CN101952720A - 用于分析具有不同拓扑图的表面与环境之间相互作用的高通量筛选方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于分析材料表面和环境间相互作用的高通量筛选方法，包括：提供包括所述材料并具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列；使至少部分所述大量单元与所述环境接触；和筛选所述微阵列以得出一个或多个所述单元与所述环境间的相互作用。

Description

用于分析具有不同拓扑图的表面与环境之间相互作用的高通量筛选方法和设备
本发明涉及一种用于分析材料表面与其环境之间的相互作用的高通量筛选方法，还涉及一种用于进行高通量筛选的设备。
以往对能够用于临床的材料已经进行了广泛的研究。在临床应用中普遍使用的材料的重要示例是钛植入体、汞合金牙齿植入体以及塑料心脏瓣膜。大多数材料能够成功应用的关键在于它们的生物惰性，即材料与周围组织之间的最小的相互作用。
尽管具有这些优势特性，通常可以接受的是：理想的补救方法是对正常组织的完全修复。比较有利的方法是植入能够提供临时的机械性支持，但最终会降解，从而被已恢复的正常组织取代的材料。一个示例是可降解的缝合线。在伤口愈合之后，缝合线不再被需要并将降解。有许多可降解的聚合物体系可用。在特定的领域，例如在骨重建领域，也使用可降解的陶瓷材料，以及聚合物/陶瓷复合材料。
可降解的植入体在骨科和软骨手术领域也是有利的。在该领域中主要的手术治疗依靠金属医用植入体与骨或骨替代物结合使用。这些植入体必须被成功地纳入骨组织，以取得良好的临床效果。在过去几十年中，在这一领域已取得了关键进展和成果，但随着时间的推移，对于成功的长期关节置换来说，植入体松动仍然是一个重要问题。目前的材料无法实现较大的骨缺损的桥接，并单独保持长期稳定。若使用取自患者自身的骨移植物来解决这些问题，则供区的发病率相对较高，为15-30％。多达20％经受髋关节置换手术的患者在初次手术后的10至15年内发生假体周围骨质流失，在进行脊柱融合手术的患者中，20-30％发生融合不良。此外，在不久的将来，患病人群将包括大量的年轻患者，预计与长期无菌性植入体松动相关的问题将大幅度增加。
体内植入体的生物相容性/生物结合非常复杂，涉及传统上属于医学科学、表面科学、材料科学和分子生物技术的过程。在植入体被植入身体之后的几毫秒之内，由来自生理液的水、蛋白质和其它生物分子组成的生物膜层形成于植入体表面。来自周围组织的细胞迁移到植入体周围的区域。植入体表面的特性严重影响其与细胞的相互作用。为了优化生物相容性，植入体表面对细胞生物学特性的影响变得至关重要。此外，细胞的特性，例如，它们通过信号分子穿过细胞外基质进行沟通的能力对良好的生物相容性来说是很重要的。所有这些机制都有助于组织对植入体的响应，和确定植入体是否以足够的机械强度成功地固定在患者的骨头内，或者是否对植入体发生炎症反应，这些最终都将导致无菌性松动和手术失败。
人们普遍承认，医疗器材或植入体的材料与其周围组织或细胞之间的相互作用可以通过调节表面拓扑图来加以改善，参见例如WO-A-2006/114098。
已经表明，表面拓扑图可以例如影响细胞定位、细胞粘附和增殖，和/或细胞分化。
可以通过在例如所述的用于肌腱修复(Curtis等，Eur.Cell Mater.2005，9，50-57)和心肌细胞定位(Deutsch等，J Biomed.Mater.Res.B2000，53(3)，267-275)的生物材料上制造图形来控制细胞定位。最近，本发明人还通过微图案聚合物设计证实了C2C12小鼠前成肌细胞与MC3T3小鼠前成骨细胞的排列(Papenburg等，Biomaterials 2007，28(11)，1998-2009)。
细胞对材料的粘附在例如骨外科领域中可能是一种理想的特性，因为它增强了材料与邻近骨组织之间的接触。相反，在其它应用中，例如当植入人工主动脉瓣膜时，它可能是不可取的。如文献中大量描述的(参见例如Den Braber等，J.Biomed.Mater.Res.A1998，40(2)，291-300；Van Kooten等，J.Biomed.Mater.Res.B1998，43(1)，1-14；和Thapa等，J.Biomed.Mater.Res.A2003，67(4)，1374-1383)，细胞粘附可以由生物材料表面的拓扑设计来控制。例如，表面粗糙度对细胞表面受体的整合素家族的性质有影响(Luthen等，Biomaterials 2005，26(15)，2423-2440)。此外，本发明人最近描述了聚合物纤维直径和表面拓扑图对人间质干细胞增殖的影响(Moroni等，Biomaterials 2006，27(28)，4911-4922)。
而且，表面拓扑图可影响细胞分化。对于用几何学定义的形状的细胞图形化已广泛用于研究细胞形状对细胞命运决定的影响(Chen等，Science 1997，276(5317)，1425-1428)。在阐述了细胞形状可以控制干细胞分化的经典实验中，微图形化被用于创建不同大小的多片粘合表面(McBeath等，2004，6(4)，483-495)。生长在小片上的人间充质干细胞(hMSCs)保持聚集且优先分化为脂肪细胞，而生长在大片上的hMSCs扩散，且分化为成骨细胞。在这种思路下，能够操纵细胞形态的生物材料会潜在地控制细胞分化。生物材料研究领域的挑战在于为所需的应用确定合适的拓扑图。
