JP2009504161A - アッセイ、合成及び保管のための装置、並びにその製造法、使用法及び操作法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/707,501号(2005年8月11日出願)の優先権を主張し、米国特許出願第10/315,832号(2002年12月10日出願)の一部継続出願であり、この米国特許出願第10/315,832号は、米国特許出願第09/975,496号(2001年10月10日出願;これは現在、米国特許第6,716,629号として発行される)の分割出願であり、米国仮特許出願第60/239,538号(2000年10月10日出願)、米国仮特許出願第60/268,894号(2001年2月14日出願)及び米国仮特許出願第60/284,710号(2001年4月18日出願)の恩恵を主張する。前記出願の各々が、その全体を参考として本明細書により組み込まれる。
樹脂の一体成型による貫通穴のアレイの製造
高密度の貫通穴アレイを製造するための従来の技術には、微細加工、放電加工(EDM)又は化学的エッチングが含まれる。あるいは、アレイは、ポリマー又は樹脂で一体成型することができる。一体成型用金型を、金型の内径がアレイデバイスの最終的な外径と等しいか、又はそれよりも大きくなるように設計することができる。一体成型用金型の深さは、1つのアレイについては0.5mmほどに小さくすることができ、又は1メートル以上にすることができる。樹脂の長いブロックが一体成型される場合、樹脂は、横に切って、所望される厚さの薄切りにすることができ、また、表面を研磨又は平滑化することができる。貫通穴はいくつかの方法による一体成型で規定することができる。固体ワイヤ、繊維、又は所望される幾何形状及び直径のピンのアレイを、一体成型用金型の内部に配置することができる。必要ならば、ワイヤ、繊維又はピンは、1つ又はそれ以上の配置用ジグを一体成型用金型内で使用することにより、所定の位置に固定化することができる。ワイヤ、繊維又はピンの化学的特性は、樹脂又はポリマーが固化するとき、それらが樹脂又はポリマーとの永続的な結合を形成せず、その結果、それらを引き抜いて貫通穴を作製できるように選ばなければならない。例えば、繊維は、エチレンテレフタレートであってもよく、樹脂はポリメチルメタクリレート(PMMA)である。あるいは、ワイヤ、繊維又はピンの表面を、最終的なキュア処理、硬化又は重合が完了すると、一体成型された樹脂又はポリマーからのワイヤ、繊維又はピンの除去を容易にする離型剤(例えば、オイル、フルオロポリマー、水又は重合抑制剤など)により被覆することができる。
貫通穴のアレイを製造する1つの方法は、上部及び下部表面を有する溝付きプレートを積み重ね、一緒に接着し、これにより三次元アレイを得ることである。任意の数の物質を、貫通穴のアレイを製造するために使用することができ、そのような物質には、ケイ素、ガラス、プラスチック、樹脂又は金属が含まれるが、これらに限定されるものではない。使用される物質に依存して、溝は、様々な技術(例えば、微細加工、化学的エッチング、エンボス加工又はスタンピング)を使用して個々の表面に加工することができる。各々の溝の深さ及び幅により、完成したプラテンにおける貫通穴の直径が決定され、そして各々の溝の深さ及び幅は、所望される仕様に従って加工することができる。
1つの態様において、貫通穴の高密度アレイが、シリコンウエハーにおいて作製される。酸化ケイ素層が、シリコンアレイを炉において、酸化を引き起こすのに十分な高い温度に加熱することによってアレイの全表面に均一に作製される。炉内の酸素及び/又は湿度レベルは、酸化プロセスを早めるために周囲よりも高くすることができる(例えば、「Atalla et al., The Bell System Technical Journal. pp. 749-783, May 1959」を参照されたい)。酸化ケイ素層は、様々な化学的表面処理をアレイ表面に適用することを可能にするので好都合である。表面処理の様々な例が、「Immobilized Affinity Ligand Techniques (Hermanson et al, Academic Press, San Diego, 1992)」及び「Unitied Chemical Technologies, Inc., Bristol, PA.)」から入手可能な技術文献に見出される。酸化ケイ素の使用は、表面の光学的反射能が、酸化ケイ素薄膜の厚さを調節することによって制御されることを可能にする、さらなる利点を提供する(例えば、「Principles of Optics, M.Born & E. Wolf, Pergamon Press, 1980, 59-66」を参照されたい)。
貫通穴アレイの表面を、(例えば、その物理的及び化学的特性を変化させるために)様々な方法で修飾することができる。表面修飾のタイプには、ポリマー被覆の適用、金属の堆積、化学的誘導体化及び機械的研磨が含まれるが、これらに限定されるものではない。
水溶液がアレイ表面に接着しないようにするために、また負荷時及び他の操作時における様々な貫通穴の間における相互汚染を防止するために、プラテンの表面を疎水性の被覆物により被覆することが望ましい。貫通穴の内側表面を親水性の被覆物により被覆し、その結果、貫通穴の内側表面が流体を保持するようにすることもまた望ましい。内側の被覆物をさらにブロッキング処理し、これにより非特異的な結合を防止する、又は親和性リガンドにより誘導体化することができる。疎水性表面及び親水性貫通穴のこの組合せにより、貫通穴への即座の負荷を可能にしながら、水溶液がアレイの表面に接着することが防止される。
1つの方法において、多数の同一の貫通穴アレイが調製され、位置合わせされ、積み重ねられる。化学試薬が、積み重ねられたアレイによって形成される連続した流路の中を通過させられる。試薬は、溶液、懸濁物、液体、蒸気又は微粉末であり得る。アレイの積み重ね物は、その後、洗浄され、乾燥され、そして特定の被覆に適切であるように加熱される。その後、チップの積み重ね物は、互いに物理的に分離され、積み重ね物の上部及び底部におけるアレイ(「犠牲アレイ」)が捨てられる。
多くの場合において、プローブを貫通穴の全て、いくつか又は1つの内壁に固定化することが望ましい。プローブをガラス又はプラスチック表面に共有結合により結合するための多くの技術が存在する(例えば、「Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Academic Press, 1992」を参照されたい)。ガラスについて有用なそれらの方法はまた、ケイ素基材の酸化された表面に使用することができる。例えば、酸化されたケイ素の貫通穴アレイにおける穴の内壁を、酸の存在下でg−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランと反応させ、そして加熱して、グリセロール被覆をもたらすことができる。その後、このグリセロール被覆は、ペプチド又は核酸プローブに共有結合することができる。
貫通穴の内壁は、Wei他(Nature, 399:243-246, 1999)により概略される手順に従った化学的エッチングによって多孔性にすることができる。多孔性の領域の面積が大きくなると、表面積が増大し、貫通穴の内壁に結合される化学試薬の量が増大する。合成の変換に使用される場合、多孔性の貫通穴の増大した試薬負荷は、収率を増大させる。検出に使用される場合、増大した試薬負荷は、感度を増大させる。更に、隣接する貫通穴の間の物質を多孔性にすることができ、これにより、液体又は気体による貫通穴間の連絡が可能になる。この方法は、隣接する貫通穴に保管された試薬の制御された送達に有用であり、これにより、試薬の混合を可能にし、反応を開始させることができる。貫通穴の全て又は一部(例えば、ちょうど中央部分)を多孔性にすることができる。
プラテンの貫通穴の内壁は、タンパク質又は細胞の共有結合的又は非共有結合的な結合が可能になるように誘導体化することができる。その後、このようにして結合させたタンパク質又は細胞から生じる何らかのシグナルは、そのシグナルがELISAアッセイでのように酵素的に増幅される場合を除いて、ウエルの周縁部に限定される。しかしながら、このように増幅された場合でさえ、シグナルは、例えば、低い分析物濃度によって弱められる。細胞付着の場合、ウエルには底がないので、細胞は内壁にだけ結合することができ、上に向かって二次元的に増殖することができる。アレイの貫通穴の壁に対する受動的なタンパク質吸着及び共有結合に対する代替法が、三次元の疎水性足場(例えば、タンパク質カップリングのために活性化されるか、又はウエル内でのタンパク質若しくは細胞の閉じ込めが可能である親水性の線状のゲル又はフォームポリマー充填物など)を導入することである。
貫通穴の内側表面は親水性であるので、親水性又は水溶性のプレポリマーをプラテンのウエルに容易に負荷することができ、そして重合反応を、温度若しくはpHの変化によって、又は開始剤の添加によって開始させることができる。タンパク質のカップリングを、重合条件がタンパク質の構造及び機能に影響を及ぼさないならば、重合時に行うことができる。あるいは、タンパク質のカップリングを、重合後に行うことができる。タンパク質を、遊離アミン、遊離カルボン酸基及び遊離スルフィド基の反応を含め、様々な反応の何れかを用いてカップリングすることができる。イソウレア連結、ジアゾ連結又はペプチド結合を形成する反応は、タンパク質を表面にカップリングするために一般的に用いられる反応の1つであるが、容易に制御される水溶性のポリマー反応の何れかを使用することができる。ポリマー足場の例には、デキストラン及びポリアミドが含まれる。
タンパク質及び細胞はともに、繊維、マトリックス、半透過性膜の細孔、ゲル又はフォームの内部におけるカプセル化によって固定化することができる。細胞のカプセル化では、下記の要因の特別な検討が必要とされる:支持体内及び支持体を介した物質の拡散;細胞に対する出発物質及びポリマーの非毒性;及び物理的特性(例えば、光学的透明度、温度安定性、柔軟性、並びに化学物質及び微生物の攻撃に対する抵抗性など)。支持体は、好ましくは、弾力的で、柔軟性であり、水素結合が可能であり、そしてタンパク質分解及び加水分解に対して抵抗性があるものである。
本発明は、多孔性膜が、プラテンの穴が膜の両側で一直線になるプラテンの間に挟まれる形式において、真核生物細胞を増殖させ、そして分析するための方法を特徴とする。細胞が、プラテンの穴の1つと膜とによって形成されるウエルにおいて増殖させられる。取り外し可能なガスケットを、細胞が加えられることができるデバイスの上部に設置することができる。テスト化合物を、マイクロスポット用のピンを用いて、又はテスト化合物がウエル上方に事前にスポットされた固体表面を位置合わせすることによって、膜のいずれかの側でウエルに導入することができる。デバイスは、蒸発を低く抑えるために、スペーサーによって隔てられるカバースリップにより両側を覆うことができる。固体基材(例えば、ガラス製顕微鏡スライドガラスなど)を、デバイスを支えるために使用することができる。画像分析を、従来の走査デバイスにより巨視的に行うことができ、又は光検出若しくは蛍光検出を用いて微視的に行うことができる。生化学的分析を、標準的な遠心分離又は真空ろ過のデバイスを使用して上清又は細胞溶解物に対して行うことができる。
繊維で満たされた穴を有する貫通穴アレイを、簡便かつ安価な様式で作製することができる。有用な繊維の例には、ガラス繊維フィルター、メッシュガラス繊維フィルター及びポリマーフィルター(例えば、ナイロン(登録商標)及びポリエーテルスルホンなど)が含まれる。これらの物質は、融着の前に、特異的な相互作用のための表面修飾をすることができる。
多孔性物質を含有する貫通穴のアレイを作製するための別の方法は、アレイを適切な方法(例えば、EDMなど)によって加工すること、そしてその後、物質をアレイにおいて増殖させることである。多孔性ガラスは、圧力をかけてホルムアミドと混合されたケイ酸カリウムの混合物をアレイの中に強制的に入れ、その後、数時間焼成することによってアレイに導入することができる。融着されるか、又は結合剤に埋め込まれるキャピラリーのアレイは、この方法によって多孔性ガラスを充填することができ、その後、多孔性ガラスが充填された貫通穴アレイの多数の薄いプラテンを得るために、冷却された切断用ノコにより切断することができる。粒子(例えば、多孔性シリカ又はポリマービーズなど)をケイ酸カリウム混合物に含めることによって、物質の親和性特性及び多孔性を所望の通りに調節することができる。
マスキングによるアレイの合成
ある特定の方法は、試薬がマスクに適用される場合、試薬がマスクによって選択された貫通穴だけに通じるようなプラテンの、1つのプラテン又は位置合わせして積み重ねたプラテンに少なくとも1つのマスクを適用することを特徴とする。特定の態様において、試薬は、水溶液、有機溶液、乾燥粉末、ゲル、気体又は電磁放射線(例えば、熱、光、X線、紫外線、磁場)から選択することができる。試薬を、マスクを介してアレイ内に導入するための方法には、機械的又は光学的圧力を試薬リザーバーに加えること、拡散及び電気泳動が含まれる。隣接するウエルの相互汚染を防止するための対策では、第2の同一のマスクを、試薬が適用される面とは反対側のプラテンの面に置くこと、そして貫通穴を通って流れる過剰な液体を吸収するためにブロッターを使用することが含まれる。マスク及びアレイは、静電気力、磁力若しくは重力によって、又は加えられた圧力(例えば、クランプを積み重ねたプラテンの周縁部に適用することによる)によって一緒に保持することができる。マスク及びアレイは、液体が貫通穴を満たす場合、静電気力、磁力又は重力により、又は積み重ねたプラテンを減圧することによって分離することができる。積み重ねたプラテンは場合により、分離を容易にするために乾燥することができる。
