KR20230169070A - 바이오마커의 검출 및 발견을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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KR20230169070A
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cancer
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라자람 크리시난
로버트 터너
사라잘 주안 파블로 히네스트로사
진 루이스
이리나 클락
데이비드 시어슨
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바이오로지컬 다이나믹스, 인크.
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Abstract

본원에서는 질환의 위험과 연관된 바이오마커를 발견하기 위한 방법 및 시스템 및 질환 예후 및 진행을 검출하기 위해 확인된 바이오마커를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

바이오마커의 검출 및 발견을 위한 방법 및 시스템
상호 참조
본 출원은 2021년 1월 12일 출원된 미국 가출원 제63/136,572호, 2021년 5월 19일 출원된 미국 가출원 제63/190,719호, 및 2021년 5월 21일 출원된 미국 가출원 제63/191,886호의 이익을 주장하고, 상기 출원들은 각각 그 전문이 본원에서 인용에 의해 포함된다.
배경
질환 상태를 검출, 모니터링 및 치료하기 위한 바이오마커의 발견 및 사용은 환자에게 개선된 결과를 제공할 가능성을 보여준다. 질환에는 종종 복잡한 병인이 있는 바, 질환을 검출, 모니터링 및 치료하기 위한 바이오마커를 선택하는 것은 도전과제가 된다. 예를 들어, 초기 단계의 국재화된 종양은 종종 외과적 절제로 치유된다. 그러나, 일부 치명적인 암은 증상이 거의 없어 진단이 지연된다. 초기 단계의 암 검출은 생존율을 높이면서, 치료를 단순화함으로써 이 분야를 변화시킬 수 있다.
요약
한 측면에서, 질환 상태와 연관된 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 상기 방법은 (a) AC 유전영동장(dielectrophoretic field)을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 질환 상태를 앓는 것으로 알려진 개체의 제1 생물학적 샘플 중 제1 복수의 분석물을 단리하는 단계; (b) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 건강한 개체의 제2 생물학적 샘플 중 제2 복수의 분석물을 단리하는 단계; 및 (c) 제1 복수의 분석물의 서브세트를 확인하는 단계로서, 여기서 서브세트는 제2 생물학적 샘플과 비교하여 제1 생물학적 샘플에서 정량적으로 상이하고, 여기서 서브세트는 질환 상태와 연관이 있는 것으로 확인되는 것인 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 단리하는 단계는 낮은 유전영동장 영역 및 높은 유전영동장 영역을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 단리하는 단계는 하나 이상의 전극에서 제1 복수의 분석물 또는 제2 복수의 분석물을 포획하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 서브세트는 제1 복수의 분석물 및 제2 복수의 분석물의 질량 분석법 분석을 포함한다. 일부 경우에서, 서브세트를 확인하는 단계는 제1 복수의 분석물 및 제2 복수의 분석물을 각각 정량화하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 분석물은 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 분석물 핵산을 포함한다. 일부 경우에서, 분석물은 엑소좀을 포함한다. 일부 경우에서, 질환 상태는 암, 신경계 질환, 감염, 또는 염증성 질환이다. 일부 경우에서, 암은 췌장암, 난소암, 방광암, 결장직장암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 유방암, 피부암, 림프종, 설암, 입암(mouth cancer), 인두암, 구강암(oral cavity cancer), 식도암, 위암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 항문직장암, 간암, 간내 담관암, 담낭암, 담도암, 소화기암, 후두암, 기관지암, 호흡기암, 골암, 관절암, 연조직암, 심장암, 흑색종, 비상피 피부암, 자궁암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 생식기암, 고환암, 신장암, 신우암, 요관암, 비뇨기암, 안암, 안와암, 신경계암, 내분비암, 갑상선암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 또는 백혈병이다.
또 다른 측면에서, (a) 개체로부터의 생물학적 샘플 중 분석물의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 분석물의 양이 대조군 샘플에서 관찰되는 양보다 더 많거나, 또는 더 적을 때, 개체는 질환 발병 위험이 있는 개체인 것으로 확인되는 것인 단계로서, 여기서 분석물은 본원에 제공된 임의의 방법에서 확인되는 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 분석 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 측정하는 단계는 AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 생물학적 샘플 중 분석물을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 단리하는 단계는 낮은 유전영동장 영역 및 높은 유전영동장 영역을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 단리하는 단계는 하나 이상의 전극에서 제1 복수의 분석물 또는 제2 복수의 분석물을 포획하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 측정하는 단계는 분석물의 질량 분석법 분석을 포함한다. 일부 경우에서, 분석물은 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 경우에서, 분석물은 핵산을 포함한다. 일부 경우에서, 분석물은 엑소좀을 포함한다. 일부 경우에서, 질환은 암, 신경계 질환, 감염, 또는 염증성 질환이다. 일부 경우에서, 암은 췌장암, 난소암, 방광암, 결장직장암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 유방암, 피부암, 림프종, 또는 백혈병이다.
추가 측면은 (a) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 질환 상태를 앓는 것으로 알려진 개체의 제1 생물학적 샘플 중 제1 복수의 분석물을 단리하는 단계; (b) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하여 건강한 개체의 제2 생물학적 샘플 중 제2 복수의 분석물을 단리하는 단계; 및 (c) 제1 복수의 분석물의 서브세트를 확인하는 단계로서, 여기서 서브세트는 제2 생물학적 샘플과 비교하여 제1 생물학적 샘플에서 정량적으로 상이하고, 여기서 서브세트는 약물 발견 또는 약물 개발을 위한 치료 표적으로서 확인되는 것인 단계를 포함하는, 치료 표적을 확인하는 방법을 제공한다.
인용에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 인용에 의해 포함되는 것으로 명시된 것과 같은 정도로 본원에서 인용에 의해 포함된다.
도면의 간단한 설명
특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 필요한 요금 청구 및 납부시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 자세히 기술된다. 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명, 및 하기와 같이 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 수 있게 될 것이다:
도 1은 (좌측) 검정 카트리지의 경사진 상면도; (가운데) 전극에서 떨어진 샘플로부터 분리된 혈액 세포의 시각화; 및 (좌측) 전극 상의 DNA 및 세포외 소포의 시각화를 보여주는 것이다.
도 2는 바이오마커 분석에 대한 워크플로우를 보여주는 것이다: (좌측) 전극 상에서 단리된 바이오마커, (가운데) 분석하고자 하는 다양한 바이오마커; 및 (우측) 오프 칩 또는 온 칩 하류 분석에 대한 모달리티.
도 3은 세포로부터 핵산을 단리하는 방법의 예를 보여주는 것이다.
도 4는 세포를 포함하는 유체로부터 세포외 핵산을 단리하는 방법의 예를 보여주는 것이다.
도 5는 바이오마커 발견을 위한 흐름도를 보여주는 것이다.
도 6은 (좌측) 췌장암 환자로부터 단리된 엑소좀 단백질의 클러스터 다이어그램, (우측) 건강한 대조군과 비교하여 췌장암에서 과다발현 및 과소발현된 바이오마커의 히트 맵을 보여주는 것이다.
도 7은 공지된 암 환자 및 건강한 대조군으로부터의 샘플을 이용하는 다중 암 검사에서 사용된 피험체를 보여주는 것이다.
도 8은 공지된 암 환자 및 건강한 대조군으로부터의 샘플을 이용하는 다중 암 검사의 결과를 보여주는 것이다.
도 9a-9c는 실험 개요를 보여주는 것이다. 도 9a는 워크플로우 다이어그램을 보여주는 것이다. 도 9b는 EXPLORE 테스트를 개발하고, 그의 성능을 평가하기 위한 통계적 접근법을 보여주는 것이다: 개발(훈련 세트, 피험체 중 67%) 및 성능 평가(테스트 세트, 피험체 중 33%)를 위해 무작위로 선택된 피험체에 대한 100회 반복을 사용하였다. 도 9c는 피험체 ID별로 EXPLORE 테스트에 사용된 13개의 엑소단백질의 상대 농도를 보여주는 것이다. 농도 수준을 각 바이오마커에 대해 관찰된 최고 농도로 정규화하였고, 최저 발현은 흰색으로, 및 최고 발현은 녹색으로 도시되어 있다.
도 10a-10c는 EXPLORE 테스트의 성능을 보여주는 것이다. 도 10a는 건강한 대조군 대비 암 코호트의 ROC 곡선을 보여주는 것이다: 검은색 선은 100회 반복의 평균 곡선(회색 선)을 나타낸다. 빨간색 다이아몬드 표시는 99% 특이도를 나타낸다. 도 10b는 >99% 특이도에서 병기별로 올바르게 분류된 암 환자의 비율(민감도)을 보여주는 것이다. 도 10c는 >99% 특이도에서 암 유형에 기초하여 검출된 암 환자의 비율(민감도)을 보여주는 것이다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 11a-11c는 암 서브타입에 대하여 >99%(상단), 97%(중간) 및 95%(하단)에서 검출된 EXPLORE 테스트 비율을 보여주는 것이다. 도 11a는 21명의 I기(96%, 97%, 98%) 및 23명의 II기(95%, 96%, 97%)에 대하여 검출된 췌장 관 선암종 비율을 보여주는 것이다. 도 11b는 37명의 I기(65%, 69%, 76%) 및 25명의 IA기 환자(66%, 69%, 75%) 뿐만 아니라, 22명의 I기 & II기 장액성 선암종 환자(69%, 73%, 80%)에 대하여 검출된 난소암 비율을 보여주는 것이다. 도 11c는 27명의 I기(56%, 61%, 67%), 15명의 저등급(52%, 58%, 68%), 및 33명의 고등급(50%, 54%, 62%)(I기 및 II기 모두)에 대하여 검출된 방광암 비율을 보여주는 것이다. 각 다이아몬드 표시는 평균을 나타내고, 오차 막대는 100개의 테스트 구간으로부터의 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 12a-12b는 건강한 대조군 및 암 환자로부터 단리된 엑소좀의 크기 분포 및 입자 농도를 보여주는 것이다. 도 12a는 NTA 분석에 의해 입자 크기 분포에 대하여 이루어진 엑소좀 샘플의 특징화를 보여주는 것이다. 도 12b는 NTA 분석에 의해 입자 농도에 대하여 이루어진 엑소좀 샘플의 특징화를 보여주는 것이다. 건강한 대조군(녹색) 및 암 환자(빨간색)에 대한 중앙값 및 범위를 계산하였다.