然而，到目前为止，为了通过表面拓扑图操纵医疗器材与其周围组织的相互作用所进行的生物材料的设计，主要通过合理的设计或反复试验来实施，它具有变量数量少的特点。
在植入体和医疗器械中使用的生物材料，不仅要经受反复试验设计。而且在许多其它应用中，材料与其环境间的相互作用在材料的有效性和/或适用性方面起主要作用。在很多情况下，由于材料通过表面拓扑图与环境接触，因此材料的拓扑图是影响该种相互作用的重要因素。
本发明的目的是提供用于分析拓扑图文库与特定环境间相互作用的筛选方法，该方法能够高通量筛选大量变量。
本发明再一个目的是提供一种材料和表面拓扑图的细胞和/或组织相容性的高通量筛选方法。
本发明另一个目的是提供一种可用于制备医疗器材且在应用中要与人体接触的材料的筛选方法，例如支架、缝合线、心律调整器等等。
本发明另一个目的是提供一种高通量筛选方法，用于分析在生物医学、药剂学、肿瘤学、再生医学、神经学和家用工具中使用的材料和/或拓扑图的适用性。
本发明另一个目的是提供一种用作软骨和/或骨骼替代物的适用材料的筛选方法。
据发现，通过使用具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列，可以实现上述一个或多个目的。
因此，本发明的第一方面涉及一种用于分析材料表面和环境间相互作用的高通量筛选方法，包括：
-提供包括所述材料并具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列；
-使至少部分所述大量单元与所述环境接触；和
-筛选所述微阵列以得出一个或多个所述单元与所述环境间的相互作用。
本发明人发现，根据本发明可以筛选大量的不同材料和/或不同表面拓扑图得到其与环境间的特异性相互作用。为了找到好的候选，本发明允许对可能的材料和表面拓扑图进行快速和有效地筛选。可以对这些候选进行更仔细的研究。例如，这为开发在应用期间要与细胞、细胞培养基和/或组织接触的更好的医用器材提供了巨大的可能性。
根据本发明的方法，各种环境都是可以的。例如，所述环境可包括组织、细胞、复合分子混合物(例如体液、土壤、海水、空气、细胞裂解液、器官或完整的有机体、废品、尿、粪便)。然而，所属环境还可包括特异性分子。如果环境包括细胞、复合分子混合物或特异性分子，则本发明包含将微阵列分别与所述细胞、所述复合分子混合物或所述特异性分子接触。
通过每天对材料的构造和/或表面特性进行有益的改变，材料(例如生物材料)仅通过改变拓扑图就可加以应用。因此，参与的重组蛋白或复杂的化学便不再需要了。材料拓扑图的策略设计能够改善其与环境的相互作用。
在一个实施方案中，微阵列包括生物相容性材料，例如生物相容性聚合物。材料可以是生物可降解的。生物可降解聚合物的合适的示例包括聚氧乙烯/聚对苯二甲酸丁二醇酯(PEO/PBT)，聚酯家族的聚合物例如聚(乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)，以及它们的共聚物，聚内酯(例如聚(ε-己内酯))，聚碳酸酯(例如三亚甲基碳酸酯)，聚酸酐，聚原酸酯，聚氨酯，及其衍生物(Gunatillake et al.Eur.CellMater.2003，5，1-16)。而且，不同聚合物的共聚物和/或共混物也可用于本发明的微阵列。
其它可包含于本发明微阵列的适用的材料包括陶瓷、半导体、金属、金属氧化物、金属氮化物、合金、聚合物/陶瓷复合材料、碳、及其共聚物和/或共混物。如果需要，这些材料可以结合适当的聚合物。
微阵列包括大量的拓扑图单元。这些拓扑图单元的数量可以在较大范围内变化。拓扑图单元的数量大是有利的，这样可以一次性筛选大量的拓扑图单元以检测细胞相容性。例如微阵列可以包含至少100个拓扑图单元，优选至少10000万个拓扑图单元，更优选至少30000万个拓扑图单元。由于实际操作的原因，拓扑图单元的上限为约300000个拓扑图单元，或250000个拓扑图单元，但实质上不限于此。这与专利WO-A-02/02794不同。前述发明限于使用96、384或1536孔的装置。此外，它还具有不同几何形状的绝热孔。在本发明中，孔具有相同的几何形状并可一致变化。
单个拓扑图单元的大小可以根据应用情况而变化。例如，单个拓扑图单元具有100-50000μm2或更大，例如500-25000μm2，或1000-10000μm2的表面积。
例如，至少部分单元的拓扑图可在表面孔隙度、表面粗糙度和/或形状方面不同。本专利一个更重要的方面是，可对表面形貌进行设计，并且对制备工艺进行很好的控制，以复制设计的拓扑图。这与专利US-A-2006/0240058不同，该专利描述了一种方法，其中应用组合化学而非微加工通过混合聚合物来创造不同的表面粗糙度。在该申请中，表面拓扑图的几何结构不可控。单元的表面孔隙度在0-90％，如20-70％的范围内变动。孔的平均大小为50μm或更小，例如1nm-50μm。表面粗糙度在5-50纳米至5-10μm范围内变动。而且，至少部分单元的疏水性/亲水性可以改变。此外，至少部分单元的表面可具有特异性官能团。