本発明の態様では、合成又は分析のために使用されるアレイと、実質的に同一である貫通穴アレイの使用によってマスクを製造することが提供される。一態様において、マスクを、金属、誘電体(ガラス、ポリマー)又は半導体(例えば、ケイ素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム)から製造することができる。慣性ドリリング(drilling)が、ポリマー、ガラス又は金属でのマスクを製造するための好適な製造プロセスである。パターン化の化学的エッチングプロセス(例えば、深掘り反応性イオンエッチング(DRIE)など)は、半導体及び誘電体(例えば、ガラスなど)でのマスクを製造するための別の好適な製造プロセスを提供する。放電加工(EDM)は、導電性物質(例えば、導電性半導体及び金属)でのマスクを製造するための別の好適な製造プロセスである。
貫通穴におけるプローブのアレイの合成では、多くのマスクの使用を伴うので、マスクを交換するための迅速な自動化方法が望ましい。1つの方法では、合成されるアレイの幅よりも広い幅を有する単一の柔軟なテープ(例えば、金属又はプラスチックのテープなど)において多数のマスクを作製することを含む。第1のマスクをアレイと位置合わせでき、試薬をそのアレイに移すことができる。その後、テープを、第2の試薬を加える前に、次のマスクを明らかにするように進めることができる。このプロセスを、固相合成が完了するまで繰り返すことができる。アレイ全体の洗浄を必要とする工程のために、単一の大きい穴、又はアレイにおける各々の位置に対応する穴を、テープ上に作製することができる。合成のさらなる処理及び特別仕様化のために、テープは、例えば、テープを進めるときに穴を作製する、パンチ穴のアレイ又はマイクロ配置レーザードリリングシステムを有することによって、合成と同時に作製することができる。第2のテープ又はブロッターを、(例えば、クロストークを防止するために)アレイの反対側で使用することができる。マスクをアレイと位置合わせするための様々な方法が使用でき、これらには、正確な位置合わせ用切り欠きをテープに設置すること、及びアレイに対するマスクの位置を決めるための光学的又は電流検出を使用することが含まれる。
本明細書中に記載されるマスク合成方法はまた、硬質のプラテンの代わりに、アドレス指定できない多孔性膜(例えば、フィルター)と共に使用することができる。
断面で見る場合、キャピラリーチューブアレイ(図6)が、第2のアレイの貫通穴に正確に嵌合する外径を有するキャピラリーチューブ(1)から構築される。チューブアレイ(3)が、一方の端におけるチューブが、貫通穴アレイにおける穴の間の間隔に等しい中心間の間隔を有し、反対側の端におけるチューブが、マイクロタイタープレート(2)におけるウエルの中心間の間隔に等しい中心間の間隔を有するように設計される。このような間隔の貫通穴を有するプレートは、チューブを通常のアレイで保持するためのジグ(4)として役立つ。これら2つの端の間に置かれたさらなる貫通穴プレートは、中心間の間隔がチューブの長さにわたって変化するとき、チューブアレイに追加の支えを提供するスペーサージグである。
図7に例示されるように、流体を、柔軟な部材のアレイ(2)(例えば、形状記憶合金繊維)を用いてマイクロタイタープレート(3)の個々のウエルから移すことができる。繊維の直径は、流体が移されるアレイ(1)における貫通穴の内側寸法以下である。束における繊維の数は、例えば、マイクロタイタープレートにおけるウエルの数に等しくすることができる。束の一方の端における繊維の端は、貫通穴アレイにおける穴の間隔に等しい中心間の間隔を有することができ、一方、反対側の端における繊維の端は、マイクロタイタープレートにおけるウエルの間隔に等しい中心間の間隔を有することができる。繊維は、束の一方の端から別の端まで繊維間の間隔を増大させるように設計された一連の貫通穴ジグにより所定の位置で保持することができる。所定の位置に固定されると、形状記憶合金繊維を、その臨界転移温度よりも高く加熱して、強制された繊維の曲率を永続的にすることができる。室温に冷却された後、繊維を、繊維の中心間の間隔における変化を損なうことなく、保持用ジグから取り除くことができる。その後、繊維束の密集した端を、プレートにおける各々のウエルから流体が入ることになる貫通穴アレイに、挿入することができる。反対側の端は、各々の繊維がマイクロタイタープレートにおけるウエルの上に配置され、かつ繊維の端が各々のウエルに含有される流体に沈めることができるように配置することができる。引っ込められたとき、小さい体積の滴(4)を、各々の繊維の端に(例えば、表面張力によって)付着させたままにすることができる。貫通穴アレイの穴を通って束を引っ張るように、力を繊維束の反対側の端に加えることができ、その結果、流体が、対応する貫通穴と接触するようになる。繊維が穴を通って引っ張られるので、繊維が取り除かれるとき、表面張力が液体を貫通穴に保持するように作用することができる。
アレイはまた、圧力をプラテン全体に加えることによって負荷することができ、それにより、試薬及び/又はサンプルの希釈溶液を貫通穴のアレイを通って流れるようにできる。この方法は、貫通穴が試薬により既に負荷され、第2の組の試薬との反応が望まれる場合に好都合であり得る。
ビーズの負荷を、均一なサイズの微細なポリマー球体に固定化されたコンビナトリアルライブラリー全体を負荷するために使用することができる。この方法では、アレイにおける貫通穴は、1つの貫通穴あたり1個だけの微小球体を保持するように形状化することができる。貫通穴はさらに、微小球体がアレイ表面又はそれよりも下側のいずれかで穴に置かれるように、先細りの断面を有することができる(図8)。
貫通穴を含有するプラテンを複製することにより、各々の流路が特異な遺伝的プロフィールを有する細胞のコロニーを含有する、アレイが複製される。マスタープレートが、多様な遺伝的特性の細胞の懸濁物から調製される。懸濁物は、アレイが希釈溶液から負荷される場合、平均して1個の細胞が各々の流路に移されるように希釈することができる。その後、アレイは、細胞が中期対数期に達するまで、その細胞タイプのための適切な温度及び撹拌と共に、閉じられた湿度チャンバーにおいてインキュベーションされる。細胞数密度を、選択された流路を光学顕微鏡で観察し、光がアレイに入射するときの散乱の量を測定することによって、又は細胞が緑色蛍光タンパク質の産生のための遺伝子を含有するならば、各々の流路からの蛍光の強度を測定することによって推定することができる。様々な方法を、細胞の一部を各々の流路から第2のアレイの対応する流路に移すために使用することができる。
貫通穴アレイに含有される液体サンプルは、親水性領域及び疎水性領域のパターンを有する平坦な表面に一部又は全てを移すことができる。親水性領域は、アレイが表面と接触する場合に、各々の貫通穴の内容物が多くても1つの親水性領域と接触するように、互いに空間的に隔離され、かつ貫通穴の間隔に一致しなければならない。表面における疎水性領域はまた、移された流体を互いに隔離するために役立つ。
プランジャーの殺菌は、連続サンプリングスキームの重要な態様であり得る。1つの方法は、少なくとも2つのプランジャーを有することである。この場合、一方のプランジャーがサンプリング中である間に、他方が殺菌される。2つのプランジャーは、共通の機械的ハウジングに設置することができ、例えば、プランジャー軸に平行する軸の周りで回転するように取り付けることができる。プランジャーの殺菌は、熱、又は殺菌剤(例えば、70%エタノール)への曝露によって達成することができる。セラミック外装の内部のワイヤ(例えば、白金)ループは、好適なプランジャー設計の一例である。セラミック外装は機械的堅さを与え、電気的絶縁体であり、これに対して、ワイヤループは、電流による加熱を可能する。一例として、4J/kg・℃の比熱を有する白金のワイヤループが使用されることを仮定する。10−4kgのワイヤを、0.2sで1000℃に電気的に加熱するためには、4.5Aの最大電流が必要であるが、これは、中出力のサイリスターを用いて容易に達成される。急速冷却は、揮発性の殺菌剤(例えば、エタノール)のスプレーから達成することができ、その大きい蒸発潜熱が、加熱されたワイヤを冷却することを助けることができる。あるいは、ワイヤは、ガス又は液化ガス(例えば、液体窒素など)のスプレーによって急速冷却することができる。
試薬又は培地がタンパク質又は界面活性剤が多く含み、表面張力が低い場合には、プラテンを目的の試薬に沈めることによってプラテンに負荷することが、1つの課題となり得る。低い表面張力の流体の液滴は、負荷される流体から除かれた後もプラテンの表面に留まることができる。タンパク質が多い培地の液滴又は表面被覆物が、表面に留まるな場合、アッセイの汚染又は貫通穴間のクロストークが生じる。この問題は、負荷される流体と混和しない疎水性流体の層に通してプラテンを引き上げることによって、大幅に軽減される。これにより、プラテンの表面に付着しているタンパク質又は界面活性剤を取り除くワイピング(wiping)又は「液体スキージー(squeegee)」効果がもたらされる。ワイピング液の設定は、少なくとも3つの方法のうちの1つで生成することができる。
ピンのアレイ(1)を、貫通穴の第2の通常のアレイ(2)と一緒に位置決めし、そして位置合わせするように配置されたピンを用いて製造することができる(図3)。各々の貫通穴は、化学合成のために好適なリンカー分子が各々の貫通穴の内側表面に固定化されるように調製することができる。ピンの末端又は先端を、所定の表面積にわたって親水性にすることができ、一方で、アレイ表面積の残り部分は疎水性にされる。一態様において、ピンアレイにおけるピンの先端が、貫通穴アレイ(3)の貫通穴に負荷される流体と接触させられる。引っ込められたとき、小さい体積の液体の滴が(例えば、表面張力によって)各々のピンの親水性領域に付着する。ピンに付着している液体の体積は、液体と固体表面との間における相対的な表面エネルギー、及び疎水性表面積に対する液体内へのピンの浸漬深さによって決定される。付着性液体の滴を有するピンアレイを、液体が入れられる貫通穴が付着性液体の滴を有する各々のピンに対して相対的に位置合わせするように、貫通穴アレイに対して配置することができる。これら2つのアレイは、滴が(例えば、毛細管圧によって)対応する貫通穴の中に入るように接触させることができる。ピンアレイを除くことにより、アレイ(4)の貫通穴の中に置かれた流体が後に残る。従って、化学反応を、貫通穴の内側表面に固定化されたリンカー分子と、貫通穴に置かれた液体との間で開始させることができる。化学反応の速度は、温度を上げることによって、及び/又は貫通穴アレイの周りの雰囲気の気体の分圧及び/又は組成を変化させることによって増大させることができる。反応が完了した後、アレイは、未反応の成分を除くために洗浄し、そして過剰な溶媒を除くために乾燥することができる。同じ又は異なるピン構成のいずれかを有する第2のピンアレイは、流体で負荷することができ、合成プロセスを繰り返すことができる。アレイ負荷プロセスは、単純な機械的動きに依存できるので、アレイ負荷は極めて迅速であり得る。従って、律速段階は、合成工程そのものであると考えられる。
確率論的アレイを、アレイにおける異なる貫通穴にランダムに動くノズルを使用して作製することができる。貫通穴に確率論的方法(この場合、サンプルの1つの変数がランダムな様式で変化する)で負荷することは、多くの用途を有する。例えば、確率論的負荷は、負荷されたサンプルにおける特定の試薬の濃度に関して変化し得る。試薬の濃度の違いは、多くの異なる反応条件の制御された様式でのサンプリングを同時にすることを可能にする。例えば、サンプルのこの種の適用は、化学合成における反応条件を最適化するために使用することができ、又は結晶化実験のパラメーターを最適化することができる。
コンビナトリアルライブラリーの合成
本発明は、コンビナトリアルライブラリーをプラテンにおいて作製する新規な方法を提供する。この新規な方法を用いて作製することができるコンビナトリアルライブラリーのタイプには、核酸アレイ、ペプチドアレイ、タンパク質アレイ、ポリマーアレイ、及び小分子のアレイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
化学的プロセス又は物理的プロセスの最適化では、実験条件の多変数空間を、所望の結果をもたらすそのようなパラメーターのサブセットについて探索することが要求される。この探索の方法は、体系的又は確率論的のいずれでも可能であり、いずれか又は両方の方法を本発明の態様として実行することができる。体系的な最適化は、既知の通常の様式で貫通穴ごとの化学的条件又は物理的条件のアレイを作製することにより達成される。
結晶化されたタンパク質のX線回折は、タンパク質の構造及び機能を明らかにするための重要な分析ツールである。タンパク質は、一般に多数の疎水性分子群及び親水性分子群を含むので、結晶化させることが困難であり得る。結果として、タンパク質は多くの場合、溶媒、pH、塩濃度及び温度の各条件の特定のセットのもとでのみ結晶化する。タンパク質結晶化のためのハイスループット方法が、本発明によって可能になる。
生化学的に有効な化合物が、医薬品化合物としてのさらなる開発のために好適であるか否かを決めるパラメーターには、吸収、分布、代謝、排出及び毒性(「ADMET」)が含まれる。薬剤の可能性のあるリード化合物の数が、一次ハイスループットスクリーニングにおける進歩により増大するので、ADMETテストがますます、薬剤開発プロセスにおける律速になり得る。
経口投与が、小分子薬剤のための好ましい投与経路である。経口投与された薬剤が生物学的効力を有するためには、その薬剤が生体利用可能でなければならない(すなわち、その薬剤は腸を介して、血流の中に入ることができなければならない)。薬剤の候補物が腸の内壁を通過する能力を、インビトロアッセイで評価することができることが非常に望ましい。一般的には、そのような吸収アッセイでは、2つの液体充填チャンバーを分離する半透過性膜に増殖させた細胞の単層物が利用される。薬剤候補物が、チャンバーの一方に加えられ、拡散又は輸送のための十分な時間の後で、もう一方のチャンバーにおける分子の濃度が定量分析される。
代謝検討のために、化合物は、様々なチトクロームP−450(CYP−450)酵素又は肝臓ミクロソーム調製物によって分解される、その性向についてテストすることができる。薬剤−薬剤の相互作用を引き起こす性向を、各々の薬剤又は薬剤候補物による様々なCYP450酵素の阻害をアッセイすることによって評価することができる。
