JP2021509266A - 無細胞ｄｎａ断片を検出および定量化するための方法とデバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞を含む流体から核酸を単離するための方法、デバイス、およびシステムを含む。様々な態様において、方法、デバイス、およびシステムは、最小の量の物質を必要とし、および／または、血液あるいは環境サンプルなどの複合流体から単離された高純度核酸を結果としてもたらす、迅速な手順を可能にし得る。【選択図】図１

Description

本特許出願は、２０１７年１２月１９日に出願された米国仮特許出願６２／６０７，８６９号の利益を主張するものであり、この文献は全体として参照によって組み込まれる。

無細胞ＤＮＡを使用する癌の検出は進歩している。次世代シーケンシングなどの方法は、無細胞ＤＮＡ診断へのアクセスをより利用しやすくすることを目標にしている。これらの進歩は、癌の検出、予後、および治療のモニタリングにおいて無細胞ＤＮＡ診断の広範な使用をもたらす。しかしながら、無細胞ＤＮＡを分析する現在の方法は、サンプルを調製および検出するために、莫大な費用、努力、および専門知識を必要とする。無細胞ＤＮＡの分析をさらに簡素化する新しい技術およびデバイスが必要とされている。

本明細書に開示されるデバイス、方法、およびキットは、無細胞ＤＮＡの分析の改善に対するニーズを満たすものである。本明細書に記載された実施形態のいくつかは、生体サンプルからの無細胞ＤＮＡを単離および分析するために使用可能である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたデバイスと方法は、特定のサイズの無細胞ＤＮＡ断片を単離、検出、定量化、および／または分析することができる。記載されるように、特定のサイズまたはサイズ範囲に対応するサンプル中のＤＮＡの量は、疾患または疾病を検出し、診断し、分類し、同定し、疾患または疾病を抱える被験体の予後を判定し、あるいは癌を含む疾患または疾病を抱える被験体のための処置レジメンの進展あるいは有効性を評価するために、使用可能である。

被験体からの生体サンプルを分析するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は：生体サンプル中の複数の核酸断片を捕捉する工程であって、複数の核酸断片が複数のサイズを含み、複数のサイズが少なくとも２５０ｂｐ長さの核酸断片を含む、工程；複数の核酸を検出する工程；および、少なくとも２５０ｂｐ長さの核酸断片の検出に基づいて、被験体が疾患または疾病を抱えているかを判定する工程、を含む。

いくつかの実施形態において、核酸断片は、無細胞ＤＮＡ断片および／またはエキソソームを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸断片を捕捉する工程は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉することを含む。

いくつかの実施形態では、疾患または疾病は癌である。いくつかの実施形態において、疾患または疾病は、炎症性疾患、敗血症、心臓病、同種免疫疾患、あるいは自己免疫疾患である。

いくつかの実施形態において、検出する工程は、複数の核酸を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸を定量化することは、特定のサイズまたはサイズ範囲を有するある量の核酸を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイズ範囲は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの少なくとも１つのサイズ範囲を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイズ範囲は、少なくとも２５０ｂｐ、２５０ｂｐ、２７５ｂｐ、３００ｂｐ、３２５ｂｐ、３５０ｂｐ、３７５ｂｐ、４００ｂｐ、４２５ｂｐ、４５０ｂｐ、４７５ｂｐ、５００ｂｐ、５２５ｂｐ、５５０ｂｐ、５７５ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、３ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、６ｋｂｐ、７ｋｂｐ、８ｋｂｐ、９ｋｂｐ、および／または１０ｋｂｐ長さの断片を含む。

いくつかの実施形態において、複数の核酸を定量化することは、少なくとも１つのサイズに対応するある量の核酸を定量化することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのサイズは、２５０ｂｐ〜１０ｋｂｐの間の任意の全数の塩基対の少なくとも１つのサイズを含む。

いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１のサイズまたはサイズ範囲に対応するある量の核酸を、第２のサイズまたはサイズ範囲に対応する第２の量の核酸と比較する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、ある量の核酸を対照と比較する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１のサイズまたはサイズ範囲に対応するある量の核酸を、対照と比較する工程を含む。いくつかの実施形態において、対照は、初期の被験体から、被験体が癌を患っていないと推定されるときの被験体から、健康な個体から、癌の処置を受ける前の被験体から、癌の処置を受けている被験体から、癌の処置を受けた後の被験体から得られ、あるいは、対照は、癌の被験体あるいは癌のない被験体を示すと決定された値である。

いくつかの実施形態において、被験体が癌を患っているかどうかを判定することは、癌の種類、癌のステージ、予後、腫瘍のサイズ、腫瘍量、癌の量の変化、腫瘍サイズの変化、腫瘍の数の変化、前癌状態、あるいは前癌症状を判定することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、複数の核酸断片を捕捉する工程は、ＡＣ誘電泳動電界を生成するように構成された電極を使用することを含む。いくつかの実施形態において、複数の核酸断片を捕捉する工程は、誘電泳動低電界領域と誘電泳動高電界領域を生成するように構成された複数の電極を使用することを含む。いくつかの実施形態では、誘電泳動低電界領域は、１ボルトから４０ボルトのピーク−ピークの電圧；および／または、５Ｈｚから５，０００，０００Ｈｚの周波数、ならびに５％から５０％までのデューティサイクルを有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、誘電泳動高電界領域は、１ボルトから４０ボルトのピーク−ピークの電圧；および／または、５Ｈｚから５，０００，０００Ｈｚの周波数、ならびに５％から５０％までのデューティサイクルを有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態において、複数の電極は、２５０−６００ｂｐ、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉するように構成される。

いくつかの実施形態において、複数の電極はヒドロゲルでコーティングされる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、合成ポリマーの２つ以上の層を含む。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは電極上でスピンコーティングされる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、スピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する。

いくつかの実施形態において、電極は、プラチナ、金、アルミニウム、タンタル、砒化ガリウム、銅、銀、黄銅、亜鉛、スズ、ニッケル、ケイ素、パラジウム、チタン、黒鉛、炭素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む。いくつかの実施形態において、電極は混合金属酸化物を含む。いくつかの実施形態において、混合金属酸化物は、酸化チタン、ジルコニウムからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞からなる群から選択された少なくとも１つの分析物を検出する工程を含む。

請求項１−２９のいずれか１つに記載の方法であって、生体サンプルは、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせを含む。

請求項３０の方法であって、生体サンプルは細胞を含み、方法はさらに細胞を溶解する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、捕捉した核酸断片を溶離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、核酸断片を配列決定する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、方法の診断力または予測力あるいは精度を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％増加させる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、偽陽性率を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％減少させる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、偽陰性率を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％減少させる。いくつかの実施形態において、方法のパフォーマンスは、０．６０〜０．７０、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、あるいは、０．９０〜１．００の範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＡＵＣ）下の領域を特徴とする。

引用による組み込み
本明細書に言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれるよう具体的かつ個別に示されるのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

特許あるいは出願のファイルは、色つきで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を備えるこの特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払い後に当該事務局によって提供される。

本発明の新しい特徴は、添付の請求項の特殊性をもって説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
記載されたデバイス上で単離された腺癌、扁平上皮癌、および卵巣癌の患者、ならびに健全な対照からのｃｆＤＮＡサンプルの結果を示す。 ５２人の健康な患者および５３人の癌患者（肺、乳房、卵巣、および膵臓の癌）についてのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。 癌の処置を受ける際の２人の患者のｃｆＤＮＡの濃度を示す。図はＹ軸上のｃｄＤＮＡの濃度をｎｇ／ｍＬとして示し、Ｘ軸は時間を表す。 癌の処置を受ける際の２人の患者のｃｆＤＮＡの濃度を示す。図はＹ軸上のｃｄＤＮＡの濃度をｎｇ／ｍＬとして示し、Ｘ軸は時間を表す。

流体組成物から細胞の成分あるいは分子を単離または分離させるのに適した方法、デバイス、およびシステムが本明細書に記載されている。そのような成分および分子の例としては、無細胞ＤＮＡおよびＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞が挙げられる。

特定の実施形態において、細胞あるいは他の粒子物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む流体から、無細胞核酸を含む核酸を単離または分離させるための方法、デバイス、およびシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、核酸の定量化を可能にする。様々な態様において、方法、デバイス、およびシステムは、最小の量の物質を必要とし、および／または、血液あるいは環境サンプルなどの複合流体から単離された高純度ＤＮＡを結果としてもたらす、迅速な手順を可能にし得る。

無細胞ＤＮＡ断片は患者における癌の診断を予測することができる。他のものは、無細胞ＤＮＡ断片化は腫瘍進行と相関することを示している。結果として、癌患者は、癌を抱えていない患者よりも血液中の短いＤＮＡ断片の割合が高い。ある研究では、腫瘍が成長するにつれ、およそ７３ｂｐサイズの断片の濃度はマウスにおいて大幅に上昇した。対照的に、およそ１４５ｂｐサイズの断片の濃度は、腫瘍が成長するにつれてごくわずか上昇するだけであり、およそ３００ｂｐ長さの断片の濃度は、腫瘍が成長するにつれて最終的に低下した（Ｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ． （２０１１） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（９）： ｅ２３４１８．）。

これらのような試験に反して、本発明者らは驚くべきことに、３００ｂｐよりも大きな、例えば、３００〜５００ｂｐあるいはそれ以上のＤＮＡ断片の量で、癌の将来的なリスクを予測することができるということを発見した。結果として、大きなＤＮＡ断片、つまり、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐあるいはそれ以上のＤＮＡ断片を検出する本明細書に記載される試験は、例えば、癌と転移性疾患における疾患のスクリーニング、早期発見、およびリスク予測に使用することができる。他の疾患あるいは症状も企図される。これらは例えば、感染性疾患または疾病、敗血症、移植合併症または拒絶反応に関連するものを含む同種免疫性および自己免疫性疾患または疾病、炎症性疾患または疾病、あるいは心臓の疾患または心臓の疾病を含む。本明細書に記載される試験を行う単純さと比較的低いコストにより、もっと頻繁な試験が可能となる。その結果、様々な危険因子によっては、１年間に１〜６回あるいはそれ以上の試験を受ける患者もあり得る。

患者は頻繁かつ低コストの試験から利益を得ることができる。例えば、頻繁な試験により、患者と医療提供者は縦断的研究からのデータを使用して、患者プロフィールを作成することができる。これらのプロフィールは、正常の健康な状態を、癌などの疾患または疾病の存在を示し得る状態と区別するために使用することができる。より頻繁な試験の使用は、患者が疾患あるいは疾病を初期に検知するのを助けることができる。したがって、より頻繁な試験の使用は、試験の精度を高めるだけでなく、患者が処置レジメンを早期に始める際の予後を考慮することもできるという可能性を有する。

ある実施形態では、流体組成物から粒子または分子を単離または分離させるための方法、デバイス、およびシステムが本明細書で提供され、方法、デバイス、およびシステムは、流体をデバイスに塗布することと、少なくとも３００ｂｐのサンプルから核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態において、核酸は定量化され、標準サンプルに対して比較される。他の実施形態では、核酸は少なくとも１つのバイオマーカーの存在について分析される。さらに他の実施形態では、核酸は無細胞核酸として単離される。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。さらに他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。

いくつかの実施形態において、核酸は血漿または血清を遠心分離機にかけることにより単離される。そのような遠心分離には、Ｅｍａｎｕｅｌ ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ （１９９３）の方法によって記載されるような熱を伴うことがあり得る。他の方法は、参照によって本明細書に組み込まれるＸｕｅ， Ｘｉａｏｙａｎ， ｅｔ ａｌ． “Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ．” Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ４０４．２ （２００９）： １００−１０４に記載されるように、界面活性剤、熱、およびフェノールの使用を含む。

他の方法は、フェノールクロロホルム抽出の使用を含む。例示的な方法では、血漿は、１ｘＳＤＳ／プロテイナーゼＫ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（１：１）で処理され、５６°Ｃで夜通しインキュベートされ、その後、フェノール−クロロホルム（４：１）処理され、７，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけられる。上層は新鮮な１５ｍｌの遠心分離管へ移され、同じ工程が再度繰り返される；ＤＮＡは、グリコゲン（０．１μｇ／μｌ）、酢酸アンモニウム（７．５Ｍ）、および無水アルコールを加えることによって沈殿する。ＤＮＡペレットは７，０００ｒｐｍで遠心分離機にかけることにより得られる。

いくつかの実施形態において、核酸は、ＱＩＡａｍｐ血液キット、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｃｆＤＮＡキット、あるいはＥＺ１ ｃｃｆＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などのＤＮＡ抽出カラムを使用して単離される。他の方法は、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ のＭａｇＭＡＸ無細胞ＤＮＡ単離キットあるいはＢｉｏＣｈａｉｎのｃｆＰｕｒｅキットの使用を含む磁気ビーズの使用を含んでいる。