在由微阵列表面限定的平板内，全部或部分单元可以包括一维或多维微米或纳米级形貌。本文使用的术语“微米级”是指1-1000μm的长度范围。本文使用的术语“纳米级”是指1-1000nm，尤其是1-100nm的长度范围。所述形貌可以是例如结构形貌，例如微阵列表面延伸出的突起。该突起可以具有不同的横截面几何外形，例如圆形突起(例如圆形或椭圆形)以及具有包括多角形，例如多边形、三角形、长方形、正方形、六边形、星角形状、平行四边形等的突起。拓扑图单元的其它形状可见于例如WO-A-2006/114098，其以参阅的方式全文并入于此。微阵列的拓扑图单元可全是人工地或者可以模拟自然界中观察到的表面结构。
形貌至少在一个横向上的横向尺寸为1-100μm，例如1-5μm、5-10μm、10-25μm、25-50μm或50-100μm。优选地，至少一个横向尺寸的范围为1-10μm。从形貌的横截面区域内的任一给定点到横截面边缘的最短距离优选至多为20μm，更优选至多为10μm，甚至更优选至多为5μm，例如，至多2μm。
任何微米级形貌与其最近形貌间的最大距离，或空隙至少在一个横向上的横向尺寸可为1-50μm，例如1-5μm、5-10μm、10-15μm、15-20μm、20-30μm、或30-50μm。优选地，一个形貌与其最近形貌间的最大横向距离优选至多30μm，更优选至多10μm，甚至更优选至多5μm，例如至多2μm。
形貌的深度/高度，例如其在一个方向上投射出微阵列表面的线性尺寸可为纳米级或微米级。因此，形貌的高度/深度可为至少1nm。该高度/深度可为50μm，或甚至100μm。相应的，形貌的高度/深度可在1nm-50μm的范围内，例如在50-100nm、100-500nm、500-1000nm、1-2μm、2-5μm、5-10μm、10-20μm、20-30μm、30-40μm或40-50μm的范围。在一些实施方案中，所有形貌具有基本相同的高度，而在另一些实施方案中，形貌可能具有不同的高度。
在环境包括细胞的情况下，可根据突起的相对尺寸和/或与细胞尺寸相关的表面粗糙度，为每个单元提供一个或多个细胞并使细胞定位在相对粗糙的表面，但也可使细胞定位在特定形状的孔内。对于孔而言，重要的是使细胞保持在不同的孔中并避免细胞蔓延到孔脊。这可以例如通过将细胞粘附性或对抗性蛋白和/或使细胞保持在某一期望的形状内或其上的化学物质涂覆于形貌上来控制。这些蛋白和/或化学物质可通过模版印刷技术和/或微流体(参见Dusseiller等，LabChip 2005，5(12)，1387-1392)提供。此外，孔脊的尺寸和/或纵横比也有助于控制细胞附着。
形貌的上表面和/或侧面基本上是平的，但是，也可以存在具有包括纳米级形貌表面的微米级形貌。这是考虑到微米级或纳米级拓扑图的协同效应。
优选大量单元规则地分布在微阵列上。这便于大量单元与环境的接触和筛选，例如，微阵列上的细胞应用以及细胞筛选。然而，也可以将这些单元在微阵列上随机分布。
本发明的微阵列可通过本领域公知的方法制得。
制备微阵列方法的一个实例是结合了光刻和刻蚀的传统微加工。电子束刻蚀，可直接应用在金属(硅)的表面。这些技术能够制备出微米级的高精密结构。然而，对材料的选择是有限的，因为该项技术要求硅或硅基材料占大部分。可选地，实施后处理步骤例如涂覆，以增强这些材料与特定环境的接触。涂覆材料例如包括蛋白、硅烷、碳、胶原蛋白、生物聚合物(例如肝素、透明质酸)等等。较少受到材料性质限制的其它刻蚀技术为可适应于微图形聚合物的气体等离子刻蚀，和(微)立体光刻，其可被用作直接制备带结构的聚合物的光聚合工艺。
制备微阵列的方法的其它实例为复制法，例如热压或软光刻技术。这些方法比传统微加工要求的材料范围更广。热压技术采用能从熔体中处理得到的材料，而软光刻技术主要采用弹性体如聚(二甲基)-硅氧烷(PDMS)。在软光刻中，制造一个模具以在支架表面上创建油墨微图形。随后在部分无油墨表面进行涂覆。为了通过软光刻精确制图，优选采用刚性表面。
一种制备微阵列的简便方法是浇铸制膜法。通过将材料(聚合物、陶瓷、聚合物/陶瓷复合材料、或聚合物共混物等)溶解在合适的溶剂中制备溶液。将溶液浇铸在带结构的表面/模具上(其通常通过传统洁净室技术制备)并静置使溶剂挥发。表面的复制品因此被复制在材料上，参见例如，M.Mulder，Basic principles of MembraneTechnology，2nd ed.，Dordrecht，The Netherlands，Kluwer academicpublishers，1996。
包含至少部分具有不同孔隙度的大量单元的微阵列(其在组织工程学领域被有趣的用于将养分扩散到细胞)可通过相分离法制备。用于制备微阵列的合适的相分离法描述于WO-A-02/43937，其以参阅的方式全文并入于此。