本発明の態様では、ライブラリー由来の化合物の細胞毒性を測定することが提供される。吸着及び代謝アッセイに関連した上記のように、化合物は、小さい有機分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖であり得て、液体に懸濁するか、又は貫通穴の内部若しくは長さ方向の高い透過性及び横方向の低い透過性を有する膜において細胞の単層物として増殖させることができる。膜は、例えば、プレートの貫通穴における重合されるモノマー、又は貫通穴アレイのドメインに等しいドメインサイズ及び中心間の間隔を有する柔軟な膜における親水性/疎水性ドメインを含むことができる。既知濃度の様々な体積が、化合物ライブラリーから1つの貫通穴アレイに負荷される。細胞層をライブラリーアレイと接触させて置き、インキュベーションすることができ、各々の貫通穴における細胞を生存能について分析することができる。
特定の標的高分子に対する化合物ライブラリーの様々な構成成分の親和性を測定又はランク付けすること、又はプローブアレイの様々な構成成分に対する分析物の親和性を測定することは望ましいことであり得る。そのようなスクリーニングを、本明細書中に記載の新規な方法を用いて行うことができる。例えば、親和性実験を、標的を貫通穴アレイの多くの穴に固定化すること、潜在的なリガンドのライブラリーでプローブすること、又はリガンドライブラリーをアレイに固定化し、標的でプローブすることによって実施することができる。
新しい薬剤標的が急速に発見されつつあるので、これらの標的に対する親和性を有する分子を機能的アッセイの非存在下で見出すための方法が必要である。この目標を満たすことは、標的生体分子をアレイの内側表面に固定化すること、アレイの穴を化合物のライブラリーと共にインキュベーションすること、そして化合物を保持するアレイのそのような構成成分を検出することによって達成することができる。結合した化合物はまた、標的分子を、熱変性に対して親和性の程度と相関する程度に安定化させる。タンパク質のアンフォールディングを温度又は変性溶媒条件の関数として検出することによって、親和性を、例えば、米国特許第6,020,141号(Pantolianoら)に記載されるように、ランク付けすることができる。
本発明の態様では、数多くの既知の核酸配列を含有する貫通穴アレイの製造が提供され、この場合、少なくともいくつかの未知の配列を有する核酸溶液をアレイの穴の各々に加えること、未知の核酸が貫通穴における相補的な核酸に特異的に結合するための十分な時間、温度及び溶液の条件を提供すること、そして各々の貫通穴における既知及び未知の配列の核酸との間でのハイブリダイゼーションの程度を分析することを伴う。結合後、アレイを所望の厳密性の溶液により洗浄することができる。多くの場合、未知の核酸には、蛍光性プローブが結合している。本発明の利点は、シグナルの増幅が、ハイブリダイゼーションした核酸に関連する酵素反応を使用することによって達成することである。例えば、未知の核酸を西洋ワサビペルオキシダーゼにより標識することができ、そして結合及び洗浄工程の後で酵素と反応した場合に、発光、蛍光又は発色シグナルを生成する基質とインキュベーションすることができる。そのような増幅技術は、平面状の表面での従来の核酸アレイとの適合性を有することができるが、これは、溶液における活性化された基質は一般に、拡散のためにアレイ上の特定の点に割り当てることができないことによる。PCR又は他の熱サイクル反応を、アレイを水非混和性液体(例えば、オイル、アルカン又はペルフルオロ化溶媒など)に沈めることによってアレイにおいて行うことができる。アレイ及び水非混和性液体を、熱伝導性の容器(例えば、金属箱など)に含まれるようにでき、その後、そのような箱を収容するのに適合化したサーマルサイクラー(thermal cycler)に入れることができる。
蒸発を最小限にするために、少量の低揮発性の非混和性液体で小さい体積の水性反応媒体の上に層を作ることが当分野では既知である。例えば、少量の鉱油で、加熱サイクル期間中の蒸発を最小限にするために、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)反応液を含有する反応バイアルに層を作ることができる。酸素溶解性が大きい内容物を伴う流体が、酸素を必要とする系への酸素輸送を可能にするために使用されることもまた知られている。本発明の新規な態様では、酸素溶解性が高い内容物を伴う非混和性流体を、細胞の生存能を維持するために酸素輸送を容易にしながら、サブマイクロリットルのサンプルのアレイからの蒸発をなくすために使用することができる。
サンプルを貫通穴から移す方法
さらに別の方法は、マイクロタイタープレートへの移送を特徴とする。テストに対して陽性の応答となるサンプルを回収するために、多くの場合、高密度アレイプレートにおける選択された貫通穴から、流体を低密度のウエルを有するマイクロタイタープレートに移す必要がある。多くの場合、この移送プロセスは、無菌技術を用いて実施しなければならない。このことは、選択された性質を有する貫通穴に保持された物質をサンプルのより大きいコレクションからサンプリングすることを可能にする。流体を高密度アレイプレートからマイクロタイタープレートのウエルに移すための、3つの一般的な方法が存在し、単一のサンプリングデバイスによる移送、サンプリングデバイスの線状アレイによる移送、及びサンプリングデバイスの二次元アレイによる移送である。禁止された(proscribed)貫通穴からのサンプルを、空間的に局在化された機械的動作によって取り出すことができる。1つの一般的な態様は、物質を機械的に反対側から移動させるために、穴の下に配置された容器に入れるように、部材を穴に通して挿入することである。第二の一般的な態様は、穴における物質を反対側の端から移動させるために、穴の下に配置された容器に入れさせるように、局在化されたガスジェット又は液体ジェットを適用することである。第三の、しかし、より遅い方法は、液体をピン又はシリンジに移し、ピン又はシリンジを容器に移動させ、液体を分注することによって、液体を穴から待ち受け容器に移すことである。
図10に関連して、レーザー(1)からのビームは、シャッター(2)を通過し、貫通穴の高密度アレイ(5)における指定された貫通穴(4)に収束するようにビーム走査システム(3)によって導くことができる。レーザーの波長は、標的の貫通穴における流体の吸収バンドと一致するように選ぶことができる。対応する吸収係数は、入射したレーザー放射線の大きな割合が液体カラムの上部の薄い層において吸収されるようにすることができる。シャッターは、貫通穴の液体がレーザー放射線に曝される時間の長さを制御することができる。シャッターが開いているとき、レーザー光は液体を照射し、十分なエネルギーが曝露時間の間に吸収されて、薄い液体層を迅速に加熱して気化させ、これにより、圧力の迅速な増大を貫通穴の一方の端において引き起こす。膨張しつつある蒸気から得られた力により、液体が穴の反対側の端(6)から貫通穴アレイの下に位置するマイクロタイタープレート(7)のウエルの中へ噴出されるのを引き起す。加熱された表面の上方の体積が気密シールされるならば、液体に加えられる力を増大させ、さらなる力の増大が可能である。カラムからの液体の迅速な気化及び排出では、レーザーエネルギーを熱化時間よりも少ない時間で堆積させることが要求される。迅速な排出は、処理能を増大させるために、また液体に含有される細胞又は試薬の実質的な分解を防止するために必要となる。
前述の態様の延長としては、貫通穴の一方の端の近くに位置する炸薬を発火させたときの急速に膨張するガスによって生じる圧力波によって液体を貫通穴から排出することである。図10に関連して、ばらばらの緩燃性炸薬のアレイ(1)が、1つの炸薬が1つの貫通穴の上に位置するように、貫通穴アレイに関して一緒に位置決めされる。各々の炸薬が、共通壁としての薄い膜を貫通穴とともに有するチャンバーにおいて設置される。炸薬アレイが、貫通穴アレイに接着される(又は、強固に取り付けられる)。この適用のための爆発性物質の例には、プラスチック爆薬シート、例えば、「C4」、又はプラスチックに埋め込まれたトリニトロトルエン(TNT)などが含まれる。炸薬アレイは、例えば、電気的又は光学的にアドレス指定可能である。個々の炸薬を、電流を、チャンバー内に位置する抵抗エレメント(2)に流すことによって、又は収束レーザービームによってチャンバー内に与えられる熱エネルギーによって発火させることができる。発火させられると、爆発からの膨張するガスが、分離用膜を破裂させ、液体(3)を、貫通穴(4)を通して、貫通穴アレイ(7)の下に位置するマイクロタイタープレート(6)のウエル(5)の中に押し出すのに十分な圧力を生じさせる。
貫通穴又は貫通穴群の液体サンプルは、チューブ又は流路に吸引することによって貫通穴から移すことができる。柔軟なチューブ又は硬質のチューブ(一般には貫通穴の内径よりも小さい外径を有する)の1つの先端を、貫通穴内に位置が合うようにできる。その場合、チューブの遠位端を減圧にして、流体を貫通穴からチューブの中に吸引するように使用することができる。吸引される流体の量は、いくつかの変数を操作することによって正確に制御することができる。例えば、チューブの長さ及び内径により、1本のチューブの両端における圧力低下が決定される。この圧力低下は、結果として、減圧にする所定の量に対して、1本のチューブを通過する流速に影響する。一定量の流体を、貫通穴からバルブアセンブリーに吸引することができ、バルブアセンブリーから、流体を、所定の適用に必要とされる流体素子回路の何れかのタイプに加圧又は減圧によって移動させることができる。一態様において、流体が、貫通穴から流体素子バルブに吸引される。そのようなバルブの作動により、流体が、その流体を分析するために質量分析計に加圧により導入される。あるいは、さらなるサンプル調製又は特徴付け(例えば、クロマトグラフィー、分光法)を、貫通穴から吸引される流体に対して実施することができる。
本発明はまた、イオン性サンプルを、化学的プローブを含有する貫通穴アレイに導入するための方法、サンプルにおけるある特定のイオンとプローブとの間での結合を厳密に調節するための方法、及びイオン性サンプルを貫通穴アレイから取り出すための方法を提供する。この方法では、穴に局在化された化学的プローブを含有する貫通穴アレイを、電気泳動装置中の緩衝液に入れることが含まれる。イオンを含有するサンプルが、平面状の貫通穴アレイの一方の側において電気泳動装置に導入され、その結果、電場が加えられると、適切な電荷のイオンが貫通穴アレイの方向で移動するようにされる。特定のイオンが、アレイに結合せず、また、電場が十分な時間にわたって加えられるならば、そのイオンは穴を通って貫通穴アレイの反対側に移動する。電場の方向を周期的に変化させることによって、貫通穴における荷電化学種と化学的プローブと間での結合の平衡状態に近づくことが加速される。分析されるサンプルの部分精製は場合により、貫通穴アレイへの移動の前にゲルによるサンプルの電気泳動によって達成することができる。サンプルにおける目的の分析物が化学的プローブと会合していると、非特異的に結合したイオンを化学的プローブから解離させるための十分な時間及び十分な強度で電場を加えることができる。その後、貫通穴アレイを電気泳動装置から取り出し、結合のパターンを分析することができる。結合した分析物はまた、さらなる分析のために取り出すことができるが、例えば、膜にエレクトロブロッティングし、その後、その膜をさらなる分析のために取り出す。
多くの適用のために、サンプルは、クロマトグラフィー工程によって単離、精製又は濃縮される。多くの異なるタイプのクロマトグラフィーを、液体サンプルに対して行うことができる。公知のクロマトグラフィー法の例には、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、バイオアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーマトリックスは、不溶性のビーズ、ゲル、樹脂、ポリマー又はスラリーの形態であり得る。あるいは、マトリックスは微細加工構造物であり得る。そのような微細加工構造物の1つの態様が、面の大きさが0.01μm〜10μmの程度の正方形の貫通穴又は流路のグループ化である。これらの貫通穴の壁は、サンプルが貫通穴の群の中を流れるとき、分離が達成されるように、所望の親和性を有する表面により被覆することができる。その後、目的の分析物混合物がこのマトリックスに導入され、マトリックスに対する分析物混合物の成分の選択的な結合が生じる。その後、目的の分析物又は混入物を、マトリックスの物理的又は化学的環境を変化させることによってマトリックスから選択的に溶出させることができる。
デバイスを、カラムのアレイの内部に固定化されたクロマトグラフィーマトリックスを有するクロマトグラフィーカラムのアレイを含むように製造することができ、例えば、カラムのアレイが、クロマトグラフィーマトリックスを含有しない貫通穴のアレイにおける貫通穴と一緒に位置決めできるような間隔を有している。貫通穴のアレイの物理的サイズにより、カラムのアレイのサイズが決定される。好ましくは、カラムのアレイにおける各々のカラムの内径は、貫通穴のアレイにおける対応する一緒に位置決めされる貫通穴の内径と類似である。
クロマトグラフィーでは一般に、化合物の混合物を、クロマトグラフィーマトリックスとその混合物の個々の成分の示差的な化学的及び/又は物理的相互作用に基づいて分離することを伴う。物理的及び/又は化学的環境における突然の変化又は漸進的変化は、混合物の成分とクロマトグラフィーマトリックスとの間における相互作用に影響を及ぼす。一般的には、物理的及び/又は化学的条件が変化するのに伴って、混合物の各々の成分が、クロマトグラフィーマトリックスから個々に溶出する。化合物の混合物の所定の成分を、さらなる分析又はクロマトグラフィーのために単離することは望ましいことであり得る。一部の場合において、目的の成分を、オンラインでの分光学的分析によって同定することができる。
大気圧イオン化質量分析(API−MS)