ある実施形態では、流体組成物から粒子または分子を単離または分離させるための方法、デバイス、およびシステムが本明細書で提供され、方法、デバイス、およびシステムは、電極のアレイを含み、かつ、ＡＣ動電学的な力を生成することができる（例えば、電極のアレイが電圧を印加されるときに）デバイスに流体を塗布することを含む。いくつかの実施形態では、誘電泳動電界は、ＡＣ動電学的力効果の成分である。他の実施形態において、ＡＣ動電学的力効果の構成要素は、ＡＣ電気浸透効果またはＡＣ電熱効果である。いくつかの実施形態において、誘電泳動電界を含むＡＣ動電学的力は、高電界領域（正のＤＥＰ、すなわち、不均一な電界により電界線の強い集中が存在する区域）、および／または低電界領域（負のＤＥＰ、すなわち、不均一な電界により電界線の弱い集中が存在する区域）を含む。

特定の例では、粒子、細胞成分、または分子（例えば、核酸）は、誘電泳動電界の電界領域（例えば、高電界領域）で単離される（例えば、細胞から単離または分離される）。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の成分あるいは分子は、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせから単離される。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の成分あるいは分子は、無細胞である流体あるいは流体の一部から単離される。いくつかの実施形態において、粒子、細胞の成分あるいは分子は、無細胞ＤＮＡを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞、および、上記のいずれかの断片あるいは一部であるか、これらを含む。

いくつかの実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムは、以下の工程の１つ以上を含む：第１の誘電泳動電界領域（例えば、高電界ＤＥＰ領域）において所望の粒子あるいは分子を集中させる工程と、上記領域を洗い流すまたは洗浄することによって所望の粒子または分子から汚染物質を取り除く工程。他の実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムは、以下の工程の１つ以上を含む：第１の誘電泳動電界領域（例えば、低電界ＤＥＰ領域）において細胞および他の残留物質または汚染物質を集中させる工程、第２の誘電泳動電界領域（例えば、高電界ＤＥＰ領域）において核酸を集中させる工程、および、細胞と残留物質を洗い落とす工程。方法はさらに、以下の工程の１つ以上を実施することができる、デバイスおよび／またはシステムを随意に含む：核酸を洗浄するか、さもなければ核酸から残留（例えば、細胞）物質を除去する工程（例えば、核酸が集中し、アレイの高電界ＤＥＰ領域内で維持される間に、水または緩衝液でアレイをすすぐ工程）、残留タンパク質（溶解した細胞および／または他の供給源からの残留タンパク質）を分解する工程であって（こうした分解は、例えば、熱、プロテアーゼ、または化学薬品を用いるものなどの任意の適切なメカニズムによって生じる）、核酸から分解されたタンパク質を洗い流す工程、および、核酸を採取する工程。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイスの操作、システムの操作の結果は、随意にＤＮＡ配列決定に適切な量および純度の単離された核酸である。いくつかの実施形態において、所望の粒子または分子は、無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、無細胞ＲＮＡを含むＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、（エンドソームの表面上で発現されたタンパク質を含む）タンパク質、タンパク質断片、細胞膜断片、ミトコンドリア、細胞小胞、およびエンドソーム起源の小胞である。

いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、短い時間で実施され、デバイスは短い時間で操作され、および、システムは短い時間で操作されることが有利である。いくつかの実施形態では、期間は、デバイスの流体の追加から単離された核酸の入手までの時間から測定される「手順時間」に関連して、短い。いくつかの実施形態では、手順時間は、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分、または５分未満である。

別の態様では、期間は、人がデバイスへの流体の追加から単離された核酸の入手までの時間から手順に注意を払わなければならない、累積的な時間として測定される「実地時間（ｈａｎｄｓ−ｏｎ ｔｉｍｅ）」に関連して、短い。いくつかの実施形態では、実地時間は、２０分未満、１０分未満、５分未満、１分未満、または３０秒未満である。

いくつかの例では、本明細書に記載されるデバイスは単一の容器を含み、本明細書に記載されるシステムは単一の容器を含むデバイスを含み、本明細書に記載される方法は、単一の容器、例えば、本明細書に記載されているような誘電泳動デバイスにおいて実施可能であるということは有利である。いくつかの態様では、そのような単一の容器の実施形態は、流体を取り扱う工程の回数を最小限に抑え、および／または、短時間で実施される。いくつかの例では、本方法、デバイス、およびシステムは、１つ以上の遠心分離工程および／または培地交換を使用する方法、デバイス、およびシステムと対比される。いくつかの例では、遠心分離は、核酸を単離するために必要とされる実地時間の量を増加させる。他の態様では、単一の容器の手順またはデバイスは、最小限の量の消費可能な試薬を使用して、核酸を単離する。

デバイスおよびシステム
いくつかの実施形態において、流体から細胞物質を集めるためのデバイスが本明細書に記載される。一態様では、細胞を含む流体から、流体の無細胞部分から、あるいは他の粒子物質から細胞物質を集めるためのデバイスが本明細書に記載される。

いくつかの実施形態において、生体サンプルまたは環境サンプルから所望の粒子あるいは分子を単離し、所望の核酸配列について所望の粒子または分子を分析するためのデバイスおよび方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイスおよび方法は、疾患を抱える被験体あるいは患者を特定する。例示的な疾患としては、乳癌、肺癌（腺癌を含む非小細胞肺癌と小細胞肺癌を含む）、大腸癌、膵臓癌、および卵巣癌などの癌を含む。疾患はさらに炎症性疾患を含み得る。

他の実施形態では、本明細書に開示される方法およびデバイスは、特定のバイオマーカーを検出することによって、疾患を抱える被験体あるいは患者を特定する。例示的なバイオマーカーは、核酸および様々なサイズのその断片などの核酸、ならびに、限定されないがＰＤ−Ｌ１および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を含むタンパク質を含む。本明細書に記載される方法を使用して検出されるタンパク質マーカーとしては、限定されないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、ＣＡ２７．２９、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９．９、プロラクチン、Ｋｉ−６７、エストロゲン受容体α、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１０、生存、ＡＺＵ１、α−フェトプロテイン（αＦＰ）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）、グリピカン−１（ＧＰＣ−１）、ＣＹＦＲＡ−２１、ＲＮＡベースのマーカー、および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が挙げられる。

本明細書に記載される方法を使用して検出され得るさらなる癌マーカーとしては、限定されないが、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤ２０、カルシトニン、カルレチニン、ＣＤ３４、ＣＤ９９ＭＩＣ ２、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン（様々な型）、デスミン、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、第ＶＩＩＩ因子、ＣＤ３１ ＦＬ１、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、総嚢胞性疾患流体タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＭＢ−４５、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インヒビン、ケラチン（様々な型）、リンパ球マーカー、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、メソテリン、Ｍｙｏ Ｄ１、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、リンパ球共通抗原（ＣＤ４５）、Ｓ１００タンパク質、シナプトフィジン、チログロブリン、甲状腺転写因子１、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、およびビメンチンが挙げられる。

本明細書に記載される方法を使用して検出され得る炎症のさらなるマーカーとしては、限定されないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、血漿α−フェトプロテイン（αＦＰ）、βヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リソソーム粒状体、ヒスタミン、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）−８、ロイコトリエンＢ４、一酸化窒素、プロスタグランジン、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１が挙げられる。

心臓マーカーはクレアチンキナーゼ（ＣＫＭＢ）、ミオグロビン、およびトロポニン１を含む。貧血症のためのマーカーはフェリチンを含む。代謝マーカーはコルチゾール（ＣＯＲＴ）およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）を含む。腎臓マーカーはシスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、β２ミクログロブリン（ＢＭＧ）、無傷の副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）を含む。糖尿病マーカーはＣペプチド、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、およびインスリン（ＩＲＩ）を含む。甲状腺ホルモンマーカーは甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含み、その一方で、生殖ホルモンマーカーはβＨＣＧ、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモンＩＩ（ＬＨＩＩ）、およびプロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔａｔｉｎ）（ＰＲＬ）を含む。

さらに他の実施形態では、本明細書で開示される方法およびデバイスは、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞を含む所望の粒子または分子を定量化することにより、疾患を抱える被験体あるいは患者を特定する。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される方法およびデバイスは、特定された疾患の処置中に患者または被験体の予後を判定する。

いくつかの実施形態において、細胞物質を単離するためのデバイスが本明細書に開示され、デバイスは遠心分離機を含む。いくつかの実施形態において、デバイスは、遠心分離機上で流体を追加し、および、遠心分離機上でカラムから流体を除去するように構成されたロボット要素をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、デバイスはさらにヒーターを含む。いくつかの実施形態において、デバイスはさらに、カラムから核酸を単離、精製、あるいは溶離させるために使用される緩衝液と溶液を保存および分注するための流体リザーバーを含む。

いくつかの実施形態において、細胞物質を単離するためのデバイスが本明細書に開示され、デバイスは、ａ．ハウジング；ｂ．タンパク質分解剤を含むヒーターまたは熱源および／またはリザーバー；および、ｃ．ハウジング内の複数の交流（ＡＣ）電極を含み、ＡＣ電極は、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成され、それによって、ＡＣ動電学的効果が、デバイスの低電界領域において細胞の集中をもたらす。いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテイナーゼＫである。いくつかの実施形態では、デバイスはさらに、溶離剤を含む第２のリザーバーを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書にはデバイスが開示され、上記デバイスは：ａ．複数の交流（ＡＣ）電極であって、ＡＣ電極が、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される、ＡＣ電極；および、ｂ．サーモサイクリング、および、ＰＣＲあるいは他の酵素反応を行うことができるモジュールを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書にはデバイスが開示され、上記デバイスは：ａ．複数の交流（ＡＣ）電極であって、ＡＣ電極が、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される、ＡＣ電極；および、ｂ．ＡＣ電極によって捕捉あるいは単離された物質を画像化することができるモジュールを含む。いくつかの実施形態はさらに、捕捉された物質の視覚化を可能にする試薬を追加および除去するための、チャンバーおよびフルイディックスを含む。

いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスは、流体を含む生体サンプルから、無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、および細胞小胞を単離することができる。いくつかの実施形態において、デバイスは、生体サンプル中の細胞からこれらの物質を単離することができる。

いくつかの実施形態において、デバイスは、生体サンプルから１つ以上の物質を優先的に単離、分離、分類、あるいは選択するように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスは、サイズに基づいて、生体サンプルから１つ以上の物質を優先的に単離、分離、分類、あるいは選択するように構成される。いくつかの実施形態において、デバイスは、生体サンプルから１つ以上の物質を検出するように構成される。

いくつかの実施形態において、デバイスは、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応を実施することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応は１つのチェンバーにおいて実施される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応は１つのチェンバーの複数の領域において実施される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは単離され、ＰＣＲあるいは他の酵素反応は複数のチェンバーにおいて実施される。

いくつかの実施形態において、デバイスはさらに、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応を実施するために、溶離管、チャンバー、およびリザーバーの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応は、複数の温度帯を含む曲がりくねったマイクロチャネルにおいて実施される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ増幅あるいは他の酵素反応は、不混和性流体中に入れられた水性の液滴において実施される（つまり、デジタルＰＣＲ）。いくつかの実施形態では、サーモサイクリングは対流を含む。いくつかの実施形態において、デバイスは電極に接触するか、電極の近位にある表面を含み、ここで、表面は、生体分子を選択的に捕捉することができる生体リガンドで機能化される。

いくつかの実施形態において、生体サンプルから細胞物質を単離するためのシステムが本明細書で開示され、上記システムは、ａ．複数の交流（ＡＣ）電極を含むデバイスであって、ＡＣ電極は、ＡＣ動電学的高電界領域およびＡＣ動電学的低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成され、それによって、ＡＣ動電学的効果が、デバイスの高電解において細胞の集中をもたらす、デバイス；および、ｂ．シーケンサー、サーモサイクラー、あるいは、単離または採取された核酸上で酵素反応を実施するための他のデバイスを含む。いくつかの実施形態では、複数の電極は、誘電泳動高電界領域および誘電泳動低電界領域を確立するために選択的に電圧が印加されるように構成される。

様々な実施形態において、ＤＥＰ電界は、本明細書に記載されるように電極のアレイに選択的に電圧が印加されることによって作られるか、作られ得る。電極は随意に、貴金属（例えば、プラチナ、プラチナイリジウム合金、パラジウム、金など）などの金属を含む腐食に耐性を示す任意の適切な材料で作られる。様々な実施形態において、電極は、適切なＤＥＰおよび／または他の動電学的電界が精製されるように、任意の適切なサイズであり、任意の適切な配向であり、任意の適切な間隔であり、任意の適切な手法で電圧が印加され、あるいは電圧が印加され得る。

いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムが本明細書に記載され、電極は別々のチャンバーに入れられ、正のＤＥＰ領域と負のＤＥＰ領域は、ＡＣ ＤＥＰ電界が細孔または穴構造を通過することにより、内部チャンバー内に作成される。細胞、微粒子、ナノ粒子、および核酸の分離を行うための所望の正のＤＥＰ（高電界）領域およびＤＥＰの負の（低電界）領域を形成するために、様々な幾可学的形状が使用される。いくつかの実施形態において、細孔または穴構造は、多孔質材料（ヒドロゲル）を含み（で充填され）、または多孔質膜構造と覆われている。いくつかの実施形態において、別々のチャンバーへ電極を分離することによって、そのような細孔／穴構造ＤＥＰデバイスは、ＤＥＰプロセスの間に内部の分離チャンバー内で生じる電気化学効果、加熱、あるいは無秩序な流体の運動を減らす。

一態様では、電極を含むデバイスが本明細書で記載され、ここで、電極は別々のチャンバーに入れられ、ＤＥＰ電界は、細孔構造を通過することによって内部チャンバー内で作られる。例示的なデバイスは、ハウジング内に複数の電極と電極を含むチャンバーとを含んでいる。デバイスのコントローラーは、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００９／１４６１４３Ａ２にさらに記載されるように、電極を独立して制御する。

いくつかの実施形態において、チャンバー付きのデバイスは、様々な細孔および／または穴構造（ナノスケール、マイクロスケール、および、マクロスケールでも）を伴って作られ、ならびに、細胞、ナノ粒子、あるいは他の実体が内部チャンバーに分散するか運ばれるのを制御、制限、あるいは抑制する膜、ゲル、あるいは濾過材料を含み、その一方で、ＡＣ／ＤＣ電界、溶質分子、緩衝液、および他の小分子がチャンバーを通過することができる。

様々な実施形態において、デバイスの様々な構成が可能である。例えば、デバイスは、例えば、ＡＣ動電学を可能にするために反復する不平等電界を作るように構成された正方形または長方形のパターンで電極のより大きなアレイを含む。例示目的のためだけに、適切な電極アレイは、限定されないが、１０ｘ１０電極構成、５０ｘ５０電極構成、１０ｘ１００電極構成、２０ｘ１００電極構成、あるいは２０ｘ８０電極構成を含み得る。

そのようなデバイスは、限定されないが、多重化電極およびチャンバー付きのデバイス、再構成可能な電界パターンを作ることができるデバイス、ＤＣ電気泳動プロセスと流体プロセスを組み合わせるデバイス；サンプル調製デバイス、サンプル調製、単離された核酸分子の酵素学的な操作、および、その後の検出および分析を含む診断デバイス、ラボオンチップデバイス、ポイントオブケア、ならびに他の臨床診断システムあるいはバージョンを含む。

いくつかの実施形態において、平面の白金電極アレイデバイスは、サンプル流体が流れるハウジングを含む。いくつかの実施形態では、流体は入口端部から出口端部へと流れ、随意に側方の分析物出口を含む。例示的なデバイスは複数のＡＣ電極を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、ミクロンサイズの実体あるいは細胞の組み合わせ、より大きなナノ粒子、およびより小さなナノ粒子または生体分子からなる。いくつかの例では、より大きなナノ粒子はサンプル中に分散した細胞残屑である。いくつかの実施形態において、より小さなナノ粒子は、タンパク質、より小さなＤＮＡ、ＲＮＡ、および細胞断片である。いくつかの実施形態において、平面電極アレイデバイスは、個別に制御することができるが同時に作動させることができる３つの２０ｘ２０アレイへ随意に区分される６０ｘ２０電極アレイである。随意の補助のＤＣ電極は正電荷へ切り替え可能であり、その一方で、随意のＤＣ電極は電気泳動目的のために負電荷へ切り替えられる。いくつかの例では、制御されたＡＣおよびＤＣシステムの各々は、様々な実施形態において、連続的および／またはパルス化手法の両方で使用される（例えば、各々は、比較的短時間の間隔でパルス化をオンおよびオフすることができる）。サンプルの流れの側に沿った随意の平面電極アレイは、ナノ多孔性材料（例えば、合成ポリマーのヒドロゲル）を重ね合わされると、ＡＣ ＤＥＰと同様にＤＣ電気泳動力を生成するために随意に使用される。加えて、マイクロ電気泳動分離プロセスは、ｘ−ｙ−ｚ次元でアレイの平面電極および／または補助電極を使用して、ナノポア層内で随意に実行される。

様々な実施形態において、これらの方法、デバイス、およびシステムは、１，０００Ｈｚから１００ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で、およそ１ボルトから２０００ボルトのｐｋ−ｐｋまで変動し得る電圧で；１ボルトから１０００ボルトまでのＤＣ電圧で、毎分１０マイクロリットルから毎分１０ミリリットルまでの流量で、１°Ｃから１２０°Ｃまでの温度範囲で、作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約３〜約１５ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、５〜２５ボルトｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約１〜約５０ボルト／ｃｍの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約１〜約５ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分約１０マイクロリットル〜毎分約５００マイクロリットルまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、約２０°Ｃ〜約６０°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１０ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１００ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０００Ｈｚ〜１０ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚのＡＣ周波数範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１５００ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１５００ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１０００ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜５００ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜２５０ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜１００ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、およそ１ボルト〜５０ボルトのｐｋ−ｐｋの電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜１０００ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜５００ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜２５０ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜１００ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１ボルト〜５０ボルトのＤＣ電圧で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分１０マイクロリットル〜毎分１ｍｌまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分１０マイクロリットル〜毎分５００マイクロリットルまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分１０マイクロリットル〜毎分２５０マイクロリットルまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、毎分１０マイクロリットル〜毎分１００マイクロリットルまでの流量で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、１°Ｃ〜１００°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、２０°Ｃ〜９５°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは、２５°Ｃ〜１００°Ｃの温度範囲で作動する。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、およびシステムは室温で作動する。

いくつかの実施形態において、コントローラーは、電極の各々を独立して制御する。いくつかの実施形態において、コントローラーは、ソケットおよびプラグ接続によるなどしてデバイスに外部接続されるか、あるいはデバイスハウジングと一体化される。

さらに、ロバストな電極のスケールされた断面（ｘ−ｙ次元）アレイと、ＤＥＰ、電気泳動、および流体力を組み合わせる補助電極の戦略的に置かれた（ｘ−ｙ−ｚ次元）配置と、その使用が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、臨床的に関連する量の血液、血清、血漿、あるいは他のサンプルは、より高いイオン強度および／または伝導条件下でより直接的に分析される。電極または電極の近くで生じ得るあらゆる電気化学（電気分解）反応、加熱、および無秩序な流体の運動の効果を弱めるために、ならびに、細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子、ＤＮＡ、および他の生体分子の有効な分離を実行することができるようにするために、材料（天然または合成の多孔性ヒドロゲル、膜、制御されたナノポア材料、および薄い誘電体層状材料）の１つ以上の多孔層で、ロバストな電極構造（例えば、白金、パラジウム、金など）を覆うことが本明細書で記載されている。いくつかの実施形態において、高分解能分離を達成するためにＡＣ周波数交差点を使用することに加えて、オンデバイス（オンアレイ）ＤＣ微量電気泳動法は二次的な分離に使用される。例えば、ＤＮＡナノ粒子（２０−５０ｋｂ）、高分子量ＤＮＡ（５−２０ｋｂ）、中間分子量ＤＮＡ（１−５ｋｂ）、および低分子量ＤＮＡ（０．１−１ｋｂ）断片の分離は、アレイ上のＤＣ微量電気泳動法によって遂行され得る。いくつかの実施形態において、デバイスは、様々な血液細胞、細菌、およびウイルスの同時分離、ならびに、そのようなデバイス上で同時に実行されるＤＮＡの様々な目的のために随意に細分化される。

いくつかの実施形態において、デバイスは、ハウジング、および、ヒーターまたは熱源、および／または、タンパク質分解剤を含むリザーバーを含んでいる。いくつかの実施形態において、ヒーターまたは熱源は、流体の温度を所望の温度（例えば、タンパク質を分解するのに適切な温度、約３０°Ｃ、４０°Ｃ、５０°Ｃ、６０°Ｃ、７０°Ｃなど）に増加させることができる。いくつかの実施形態において、ヒーターまたは熱源は、ＰＣＲサーモサイクラーとしての作用に適している。他の実施形態では、ヒーターまたは熱源は、一定の温度（等温条件）を維持するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質分解剤はプロテアーゼである。他の実施形態では、タンパク質分解剤は、プロテイナーゼＫであり、ヒーターまたは熱源はタンパク質分解剤を不活性化するために使用される。

いくつかの実施形態において、デバイスは、ハウジング内に複数の交流（ＡＣ）電極を含み、ＡＣ電極は、誘電泳動（ＤＥＰ）高電界と誘電泳動（ＤＥＰ）低電界領域を確立するために、選択的に電圧が印加されるように構成され得、それによって、ＡＣ動電学的効果が、デバイスの低電界領域において細胞の集中をもたらす。いくつかの実施形態において、電極は、第１のＡＣ動電学的電界領域を提供するために選択的に電圧が印加され、および、第２のＡＣ動電学的電界領域を提供するために、その後、あるいは、継続的に、選択的に電圧が印加される。例えば、電極、およびＤＥＰ電界における細胞の集中のさらなる説明は、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１４６１４３号Ａ２において見られる。

いくつかの実施形態において、デバイスは溶離剤を含む第２のリザーバーを含む。溶離剤は、デバイスから単離された細胞物質を溶離するのに適切な任意の流体である。いくつかの例では、溶離剤は水または緩衝液である。いくつかの例では、溶離剤はＤＮＡ配列決定方法に必要とされる試薬を含む。

いくつかの実施形態において、デバイスは複数のリザーバーを含み、各々のリザーバーは、デバイス中の単離された細胞物質の染色と洗浄に役立つ試薬を含んでいる。例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、プローブと色素、緩衝液、洗浄液、水、界面活性剤、および溶剤が挙げられる。

さらに、複数の交流（ＡＣ）電極を含むシステムとデバイスが本明細書で提供され、ＡＣ電極は、誘電泳動（ＤＥＰ）高電界と誘電泳動（ＤＥＰ）低電界領域を確立するために、選択的に電圧が印加されるように構成されている。いくつかの例では、ＡＣの動電学的効果は、ＤＥＰ電界の低電界領域中の細胞の集中、および／または高電界領域中の分子（例えば、核酸などの高分子）の集中（あるいは、採取または単離）をもたらす。

さらに、複数の直流（ＤＣ）電極を含むシステムとデバイスが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、複数のＤＣ電極は、アレイ全体にわたって広がっている少なくとも２つの長方形の電極を含む。いくつかの実施形態において、電極はアレイの縁に位置する。いくつかの実施形態では、ＤＣ電極はＡＣ電極間に点在する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、核酸を操作するための手段を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、酵素反応を実施する手段を含む。他の実施形態では、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅、ライゲーション反応、制限分析、核酸クローニング、転写あるいは翻訳アッセイ、あるいは他の酵素ベースの分子生物学的アッセイを実施する手段を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、核酸シーケンサーを含む。シーケンサーは随意に、限定されないが、サンガーシーケンサー、パイロシーケンサー、イオン半導体シーケンサー、ポロニーシーケンサー、ライゲーションデバイスによるシーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシングデバイス、あるいは単一分子配列決定デバイスを含む任意の適切なＤＮＡシーケンシングデバイスである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、一定の温度を維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、アレイまたはチャンバーを冷却することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、アレイまたはチャンバーを加熱することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムまたはデバイスは、サーモサイクラーを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイスは、局所的な温度制御要素を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるデバイスは、温度の感知および制御の両方を行うことができる。

いくつかの実施形態において、デバイスはさらに加熱素子あるいは熱素子を含む。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は電極の真下に位置する。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は金属を含む。いくつかの実施形態において、加熱素子あるいは熱素子は、タンタル、アルミニウム、タングステン、あるいはこれらの組み合わせを含む。通常、加熱素子あるいは熱素子によって達成される温度は、それを通る電流に比例する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、局所的な冷却素子を含む。いくつかの実施形態において、熱抵抗性の素子は、露出した電極アレイの下に直接置かれる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃと約１２０°Ｃの間の温度を達成し維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスが、約３０°Ｃ〜約１００°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。他の実施形態では、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃ〜約９５°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２５°Ｃ〜９０°Ｃ、約２５°Ｃ〜約８５°Ｃ、約２５°Ｃ〜約７５°Ｃ、約２５°Ｃ〜約６５°Ｃ、あるいは約２５°Ｃ〜約５５°Ｃの間の温度を達成および維持することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、約２０°Ｃ、約３０°Ｃ、約４０°Ｃ、約５０°Ｃ、約６０°Ｃ、約７０°Ｃ、約８０°Ｃ、約９０°Ｃ、約１００°Ｃ、約１１０°Ｃ、あるいは約１２０°Ｃの温度を達成および維持することができる。