도 13a-13b는 암 및 건강한 코호트에 대해 분석된 단백질에 대하여 정규화된 농도 값의 히트맵을 보여주는 것이다. 도 13a는 엑소단백질에 대한 히트맵을 보여주는 것이다. 도 13b는 유리 단백질에 대한 히트맵을 보여주는 것이다. 정규화는 각 마커의 전체 코호트에 걸쳐 이루어진다. 각 열은 연구 중인 피험체를 나타낸다.
도 14는 검정법에서 사용된 단백질 바이오마커의 워터폴 플롯을 보여주는 것이다. 값은 높은 값(좌측)에서 낮은 값(우측)으로 정렬된다. 각 열은 개별 환자 샘플을 나타낸다(빨간색, 암 환자; 녹색, 건강한 대조군).
도 15는 엑소단백질 및 유리 단백질을 이용한 EXPLORE 테스트 성능을 보여주는 것이다. 엑소-단백질(검은색) 또는 혈장 중 유리 단백질(주황색)로부터 도출된 단백질 농도를 사용하여 ROC 곡선을 작성하였다. AUROC는 95% 신뢰 구간으로 각 코호트에 대한 그래프에 제시되어 있다.
도 16a-16b는 단백질 수준의 상관관계를 보여주는 것이다. 도 16a는 엑소좀 단백질에 대한 피어슨(Pearson) 상관계수를 보여주는 것이다. 도 16b는 유리 단백질에 대한 피어슨 상관 계수를 보여주는 것이다.
도 17은 AC 동전기(ACE) 방법 또는 초원심분리 방법을 사용하는 EV 단리 워크플로우 개략도를 보여주는 것이다. (상단) 베리타(Verita)™ 단리 플랫폼을 이용한 워크플로우. 혈장 샘플이 동력을 공급받은 AC 동전기(ACE) 미세전극 어레이 상을 유동함에 따라 EV는 전극 상에 수집된다. 비결합된 물질을 완충제 세척으로 제거되고, 전기장은 꺼지고, EV는 완충제 내로 용출된다. (하단) 분별 초원심분리에 대한 워크플로우. 혈장 샘플을 희석하고, 저속 원심분리에 의해 큰 잔해물을 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 추가로 2 사이클의 저속 원심분리를 수행한다. 이어서, 세정된 상청액 중 EV를 2회에 걸쳐 초원심분리하고, 최종적으로 펠릿을 완충제 중에 재현탁시킨다.
도 18a-18c는 ACE 또는 분별 초원심분리에 의해 단리된 EV의 특징화를 보여주는 것이다. 도 18a는 나노입자 추적 분석에 의해 측정된 입자 크기의 분포를 보여주는 것이다. 베리타 단리된 EV, 파란색 선으로 표시; 초원심분리 단리된 EV, 회색 선으로 표시. 도 18b는 큐비트(Qubit)™ 단백질 검정법에 기초한 전체 단백질을 오염시키는 잔류물의 수준을 보여주는 것이다. 도 18c는 바이오마커 CA 19-9 및 CA 125에 대하여 제시된 대조군(좌측 박스) 및 암 사례(우측 박스) 사이의 차이를 보여주는 것이다. 상단, 베리타™ 시스템을 사용하여 단리된 EV; 하단, 분별 초원심분리에 의해 단리된 EV.
도 19는 다중 암 조기 검출을 위한 분류 알고리즘의 개발을 보여주는 것이다. 교차 검증과 함께 반복 피처 제거(RFE: Recursive Feature Elimination)를 통해 바이오마커 선택을 수행한다. 바이오마커 선택 후, 데이터세트를 훈련 세트 및 테스트 세트로 분할한다. 훈련 세트는 각 바이오마커에 대한 로지스틱 회귀에서 계수를 결정하는 데 사용되고, 테스트 세트는 "홀드 아웃" 테스트 세트에서 훈련 세트로부터의 로지스틱 회귀 적합도 성능을 평가하는 데 사용된다. 마지막으로, 성능 확인을 위해 데이터세트를 훈련 세트 및 테스트 세트로 분할하는 프로세스를 무작위로 100회 반복한다.
도 20a-20c는 EV 단백질 기반 로지스틱 분류기를 사용하여 조기 암의 존재를 검출하기 위한 전반적인 성능을 보여주는 것이다. 도 20a는 홀드 아웃 테스트 세트에서의 대조군 대비 암 사례 비교로부터의 ROC 곡선을 보여주는 것이고: 검은색 선은 100개의 독립적으로 리샘플링된 홀드 아웃 테스트 세트의 평균 곡선(회색 선)을 나타낸다. 도 20b는 > 99% 특이도에서 병기별 민감도를 보여주는 것이다. 좌측 막대는 I기 췌장암, 난소암, 및 방광암 검출에 대한 조합 민감도를 나타내고; 우측 막대는 이들 암의 II기 검출에 대한 조합 민감도를 나타낸다. 도 20c는 > 99% 특이도에서 암 유형별 민감도를 보여주는 것이다. 좌측 막대는 I기 및 II기 췌장암 검출에 대한 민감도를 나타내고; 가운데 막대는 I기 및 II기 난소암 검출에 대한 민감도를 나타내고; 우측 막대는 I기 및 II기 방광암 검출에 대한 민감도를 나타낸다. 오차 막대는 양측 95% 윌슨(Wilson) 신뢰 구간을 나타낸다.
도 21a-21c는 EV 단백질 바이오마커를 이용한 3개의 암 유형 검출에 대한 > 99% 특이도에서의 민감도를 보여주는 것이다. 도 21a는 I기 또는 II기 췌장암 검출에 대한 민감도를 보여주는 것이다. 도 21b는 I기 또는 II기 난소암 검출에 대한 민감도를 보여주는 것이다. 도 21c는 I기 또는 II기 방광암 검출에 대한 민감도를 보여주는 것이다. 오차 막대는 양측 95% 윌슨 신뢰 구간을 나타낸다.
도 22a-22c는 대조군 및 암 사례로부터의 NTA 결과 비교를 보여주는 것이다. 도 22a는 베리타 정제된 EV에 대한 입자 농도를 보여주는 것이다. 좌측 박스, 대조군 샘플로부터의 EV; 우측 박스, 암 사례로부터의 EV. 도 22b는 베리타 정제된 EV 입자, 입자 크기(중앙값)을 보여주는 것이다. 좌측 박스, 대조군 샘플로부터의 EV; 우측 박스, 암 사례로부터의 EV. 도 22c는 암 및 대조군에 대한 전반적인 입자 크기 분포를 보여주는 것이다. 상부 선, 대조군 샘플로부터의 EV; 하부 선, 암 사례로부터의 EV.
도 23a-23b는 베리타™ 또는 분별 초원심분리를 사용하여 단리된 EV 사이의 비교를 보여주는 것이다. 도 23a는 대조군에 대해, 및 난소암, 방광암, 및 췌장암 샘플에 대해 제시된 입자 크기 분포를 보여주는 것이다. 파란색 선, 베리타 단리된 EV; 회색 선, 초원심분리 단리된 EV. 도 23b는 선백된 샘플에 대한 단백질 바이오분석기 전기영동도를 보여주는 것이다. 파란색 점선은 알부민의 단백질 크기 범위(50 내지 60 kDa)를 나타내고, 녹색 점선은 피브리노겐에 대한 동일한 범위(70-85 Da)를 나타내고, 청록색 점선은 IgG(140-180 kDa)에 대한 동일한 범위를 나타낸다.
도 24a-24b는 암 및 대조군 사례에 대해 분석된 단백질에 대한 정규화된 농도 값의 히트맵을 보여주는 것이다. 도 24a는 엑소-단백질을 보여주는 것이다. 도 24b는 유리 단백질을 보여주는 것이다. 정규화는 각 마커에 대해 전체 코호트에 걸쳐 이루어지고; 각 열은 연구 중인 피험체를 나타낸다.
도 25는 모델에서 선택된 모든 바이오마커에 걸쳐 대조군 및 암 사례에 대한 EV 단백질 농도의 비교를 보여주는 것이다. 대조군, 좌측 박스; 암 사례, 우측 박스.
도 26은 로지스틱 분류기 모델에서 선택된 바이오마커에 대한 피어슨 상관 계수를 보여주는 것이다.
도 27은 EV 단백질과 유리 단백질 사이의 ROC 비교를 보여주는 것이다. ROC 곡선은 로지스틱 분류기 모델에서 선택된 바이오마커를 사용하여 엑소-단백질(검은색 선) 또는 유리 단백질(주황색 선)에서 도출된 단백질 농도를 사용하여 작성하였다.
