CN105603361A - 高通量生物薄膜的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量生物薄膜的制备方法,包括以下制备步骤:准备自相似掩膜,根据制备目的,设置基片与所述第一掩膜的相对位置;通过转动所述第一掩膜,在所述基片的四个象限上分别沉积四种不同的沉积组分;引用其他掩膜,重复上述沉积步骤,不同的沉积组分可以选择性地沉积于所述基片的固定位置;上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜;将所有生物薄膜进行退火处理,从而制得高通量生物薄膜,该薄膜可用于生物医疗领域,具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物薄膜,特别涉及一种高通量生物薄膜的制备方法和应用。
背景技术
生物多样性是生物及其与环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和,包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以及它们与其生存环境形成的复杂的生态系统,是生命系统的基本特征。生命系统包括多个层次或水平:基因、细胞、组织、器官、种群、物种等。每一个层次都存在多样性,研究较多的主要有基因多样性(或遗传多样性)、物种多样性和生态系统多样性。全世界大概有1300万至1400万个物种,但是经过科学描叙的仅约175万种,对于已有记录的175万个物种,有许多都不是很清楚,因为物种的多样性带来了产物的多样性和生物功能的多样性,相互结合又会产生更多的多样性,简单的筛选方法只能一一进行,不能高效大量的检出,又因为生物特殊性,常规的高通量方法也不能广泛适用,因此,对于大量的生物功能人类无法利用,现仅有微生物被广泛用于生产抗生素,为人类造福。
另,随着人类基因组和众多的致病菌的基因组全序列的测序完成和公开,探求感染疾病发生的分子基础成为可能。只有真正了解疾病的发生分子机制,也就是病原体和人体相互作用的分子过程,临床医生才可能对该疾病进行准确的诊断、治疗和防治。但是疾病产生的原因错综复杂,基因库也是一个庞大的数据库,只有通过高通量筛选方法才能有效地研究病原体和人体相互作用的分子过程,才能快速鉴定感染致病的病原体,探求感染疾病的病理基础。
因此,现有的根据经验和直觉,一次一个组分或少量的多个组分进行筛选和检测的方法由于周期长、成本高,已经难以满足社会高速发展的需求,很多目标物都跟多种因素相关,需要同时结合多个因素和多个样本进行研究检测,这是一个庞大的数据库,检测库的建立是基础。然而,由于生物的特殊性,生物库的建立与其他库的建立不能随便通用,所以需另外特别研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量生物薄膜的制备方法和应用,以解决现有的高通量方法在生物领域、医学领域不能广泛有效应用的弊端。
为了实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
高通量生物薄膜的制备方法,包括以下制备步骤:
准备四个自相似掩膜,分别为第一掩膜、第二掩膜、第三掩膜和第四掩膜;
根据制备目的,准备沉积组分;
准备用于沉积的基片;
根据制备目的,设置基片与所述第一掩膜的相对位置;
通过转动所述第一掩膜,在所述基片的四个象限上分别沉积四种不同的沉积组分;
引入所述第二掩膜,以上述相同的沉积方法在所述基片的四个象限的左上角添加一种新的沉积组分;
使用第三掩膜和第四掩膜重复上述沉积步骤,不同的沉积组分可以选择性地沉积于所述基片的固定位置;
上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜;
将所有生物薄膜进行退火处理;
其中,所述沉积组分可以通过脉冲激光溅射沉积法或旋转涂布法沉积于设有掩膜的所述基片上。
上述制备方法与传统的每次只合成、表征一种物质的策略不同,其采用并行合成、高通量表征的组合方法,在短时间内通过有限的步骤操作,快速合成大量不同的样品,形成样品库。具体地,其采用掩膜的方式,通过排列组合可以将不同的沉积组分沉积在不同的位置,最终形成大量的数据库,而且其不需要在特殊的环境下操作,适用于能形成薄膜的任一物质,可以被广泛应用。在实践操作中,需要首先确定沉积组分。根据检测目的,设置不同因子的沉积组分一一沉积,形成囊括各个因子变量的一个数据库,再利用合适的表征方式,将待测物质或目的物质从已经建立的数据库中筛选出来,例如核酸杂交、荧光标记等方法。大量数据库的建立可利用计算机技术,计算机技术的高速发展使得该方法可以同时进行、高效实施。