相分离微成模(PSμM)是基于相分离法的复制技术，其主要用于制备合成膜。该方法涵盖的聚合物范围很广。在PSμM中，相分离与亚微米级的结构复制相结合，参见WO-A-02/43937。首先，基于来源于微电子技术和光刻技术的公知技术制备微米到纳米结构的母模。然后，将理想的聚合物溶液浇铸在母模上。可通过下述方式诱导相分离，例如，对与溶剂不相混溶的聚合物，通过将浇铸的聚合物溶液浸泡在非溶剂中(液诱导相分离)进行，或通过降温(热致相分离)进行。相分离导致浇铸聚合物固化成母模的微米到纳米级的三维结构。此后聚合物微结构可从母模中释放出来。聚合物浓度例如可为1-20wt.％。该方法中使用的溶剂可包括N-甲基-2-吡咯烷酮、二恶烷、氯仿、丙酮、甲苯、烷烃和苯类。该方法中使用的非溶剂可包括水、醇、烷烃、乙醚等。降温一般是将温度降至聚合物的Tc以下，例如可减少10℃或更多。
根据聚合物溶液和非溶剂的组成，产生的聚合物膜在相分离后可显示内在孔隙度，产生多孔的微结构聚合物。此外，该技术通过采用后处理，例如裂解或焙烧，不仅可用于在聚合材料上，也可用在无机材料上(例如陶瓷、金属或碳)制备拓扑图形貌。实现这一目标的一种方式是通过使聚合物和陶瓷的共混溶液沉淀。或者，通过温度处理烧掉聚合物，同时烧结陶瓷。
可为至少部分形貌单元提供生物活性的化合物，例如，肽、蛋白质、糖类、抗原、抗体、DNA、RNA、脂类和/或生长激素。可以利用一种或多种这类生物活性化合物的存在及其与环境(例如细胞)间的相互作用，例如，通过为材料施予有益特性以控制伤口愈合反应。在一个实例中，已知Arg-Gly-Asp氨基酸序列能与粘附受体的整合素家族相互作用，以及涂覆非粘附表面例如聚乙二醇(PEG)，和Arg-Gly-Asp肽能极大地改善细胞的结合及分布。或者，可将参与骨形成的重组蛋白，例如BMP2和IGF-I用于组织再生的控释策略(参见例如Chen等.Growth Factors 2004，22(4)，233-241 and Lutolf et al.Nat.Biotechno1.2005，23(1)，47-55)。
在一个实施方案中，与至少部分大量单元接触的环境包括细胞。这些细胞优选为肝细胞(如全能、多能或多能性干细胞)，因为这些细胞能进行自我复制并生成特化细胞。但是，也可以应用其它类型的细胞。在软骨和骨骼的应用中，间充质干细胞是非常合适的，因为这些细胞可以产生骨骼和软骨的所有类型的细胞。间充质干细胞优选人间充质干细胞。人间充质干细胞可源于骨髓。在一个优选的实施方案中使用细胞。可在体外使用单一细胞将至少部分大量单元与细胞进行接触，但是，也可例如将微阵列在体外植入器官培养基，甚或将微阵列植入体内。后一种可能性的实例为一种带有大量拓扑图的支架，其可筛选用于体内内皮粘附。
考虑到细胞培养中存在的变异，建议采用相同培养的细胞筛选材料及其拓扑图一次以上，例如至少10次，优选至少100次。此外，如下述实施例所示，各拓扑单元(topounit)(形貌集)可在各拓扑芯片(topochip)上重复至少4次。
根据本发明的一个特别实施方案，微阵列上的至少部分大量拓扑图单元为成骨细胞，成骨细胞可以是能够形成骨骼的任何种类的细胞，包括自然产生的细胞类型，和/或改性细胞类型，例如通过基因工程的方式。
环境与微阵列上至少部分大量拓扑图单元的局部接触可通过微流体实现。例如允许将细胞定位在微阵列上。根据所要进行的排列，每个拓扑图单元的细胞数可下降至每单元一个细胞。
此外，如果环境包含细胞，则较为有利的是对细胞施以核染色(如Hoechst染色)或细胞骨架染色(如鬼笔环肽(phalloidin)染色)，以在微阵列上沉积后采用显微技术确定细胞的位置和数量。这些染色可以显示哪些单元含有1个细胞，哪些单元没有细胞，以及哪些单元有一个以上细胞。
根据所要进行的筛选，在筛选微阵列前将大量单元与环境接触一段时间。例如，当对细胞与材料的粘附进行评估时，筛选前接触几个小时即已充分，但是当要对基因表达分析更长的时间时，优选例如1天或2天。
一个或多个拓扑图单元与环境间的相互作用可以包括任何可测量的物理、化学和/或生物相互作用。这些相互作用的实例包括化学反应、光谱移动、氢键、受体-配体相互作用、电子转移、能量转移、粘附、静电相互作用、范德华键、亲水/疏水相互作用、偶极相互作用、抗原-抗体结合、特异性细胞行为(如细胞定位、细胞粘附、细胞增殖、细胞分化，和/或一种或多种蛋白的表达)。
特异性细胞行为例如包括细胞分化，例如细胞谱系特异性分化，例如成骨或软骨细胞系特异性分化。
对检测来讲，优选一个或多个拓扑图单元和环境间的相互作用包括发光(例如荧光或磷光)，例如通过表达一种或多种发光蛋白。根据本发明一个优选的实施方案，相互作用包括由一种或多种骨骼特异性启动子(如BSP、骨钙素、I型胶原蛋白和/或OSE1)和/或一种或多种软骨特异性启动子(如2型胶原蛋白、COMP和X型胶原蛋白)控制的一种或多种荧光蛋白的表达。该相互作用还包括特异性蛋白放射性标记同位素的表达。
可采用适当的检测手段检测一个或多个拓扑图单元与环境间的相互作用。实例包括例如由发光蛋白(例如绿色荧光蛋白及相关蛋白、萤火虫荧光素酶、光素酶等)或发光抗体产生的光学信号检测。光学信号可例如通过显微镜(例如荧光显微镜)包括其衍生技术例如荧光寿命成像，以及使用电荷耦合装置照相机的冷光成像(luminescentimaging using a charge coupled device camera)检测。