도 28a-28b는 입자 농도가 공지된 상태에서 K2EDTA 혈장으로 스파이킹된 EV를 이용한 검정법의 성능을 보여주는 것이다. (a) 3개의 상이한 입자 농도에서 H1975 EV에서 측정된 CA 19-9의 농도는 투입에 따라 선형 반응을 나타낸다. EV가 스파이킹되지 않는 K2EDTA 혈장은 무시할 수 있는 농도의 마커를 보여주었다. (b) K2EDTA 혈장으로 스파이킹된 EV 유형을 기반으로 예상되는 단백질의 정량적 검출. H1975 세포 EV, 빨간색 마커; HeLa 세포 EV, 파란색 마커.
도 29a-29b는 단백질 수준의 피어슨 상관관계를 보여주는 것이다. 도 29a는 EV 단백질을 보여주는 것이다. 도 29b는 유리 단백질을 보여주는 것이다.
상세한 설명
전이성 암은 치명적이며, 예를 들어, 췌장암은 5년 생존율이 ~3%로 참담한, 가장 치명적인 암 중 하나이다. 실제로, 췌장 관 선암종(PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma)은 곧 미국에서 모든 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이 될 것이다. 대조적으로, 국소 질환 진단을 받은 소수의 환자(11%)의 경우, 5년 생존율은 ~40%이다. 초기 병기 질환과 진행 병기 질환 사이의 이러한 생존율의 큰 차이는 췌장암에만 특별한 것이다. 국소 질환을 앓는 여성 중 ~15%는 놀랍게도 93%인 반면, 전이성 난소 암종의 경우, 5년 생존율은 <31%이다. 외과적 관리와 보조 요법을 사용해도 진행성 질환을 앓는 여성의 80%에서 재발이 일어나고, 그 후에는 악성 종양의 치료가 더 이상 기대되지 않는다. 유사하게, 방광암에서 방광벽의 내층 너머로 확산되지 않은 질환 검출 결과, 5년 생존율은 96%이다. 중요한 것은 조기 발견이 삶의 질에 미치는 영향을 제한한다는 점인데, 이는 외과적 개입은 경요도 방광 종양 절제만을 수반할 수 있는 반면, 더 침습적인 암은 전체 방광의 근치적 제거가 필요할 수 있기 때문이다.
다수의 다른 악성종양과 마찬가지로, 이들 3개의 암에 대해 승인받은 스크리닝 방식은 없다. 여러 새로운 혈액 기반 다중 암 검출 검정법은 기계 학습을 DNA 돌연변이/메틸화 및/또는 단백질 바이오마커와 조합함으로써 이들 암의 조기 검출을 해결하려고 시도한다. 그러나, 광범위한 스크리닝을 구현하는 데 필요한 특이도 (>99%)에서 상기 시험 중 다수는 I-II기 암에 대해 0%만큼 낮은 민감도를 입증하였다(문헌 [Liu, M.C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology 31, 745-759 (2020)]; [Cohen, J.D., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 359, 926-930 (2018)]). 최근, 엑소좀(세포 간 소통을 매개하는 세포외 소포)에 결합된 단백질이 폐암 및 췌장암 확인에 위한 유망한 바이오마커인 것으로 나타났다 (문헌 [Hoshino, A., et al. Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. Cell 182, 1044-1061.e1018 (2020)]). 그러나, 엑소좀 단리를 위해서는 하루 동안의 번거로운 초원심분리 프로세스가 요구된다. 본원에서 제공되는 방법은 교류 동전기 기반 플랫폼인 베리타(Verita)™를 사용하여 단리된 엑소좀(문헌 [Hinestrosa, J.P., et al. Simultaneous Isolation of Circulating Nucleic Acids and EV-Associated Protein Biomarkers From Unprocessed Plasma Using an AC Electrokinetics-Based Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 8(2020)]) 및 프로빙된 엑소좀 보유 단백질(엑소-단백질)을 사용하는 것을 포함하며, 이를 통해 < 2 hr의 워크플로우로 췌장암 및 뇌암을 검출할 수 있다.
본원에서는 I기 및 II기 암 확인을 위해 다중 암 검출 시험에서 사용하기 위한 순환 마커, 예컨대, 혈장 엑소좀과 연관된 단백질을 이용하는 시스템 및 방법을 제공한다. 일부 경우에서, 본원의 방법은 췌장암, 난소암 및 방광암의 검출에 유용하다. 일부 경우에서, 본원의 방법은 조기 검출이 높은 임상적 가치를 제공하게 되는 것으로 암 검출에서 유용하다. 본원의 방법은 일부 경우에서, 0.95(95% 신뢰 구간(CI: Confidence Interval) = 0.94-0.97)의 곡선하 면적(AUC: area under the curve)으로 초기 단계의 질환의 신뢰할 수 있는 검출을 나타낸다. 일부 경우에서, 99% 특이도에서, I기 질환의 검출 비율은 췌장암에서는 97%, 난소암에서는 65%(IA기의 경우, 66%), 및 방광암에서는 56%에 달하였다.
본원에서 질환 상태와 연관된 바이오마커를 발견하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다.
본원에서는 또한 질환의 위험이 있는 개체를 확인 또는 개체에서 질환의 예후 또는 진행을 확인하는 데 유용한 복수의 바이오마커를 제공한다.
일부 측면에서, 방법, 장치 또는 시스템은 생물학적 복합체, 예를 들어, 소포, 예컨대, 세포외 소포, 엑소좀, 미세소포, 외피 입자, 및 다른 복합 입자, 또는 DNA, RNA, 단백질, 지질 및 다른 생물학적 분자를 비롯한, 생물학적 성분의 조합을 포함하는 생물학적 파슬(parcel)로부터의 바이오마커의 단리 및/또는 확인하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템은 생물학적 샘플로부터 단리된 엑소좀으로부터 바이오마커(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질 또는 세포막 단편)를 단리한다.
일부 실시양태에서, 방법, 장치 또는 시스템은 하기 단계: 제1 유전영동장 영역(예컨대, 높은 DEP 장 영역)에서 엑소좀을 농축시키는 단계, 및 엑소좀으로부터 바이오마커(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질, 또는 세포막 단편)를 단리하는 단계 중 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법, 장치 또는 시스템은 하기 단계: 제1 유전영동장 영역(예컨대, 낮은 DEP 장 영역)에서 더 큰 미립자(예컨대, 세포)를 농축시키는 단계, 제2 유전영동장 영역(예컨대, 높은 DEP 장 영역)에서 엑소좀을 농축시키는 단계, 세포 및 잔류 물질을 세척하는 단계, 및 엑소좀으로부터 바이오마커를 단리하는 단계 중 하나 이상의 단계를 포함한다. 본 방법은 또한 임의적으로 하기 단계: 엑소좀으로부터 잔류 (예컨대, 세포성) 물질을 세척하거나, 또는 다르게는 제거하는 단계(예컨대, 엑소좀은 어레이의 높은 DEP 장 영역에서 농축시키고, 유지시키면서, 물 또는 완충제로 어레이를 세정하는 단계), 임의적으로 잔류 단백질을 분해시키는 단계(예컨대, 용해된 세포 및/또는 다른 공급원으로부터의 잔류 단백질, 상기 분해는 열, 프로테아제, 또는 화학물질과 같은 임의의 적합한 메커니즘에 따라 발생한다), 분해된 단백질을 핵산으로부터 플러싱하는 단계, 및 엑소좀을 수집하는 단계 중 하나 이상의 단계를 수행할 수 있는 장치 및/또는 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치의 작동, 및 시스템의 작동의 결과는 임의적으로 추가 분석(예컨대, 질량 분광법, DNA 시퀀싱)에 적합한 정량 및 순도의 단리된 미립자(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질, 세포막 단편을 포함하는 엑소좀)이다.
예시적인 워크플로우가 도 2에 제시되어 있다. 유전영동을 이용하여 크기 범위가 미리 결정된 바이오마커를 단리하고, 포획되는 분석물로는 엑소좀, (엑소좀 단백질, RNA 및 엑소좀 DNA), 무세포 DNA, 메틸화 마커, 및/또는 혈장 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단리된 바이오마커는 칩으로부터 용출되거나, 또는 칩에서 검출된 후 분석된다. 더욱 상세한 워크플로우는 도 5에 제시되어 있다. 암, 신경계 질환 또는 감염성 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 질환 상태의 환자로부터의 샘플은 세포외 소포(또는 엑소좀) 및 무세포 DNA를 단리함으로써 분석된다. 세포외 소포로부터의 핵산 및 무세포 DNA는 게놈 프로파일링에 의해 분석된다. 세포외 소포로부터의 단백질은 프로테오믹 방법을 사용하여 분석된다. 상기 분석물 및 건강한 대조군으로부터의 분석물이 분석될 것이며, 일부 경우에서, 머신 러닝 또는 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 새로운 바이오마커를 발견한다. 바이오마커의 분석은 도 6에 제시된 바와 같이 기능적 클러스터링 및 발현 비교(예를 들어, 히트 맵)를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 방법은 짧은 시간 내에 수행되고, 장치가 짧은 시간 내에 작동되며, 시스템이 짧은 시간 내에 작동된다는 점에서 이롭다. 일부 실시양태에서, 장치에 유체를 첨가하는 것과 단리된 핵산을 수득하는 것 사이의 시간으로부터 측정된 "절차 시간"과 관련하여 그 기간은 짧은 시간이다. 일부 실시양태에서, 절차 시간은 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만, 20분 미만, 10분 미만, 또는 5분 미만이다.