以及,上述高通量生物薄膜在生物、医学领域上对疾病病理和生物功能的检测应用。这样大大提高了高通量生物筛选方法的使用范围,也有利于促进医学材料的选择和疾病治疗的速度。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明,附图中:
图1为高通量生物薄膜的制备方法步骤简图;
图2为高通量生物薄膜的制备过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例与附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种高通量生物薄膜的制备方法,包括以下制备步骤:
S01、准备四个自相似掩膜,分别为第一掩膜、第二掩膜、第三掩膜和第四掩膜。
S02、根据制备目的,准备沉积组分,准备用于沉积的基片。
S03、根据制备目的,设置基片与所述第一掩膜的相对位置;通过转动所述第一掩膜,在所述基片的四个象限上分别沉积四种不同的沉积组分。
S04、引入所述第二掩膜,以上述相同的沉积方法在所述基片的四个象限的左上角添加一种新的沉积组分。
S05、使用第三掩膜和第四掩膜重复上述沉积步骤,不同的沉积组分可以选择性地沉积于所述基片的固定位置;上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜。
S06、将所有生物薄膜进行退火处理。
具体地,在S01步骤中,根据所需的样品数量设置掩膜形式,例如掩膜孔的数量、形状等,掩膜的材质为本领域技术人员公知的材质。设置四个掩膜是因为可以满足普遍样品需求,当然你也可以设置四个以上的掩膜,进行更复杂更大样品数据库的建立,操作原理也是一样的。
在S02步骤中,用于沉积的基片可以自由选择现有的基片,例如单晶硅、石英等。沉积组分的确定根据制备目的而定,可以为有机物,例如氨基酸、肽、蛋白质、酶等,优选具有生物活性,可以用于作为检测试纸的物质。也可以为生物分子,例如荧光分子、核酸和其他的抗原抗体分子等,进行分子层面的制膜,适于检测。还可以是无机盐,例如身体所需的各种微量元素:钙、钾、镁等。微量元素是人体重要的微营养素,具有重要的生理生化功能,多种地方病以及疑难病的发生发展均与微量元素失衡有关。具体举例而言,例如NO作为一种重要的生物信使分子,在生理和病理过程中发挥着重要的作用,它在人体内广泛参与神经传递、血管舒张、炎症的发生、免疫反应和记忆形成及表达,因此检测体内存在的NO量具有重要的意义,可据此通过荧光分子沉积标记,制备正常人、心脑血管病患者、糖尿病患者等血样样品数据库,其中涉及多个部位、不同含量数值等,数据库建立后,通过血液、尿液等NO检测达到快速确定病源病症的目的。再例如建立确定疾病DNA基因库,在待检测的样品上制造出荧光标记的核酸分子,让其与DNA基因库的核酸分子杂交,分析样品中mRNA或DNA的相对量的变化,从而全面检测疾病发生的各种可能的分子机制,提供尽可能客观的实验检测结果。
在S03—S05步骤中,设置掩膜与基片的相对位置,可以确定沉积的位置。对于四个自相似掩膜,可以先用第一掩膜从基片四个象限的其中一个象限开始沉积,即,其他三个象限需要遮蔽,仅露出其中一个象限的基片位置,然后沉积完一层后再旋转至另一个象限沉积,如此继续操作,可以最初在四个象限上沉积所需的沉积组分,再换用第二掩膜,进行第二层的沉积......如此重复操作,最终至所有沉积组分沉积在不同的部位,形成多个生物薄膜。具体地,参见图1,首先用第一掩膜覆盖在基片上沉积组分A1,然后转动掩膜沉积组分A2,....,到组分A4沉积完毕时就完成了一层的沉积,得到含有4个不同材料样品的材料库。接着,换用第二掩膜,以相同的方法沉积B1、B2、B3、B4,得到含有16个不同材料样品的材料库,这样每4步完成一层薄膜的沉积,相应的样品数增加4倍,一般条件下,在1英寸见方的基片上,用16步完成4层薄膜的沉积,可以获得256个样品,用20步完成5层薄膜的沉积,可以获得1024个薄膜(例如AnBmCiDkEj(其中,n、m、i、k、j=1,2,3,4),以此类推。这样,上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜。