電極
複数の交流電極は、本明細書に記載される分離プロセスに適した任意の手法で随意に構成される。例えば、電極、および／またはＤＥＰ電界における細胞の集中を含むシステムまたはデバイスのさらなる説明は、開示のために本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１４６１４３号において見られる。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される電極は、任意の適切な金属を含むことができる。いくつかの実施形態では、電極は限定されないが以下を含むことができる：アルミニウム、銅、炭素、鉄、銀、金、パラジウム、白金、イリジウム、白金イリジウム合金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、タンタル、チタン、タングステン、ポリシリコン、および酸化インジウム錫、あるいはこれらの組み合わせ、ならびに、白金シリサイド、チタンシリサイド、金シリサイド、あるいはタングステンシリサイドなどのシリサイド材料。いくつかの実施形態において、電極は、スクリーン印刷することができる導電性インクを含み得る。

いくつかの実施形態において、電極のエッジ−エッジ（Ｅ２Ｅ）対直径比は、約０．５ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約１ｍｍ〜約４ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約１ｍｍ〜約３ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約１ｍｍ〜約２ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約２ｍｍ〜約５ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約１ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約２ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約３ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約４ｍｍである。いくつかの実施形態において、Ｅ２Ｅ対直径比は、約５ｍｍである。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極はドライエッチングされる。いくつかの実施形態において、電極はウェットエッチングされる。いくつかの実施形態において、電極は、ドライエッチングとウェットエッチングの組み合わせを受ける。

いくつかの実施形態において、それぞれの電極は個々に部位制御される。

いくつかの実施形態において、電極のアレイはユニットとして制御される。

いくつかの実施形態において、パッシベーション層が使用される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は当該技術分野において知られている任意の適切な材料から形成することができる。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は窒化ケイ素を含む。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は二酸化ケイ素を含むことができる。いくつかの実施形態では、パッシベーション層は、約２．０〜約８．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約３．０〜約８．０、約４．０〜約８．０、あるいは約５．０〜約８．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態では、パッシベーション層は、約２．０〜約４．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態では、パッシベーション層は、約２．０〜約３．０の相対的な誘電率を有する。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、あるいは約４．０の相対的な誘電率を有する。

いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．５ミクロン〜８ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜５ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜４ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約１．０ミクロン〜３ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．２５ミクロン〜２ミクロンの間の厚さである。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は約０．２５ミクロン〜１ミクロンの間の厚さである。

いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、限定されないが、窒化ケイ素または二酸化ケイ素を含む、任意の適切な絶縁性の低ｋ誘電材料で構成される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、ポリアミド、炭素、ドープ窒化ケイ素、炭素ドープ二酸化ケイ素、フッ素ドープ窒化ケイ素、フッ素ドープ二酸化ケイ素、多孔性の二酸化ケイ素、あるいはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、パッシベーション層は、スクリーン印刷することができる誘電性インクを含み得る。

電極の幾可学的形状
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は、本明細書で開示される方法を実行するのに適切な任意の手法で配置され得る。

いくつかの実施形態において、電極はドット構成であり、例えば、電極は通常円形または丸い構成を含む。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約２５°〜約６０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°〜約５５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°〜約５０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３５°〜約４５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約２５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約３５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約４０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約４５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約５０°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約５５°である。いくつかの実施形態において、ドット間の配向の角度は約６０°である。

いくつかの実施形態において、電極は実質的に細長い構成である。

いくつかの実施形態において、電極は波線または非線形線に似た構成である。いくつかの実施形態において、電極のアレイは波線または非線形線の構成であり、ここで、上記構成は、リンカーによって接続される１対のドットの形状を含む反復単位を含み、ここで、ドットとリンカーは電極の境界を定義し、ここで、リンカーは、上記対のドット間の中点に向かってあるいはその中点で内部へ先細りになっており、ここで、ドットの直径は反復単位の長さに沿って最も幅広い点であり、ここで、反復単位の並列セット間のエッジからエッジまでの距離は等距離であるか、だいたい等距離である。いくつかの実施形態において、図８に描かれるように、電極は波線に似たストリップである。いくつかの実施形態において、電極の間のエッジからエッジまでの距離は、波線構成全体にわたって等距離であるか、だいたい等距離である。いくつかの実施形態において、波線の電極の使用は、本明細書で開示されるように、ＤＥＰ電界勾配の増強をもたらす。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は、平面構成である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される電極は非平面構成である。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるデバイスは、その表面上で生体分子を選択的に捕捉する。例えば、本明細書で開示されるデバイスは、例えば、ａ．核酸ハイブリッド形成；ｂ．抗体−抗原相互作用；ｃ．ビオチン−アビジン相互作用；ｄ．イオンまたは静電相互作用；または、（ｅ）これらの任意の組み合わせによって、核酸などの生体分子を捕捉し得る。したがって、本明細書に開示されるデバイスは、機能化された表面を取り込み得、これは、捕捉分子、例えば、相補的な核酸プローブ、抗体、あるいは生体分子（核酸など）を捕捉することができる他のタンパク質捕捉物、ビオチン、あるいはアビジンなどの他の相補的な標的分子を捕捉することができる他の固定捕捉物、イオン相互作用または静電相互作用によって生体分子を捕捉することができる捕捉分子、あるいはこれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、表面は、ａ．ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールＰＥＧ）；ｂ．イオンまたは静電相互作用；ｃ．界面活性剤；または、ｄ．これらの任意の組み合わせによって、非特異的な結合相互作用を最小限に抑え、および／または、阻害するように官能化される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、そのような相互作用に干渉することによって非特異的な結合相互作用を減らす添加剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ２０など、ウシ血清アルブミン、非特異的な免疫グロブリンなどの使用を含む。

いくつかの実施形態において、デバイスは、（ａ）横に並んで、（ｂ）垂直に面して、あるいは（ｃ）水平に面して配向された複数の微小電極デバイスを含む。他の実施形態では、電極は、サンドイッチされた構成であり、例えば、垂直フォーマットで互いに上に積み重ねられる。

ヒドロゲル
材料の１つ以上の層で電極構造を覆うことは、限定されないが、電極あるいはその電極の近くで生じ得る電気分解反応、加熱、および無秩序な流体の運動を含む有害な電気化学効果を弱めることができ、依然として、細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子、ＤＮＡ、および他の生体分子の有効な分離を行うことができる。いくつかの実施形態において、電極構造上で層状になっている材料は１つ以上の多孔層であり得る。他の実施形態では、１つ以上の多孔層はポリマー層である。他の実施形態では、１つ以上の多孔層はヒドロゲルである。

一般的に、ヒドロゲルは、構成解除（ｄｉｓｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）または分解することなく、電極表面で電気化学的効果を持続させることができるように、十分な機械的強さを備えていなければならず、かつ、比較的、化学的に不活性でなければならない。一般的に、ヒドロゲルは、小さな水性のイオンに対して十分に透過性であるが、生体分子を電極表面から離す。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは１つの層またはコーティングである。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは多孔性の勾配を含み、ここで、ヒドロゲル層の底部はヒドロゲル層の上部よりも大きな多孔性を有する。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは複数の層またはコーティングを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは２つのコートを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは３つのコートを含む。いくつかの実施形態において、底部（最初の）コーティングは、その後のコーティングよりも大きな多孔性を有する。いくつかの実施形態において、上部コートは第１のコーティングよりも少ない多孔性を有する。いくつかの実施形態において、上部コートは、直径で１００ピコメートルよりも大きな粒子に対するサイズカットオフとして機能する平均的な細孔直径を有する。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．００１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１．０Ｓ／ｍ〜約１０Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．０１Ｓ／ｍ〜約２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１．５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１Ｓ／ｍ〜約１．０Ｓ／ｍの導電率を有する。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは約０．１Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．２Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．３Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．４Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．５Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．６Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．７Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．８Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約０．９Ｓ／ｍの導電率を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは約１．０Ｓ／ｍの導電率を有する。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約１０ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜約２ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約１ミクロン〜約２ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、約０．５ミクロン〜約１ミクロンの厚さを有する。

いくつかの実施形態において、スピンコーティング前のヒドロゲル溶液の粘度は、約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの範囲である。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル溶液の１回のコーティングは、スピンコーティングの前で約０．７５ｃＰと５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、複数のコートヒドロゲルでは、第１のヒドロゲル溶液はスピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約１．５ｃＰの粘度を有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲル溶液は、約１ｃＰ〜約３ｃＰの粘度を有する。ヒドロゲル溶液の粘度は、溶媒中のポリマー濃度（０．１％−１０％）とポリマー分子量（１０，０００〜３００，０００）、および、溶媒の開始粘度に基づく。

いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．５ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．５ミクロン〜０．７５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲルコーティングは、約０．７５〜１ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２ミクロン〜０．５ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２〜０．４ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．２〜０．３ミクロンの厚さを有する。いくつかの実施形態において、第２のヒドロゲルコーティングは、約０．３〜０．４ミクロンの厚さを有する。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ヒドロゲルを形成する任意の適切な合成ポリマーを含む。一般的に、任意の十分に親水性および重合可能な分子は、本明細書で開示されるように使用される合成ポリマーヒドロゲルの生成において利用され得る。単量体中の重合可能な部分は、限定されないが、置換または非置換のα，β，不飽和カルボニル（二重結合は炭素に直接結合し、炭素は酸素に二重結合し、別の酸素、窒素、硫黄、ハロゲン、あるいは炭素に単結合している）；ビニル（二重結合は酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に単結合している）；アリル（二重結合は炭素に単結合し、炭素は酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に結合している）；ホモアリル（二重結合は炭素に単結合し、炭素は別の炭素に単結合し、別の炭素は、酸素、窒素、ハロゲン、リン、あるいは硫黄に単結合している）；アルキニル部分（２つの炭素原子間に三重結合が存在する）を含むアルケニル部分を含み得る。いくつかの実施形態において、アクリロイルまたはアクリルアミドの単量体、例えば、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドなどは、本明細書に開示されるようにヒドロゲルの形成に役立つ。多くの好ましいアクリルアミド単量体は、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、およびメタクリルアミドを含む。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ポリマー、例えば、エポキシドベースのポリマー、ビニルベースのポリマー、アリルベースのポリマー、ホモアリルベースのポリマー、環状無水物ベースのポリマー、エステルベースのポリマー、エーテルベースのポリマー、アルキレングリコールベースのポリマー（例えば、ポリプロピレングリコール）などを含む。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、あるいは任意の適切なアクリルアミド、あるいはビニルベースのポリマー、またはその誘導体を含む。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは蒸着によって塗布される。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によって重合される。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは可逆的な追加−断片化連鎖移動反応（ＲＡＦＴ）重合によって重合される。

いくつかの実施形態において、添加剤は、ゲルの導電率を増大させるためにヒドロゲルに加えられる。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル添加剤は、導電性ポリマー（例えば、ＰＥＤＯＴ：ＰＳＳ）、塩（例えば、塩化銅）、金属（例えば、金）、可塑剤（例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、あるいはＰＥＧ６００）、または共溶媒である。

いくつかの実施形態において、ヒドロゲルはさらに、限定されないが、ヒスチジン、ヒスチジンペプチド、ポリヒスチジン、リジン、リジンペプチド、および他のカチオン性化合物または物質を含む、ＤＮＡハイブリッドの安定性を維持するのを助ける化合物あるいは物質を含む。

誘電泳動電界
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、およびシステムは、流体物質（随意に他の物質（汚染物質、残留細胞物質など）を含む）から、細胞、粒子、および／または分子（核酸など）を採取、分離、または単離するためのメカニズムを与える。

いくつかの実施形態において、ＡＣ動電学的電界は、核酸などの生体分子を採取、分離、または単離するために生成される。いくつかの実施形態において、ＡＣ動電学的電界は誘電泳動電界である。これに応じて、いくつかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）は、本明細書に記載される方法の様々な工程で利用される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスとシステムはＤＥＰ電界などを生成することができる。特定の実施形態では、ＤＥＰは、（例えば、同時にあるいは異なるときに）細胞および／または核酸を集中させるために使用される。ある実施形態では、本明細書で記載される方法は、第１、第２、および任意のさらなる随意のＤＥＰ電界を作るために、電極のアレイに電圧を印加する工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスとシステムは、第１、第２、および任意のさらなる随意のＤＥＰ電界を作るために、電圧が印加され得る。