貫通穴のアレイにおけるサンプルを、大気圧イオン化質量分析(API−MS)のような分光分析技術によって分析することができる。分光分析は、一般的には連続的に行われる。従って、チップは、蒸発によるサンプルの損失を避けるために、制御された温度及び湿度の環境において環境的に隔離されなければならない。API−MSにおいて、サンプルを質量分析計に導入するための1つの簡便な方法は、選択されたサンプルを、(例えば、本明細書中に記載されるように)ある長さのキャピラリーチューブを使用して、特定の貫通穴からバルブの中に直接に吸引することを特徴とする。その場合、一定体積のサンプルを、標準的なAPI−MSプロトコルを用いて質量分析計に導入することができる。
MALDI TOF−MS分析において、目的のサンプルは一般に、1つ又はそれ以上のマトリックス形成化合物と混合される。一般的に、有機マトリックス物質(例えば、ヒドロキシケイ皮酸の誘導体)の飽和溶液が、等体積のサンプルと混合される。MALDI TOF−MSのいくつかの適用では、有機マトリックス化合物が無機のナノ粒子(例えば、コロイド状金、量子ドット又は多孔性シリカ)によって置き換えられる。その後、混合物は、平坦なプレートでの通常のアドレス指定可能なアレイの形態でスポットされ、完全に蒸発させられる。その後、サンプルプレートが質量分析計に置かれ、サンプルがパルスレーザーからの照射によってイオン化される。
電場の中に置かれるか又は圧力により動かされる場合、貫通穴アレイは、並列キャピラリー電気泳動、界面動電クロマトグラフィー又はクロマトグラフィーのデバイスとして使用することができる。1つの貫通穴アレイにおけるアレイのサンプルを、第2の、一般的にはより長い貫通穴アレイに導入することができる。第2の貫通穴アレイは、ゲル(例えば、シリカ)、ポリマー(例えば、ポリアクリルアミド)又は樹脂により満たすことができ、そして電気浸透又はタンパク質結合を防止若しくは強化するために、その壁を被覆することができる。しかしながら、電気泳動又はクロマトグラフィーがそのようなアレイで実施されるならば、各々のカラムの産出物を、分子がカラムから現れるときに分析することは困難である。この問題を軽減するための1つの方法は、分析物の分子に親和性を有する移動する表面(例えば、ニトロセルロースシート)に産出物を通し、その後その膜を画像化検出器に移動させることである。例えば、蛍光標識されたDNA又はタンパク質を、移動するニトロセルロース膜の上に溶出させ、そして分析するために蛍光画像化装置に通すことができる。連続して移動する表面は、テープの様式で移動する場合、サンプルのスミアリングを引き起すであろう。従って、表面が移動しているような期間に、電場の極性若しくは圧力を低下させるか、又は電場の極性又は圧力を反転させることが好都合である。検出システムの感度の増大は、検出器が画像を取得している間に、表面の運動を遅らせること及び電圧又は圧力によって達成することができる。あるいは、画像化装置は、ラインスキャナー(例えば、蛍光レーザーラインスキャナーなど)が可能である。表面は、所望されるならば、(例えば、テープ様の様式で)長いスプールから供給することができる。表面はさらに、第2のスプールで巻き取ることができる。
貫通穴の壁に対する化学的結合を検出するためにアレイの湿潤性を使用する方法
2つのタンパク質の間の結合(例えば、抗体と抗原との間における結合など)が、流路内部の表面エネルギーに対するその影響により検出される。
サンプル又はサンプルのアリコートは、いくつかの異なる方法の1つによって、質量分析による分析のために貫通穴のアレイから取り出すことができる。そのような方法の一つは、サンプル又はそのアリコートを減圧の適用によりチューブに引き入れることを特徴とする。この方法の一例では、シリンジの先端が、アレイにおける選択された貫通穴に挿入され、一定量のサンプルがシリンジの中に引き込まれる。あるいは、真空を使用して、サンプルを、チューブの長さ部、バルブ又は保管用容器に吸引することができる。
多くの生物学的アッセイは、貫通穴のアレイから蛍光画像化によって取得することができる蛍光読み取り値を与えるように構成される。一般的に、励起ランプ又はレーザーからの光は、励起フィルターを通過し、アレイを通過し、放射フィルターを通過し、その後CCDカメラに至る。多くの場合において、シグナルの感度が、フィルターの不完全な性能に起因するバックグラウンド光によって、また、サンプル及び光学的要素による光の非弾性散乱及び弾性散乱によって制限される。目的の蛍光団が、約1ns〜1msの蛍光寿命を有することから見れば、散乱ははるかにより短い時間スケールで生じる。従って、バックグラウンド光の除去を、時間ゲート化の技術によって達成することができる。時間ゲート化は、カメラがデータを取得することを防止しながら、サンプルを照射し、迅速に励起光を除き、その後、蛍光放射画像を取得する前に一定の遅延時間を待つプロセスである。励起後の最初の1ps〜100psの期間中に放射された光子を集めないことによって、バックグラウンドノイズが著しく減少し、シグナル対ノイズが改善される。同様な装置を、様々な遅延時間によるデータ取得を繰り返すために使用することができ、従って、アレイにおける貫通穴の各々についての蛍光寿命情報がもたらされる。
貫通穴アレイは、各々の貫通穴に含有される物質と光場との同時かつ並行する相互作用のための光学的共鳴器又は光学的干渉計のいずれかに挿入することができる(図21を参照されたい)。そのような方法は、貫通穴アレイ(2)が、吸収(5)を増大させるために、光路長を貫通穴アレイの長さよりも増大させるように、光学的共鳴器に設置される場合(照射(1)が照らし、ミラー(2)とミラー(3)との間で増幅される)には、好都合であり得る。光路長が、光学的吸収を増大させるために、素通り長さの倍数として増やされる。例えば、化学反応を同時に開始させるには、光学的共鳴器に特徴的な増強された光場によって実施する。それはまた、例えば、入射光場強度、位相、偏光若しくは振動数の変化を記録することによって、又は貫通穴に含有される物質と入射光場との間での相互作用の結果(例えば、蛍光、リン光)若しくは物質そのものにおける変化(例えば、ルミネセンス)として放射される光のこれらのパラメーターを記録することによって、貫通穴に含有される物質間の相互作用を同時に分析するための手段として好都合であり得る。
本発明は、化学的プローブのアレイの出力を検出するために、多くのシステムとの適合性を有している。市販の蛍光スキャナーを、所望されるならば、使用することができる。アレイにおける各々の位置は、2つの開口部(すなわち、プラテンの上部面及び底部面に)を有するので、アレイは、プラテンの一方の面で電磁放射線に曝すことができ、アレイのサンプルの光学的特性を、プラテンの反対側の面での検出によって測定することができる。アレイの位置を並行して、又は連続走査技術によって画像化することができる。反応の静的分析及び動的分析の両方を利用することができる。
液体で満たされた2つ又はそれ以上のアレイの積み重ね物を分離する方法
個々の貫通穴の内容物が積み重ねによって一緒にされると、アレイを分離することは望ましいことであり得る。例えば、2倍ずつの希釈を行うために、化学的ライブラリーで満たされたアレイが、溶媒緩衝液を含有するアレイに積み重ねられる。2つの液体の混合のための十分な時間(100nlについては約15秒)が経過した後、プレートは、ライブラリー構成成分が初期濃度の半分である2つの同一のアレイを作製するために分離される。このプロセスを、希釈系列を作製するために繰り返すことができる。
多くの生物学的又は化学的アッセイでは、サンプルの遠心分離及び/又はろ過が必要とされる。多くの場合、貫通穴のアレイで行われる生物学的又は化学的アッセイにおいて、サンプルをろ過又は遠心分離することは望ましいことであり得る。下記の発明は、貫通穴のアレイの遠心分離及び/又はろ過のためのデバイスに関する。
ナノリットル体積の流体取り扱いによって提供される試薬体積の節約及び増大した処理能の潜在的可能性を完全に実現するために、化学的及び生物学的サンプルを小さい体積に高密度で保管する手段及び方法が必要である。このような保管システムは、マイクロ流体のスクリーニング器具類によって容易に利用されなければならない。
試薬を節約し、そして処理能を増大させるために、薬剤候補物のようなサンプルを非常に小さい体積でスクリーニングすることは好都合である。一般的な貫通穴アレイ形式は、60nlの流体を保持する流路を有しており、一般的なアッセイが、合計で120nlを保持する2つの積み重ねられたチップを用いて行われる。アッセイにおいて許容されるDMSOの最大濃度が2%であるならば、合計で2.4nlが流路の1つに分注されなければならず、これは、従来の液体取り扱いシステムにより行うことが極めて困難である。この問題を解決するための1つの方法が、化合物を揮発性溶媒(エタノール、DMSO、水など)に溶解し、化合物を分注し、溶媒を蒸発させ、これにより、乾燥した化合物のスポットを容器に残すことである。これは、化合物が、容易に再溶解しない形態に結晶化することがあり、また十分に固定化されないという点で、いくつかの大きな欠点を有する。別の方法が、DMSOのような揮発性溶媒の化合物を分注し、DMSOを蒸発させて、所望の化合物をより少ない体積のDMSOにおいて残すことである。この場合、溶媒を一様に蒸発させることが困難であるかもしれず、このために、サンプルに対して行われるアッセイが妨げられるかもしれない。
(実施例)
DNAプローブアレイ
50,000流路の貫通穴アレイを、ケイ素から製造する。遺伝子データベースを用いて、80個の空間的フィルターの上部マスクのシリーズを、別の80個の同一底部マスクと共に製造する。アレイを位置合わせして、遊離官能基の被覆を貫通穴の内側表面に施すために、3−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランにより誘導体化する。
触媒スクリーニング
組換え酵素ライブラリーを、蛍光発生基質に対して貫通穴の高密度アレイにおいてスクリーニングする。ポリヒスチジンタグを有するプロテアーゼ・ズブチリシンの遺伝子を含有する遺伝子的に多様な大腸菌を、変異誘発によって作製する。細菌の希釈溶液を、1つの貫通穴当たり平均して1〜2個の細菌が存在するようにニッケル被覆アレイに加える。細菌を対数期に増殖させ、複製を(上記のように)作製する。アレイにおける細菌を、加熱によって溶解し、タグ化ズブチリシンをアレイのニッケル被覆壁に結合させる。蛍光発生基質及び反応緩衝液(Boehringer)を各々のウエルに含有する別のアレイを、第1のアレイと共に積み重ねる。積み重ね物を、CCDカメラベースの蛍光画像化システムに直ちに入れ、蛍光強度の増大速度を各々の貫通穴について測定する。最も速い速度を有する酵素を選択し、複製プレートにおける対応する細菌を更なる研究のために増殖させる。
ビーズを用いたハイスループットスクリーニング
直径10ミクロンのビーズに光切断可能なリンカーを介して固定化された100,000成分のコンビナトリアルライブラリーを、Affymaxから購入する。プラテンを、1個だけのビーズが各々の穴に嵌るような直径の100,000個の貫通穴を伴って調製する。ビーズをPBSで洗浄し、スクリーニングされる酵素についての蛍光発生基質を含有する溶液に懸濁し、ゴムスパチュラによりプラテン上に広げる。紫外線ランプを使用して、ライブラリーの成分をビーズから脱結合する。反応緩衝液における酵素の溶液が満たされた第2のプラテンを位置調整し、第1のチップの上に積み重ねる。積み重ね物を落射蛍光によって直ちに画像化して、蛍光強度における増大速度を流路位置の関数として測定する。低下した酵素速度を示すそのような穴を、薬剤リード化合物として更なる分析のために選択する。
吸収アッセイ
CaCo−2細胞の単細胞層を、貫通穴のアレイよりもわずかに大きい、コラーゲンにより被覆された2つの同一の異方性膜において増殖させる。CaCo−2細胞のインビトロでの増殖及び維持において使用される細胞培養条件、培地及び膜被覆物は、当業者によって広く知られている。細胞の均一な層が確立されると、各々の膜を、培養維持培地が浸漬負荷された貫通穴の2つの同一の貫通穴アレイの間に挟む。アレイ及び膜のアセンブリーを、CaCo−2細胞が貫通穴において平衡化し、無傷の層を形成することを可能にするためにさらに1日培養する。CaCo−2アレイと一緒に位置決めされた貫通穴を有する2つの追加のアレイに、小分子の化学的多様性ライブラリーを負荷する。CaCo−2細胞を通過しないことが知られている化合物(例えば、マンニトール)が、CaCo−2細胞単層の一体性を評価するための陰性対照として使用され、一方で、CaCo−2細胞単層を容易に拡散して通過することが知られている化合物が、陽性対照として使用される。化学的ライブラリーを含有するアレイの1つを、先端から基部への吸収を評価するために、CoCa−2細胞単層アレイの1つの先端側に積み重ね、一方で、第2の同一の化学的ライブラリーアレイを、基部から先端への吸収を評価するために、CoCa−2細胞単層アレイの基部側に設置する。完成したアレイを、ライブラリー化合物の輸送又は浸透を可能にするように1時間インキュベーションする。化学的ライブラリーの経口による生物学的利用能が、CaCo−2細胞単層を拡散して通過するライブラリー化合物の量を(例えば、質量分析によって)定量することによって評価される。
2−Dゲルからのブロッティングによるリガンドフィッシング
リガンドに対する親和性を示す細胞タンパク質を、2−Dゲルを使用して同定する。500,000個の貫通穴を有するプラテンを、ヒト上皮増殖因子受容体のセグメントを各々の貫通穴の内側に共有結合により連結するために誘導体化する。各々の穴に緩衝液を満たす。その後、ヒト細胞株の細胞抽出物を、プラテンのサイズと同様なサイズの2−Dゲルで分離し、その後、プラテンと位置調整する。その後、2−Dゲルにおけるタンパク質を、緩衝液をチップの上方に加え、チップを通過する液体を、チップをブロッターの上に置くことにより引き寄せることによってチップ上にブロットする。タンパク質をこのようしてチップから移し、上皮増殖因子受容体に対する親和性を有するタンパク質がチップに保持される。100mMのTris緩衝液(pH8)中の1Mのホルムアミドから構成される変性溶液を使用して、チップの内容物を質量分析法による分析のためにプラテンにブロットする。受容体に対して親和性を有するタンパク質を含有するそのような穴の場所、及びそのような穴に含有されるタンパク質の質量を使用して、結合性タンパク質の同定を決定する。これらのタンパク質は、ある特定のガン治療としてEGFのシグナル伝達経路を遮断する薬剤の標的である可能性がある。