根据本发明的一个优选实施方案，相互作用包括由反映细胞行为变化的一种或多种DNA调控因子控制的一种或多种荧光蛋白的表达。实例包括骨骼特异性基因启动子如BSP、骨钙素、I型胶原蛋白和/或OSE1)和/或一种或多种软骨特异性启动子(如2型胶原蛋白、COMP和X型胶原蛋白)。
此外，可通过采用荧光或其它标记的抗体的免疫组织化学监测一种或多种拓扑图单元与环境间的相互作用。也可在基因表达的水平上监测该相互作用，为此可采用多种技术例如原位杂交和聚合酶链反应。采用原位杂交可使基因组的变化实现可视化。
可使用其它的表面成像光谱测定表面对环境的效应参数。例如，可从环境中获得核磁共振(NMR)，为此，可使用例如用于基于核磁共振成像的量子点和其它分子体的探针。此外，光谱成像可用于分子构成的环境的可视化，如拉曼成像和红外光谱。光学显微镜可用于检测形态特征(例如表面上生长的细胞或组织的特征)。这可以例如提供细胞在表面上的生物学信息，如细胞增殖、凋亡、粘附等等。
其它检测方法包括原子力显微镜、电子显微镜、扫描探针显微镜、扫描近场光学显微镜、X射线光电子显微镜、X射线显微分析、X射线衍射和/或表面等离子体共振。
为了筛选，可应用用于拓扑图单元和细胞间相互作用的微阵列，可采用荧光报道基因对细胞进行基因工程改造。可采用慢病毒技术将荧光报道基因引入到细胞中。例如，为在单细胞水平上检测成骨或软骨分化，可采用荧光报道基因构建体对hMSCs进行基因工程改造。为构建报道基因的骨或软骨特异性表达，可将荧光蛋白置于启动子的控制之下，该启动子在骨或软骨组织中具有独特活性但在未分化的hMSCs中没有活性。对于骨谱系，可从由BSP骨钙素、I型胶原蛋白、OSE1组成的骨特异性启动子的组中选出一种启动子。对于软骨谱系，可从由2型胶原蛋白、COMP、X型胶原蛋白组成的软骨特异性启动子组成的组中选出一种启动子。然后，可利用例如共聚焦激光扫描显微镜检测该荧光蛋白。
微阵列筛选的结果是可能与环境间具有不同相互作用的大量拓扑图单元。这些单元的形貌可大规模制备，以及可采用一系列分子生物技术例如qPCR、报道基因检测、生物监测等等对材料/环境的相互作用做进一步详细分析。
本发明的另一方面涉及一种可对材料表面和环境间的相互作用进行高通量筛选的设备，包括：
-包括所述材料和具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列；
-用于使所述微阵列与所述环境接触的接触装置；以及
-用于监测一个或多个所述单元与所述环境间的相互作用的检测装置。
附图说明
图1：第一设计微阵列(拓扑芯片)示意图。
图2：模具的典型SEM照片。(a)，(b)：带有凸出形貌的模具，在聚合物片中形成支柱。(c)，(d)：带有凹陷形貌的模具，在聚合物片中形成凹点。每个区域是100x100μm。
图3：PLLA拓扑芯片的典型SEM照片。(a)，(b)：带有凹陷的拓扑芯片。(c)，(d)：带有支柱的拓扑芯片。(e)，(f)：带有凹陷(e)和支柱(f)的拓扑芯片的横截面。每个区域是100x100μm。注：图3b的拓扑芯片是图2d中模具的反向复制。(g)：涂覆有磷酸钙的拓扑芯片的典型SEM照片。(h)：钛溅射拓扑芯片的典型SEM照片。
图4：细胞植覆装置的组件。
图5：带有连续流动用附件的改装植覆装置。
图6：用转基因中国仓鼠卵巢细胞株进行的均匀高密度细胞植覆。
图7：用转基因中国仓鼠卵巢细胞株进行的低密度(每个拓扑芯片约8-12个细胞)植覆的荧光显微图。
图8：(a)：采用Genepix pro 4200AL微阵列扫描仪成像的由AlexaFluor 488鬼笔环肽染色的小鼠胚胎干细胞植覆的拓扑芯片。
(b)：采用BD Pathway 435成像的由AlexaFluor 488鬼笔环肽染色的人间质干细胞植覆的拓扑芯片。
(c)：计算机自动细胞分析期间的细胞分裂的典型照片。
图9：(a)：拓扑单元之间的细胞分布频率，(b)-(e)：细胞刚植覆后，表示固定的人间充质干细胞均匀分布的拓扑芯片的随机光显微照片，(f)每个拓扑单元的阳性细胞计数。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
微阵列的制备(拓扑芯片)
通过在微图案模具上用溶剂浇铸聚合物溶液来制备拓扑芯片，得到合并有模具微图案的反向复制物的聚合物片。将小鼠ES细胞作为转基因中国仓鼠卵巢细胞培养，并用荧光显微镜进行分析。
模板设计和模具制作
在此，应用硅微加工技术制作微图案模具，利用投影模板，将微图案蚀刻在平整的硅晶片上。
采用市售的软件CIe Win layout editor version 4.0(WieWebSoftware，Hengelo，The Netherlands)绘制投影模板设计。该设计被输入激光系统并写入铬模板。该模板用于将图案投影到平整的硅晶片的光阻蚀剂层，然后显影，图案就建立在光阻蚀剂上了。
拓扑芯片模具分两步制作：第一，通过干蚀刻法建立拓扑单元的壁；第二，通过湿化学蚀刻法建立形貌。
