JP2016183954A

JP2016183954A - 微小粒子保持装置

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Publication number: JP2016183954A
Application number: JP2015199726A
Authority: JP
Inventors: 聡文最上; Akifumi Mogami
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-10-07
Publication date: 2016-10-20
Anticipated expiration: 2035-10-07
Also published as: JP6679873B2

Abstract

【課題】微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を備えた保持装置において、前記微小粒子を保持した各保持部を確実に分画／密閉し、かつ前記保持部内の溶液を採取可能な装置を提供すること。【解決手段】基板表面は撥水性樹脂で処理される一方、前記保持部の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理されていることで、前記課題を解決する。【選択図】図３

Description

本発明は、微小粒子を含む液体から前記微小粒子を保持可能な装置に関する。特に本発明は、前記微小粒子を保持した保持部間で確実に分画／密閉可能な装置に関する。

近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、前記分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。

引用文献１には、細胞を保持可能な保持部を設けた細胞保持手段と、誘電泳動力により前記保持部に細胞を保持させるための一対の電極とを備えた細胞保持装置を用いて、試料中に含まれる細胞を前記保持部内へ効率的に保持させた後、前記保持部の開口部をミネラルオイル等の疎水性の液体で覆って各保持部を分画／密閉することで、当該密閉された保持部内での遺伝子解析を行なうこと、また前記解析後の溶液を採取することが開示されている。しかしながら、本方法は細胞保持手段の表面を介して、前記保持部に収容された溶液同士が連通するおそれがあり、結果のコンタミネーションが発生するおそれがあった。

保持部を分画／密閉する別の方法として、特許文献２には、試料中に含まれる細胞を誘電泳動力を用いて保持部内に保持させた後、シリコーン樹脂製の膜を前記保持部の開口部に接合することで、各保持部を分画／密閉する方法が開示されている。しかしながら特許文献２で開示の方法では密閉された保持部から溶液を採取できないという問題点がある。

保持部を分画／密閉する、さらに別の方法として、特許文献３には、アモルファスフッ素樹脂で形成した疎水性の上面および側壁を有した保持部を設けた保持手段において、前記各保持部に１個ずつビーズを収容した後、フッ素溶媒等の疎水性溶媒で前記各保持部を分画／密閉する方法が開示されている。しかしながら引用文献３で開示の方法は、微小粒子（細胞）を保持部へ保持させる方法として重力により保持部へ沈降させる方法を採用している。従って、保持部に保持されなかった微小粒子（細胞）を保持部に保持させるには、当該微小粒子（細胞）を含む溶液を回収し、再度保持手段へ導入する必要があるため、作業工程が増大する問題点があった。

細胞保持手段を疎水性の膜で覆う方法として、特許文献４には、細胞を１つだけ保持可能な保持部を設けた保持手段において、前記保持部の内面をフルオロカーボン膜または酸化シリコン膜で覆うことで、前記保持部に収容された細胞を容易に回収できる旨、開示されている。しかしながら引用文献４で開示の方法も、引用文献３と同様、微小粒子（細胞）を保持部へ保持させる方法として重力により保持部へ沈降させる方法を採用しており、引用文献３と同様な問題点を有していた。さらに引用文献４で開示の方法は、保持部の内面をフルオロカーボン膜または酸化シリコン膜で覆う一方、保持手段の表面は撥水性または疎水性を有していると前記保持部への細胞の保持が困難となることから、親水性と疎水性の中間の性質を有する酸化シリコン膜で覆っている。そのため各保持部を確実に分画／密閉させることは困難であった。

ＷＯ２０１１／１４９０３２号特開２０１２−０３４６４１号公報ＷＯ２０１２／１２１３１０号ＷＯ２００５／０６９００１号

本発明の課題は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を備えた保持装置において、前記微小粒子を保持した各保持部を確実に分画／密閉し、かつ前記保持部内の溶液を採取可能な装置を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を備えた微小粒子保持装置であって、前記基板の表面は撥水性樹脂で処理される一方、前記保持部の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理されている、前記装置である。