ＤＥＰは、不平等電界にさらされるとき、誘電体粒子上に力が加えられる現象である。本明細書に記載される方法の工程、明細書に記載されるデバイスとシステムの態様などに依存して、様々な実施形態にける誘電体粒子は、生体細胞および／または分子、例えば、核酸分子である。本明細書に記載される方法の様々な工程、あるいは、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムの態様は、様々な成分、例えば、無傷細胞あるいは他の特別の物質を単離および分離するために利用され得；さらに、ＤＥＰ電界の様々な電界領域は、本明細書に記載される方法の様々な工程、あるいはデバイスとシステムの態様で使用され得る。この誘電泳動力は、粒子を帯電することを必要としない。いくつかの例では、力の強さは、媒体、および特定の粒子の電気特性、粒子の形状および大きさ、ならびに電界の周波数に依存する。いくつかの例では、特定の周波数の電界は、粒子を選択的に操作する。本明細書に記載される特定の態様において、これらのプロセスは、（例えば、流体媒体中の）他の成分からの、あるいは互いの、細胞および／または小さな粒子（核酸分子を含む分子など）の分離を可能にする。

本明細書で提供される様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、アレイを用いて、第１のＤＥＰ電界領域と第２のＤＥＰ電界領域を生成する工程を含む。本明細書で提供される様々な実施形態において、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、アレイを用いて、第１のＤＥＰ電界領域と第２のＤＥＰ電界領域を生成することができる。いくつかの例では、第１と第２の電界領域は、１つの電界の一部である（例えば、第１と第２の領域は同時に存在するが、デバイス内および／またはアレイ上の様々な位置で見られる）。いくつかの実施形態において、第１と第２の電界領域は異なる電界である（例えば、第１の領域は第１の時間に電極を電圧で印加することにより作られ、第２の領域は第２の時間に電極を電圧で印加することにより作られる）。特定の態様では、第１のＤＥＰ電界領域は、細胞を（例えば、低電界ＤＥＰ領域へ）集中させるか単離するのに適切である。いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域は、例えば、高電界ＤＥＰ領域へ分子（例えば、核酸）などのより小さな粒子を集中させるのに適切である。いくつかの例では、本明細書に記載される方法は、第１あるいは第２のＤＥＰ電界領域のいずれかの使用を随意に除外する。

いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、第２のＤＥＰ電界領域のように、本明細書に開示されるデバイスの同じチャンバー内にある。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域と第２のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの同じ領域を占める。

いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、第２のＤＥＰ電界領域とは異なる、本明細書に開示されるデバイスあるいは完全に異なる別のデバイスの別のチャンバー内にある。

ＤＥＰ電界領域
いくつかの態様、例えば、高伝導度緩衝液（＞１００ｍＳ／ｍ）において、本明細書に記載される方法は、電極のアレイを含むデバイスに無細胞ＤＮＡを含む流体を適用する工程と、それによって、第１のＤＥＰ電界領域に無細胞ＤＮＡを集中させる工程とを含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、第１のサイズまたはサイズ範囲の無細胞ＤＮＡ断片を集中させ、第２のＤＥＰ電界領域は、第２のサイズまたはサイズ範囲の無細胞ＤＮＡ断片を集中させる。その後のまたは同時の随意な第３および第４のＤＥＰ領域は、さらに多くのサイズまたはサイズ範囲のＤＮＡ断片を採取または単離することもあれば、あるいは、タンパク質またはＲＮＡなどの生体分子を含む他の流体成分を単離することもある。

第１のＤＥＰ電界領域は、流体から細胞を集中させるのに適切な任意の電界領域であり得る。この用途について、無細胞ＤＮＡ断片は通常、電極のアレイの近くに集中する。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は誘電泳動高電界領域である。いくつかの態様、例えば、低伝導度緩衝液（＜１００ｍＳ／ｍ）において、本明細書に記載される方法は、電極のアレイを含むデバイスに無細胞ＤＮＡ断片を含む流体を適用する工程と、それによって、第１のＤＥＰ電界領域に無細胞ＤＮＡ断片あるいは他の粒子物質を集中させる工程とを含む。

高電界対低電界の捕捉は通常、流体の導電率次第であり、ここで、通常、交差点は約３００−５００ｍＳ／ｍの間である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約３００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界は、約３００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界は、約３００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、約５００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動低電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界は、約５００ｍＳ／ｍよりも大きな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界は、約５００ｍＳ／ｍよりも小さな流体導電率で実施された誘電泳動高電界領域である。

いくつかの実施形態において、第１の誘電泳動電界領域は交流によって作られる。交流は、無細胞ＤＮＡ断片を集中させるのに適切な、任意のアンペア数、電圧、周波数、およびその他同種のものを有する。いくつかの実施形態では、第１の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１０アンペアのアンペア数；１−５０ボルトのピーク−ピークの電圧；および／または、１〜１０，０００，０００Ｈｚの周期数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５−２５ボルトのピーク−ピークの電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、３−１５ｋＨｚの周波数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１−２５ボルトのピーク−ピークの電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１−１０ボルトのピーク−ピークの電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、２５−５０ボルトのピーク−ピークの電圧を有する交流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０−１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０−１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００−１０，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１０，０００−１００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００，０００−１，０００，０００Ｈｚの周波数を使用して生成される。

いくつかの実施形態において、第１の誘電泳動電界領域は直流によって作られる。直流は、細胞を集中させるのに適切な、任意のアンペア数、電圧、周波数などを有する。いくつかの実施形態では、第１の誘電泳動電界領域は、０．１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数；１０ミリボルト〜１０ボルトの電圧；および／または、１ミリ秒〜１０００秒のパルス幅と０．００１〜１０００Ｈｚのパルス周波数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００マイクロアンペア〜５００ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１ミリアンペア〜１アンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１マイクロアンペア〜１ミリアンペアのアンペア数を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜５００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒〜１００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１秒〜１０００秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、５００ミリ秒−１秒のパルス幅を有する直流を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．０１−１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、０．１−１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１−１００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。いくつかの実施形態では、第１のＤＥＰ電界領域は、１００−１０００Ｈｚのパルス周波数を使用して生成される。

いくつかの実施形態において、流体はさらに細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は細胞型の混合物を含む。例えば、血液は、赤血球および白血球を含む。いくつかの実施形態において、１つの細胞型（あるいは、サンプルを含む細胞型の合計数未満の細胞型の任意の数）は、無細胞ＤＮＡが集中するＤＥＰ電界とは異なっているＤＥＰ電界に優先的に集中する。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、特定のサイズの無細胞ＤＮＡ断片を単離あるいは分離するのに適している。いくつかの実施形態において、方法、デバイス、あるいはシステムのＤＥＰ電界は、特定のサイズの無細胞ＤＮＡ断片の、ＤＥＰ電界の電界領域への分離あるいは集中を可能にするために特別に調整される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、１つを超える電界領域を提供し、無細胞ＤＮＡの１つを超えるサイズが優先的に単離あるいは集中される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、様々なサイズの無細胞ＤＮＡ断片の、そのＤＥＰ電界領域内への単離あるいは集中を可能にするように調整可能である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＤＥＰ電界を調整する工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるデバイスまたはシステムは、ＤＥＰ電界を調整することができる。いくつかの例では、そのような調整は、所望の目的に特に適したＤＥＰを提供する際のものであり得る。例えば、アレイ、エネルギー、あるいは別のパラメータの修正は、ＤＥＰ電界を調整するために随意に利用される。より微細な分解能のための調整パラメータは、電極の直径、電極間のエッジ−エッジ距離、電圧、周期数、流体導電率、およびヒドロゲル組成物を含む。

いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの全体を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの一部を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は、電極のアレイの約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、あるいは約１０％を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＥＰ電界領域は電極のアレイの約三分の一を含む。

核酸の単離
一態様では、流体から核酸を単離するための方法が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、核酸は無細胞核酸である。いくつかの実施形態において、流体から無細胞核酸を単離するための方法が本明細書に開示され、上記方法は：ａ．デバイスに流体を塗布する工程であって、上記デバイスが電極のアレイを含む、工程；ｂ．第１のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で複数の細胞物質を集中させる工程；ｃ．第２のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で核酸を単離する工程；および、ｄ．細胞物質を洗い流す工程、を含む。いくつかの例では、残留細胞物質は低電界領域の近くに集中する。いくつかの実施形態において、残留物質はデバイスから洗い流され、および／または核酸から洗い流される。いくつかの実施形態において、核酸は第２のＡＣ動電学的電界領域に集中する。

一態様では、細胞または他の粒子物質を含む流体から核酸を単離するための方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、核酸は細胞（例えば、流体中の無細胞ＤＮＡ）の内部ではない。いくつかの実施形態において、細胞または他の粒子物質を含む流体から核酸を単離するための方法が本明細書で開示され、上記方法は：ａ．デバイスに流体を塗布する工程であって、上記デバイスが電極のアレイを含む、工程；ｂ．第１のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で複数の細胞を集中させる工程；ｃ．第２のＡＣ動電学的（例えば、誘電泳動）電界領域で核酸を単離する工程；および、ｄ．細胞を洗い流す工程、を含む。いくつかの実施形態では、上記方法はさらに、細胞を洗い流した後に、残留タンパク質を分解する工程を含む。いくつかの実施形態において、細胞は低電界領域あるいはその近くに集中し、核酸は、高電界領域あるいはその近くに集中する。いくつかの例では、細胞はデバイスから洗い流され、および／または核酸から洗い流される。

一態様では、本明細書に記載される方法、システム、およびデバイスは、流体から核酸を単離する。いくつかの実施形態では、流体は、液体、随意に水もしくは水溶液、または分散液である。いくつかの実施形態において、流体は体液を含む任意の適切な流体である。典型的な体液は、血液、血清、血漿、胆汁、乳汁、脳脊髄液、胃液、射精液、粘液、腹水、唾液、汗、涙、尿などを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、医学的な治療または診断の手順、デバイス、またはシステムの一部として、本明細書に記載される方法、システム、またはデバイスを使用して、体液から単離される。いくつかの実施形態では、流体は、流体中に可溶化および／または分散した、組織および／または細胞である。例えば、組織は、核酸が本明細書に記載される方法、デバイス、またはシステムを使用して単離可能な癌腫瘍であり得る。

いくつかの実施形態において、流体は水である。

いくつかの実施形態において、流体はさらに他の粒子物質を含み得る。そのような粒子物質は、例えば、封入体（例えば、セロイドまたはマロリー体）、細胞円柱（例えば、顆粒円柱、硝子円柱、細胞円柱、蝋様円柱、および偽円柱）、ピック体、レーヴィ体、神経原線維変化、筋原繊維形成、細胞残屑、および他の粒子物質であってもよい。いくつかの実施形態では、粒子物質は凝集タンパク質（例えば、ベータアミロイド）である。

流体は、高いまたは低い導電率を含む任意の導電率を有し得る。いくつかの実施形態では、導電率は、約１μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は、約１０μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。他の実施形態では、導電率は、約５０μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は、約１００μＳ／ｍ〜約１０ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約８ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約６ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約５ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約４ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約３ｍＳ／ｍ、約１００μＳ／ｍ〜約２ｍＳ／ｍ、および約１００μＳ／ｍ〜約１ｍＳ／ｍである。

いくつかの実施形態では、導電率は約１μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１０μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約２ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約３ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は約４ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約５ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１０ｍＳ／ｍである。さらに別の実施形態では、導電率は約１００ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は約１Ｓ／ｍである。他の実施形態において、導電率は約１０Ｓ／ｍである。

いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１μＳ／ｍである。まだ他の実施形態では、導電率は少なくとも１０μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１ｍＳ／ｍである。さらなる実施形態では、導電率は少なくとも１０ｍＳ／ｍである。まだ他の実施形態では、導電率は少なくとも１００ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は少なくとも１０Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０μＳ／ｍである。他の実施形態において、導電率は最大で１００μＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０ｍＳ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１００ｍＳ／ｍである。さらに他の実施形態では、導電率は最大で１Ｓ／ｍである。いくつかの実施形態では、導電率は最大で１０Ｓ／ｍである。

いくつかの実施形態では、流体は、１０ｍｌ未満を含む少量の液体である。いくつかの実施形態では、流体は８ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は２ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は２００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は５μｌ未満である。いくつかの実施形態では、流体は１μｌ未満である。