또 다른 측면에서, 장치에 유체를 첨가하는 것과 단리된 핵산을 수득하는 것 사이의 시간으로부터 사람이 반드시 절차에 참여하여야 하는 시간의 누적량으로서 측정되는 "직접 실행 시간(hands-on time)"과 관련하여 그 기간은 짧은 시간이다. 일부 실시양태에서, 직접 실행 시간은 40분 미만, 20분 미만, 10분 미만, 5분 미만, 1분 미만, 또는 30초 미만이다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 장치는 단일 베쓸을 포함하고, 본원에 기술된 시스템은 단일 베쓸을 포함하는 장치를 포함하고, 본원에 기술된 방법은 단일 베쓸에서, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 유전영동 장치에서 수행될 수 있다는 점에서 이롭다. 일부 측면에서, 상기 단일 베쓸 실시양태는 유체 취급 단계 수를 최소화하고/거나, 단시간 내에 수행된다. 일부 경우에서, 본 방법, 장치 및 시스템은 하나 이상의 원심분리 단계 및/또는 배지 교환을 사용하는 방법, 장치 및 시스템과 대조적이다. 일부 경우에서, 원심분리는 DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질, 및/또는 세포막 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 분석물 또는 바이오마커를 엑소좀으로부터 단리하는 데 필요한 직접 실행 시간량을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, 단일 베쓸 절차 또는 장치는 최소량의 소모성 시약을 사용하여 엑소좀으로부터 분석물 또는 바이오마커(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질, 및/또는 세포막 단편)를 단리한다.
장치 및 시스템
일부 실시양태에서, 본원에서는 유체로부터 엑소좀 유래 바이오마커를 수집하기 위한 장치를 기술한다. 한 측면에서, 본원에서는 세포를 포함하는 유체, 유체의 무세포 부분, 또는 다른 미립자 물질로부터 바이오마커를 수집하기 위한 장치를 기술한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 세포성 물질을 단리하기 위한 장치로서, a. 하우징; b. 히터 또는 열원 및/또는 단백질 분해제를 포함하는 저장소; 및 c. 하우징 내의 복수의 교류(AC: alternating current) 전극으로서, AC 전극은 높은 AC 동전기 장 영역 및 낮은 AC 동전기 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성되고, 이로써, AC 동전기 효과는 장치의 낮은 장 영역에서 세포를 농축시키는 것인 복수의 AC 전극을 포함하는 것인 장치를 개시한다. 일부 실시양태에서, 복수의 전극은 높은 유전영동장 영역 및 낮은 유전영동장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 단백질 분해제는 프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 단백질 분해제는 프로테이나제 K이다. 일부 실시양태에서, 장치는 용리제를 포함하는 제2 저장소를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 교류(AC) 전극이 높은 AC 동전기 장 영역 및 낮은 AC 동전기 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된 복수의 AC 전극; 및 b. 열순환할 수 있고, PCR 또는 다른 효소 반응을 수행할 수 있는 모듈을 포함하는 장치를 개시한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 교류(AC) 전극이 높은 AC 동전기 장 영역 및 낮은 AC 동전기 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된 복수의 AC 전극; 및 b. AC 전극에 의해 포획되거나, 또는 단리된 물질을 영상화할 수 있는 모듈을 포함하는 장치를 개시한다. 일부 실시양태는 또한 포획된 물질의 시각화를 허용하는, 시약 첨가 및 제거를 위한 챔버 및 유체공학적 성질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 전극은 높은 유전영동장 영역 및 낮은 유전영동장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 장치는 생물학적 샘플 포함 유체로부터 무세포 DNA 및 DNA 단편을 비롯한 DNA, RNA, 뉴클레오솜, 엑소좀, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포를 단리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 생물학적 샘플 중 세포로부터 상기 물질을 단리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 PCR 증폭 또는 다른 효소 반응을 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 챔버에서 DNA가 단리되고, PCR 또는 다른 효소 반응이 수행된다. 일부 실시양태에서, 단일 챔버의 다중 영역에서 DNA가 단리되고, PCR 또는 다른 효소 반응이 수행된다. 일부 실시양태에서, 다중 챔버에서 DNA가 단리되고, PCR 또는 다른 효소 반응이 수행된다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 추가 분석(예컨대, 질량 분광법)에 의해 장치로부터 용출된다.
일부 실시양태에서, 장치는 PCR 증폭 또는 다른 효소 반응을 수행하기 위해 용출 튜브, 챔버 및 저장소 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PCR 증폭 또는 다른 효소 반응은 복수의 온도 구역을 포함하는 사행형 마이크로채널에서 수행된다. 일부 실시양태에서, PCR 증폭 또는 다른 효소 반응은 비혼화성 유체 중에 포획된 수성 액적 중에서 수행된다(즉, 디지털 PCR). 일부 실시양태에서, 열순환은 대류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 대류를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치는 전극에 접촉하거나, 전극에 근접한 표면을 포함하고, 여기서 표면은 생체분자를 선택적으로 포획할 수 있는 생물학적 리간드로 관능화된다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 교류(AC) 전극이 높은 AC 동전기 장 영역 및 낮은 AC 동전기 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성되고, 이로써, AC 동전기 효과는 장치의 낮은 장 영역에서 세포를 농축시키는 것인 복수의 AC 전극; 및 b. 시퀀서, 열순환기 또는 단리 또는 수집된 핵산 상에서 효소 반응을 수행하기 위한 다른 장치를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 세포성 물질을 단리하기 위한 시스템을 개시한다. 일부 실시양태에서, 복수의 전극은 높은 유전영동장 영역 및 낮은 유전영동장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된다.
다양한 실시양태에서, DEP 장은 본원에 기술된 바와 같이 전극의 어레이에 선택적으로 동력을 공급함으로써 생성되거나, 또는 생성될 수 있다. 전극은 임의적으로 예컨대, 귀금속(예컨대, 백금, 백금 이리듐 합금, 팔라듐, 금 등)과 같은 금속을 비롯한 임의의 적합한 내부식성 물질로 제조된다. 다양한 실시양태에서, 전극은 적합한 DEP 및/또는 다른 동전기 장이 생성되도록 임의의 적합한 크기이고, 임의의 적합한 배향이고, 임의의 적합한 간격이고, 임의의 적합한 방식으로 동력을 공급받거나, 또는 동력을 공급받을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 전극이 개별 챔버 내에 배치되어 있고, AC DEP 장이 공극 또는 홀(hole) 구조를 통과함으로써 내부 챔부 내에서 양의 DEP 영역 및 음의 DEP 영역이 생성되는 것인, 방법, 장치 및 시스템을 기술한다. 세포성, 미세입자, 나노입자, 및 핵산 분리물을 이동시키기 위하여 원하는 양의 DEP (높은 장) 영역 및 DEP 음의 (낮은 장) 영역을 형성하는 데 다양한 기하 구조가 사용된다. 일부 실시양태에서, 공극 또는 홀 구조는 다공성 물질 (하이드로겔)을 함유하거나(또는 그로 충전되거나), 다공성 막 구조로 커버된다. 일부 실시양태에서, 전극을 개별 챔버로 분리함으로써, 상기 공극/홀 구조 DEP 장치는 전기화학적 효과, 가열, 또는 무질서한 유체 이동이 DEP 프로세스 동안 내부의 개별 챔버 내에서 발생할 가능성을 감소시킨다.
한 측면에서, 본원에서는 전극을 포함하는 장치로서, 여기서 전극이 개별 챔버 내에 배치되어 있고, DEP 장은 공극 구조를 통과함으로써 내부 챔부 내에서 생성되는 것인, 장치를 기술한다. 예시적인 장치는 복수의 전극 및 하우징 내에 전극 함유 챔버를 포함한다. PCT 특허 공보 WO 2009/146143 A2(이 특허는 상기 개시내용에 대하여 본원에 포함된다)에 추가로 기술되어 있는 바와 같이, 장치의 제어 장치는 독립적으로 전극을 제어한다.
일부 실시양태에서, 챔버형 장치는 다양한 공극 및/또는 홀 구조(나노스케일, 마이크스케일 및 심지어 마크로스케일)로 생성되고, AC/DC 전기장, 용질 분자, 완충제 및 다른 소분자는 챔버를 통해 통과할 수 있는 반면, 세포, 나노입자 또는 다른 엔티티는 내부 챔버 내로 확산 또는 수송되지 못하게 제어, 국한 또는 방지하는 막, 겔 또는 여과재를 함유한다.