また本発明の第二の態様は、撥水性樹脂がフッ素樹脂である、前記第一の態様に記載の装置である。

さらに本発明の第三の態様は、以下の（１）から（４）の工程を含む、前記第一または第二の態様に記載の装置を用いた、微小粒子解析方法である。
（１）微小粒子を含む水溶液を前記第一または第二の態様に記載の装置に備えた基板へ導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部へ保持する工程
（３）前記微小粒子を保持した保持部を疎水性溶媒を用いて密閉する工程
（４）前記密閉された保持部に保持された微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析する工程
さらに本発明の第四の態様は、以下の（１）から（５）の工程を含む、前記第一または第二の態様に記載の装置を用いた、微小粒子回収方法である。
（１）微小粒子を含む水溶液を前記第一または第二の態様に記載の装置に備えた基板へ導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部へ保持する工程
（３）前記微小粒子を保持した保持部を疎水性溶媒を用いて密閉する工程
（４）前記密閉された保持部に保持された微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析する工程
（５）（４）の解析後、前記密閉された保持部内の微小粒子または微小粒子を含む水溶液を回収する工程
また本発明の第五の態様は、前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、前記第三または第四の態様に記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の保持装置で保持部に保持する微小粒子の一例として、赤血球や白血球などの血液細胞、がん細胞、臓器組織などの生体試料や、樹脂ビーズ、セラミックス粉体、金属微粒子があげられる。なお本発明の保持装置は、微小粒子を保持した保持部を密閉後、前記微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析するため、前記保持部で保持された微小粒子の移動を制限する必要がある。制限の方法は、微小粒子の性状に応じて適切な方法を採用すればよい。微小粒子が磁性体の場合は保持部（基板）に磁界を印加することで保持すればよい。微小粒子が電荷を有していれば保持部（基板）に電界を印加することで保持すればよい。微小粒子が細胞等の誘電体であれば、保持部を挟むように設けた電極に交流電荷を印加することで誘電泳動力を用いて保持部に保持すればよい。微小粒子がその表面にタンパク質を有している場合は、当該タンパク質の受容体や当該タンパク質に対する抗体を保持部に固定化し、タンパク質−受容体相互作用や抗原抗体反応を利用して当該保持部へ導入すればよい。微小粒子がその表面に官能基を有している場合は、当該官能基と特異的に結合可能なリガンドを保持部に固定化し、当該特異的結合を利用して当該保持部へ導入すればよい。またこれらの導入に加え、保持部自体に微細な孔を形成することで、保持部に保持した微小粒子の移動を物理的に制限させてもよい。

なお微小粒子や分散させる液体の導電率が低い（例えば細胞を含む液体や導電率１ｍＳ／ｃｍ以下（好ましくは２００μＳ／ｃｍ以下）の微小粒子を含んだ液体）の場合、誘電泳動力を用いて保持部へ導入させると、保持部に微小粒子を効率的に導入させることができる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ微小粒子を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の微小粒子の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、微小粒子が細胞であれば周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。

本発明の微小粒子保持装置は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板の表面が撥水性樹脂で処理されていることを特徴としている。撥水性樹脂としては、フッ素樹脂、シリコーン樹脂等、撥水性を有する樹脂の中から適宜選択すればよい。中でもフッ素樹脂が高い撥水性、および高い耐久性を有する点で、基板表面を処理する撥水性樹脂として好ましい。撥水性樹脂による基板表面の処理方法としては、撥水性樹脂を刷毛などで直接基板に塗布する方法や、撥水性樹脂を基板に滴下後、スピンコートにより基板全体に展開させる方法が例示できる。なお撥水性樹脂による基板表面の処理は、微小粒子を含む水溶液を収容した保持部を疎水性溶媒によって密閉可能な疎水性が、基板表面に付与されるよう処理すればよく、必ずしも基板表面全体に撥水性樹脂の膜を形成させる必要はなく、基板表面に撥水性樹脂の膜が斑状に形成されていてもよい。また撥水性樹脂による処理を保持部内面まで行なうと、当該保持部内空間の撥水性が高まり、微小粒子の保持が困難となるおそれがあるため、撥水性樹脂で基板を処理する際は、保持部内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理するとよい。