在第一步设计中，将2x2cm的芯片设计成100x100μm(拓扑单元)具有不同图案特征的区域；拓扑单元之间的脊宽为10μm。
包括以下的图案形貌：
-正方形
-三角形
-圆形
-八边形
-五角星形
这些形貌的尺寸系统地按比例扩大成两个范围。第一个范围在细胞尺寸内(1-20μm)以增加表面粗糙度；第二个范围在大于细胞尺寸内(10-100μm)以限定细胞。增加粗糙度的形貌包括如下尺寸：1、2、3、5、10和20μm。限定细胞的形貌包括如下尺寸：10、20、30、40、70和100μm。所有这些尺寸都可以在特定的范围内互相结合，使两个对称的形貌变成不对称的形貌(即正方形变成矩形，或者圆形变成椭圆形)。
对于各形貌之间的间距，选择与形貌尺寸相同的值并在特定范围内应用到所有形貌尺寸的组合。每个拓扑单元包含仅有一个参数设置(形貌类型、尺寸和间距)的形貌；每个参数设置重复12或13次。该设计的示例见图1。可以发现，对称的和/或随机排布的拓扑形貌特征对细胞行为产生影响，因此我们在每个拓扑单元中也开发了设计随机图案的算法。从拓扑芯片的筛选中收集的信息可以用于输入以开发更多用于芯片新一代设计的进化算法。
为了获得同时具有凸出的(“柱状物”)和压痕的(“凹点”)形貌，采用相同的模板制作两个模具。用负型光阻蚀剂创建柱状物(在聚合物芯片中)，用正型光阻蚀剂创建凹点(在聚合物芯片中)。模具的SEM照片见图2。
为了改善拓扑芯片，绘制了拓扑芯片的第二个设计。第二个设计包括3μm或更大的形貌。除了考虑高分辨率范围的限制，还要考虑各种新形貌，以及已有形貌的变化。此外，还需要适合的蚀刻工艺。
在第二个设计中，也设计了2x2cm的芯片。在这个设计中，拓扑单元为90x90μm；拓扑单元的宽度范围保持在10μm，在一个芯片上得到总计40000个拓扑单元。包括如下图案形貌：
-正方形
-三角形
-圆形
-八边形
-五角星形
-六边形
-三角星形
-半月形
-有缺角的圆形(“圆角”)
-空白区作为对照
增加粗糙度的尺寸范围：3、5、7、10、15和20μm。限定细胞的形貌尺寸包括：20、30、40、50、65和80μm。另外，所有这些尺寸都可以在特定的范围内相互结合，使两个对称的形貌变成不对称的形貌。
在增加粗糙度的范围中，选择与形貌尺寸相同的值，用于形貌之间的间距。对于限定细胞的范围，包括如下间隔值：5、10、15、20、25和30μm。在特定的范围内各间隔值可以在每个形貌尺寸的结合中应用。
此外，在目前所描述的“完整”形貌旁边，在每个形貌类型中都设计一个“空心”的版式；即将第一个形貌与第二个相似形貌合并(第二个形貌为原始大小的50％)，这样在第一个形貌内就创建出一个空心的布局。
在第二个设计中，通过翻转图案，将同时具有凸面(“柱状物”)和凹面的(“凹点”)形貌都绘制到一个设计中，从而创建具有两种形貌类型的一个模具。
每个拓扑单元包含仅有一个参数设置(形貌类型、尺寸和间距，完整或空心形貌，柱状或凹点)的形貌；每个参数设置重复4次。
拓扑芯片的制作
将聚(L-乳酸)(PLLA)(Mw：267000gmol-1)溶于氯仿中(Merck，分析纯)得到10％重量比的溶液。将该溶液以不同的初始铸型厚度(di)250-1000μm浇铸在微图案模具上。为了便于加工，选择500μm的尺寸(di)，得到的最终厚度(df)约为50/80μm(带有/不带有形貌)，除另有不同说明外，所得片的厚度以此作为标准和结果。
蒸干溶剂使聚合物固化。在Milli-Q水中湿润至少1小时后，可从模具中脱模得到由此产生的结合有模具微图形的反向复制的致密聚合物片。随后，用Milli-Q水彻底冲洗聚合物片至少1天，在控制的环境下干燥(T＝19-20℃)。
溶剂浇铸和蒸发可成功制得拓扑芯片。观察到PLLA的形貌的高复制品质。聚合物拓扑芯片的SEM照片见图3。目前尚未用含有第二个拓扑芯片设计的模具的制作拓扑芯片。
拓扑芯片的细胞植覆
小鼠ES细胞培养
按照Smith等在Dev.Biol.1987，121(1)，1-9中所述的方法培养小鼠胚胎干细胞株IB10。简言之，将密度为5000-10000个细胞/cm2的细胞置于涂布明胶组织的培养瓶中。将小鼠ES细胞在50％mES的由达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(DMEM，Biowhittaker))组成的增殖培养基中培养，DMEM培养基含有4.5mg/ml D-葡萄糖、10％胎牛血清(用于mES细胞培养的选择批次，Greiner)、0.1mM非必需氨基酸(NEAA，Sigma)，4mM L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)、100U/ml青霉素(Invitrogen公司)、100μg/ml链霉素(Invitrogen公司)和50％的布法罗大鼠肝细胞调节的mES增殖培养基。使用前，向培养基中加入1000U/ml白血病抑制因子(Esgro，Chemicon International)和50μM二巯基醇(Gibco)。细胞在37℃5％二氧化碳的潮湿培养箱中生长，细胞覆盖前用0.05％胰蛋白酶/EDTA传代。