其中,上述沉积组分可以通过脉冲激光溅射沉积法或旋转涂布法沉积于设有掩膜的所述基片上,沉积环境优选为真空环境,这样有利于减少杂质,促进优质薄膜的形成。具体地,若沉积组分为容易气化的固态物质,则可以选择脉冲激光溅射沉积法,若沉积组分为液态,则可以选择旋转涂布法制膜,这个可以根据沉积组分的性质和形态灵活选择。
脉冲激光溅射沉积法是将脉冲激光器所产生的高功率脉冲激光聚焦作用于靶材的表面,使靶材表面产生高温及烧蚀,并进一步产生高温高压等离子体,这种等离子体定向局域膨胀,在基片上形成薄膜,在这过程中,它不仅有固态靶材上高能脉冲激光辐射与材料相互作用的物理过程,而且还包含了高能粒子簇等离子体羽辉的形成及羽辉与被加热的基片表面接触时被烧蚀物质的转移。这种沉积方式易于在较低温度下原位生长取向一致的薄膜,而且可以灵活换靶,便于实现多层膜的生长。参见图2,本发明实施例将脉冲激光溅射沉积法与掩膜配合使用,可以完成高通量薄膜的制备。
旋转涂布法中,将准备好的涂布液置于高速旋转的涂布机基片上,旋转所得纳米级薄膜。在本发明实施例中,旋转速度一般为1r/s-100r/s,优选30r/s-70r/s,例如45r/s、50r/s、40-60r/s等。
在S06步骤中,刚沉积完的薄膜是分层的,先要在中低温下进行长期退火处理,以促进组分之间的充分扩散,防止组分蒸发和亚稳相形成,因此退火温度的设定影响着薄膜的性能。
相应地,本发明实施例还提供了上述高通量生物薄膜在生物、医学领域上对疾病病理和生物功能的检测应用,可以将人体的血液、尿液等作为待检物进行检测,这样极大地促进了医学诊断、基因检测技术的发展,对人类健康具有重大的意义。
现以具体高通量生物薄膜的制备和应用为例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
结核分枝杆菌是结核病的病原体,并随着菌株的发展,出现了不同的突变体,导致结核病至今仍是公共卫生的重大威胁。在此,我们可以依据主要病原体基因建立高通量生物薄膜数据库,从而加快结核病症的检测和分析,具体如下:
1、利用中性罗氏培养基培养100个菌株;
2、将100个菌株中各挑一个菌落分别加入提取液的管中快速震荡5min,再置于90℃水浴锅中,加热6min,5500r/min离心2min,从而提取获得各个菌落的相关DNA。
3、结核分枝杆菌的变异种主要与katG及inhA基因突变有关,通过提取的DNA制取获得未突变的基因片段,并制取含有突变点的基因片段。主要包括基因katG(AGC)、katG(AGC→ACC)、katG(AGC→AAC)、inhA-15(C)、inhA-15(C→T)。
4、通过PCR扩增试剂和基因扩增仪对选取的基因进行扩增处理。
5、结核病由结核分枝杆菌和/或杆菌变异种触发,对上述扩增片段进行单独处理和排列组合,加入缓冲溶液,形成单独的基因片段或多个杂交混合物,分别为A1、A2.....B1、B2.....,选用旋转涂布法制膜,转速为5r/s。
首先用第一掩膜覆盖在基片上沉积组分A1,然后转动掩膜沉积组分A2,....,到组分A4沉积完毕时就完成了一层的沉积,得到含有4个不同材料样品的材料库。接着,换用第二掩膜,以相同的方法沉积B1、B2、B3、B4,得到含有16个不同材料样品的材料库,上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜。
可以由此获得单层、双层、多层生物薄膜,形成数据库。
6、将待测人的痰液进行处理,提取DNA进行检测,通过数据库读取,知悉是否患病,发病病原体特征和类型,从而对症下药。
实施例2
慢性肾炎是各种病因引起的不同疾病类型的双侧肾小球弥漫性或局灶性炎症改变。微量元素与人体健康密切相关,机体某些疾病的发生可以引起某些微量元素的代谢紊乱,建立慢性肾炎血清的微量元素数据库,可以为临床慢性肾炎诊断及治疗提供借鉴。
经临床检测发现,慢性肾炎患者血清中,会出现Ca、Cr、Ni的含量显著偏高,最大相差千倍以上,而Al、K、Mn、Fe、Zn、Pb的含量显著偏低的症状,但在最初的症状中,并不会同时导致上述微量元素的紊乱,而是部分联合发生,最终导致上述所有微量元素紊乱。经抽取大量样品测定,健康人和慢性肾炎患者血清相关微量元素差异体现如下表:
表1.