다양한 실시양태에서, 장치에 대해 다양한 구성이 가능하다. 예를 들어, AC 동전기적 성질을 가능하게 하는 반복적 불균일한 전기장을 발생시키도록 구성된 사각형 또는 직사각형 패턴인 것과 같은 더 큰 전극 어레이를 포함하는 장치가 있다. 단지 예시적인 목적으로, 적합한 전극 어레이는 10x10 전극 구성, 50x50 전극 구성, 10x100 전극 구성, 20x100 전극 구성, 또는 20x80 전극 구성을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 장치는 다중화 전극 및 챔버형 장치, 재구성 가능한 전기장 패턴이 생성될 수 있도록 허용하는 장치, DC 전기영동 및 유체 프로세스를 조합하는 장치; 샘플 제조 장치, 샘플 제조, 단리된 핵산 분자의 효소적 조작 및 후속 검출 및 분석을 포함하는 진단 장치, 랩-온-칩(lab-on-chip) 장치, 현장 진단(point-of-care) 및 다른 임상학적 진단 시스템 또는 버전을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 평면형 백금 전극 어레이 장치는 샘플 유체가 유동하여 통과하게 되는 하우징을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 유입구 단부로부터, 임의적으로, 측면 분석물 배출구를 포함하는 배출구 단부로 유동한다. 예시적인 장치는 다중 AC 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 마이크로미터 크기의 엔티티 또는 세포, 더 큰 나노미립자 및 더 작은 나노미립자 또는 생체분자의 조합으로 이루어진다. 일부 경우에서, 더 큰 나노미립자는 샘플 중에 분산되어 있는 세포성 잔해물이다. 일부 실시양태에서, 더 작은 나노미립자는 단백질, 더 작은 DNA, RNA 및 세포성 단편이다. 일부 실시양태에서, 평면형 전극 어레이 장치는 개별적으로 제어되지만, 동시에 작동될 수 있는 임의적으로 3개의 20x20 어레이로 구획화된 60x20 전극 어레이이다. 임의적 DC 전극이 전기영동 목적으로 음전하로 전원이 켜지는 동안, 임의적 보조 DC 전극은 양전하로 전원이 켜질 수 있다. 일부 경우에서, 각각의 제어된 AC 및 DC 시스템은 다양한 실시양태에서 연속 및/또는 펄스 방식(예컨대, 각각은 비교적 짧은 시간 간격으로 펄스가 꺼지고 켜질 수 있다) 둘 모두로 사용된다. 나노다공성 물질(예컨대, 합성 중합체의 하이드로겔)로 오버 레이어링될 때, 샘플 유동 측면을 따라 진행되는 임의적 평면형 전극 어레이는 임의적으로 DC 전기영동력 뿐만 아니라, AC DEP를 발생시키는 데 사용된다. 추가로, 마이크로전기영동 분리 프로세스는 어레이의 평면형 전극 및/또는 x-y-z 차원의 보조 전극을 사용하여 나노포어 층 내에서 임의적으로 수행된다.
다양한 실시양태에서, 상기 방법, 장치 및 시스템은 1,000 Hz 내지 100 MHz 범위의 AC 주파수에서, 대략 1 볼트 내지 2,000 볼트 pk-pk의 범위일 수 있는 전압에서; 1 볼트 내지 1000 볼트의 DC 전압에서, 10 ㎕/분 내지 10 ml/분의 유속에서, 및 1℃ 내지 120℃ 범위의 온도에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 약 3 내지 약 15 kHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 5-25 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 약 1 내지 약 50 볼트/cm의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 약 1 내지 약 5 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 약 10 ㎕/분 내지 약 500 ㎕/분의 유속으로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 약 20℃ 내지 약 60℃ 범위의 온도에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1,000 Hz 내지 10 MHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1,000 Hz 내지 1 MHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1,000 Hz 내지 100 kHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1,000 Hz 내지 10 kHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 10 kHz 내지 100 kHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 100 kHz 내지 1 MHz 범위의 AC 주파수에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 1500 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 1500 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 1000 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 500 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 250 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 100 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 대략 1 볼트 내지 50 볼트 pk-pk의 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1 볼트 내지 1000 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1 볼트 내지 500 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1 볼트 내지 250 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1 볼트 내지 100 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 및 시스템은 1 볼트 내지 50 볼트의 DC 전압에서 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 10 ㎕/분 내지 1 ml/분의 유속으로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 0.1 ㎕/분 내지 500 ㎕/분의 유속으로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 0.1 ㎕/분 내지 250 ㎕/분의 유속으로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 0.1 ㎕/분 내지 100 ㎕/분의 유속으로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 1℃ 내지 100℃ 범위의 온도로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 20℃ 내지 95℃ 범위의 온도로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 25℃ 내지 100℃ 범위의 온도로 작동된다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치, 및 시스템은 실온에서 작동된다.
일부 실시양태에서, 제어 장치는 각 전극을 독립적으로 제어한다. 일부 실시양태에서, 제어 장치는 예컨대, 소켓 및 플러그 연결에 의하여 장치에 외부적으로 연결되거나, 또는 장치 하우징 내로 통합된다.
또한 본원에서는 견고한 전극의 스케일링된 구획화된(x-y 차원의) 어레이 및 DEP 힘, 전기영동력, 및 유동력을 조합한 보조 전극의 전략적으로 배치된(x-y-z 차원의) 배열, 및 그의 사용을 기술한다. 일부 실시양태에서, 임상학적으로 관련된 부피의 혈액, 혈청, 혈장, 또는 다른 샘플은 더 높은 이온 강도 및/또는 전도도 조건하에서 더욱 직접적으로 분석된다. 본원에서는 전극 상에서 또는 그 근처에서 발생할 수 있는 임의의 전기화학(전기분해) 반응, 가열, 및 무질서한 유체 이동의 효과를 감소시키면서, 여전히 세포, 박테리아, 바이러스, 나노입자, 엑소좀, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포, 및 다른 생체분자가 효과적으로 분리될 수 있도록 허용하는 물질(천연 또는 합성 다공성 하이드로겔, 막, 제어된 나노포어 물질, 및 박층 유전체 물질)의 하나 이상의 다공성 층에 의한 견고한 전극 구조(예컨대, 백금, 팔라듐, 금 등)를 오버레이하는 것을 기술한다. 일부 실시양태에서, 더 높은 고분해능 분리를 달성하기 위해 AC 주파수 교차점을 사용하는 것 이외에, 온-장치(온-어레이) DC 마이크로전기영동이 2차 분리에 사용된다. 예를 들어, DNA 나노미립자(20-50 kb), 고분자량 DNA(5-20 kb), 중간 분자량 DNA(1-5 kb), 및 저분자량 DNA(0.1 -1kb) 단편의 분리는 어레이 상에서 DC 마이크로전기영동을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치는 임의적으로 상기 장치에서 동시에 수행되는 상이한 혈액 세포, 박테리아 및 바이러스, 및 DNA의 동시적 분리를 목적으로 하위 구획화된다.
일부 실시양태에서, 장치는 하우징 및 히터 또는 열원 및/또는 단백질 분해제를 포함하는 저장소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히터 또는 열원은 유체의 온도를 원하는 온도로(예컨대, 단백질 분해에 적합한 온도, 약 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 등으로) 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 히터 또는 열원은 PCR 열순환기로서의 작동에 적합하다. 다른 실시양태에서, 히터 또는 열원은 일정한 온도(등온 조건)를 유지하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질 분해제는 프로테아제이다. 다른 실시양태에서, 단백질 분해제는 프로테이나제 K이고, 히터 또는 열원은 단백질 분해제를 불활성화시키는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 장치는 또한 하우징 내에 복수의 교류(AC) 전극을 포함하고, AC 전극은 높은 유전영동(DEP: dielectrophoretic) 장 영역 및 낮은 유전영동(DEP) 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성될 수 있고, 이로써, AC 동전기 효과는 장치의 낮은 장 영역에서 세포를 농축시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 선택적으로 동력을 공급받음으로써 제1 AC 동전기적 장 영역을 제공하고, 이어서 또는 연속하여 선택적으로 동력을 공급받음으로써 제2 AC 동전기적 장 영역을 제공한다. 예를 들어, 전극 및 DEP 장에서의 세포 농축에 대한 추가 설명은 PCT 특허 공보 WO 2009/146143 A2(이 특허는 상기 개시내용에 대하여 본원에 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 장치는 용리제를 포함하는 제2 저장소를 포함한다. 용리제는 장치로부터 단리된 세포성 물질을 용출시키는 데 적합한 임의의 유체이다. 일부 경우에서, 용리제는 물 또는 완충제이다. 일부 경우에서, 용리제는 DNA 시퀀싱 방법에 필요한 시약을 포함한다. 일부 경우에서, 용리제는 질량 분광 방법에 필요한 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 각 저장소가 장치에서 단리된 세포성 물질을 염색 및 세척하는 데 유용한 시약을 함유한다. 예로는 항체, 올리고뉴클레오티드, 프로브, 및 염료, 완충제, 세척액, 물, 계면활성제, 및 용매를 포함한다.
본원에서는 또한 AC 전극이 유전영동(DEP) 높은 장 영역 및 유전영동(DEP) 낮은 장 영역을 확립하기 위해 선택적으로 동력을 공급받도록 구성된, 복수의 교류(AC) 전극을 포함하는 시스템 및 장치를 제공한다. 일부 경우에서, AC 동전기 효과는 DEP 장의 낮은 장 영역에서는 세포를 농축시키고/거나, DEP 장의 높은 장 영역에서는 분자(예컨대, 거대분자, 예컨대, 핵산)를 농축(또는 수집 또는 단리)시킨다.
본원에서는 또한 복수의 직류(DC: direct current) 전극을 포함하는 시스템 및 장치를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 DC 전극은 어레이 전역에 퍼져 있는 적어도 2개의 전극을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전극은 어레이의 에지에 위치한다. 일부 실시양태에서, DC 전극은 AC 전극 사이에 산재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 핵산을 조작하기 위한 수단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 효소 반응을 수행하기 위한 수단을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 라이게이션 반응, 제한 분석, 핵산 클로닝, 전사 또는 번역 검정, 또는 다른 효소 기반 분자 생물학 검정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 핵산 시퀀서를 포함한다. 시퀀서는 임의적으로 생어(Sanger) 시퀀서, 파이로-시퀀서, 이온 반도체 시퀀서, 폴로니(polony) 시퀀서, 라이게이션 장치에 의한 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱 장치, 또는 단일 분자 시퀀싱 장치를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 DNA 시퀀싱 장치이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 일정한 온도를 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 어레이 또는 챔버를 냉각시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 어레이 또는 챔버를 가열시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 시스템 또는 장치는 열순환기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 국재화된 온도 제어 부재를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 온도 감지 및 제어, 둘 모두 가능하다.