在置于两腔室斜面(Lab-tek腔室斜面，Nalge Nunc International)的2x2cm拓扑芯片上植覆640000个细胞。用腔室斜面中的Viton 75，化合物51414垫片(Eriks NL)保护芯片。
为了达到细胞植覆的均匀性，用Park等在Lab Chip 2006，#(8)，988-994中描述的技术制作植覆装置。通过对聚甲基丙烯酸甲酯进行微加工制作该装置。植覆装置包括一个0.1mm的沟槽用于放置拓扑芯片。其还包括入口和出口储存器，见图4。
为了保持细胞的营养，通过对植覆装置包括入口和出口的改造(如图5所示)，可以达到培养基的连续层流，使用的流速为140μl/分。
转基因中国仓鼠卵巢细胞
用中国仓鼠卵巢细胞(在结构性激活启动子CMV的控制下表达GFP)检测基于微阵列扫描仪的成像。在组织培养瓶中用DMEM、10％FBS和100U/ml青霉素(Invitrogen)、100μg/ml链霉素(Invitrogen)培养细胞。
用植覆装置将不同浓度的细胞植覆到拓扑芯片上，植覆后成像1小时，用荧光显微镜检查植覆的均匀性。
小鼠ES细胞培养和转基因中国仓鼠卵巢细胞
图6和图7显示采用本技术在拓扑芯片上达到了均匀的细胞植覆密度。图8证实采用微阵列扫描仪通过荧光分析可以进行拓扑芯片的高通量筛选。小鼠胚胎干细胞实验显示这些细胞对细胞骨架的形状改变有响应，表面形貌呈现系统和有序的变化。
实施例2
拓扑芯片的制作
采用光刻法和蚀刻法在面积为2cmx2cm的硅母版(siliconmaster)上创建拓扑形貌。该设计由大约8000个不同的表面拓扑形貌组成，这些拓扑形貌分布在一个90μm×90μm的方形区域，该区域称为拓扑单元。每个拓扑单元重复4次，最后由40000个拓扑单元构成一个拓扑芯片，其余的用空白拓扑单元填补。用Obducat热压/纳米压印工具(Obducat AB公司，瑞典)进行热压。将PLA片加载到覆有硅母的印迹系统中生产聚合物微图案芯片。在接近腔室地方进行印迹，以便使压力与硅母版和主材料底片都能接触到。在施加3兆帕的印迹压力前，将主聚合物底物夹层加热至80℃，高于PLA的Tg(60℃)20℃。经过预定的压印时间600秒后，使温度下降到38℃，低于Tg，但维持施加的压力。在到达此温度时，释放压力。将该聚合物慢慢冷却到室温，然后将硅母版与聚合物分离。
细胞培养
用固定的人类间质干细胞株进行细胞培养实验。在由最少必需培养基(αMEM Life Technologies)、10％胎牛血清(Cambrex公司)，2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)，100单位/ml青霉素(LifeTechnologies)和10μg/ml链霉素(Life Technologies)组成的培养基中培养这些细胞。细胞在37℃5％二氧化碳的潮湿培养箱中生长，细胞覆盖前用0.05％胰蛋白酶/EDTA传代。用细胞在拓扑芯片上植覆前24小时，将烧瓶中的培养基用无胎牛血清的培养基代替，使细胞挨饿，并同时使细胞周期进入G0期。
将1.8×106个细胞植覆到一个2cmx2cm的拓扑芯片上，该拓扑芯片被放在一个定制的PMMA植覆装置中，合上盖子，从而使细胞平均分布在整个芯片表面。这些细胞被固定并附着2小时，然后用植覆装置继续以100μl/min的速度(使用蠕动泵)连续灌注培养基。
免疫染色
培养8小时后，在室温下用PBS冲洗细胞，用4wt％多聚甲醛固定15min。再用PBS冲洗，用0.01％曲拉通-X 100溶液渗透4分钟。再用PBS漂洗样品，用3％牛血清白蛋白封闭30分钟。然后用1∶200倍稀释的一级抗体抗人Ki-67(sc-15402 SantaCruz Biotechnology，Inc.)在保湿箱中培养样品2小时。洗涤样品，随后用1∶1000的山羊二抗兔Alexa 488(Molecular Probes)结合抗体在黑暗的保湿箱中培养1小时。再次洗涤样品，用1∶40 Alexa 568鬼笔环肽(Molecular Probes)和1μg/ml DAPI染色20分钟。
成像
采用共聚焦高通量筛选系统(BD Pathway 435)对样品进行成像。短时间内，通过用3个探针循环创建一个宏，制作出整个芯片的蒙太奇(剪辑)图像。
图像分析
采用CellProfiler软件进行图像分析。简言之，将成像转换为.png格式后，得到蒙太奇图像。然后通过包括网格算法的自定义通道(custom pipeline)运行这些图像来鉴别拓扑单元。随后，用DAPI和Alexa 488图像来量化细胞数量和每拓扑单元增殖细胞的数目。
结果
热压印工艺生产的拓扑芯片具有界限清楚的大量复制一致的表面拓扑形貌。此外，区分拓扑形貌图案的区域的精确阵列使我们可以对细胞行为进行自动的高通量分析。我们通过拓扑单元能够一致地区分细胞。图9a显示了拓扑单元之间细胞的分布频率。简言之，超过80％的拓扑单元填充了6-14个细胞。此外，我们分析了Ki-67的抗体染色的图像，我们能够量化1467个拓扑单元区域中每个拓扑单元中Ki-67阳性细胞的数量。这些结果说明了该技术的效果和可行性。

Claims (21)

