CN105241855A - 微通道电泳定量分析装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物大分子检测,具体涉及电泳分析检测。一种微通道电泳定量分析装置,包括一电泳检测系统,电泳检测系统包括待分析混合物、微通道和荧光检测装置,待分析混合物包括标准参照物和待分析组分;微通道设有正极端和负极端,微通道的横截面直径在微米级,微通道内充满电解液;待分析混合物位于负极端内,微通道内还设有一检测区域,荧光检测装置朝向检测区域。本发明优化了微通道聚合物电泳系统的结构,采用微管道实现了对生物大分子物质进行分析分离。微通道为待分析混合物提供分离通道。电解液使待分析混合物在电泳过程中,按照分子量不同而分离。

Description

微通道电泳定量分析装置及方法
技术领域
本发明涉及生物大分子检测,具体涉及电泳分析检测。
背景技术
在分析物质的过程中,我们往往采用电泳方法来分离所需物质,电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来,电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。
然而现有的电泳检测系统无法对DNA、RNA、蛋白质等生物分子进行精确的分离分析,而且方法繁琐,不利于长期发展。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种微通道电泳定量分析装置,解决以上技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种微通道电泳定量分析方法,解决以上技术问题。
一种微通道电泳定量分析装置,包括一电泳检测系统,其特征在于,所述电泳检测系统包括待分析混合物、微通道和荧光检测装置,所述待分析混合物包括标准参照物和待分析组分;
所述微通道设有正极端和负极端,所述微通道的横截面直径在微米级,所述微通道内充满电解液;
所述待分析混合物位于所述负极端内,所述微通道内还设有一检测区域,所述荧光检测装置朝向检测区域。
本发明优化了微通道聚合物电泳系统的结构,采用微管道实现了对生物大分子物质进行分析分离。微通道为待分析混合物提供分离通道。电解液使待分析混合物在电泳过程中,按照分子量不同而分离。
所述标准参照物与所述待分析组分具有不同分子量。便于在电泳过程中分离。
所述标准参照物与所述待分析组分具有相同分子属性,是同一种生物大分子。因此标准参照物与待分析组分具有相同的荧光染料结合率,便于从二者的荧光强度关系推倒为浓度/质量关系。
作为一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为DNA。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为RNA。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为蛋白质。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为酚类化合物。
作为一种方案,所述电解液内混合有荧光染料。
作为另一种方案,所述待分析混合物中混合有荧光染料。
本发明通过荧光染料与待分析混合物在激发光下能够发出荧光,使待分析混合物在激发光下能够被检出。
所述微通道可以是毛细管或芯片微通道。
所述微通道正极端和负极端还连接一高压电源。为电泳分析提供均匀电场。
作为一种方案,所述电解液为TBE(Tris-硼酸),由Tris54g,27.5g硼酸,20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)混合,加蒸馏水定容至1L,高温高压灭菌制成。
作为另一种方案,所述电解液可为TAE、TPE或MOPS。
所述高压电源还连接一控制系统,所述控制系统连接一荧光激发装置;所述荧光激发装置是激光发生器、光谱仪或LED,所述荧光激发装置朝向所述检测区域。为待分析混合物和荧光的结合物提供激发光,控制系统用于收集和储存来自荧光检测装置传输的数据。
所述荧光检测装置包括一光电检测器,所述光电检测器将荧光信号转换成电信号,传输到数据处理系统和控制系统;所述光电检测器包括CCD图像传感器、光电二极管、光电三极管、光电倍增管、电荷耦合器件中任意一种,优选为光电倍增管。光电倍增管具有极高灵敏度和超快时间响应的光探测器件,成本低。在检测区域收集微通道内发出的荧光信号。
所述荧光检测装置连接所述控制系统,所述荧光检测装置包括一光电传感器,所述光电传感器与所述毛细管内的检测区域之间设有第一光学装置,所述第一光学装置包括滤光片;
所述光电传感器是一CCD传感器或PMT传感器。
所述第一光学装置还包括一变焦透镜,所述变焦透镜连接所述控制系统。通过变焦透镜对图像进行变焦处理。
所述荧光激发装置包括一激发荧光的发光元件,用于调整发光元件发光强度的电流调节模块;所述电流调节模块可连接所述控制系统,所述电流调节模块连接所述发光元件。便于调节发光元件的强弱。