抗体についてのスクリーニング
500,000成分のコンビナトリアルペプチドライブラリーを、ペプチドが穴における無菌の細胞培養培地に溶解されるように、500,000個の貫通穴を含むプラテンに調製する。ライブラリーを、各々の貫通穴に存在するペプチドの同定が既知であるように調製する。Enterococcus faecium細菌の薄い培養物を、各々の貫通穴が平均して10個の細菌を細胞培養培地に受けるように調製する。細菌プラテンをペプチドライブラリープラテンと共に積み重ねて、混合され、その後、30℃で5時間インキュベーションする。その後、積み重ねられたプラテンを光散乱測定によって画像化して、各々の貫通穴における細菌増殖の程度を測定する。
放射能標識によるキナーゼのペプチド標的を見出すこと
プロテインキナーゼであることが疑われるタンパク質を、単離する。このタンパク質を、100,000個の異なるタンパク質(全てが、貫通穴を有するプラテンにおいて特有の位置を占める)の存在下、放射能標識されたATP基質とインキュベーションする。十分な時間(例えば、約20分)のインキュベーションの後、貫通穴を含有するプラテンを水により洗浄し、放射能標識されたタンパク質の存在を、リン光体の画像化システムによって検出する。キナーゼについてのタンパク質標的を、このようにして同定する。
蛍光によるチトクロームP450阻害アッセイ
本実験の目的は、特定のCYP450酵素を阻害する化合物のライブラリーの可能性を調べることである。プロトコルは、Crespiらの「Anal. Biochem. 248:188-190, 1997」を適応する。蛍光分析用基質は、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19及びCYP2D6については3−シアノ−7−エトキシクマリンであり、CYP3A4についてはレゾルフィンベンジルエーテル(BzRes)である。これらの試薬を、Pharmazymeから得る。化合物ライブラリーを、各酵素のKmに等しい濃度でテストされるCYP450酵素の各々の1つのプラテンアレイデバイスに負荷する。適切な基質含有反応混合物を、第2のプラテンアレイデバイスに加え、酵素を第3のプラテンアレイデバイスに加える。これらのチップを積み重ねて、反応を開始させ、蛍光シグナルにおける増大を蛍光画像化によって連続してモニターする。P450阻害の相対的な速度を用いて、薬剤リード化合物を候補化合物ライブラリーから選択する。
ハイスループットタンパク質結晶化
溶媒におけるタンパク質を、貫通穴アレイに均一に負荷する。アレイの貫通穴を、塩の濃度及び相対的な存在量をランダムに変化させて、種々の塩を含有する溶液でランダムに満たす。酸性溶液及び塩基性溶液を続いて、pHを変化させて貫通穴に負荷する。温度勾配を、アレイデバイスに加え(又は、アレイを一定の温度で交互に保つことができ)、これにより、溶媒を所定の速度で蒸発させる。加えて、溶媒の分圧もまた、アレイが、蒸発速度を変化させるために置かれる容器において変化させることができる。タンパク質の結晶化が観測されるそのような貫通穴をX線又は電子のビームに曝し、回折パターンを分析のために記録する。1つの重要な利点が、結晶化をもたらす実験条件を迅速かつ効率的に見い出すことである。そのうえ、タンパク質の結晶を、貫通穴において直接に分析することができる。
貫通穴の高密度アレイにおけるウルトラハイスループット混合物の分離及びスクリーニング
多くの状況(例えば、薬理学的活性分子についての天然産物のスクリーニングなど)において、複雑な混合物を迅速かつ効率的に分離し、そしてタンパク質標的に対してスクリーニングする必要がある。本実験の目的は、蛍光発生基質に対して天然産物の複雑な混合物を貫通穴の高密度アレイにおいて分離し、そしてスクリーニングすることである。天然産物サンプルを、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)のための通常の様式で最初に調製する。液体がクロマトグラフィーカラムから溶離するとき、等体積のサンプルを得て、アレイの貫通穴に順次保管する。複製プレートを同時に作製することができる。その後、蛍光発生基質を、第2の貫通穴アレイに均一に負荷する。クロマトグラフィー分離が完了した後、アレイにおける各々のサンプルを、サンプルプレートを基質プレートの上に積み重ねることによって基質に曝す。アッセイされた分画物からの蛍光シグナルを光学的にモニターすることにより、アッセイされたプレート又は複製プレートの何れかからサンプルを、更なる評価のために選択する。
化学合成条件の最適化
1つ又はそれ以上のプロセスパラメーターを変化させ、そして1組の反応条件で合成された物質の量を記録することにより、化学合成を最適化する。変更されるプロセスパラメーターには、試薬のタイプ、試薬濃度、添加/混合の順序、温度及び時間が含まれる。
ファージ抗体ライブラリーの選抜(マルチチップ法)
貫通穴の高密度アレイにおける標的抗原に対するファージ抗体のライブラリーを、スクリーニングする。プロトコルは、「Winter, http://aximtl.imt.uni-marburg.de/〜rek/AEPStart.html」を適用する。
ファージ抗体の選抜(単一プレート法)
ファージディスプレー抗体のライブラリーを、貫通穴の1枚の10,000個の流路アレイを使用して、標的抗原に対してスクリーニングする。1枚のアレイにおける選抜を行うことによって、スクリーニングプロセスが簡略化されるが、ELISAアッセイでは、選択されたファージを、細菌に再感染させることができないので、ファージをそのDNAから再構築しなければならない。
タンパク質チップ
10万個のタンパク質結合プローブを、各々のプローブが特定のヒトタンパク質と高い親和性及び特異性により選択的に結合するように、Sheetsらの「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6157-6162, 1998」(これは、その全体が参考として組み込まれる)に記載される方法に従って、ファージディスプレー技術を用いて作製する。プローブを、異なるタンパク質結合プローブがその貫通穴の各々に存在するように、プラテンに移す。プラテンは、湿潤化及びタンパク質吸収を防止するためにテフロン(登録商標)表面を有する。
迅速な並行するサンプル分離及び精製のためのミクロHPLCカラムのアレイの構築
直線配置の12個の貫通穴のアレイを、物質のブロック(例えば、金属、セラミック又はプラスチック)において加工する。貫通穴は、直径が250μmであり、全長が20mmであり、中心間の間隔が9ミリメートルである。貫通穴のアレイの遠位端の内径は、標準的なナット・フェルール圧縮嵌合を使用して標準的な1/16”外径のHPLCチューブを受けられるように広げられ、ねじ切りされる。内径が50μmで、外径が1/16”のチューブの長さ2cmのものを、加工された圧縮嵌合によりアレイの貫通穴の各々にかみ合わせる。外径が、1/16”のステンレススチール製フリットを、貫通穴の内部に設置し、圧縮嵌合によりその位置に保持する。その後、クロマトグラフィー媒体をスラリーの形態でアレイの各々の貫通穴に詰める。クロマトグラフィー媒体が、ステンレススチール製フリットが遠位端に存在するために貫通穴内に固定化され、ミクロHPLCカラムが作製される。加圧された場合、サンプル、洗浄及び溶出緩衝液が、クロマトグラフィー媒体及びフリットを通って流れ、遠位端のかみ合った50μmの内径のチューブを通って貫通穴から溶出する。
マイクロキャピラリー流路での並列HPLCのための流体シール
図16に関連して、貫通穴のアレイを、物質のブロック(例えば、金属、セラミック又はプラスチック)において加工する。貫通穴は、直径が1mm未満であり、アスペクト比が10を越える。貫通穴は、O−リングのガスケットを受け入れるために面取りされる。シリンジ列を、貫通穴アレイと同じ中心間の間隔を伴って製造する。シリンジの針が、空気圧により作動されるバネ押しピンによって、シリンジ列ホルダーに取り付けられる金属ブロックを通過する。O−リングのガスケットを、ブロックを通って突き出るシリンジの針に付ける。シリンジに、流体を負荷し、キャピラリーチューブに挿入する。ピンを空気圧により作動させて、金属ブロックをキャピラリーチューブブロックの上部表面と接触させ、O−リングのガスケットを穴の面取り部内に、シリンジの針の周りで押しつける。これにより、漏れのないシールが、針とキャピラリー流路との間に作製され、従って、キャピラリー流路がシリンジによって加圧されることが可能になる(図17)。図18及び図19には、それらの図におけるシリンジ列が、容易な取り扱いのための堅牢な構造とするためにキャピラリーチューブアレイにボルト締めされることが示されることを除いて、同様な方法が例示される。
生体分子標的に対するリガンドを同定すること
本実験の目的は、生体分子標的(この場合にはタンパク質)に結合する、化学的、生化学的又は生物学的混合物におけるリガンドを同定するために、貫通穴アレイを使用して少ない体積のクロマトグラフィーを使用することである。2つの線状貫通穴アレイを、各々の貫通穴が、満たされる場合に50nlの液体を保持するように構築する。アレイの外側表面を、疎水性にするために処理し、また、内部を親水性にするために処理する。各々の貫通穴の間は、9mmの中心間の間隔であり、位置決め穴が、精密ジグにおけるピンを使用してアレイを積み重ねたときの貫通穴の位置調整及び同時位置決めを確実にするために含められる。シリンジの列が、50nlの標的タンパク質溶液を第1のアレイに分注し、そして50nlの異なる化合物ライブラリーを第2のアレイの各々の貫通穴に分注するために使用される。アレイを、精密ジグを使用して積み重ね、流体により、同時位置決めされた貫通穴位置の各々において混合することが可能となる。圧縮嵌合を有するシリンジの列は、1mlの溶出液を満たし、続いて、小さい気泡を満たし、その後、100nlのタンパク質ライブラリー反応混合物を引き込むのに使用する。反応混合物を、シリンジの先端に保持し、空気のすき間によって溶出液リザーバーから分離されたままにする。シリンジの先端を、サイズ排除カラムのアレイの開口部の中に入れ、圧縮嵌合を締めて、シールを確実にする。サンプルをカラムに分注し、続いて、溶出液を分注する。少なくとも1つのカラムから出るサンプルのUV吸光度をモニターすることによって、リガンドに結合するタンパク質が、何時カラムから出てくるかを、測定することができる。その場合、このタンパク質は、2つのカラムアレイをつなぐことによって逆相カラムのアレイに回収される。リガンドを逆相クロマトグラフィーによってタンパク質から除き、回収し、分析して、その同定を決定する。
ワックスでの被覆による貫通穴の保護
54℃の融点を有するパラフィンワックスを、その融点よりも高く加熱する。貫通穴アレイを、平均分子量が1500である溶融したポリ(エチレングリコール)ワックスの薄い層に沈める。貫通穴アレイ及びワックスを冷却して、ワックスを固まらせる。過剰なワックスを、鋭利な刃によりかき取り、その後、研磨することによって表面から除く。その後、ワックスが満たされたアレイを、キシレン中の1:20希釈された(トリデカフルオロ−1,1,2,2−テトラヒドロオクチル)−1−トリクロロシランの溶液からの蒸気に10秒間曝す。その後、被覆を、プラテンを110℃で30分間焼成(ワックスを融解させ、プラテンから滴下させながら)することによって硬化させる。ワックス残渣を、水で洗浄することによって流路内部から除くことができる。その後、プラテンを、硫酸/過酸化水素(2:1)で10秒間すすぎ、次いで水ですすいで、残渣を除き、そして流路内部の酸化を確実なものにする。得られた貫通穴アレイは、疎水性の外部と、親水性の内部とを有する。
ガラス繊維の貫通穴アレイ製造の光開始方法
Millipore(Bedford, MA)から入手可能であるようなガラス繊維フィルターの1シートを、重合可能な溶液(例えば、メチルメタクリレートモノマー及びベンゾインメチルエーテルのような光開始剤を含有する溶液)に浸し、2枚の石英プレート(各々が開放及び多孔性のままである部分を遮蔽するために使うドットのアレイを有している)の間に置く。モノマー溶液の重合を、フォトマスクを紫外線で照射することによって実施する。
貫通穴のアレイへのアッセイの適用
薬剤発見への取り組みにおいて使用される一般的なアッセイの1つが、チトクロームP450阻害アッセイである。P450酵素の活性を阻害する化合物は一般に、医薬品として望ましくない。そのような化合物は、深刻な副作用を引き起こす可能性を有し、そして他の医薬品との併用で好ましくない反応の可能性を有するからである。医薬品にするために潜在的な候補物である化合物をスクリーニングするのに使用される一般的なアッセイは、P450酵素を発現する細胞、細胞外又は組換えシステムで化合物をインキュベーションし、酵素の活性を候補化合物の存在下でアッセイすることである。そのようなアッセイは、貫通穴のアレイにおける大規模な並列様式での分析のために修正することができる。
タンパク質を貫通穴アレイの表面から洗浄すること
貫通穴アレイを、フルオロ−クロロ−アルカンの被覆をその表面に有するケイ素から調製し、そして穴の内部を親水性にする酸化液により処理する。アレイを水に浸けて−80℃に凍結し、フルオロポリマーFluoroPel(登録商標)(Cytonix Corp., Beltsville, MD)の溶液に素早く浸ける。アレイを、200℃で20分間焼成し、その後、10%のウシ胎児血清を含有する細胞培地に浸ける。貫通穴アレイを培地に浸けることにより、アレイの穴が満たされ、表面が湿らされる。その後、貫通穴アレイをペルフルオロオクタンに浸け、ゆっくり引き上げることによって、表面から、全ての水性培地が除かれる。
DNA配列決定