本明細書において、実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないとは、保持部の側面と基板表面とが接する領域、および保持部の側面と底面とが接する領域以外には撥水性樹脂の膜が形成されないことを意味する。保持部の側面と基板表面とが接する領域、および保持部の側面と底面とが接する領域は、保持部の貫通孔の直径および深さ、ならびに処理に用いる撥水性樹脂の材質により変わり得る。例えば、貫通孔（保持部）の直径が３０から５０μｍ、貫通孔（保持部）の深さが３０から５０μｍであって、処理に用いる撥水性樹脂がフッ素樹脂の場合、
保持部の側面と基板表面とが接する領域は、保持部の側面において当該側面と基板表面との接線から保持部の底面方向に保持部の深さの５％以下の領域となり、
保持部の側面と底面とが接する領域は、保持部の側面において当該側面と底面との接線から基板表面方向に保持部の深さの５％以下の領域、および保持部の底面において当該底面と前記側面との接線から当該底面の中心方向に当該底面の半径の１０％以下の領域かつ保持部の底面積の２０％以下の領域となる。

本発明の微小粒子保持装置は、保持部に微小粒子を保持した後、疎水性溶媒を用いて前記保持部を密閉することで、微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析することができる。さらに前記解析後、前記保持部に保持された微小粒子または前記微小粒子を含む水溶液を回収することもできる。保持部を密閉させるのに用いる疎水性溶媒は、保持部に保持された溶液（水溶液）に対しては親和性を有しない一方、基板表面の処理に用いた撥水性樹脂とは親和性を有する溶媒であればよく、一例としてミネラルオイル等のオイル類や、フッ素溶媒があげられる。なお前記保持部を密閉する方法として、疎水性溶媒の代わりに、前記基板の表面と密着可能なシートを用いてもよい。前記シートの一例として光透過性を有したシリコーンゴムがあげられる。なおシートを用いた密閉方法は、微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析する目的であれば有用な密閉方法であるが、保持部に保持された微小粒子または前記微小粒子を含む水溶液を回収する目的に対しては好ましくない密閉方法である。なぜなら、シートによる密閉を解除する（シートを基板表面から剥がす）際に、保持部に保持された水溶液が蒸発したり、シート側に剥ぎ取られたりするおそれがあるためである。

微小粒子の表面または内部に存在する特定物質は、当該微小粒子表面または内部に存在する、目的とする微小粒子を特定させるための物質であり、微小粒子が細胞の場合は、酵素等のタンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の遺伝子が例示できる。解析方法の一例として、特定物質と蛍光物質とを結合させ、当該蛍光物質から発する蛍光を直接観察する方法がある。なお前記結合様式は、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイゼーション等の中から特定物質の態様を考慮し、適宜選択すればよい。なお特定物質が酵素の場合は、特定物質と蛍光基質とを反応させて得られた蛍光を観察する方法を用いてもよい。また特定物質が遺伝子の場合は、当該遺伝子の一部領域を含む核酸を増幅させた後（または増幅と同時に）、当該増幅した核酸を蛍光等で検出する方法を用いてもよい。微小粒子または前記微小粒子を含む水溶液を回収する際は、回収対象の保持部へ直接チップやピペットを挿入して回収してもよいし、密閉に用いた疎水性溶媒を除去してから前記回収操作を行なってもよい。また、ＰＬＯＳＯＮＥ、１０、ｅ０１３０４１８（２０１５）に記載の方法を用いて回収してもよい。本方法は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板であって、貫通孔（保持部）の直径が３０μｍ、貫通孔（保持部）の深さが４０μｍの保持部を備えた基板の保持部に保持された、採取の標的である、がん細胞を、内径３０μｍのガラス製キャピラリーを備えた細胞採取装置により吸引することで選択的に採取することができる方法である。なお本方法によれば、隣接する保持部に保持された、採取の標的ではない白血球細胞を同時に吸引することはない。