作为一种方案,所述荧光激发装置还包括第二光学装置,所述第二光学装置包括一准直透镜,以及至少四个反射镜,所述反射镜反射面朝向所述准直透镜,且反射面与所述准直透镜的主光轴呈45度角;所述反射镜至少一条边与所述准直透镜主光轴间的距离小于所述主光轴与所述准直透镜边缘的距离;
所述准直透镜的入射方向上设有所述发光元件,以所述反射镜的反射方向为所述荧光激发装置的发光方向。增强荧光激发装置的激发效果。
作为另一种方案,所述第一光学装置包括一准直透镜,以及至少四个反射镜,所述反射镜反射面朝向所述准直透镜,且反射面与所述准直透镜的主光轴呈45度角;
所述反射镜至少一条边与所述准直透镜主光轴间的距离小于所述主光轴与所述准直透镜边缘的距离。提高探测装置收集数据的信噪比。
所述反射面为四边形,至少四个所述反射面的一条边分别位于同一平面上,且所述主光轴垂直于所述平面。
四个所述四边形为全等的等腰梯形,四个所述等腰梯形围成一倒置四锥台,所述短底边接近所述准直透镜。
所述控制系统还连接一数据处理系统。用于分析编辑收集到的荧光信号数据。
所述微通道外壁还设有一温控装置,所述温控装置与所述控制系统连接。
本发明通过温控装置对微通道进行加温与控温的,使微通道保持在最适宜的反应温度。
所述温控装置包括用于改变微通道温度的半导体温控片,还包括用于测量微通道温度的温度传感器;所述半导体温控片和所述温度传感器均与所述控制系统相连。
所述控制系统连接一显示屏。所述显示屏能将采集到的荧光信号直接发送到显示屏中便于观察。
所述光电检测器包括透镜组、光电传感器,所述透镜组包括一滤光片;所述透镜组后方设有所述光电传感器,所述光电传感器连接所述控制系统。
所述光电传感器获取检测信号通过控制系统将图像反馈到显示屏中,控制系统能对得到的检测信号进行分析。
所述透镜组还包括一变焦透镜,所述变焦透镜连接所述控制系统。通过变焦透镜对图像进行变焦处理。
一种采用电泳检测系统进行微通道电泳定量分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:微通道内添加待分析混合物,微通道正极端和负极端连接一高压电源;
步骤二:电泳开始前,待分析混合物于微通道内负极一端;电泳开始时,控制系统控制高压电源开启,微通道内部形成电场,待分析组分在微通道内部从负极向正极迁移,标准参照物与待分析组分电泳后互相分离;
步骤三:待分析组分与荧光染料结合,在激发光下发出荧光;
步骤四:待分析组分迁移到微通道检测区域,发出的荧光被荧光检测装置检测,控制系统收集并储存检测数据。
所述检测数据包括一电泳图谱。便于进行直观分析。
标准参照物在待分析混合物中的质量或浓度为已知,待分析混合物的电泳分析数据(即电泳图谱)反应其荧光强度,又由于毛细管电泳的在线检测特点,其电泳峰面积与荧光强度的待分析混合物中待分析组分的质量(或浓度)为其电泳峰面积乘以标准参照物的质量-电泳峰面积比。
作为一种方案,若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Q1,则待分析混合物中待分析组分的质量(或浓度)为Q2=Q1*(A2/A1);其中A1为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、A2为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积。
电泳图谱上,代表待分析混合物中待分析组分的电泳峰(或者电泳条带)的面积A(或电泳条带亮度的积分)与待分析组分在激发光下荧光强度I成正比,与待分析组分在混合物中的质量Q(或浓度)成正比,A=C*I=K*Q(C、K为常数);同一电泳图谱上,具有一定分离度的两个电泳峰(或电泳条带),其各自面积(或电泳条带亮度积分)与所代表的待分析组分质量(或浓度)比相同,A1/Q1=A2/Q2=K;待分析混合物中标准参照物和待分析组分的质量(或浓度)分别为Q1、Q2,在电泳图谱中对应电泳峰面积分别为A1、A2。
作为另一种方案,若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Qi,则待分析混合物中待分析组分的质量或浓度为Q=Qi*(ATi/AiT);其中Ai、Ti为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间;A、T为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间。
毛细管定量检测需要计算电泳图谱电泳峰的面积,该电泳峰对应待分析物的检出时间。通常电泳峰面积A与待分析物电泳条带的荧光亮度I之间的关系为公式(1)。其中C为常数,n为与检出时间有关的参数(公式(2))。
A=n*C*I(1)
n=f*Ls*tm/Le(2)
其中,f光电探测器的探测频率,tm为电泳条带的检出时间,Le为毛细管的有效长度。