蛍光標識されたDNAフラグメントを、サンガー配列決定によって調製し、厚さが0.5mmのプラテンの2500個の貫通穴のアレイに配置する。その後、このプラテンを、ゲルを含有する、厚さが80mmである第2のプラテンの上に積み重ね、盛んに冷却されている電気泳動タンクの中に入れる。蛍光性オリゴが、カラムアレイから現れるとき、蛍光性オリゴは、スプールから巻きから解かれるニトロセルロース膜に結合する。コンピューターにより、(テープの形態で)ニトロセルロース膜が移動している間に、膜の動きが制御され、そして電場が止められる。その後、膜を移動させて、光源及びCCDカメラに曝し、貫通穴の各々について画像が分析され、溶出プロフィールが作製される。これにより、DNA配列の再構築が達成される。
多数の溝付きプレートを使用してプラテンを製造する方法
貫通穴を有するプラテンは、並行する溝を有するケイ素のプレートから製造することができる。図20を参照されたい。得られるアレイは、5000個の貫通穴を有しており、この場合、貫通穴は、各々の辺が0.25mmの長さを有するほぼ正方形であり、プラテンは約1mmの深さを有する。
ナノリットル体積の化合物ライブラリーの保存及びスクリーニング
化合物を、96ウエルプレートから貫通穴アレイに、下記にように再配置する。96ウエルプレートにおける化合物を、化合物がアッセイされる濃度の100倍に、例えば、アッセイで1uMの最終濃度については、100uMでDMSOに溶解する。96ウエルプレートの各々のウエルにおけるDMSOサンプル溶液の総体積は、10ulである。さらに90ulのエタノールを各々のウエルに混合し、サンプルを分注のために直ちにシリンジ列に引き込む。自動化されたシリンジ列では、60nlの体積が、96ウエルプレートと同じフットプリントを有する貫通穴アレイの各々の積み重ね物に分注される。このプロセスを、貫通穴アレイが実質的に一杯になるまで、新しい96ウエルプレートを用いて繰り返す。その後、アルコールを蒸発させ、これにより、約600plのDMSO溶解化合物の残渣を、各々の貫通穴アレイの各々の流路に残す。−80℃での乾燥下に所望の期間、化合物を保存した後、配列された化合物を含有する貫通穴アレイを取り出し、DMSOが凍結したままであるように10℃にし、10℃に冷却されているアッセイ水溶液を含有するビーカーの中に浸ける。貫通穴アレイを加湿環境のもとでビーカーから取り出すことにより、チップの貫通穴が水性媒体で満たされる。貫通穴アレイを周囲温度まで加温して、溶媒の混合を可能にする。第2の貫通穴アレイに、酵素及び蛍光発生基質を含有する新しく調製され、冷却されたアッセイ緩衝液を、均一に満たす(マトリックスメタロプロテアーゼアッセイの場合に)。2つのチップを積み重ね、周囲温度に加温し、30分間にわたっていくつかの時点で蛍光画像化することにより、酵素阻害についての一次スクリーニングがもたらされる。
細胞培養のための膜の選択
本発明は、これらに限定されないが、成体幹細胞、軟骨細胞、胚性幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、造血系細胞、筋肉細胞(心臓の心筋細胞を含む)、ニューロン、骨細胞を含む、真核細胞等の様々な細胞タイプの増殖のための方法を提供する。この方法の概略が、図25に示される。これらの細胞の増殖を容易にするための多孔性膜を、例示的な細胞タイプ(PKCb−GFP発現ベクターによりトランスフェクションされたHEK293細胞)の付着、生存、成長又は増殖を支えるその能力についてアッセイした(図26)。細胞を、アッセイされるインサートを含有する24ウエルプレート(BD−Biocoat24ウエル)のウエルに置床した。被覆されていないか、又はフィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンにより被覆された3μmの細孔のインサートを、0.2μmの細孔サイズの均一なキャピラリー細孔構造を有する酸化アルミニウムから製造された膜(ANOPORE組織培養インサート)(Nunc Inc.)と同じようにテストした。膜を200,000個の細胞と一晩インキュベーションした。このインキュベーションの後、ANOPORE膜は完全な集密度になった(図25)。ラミニンにより被覆された膜は約20%の集密度であった。他の膜は10%未満の集密度であった。75,000個/ウエルでAnoporeインサートに播種された細胞は、6日目に十分な集密度になるまで増殖し続けた(図27を参照されたい)。
細胞チップの構築方法
細胞チップ構築のために、anodisc膜(これは、ANOPOREインサートにおける膜である)を使用した。最初に、膜を、スライドガラスの上に置き、そして直径が150μmの細孔を有する、厚さが400μmのステンレススチール製プラテンを、膜の上に置いた。デバイスを、Cytospinスライドガラス遠心分離器のチャンバーに入れ、細胞をプラテンの上部に加えた。24時間のインキュベーションの後、プラテンを細胞培養培地で3回洗浄した。膜に接着している細胞が存在したが、細胞は丸くなり、anoporeインサートを使用する以前の実験で見られたようなしっかりした付着又は広がりは認められなかった。このインサートに関して、膜は、固体支持体の上に置かないで、プラテン内につり下げられた。これにより、膜が両方の表面で培地と接触するのを可能にした。
アレイスポッティング
化合物をテストするために、アレイスポッターと共に使用される細胞チップの潜在的可能性を評価するために、単一のピンによるスポッティングを特定化する(図29)。図30は、ヘキスト(Hoechst)色素を使用する金プラテンにおけるマイクロスポッティングを示す。図36は、細胞生存能を測定するためのC12レサズリンの、マイクロスポッティングを示す。C12レサズリンは、細胞の代謝を検討するために使用される検出剤である。C12レサズリンの還元生成物が、C12−レゾルフィンであり、これは、レサズリンの還元生成物に関連した強化された細胞保持及び検出を示す。代謝的活性な細胞は、C12レサズリンを、赤色の蛍光を発するC12−レゾルフィンに還元する。ヘキスト染色を、対比染色として含めた。プラテンに軽くスポットした後、細胞チップを、37℃、5%CO2で15分間インキュベーションした。チップを、蛍光顕微鏡を使用して調べた。スポットの領域における数個のウエルがヘキスト染色を示し、代謝的に活性な細胞を含有していた。この領域は、直径が約300uMであり、ピンの直径の約1.5倍であった(図29を参照されたい)。図36は、開放アレイ型の細胞チップ及び浮動ピンを使用するアレイ上の単一のウエルへのC12−レサズリンの送達を示す。
細胞のヘキスト染色
細胞をステンレススチールの細胞チップにおいて一晩インキュベーションし、その後、培地により洗浄した。ヘキスト色素を、ブロッティングによって乾燥された第1のプラテンにスポットした。テストされたステンレススチール製プラテン(National Jet Company, LaVale, M.D.)は1インチ平方であり、厚さが400μmであり、細孔は直径が150μmであった。第2のプラテンを、中心部を切り取った接着性のシール用フィルムを使用して第1のプラテンに取り付けた。チップを、プラテンとチャンバーの上部との間の小さいガスケットと共に、cytospinサンプルチャンバーに入れた。漏斗を使用しなかった。本実験の結果が、図32に示される。図33は、2つのステンレススチール製プラテンの間に挟まれたanopore膜を示す。PKCβ−GFP細胞を加え、一晩インキュベーションした。
[実施例28]
細胞マイクロアレイのプロトタイプを、厚さが200μmのタングステン製プラテンにおいて構築した。プラテン(National Jet Company, LaVale, M.D.)は、直径が300μmの細孔を有し、4つのネジにより取り付けられた。このプロトタイプが、図34に示される。酸化アルミニウムのAnopore膜を2つのタングステン製プラテンの間に挟んだ(図34に示されるように)。PKCβ−GFP細胞を加え、48時間インキュベーションした(図35)。本実験では、ランダムな細胞分布が観察され、細胞はよりしっかりと基質に付着していた。生体適合性を有する金属プラテンは、このような方法で使用することができる。生体適合性でない金属は、生体適合性のポリマー(PEG)又は金属で被覆することができる。
培養細胞の共焦点画像
図37は、5×105個/mLで加えられ、そして37℃にて5%CO2でインキュベーションされた、PKCβ−GFPトランスフェクション細胞を有する開放アレイ型細胞チップを示す。画像を共焦点顕微鏡によって取得した。図38は、プラテンが示されていないことを除いて、実質的に図37に示される図と同じである。
多孔性膜に結合することができる硬質の物質
硬質の物質(例えば、直径が10〜300μmの細孔を有する金属又はポリスチレンなど)のプラテンを、多孔性膜又は修飾されたガラス表面に取り付けて、多孔性の底部を有するマイクロウエルのアレイを形成する(図39)。細胞を加え、膜に一晩接着させる。続いて、1つ又はそれ以上のテスト化合物を、マイクロスポット用のピンを使用して加える。インキュベーション後、ハイコンテント画像分析を実施する。膜を処理して、タンパク質、mRNA発現を分析するか、又は目的の生物学的機能における変化を検出する。図40は、図39に示される個々のウエルの断面を示す。本発明は、図41に示されるように適合させることができる。図41は、個々のウエルを密封するための部材及び/又はガスケットに対しての、圧力を増大させるための構造的強化を示す。
10%のFSC及び0.22ug/mLのヒグロマイシンが補充されたDMEMを使用して、PKCb−GFP細胞を維持した。いくつかの実験では、10%のFCS及び100IU/mLのペニシリン、100ug/mLのストレプトマイシンが補充された、フェノールレッドを含まないDMEMを使用した。
ヒトPKCβIIのcDNA(GenBank受入番号X07109)を、逆転写されたヒト脾臓marathon−ready cDNA(Clontech)からPCRによって単離し、そしてヒグロマイシン耐性遺伝子を含有するpCDN3ベクター(Invitrogen)にサブクローンした。遺伝子を、緑色Xuorescentタンパク質(ZsGFP)(Clontech)をコードする配列の下流側に挿入した。GFP−PKCβIIを発現する安定的な細胞株を、pcDNA3/GFP−PKCβIIベクターをヒト胚性腎臓(HEK)293細胞(QBI, Montreal, Quebec, Canada)にトランスフェクションし、その後600μg/mlのヒグロマイシンBで選別することによって得た。薬剤耐性コロニーを選び、抗PKCβII抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を使用する免疫ブロティングによってPKCβIIタンパク質発現についてスクリーニングした。GFPの発現を、Xuorescence顕微鏡によって調べた。陽性クローンを、300μg/mlのヒグロマイシンBを含有する増殖培地において維持した。GFPタグ化PKC−βIIタンパク質でトランスフェクションされたHEK293細胞を、10%のFBS、グルタミン、抗生物質及びヒグロマイシンBを含有するDMEMにおいて37℃で維持した。Ilyinらの「Methods, 37:280-288, 2005」を参照されたい(これは、本明細書により参考として組み込まれる)。
BD−Biocoat膜由来の細胞培養インサートを、3uMの細孔サイズで得た(BD Biosciences, San Jose, CA)。インサートを、ラミニン、コラーゲン又はフィブロネクチンにより被覆した。0.2uMの細孔サイズの(Nunc)膜を有するAnoporeインサートもまたテストした。インサートを24ウエル培養プレートに設置した。細胞培養培地を、液面が膜に達するまで加えた。細胞を200uLの培地でインサートに加えた。プレートを、37℃にて5%CO2で一晩インキュベーションした。枠組みされたインサートを有していない膜を使用するその後の実験では、0.2又は0.1μmの細孔を有するanodics膜(Whatman, Clifton, N.J.)を使用した。
厚さが400μmのステンレススチール製シム(shims)を得て、50μmの間隔で離れた150uMの直径の穴の10×10プラテンを、ミクロ放電加工を使用して製造するためにNational Jet Company(LaVale, M.D.)に送った。各々のシムを、中心部にプラテンを有する約1インチ平方に切断した。
容量送達範囲が5〜15nLである、FP9の0.229mm直径の浮動チューブピン(V&P Scientific Inc., San Diego, CA)を全ての実験において使用した。スポット用溶液をエッペンドルフチューブ(eppendorf tube)で作製した。スポット用ピンを溶液に浸け、その後、プラテンに対して直交して軽く触れることによってプラテンにスポットした。
C12−レサズリン(分子プローブ)を、フェノールレッドを含まないDMEM(10%FCS)で希釈した。Hoechst33258(分子プローブ)を、スポット形成効率のための対照として含めた。溶液を、上記のように、細胞の上部においてプラテンにスポットした。細胞チャンバーを、37℃にて5%CO2で15分間インキュベーションした。インキュベーション後、チャンバーを、ヘキスト色素によるDNA染色について蛍光顕微鏡観察によって調べた。その後、この領域を、生細胞によるC12−レサズリンの赤色蛍光性のレゾルフィンへの変換について共焦点顕微鏡を使用して分析した(Abs/Em 563/587)。
前述の記載から、様々な変化及び修飾が、本明細書中に記載される発明を様々な使用法及び条件に適合させるように、実施できることは明らかであろう。そのような態様もまた、本発明の特許請求の範囲内である。
Claims (127)
- 第1のプラテンの貫通穴が第2のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように、当該プラテンが位置調整され、そして当該膜がこれら2つのプラテンの間に挟まれる、各々が複数の貫通穴を有する第1のプラテン及び第2のプラテン、並びに多孔性膜を含んでなる細胞チップ。
