功能化的金纳米粒子的紫外光谱表征
图3为DNA功能化的金纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图，图中曲线a，b分别为DNAS2和S3的紫外吸收光谱图，在260nm左右处均有DNA的特征吸收峰，曲线c为金纳米粒子的紫外吸收光谱，在大约530nm处出现了金纳米粒子的特征吸收峰，曲线d中可以同时观察到DNA和金纳米粒子的两个特征吸收峰，表明DNA已成功的连接到了金纳米粒子上。
2.4可行性研究
为了证明这一靶向激活循环放大SPR检测体系的可行性，我们在相同的实验条件下进行了一系列对照实验。如图4所示，在没有聚合酶的情况下，聚合替换反应无法进行，靶分子在与适体链结合打开发夹探针后，无法被释放出来引发循环的聚合替换反应，同样聚合剪切放大也无法进行，无法进行信号放大，得到的共振角实时检测曲线如曲线b所示，与空白溶液(曲线a)相近。在向反应体系中加入聚合酶，但是没有剪切酶时，只能发生靶分子的聚合替换反应，DNA链的聚合剪切反应无法进行，检测信号有所增大。而当把靶分子聚合替换和靶分子引发的聚合剪切放大协同引入反应体系时，与空白溶液的检测信号(曲线a)相比，在溶菌酶存在的条件下，共振角显著增大(曲线d)。实验结果表明，基于适体识别的靶向激活的循环放大体系能够充分地放大溶菌酶的SPR检测信号。
2.5实验条件的优化
反应体系中，实验条件的选择对检测的灵敏度及选择性具有重要的意义，为了增强整个反应体系的放大效率，提高检测灵敏度，减小非特异性吸附，我们对一系列反应条件进行了优化，包括反应体系中反应温度、缓冲溶液的pH值、反应时间、固定在金基底上的发夹DNA的浓度、纳米金生物条码探针中不同DNA的比例、酶的用量。具体的优化结果如下：
2.5.1缓冲溶液pH值的优化
反应体系缓冲液的性能对DNA的杂交效率，酶的反应活性以及识别探针与靶蛋白质之间的反应有着较大的影响。因此我们考察了缓冲液的pH值对检测信号的影响。如图5所示，缓冲液的pH值在6.5到7.4的变化范围内，SPR响应信号随着pH值的增长，pH值为7.4时达到最大值，当pH值大于7.4时，检测信号逐渐下降。因此，我们选择7.4作为缓冲液的最佳pH值。
2.5.2反应温度的优化
循环反应中酶的活性以及DNA的杂交效率同样受到温度的影响，本实验在溶菌酶的浓度为1.0×10-12M的条件下，对反应体系的温度进行了优化。如图6所示，在体系反应温度从20℃到50℃的过程中，检测信号先增大后减小，当反应温度达到37℃时，获得最大的响应信号。这可能是因为当温度低于37℃时，随着温度的升高，酶的活性相应提高，响应信号不断增强，而当体系的反应温度大于37℃时，较高的温度能够使酶失活，从而影响反应动力，抑制循环反应的进行。因此，我们选择37℃作为酶循环反应的最佳温度，这一温度也与酶的最优反应活性温度相吻合。
2.5.3捕获探针浓度的优化
固定在金基底上的发夹探针既含有溶菌酶的适体序列又具有剪切酶的识别序列，因此在循环反应中，这一发夹探针一方面作为捕获探针将纳米金生物条码探针捕获，另一方面以纳米金生物条码上的S2链为引物链，自身作为放大反应的模板，发生靶分子的聚合替换反应以及靶分子引发的DNA链聚合剪切循环放大，从而放大反应效率。因此，综合考虑反应体系的选择性和放大效率，发夹探针的浓度是一个重要的影响因素。高浓度的发夹结构探针会增加杂交反应以及靶分子与适体识别反应的空间位阻，降低检测信号，另一方面由于发夹探针还作为放大反应的模板，如果探针浓度过低，无法提供足够的模板与纳米金生物条码上的S2链杂交，从而减少了纳米金探针的捕获，使检测信号降低。图7是扣除空白后共振角检测信号强度随发夹探针浓度变化的关系图。在1.0×10-12M溶菌酶存在的条件下，在探针浓度从5.0×10-8M到5.0×10-7M的变化区间内，共振角的响应信号随着探针浓度的增大而逐渐增强，在5.0×10-7M浓度处，能够获得最大的信号响应，当探针浓度大于5.0×10-7M时，随着探针浓度的增加，检测信号降低。实验证明，在探针浓度为5.0×10-7M时，能够实现反应体系空间位阻和放大效率的平衡，获得最大的信号值。实验中我们选择5.0×10-7M作为基底上发夹探针的浓度。
2.5.4纳米金生物条码探针比例的优化
纳米金粒子上组装了两种不同功能的DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹杂交互补，充当聚合反应前体的DNAS2。SPR响应信号的强度受纳米金上这两种DNA分子比例的影响。捕获量子点的捕获探针比例大，纳米金颗粒上负载的DNA量多，量子点的结合率高，SPR信号强度会相应增强，但是在纳米金粒子有限的负载能力下，捕获探针的比例过大会造成空间位阻，一方面影响量子点上的DNA与捕获探针杂交，另一方面也会抑制引物DNAS2与基底上发夹探针S1的杂交效率，从而降低金纳米粒子在金基底上的结合效率，影响反应信号。反之，如果捕获探针比例过小，结合在纳米金上的数量太少，无法提供足够的探针捕获量子点，同样也会降低SPR检测信号。因此，为了提高SPR检测溶菌酶的灵敏度，我们对纳米金粒子上捕获探针DNAS3与聚合反应前体链DNAS2的比例(1:1，5:1，10:1，20:1，30:1，40:1，50:1)进行了优化。图8显示了SPR信号强度随条码比例变化的关系曲线，从图中可以看出，条码比例在1:1至20:1的范围内，检测信号随着比例的增加而增大，在20:1处达到最大值，随后SPR响应信号的强度随条码比例的增大而逐渐减小。因此，我们选用20:1作为靶DNASPR检测中条码的最佳比例。