일부 실시양태에서, 장치는 가열 또는 열적 부재를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 가열 또는 열적 부재는 전극의 아래에 위치한다. 일부 실시양태에서, 가열 또는 열적 부재는 금속을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가열 또는 열적 부재는 탄탈룸, 알루미늄, 텅스텐, 또는 그의 조합을 포함한다. 일반적으로, 가열 또는 열적 부재에 의해 달성된 온도는 이를 통해 흐르는 전류에 비례한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 국재화된 냉각 부재를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내열 부재는 노출된 전극 어레이 바로 아래에 위치한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 약 20℃ 내지 약 120℃의 온도를 달성하여 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 약 30℃ 내지 약 100℃의 온도를 달성하여 유지할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 약 20℃ 내지 약 95℃의 온도를 달성하여 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 약 25℃ 내지 약 90℃, 약 25℃ 내지 약 85℃, 약 25℃ 내지 약 75℃, 약 25℃ 내지 약 65℃ 또는 약 25℃ 내지 약 55℃의 온도를 달성하여 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치는 약 20℃, 약 30℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 70℃, 약 80℃, 약 90℃, 약 100℃, 약 110℃ 또는 약 120℃의 온도를 달성하여 유지할 수 있다.
예시적인 장치가 도 1에 제시되어 있으며, 여기서 왼쪽 패널에 DEP 전극이 있는 카트리지가 제시되어 있다. 분리 후 전극을 시각화한 결과, 혈액 세포가 전극떨어진 곳에 클러스터링되어 있을 것을 볼 수 있다(가운데 패널). 오른쪽 패널에서 DNA 및 세포외 소포는 전극에 축적되어 있는 것이 관찰된다.
전극
복수의 교류 전극은 임의적으로 본원에 기술된 분리 프로세스에 적합한 임의의 방식으로 구성된다. 예를 들어, 전극 및/또는 DEP 장에서의 세포 농축을 비롯한, 시스템 또는 장치에 대한 추가 설명은 PCT 특허 공보 WO 2009/146143(이 특허는 상기 개시내용에 대하여 본원에 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전극은 임의의 적합한 금속을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전극은 알루미늄, 구리, 탄소, 철, 은, 금, 팔라듐, 백금, 이리듐, 백금 이리듐 합금, 루테늄, 로듐, 오스뮴, 탄탈룸, 티타늄, 텅스텐, 폴리실리콘, 및 산화 인듐 주석, 또는 그의 조합 뿐만 아니라, 실리사이드 물질, 예컨대, 백금 실리사이드, 티타늄 실리사이드, 금 실리사이드, 또는 텅스텐 실리사이드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 전극은 스크린 인쇄될 수 있는 전도성 잉크를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전극의 직경 대비 에지에서 에지까지의 거리(E2E: edge to edge)의 비는 약 0.5 mm 내지 약 5 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 1 mm 내지 약 4 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 1 mm 내지 약 3 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 1 mm 내지 약 2 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 2 mm 내지 약 5 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 1 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 2 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 3 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 4 mm이다. 일부 실시양태에서, 직경 대비 E2E의 비는 약 5 mm이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전극은 건식 에칭된다. 일부 실시양태에서, 전극은 습식 에칭된다. 일부 실시양태에서, 전극에 대해 건식 에칭 및 습식 에칭의 조합이 이루어진다.
일부 실시양태에서, 각 전극은 개별적으로 부위가 제어된다.
일부 실시양태에서, 전극 어레이는 단위로서 제어된다.
일부 실시양태에서, 패시베이션 층이 사용된다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 당업계에 공지된 임의의 적합한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 질화규소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 이산화규소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 비유전율은 약 2.0 내지 약 8.0이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 비유전율은 약 3.0 내지 약 8.0, 약 4.0 내지 약 8.0 또는 약 5.0 내지 약 8.0이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 비유전율은 약 2.0 내지 약 4.0이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 비유전율은 약 2.0 내지 약 3.0이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 비유전율은 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5 또는 약 4.0이다.
일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 10 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 0.5 ㎛ 내지 8 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 1.0 ㎛ 내지 5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 1.0 ㎛ 내지 4 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 1.0 ㎛ 내지 3 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 0.25 ㎛ 내지 2 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층의 두께는 약 0.25 ㎛ 내지 1 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 질화규소 또는 이산화규소를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 적합한 절연성 저유전율 k(low k) 유전체 물질로 구성된다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 폴리아미드, 탄소, 도핑된 질화규소, 탄소 도핑된 이산화규소, 플루오린 도핑된 질화규소, 플루오린 도핑된 이산화규소, 다공성 이산화규소, 또는 그의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 패시베이션 층은 스크린 인쇄될 수 있는 유전성 잉크를 포함할 수 있다.
전극 기하 구조
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전극은 본원에 개시된 방법을 실시하는 데 적합한 임의의 방식으로 배열될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전극은 도트 구성으로 존재하고, 예컨대, 전극은 일반적으로 원형 또는 둥근형 구성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 25° 내지 약 60°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 30° 내지 약 55°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 30° 내지 약 50°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 35° 내지 약 45°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 25°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 30°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 35°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 40°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 45°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 50°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 55°이다. 일부 실시양태에서, 도트 사이의 배향 각도는 약 60°이다.
일부 실시양태에서, 전극은 실질적으로 장방형 구성으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 전극은 웨이브형 또는 비선형 라인과 유사한 구성으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 전극 어레이는 웨이브형 또는 비선형 라인 구성으로 존재하고, 여기서 구성은 링커에 의해 연결된 한 쌍의 도트 형상을 포함하는 반복 단위를 포함하고, 여기서 도트 및 링커는 전극의 경계를 정의하고, 여기서 링커는 한 쌍의 도트 사이의 중심점에서 또는 그를 향하여 안쪽으로 점점 가늘어지고, 여기서 도트의 직경은 반복 단위의 길이를 따라 가장 넓은 점이고, 여기서 반복 단위의 평행 세트 사이의 에지에서 에지까지의 거리는 등거리이거나, 또는 대략적으로 등거리이다. 일부 실시양태에서, 전극은 도 8에 제시된 바와 같이, 웨이브형 라인과 유사한 스트립이다. 일부 실시양태에서, 전극 사이의 에지에서 에지까지의 거리는 웨이브형 라인 구성 전역에서 등거리, 또는 대략적으로 등거리이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 웨이브형 라인 전극의 사용은 DEP 장 구배를 증강시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전극은 평면형 구성으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 전극은 비평면형 구성으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 장치 표면은 그의 표면 상에 생체분자를 선택적으로 포획한다. 예를 들어, 본원에 개시된 장치는 예를 들어, a. 핵산 하이브리드화; b. 항체 - 항원 상호작용; c. 비오틴 - 아비딘 상호작용; d. 이온 또는 정전기 상호작용; 또는 e. 그의 임의의 조합에 의해 생체분자, 예컨대, 핵산을 포획할 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 장치는 포획 분자, 예컨대, 상보성 핵산 프로브, 항체, 또는 생체분자(예컨대, 핵산)를 포획할 수 있는 다른 단백질 포획물, 예컨대, 아비딘과 같은 상보성 표적 분자를 포획할 수 있는 비오틴 또는 다른 고정 포획물, 이온 또는 정전기 상호작용에 의해 생체분자(예컨대, 핵산)를 포획할 수 있는 포획 분자, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 관능화된 표면을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면은 a. 중합체(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 PEG); b. 이온 또는 정전기 상호작용; c. 계면활성제; 또는 d. 그의 임의의 조합에 의한 비특이적 결합 상호작용을 최소화하고/거나, 억제하도록 관능화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 예컨대, 트윈(Tween) 20 등, 우혈청 알부민, 비특이적 면역글로블린 등과 같은, 상기 상호작용에서 간섭에 의해 비특이적인 결합 상호작용을 감소시키는 첨가제의 사용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 장치는 (a) 나란히 평평하게, (b) 수직 대향으로, 또는 (c) 수평 대향으로 배향된 복수의 미세전극 장치를 포함한다. 다른 실시양태에서, 전극은 예컨대, 수직 포맷으로 서로 상부에 적층된 것과 같은, 샌드위치 구성으로 존재한다.
하이드로겔
전극 구조에 하나 이상의 물질 층으로 오버레이하면 전극 상에서 또는 그 근처에서 발생할 수 있는 전기분해 반응, 가열, 및 무질서한 유체 이동을 포함하나, 이에 제한되지 않는 유해한 전기화학적 효과를 감소시킬 수 있으면서, 여전히 세포, 박테리아, 바이러스, 나노입자, DNA, 및 다른 생체분자를 효과적으로 분리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전극 구조 상에 적층된 물질은 하나 이상의 다공성 층일 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 다공성 층은 중합체 층이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 다공성 층은 하이드로겔이다.