いくつかの実施形態では、デバイスに適用される、または方法において使用される、流体の量は、約１００，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１０，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１，０００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１００，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１０，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は、約１，０００未満の細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は無細胞である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、または約１分未満の時間を要する。他の実施形態において、本明細書に記載されたデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、３０分以下、約２０分以下、約１５分以下、約１０分以下、約５分以下、約２分以下、または約１分以下の時間を要する。さらなる実施形態では、本明細書に記載されたデバイス、システム、および方法を用いる、細胞または他の粒子物質を含む流体からの核酸の単離は、約１５分未満、好ましくは約１０分未満、または約５分未満の時間を要する。

いくつかの例では、細胞外ＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ断片、あるいは他の核酸（外部の細胞）は、細胞または他の粒子物質を含む流体から単離される。いくつかの実施形態では、流体は細胞を含む。いくつかの実施形態では、流体は細胞を含まない。

残留物質の除去
いくつかの実施形態において、第２のＤＥＰ電界領域での標的とされた細胞物質の集中の後、方法は、標的とされた細胞物質から残留物質を随意に洗い流す工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、標的とされた細胞物質から残留物質を洗い流すのに適している流体を含むリザーバーを随意に含むことができる。いくつかの実施形態において、標的とされた細胞物質は、電極に電圧を印加し続けることにより、第２のＤＥＰ電界領域などの電極のアレイの近くで保持される。「残留物質」とは、流体中に本来存在し、細胞中に本来存在し、手順の間に添加され、限定されないが、細胞（つまり、残留細胞物質）の溶解を含むプロセスの任意の工程を通じて作成されたものなどである。例えば、残留物質は、非溶解細胞、細胞壁断片、タンパク質、脂質、炭水化物、無機質、塩、緩衝液、血漿、および望ましくない核酸を含む。いくつかの実施形態において、溶解した細胞物質は、溶解時に複数の細胞から解放された残留タンパク質を含む。標的とされた細胞物質のすべてが第２のＤＥＰ電界に集中するわけではないことは起こりうる。いくつかの実施形態では、一定量の標的とされた細胞物質は、残留物質を用いて洗い流される。

いくつかの実施形態では、残留物質は、任意の適切な流体、例えば、水、ＴＢＥ緩衝液などで洗い流される。いくつかの実施形態では、残留物質は、任意の適切な量の流体で洗い流されるか、任意の適切な時間洗い流されるか、２種類以上の流体を用いて洗い流されるか、または他の任意のバリエーションである。いくつかの実施形態では、残留物質を洗い流す方法は、標的とされた細胞物質の単離の望ましいレベルに関連し、高純度の標的とされた細胞物質は、より厳重な洗い流しおよび／または洗浄を必要とする。他の実施形態において、残留物質を洗い流す方法は、特定の出発物質およびその組成物に関連する。いくつかの例では、脂質が多い出発物質は、脂質を可溶化するのに適切な疎水性流体を伴う、洗い流し手順を必要とする。

いくつかの実施形態では、方法は、残留タンパク質を含む残留物質を分解する工程を含む。いくつかの実施形態では、デバイスまたはシステムは、残留タンパク質を含む残留物質を分解可能である。例えば、タンパク質は、１つ以上の化学分解（例えば、酸加水分解）および酵素学的な分解により分解される。いくつかの実施形態では、酵素学的な分解剤はプロテアーゼである。他の実施形態において、タンパク質分解剤はプロテイナーゼＫである。残留物質の分解の随意の工程は、任意の適切な時間、温度などで実施される。いくつかの実施形態では、分解された残留物質（分解タンパク質を含む）は、核酸から洗い流される。

いくつかの実施形態では、残留物質を分解するために使用される薬剤は、不活性化または分解される。いくつかの実施形態では、デバイスまたはシステムは、残留物質を分解するために使用される薬剤を分解または不活性化することができる。いくつかの実施形態では、残留物質を分解するために使用される酵素は、熱（例えば、５０から９５℃で５−１５分間）により不活性化される。例えば、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を含む酵素は、熱（一般的には、１５分、７０℃）を使用して分解および／または不活性化される。残留タンパク質が酵素により分解されるいくつかの実施形態では、方法はさらに、タンパク質の分解後に、分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）を不活性化する工程を含む。いくつかの実施形態では、熱は、デバイス中の加熱モジュールにより提供される（温度範囲は、例えば３０から９５℃）。

方法の特定の工程の順序および／または組み合わせは、変更可能である。いくつかの実施形態では、デバイスまたは方法は、任意の順序または組み合わせで、特定の工程を実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、残留物質および分解タンパク質は、別のまたは同時の工程で洗い流される。すなわち、残留物質が洗い流され、その後、残留タンパク質が分解され、その後、核酸から分解されたタンパク質が洗い流される。いくつかの実施形態において、最初に残留タンパク質を分解し、その後、組み合わされた工程で核酸の残留物質と分解タンパク質の両方を洗い流す。

いくつかの実施形態において、標的とされた細胞物質はデバイス中で保持され、ＰＣＲ、あるいは、核酸を操作または増幅する他の手順などのさらなる手順で随意に使用される。いくつかの実施形態において、デバイスとシステムはＰＣＲあるいは他の任意の手順を実施することができる。他の実施形態において、標的とされた細胞物質は、デバイスから採取および／または溶離される。いくつかの実施形態において、デバイスとシステムは、デバイスまたはシステムからの標的とされた細胞物質の採取および／または溶離を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、単離された細胞物質は、（ｉ）第２の誘電泳動電界領域をオフにすること；および、（ｉｉ）溶離剤中のアレイから物質を溶離することによって、採取される。典型的な溶離剤は、水、ＴＥ、ＴＢＥ、およびＬ−ヒスチジン緩衝液を含む。

核酸およびその収率
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、デバイス、あるいはシステムは、そのような方法、デバイス、あるいはシステムから得られ得るあらゆる所望の核酸を入手、単離、または分離するために随意に利用される。本明細書に記載される方法、デバイス、およびシステムにより単離された核酸は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、およびこれらの組み合わせを含む。ＤＮＡは無細胞ＤＮＡとＤＮＡ断片を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、配列決定、または増幅、ライゲーション、あるいはクローニングを含む核酸のさらなる操作に適切な形態で単離される。

いくつかの実施形態において、単離、分離、または捕捉された核酸は、そのサイズに基づいて選択的または優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片を含む。いくつかの実施形態において、選択的または優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、および／または３００−５００ｂｐ長さである。いくつかの実施形態において、選択的または優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、または９−１０ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、選択的または優先的に単離、分離、または捕捉されるＤＮＡ断片は、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、あるいは１０００ｂｐサイズよりも大きい。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ断片は無細胞ＤＮＡ断片である。

様々な実施形態において、単離または分離される核酸は、少なくとも９９質量％の他の物質を含まず、（例えば、核酸が入手される溶解細胞からの）少なくとも９９質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも９８質量％の他の物質を含まず、少なくとも９８質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも９５質量％の他の物質を含まず、少なくとも９５質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも９０質量％の他の物質を含まず、少なくとも９０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも８０質量％の他の物質を含まず、少なくとも８０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも７０質量％の他の物質を含まず、少なくとも７０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも６０質量％の他の物質を含まず、少なくとも６０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも５０質量％の他の物質を含まず、少なくとも５０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも３０質量％の他の物質を含まず、少なくとも３０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも１０質量％の他の物質を含まず、少なくとも１０質量％の残留細胞物質を含まず、少なくとも５質量％の他の物質を含まず、あるいは、少なくとも５質量％の残留細胞物質を含まない、核酸を含む組成物である。

様々な実施形態において、核酸は任意の適切な純度を有する。例えば、ＤＮＡ配列決定手順が約２０％の残留細胞物質を有する核酸サンプルで機能し得る場合、８０％まで核酸の単離が適切である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、約８０質量％未満、約７０質量％未満、約６０質量％未満、約５０質量％未満、約４０質量％未満、約３０質量％未満、約２０質量％未満、約１０質量％未満、約５質量％未満、または約２質量％未満の非核酸の酸性物質細胞物質および／またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、約９９質量％を超える、約９８質量％を超える、約９５質量％を超える、約９０質量％を超える、約８０質量％を超える、約７０質量％を超える、約６０質量％を超える、約５０質量％を超える、約４０質量％を超える、約３０質量％を超える、約２０質量％を超える、または約１０質量％を超える核酸を含む。

核酸は、未修飾の形態、誘導体化された形態、断片化された形態、断片化されていない形態などの任意の適切な形態で単離される。いくつかの実施形態では、核酸は配列決定に適切な形態で採取される。いくつかの実施形態では、核酸は、ショットガン・シークエンシング法、増幅、または他の操作に適切な断片化された形態で採取される。核酸は、例えば、合成方法による配列決定で使用されるようなヌクレオチドなどの、ＤＮＡ配列決定手順で使用される試薬を含む溶液において、デバイスから採取されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、出発サンプルの核酸のほぼ典型である単離された核酸を結果としてもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるデバイスおよびシステムは、出発サンプルの核酸のほぼ典型であるサンプルから核酸を単離することができる。すなわち、方法により採取される、あるいは、デバイスまたはシステムにより採取することができる核酸の集団は、流体中の細胞に存在する核酸の集団に実質的に比例する。いくつかの実施形態では、本態様は、流体が、多くの細胞型の複合混合物であり、開業医が、様々な細胞型の関連する集団を判定するための核酸に基づく手順を望む用途において効果的である。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は高品質であり、および／または、ＤＮＡ配列決定などの下流の手順、ＰＣＲなどの核酸増幅、あるいはライゲーション、クローニング、またはさらなる翻訳および形質転換アッセイなどの他の核酸操作で直接使用するのに適している。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で０．０１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で０．５％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で０．１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で１％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で２％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で３％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で４％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、採取された核酸は、最大で５％のタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法によって単離された、あるいは、本明細書に記載されるデバイスによって単離され得る核酸は、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度を有する。

いくつかの実施形態において、約５０ピコグラムの核酸は、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスを使用して、約５，０００の細胞から単離される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも２０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも５０ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも７５ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも２００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも３００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも４００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも５００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１０００ピコグラムの核酸を生じさせる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法、システム、あるいはデバイスは、約５，０００の細胞から少なくとも１００００ピコグラムの核酸を生じさせる。

アッセイおよびアプリケーション
いくつかの実施形態において、特定のサイズの核酸の量を含む核酸の量は、定量化され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、例えば、核酸を標識、色素で染色するか、さもなければ、定量化、同定、および／または追跡のために核酸をタグ付けすることを含む、核酸の可視化によって定量化可能である。本明細書で開示される方法およびデバイスは、挿入色素を含む色素、抗体標識、染色、および、無細胞のバイオマーカー物質の直接的な定量化を直接的に、あるいは、蛍光顕微鏡検査法の使用を含む具現化されたデバイスとともに使用して行うことができる他の画像化分子を採用することもある。限定されないが、シアニン二量体を含む高親和性染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、微粒子、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの蛍光標識の例が使用可能である。例は、ＹＯＹＯＲ−１、ＹＯＹＯＲ−３、ＰＯＰＯＴＭ−１、ＰＯＰＯＴＭ−３、ＴＯＴＯＲ−１、およびＴＯＴＯＲ−３、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ｓｔａｉｎｓ、ＳＹＢＲ ＤＸ、ＳＹＴＯ １０、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＢＲ１４、ＳＹＴＯ−８２、および臭化エチジウムを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離された核酸を随意に増幅する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ反応は、電極のアレイあるいはそのアレイの近くで、あるいはデバイス内で行われる。いくつかの実施形態では、デバイスまたはシステムは、熱サイクルに適切なヒーターおよび／または温度制御機構を含む。

ＰＣＲは、２つの効率的な熱伝導性要素（例えば、アルミニウムまたは銀）の間に反応化学分析物を配置すること、および、ＴＥＣを使用して反応温度を調節することにより、従来の熱サイクルを使用して随意に行われる。さらなる設計は、ガラスまたは熱ポリマーなどの透過性材料を介する赤外線加熱を随意に使用する。いくつかの例では、設計は、基板を介して網状に繋げられた導電配線を含むスマートポリマーまたはスマートガラスを使用する。この導電配線は、物質の迅速な熱伝導を可能にし、および、（適切なＤＣ電圧を印加することにより）効率的なＰＣＲ反応を持続させるために必要とされる温度変化と温度勾配をもたらす。ある例では、加熱は、抵抗性チップヒーター、および温度を急速に、かつ通過する電流の量に比例して変化させる他の抵抗素子を使用して加えられる。