研究表明,电泳条带的荧光强度与其浓度/质量成正比,如公式(3)所述,其中k为常数。本发明在进样过程中,将待分析物与一质量/浓度(Qi)已知的内参照物混合到一起。则可通过该内参照物的荧光强度计算得到待分析物的浓度(公式(4))。结合公式(1)、(2)、(4),便可得待分析物的计算方法,如公式(5)。
Q=k*I(3)
Q=Qi*(I/Ii)(4)
Q=Qi*(A/Ai)*(tmi/tm)(5)
所述标准参照物与所述待分析组分具有相同分子属性,是同一种生物大分子。
所述标准参照物与所述待分析组分具有不同分子量。便于在电泳过程中分离。
作为一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为DNA。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为RNA。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为蛋白质。
作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为酚类化合物。
附图说明
图1为本发明的一种检测结果的电泳图谱;
图2为本发明微通道电泳定量分析的流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体图示进一步阐述本发明。
参照图1、图2,一种微通道电泳定量分析装置,包括一电泳检测系统,其特征在于,所述电泳检测系统包括待分析混合物、微通道和荧光检测装置,所述待分析混合物包括标准参照物和待分析组分;所述微通道设有正极端和负极端,所述微通道的横截面直径在微米级,所述微通道内充满电解液;所述待分析混合物位于所述负极端内,所述微通道内还设有一检测区域,所述荧光检测装置朝向检测区域。本发明优化了微通道聚合物电泳系统的结构,采用微管道实现了对生物大分子物质进行分析分离。微通道为待分析混合物提供分离通道。电解液使待分析混合物在电泳过程中,按照分子量不同而分离。所述标准参照物与所述待分析组分具有不同分子量。便于在电泳过程中分离。所述标准参照物与所述待分析组分具有相同分子属性,是同一种生物大分子。因此标准参照物与待分析组分具有相同的荧光染料结合率,便于从二者的荧光强度关系推倒为浓度/质量关系。
作为一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为DNA。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为RNA。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为蛋白质。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为酚类化合物。作为一种方案,所述电解液内混合有荧光染料。作为另一种方案,所述待分析混合物中混合有荧光染料。本发明通过荧光染料与待分析混合物在激发光下能够发出荧光,使待分析混合物在激发光下能够被检出。所述微通道可以是毛细管或芯片微通道。所述微通道正极端和负极端还连接一高压电源。为电泳分析提供均匀电场。作为一种方案,所述电解液为TBE(Tris-硼酸),由Tris54g,27.5g硼酸,20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)混合,加蒸馏水定容至1L,高温高压灭菌制成。作为另一种方案,所述电解液可为TAE、TPE或MOPS。所述高压电源还连接一控制系统,所述控制系统连接一荧光激发装置;所述荧光激发装置是激光发生器、光谱仪或LED,所述荧光激发装置朝向所述检测区域。为待分析混合物和荧光的结合物提供激发光,控制系统用于收集和储存来自荧光检测装置传输的数据。
所述荧光检测装置包括一光电检测器,所述光电检测器将荧光信号转换成电信号,传输到数据处理系统和控制系统;所述光电检测器包括CCD图像传感器、光电二极管、光电三极管、光电倍增管、电荷耦合器件中任意一种,优选为光电倍增管。光电倍增管具有极高灵敏度和超快时间响应的光探测器件,成本低。在检测区域收集微通道内发出的荧光信号。所述荧光检测装置连接所述控制系统,所述荧光检测装置包括一光电传感器,所述光电传感器与所述毛细管内的检测区域之间设有第一光学装置,所述第一光学装置包括滤光片;所述光电传感器是一CCD传感器或PMT传感器。所述第一光学装置还包括一变焦透镜,所述变焦透镜连接所述控制系统。通过变焦透镜对图像进行变焦处理。所述荧光激发装置包括一激发荧光的发光元件,用于调整发光元件发光强度的电流调节模块;所述电流调节模块可连接所述控制系统,所述电流调节模块连接所述发光元件。便于调节发光元件的强弱。