일반적으로, 하이드로겔은 손상 또는 분해를 일으키지 않으면서, 전극 표면에서 전기화학적 효과를 견딜 수 있도록, 충분한 기계적 강도를 갖고, 상대적으로 화학적으로 불활성이어야 한다. 일반적으로, 하이드로겔은 작은 수성 이온에 충분히 투과성이지만, 생체분자가 전극 표면으로부터 멀리 떨어져 있도록 유지시킨다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 단일 층, 또는 코팅이다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 하이드로겔 층의 하부의 다공성이 하이드로겔 층의 상부보다 더 큰 것인, 다공성 구배를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 다중 층 또는 코팅을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔은 2개를 코트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔은 3개의 코트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하부(제1) 코팅은 후속 코팅보다 다공성이 더 크다. 일부 실시양태에서, 상부 코트는 제1 코팅보다 더 작은 다공성이 더 작고, 그를 가진다. 일부 실시양태에서, 상부 코트는 직경이 100 피코미터 초과인 입자의 크기 컷 오프로서 작용하는 평균 공극 직경을 가진다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.001 S/m 내지 약 10 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.01 S/m 내지 약 10 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 10 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 1.0 S/m 내지 약 10 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.01 S/m 내지 약 5 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.01 S/m 내지 약 4 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.01 S/m 내지 약 3 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.01 S/m 내지 약 2 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 5 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 4 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 3 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 2 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 1.5 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m 내지 약 1.0 S/m이다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.1 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.2 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.3 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.4 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.5 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.6 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.7 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.8 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 0.9 S/m이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 전도도는 약 1.0 S/m이다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 10 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 4 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 3 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.1 ㎛ 내지 약 2 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 1 ㎛ 내지 약 4 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 1 ㎛ 내지 약 3 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 1 ㎛ 내지 약 2 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔의 두께는 약 0.5 ㎛ 내지 약 1 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 스핀 코팅 이전의 하이드로겔 용액의 점도는 약 0.5 cP 내지 약 5 cP 범위이다. 일부 실시양태에서, 스핀 코팅 이전의 하이드로겔 용액의 단일 코팅의 점도는 약 0.75 cP 내지 5 cP이다. 일부 실시양태에서, 다중 코트 하이드로겔에서, 스핀 코팅 이전의 제1 하이드로겔 용액의 점도는 약 0.5 cP 내지 약 1.5 cP이다. 일부 실시양태에서, 제2 하이드로겔 용액의 점도는 약 1 cP 내지 약 3 cP이다. 하이드로겔 용액의 점도는 용매 중의 중합체 농도(0.1% -10%) 및 중합체 분자량(10,000 내지 300,000) 및 용매의 출발 점도를 기반으로 한다
일부 실시양태에서, 제1 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제1 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.5 ㎛ 내지 0.75 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제1 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.75 내지 1 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제2 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.2 ㎛ 내지 0.5 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제2 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.2 내지 0.4 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제2 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.2 내지 0.3 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 제2 하이드로겔 코팅의 두께는 약 0.3 내지 0.4 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 하이드로겔을 형성하는 임의의 적합한 합성 중합체를 포함한다. 일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 용도의 합성 중합체 하이드로겔 제조에서 임의의 충분히 친수성이고, 중합 가능한 분자가 사용될 수 있다. 단량체 중 중합 가능한 모이어티로는 이중 결합이, 산소에는 이중 결합되어 있고, 또 다른 산소, 질소, 황, 할로겐, 또는 탄소에 단일 결합되어 있는 탄소에 직접 부착되어 있는 것인 알케닐 모이어티(치환 또는 비치환된 α,β-불포화 카르보닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다); 이중 결합이 산소, 질소, 할로겐, 인 또는 황에 단일 결합되어 있는 것인 비닐; 이중 결합이, 산소, 질소, 할로겐, 인 또는 황에 단일 결합되어 있는 탄소에 단일 결합되어 있는 것인 알릴; 이중 결합이, 또 다른 탄소에 단일 결합되어 있고, 이어서, 산소, 질소, 할로겐, 인 또는 황에 단일 결합되어 있는 것인 탄소에 단일 결합되어 있는 것인 호모알릴; 2개의 탄소 원자 사이에 삼중 결합이 존재하는 알키닐 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아크릴로일 또는 아크릴아미도 단량체, 예컨대, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드 등은 본원에 개시된 하이드로겔 형성에 유용하다. 더욱 바람직한 아크릴아미도 단량체로는 아크릴아미드, N 치환된 아크릴아미드, N 치환된 메타크릴아미드, 및 메타크릴아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔은 중합체, 예컨대, 에폭시드 기반 중합체, 비닐 기반 중합체, 알릴 기반 중합체, 호모알릴 기반 중합체, 사이클릭 무수물 기반 중합체, 에스테르 기반 중합체, 에테르 기반 중합체, 알킬렌 글리콜 기반 중합체(예컨대, 폴리프로필렌 글리콜) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(pHEMA), 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 또는 임의의 적절한 아크릴아미드 또는 비닐 기반 중합체, 또는 그의 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 기상 증착에 의해 도포된다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 원자 이동 라디칼 중합화(ATRP: atom-transfer radical-polymerization)을 통해 중합화된다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 가역적 첨가 단편화 쇄 이동(RAFT: reversible addition-fragmentation chain-transfer) 중합화를 통해 중합화된다.
일부 실시양태에서, 겔의 전도도를 증가시키기 위해 첨가제가 하이드로겔에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 하이드로겔 첨가제는 전도성 중합체(예컨대, PEDOT: PSS), 염(예컨대, 염화구리), 금속(예컨대, 금), 가소화제(예컨대, PEG200, PEG 400, 또는 PEG 600), 또는 공용매이다.
일부 실시양태에서, 하이드로겔은 또한 히스티딘, 히스티딘 펩티드, 폴리히스티딘, 리신, 리신 펩티드, 및 다른 양이온성 화합물 또는 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는, DNA 하이브리드의 안정성을 유지시키는 데 도움을 주는 화합물 또는 물질을 포함한다.
유전영동장
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치 및 시스템은 (임의적으로 다른 물질, 예컨대, 오염물질, 잔류 세포성 물질 등을 함유하는) 유체 물질로부터 세포, 입자, 및/또는 분자(예컨대, 엑소좀, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포)를 수집, 분리 및/또는 단리하는 메커니즘을 제공한다.
일부 실시양태에서, AC 동전기 장은 생체분자, 예컨대, 엑소좀, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포를 수집, 분리 또는 단리하기 위해 생성된다. 일부 실시양태에서, AC 동전기 장은 유전영동장이다. 따라서, 일부 실시양태에서 유전영동(DEP)은 본원에 기술된 방법의 다양한 단계에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 DEP 장 등을 발생시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, DEP는 (예컨대, 동시에 또는 다른 시점에) 세포 및/또는 핵산을 농축시키는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 제1, 제2 및 임의의 추가의 임의적 DEP 장을 생성하기 위해 전극 어레이에 동력을 공급하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 제1, 제2 및 임의의 추가의 임의적 DEP 장을 생성하기 위해 동력을 공급받을 수 있다.
DEP는 유전체 입자가 불균일한 전기장에 있는 경우에, 힘이 유전체 입자에 가해지는 현상이다. 본원에 기술된 방법의 단계, 본원에 기술된 장치 및 시스템의 측면 등에 의존하여, 본원의 다양한 실시양태에서 유전체 입자는 생물학적 세포 및/또는 분자, 예컨대, 핵산 분자이다. 본원에 기술된 방법의 상이한 단계 또는 본원에 기술된 장치 또는 시스템의 측면은 상이한 성분, 예컨대, 무손상 세포 또는 다른 특정 물질을 단리 및 분리시키는 데 사용될 수 있고; 추가로, DEP 장의 상이한 장 영역은 본원에 기술된 방법의 상이한 단계 또는 장치 및 시스템의 측면에서 사용될 수 있다. 이러한 유전영동력을 위해서 입자가 하전될 필요는 없다. 일부 경우에서, 그 힘의 강도는 매질 및 특이적인 입자의 전기적 특성, 입자의 형상 및 크기 뿐만 아니라, 전기장의 주파수에 의존한다. 일부 경우에서, 특정한 주파수의 장은 입자를 선택적으로 조작한다. 본원에 기술된 특정 측면에서, 상기 프로세스를 통해 (예컨대, 유체 성분 중의) 다른 성분 또는 서로로부터 세포 및/또는 더 작은 입자(예컨대, 핵산 분자를 비롯한 분자)를 분리시킬 수 있다.
본원에서 제공된 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법 또는 장치는 복수의 DEP 장 영역을 생성하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 방법 또는 장치는 어레이를 사용하는 제1 DEP 장 영역 및 제2 DEP 장 영역을 포함한다. 본원에서 제공된 다양한 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 또는 시스템은 어레이를 사용하여 제1 DEP 장 영역 및 제2 DEP 장 영역을 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 제1 및 제2 장 영역은 단일 장의 일부분이다(예컨대, 제1 및 제2 영역이 동시에 존재하지만, 이는 장치 내의 및/또는 어레이 상의 상이한 위치에서 확인된다). 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 장 영역은 상이한 장이다(예컨대, 제1 영역은 첫 번째로 전극에 동력을 공급함으로써 생성되고, 제2 영역은 두 번째로 전극에 동력을 공급함으로써 생성된다). 구체적인 측면에서, 제1 DEP 장 영역은 세포를 (예컨대, 낮은 DEP 장 영역으로) 농축 또는 단리하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 더 작은 입자, 예컨대, 분자(예컨대, 무세포 핵산을 비롯한 핵산)를 예를 들어, 높은 DEP 장 영역으로 농축시키는 데 적합하다. 일부 경우에서, 본원에 기술된 방법은 임의적으로 제1 또는 제2 DEP 장 영역 중 하나를 사용하는 것을 배제한다.