元素 | 患者测定平均值(ng/g) | 健康者测定平均值(ng/g) |
Al | 5.5-7.5 | 18.0-19.0 |
K | 730.2-735.5 | 945.8-950.5 |
Ca | 524.9-527.8 | 443.2-445.3 |
Cr | 1.3-1.4 | 0.2-0.3 |
Mn | 0.03-0.04 | 0.15-0.16 |
Fe | 4.2-4.4 | 6.4-6.5 |
Ni | 0.26-0.28 | 0.06-0.07 |
Zn | 0.04-0.05 | 42-43 |
Pb | 0.03-0.04 | 0.5-0.6 |
选取Ca、Cr、Ni、Al、K、Mn、Fe、Zn、Pb和荧光分子靶材,利用脉冲激光溅射沉积,通过掩膜设置,按照例1的掩膜方法,在真空环境下形成高通量生物薄膜库并通过荧光分子的不同反应做出标记(生物薄膜各组分浓度控制在以上患者浓度范围内)。
将待测血清制膜比较数据库,从中判断是否有发病迹象,并筛选出对应的发病症状,与单纯的元素缺乏相区别。
实施例3
通过高通量生物薄膜的制备,还可以根据需要,选择具有一定生物功能的物质。为能在化学成分明确、无异源、无饲养层的环境下无性繁殖人类多能干细胞,进行高通量生物薄膜的制备,从库中选出最支持细胞生长的薄膜。
高通量生物薄膜由具备不同的疏水性、亲水性和不同的交联密度的22种丙烯酸酯单体聚合而成,其中包括16种主要单体和6种次要单体,按照六个不同的比例(100:0、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30,体积/体积)聚合。操作步骤如下:
首先将基片浸于质量浓度为4g/100mL的甲基丙烯酸-2-羧基乙酯中5min;再将上述单体混合物按照不同的比例以三层的方式一一沉积于表面附着有甲基丙烯酸-2-羧基乙酯的基片上(沉积方法如例1),再将沉积后的单体混合物暴露在长波紫外光下进行聚合(波长为365nm),时长为十秒。最后在真空环境下干燥七天以上,形成496种具有不同组分的生物薄膜。
蛋白质可以迅速吸附到用于细胞培养的材料表面,由此可以改变细胞生长的培养基表面性质,从而更好地促进细胞生长,所以选择具有很好粘附性能的蛋白质对于多能干细胞的生长至关重要。我们将纤连蛋白、层粘连蛋白、牛血清蛋白和胎牛血清分别从溶液中吸附到高通量生物薄膜中去,发现,胎牛血清最能支持多能干细胞的增值,而其他的蛋白更容易导致细胞分化。因此,我们用胎牛血清涂覆高通量生物薄膜,可以从中选取适合细胞生长的聚合物,获得具有较强粘附功能的薄膜物质用于放入培养基中进行细胞培养。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,包括以下制备步骤:
准备四个自相似掩膜,分别为第一掩膜、第二掩膜、第三掩膜和第四掩膜;
根据制备目的,准备沉积组分;
准备用于沉积的基片;
根据制备目的,设置基片与所述第一掩膜的相对位置;
通过转动所述第一掩膜,在所述基片的四个象限上分别沉积四种不同的沉积组分;
引入所述第二掩膜,以上述相同的沉积方法在所述基片的四个象限的左上角添加一种新的沉积组分;
使用第三掩膜和第四掩膜重复上述沉积步骤,不同的沉积组分可以选择性地沉积于所述基片的固定位置;
上述沉积步骤可以一直继续下去,即以n层、共4×n步的薄膜沉积,得到4n个不同组分的生物薄膜;
将所有生物薄膜进行退火处理;
其中,所述沉积组分可以通过脉冲激光溅射沉积法或旋转涂布法沉积于设有掩膜的所述基片上。
2.如权利要求1所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,在所述旋转涂布法中,旋转速度为1r/s-100r/s。
3.如权利要求2所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,在所述旋转涂布法中,旋转速度为30r/s-70r/s。
4.如权利要求1所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,所述沉积组分为有机物、生物分子和无机盐。
5.如权利要求4所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,所述有机物为具有生物活性的物质。
6.如权利要求4所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,所述有机物为氨基酸、肽、蛋白质,所述生物分子为荧光分子、核酸。
7.如权利要求1所述的高通量生物薄膜的制备方法,其特征在于,所述沉积步骤在真空环境下进行。
8.高通量生物薄膜的应用,其特征在于,根据权利要求1-7任一项所述的高通量生物薄膜的制备方法所制备出来的生物薄膜应用于生物、医学领域。
9.如权利要求8所述的高通量生物薄膜的应用,其特征在于,所述高通量生物薄膜用于病理和生物功能的检测。
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