本明細書に開示される方法およびデバイスはさらに、核またはミトコンドリアＤＮＡ、あるいは他の標的核酸分子マーカー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む定量的リアルタイムＰＣＲ、ダイレクトＳＹＢＲ ｇｏｌｄアッセイ、ダイレクトＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ、マイクロサテライトマーカーのヘテロ結合性（ＬＯＨ）の喪失、随意に、その後の、限定されないが、キャピラリー電気泳動分析を含む電気泳動分析、次世代シーケンシングを含む配列決定および／またはクローニング、限定されないが、修飾されたセミネステッドあるいはネステッドメチル化特異的ＰＣＲを含むメチル化分析、ＤＮＡ特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ビスルフィトーム増幅（ｑＭＡＭＢＲＡ）後の微量のＤＮＡの定量化、同様に、ビーズ上のメチル化、限定されないが、随意にＰＣＲと組み合わせた、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型分析）を含む質量ベースの分析、およびデジタルＰＣＲを使用し得る。

いくつかの実施形態において、従来の蛍光光度法（ｃｃｄ、ｐｍｔ、他の光学検出器、および光学フィルター）と共に使用されて、倍の増幅はリアルタイムで、あるいは時間間隔をおいてモニタリングされる。ある例では、最終的な倍の増幅の定量化は、光学的検出を介して、ＡＦＵ（倍化を分析するために相互に関連する任意の蛍光ユニット）に変換され、あるいは、インピーダンス測定または他の電気化学的感知を介して電気信号に翻訳されたことが報告されている。

微小電極アレイの小さなサイズを考慮すると、これらの要素は微小電極アレイの周囲に随意に追加され、ＰＣＲ反応は主なサンプル処理チャンバ（ＤＥＰアレイ上）で実施され、あるいは増幅される分析物は、オンカートリッジ・ラボオンチップ処理を可能にするために流体カートリッジ内の別のチャンバーへフルイディックスによって随意に運ばれる。

いくつかの例では、光送達スキームは、光の励起および／または発光、ならびに／あるいは倍の増幅の検出を提供するために利用される。特定の実施形態では、これは、外部の構成要素を使用する必要をなくすための光導波管として、フローセル材料（アクリル（ＰＭＭＡ）環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）等のような熱のポリマー）を使用することを含む。加えて、いくつかの例では、光源−発光ダイオード−ＬＥＤ、垂直共振器面発光レーザ−ＶＣＳＥＬ、および他の照明スキームは、フローセルの内部で直接統合され、または微小電極アレイ表面上に直接構築されて、内部制御され動力が供給された光源を有する。小型のＰＭＴ、ＣＣＤ、またはＣＭＯＳ検出器もフローセルへと組み込むことができる。この最小化および小型化は、類似する従来のデバイス（すなわち、標準的なベンチトップＰＣＲ／ＱＰＣＲ／蛍光測定器）のフットプリントを低減させつつ、迅速な信号送達および検出が可能なコンパクトなデバイスを可能にする。

オンチップ増幅
いくつかの例では、シリコン微小電極アレイは、ＰＣＲに必要な熱サイクルに耐えることができる。いくつかの適用では、少量の標的核酸が移行工程中に失われ得るだけなので、オンチップＰＣＲは有利である。本明細書に記載されるデバイス、システム、またはプロセスの特定の実施形態では、複数のＰＣＲ技術の任意の１つ以上が随意に使用され、そのような技術は、以下のいずれか１つ以上を随意に含む：フローセルにおける直接的な熱サイクリング；様々な温度帯を有するマイクロチャネルを通って物質を移動させること；および、システム上で増幅され得るか、ＰＣＲ機械に移され得るＰＣＲ管へ量を移動させること。いくつかの例では、出口が不混和性流体を含むＴ字路と界面安定化剤（界面活性剤など）を含む場合に、液滴ＰＣＲは実施される。ある実施形態では、液滴は任意の適切な方法によって熱サイクルされる。

いくつかの実施形態において、増幅は、等温反応、例えば、転写増幅法、核酸配列ベース増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介性増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅、ＤＮＡのＬＡＭＰ法、等温ＭＤＡ法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅、あるいは環状ヘリカーゼ依存増幅（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用して実施される。

様々な実施形態において、増幅は、均質溶液中で、あるいはアンカードプライマー（ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を有する不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ）として実施される。後者のいくつかの実施形態において、結果として生じるアンプリコンは、より高い多重度のために表面に直接連結される。いくつかの実施形態において、アンプリコンを変性することで、電極上あるいはその電極の近くに単鎖産物を与える。その後、ハイブリダイゼーション反応は、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、突然変異、挿入／欠失、メチル化などの、遺伝子情報調べるために任意に実施される。メチル化は並行分析によって随意に決定され、ここで、１つのＤＮＡサンプルはバイサルファイト処理され、１つはバイサルファイト処理されていない。バイサルファイトは、未修飾のＣを脱プリン化してＵにする。メチル化Ｃは、いくつかの例において影響を受けない。いくつかの実施形態において、対立遺伝子特異的塩基伸長が、対象の塩基を報告するために使用された。

特定の相互作用ではなく、表面は、捕捉のための非特異的部分で随意に修飾される。例えば、表面は、ポリカチオン（つまり、ポリリシン）で修飾され、逆バイアス（−Ｖ）によって遊離することができるＤＮＡ分子を捕捉することができる。いくつかの実施形態において、表面への修飾は、表面にわたって均一であるか、あるいは電極領域または非電極領域を機能化するために特異的にパターン化される。ある実施形態では、これは、フォトリソグラフィー、電気化学的活性化、スポッティングなどを用いて遂行される。

いくつかの用途では、チップは複数の領域を含む場合があり、各領域は、特定のサイズあるいは異なるサイズのＤＮＡ断片を捕捉するように構成される。チップ領域は、選択的に様々な領域の様々なサイズの断片を捕捉するために、電圧、アンペア数、周期数、ピッチ、電極の直径、ウェルの深さ、あるいは他の要因に対して時々変化することがある。いくつかの実施形態において、各領域は複数の電極のアレイを含む。

様々な実施形態において、デバイスまたは領域は、順次にあるいは平行して実行される。いくつかの実施形態において、複数のチップ設計を使用して、収集された物質のサイズ範囲を狭くし、バンドパスフィルターを作る。いくつかの例では、現在のチップの幾可学的形状（例えば、２００ｕｍの中心間のピッチの直径８０ｕｍの電極（８０／２００））は、（例えば、約１０Ｖｐｐおよび１０ｋＨｚの電圧および周波数の条件を使用して）５００ｂｐの遮断フィルターとして機能する。そのような例では、５００ｂｐを越える核酸が捕捉され、５００ｂｐ未満の核酸は捕捉されない。代替的な電極直径およびピッチの幾可学的形状は、チップの組み合わせが所望の断片サイズを提供するように、異なる遮断サイズを有する。いくつかの例では、１００ｕｍの中心間ピッチの直径４０ｕｍの電極（４０／１００）はより低い遮断閾値を有するが、４００ｕｍの中心間のピッチの直径１６０ｕｍの電極（１６０／４００）は、同様の条件下で、８０／２００の幾可学的形状に対してより高い遮断閾値を有する。様々な実施形態において、シングルチップまたは複数のチップ上の幾可学的形状は、特定のサイズの断片または粒子を選択するために組み合わせられる。例えば、６００ｂｐの遮断チップは、溶液中に６００ｂｐ未満の核酸を残し、その後、その物質は、５００ｂｐの遮断チップ（６００ｂｐのチップに対向している）で随意に再捕捉される。これにより、５００−６００ｂｐからなる核酸集団が溶液中に残る。その後、この集団は、同じチャンバー、サイドチャンバー、あるいは他の構成で随意に増幅される。いくつかの実施形態において、サイズ選択は、単一の電極形状を使用して遂行され、ここで、＞５００ｂｐの核酸は電極上で単離され、その後、洗浄され、その後、＜６００ｂｐの核酸を遊離するために、ＡＣＥＫ高電界の強度（電圧、周期数、導電率の変化）を低減することにより、５００−６００ｂｐの上清核酸集団を結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、デバイスは、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、および／または３００−５００ｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉するように構成される。

いくつかの実施形態において、チップデバイスは、温度勾配カラムを作る下端でヒーターと垂直に配向される。ある例では、底部は変性温度であり、中部はアニーリング温度であり、上部は伸長温度である。いくつかの例では、対流が断続的にプロセスを駆動する。いくつかの実施形態において、電熱による流動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｆｌｏｗｓ）およびプロセスの加速を特にもたらす電極設計を含む、方法またはシステムが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、そのような設計が、同じデバイス上、あるいは適切に配置された別々のデバイス上に随意にある。いくつかの例では、上部での能動冷却あるいは受動冷却は、フィンまたはファン（ｆｉｎｓ ｏｒ ｆａｎｓ）などによって急な温度勾配をもたらす。いくつかの例では、本明細書に記載されるデバイスまたはシステムは、デバイス上の、あるいは反応チャンバーのモニター温度中の温度センサーを備えるか、または本明細書に記載された方法は上記センサーを使用し、そのようなセンサーは、フィードバック方式で温度を調節するために任意に使用される。いくつかの例では、そのようなセンサーは、様々な熱転写特性を有する材料と結合され、連続的および／または不連続的勾配プロファイルを作成する。

いくつかの実施形態において、増幅は一定温度で進行する（つまり、等温増幅）。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるような単離された核酸を配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸はサンガーシーケンシングあるいは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって配列決定される。いくつかの実施形態において、次世代シーケンシング方法は、限定されないが、パイロシークエンシング、イオン半導体シーケンシング、ポロニー配列決定、ライゲーションシーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ライゲーションシーケンシング、あるいは一分子シーケンシングを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される単離された核酸は、サンガーシーケンシングにおいて使用される。いくつかの実施形態において、サンガーシーケンシングは、核酸単離（ラボ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ））と同じデバイス内で行われる。サンプルの準備のためのラボ・オン・チップのワークフローおよびサンガーシーケンシングの結果は：ａ）ＡＣＥチップを使用するサンプル抽出；ｂ）標的配列のオンチップ増幅の実施；ｃ）ＡＣＥによるＰＣＲ産物の捕捉；ｄ）標的鎖を濃縮するためのサイクルシークエンスの実施；ｅ）濃縮された標的鎖の捕捉；ｆ）サンガー連鎖停止反応の実施；オンチップ多色蛍光検出を用いるキャピラリー電気泳動による、標的配列の電気泳動分離の実施の工程を組み込む。必要に応じて、核酸の洗浄、試薬の添加、および電圧を切ることが実施される。反応は、複数の捕捉ゾーンを有するシングルチップ上で、別々のチップおよび／または反応チャンバー上で実施することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、核酸上で反応を実施する（例えば、ＤＮＡあるいはＲＮＡの断片化、制限分解、ライゲーション）工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるように、反応は、アレイ上あるいはその近くで、またはデバイス内で生じる。

他のアッセイ
本明細書に開示される単離された核酸は、様々なアッセイフォーマットで利用され得る。例えば、核酸プローブまたはアンプリコンと共に扱われるデバイスは、ドットブロット分析または逆ドットブロット分析、塩基スタッキング一塩基多型（ＳＮＰ）分析、電子的なストリンジェンシー（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を用いる分析において、またはＳＴＲ分析において利用されてもよい。加えて、本明細書に開示されるそのようなデバイスは、例えば、酵素的な報告を用いる遺伝子発現解析、固定された核酸増幅などの酵素的な核酸修飾、あるいはタンパク質−核酸相互作用のためのフォーマット、または、制限エンドヌクレアーゼ切断、ｅｎｄｏ−ヌクレアーゼまたはｅｘｏ−ヌクレアーゼ切断、小溝結合タンパク質アッセイ、ターミナルトランスフェラーゼ反応、ポリヌクレオチドキナーゼもしくはホスファターゼ反応、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応、および他の核酸の結合もしくは修飾タンパク質反応を含む、固相フォーマットに適した他の核酸修飾などのためのフォーマットで利用されてもよい。

加えて、本明細書で開示されるデバイスは、免疫学的アッセイに有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、デバイスの位置は、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、あるいは他のフォーマットにより体液サンプル中の抗体を分析するために、抗原（例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、プロテオグリカン、糖タンパク質など）と関連付けられる場合がある。代替的に、デバイスの位置は、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または他のアッセイフォーマットにより、サンプル中の抗原を検出するために、抗体と共に扱われることもある。実験法あるいはｐＨ／電荷の計算によって抗体およびタンパク質の等電点を極めて容易に決定することができるので、デバイスの電子アドレッシング（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）と電子濃度の利点は、電子アドレッシングされた種あるいは分析種（ａｎａｌｙｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）が帯電するように、緩衝液のｐＨを単に調節することによって利用することができる。