本発明の微小粒子保持装置の一例を図１に示す。図１に示す微小粒子保持装置１は、
貫通孔１１ａを有した平板状の絶縁体１１と、
平板状のスペーサ１２と、
絶縁体１１およびスペーサ１２を上下方向に密着して挟むよう設けた電極基板２１・２２と、
電極基板２１・２２同士を接続する導線３０と、
電極基板２１・２２に信号を印加する信号発生器４０と、
を備えている（なお以降、絶縁体１１と電極基板２１とを合わせた態様を保持基板１０という）。電極基板２２には導入口２２ａおよび導入口２２ｂを設けている。貫通孔１１ａおよび絶縁体１１の下部に密着して設けた電極基板２１により保持部５０が構成され、導入口２２ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１２ａを通じて保持部５０へ微小粒子が導入される。なお電極基板２２はスペーサ１２上部に密着して設けており、導入口２２ａから導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。また保持部５０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板２２はスペーサ１２から取り外し可能な構造となっている。

本発明は、微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を備えた微小粒子保持装置であって、前記基板の表面は撥水性樹脂で処理される一方、前記保持部の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理されていることを特徴としている。本発明の装置は、前記保持部へ微小粒子を保持させた後、疎水性溶媒を導入することで前記保持部を確実に分画／密閉させることができる。従って、その後の解析工程（酵素反応、抗原抗体反応、核酸増幅反応等）において保持部間のコンタミネーションを防ぐことができる。さらに、分画／密閉された保持部から微小粒子または微小粒子を含む水溶液を回収することができる。

本発明の微小粒子保持装置の一例を示した図。（Ａ）は分解図を、（Ｂ）は正面図を、それぞれ表わす。実施例４および比較例１で行なった、本発明の微小粒子保持装置を用いた細胞解析方法の各工程を示した図。実施例４の結果を示した図。（Ａ）および（Ｂ）は実施例１で作製した本発明の微小粒子保持装置（保持部の直径３０μｍ）の明視野像および蛍光像であり、（Ｃ）および（Ｄ）は実施例２で作製した本発明の微小粒子保持装置（保持部の直径１００μｍ）の明視野像および蛍光像である。比較例１の結果を示した図。（Ａ）および（Ｂ）は比較例１で作製した微小粒子保持装置（保持部の直径３０μｍ）の明視野像および蛍光像であり、（Ｃ）および（Ｄ）は比較例１で作製した微小粒子保持装置（保持部の直径１００μｍ）の明視野像および蛍光像である。実施例５で行なった、本発明の微小粒子保持装置を用いた細胞解析、および標的細胞の採取方法の各工程を示した図。実施例５の結果を示した図。（Ａ）から（Ｃ）は標的細胞採取前の明視野像、蛍光像および細胞核染色像であり、（Ｄ）から（Ｆ）は標的細胞採取後の明視野像、蛍光像および細胞核染色像である。実施例６で行なった、シリコーンゴムシートにより保持部を密閉する方法を用いた細胞解析、および標的細胞の採取方法の各工程を示した図。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