2.5.5循环反应时间的优化
孵育时间决定着循环放大SPR检测溶菌酶的响应信号大小，因为反应时间的长短直接影响着DNA的杂交及随后的循环放大反应完成效率。因此，为了获得令人满意的分析性能，我们对反应时间进行了优化，实验结果如图9所示，随着反应时间的增加，循环反应不断进行，信号急剧增大，然后逐渐趋于平稳，当反应时间超过90分钟时，随着时间的延长，信号变化趋势不明显，当反应时间增大，但信号出现平台时，说明反应达到饱和点，对应的时间为反应的饱和时间。因此，综合考虑时间的损耗和放大效率的影响，我们选择90分钟作为最优反应时间。
2.5.6酶的用量优化
循环反应体系中，酶的用量会直接影响大放大效率，酶的用量过大，会造成药品的浪费，用量不足，会使循环反应不能充分进行，影响检测灵敏度。因此本实验对循环反应体系中聚合酶、核酸内切酶Nb.BbvCI的用量分别进行了优化，实验中所用的溶菌酶的浓度为1.0×10-12M，在固定剪切酶的用量，通过向反应体系中加入不同量的聚合酶，观察SPR检测信号的变化。如图10所示，在聚合酶的用量从0.05UμL-1增加到0.2UμL-1的变化过程中，随着聚合酶用量的增大，SPR检测信号不断增强，这是由于随着聚合酶用量的加大，聚合反应的完成效率不断提高，而当聚合酶用量大于0.2UμL-1后，继续增加反应体系中聚合酶的用量，SPR检测信号趋于平稳，出现平台。说明体系中聚合反应所需的聚合酶已基本达到饱和，考虑到经济和聚合效率的影响，我们选择0.2UμL-1作为体系中聚合酶的最佳使用量。随后，我们固定聚合酶的用量为0.2UμL-1，通过向反应体系中加入不同量的剪切酶，观察SPR检测信号的变化。由图11可以看出，在剪切酶用量达到0.3UμL-1时，循环反应达到饱和点，因此我们选择0.3UμL-1作为剪切酶Nb.BbvCI的最佳用量。
2.6SPR检测溶菌酶的灵敏度
在最佳的实验条件下，我们考察了溶菌酶的检测灵敏度。图12为不同浓度的溶菌酶进行靶向激活循环放大SPR检测得到的共振角实时变化曲线。从图中可以看出，当溶菌酶浓度在1.0×10-13～5.0×10-11M之间变化时，SPR响应信号的强度随靶DNA浓度的增加而增大。
图13为共振角度的变化对溶菌酶浓度的工作曲线，以溶菌酶浓度的对数值为横坐标，不同浓度的溶菌酶SPR检测信号值为纵坐标绘制标准工作曲线。从图中可以看出，溶菌酶检测的线性范围为1.0×10-13～5.0×10-11M，线性回归方程为Y＝0.3726log10C+4.8762(Y为扣除空白溶液响应后的SPR响应信号的变化，C为溶菌酶的浓度)，线性相关系数为0.9896，检测限为7.6×10-14M(S/N＝3)。对1.0×10-12的靶DNA进行11次的平行测定，相对标准偏差为8.2％，表明该检测方法具有良好的精密度和重现性。
2.7溶菌酶检测的选择性
除了检测灵敏度，选择性是评价检测体系的另一个关键因素。对于适体感应系统，检测的特异性主要由适体的内在性质所决定的。尽管溶菌酶的适体链对靶分子具有特异性识别作用，但是在本实验体系中，适体序列被包含在探测探针中，有可能会影响适体序列对靶物质的识别能力。为了考察该检测体系的选择性，我们在相同实验条件下对非靶蛋白质对反应体系的影响进行了研究。如图14所示，当没有溶菌酶存在的条件下，检测信号十分微弱，说明含有适体序列的发夹结构的检测探针能提高反应的选择性而且通过使用PBS缓冲溶液对金片进行彻底地冲洗能够去除金膜上非特异性吸附的物质。假设相同实验条件下，低浓度的溶菌酶产生的检测信号为100％，而在反应体系中加入较高浓度的非靶蛋白质时，它们所产生的相对的SPR检测信号还不足3.0％。实验结果表明，观测到的检测信号是由溶菌酶和适体之间特异性的结合作用所产生，该检测方法具有较好的选择性。
2.8SPR检测体系的实用性研究
为了验证该方法在实际临床应用中的可行性，采用加标回收法，将不同浓度的溶菌酶加入到人血清样品中，测得加标回收率为96.3～103.7％，相对标准偏差为5.6～7.1％。实验结果如表2，该方法具有实际临床应用潜力，能够对复杂生物样品进行分析检测。
表2血清样品中SPR检测溶菌酶的回收率
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，其特征是：步骤如下：