1.用于分析材料表面和环境间相互作用的高通量筛选方法，包括：
-提供包括所述材料并具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列；
-使至少部分所述大量单元与所述环境接触；和
-筛选所述微阵列以得出一个或多个所述单元与所述环境间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其中所述环境包括组织、细胞、复合分子混合物(例如体液、土壤、海水、空气、细胞裂解液、器官或完整的有机体、废品、尿、粪便)或特异性分子。
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其中所述相互作用包括化学反应、光谱移动、氢键、受体-配体相互作用、电子转移、能量转移、粘附、静电相互作用、范德华键、亲水/疏水相互作用、偶极相互作用、抗原-抗体结合和/或特异性细胞行为。
4.根据权利要求2所述的高通量筛选方法，其中所述特异性细胞行为包括细胞定位、细胞粘附、细胞增殖、细胞分化和/或一种或多种蛋白的表达。
5.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述材料为生物可降解和/或生物可容性材料。
6.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述材料选自下组：聚氧乙烯/聚对苯二甲酸丁二醇酯共聚物、聚酯家族的聚合物及其共聚物、聚内酯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚原酸酯，聚氨酯及其共聚物和/或共混物。
7.根根据权利要求1-3任一项所述的高通量筛选方法，其中所述材料选自陶瓷、金属、聚合物/陶瓷复合材料、碳及其共混物和/或复合物。
8.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述微阵列包括至少100个拓扑图单元，优选至少10000个拓扑图单元，更优选至少30000个单元，例如40000-300000个单元。
9.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述微阵列中单个拓扑图单元的表面积为100-50000μm2，例如500-25000μm2，或1000-10000μm2。
10.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述大量单元包括在垂直于微阵列表面的方向上具有1nm-100μm，优选50nm-50μm尺寸的结构形貌。
11.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中至少部分所述单元的拓扑图在表面孔隙度、表面粗糙度、疏水性和/或形状方面不同。
12.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中给至少部分所述单元提供生物活性化合物，例如肽、蛋白质、糖类、抗原、抗体、DNA、RNA、脂类和/或生长激素。
13.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述环境包括干细胞，优选间充质干细胞，更优选人间充质干细胞。
14.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述相互作用包括所述环境中所含细胞的谱系特异性分化。
15.根据权利要求13所述的高通量筛选方法，其中所述分化对成骨或软骨形成谱系具有特异性。
16.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述相互作用包括一种或多种荧光蛋白的表达。
17.根据权利要求12所述的高通量筛选方法，其中所述一种或多种荧光蛋白受控于一种或多种骨骼特异性启动子和/或一种或多种软骨特异性启动子。
18.根据权利要求13所述的高通量筛选方法，其中所述一种或多种骨骼特异性启动子选自由BSP、骨钙素、I型胶原蛋白和OSE1组成的组。
19.根据权利要求13所述的高通量筛选方法，其中所述一种或多种软骨特异性启动子选自由2型胶原蛋白、COMP和X型胶原蛋白组成的组。
20.根据前述权利要求任一项所述的高通量筛选方法，其中所述筛选包括一种或多种显微镜(例如光学显微镜和荧光显微镜)，及由其衍生的技术例如荧光寿命成像、发光成像、免疫组织化学、原位杂交、聚合酶链反应、荧光原位杂交、核磁共振、拉曼成像、红外光谱、原子力显微镜、电子显微镜、扫描探针显微镜、扫描近场光学显微镜、X射线光电子显微镜、X射线显微分析、X射线衍射和表面等离子体共振。
21.用于对材料表面和环境间的相互作用进行高通量筛选的设备，包括：
-包括所述材料和具有至少部分带有不同拓扑图的大量单元的微阵列；
-用于使所述微阵列与所述环境接触的接触装置；以及
-用于监测一个或多个所述单元与所述环境间的相互作用的检测装置。
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