実施例１微小粒子保持装置の作製（保持部の直径３０μｍ）
以下に示す方法で、図１に示す微小粒子保持装置１を作製した。
（１）電極基板２１（縦７０ｍｍ×横３８ｍｍ×厚さ１ｍｍのガラス基板にＩＴＯを成膜したもの）のＩＴＯ成膜面に、スピンコーターを用いて３０μｍの膜厚になるようレジスト（エポキシ系のネガ型レジスト）を塗布した。
（２）１分間自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（９５℃、３分間）した。
（３）縦５０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、間隔が５０μｍで、縦１０００個×横６００個のアレイ状に並べた、直径３０μｍの貫通孔パターンを描いた露光用フォトマスクを用いて、ＵＶ露光機でレジストを露光し、現像液で現像した。なお露光時間と現像時間は、貫通孔の深さがレジストの膜厚と等しい３０μｍになるように調整し、電極基板２１のＩＴＯ成膜面が露出するようにした。
（４）ホットプレートを用いてポストベーク（１８０℃、３０分）することで、レジスト構造を固めた。これにより、電極基板２１の上部に貫通孔１１ａを有した絶縁体１１を設けた、保持部５０を設けた保持基板１０を得た。
（５）（４）で得られた保持基板１０の絶縁体１１側表面（絶縁体１１上面）に、フッ素樹脂コーティング剤であるフロロサーフＦＳ−１０００シリーズ（フロロテクノロジー製）を１ｍＬ滴下し、スピンコーターを用いて回転数３００ｒｐｍで５秒、続いて回転数１５００ｒｐｍで５秒回転することで撥水性樹脂による処理を行なった。
（６）撥水性樹脂による処理後、ホットプレートを用いて１００℃で１２０分間ベークを行ない、揮発成分を揮発させた。撥水性樹脂による処理後の絶縁体１１表面の水接触角は約１１０度と、処理前の値（９０度未満）と比較し撥水性が向上していることを確認した。なお撥水性樹脂による処理後の絶縁体膜表面（絶縁体１１上面）に対しエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）マッピング測定を行なった結果、絶縁体膜表面（絶縁体１１上面）に対し、フッ素樹脂の膜が全体ではなく斑状に形成されていたが、本発明を実施するにおいて支障はない。また撥水性樹脂による処理後の保持部内面に対し同様にＥＤＳマッピング測定を行なった結果、保持部内面で確認されたフッ素樹脂の膜は、保持部の側面において当該側面と底面との接線から基板表面方向に１μｍ（保持部深さの約３％）の領域、および保持部の底面において当該底面と前記側面との接線から当該底面の中心方向に１．４μｍ（当該底面の半径の約９％、保持部底面積の約１８％）の領域のみであった。従って本処理法では、保持部内部は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理しているといえる。
（７）撥水性樹脂で処理した保持基板１０の上部にスペーサ１２を積層し圧着させた。スペーサ１２は縦３．５ｍｍ×横１０ｍｍの貫通部１２ａを設けた厚さ１．０ｍｍのシリコンゴム製の平板であり、表面は粘着性があるため、圧着することで各部品を密着させることができる。なお貫通部１２ａ内に存在する保持部５０（貫通孔１１ａ）の数は約２２０００個である。
（８）スペーサ１２の上部に電極基板２２を積層し圧着させた。なお電極基板２２には導入口２２ａおよび導入口２２ｂとを設けており、貫通部１２ａ内に存在する保持部５０（貫通孔１１ａ）へ液体を導入／排出させることができる。
（９）電極基板２１・２２と信号発生器４０との間を導線で３０で接続することで、図１に示す微小粒子保持装置１を作製した。

実施例２微小粒子保持装置の作製（保持部の直径１００μｍ）
以下に示す方法で、図１に示す微小粒子保持装置１を作製した。
（１）実施例１（１）および（２）に記載の方法でレジストを塗布した電極基板２１の縦５０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、間隔が２００μｍで、縦２５０個×横１５０個のアレイ状に並べた、直径１００μｍの貫通孔パターンを描いた露光用フォトマスクを用いて、ＵＶ露光機でレジストを露光し、現像液で現像した。なお露光時間と現像時間は、貫通孔の深さがレジストの膜厚と等しい３０μｍになるように調整し、電極基板２１のＩＴＯ成膜面が露出するようにした。
（２）ホットプレートを用いてポストベーク（１８０℃、３０分）することで、レジスト構造を固めた。これにより、電極基板２１の上部に貫通孔１１ａを有した絶縁体１１を設けた、保持部５０を設けた保持基板１０を得た。
（３）実施例１（５）および（６）に記載の方法で撥水性樹脂による処理を行なった。本処理により、実施例１と同様、基板（絶縁体１１）表面は撥水性樹脂による処理がされているが、保持部内部は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理されている。
（４）撥水性樹脂で処理した保持基板１０の上部にスペーサ１２を積層し圧着させた。スペーサ１２は縦３．５ｍｍ×横１０ｍｍの貫通部１２ａを設けた厚さ１．０ｍｍのシリコンゴム製の平板であり、表面は粘着性があるため、圧着することで各部品を密着させることができる。なお貫通部１２ａ内に存在する保持部５０（貫通孔１１ａ）の数は約１３７５個である。
（５）スペーサ１２の上部に電極基板２２を積層し圧着させた。なお電極基板２２には導入口２２ａおよび導入口２２ｂとを設けており、貫通部１２ａ内に存在する保持部５０（貫通孔１１ａ）へ液体を導入／排出させることができる。
（６）電極基板２１・２２と信号発生器４０との間を導線で３０で接続することで、図１に示す微小粒子保持装置１を作製した。