- 前記膜が、貫通穴の直径の半分以下である細孔を含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、約0.2〜250μmの細孔を含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、約0.2μm、0.5μm又は1.0μmの細孔を含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、直径が0.2μmである均一な構造の細孔を含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、酸化アルミニウムを含んでなる、請求項5に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、ポリカーボネートを含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記ポリカーボネートが、1μmの細孔を含んでなる、請求項7に記載の細胞チップ。
- 前記ポリカーボネートが、細胞接着を支えるフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又は別の基質で被覆される、請求項7に記載の細胞チップ。
- 前記プラテンが、金属を含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記金属が、金、タングステン又はステンレススチールである、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記プラテンが、ポリスチレンを含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記チップが、個々のウエルを密封するガスケットをさらに含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記ガスケットが、取り外し可能である、請求項9に記載の細胞チップ。
- 前記チップが、横方向の拡散を防止する疎水性化合物をさらに含む、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記膜と前記プラテンとの間の水密シールをもたらす疎水性化合物をさらに含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 一方のプラテンが柔軟な生体適合性物質を包含し、そして他方のプラテンが、前記柔軟なプラテンを支える堅いプラテンである、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記柔軟なプラテンが、シリコーン、ポリプロピレン又はゴムを含んでなる、請求項13に記載の細胞チップ。
- 前記2つのプラテンが、一方のプラテン上の凹んだ表面に嵌合する他方のプラテン上の盛り上がった表面によって取り付けられる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 細胞チップの全体の厚さが、約10mm以下である、請求項1に記載の細胞チップ。
- 細胞チップの全体の厚さが、約5mm以下である、請求項1に記載の細胞チップ。
- 細胞チップの全体の厚さが、約1mm以下である、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記第1のプラテンと接触している固体支持体をさらに含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- 前記固体支持体が、顕微鏡用スライドガラスである、請求項23に記載の細胞チップ。
- 前記第2のプラテンと接触しているカバースリップをさらに含んでなる、請求項24に記載の細胞チップ。
- 前記カバースリップ、顕微鏡用スライドガラス及び細胞チップが、一緒に固定される、請求項22に記載の細胞チップ。
- 上部から底部への順に、
(a)スペーサーと接触しているカバースリップ、
(b)カバースリップを第1のプラテンから隔てるスペーサー、
(c)複数の貫通穴を有する第1のプラテン、
(d)第1のプラテンと膜との間のシールをもたらす、複数の貫通穴を含むガスケット、
(e)ガスケットと第2のプラテンとの間に挟まれた、酸化アルミニウムを包含し、そして0.1μm〜1μmの細孔を有する多孔性膜、
(f)複数の貫通穴を有する第2のプラテン、
(g)第2のプラテンと接触している固体支持体
を含んでなる、細胞チップ。 - 様々な構成要素を一緒に保持する留め具をさらに含んでなる、請求項27に記載の細胞チップ。
- 前記膜が、直径が0.2μmである均一な構造の細孔を含んでなる、請求項27に記載の細胞チップ。
- 前記プラテンが、タングステン、金又はステンレススチールを含んでなる、請求項1に記載の細胞チップ。
- (a)細胞培養培地を包含している請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞チップを提供すること、
(b)多孔性膜を細胞と接触させること、そして
(c)細胞を、細胞生存のための好適な条件のもとでインキュベーションすること、
を含んでなる、細胞を細胞チップ上で培養する方法。 - 前記条件が、前記細胞チップをガス透過性液体と接触させることを含んでなる、請求項31に記載の方法。
- 前記ガス透過性液体が、ペルフルオロデカリンである、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞チップが、前記細胞培養培地と接触している疎水性流体をさらに含んでなる、請求項32に記載の方法。
- 前記疎水性流体が、ペルフルオロデカリン、シリコーンオイル又は鉱油である、請求項32に記載の方法。
- (a)複数の貫通穴を有する第1のプラテンに細胞培養培地を充填すること、
(b)第1のプラテンを多孔性膜と接触させること、
(c)膜を、貫通穴が実質的に位置が合うように、複数の貫通穴を有する第2のプラテンと接触させ、それにより、細胞チップを構築すること、
を含んでなる、請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞チップを構築する方法。 - 前記細胞チップが、前記第1のプラテンと接触している固体支持体をさらに含んでなる、請求項36に記載の方法。
- 前記細胞チップが、前記第2のプラテンと接触しているスペーサーをさらに包含し、前記スペーサーがカバースリップと接触している、請求項37に記載の方法。
- 前記細胞チップが、前記第1のプラテンとの間に挟まれたガスケットをさらに含んでなる、請求項36に記載の方法。
- 前記ガスケットが、柔軟な物質を含んでなる、請求項36に記載の方法。
- 前記ガスケットが、生体適合性エラストマーを含んでなる、請求項36に記載の方法。
- 前記エラストマーが、テフロン(登録商標)、シリコーン又はゴムである、請求項36に記載の方法。
- 前記充填することが、前記第1のプラテンを固体支持体の上に置き、プラテン及び固体支持体を遠心分離することによって達成される、請求項36に記載の方法。
- 前記第1のプラテンを、ガスケットに接触させ、次いで細胞培地で前記プラテンを覆う、請求項36に記載の方法。
- (a)細胞を包含する請求項1〜30のいずれか一項に記載の細胞チップを、薬剤を包含するプラテンと接触させること、
(b)細胞を薬剤と接触させること、そして
(c)細胞における変化を検出し、それにより、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定すること。
を含んでなる、所望の生物学的活性を有する薬剤を同定するための方法。 - 前記薬剤を細胞増殖培地に存在させるか、又は溝付きピン若しくはシリンジを使用して薬剤を細胞と接触させるか、又は細胞を薬剤を包含するウエルに加えることによって細胞と接触させる、請求項45に記載の方法。
- 前記薬剤が、ポリペプチド、核酸分子又は小さい化合物である、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸分子が、siRNA、ミクロRNA又はアプタマーである、請求項45に記載の方法。
- 前記変化が、遺伝子発現、ポリペプチド発現、細胞成長、細胞増殖又は細胞生存における変化、細胞成分の細胞内局在化における変化、形態学的変化、又は運動性における変化である、請求項45に記載の方法。
- 前記変化が、免疫アッセイ、酵素アッセイ、ハイスループット遺伝子発現プロファイリング、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、定量的PCR、リアルタイムPCR、メチル化、又は定量的蛍光顕微鏡観察及び自動化された画像収集を用いるハイコンテントスクリーニング(HCS)で検出される、請求項44に記載の方法。
- 前記ハイコンテントスクリーニングにより、タンパク質移行の変化が検出される、請求項44に記載の方法。
- 前記細胞を溶解して、タンパク質又は核酸分子を結合性表面に結合させる、請求項44に記載の方法。
- 前記結合性表面が、弱カチオン交換媒体である、請求項51に記載の方法。
- 前記結合したタンパク質又は核酸分子が、配列、分子量、結合特性及び発現レベルからなる群より選択される特性について分析される、請求項50に記載の方法。
- 前記結合特性が、免疫アッセイで、又はポリペプチドの結合によって検出される、請求項50に記載の方法。
- a)上部表面及び下部表面を有する複数のプレートを提供すること(ここにおける前記複数のプレートの少なくともいくつかの上部表面及び下部表面の一方又は両方が、前記表面の長さにわたる連続する実質的に平行な溝を有する)、
b)前記複数のプレートの1つを除く全ての上部表面をそれ以外のプレートの下部表面に結合すること、そして
c)所望の厚さを達成するために必要ならば、プラテンを貫通穴に対して実質的に直交して薄切りにし、それにより、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを得ること、
を含んでなる、複数の貫通穴を有する所望の厚さのプラテンを作製する方法。 - 複数のプラテンを作製するために、工程c)を繰り返すことをさらに含んでなる、請求項56に記載の方法。
- 前記プレートが、1つのプレートの溝がそれ以外のプレートの各々の溝に対して実質的に平行である形態で結合される、請求項56に記載の方法。
- 複数の貫通穴(ここにおける貫通穴の少なくともいくつかが、プローブ、細胞又は溶媒の固定化のための多孔性物質を含有する)を有するプラテンを含んでなる、プローブ、細胞又は溶媒を固定化するためのデバイス。
- (a)プレートを、両親媒性分子と反応する物質により被覆すること、
(b)貫通穴を形成すること、そして
(c)プレートを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を、貫通穴の壁ではなく、プラテンの表面に有するプラテンを提供すること、
を含んでなる、疎水性の対置する表面と、複数の親水性貫通穴を有するプラテンを作製する方法。 - 請求項60に記載の方法によって、作製されるプラテン。
- (a)存在するならば、残留する疎水性被覆を除くこと、そして
(b)プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生すること、
を含んでなる、請求項61に記載のプラテンの使用後に、疎水性被覆を再生する方法。 - (a)プラテンの表面を、両親媒性分子と反応する物質で選択的に被覆すること、そして
(b)プラテンを両親媒性分子の溶液又は蒸気で処理して、疎水性被覆を再生すること、
を含んでなる、複数の貫通穴を有するプラテンの表面における被覆を選択的に作製する方法。 - プラテンは、2つの対置する表面及びこれらの表面間に伸びる複数の貫通穴を有しており、この貫通穴の壁及び前記表面がそれぞれ独立して機能するように、壁及び表面が異なる化学的特性を有するデバイス。
- a)複数のキャピラリーを、貫通穴を有する少なくとも2つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れること、
b)隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離だけ隔てること、
c)プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入すること、
d)プラスチック体を形成すること、そして
e)プラテンとプラスチック体との境界で薄切りにして、チップを形成すること、
を含んでなる、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックプラテンを作製する方法。 - a)複数の繊維又はワイヤを、貫通穴を有する少なくとも2つのプラテンを包含するプラテン積み重ね物の貫通穴に入れること、
b)隣接するプラテンを、所望の厚さと等しい距離で隔てること、
c)プラスチック形成物質を、隔てられているプラテンの間の空間に注入すること、
d)プラスチック体を形成すること、
e)繊維又はワイヤをプラスチック体から引き抜いて、貫通穴を形成すること、そして
f)プラテンとプラスチック体との境界で薄切りにして、チップを形成すること、
を含んでなる、貫通穴を有する所望の厚さのプラスチックプラテンを作製する方法。 - a)複数の貫通穴及び2つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
b)マスクをプラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、貫通穴の少なくともいくつかを塞ぎ、その一方で、他の貫通穴を開いたままにすること、
c)プラテンの表面を試薬に曝し、試薬が開いている貫通穴の少なくとも1つに入るようにすること、そして
d)工程b)及び工程c)を、少なくとも1つの異なるマスク及び少なくとも1つの異なる試薬を用いて繰り返し、化学的アレイを作製すること、
を含んでなる、化学的アレイを作製する方法。 - 前記マスクが、ポリマー、エラストマー、紙、ガラス又は半導体物質から作製される、請求項67に記載の方法。
- 前記マスクが、機械的バルブ、ピンアレイ又はガスジェットを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記適用する工程により、前記マスクと前記プラテンとの間に気密シールが形成される、請求項67に記載の方法。
- 前記試薬が、液体、気体、固体、粉末、ゲル、溶液、懸濁物、細胞培養物、ウイルス調製物又は電磁放射線である、請求項67に記載の方法。