(1)基底上发夹结构的检测探针DNAS1既含有靶蛋白的适体序列，又具有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与DNAS1上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNAS1上3’暴露出来；
(2)纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补，充当聚合反应引物的DNAS2，所述DNAS2与步骤(1)打开的发夹探针互补杂交后，以发夹探针为模板链复制，将靶蛋白质从DNAS1上替换下来，替换下来的靶蛋白与其他的发夹探针结合，引发新的靶分子的替换聚合反应，同时，由于发夹结构的检测探针上还具有剪切酶的识别序列，当引物沿模板链聚合生长形成双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处在模板链对应的互补序列上形成缺口，随后再在DNA聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模板链聚合生长，将形成缺口的另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板链互补的序列，也能和其他的发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的核酸链替代聚合反应，结合靶分子的替换聚合循环放大，形成了双重循环放大体系；
(3)将步骤(2)反应结束后得到的基底进行表面等离子共振检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(1)中待测系统中的PBS缓冲溶液的pH为6.5-8.5，更优选7.4。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(2)中双重循环放大反应的反应温度为20-50℃，更优选37℃；反应的时间为10-150min，更优选90min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(1)发夹结构探针的浓度为5.0×10-8M-1.0×10-5M，更优选5.0×10-7M。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(2)纳米金生物条码探针上S3/S2为1:1-50:1，更优选20:1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(2)中DNA聚合酶的用量为0.05UμL-1-0.5UμL-1，更优选DNA聚合酶的用量为0.3UμL-1。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(2)内切酶的用量为0.05UμL-1-0.5UμL-1，切刻内切酶的用量为0.3UμL-1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述步骤(3)具体为：将基底固定在SPR检测仪上，通入DNA功能化的量子点信号探针，进行表面等离子共振检测，所述量子点信号探针上固定的DNAS4能够与双重循环放大反应的产物互补杂交，增强检测信号。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是：所述靶蛋白为溶菌酶。
10.一种利用表面等离子共振检测蛋白质的试剂盒，其特征是：基底上发夹结构的检测探针、纳米金生物条码探针，所述基底上发夹结构的检测探针既含有靶蛋白的适体序列DNAS1，又具有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与发夹结构的检测探针DNAS1上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNAS1上的3’端的茎部3’暴露出来，所述纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚合反应前体的DNAS2，核酸链替代聚合反应体系和靶分子替代聚合反应体系。
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CN107419005A (zh) * 2017-04-27 2017-12-01 青岛大学 一种基于多种信号放大技术检测溶菌酶的qcm检测方法及应用
CN108287219A (zh) * 2018-01-10 2018-07-17 桂林理工大学 一种通用型化学生物传感信号指数级放大方法
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