実施例３微小粒子保持装置を用いた細胞保持
実施例１および２で作製した微小粒子保持装置１を用いて、以下に示す方法で、細胞保持を試みた。
（１）ヒト転移性膵臓がん細胞であるＡｓＰＣ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。
（２）細胞がサブコンフルエントに達した後にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて個々の細胞がばらばらになるよう細胞を剥がした。
（３）処理した細胞を遠心し（２５℃で２００×ｇ、５分）、上澄みを捨てた後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０１（ｖ／ｖ）％のＴｗｅｅｎ２０を添加した３００ｍＭのマンニトール水溶液に懸濁し、１×１０^５個／ｍＬの細胞密度になるよう、細胞懸濁液を調製した。
（４）（３）で調製した細胞懸濁液５５μＬを、電極基板２２の導入口２２ａよりシリンジを用いて導入し（導入細胞数：約５５００個）、信号発生器４０により電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極基板２１・２２へ３分間印加した。

結果、実施例１で作製した微小粒子保持装置１の保持部５０には、細胞が１個ずつ保持されていることを確認した。また、実施例２で作製した微小粒子保持装置１の保持部５０には、細胞が複数個ずつ保持されていることを確認した。

実施例４微小粒子保持装置を用いた細胞解析（撥水性樹脂処理あり）
実施例３に記載した方法で保持部５０に保持した細胞を、以下に示す方法で細胞解析を試みた。なお本実施例の操作の流れを図２に示す。
（１）実施例３に記載した方法で保持部５０にＡｓＰＣ−１細胞６０を保持（図２（１））した後、引き続き信号発生器４０により交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの矩形波）を電極基板２１・２２へ印加しながら、収容部へ０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジン（接着物質８０）を含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入した後、交流電圧の印加を停止し、３分間静置した（図２（２））。
（２）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、すぐに導入口２２ａからＰＢＳを細胞診断チップに導入し、微小粒子保持装置１内にある余剰のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に接着させた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、細胞６０は微細孔内に静電気的に接着しているため、前記洗浄操作により保持部５０から脱離することはない。
（３）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、導入口２２ａから１０μＭのＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ^ＴＭ−ｇＧｌｕ（五稜化学製）を含むＰＢＳを収容部内に導入し、１分間室温で静置した。なおＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ^ＴＭ−ｇＧｌｕはがん細胞が有する酵素活性により分解し蛍光を発することで、がん細胞を選択的に検出することが可能な蛍光イメージング試薬９０である（図２（３））。
（４）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、導入口２２ａからミネラルオイル１００を導入することで保持部５０を密閉した（図２（４））。
（５）室温で６０分間静置することで、がん細胞が有する酵素と蛍光イメージング試薬９０との酵素反応を進行させて、発生した蛍光９１を光学検出器２（オリンパス製倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７１）を通じて、ＣＭＯＳカメラで撮像した（図２（５））。

結果を図３に示す。明視野像（図３（Ａ）および（Ｃ））から、実施例１および２で作製した微小粒子保持装置１における各保持部内の水溶液は互いに分画されていることがわかる。また蛍光像（図３（Ｂ）および（Ｄ））から、実施例１および２で作製した微小粒子保持装置１のがん細胞が保持された保持部において当該細胞由来の蛍光を確認した。なお図３（Ｂ）および（Ｄ）において、がん細胞が保持された保持部内の蛍光強度に差がみられるが、保持部に保持されたがん細胞が有する酵素活性や細胞膜状態の違いに起因すると推定される。以上の結果から、基板（絶縁体１１）表面を撥水性樹脂で処理する一方、保持部５０の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理することで、各保持部内の水溶液は互いに分画され、目的とする細胞の選別を確実に行なえることがわかる。

比較例１微小粒子保持装置を用いた細胞解析（撥水性樹脂処理なし）
実施例１および２で作製した微小粒子保持装置１のうち、実施例１（５）および（６）に記載の撥水性樹脂による処理を行なわなかったものについて、実施例４と同様な細胞解析を試みた。

結果を図４に示す。明視野像（図４（Ａ）および（Ｃ））から、比較例１で作製した微小粒子保持装置１における保持部内の液体が絶縁膜１１表面を介して互いに連通している箇所が複数確認できた。また蛍光像（図３（Ｂ）および（Ｄ））から、比較例１で作製した微小粒子保持装置１における保持部に保持されたがん細胞由来の蛍光が絶縁膜１１表面を介して隣接する保持部へ拡散している様子が確認できた。以上の結果から、基板（絶縁体１１）表面を撥水性樹脂で処理しないと、各保持部内の水溶液の分画が不十分となり、目的とする細胞の選別が困難となるおそれがあることがわかる。