作为一种方案,所述荧光激发装置还包括第二光学装置,所述第二光学装置包括一准直透镜,以及至少四个反射镜,所述反射镜反射面朝向所述准直透镜,且反射面与所述准直透镜的主光轴呈45度角;所述反射镜至少一条边与所述准直透镜主光轴间的距离小于所述主光轴与所述准直透镜边缘的距离;所述准直透镜的入射方向上设有所述发光元件,以所述反射镜的反射方向为所述荧光激发装置的发光方向。增强荧光激发装置的激发效果。作为另一种方案,所述第一光学装置包括一准直透镜,以及至少四个反射镜,所述反射镜反射面朝向所述准直透镜,且反射面与所述准直透镜的主光轴呈45度角;所述反射镜至少一条边与所述准直透镜主光轴间的距离小于所述主光轴与所述准直透镜边缘的距离。提高探测装置收集数据的信噪比。所述反射面为四边形,至少四个所述反射面的一条边分别位于同一平面上,且所述主光轴垂直于所述平面。四个所述四边形为全等的等腰梯形,四个所述等腰梯形围成一倒置四锥台,所述短底边接近所述准直透镜。所述控制系统还连接一数据处理系统。用于分析编辑收集到的荧光信号数据。
所述微通道外壁还设有一温控装置,所述温控装置与所述控制系统连接。本发明通过温控装置对微通道进行加温与控温的,使微通道保持在最适宜的反应温度。所述温控装置包括用于改变微通道温度的半导体温控片,还包括用于测量微通道温度的温度传感器;所述半导体温控片和所述温度传感器均与所述控制系统相连。所述控制系统连接一显示屏。所述显示屏能将采集到的荧光信号直接发送到显示屏中便于观察。所述光电检测器包括透镜组、光电传感器,所述透镜组包括一滤光片;所述透镜组后方设有所述光电传感器,所述光电传感器连接所述控制系统。所述光电传感器获取检测信号通过控制系统将图像反馈到显示屏中,控制系统能对得到的检测信号进行分析。所述透镜组还包括一变焦透镜,所述变焦透镜连接所述控制系统。通过变焦透镜对图像进行变焦处理。一种采用电泳检测系统进行微通道电泳定量分析方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一:微通道内添加待分析混合物,微通道正极端和负极端连接一高压电源;步骤二:电泳开始前,待分析混合物于微通道内负极一端;电泳开始时,控制系统控制高压电源开启,微通道内部形成电场,待分析组分在微通道内部从负极向正极迁移,标准参照物与待分析组分电泳后互相分离;步骤三:待分析组分与荧光染料结合,在激发光下发出荧光;步骤四:待分析组分迁移到微通道检测区域,发出的荧光被荧光检测装置检测,控制系统收集并储存检测数据。
所述检测数据包括一电泳图谱。便于进行直观分析。标准参照物在待分析混合物中的质量或浓度为已知,待分析混合物的电泳分析数据(即电泳图谱)反应其荧光强度,又由于毛细管电泳的在线检测特点,其电泳峰面积与荧光强度的待分析混合物中待分析组分的质量(或浓度)为其电泳峰面积乘以标准参照物的质量-电泳峰面积比。作为一种方案,若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Q1,则待分析混合物中待分析组分的质量(或浓度)为Q2=Q1*(A2/A1);其中A1为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、A2为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积。电泳图谱上,代表待分析混合物中待分析组分的电泳峰(或者电泳条带)的面积A(或电泳条带亮度的积分)与待分析组分在激发光下荧光强度I成正比,与待分析组分在混合物中的质量Q(或浓度)成正比,A=C*I=K*Q(C、K为常数);同一电泳图谱上,具有一定分离度的两个电泳峰(或电泳条带),其各自面积(或电泳条带亮度积分)与所代表的待分析组分质量(或浓度)比相同,A1/Q1=A2/Q2=K;待分析混合物中标准参照物和待分析组分的质量(或浓度)分别为Q1、Q2,在电泳图谱中对应电泳峰面积分别为A1、A2。作为另一种方案,若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Qi,则待分析混合物中待分析组分的质量或浓度为Q=Qi*(ATi/AiT);其中Ai、Ti为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间;A、T为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间。
毛细管定量检测需要计算电泳图谱电泳峰的面积,该电泳峰对应待分析物的检出时间。通常电泳峰面积A与待分析物电泳条带的荧光亮度I之间的关系为公式(1)。其中C为常数,n为与检出时间有关的参数(公式(2))。A=n*C*I(1)n=f*Ls*tm/Le(2)其中,f光电探测器的探测频率,tm为电泳条带的检出时间,Le为毛细管的有效长度。研究表明,电泳条带的荧光强度与其浓度/质量成正比,如公式(3)所述,其中k为常数。本发明在进样过程中,将待分析物与一质量/浓度(Qi)已知的内参照物混合到一起。则可通过该内参照物的荧光强度计算得到待分析物的浓度(公式(4))。结合公式(1)、(2)、(4),便可得待分析物的计算方法,如公式(5)。Q=k*I(3)Q=Qi*(I/Ii)(4)Q=Qi*(A/Ai)*(tmi/tm)(5)所述标准参照物与所述待分析组分具有相同分子属性,是同一种生物大分子。