いくつかの実施形態では、単離された核酸は、免疫学的アッセイ型のアレイまたは核酸アレイにおける使用に有用である。

定義および略語

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は非限定的である。例えば、「方法」は、句の意味の最も広い定義を含み、１つを超える方法であり得る。

「Ｖｐ−ｐ」はピーク−ピーク電圧である。

「ＴＢＥ」は、トリス塩基（Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ）、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含む緩衝溶液である。

「ＴＥ」は、トリス塩基およびＥＤＴＡの混合物を含む緩衝溶液である。

「Ｌ−ヒスチジン緩衝液」は、Ｌ−ヒスチジンを含む溶液である。

「ＤＥＰ」は誘電泳動の略語である。

実施例１：開示されたデバイスおよび方法ｖｓ従来の方法を使用する血漿からの無細胞ＤＮＡの単離

メーカーのプロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮＲ循環核酸精製キット（ｃａｔ＃５５１１４）を使用して、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者から１ｍｌの血漿を精製した。簡潔に言えば、プロテイナーゼＫ溶液で１ｍｌの血漿のインキュベーションを６０°Ｃで３０分間実施した。その反応物を氷上でクエンチし、全量を真空に接続されたＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムに適用した。液体をカラムに通し、３つの異なる緩衝液（それぞれ６００−７５０ｕｌ）で洗浄した。カラムを、２０，０００ｘｇで３分間遠心分離機にかけ、１０分間５６°Ｃで焼いて（ｂａｋｅｄ）、余分な液体を取り除いた。２０，０００ｘｇでの１分間の遠心分離によって、サンプルを５５μｌの溶離緩衝液において溶離した。処理時間の合計は〜２．５時間であった。

チップダイ（ｃｈｉｐ ｄｉｅ）のサイズは１０×１２ｍｍであり、６０〜８０μｍｍの直径のＰｔ電極が、１８０〜２００μｍの中心間のピッチでそれぞれ存在する。アレイを、５％のｐＨＥＭＡヒドロゲル層（エタノール溶液からのスパンキャスト（ｓｐｕｎ ｃａｓｔ）６０００ｒｐｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓの１２％のｐＨＥＭＡストック）でオーバーコーティングした。０．５ｘＰＢＳを使用して、２Ｖ ｒｍｓ、５Ｈｚ、１５秒間、チップを前処理した。緩衝液を除去し、２５μｌのＣＬＬ患者の血漿を加えた。電源を入れて、ＤＮＡを、１１Ｖｐ−ｐ、１０Ｋｈｚで３分間単離し、その後、１００μｌ／分の流量で５００μｌのＴＥ緩衝液で洗浄した。電圧を切り、フローセル量をマイクロ遠心チューブへと溶離した。処理時間の合計は、〜１０分であった。

同じプロセスを変更することなく、新鮮な全血に適用することができる。全体の希釈されていない血液のＤＮＡを抽出および精製する能力は、本明細書に開示されるチップ技術によって独自に可能になる。

メーカーのプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）に従ってＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用してＤＮＡ定量化をＱｉａｇｅｎ上で実施して、チップは溶離する（表２）。

後のゲル電気泳動、ＰＣＲ、およびサンガーシーケンシング反応は、両方の抽出技術で同様の性能を示し、チップは、血漿と同様に全血も処理することができる。マン・ホイットニーのＵ検定のノンパラメトリック統計的検定も、Ｑｉａｇｅｎおよびチップ技術を使用して、血漿から単離されたＤＮＡ量の間で実行した。ＤＮＡ精製のいずれかの方法を使用しても、統計的差異はなかった（ｐ＜０．０５、両側）。

実施例２：健康な患者および癌患者から得られた血漿からの無細胞ＤＮＡの単離および定量化

５２人の健康な患者および５３人の癌患者から血漿サンプルを得た。実施例１に記載されるような本明細書に開示されるデバイス上で、３００ｂｐより大きいサイズの無細胞ＤＮＡ断片を血漿から単離した。ＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染色を使用して標識し、４Ｘ対物レンズに取り付けられたＣＭＯＳセンサーを用いて定量化した。その後、無細胞ＤＮＡの量を、血漿１マイクロリットル当たりのピコグラムで各サンプルについて定量化した。

図１は、腺癌、扁平上皮癌、および卵巣癌の患者、ならびに健全な対照からのサンプルの結果を示す。図２は、５２人の健康な患者および５３人の癌患者（肺、乳房、卵巣、および膵臓の癌）についてのｃｆＤＮＡ濃度の比較を示す。結果は、健康な対照と比較して、癌患者における３００ｂｐ以上のサイズの断片のｃｆＤＮＡ濃度の増加を示す。

実施例３：無細胞ＤＮＡ定量化を用いた治療反応のトラッキング
ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）治療を受けているＩＶ期の腺癌を患う２人の患者の処置の過程で、血漿サンプルを得た。上記サンプルを、実施例２に記載されるように処理および分析した。結果は、図３Ａと図３Ｂに示される。図３Ａの患者はニボルマブ処置に応答せず（これは、処置の後の一定のレベルの検出されたｃｆＤＮＡによって示される）、その後、疾患の進行の兆候を示し始めた。その後、患者にアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）を投与し、それに応答した。上記応答は、ｃｆＤＮＡ濃度の減少によって示される。その結果は、患者が治療に応答するにつれて、３００ｂｐより大きなｃｆＤＮＡの濃度が減少し、疾患が進行するにつれて、３００ｂｐより大きなｃｆＤＮＡの濃度が増加することを示す。この図は、Ｙ軸上にｎｇ／ｍＬとしてｃｄＤＮＡの濃度を示し、Ｘ軸上に時間を表す。

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され、記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。当業者であれば、多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく思いつくだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

Claims (37)

1. 被験体から生体サンプルを分析するための方法であって、
   前記方法は：
   ａ）生体サンプル中の複数の核酸断片を捕捉する工程であって、複数の核酸断片が複数のサイズを含み、複数のサイズが少なくとも２５０ｂｐ長さの核酸断片を含む、工程；
   ｂ）複数の核酸を検出する工程；および、
   ｃ）少なくとも２５０ｂｐ長さの核酸断片の検出に基づいて、被験体が疾患または疾病を抱えているかを判定する工程、
   を含む、方法。
2. 核酸断片が無細胞ＤＮＡ断片および／またはエキソソームを含む、請求項１に記載の方法。
3. 複数の核酸断片を捕捉する工程は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記疾患または疾病が癌である、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
5. 前記疾患または疾病が、炎症性疾患、敗血症、心臓病、同種免疫疾患、あるいは自己免疫疾患である、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
6. 前記検出する工程が複数の核酸を定量化することを含む、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
7. 複数の核酸を定量化することは、特定のサイズまたはサイズ範囲を有するある量の核酸を定量化することを含む、請求項６に記載の方法。
8. 少なくとも１つのサイズ範囲は、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの少なくとも１つのサイズ範囲を含む、請求項７に記載の方法。
9. 複数の核酸を定量化することは、少なくとも１つのサイズに対応するある量の核酸を定量化することを含む、請求項２に記載の方法。
10. 少なくとも１つのサイズは、２５０ｂｐ〜１０ｋｂｐの間の任意の全数の塩基対の少なくとも１つのサイズを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記方法はさらに、第１のサイズまたはサイズ範囲に対応するある量の核酸を、第２のサイズまたはサイズ範囲に対応する第２の量の核酸と比較する工程を含む、請求項７−１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記方法は、核酸の量を対照と比較する工程をさらに含む、請求項６−１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記方法はさらに、第１のサイズまたはサイズ範囲に対応するある量の核酸を、対照と比較する工程を含む、請求項７−１１のいずれかに記載の方法。
14. 前記対照は、初期の被験体から、被験体が癌を患っていないと推定されるときの被験体から、健康な個体から、癌の処置を受ける前の被験体から、癌の処置を受けている被験体から、癌の処置を受けた後の被験体から得られ、あるいは、前記対照は、癌の被験体あるいは癌のない被験体を示すと決定された値である、請求項１２−１３のいずれかに記載の方法。
15. 被験体が癌を患っているかどうかを判定することは、癌の種類、癌のステージ、予後、腫瘍のサイズ、腫瘍量、癌の量の変化、腫瘍サイズの変化、腫瘍の数の変化、前癌状態、あるいは前癌症状を判定することをさらに含む、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
16. 複数の核酸断片を捕捉する工程は、ＡＣ誘電泳動電界を生成するように構成された電極を使用することを含む、請求項１−１５のいずれか１つに記載の方法。
17. 複数の核酸断片を捕捉する工程は、誘電泳動低電界領域と誘電泳動高電界領域を生成するように構成された複数の電極を使用することを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 誘電泳動低電界領域は、１ボルトから４０ボルトのピーク−ピークの電圧；および／または、５Ｈｚから５，０００，０００Ｈｚの周波数、ならびに５％から５０％までのデューティサイクルを有する交流を使用して生成される、請求項１７に記載の方法。
19. 誘電泳動高電界領域は、１ボルトから４０ボルトのピーク−ピークの電圧；および／または、５Ｈｚから５，０００，０００Ｈｚの周波数、ならびに５％から５０％までのデューティサイクルを有する交流を使用して生成される、請求項１７−１８のいずれか１つに記載の方法。
20. 複数の電極は、２５０−６００ｂｐ、２５０−６００ｂｐ、２５０−２７５ｂｐ、２７５−３００ｂｐ、３００−３２５ｂｐ、３２５−３５０ｂｐ、３５０−３７５ｂｐ、３７５−４００ｂｐ、４００−４２５ｂｐ、４２５−４５０ｂｐ、４５０−４７５ｂｐ、４７５−５００ｂｐ、５００−５２５ｂｐ、５２５−５５０ｂｐ、５５０−５７５ｂｐ、５７５−６００ｂｐ、３００−４００ｂｐ、４００−５００ｂｐ、３００−５００ｂｐ、６００−７００ｂｐ、７００−８００ｂｐ、８００−９００ｂｐ、９００−１０００ｂｐ、１−２ｋｂｐ、２−３ｋｂｐ、３−４ｋｂｐ、４−５ｋｂｐ、５−６ｋｂｐ、６−７ｋｂｐ、７−８ｋｂｐ、８−９ｋｂｐ、および／または９−１０ｋｂｐ長さの核酸断片を選択的に捕捉するように構成される、請求項１６−１９のいずれか１つに記載の方法。
21. 複数の電極はヒドロゲルでコーティングされる、請求項１６−２０のいずれか１つに記載の方法。
22. 前記ヒドロゲルは合成ポリマーの２つ以上の層を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ヒドロゲルは前記電極上でスピンコーティングされる、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記ヒドロゲルは、スピンコーティングの前に約０．５ｃＰ〜約５ｃＰの粘度を有する、請求項２１−２３のいずれか１つに記載の方法。
25. 前記ヒドロゲルは、約０．１ミクロン〜１ミクロンの厚さを有する、請求項２１−２４のいずれか１つに記載の方法。
26. 電極は、プラチナ、金、アルミニウム、タンタル、砒化ガリウム、銅、銀、黄銅、亜鉛、スズ、ニッケル、ケイ素、パラジウム、チタン、黒鉛、炭素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択された材料を含む、請求項１６−２５のいずれか１つに記載の方法。
27. 前記電極は混合金属酸化物を含む、請求項１６−２６のいずれか１つに記載の方法。
28. 前記混合金属酸化物は、酸化チタン、ジルコニウムからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記方法はさらに、ＲＮＡ、ヌクレオソーム、エキソソーム、細胞外小胞、タンパク質、細胞膜断片、ミトコンドリア、あるいは細胞小胞からなる群から選択された少なくとも１つの分析物を検出する工程を含む、請求項１−２８のいずれか１つに記載の方法。
30. 生体サンプルは、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１−２９のいずれか１つに記載の方法。
31. 前記生体サンプルは細胞を含み、前記方法は前記細胞を溶解する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 捕捉された核酸断片を溶離する工程をさらに含む、請求項１−３１のいずれか１つに記載の方法。
33. 核酸断片を配列決定する工程をさらに含む、請求項１−３２のいずれか１つに記載の方法。
34. ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、方法の診断力または予測力あるいは精度を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％増加させる、請求項１−３３のいずれか１つに記載の方法。
35. ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、偽陽性率を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％減少させる、請求項１−３４のいずれか１つに記載の方法。
36. ＤＮＡ断片を捕捉する効率の増加は、偽陰性率を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％減少させる、請求項１−３５のいずれか１つに記載の方法。
37. 前記方法の実行は、０．６０〜０．７０、０．７０〜０．７９、０．８０〜０．８９、あるいは０．９０〜１．００の範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）を特徴とする、請求項１−３６のいずれか１つに記載の方法。

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