実施例５微小粒子保持装置を用いた細胞解析後の標的細胞の採取（撥水性樹脂処理あり）
実施例１で作製した微小粒子保持装置を用いて、実施例３に記載した方法で保持部５０に保持した細胞６０を、以下に示す方法で細胞解析後、標的細胞の採取を試みた。なお本実施例の操作の流れを図５に示す。
（１）実施例３に記載した方法で保持部５０に細胞６０を保持（図５（１））した後、引き続き信号発生器４０により交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの矩形波）を電極基板２１・２２へ印加しながら、収容部へ０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジン（接着物質８０）を含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入した後、交流電圧の印加を停止し、３分間静置した（図５（２））。
（２）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、すぐに導入口２２ａからＰＢＳを細胞診断チップに導入し、微小粒子保持装置１内にある余剰のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に接着させた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、細胞は微細孔内に静電気的に接着しているため、前記洗浄操作により保持部５０から脱離することはない。
（３）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、導入口２２ａから１０μＭのＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ^ＴＭ−ｇＧｌｕ（五稜化学製）および１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を含むＰＢＳを収容部内に導入し、１分間室温で静置した。なおＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ^ＴＭ−ｇＧｌｕはがん細胞が有する酵素活性により分解し蛍光を発することで、がん細胞を選択的に検出することが可能な蛍光イメージング試薬９０である。またＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２は生きた細胞の細胞核を染色する試薬である（図５（３））。
（４）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、導入口２２ａからフロリナート^ＴＭＦＣ−４０（３Ｍ製）（フッ素溶媒１１０）を導入することで保持部５０を密閉した。なおフロリナート^ＴＭＦＣ−４０は不活性なフッ素溶媒である（図５（４））。
（５）室温で６０分間静置することで、がん細胞が有する酵素と蛍光イメージング試薬９０との酵素反応を進行させて、発生した蛍光９１を光学検出器２（オリンパス製倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７１）を通じて、ＣＭＯＳカメラで撮像した（図５（５））。
（６）微小粒子保持装置１の電極基板２２をスペーサ１２から取り外し、ＰＬＯＳＯＮＥ、１０、ｅ０１３０４１８（２０１５）に記載の細胞採取方法で標的細胞を採取した（図５（６））。

結果を図６に示す。明視野像（図６（Ａ））から、各保持部内の水溶液は互いに分画されていることがわかる。また蛍光像（図６（Ｂ））から、がん細胞が保持された保持部において当該細胞由来の蛍光を確認した。なお図６（Ｂ）において、がん細胞が保持された保持部内の蛍光強度に差がみられるが、保持部に保持されたがん細胞が有する酵素活性や細胞膜状態の違いに起因すると推定される。例えば酵素活性の高い（蛍光強度が大きい）がん細胞を標的細胞６１とし、内径３０μｍのガラスキャピラリー１２０を備えた細胞採取装置を用いて吸引採取を試みたところ、標的細胞６１を吸引して採取することができた。一方、隣接する保持部に保持された、標的でない細胞６２は前記細胞採取装置により吸引されることはなかった（図６（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ））。なお吸引採取した標的細胞は、スライドガラスに吐出することで、顕微鏡により視認することができた。以上の結果から、基板（絶縁体１１）表面を撥水性樹脂で処理する一方、保持部５０の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理することで、各保持部内の水溶液は互いに分画され、各保持部内の解析結果の各保持部間でのコンタミネーションを防止することができ、目的とする細胞の選別を確実に行なうことができる。さらに、特開２０１２−０３４６４１号公報（特許文献２）に記載の方法で各保持部を分画／密閉する場合には不可能であった、各保持部内での解析結果より選別した、標的細胞の選択的な採取も本発明では行なうことができる。