所述标准参照物与所述待分析组分具有不同分子量。便于在电泳过程中分离。作为一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为DNA。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为RNA。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为蛋白质。作为另一种优选方案,所述标准参照物和所述待分析组分同为酚类化合物。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种微通道电泳定量分析装置,包括一电泳检测系统,其特征在于,所述电泳检测系统包括待分析混合物、微通道和荧光检测装置,所述待分析混合物包括标准参照物和待分析组分;
所述微通道设有正极端和负极端,所述微通道的横截面直径在微米级,所述微通道内充满电解液;
所述待分析混合物位于所述负极端内,所述微通道内还设有一检测区域,所述荧光检测装置朝向检测区域。
2.根据权利要求1所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述标准参照物与所述待分析组分具有相同分子属性,是同一种生物大分子;所述标准参照物与所述待分析组分具有不同分子量。
3.根据权利要求1所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述微通道是毛细管或芯片微通道。
4.根据权利要求1所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述微通道正极端和负极端还连接一高压电源;
所述高压电源还连接一控制系统,所述控制系统连接一荧光激发装置;所述荧光激发装置是激光发生器、光谱仪或LED,所述荧光激发装置朝向所述检测区域。
5.根据权利要求4所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述荧光检测装置包括一光电检测器,所述光电检测器将荧光信号转换成电信号,传输到数据处理系统和控制系统;所述光电检测器包括CCD图像传感器、光电二极管、光电三极管、光电倍增管、电荷耦合器件中任意一种;
所述荧光检测装置连接所述控制系统,所述荧光检测装置包括一光电传感器,所述光电传感器与所述毛细管内的检测区域之间设有第一光学装置,所述第一光学装置包括滤光片;
所述光电传感器是一CCD传感器或PMT传感器。
6.根据权利要求5所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述第一光学装置还包括一变焦透镜,所述变焦透镜连接所述控制系统。通过变焦透镜对图像进行变焦处理;
所述荧光激发装置包括一激发荧光的发光元件,用于调整发光元件发光强度的电流调节模块;所述电流调节模块连接所述控制系统,所述电流调节模块连接所述发光元件。
7.根据权利要求4所述的一种微通道电泳定量分析装置,其特征在于:所述微通道外壁还设有一温控装置,所述温控装置与所述控制系统连接;
所述温控装置包括用于改变微通道温度的半导体温控片,还包括用于测量微通道温度的温度传感器;所述半导体温控片和所述温度传感器均与所述控制系统相连。
8.一种采用根据权利要求1所述的电泳检测系统进行微通道电泳定量分析的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:微通道内添加待分析混合物,微通道正极端和负极端连接一高压电源;
步骤二:电泳开始前,待分析混合物于微通道内负极一端;电泳开始时,控制系统控制高压电源开启,微通道内部形成电场,待分析组分在微通道内部从负极向正极迁移,标准参照物与待分析组分电泳后互相分离;
步骤三:待分析组分与荧光染料结合,在激发光下发出荧光;
步骤四:待分析组分迁移到微通道检测区域,发出的荧光被荧光检测装置检测,控制系统收集并储存检测数据。
9.根据权利要求8所述的微通道电泳定量分析的方法,其特征在于:若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Qi,则待分析混合物中待分析组分的质量或浓度为Q=Qi*(ATi/AiT);其中Ai、Ti为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间;A、T为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积、电泳峰出现时间。
10.根据权利要求8所述的微通道电泳定量分析的方法,其特征在于:若待分析混合物中标准参照物,其质量(或浓度)已知,为Q1,则待分析混合物中待分析组分的质量(或浓度)为Q2=Q1*(A2/A1);其中A1为电泳图谱中标准参照物对应的电泳峰面积、A2为电泳图谱中待分析组分对应的电泳峰面积。
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