- 前記マスクを、異なる貫通穴を露出させるために平行移動させる、請求項67に記載の方法。
- 前記マスクが、マスクのピン及び穴の位置合わせが、前記プラテンの貫通穴に見当をつけるように共通の位置合わせ用ピン及び穴を有する、請求項67に記載の方法。
- 前記マスクが、柔軟な物質を含んでなる、請求項67に記載の方法。
- 多数のマスクが、柔軟なテープの一部であり、前記多数のマスクが、テープを進めることによってプラテンの貫通穴と位置合わせされる、請求項74に記載の方法。
- 請求項67に記載の方法によって作製されるアレイ。
- a)複数の貫通穴と、2つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
b)1つ又は複数の試薬をその表面に有するマスクを、プラテンの一方の表面又は両方の表面に適用して、試薬をマスクから貫通穴の少なくともいくつかに移すこと、そして
c)工程b)を、少なくとも1つの異なるマスク及び少なくとも1つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを作製すること、
を含んでなる、化学的アレイを作製する方法。 - a)複数の貫通穴と、2つの対置する表面を有するプラテンを提供すること、
b)プラテンを、試薬を含有する電気泳動装置の中に置き、貫通穴に対して平行する電場を加えることによって、荷電された試薬を貫通穴の少なくともいくつかに電気泳動により輸送すること、そして
c)工程b)を、少なくとも1つの異なる試薬を用いて繰り返して、化学的アレイを作製すること
を含んでなる、プラテンの化学的アレイの内部で、サンプルを分離するための方法。 - a)空間的にアドレス指定可能な複数の別個の貫通穴(各々の貫通穴が内壁を有している)を有するプラテンであって、対置する疎水性表面を有するプラテンを提供すること、そして
b)少なくとも1つの試薬又はプローブを、貫通穴の少なくともいくつかの内壁に、又は貫通穴の少なくとも1つの中に含有されるビーズに、共有結合的又は非共有結合的に固定化して、空間的にアドレス指定可能なアレイを形成すること、
を含んでなる、空間的にアドレス指定可能なアレイを作製する方法。 - 前記貫通穴が、通じていない貫通穴である、請求項79に記載の方法。
- 前記貫通穴が、選択的に通じている貫通穴である、請求項79に記載の方法。
- c)試薬を、貫通穴の所定のサブセットに入れるか、又は貫通穴の所定のサブセットを通過させること、
をさらに含んでなる、請求項79に記載の方法。 - a)複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、そして
b)複数の試薬の各々を、ランダム様式又は準ランダム様式で貫通穴に適用して、確率論的アレイを作製すること、
を含んでなる、確率論的アレイを作製する方法。 - 前記適用する工程が、貫通穴の少なくともいくつかをアドレス指定する複数の分注デバイスを提供すること、試薬溶液の異なる組合せを各々の貫通穴に分注すること、そして貫通穴の異なるセットをアドレス指定するように分注デバイスを少なくも1回は再配置することを含んでなる、請求項83に記載の方法。
- 前記試薬溶液と混和しない流体を、少なくとも1つの貫通穴に分注することをさらに含んでなる、請求項29に記載の方法。
- a)確率論的アレイを、請求項83に記載の方法を用いて作製すること、
b)確率論的アレイを、目的の特性を有する組合せ物でアッセイすること、そして
c)目的の特性を有する試薬を同定すること
を含んでなる、目的の生物学的、化学的又は物理的特性を有する試薬の組合せを同定するための方法。 - a)プラテンを、貫通穴に負荷するサンプルを包含する液体サンプルの中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷すること、そして
b)プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体に通し、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除くこと、
を含んでなる、対置する表面を有して、複数の貫通穴を有するプラテンに負荷する方法。 - a)プラテンを、貫通穴に負荷するサンプルを包含する液体サンプルの中に浸け、それにより貫通穴の少なくともいくつかにサンプルを負荷すること、そして
b)プラテンを、プラテンの表面に対する親和性を有し、しかし、液体サンプルと混和しない液体と接触させ、それによりプラテンの表面から過剰なサンプル混合物を除くこと、
を含んでなる、対置する表面を有して、複数の貫通穴を有するプラテンに負荷する方法。 - a)好気性生物を、プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに負荷すること、そして
b)プラテンを、ガス透過性液体の中に沈めること、
を含んでなる、好気性生物の生存能を、複数の貫通穴を有するプラテンにおいて維持する方法。 - 前記生物が流体中に存在し、そして前記ガス透過性液体が前記流体と混和しない、請求項89に記載の方法。
- 前記好気性生物の1つ又はそれ以上の物理的特性を、アッセイすることをさらに含んでなる、請求項89に記載の方法。
- 前記好気性生物が、細胞である、請求項89に記載の方法。
- 前記ガス透過性液体が、フルオロカーボン、シリコーンポリマー又は単分子層である、請求項89に記載の方法。
- a)複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
b)貫通穴の一部又は全てに、1つ又はそれ以上の不揮発性サンプルを任意に負荷すること、
c)プラテンの貫通穴の少なくともいくつかに、1つ又はそれ以上の揮発性サンプルを負荷して、各々の貫通穴におけるサンプルが同じ貫通穴において他のサンプルと混合することを可能にすること、そして
d)プラテンを、揮発性サンプルと混和しない液体に沈めること、
を含んでなり、工程b)、工程c)及び工程d)を任意の順序で行うことができる、
揮発性サンプルを他のサンプルと混合する方法。 - 前記混合されるサンプルが、2つの別個のプラテンにおいて最初に提供され、これらが、混合できるように前記非混和性液体に沈めて接触させられる、請求項94に記載の方法。
- 工程c)及び工程d)が逆の順序で行われる、請求項94に記載の方法。
- 前記非混和性液体が、フルオロカーボン、シリコーンポリマー、鉱油又はアルカンである、請求項94に記載の方法。
- a)複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること(ここにおける貫通穴の少なくともいくつかには、第1のサンプル又は第1のサンプルセットが負荷される)、
b)第2のサンプル又は第2のサンプルセットのアレイを包含する実質的に平坦な表面を提供すること(ここにおいて、平坦な表面における第2のサンプル又は第2のサンプルセットは、プラテンにおけるサンプルと位置合わせすることができる)、
c)プラテンを、平坦な表面における第2のサンプル又は第2のサンプルセットのアレイと位置合わせすること、そして
d)プラテンを平坦な表面と接触させること(ここにおいて、プラテンのサンプルは平坦な表面におけるサンプルと位置調整される)、
を含んでなる、サンプルのアレイを混合する方法。 - 第1のサンプル又は第1のサンプルセットが、1つ又はそれ以上のプローブを含む、請求項98に記載の方法。
- 第2のサンプル又は第2のサンプルセットが、1つ又はそれ以上のプローブを含む、請求項98に記載の方法。
- プラテンに含有されるサンプルの物理的特性を分析することをさらに含んでなる、請求項98に記載の方法。
- 前記平坦な表面が、プラテンのアレイのパターンと一致する疎水性パターンを含む、請求項98に記載の方法。
- a)プラテンを容器の上に置くこと、
b)気体、液体又は固体の一吹き、又はピンを、前記特定の貫通穴に加えて、前記試薬又はプローブを容器の中に移すこと
を含んでなる、試薬又はプローブを、複数の貫通穴を有するプラテンの特定の貫通穴から容器に移すための方法。 - 気体、液体又は固体の一吹きが、シリンジにより生じる、請求項103に記載の方法。
- 光力学的又は光熱的物質を貫通穴内又は貫通穴の上方に置き、その後、光力学的又は光熱的物質を、光力学的又は光熱的物質を活性化するのに好適な振動数及び強度のレーザービームに曝すことにより、前記の気体の一吹きが生じる、請求項103に記載の方法。
- a)プラテンを収容するのに適合したホルダー、
b)サンプルを前記プラテンの単一の貫通穴に注入するための、好適なサイズの開口度を有するノズル、及び
c)前記ノズルを通過するサンプルの流れを制御するバルブ
を含んでなり、
前記ホルダー及びノズルが互いに移動することができる、複数の貫通穴を有するプラテンの貫通穴に充填するか、又は貫通穴から排出するためのデバイス。 - 前記ノズルが、前記プラテンと接触するように配置される、請求項106に記載のデバイス。
- サンプルを前記プラテンから受け取るために配置されたマイクロプレートをさらに含んでなる、請求項106に記載のデバイス。
- 前記バルブを制御し、そして前記ホルダー及びノズルの位置を互いに制御するコンピューターをさらに含んでなる、請求項106に記載のデバイス。
- 前記バルブを制御し、そして前記マイクロプレート及びホルダーの位置を互いに制御するコンピューターをさらに含んでなる、請求項108に記載のデバイス。
- 前記マイクロプレート、ホルダー及びノズルを、少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる、請求項108に記載の方法。
- 前記ノズルが、単一の位置で保持され、そして前記ホルダー及びノズルを少なくとも二次元において互いにそれぞれ独立して移動させることができる、請求項106に記載の方法。
- a)貫通穴に第1のサンプル又は第1のサンプルセットが負荷される、複数の貫通穴を有する第1のプラテンを提供すること、
b)プラテンを検出デバイスに導入すること、
c)貫通穴にサンプル又は試薬が負荷される、複数の貫通穴を有する第2のプラテンを検出デバイスに導入すること、
d)前記第1のプラテンの貫通穴の内容物が、前記第2のプラテンの対応する貫通穴の内容物と混合し得るように、プラテンを位置合わせし、接触させること、そして
e)貫通穴の少なくともいくつかの内容物の物理的特性における変化を、経時的に検出すること、
を含んでなる、プラテンの貫通穴の少なくとも1つにおいて生じる1つ又はそれ以上の反応速度を分析する方法。 - a)貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
b)プラテンを2つの半透明ミラーの間に置くこと、
c)サンプルに、前記ミラーの1つを介して光を当てること、そして
d)サンプルからの光学的出力を検出すること、
を含んでなる、アレイにおけるサンプルの物理的特性を分析する方法。 - 当該画像化工程が、前記アレイから生じる光を測定することを含む、請求項114に記載の方法。
- 前記プラテンがレーザー空洞内にあり、そして光学的利得媒体が前記2つのミラーの間に配置される、請求項114に記載の方法。
- 当該画像化工程が、照射光源の対面にあるミラーから放射された光を測定することを含んでなる、請求項114に記載の方法。
- a)貫通穴がサンプルで負荷される、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
b)サンプルをキャピラリーのアレイの中に導入すること、
c)サンプルを、不連続な流れを生じさせるパルス圧力を用いて、キャピラリーを通して溶出すること、
d)溶出するサンプルを、キャピラリーに対して移動している表面にスポットすること(ただし、スポットは離れており、サンプル間の混合が生じない)、そして
e)スポットの物理的特性を分析すること、
を含んでなる、アレイからのサンプル出力を測定する方法。 - a)複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
b)貫通穴に、2つの溶媒(第1の溶媒が低い蒸気圧を有し、第2の溶媒がそれよりも高い蒸気圧を有する)を包含する混合物に溶解された前記サンプルを負荷すること、そして
c)第2の溶媒を蒸発させて、第1の溶媒における複数のサンプルを得ること、
を含んでなる、複数のサンプルを、アッセイが直ちに可能な、高密度形式で保存する方法。 - 各々の溶液における前記第1の溶媒の体積が、約25nl以下である、請求項119に記載の方法。
- a)貫通穴の少なくともいくつかが低い蒸気圧を有する溶媒に溶解されたサンプルを含有する、複数の貫通穴を有するプラテンを提供すること、
b)プラテンを、溶解されたサンプルを凍結させるために十分な温度に冷却すること、
c)プラテンを、試薬を含む溶液の中に浸けること(この場合、溶液の温度はサンプルの凝固点よりも低く、しかし、試薬溶液の凝固点よりも高い)、
d)プラテンを試薬溶液から取り出すこと、そして
e)プラテンを、サンプルの凝固点よりも高い温度に加温すること、
を含んでなる、ハイスループットアッセイを形成する方法。 - a)複数の貫通穴を有するプラテンを、提供すること、
b)貫通穴に、2つの溶媒(第1の溶媒が低い蒸気圧を有し、第2の溶媒がそれよりも高い蒸気圧を有する)を含む混合物に溶解されたサンプルを負荷すること、そして
c)第1の溶媒を蒸発させること、
を含んでなる、請求項121に記載の方法。 - 前記試薬溶液が、水溶液である、請求項121に記載の方法。
- 第1のプラテンの貫通穴が第2のプラテンの貫通穴と実質的に位置が合うように、これらのプラテンが位置調整され、そして膜がこれらの2つのプラテンの間に挟まれる、複数の貫通穴を各々有する第1のプラテン及び第2のプラテン、並びに半透過性膜を包含するろ過デバイス。
- 前記半透過性膜が、ニトロセルロース膜である、請求項124に記載の方法。
- 前記半透過性膜が、細胞の層を含む、請求項124に記載の方法。
- 前記プラテンが、疎水性表面を有する、請求項124に記載の方法。
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