実施例６微小粒子保持装置を用いた細胞解析後の標的細胞の採取（シリコーンゴムシートを用いて保持孔を密閉）
実施例１で作製した微小粒子保持装置を用いて、実施例３に記載した方法で保持部５０に保持した細胞６０を、以下に示す方法で細胞解析後、標的細胞の採取を試みた。なお本実施例の操作の流れを図７に示す。
（１）実施例３に記載した方法で保持部５０に細胞６０を保持（図７（１））した後、引き続き信号発生器４０により交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚの矩形波）を電極基板２１・２２へ印加しながら、収容部へ０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジン（接着物質８０）を含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入した後、交流電圧の印加を停止し、３分間静置した（図７（２））。
（２）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、すぐに導入口２２ａからＰＢＳを細胞診断チップに導入し、微小粒子保持装置１内にある余剰のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、微細孔内へ細胞を静電気的に接着させた。なお、ポリ−Ｌ−リジンの作用により、細胞は微細孔内に静電気的に接着しているため、前記洗浄操作により保持部５０から脱離することはない。
（３）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、導入口２２ａから１０μＭのＰｒｏｔｅｏＧＲＥＥＮ^ＴＭ−ｇＧｌｕ（五稜化学製）を含むＰＢＳを収容部内に導入し、１分間室温で静置した。（図７（３））。
（４）微小粒子保持装置１内の溶液を吸引除去後、微小粒子保持装置１から電極基板２２およびスペーサ１２を取り外し、すぐさま、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作成した厚さ１ｍｍのシリコーンゴムシート１３０を保持部５０の表面に押し付けた（図７（４））。
（５）室温で６０分間静置することで、がん細胞が有する酵素と蛍光イメージング試薬９０との酵素反応を進行させて、発生した蛍光９１を光学検出器２（オリンパス製倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７１）を通じて、ＣＭＯＳカメラで撮像した（図７（５））。
（６）シリコーンゴムシート１３０を保持部５０から取り外し、ＰＬＯＳＯＮＥ、１０、ｅ０１３０４１８（２０１５）に記載の細胞採取方法で、酵素活性の高い（蛍光強度が大きい）がん細胞である標的細胞６１の採取を試みた（図７（６））。しかしながら、保持部５０内の液体がすぐに蒸発したため、標的細胞６１の採取はできなかった。

１：微小粒子保持装置
１０：保持基板
１１：絶縁体
１１ａ：貫通孔
１２：スペーサ
１２ａ：貫通部
２１・２２：電極基板
２２ａ：導入口
２２ｂ：排出口
３０：導線
４０：信号発生器
５０：保持部
６０：細胞
６１：標的細胞
６２：標的でない細胞
７０：誘電泳動力
８０：接着物質
９０：蛍光イメージング試薬
９１：蛍光
１００：ミネラルオイル
１１０：フッ素溶媒
１２０：ガラス製キャピラリー
１３０：シリコーンゴムシート
２：光学検出器

Claims

微小粒子を保持可能な保持部を設けた基板を備えた微小粒子保持装置であって、前記基板の表面は撥水性樹脂で処理される一方、前記保持部の内面は実質的に撥水性樹脂の膜が形成されないよう処理されている、前記装置。
撥水性樹脂がフッ素樹脂である、請求項１に記載の装置。
以下の（１）から（４）の工程を含む、請求項１または２に記載の装置を用いた、微小粒子解析方法。
（１）微小粒子を含む水溶液を請求項１または２に記載の装置に備えた基板へ導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部へ保持する工程
（３）前記微小粒子を保持した保持部を疎水性溶媒を用いて密閉する工程
（４）前記密閉された保持部に保持された微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析する工程
以下の（１）から（５）の工程を含む、請求項１または２に記載の装置を用いた、微小粒子回収方法。
（１）微小粒子を含む水溶液を請求項１または２に記載の装置に備えた基板へ導入する工程
（２）前記微小粒子を基板に設けた保持部へ保持する工程
（３）前記微小粒子を保持した保持部を疎水性溶媒を用いて密閉する工程
（４）前記密閉された保持部に保持された微小粒子の表面または内部に存在する特定物質を解析する工程
（５）（４）の解析後、前記密閉された保持部内の微小粒子または微小粒子を含む水溶液を回収する工程
前記（２）の工程を誘電泳動力を利用して行なう、請求項３または４に記載の方法。