하기 기술되는 바와 같이, 일부 경우에서, 제1 DEP 장은 무세포 핵산을 비롯한 핵산을 일정 크기 초과, 일정 크기 미만, 또는 크기 범위 내의 것으로 농축 또는 단리하는 데 적합하다. 일부 경우에서, 제2 DEP 장은 무세포 핵산을 비롯한 핵산을 일정 크기 초과, 일정 크기 미만, 또는 크기 범위 내의 것으로 농축 또는 단리하는 데 적합하다. 제1 및 제2 DEP 장은 크기가 동일하거나 상이한 핵산을 농축 또는 단리하도록 구성될 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 개시된 방법 및 장치는 다양한 상이한 크기의 핵산을 평가하는 데 사용될 수 있다.
본원에서는 또한 각각의 장 영역이 적어도 하나의 다른 장 영역과 동일하거나 상이한 많은 것에서 작동하도록 구성될 수 있는 3개 이상의 DEP 장 영역을 포함하는 실시양태를 기술한다. 따라서, 실시양태는 다양한 특성에 기초하여 생물학적 샘플 중의 다양한 물질을 농축 또는 단리할 수 있다. 예를 들어, 제1 DEP 장 영역은 세포를 단리하도록 구성될 수 있고, 제2 DEP 장 영역은 500 bp 초과의 무세포 DNA를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있고, 제3 DEP 장 영역은 300 bp 내지 500 bp의 무세포 DNA를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있고, 제4 DEP 장 영역은 300 bp 미만의 무세포 DNA를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있다. 상기 실시양태 중 일부는 각각의 장 영역 내에서 단리 또는 농축된 DNA의 양을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 본원에 개시된 바와 같은 장치 중 제2 DEP 장 영역과 동일한 챔버에 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역 및 제2 DEP 장 영역은 전극 어레이의 동일 부위를 점유한다.
일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 본원에 개시된 바와 같은 장치 중 제2 DEP 장 영역과 다른 별개의 챔버에, 또는 완전히 별개인 장치에 존재한다.
제1 DEP 장 영역
일부 측면에서, 예컨대, 전도도가 높은 완충제(>100 mS/m)에서, 본원에 기술된 방법은 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체를 전극 어레이를 포함하는 장치에 적용하고, 이로써, 제1 DEP 장 영역에서 세포를 농축시키는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체를 전극 어레이를 포함하는 장치에 적용할 수 있고, 이로써, 제1 DEP 장 영역에서 세포를 농축시킬 수 있다. 후속 또는 동시의 제2, 또는 임의적 제3 및 제4 DEP 영역은 생체분자, 예컨대, 핵산을 비롯한, 다른 유체 성분을 수집 또는 단리할 수 있다.
제1 DEP 장 영역은 유체로부터 세포를 농축시키는 데 적합한 임의의 장 영역일 수 있다. 이러한 적용의 경우, 세포는 일반적으로 전극 어레이 근처에서 농축된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 낮은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 높은 유전영동장 영역이다. 일부 측면에서, 예컨대, 전도도가 낮은 완충제(<100 mS/m)에서, 본원에 기술된 방법은 세포를 포함하는 유체를 전극 어레이를 포함하는 장치에 적용하고, 이로써, 제1 DEP 장 영역에서 세포 또는 다른 미립자 물질을 농축시키는 단계를 포함한다
일부 측면에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체를 전극 어레이를 포함하는 장치에 적용할 수 있고, 제1 DEP 장 영역에서 세포를 농축시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 유체로부터 세포를 농축시키는 데 적합한 임의의 장 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 전극 어레이에서 농축된다. 일부 실시양태에서, 세포는 높은 유전영동장 영역에서 포획된다. 일부 실시양태에서, 세포는 낮은 유전영동장 영역에서 포획된다. 높은 장 포획 대 낮은 장 포획은 일반적으로 유체의 전도도에 의존하며, 일반적으로, 교차점은 약 300-500 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 300 mS/m 초과의 유체 전도도에서 수행되는 낮은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 300 mS/m 미만의 유체 전도도에서 수행되는 낮은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 300 mS/m 초과의 유체 전도도에서 수행되는 높은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 300 mS/m 미만의 유체 전도도에서 수행되는 높은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 500 mS/m 초과의 유체 전도도에서 수행되는 낮은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 500 mS/m 미만의 유체 전도도에서 수행되는 낮은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 500 mS/m 초과의 유체 전도도에서 수행되는 높은 유전영동장 영역이다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 약 500 mS/m 미만의 유체 전도도에서 수행되는 높은 유전영동장 영역이다.
일부 실시양태에서, 제1 유전영동장 영역은 교류에 의해 생성된다. 교류는 세포를 농축시키는 데 적합한 임의의 암페어수, 전압, 주파수 등을 가진다. 일부 실시양태에서, 제1 유전영동장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어-10 암페어; 전압이 1-50 볼트 피크 투 피크; 및/또는 주파수가 1-10,000,000 Hz인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전압이 5-25 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 주파수가 3-15 kHz인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 1 밀리암페어 내지 1 amp인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 100 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 500 마이크로암페어 - 500 밀리암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전압이 1-25 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전압이 1-10 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전압이 25-50 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 10-1,000,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 100-100,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 100-10,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 10,000-100,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 100,000-1,000,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다.
일부 실시양태에서, 제1 유전영동장 영역은 직류에 의해 생성된다. 직류는 세포를 농축시키는 데 적합한 임의의 암페어수, 전압, 주파수 등을 가진다. 일부 실시양태에서, 제1 유전영동장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어 - 1 암페어; 전압이 10 밀리볼트 - 10 볼트; 및/또는 펄스 폭이 1밀리초 - 1000초 및 펄스 주파수가 0.001 - 1000 Hz인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 100 마이크로암페어 - 500 밀리암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 1 밀리암페어 - 1 암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 밀리암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-500초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-100초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 펄스 폭이 1초 - 1000초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-1초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 0.01-1000 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 0.1-100 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 1-100 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 100-1000 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다.
일부 실시양태에서, 유체는 세포 유형의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 혈액은 적혈구 및 백혈구를 포함한다. 환경 샘플은 많은 유형의 세포 및 다른 미립자 물질을 광범위한 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 세포 유형(또는 샘플을 포함하는 세포 유형의 총 개수보다 적은 임의 개수의 세포 유형)이 제1 DEP 장에서 우선적으로 농축된다. 제한 없이, 상기 실시양태는 예컨대, 분변 대장균형 박테리아와 같은 특정한 환경적 오염물질 상에서 핵산 단리 절차에 초점을 맞추는 것에 유리하고, 이로써, DNA 시퀀싱은 오염물질의 공급원을 확인하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 제1 DEP 장은 특이적으로 세포가 아닌 바이러스를 농축시키는 방식으로 작동된다(예컨대, 전도도가 300 mS/m 초과인 유체에서, 높은 DEP 장 영역에서는 바이러스가 농축되는 반면, 더 큰 세포는 낮은 DEP 장 영역에서 농축될 것이다).
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템은 특정 세포 유형을 단리 또는 분리하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 방법, 장치 또는 시스템의 DEP 장은 DEP 장의 장 영역 내로 특정 유형의 세포를 분리 또는 농축할 수 있도록 특이적으로 조정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템은 1 초과의 세포 유형이 단리 또는 농축되는 1 초과의 장 영역을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템은 그의 DEP 장 영역 내에서 상이한 유형의 세포가 단리 또는 농축될 수 있도록 조정 가능하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 방법은 DEP 장을 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 장치 또는 시스템은 DEP 장을 조정할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 조정은 특히 원하는 목적에 적합화된 DEP를 제공하는 데 이루어질 수 있다. 예를 들어, DEP 장을 조정하는 데 어레이, 에너지, 또는 또 다른 파라미터의 변형이 임의적으로 사용된다. 더 미세한 분해를 위한 조정 파라미터는 전극 직경, 전극 사이의 에지에서 에지까지의 거리, 전압, 주파수, 유체 전도도 및 하이드로겔 조성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전극 어레이 전체를 포함한다. 일부 실시양태에서, DEP 장 영역은 전극 어레이 중 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전극 어레이의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 또는 약 10%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 전극 어레이의 약 ⅓을 포함한다.
제2 DEP 장 영역
제2 DEP 장 영역은 제1 DEP 장 영역과 동일하거나 상이하도록 구성될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 제2 DEP 장 영역은 제1 DEP 장 영역과 동일하거나 상이한 거대분자 및 세포성 성분을 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있다. 이는 엑소좀, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포를 비롯한 거대분자 및 세포성 성분을 포함한다.
일부 측면에서, 제1 DEP 장 영역 및 제2 DEP 장 영역은 동일한 유형의 거대분자 또는 세포성 성분의 상이한 서브세트를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 DEP 장 영역은 제1 크기 또는 제1 크기 범위의 제1 거대분자 또는 제1 세포성 성분을 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있고, 제2 DEP 장 영역은 제2 크기 또는 제2 크기 범위의 제1 거대분자 또는 제1 세포성 성분을 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있다. 한 예에서, 제1 DEP 장 영역은 300-500 bp의 무세포 DNA를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있고, 제2 DEP 장 영역은 300 bp보다 작은 무세포 DNA를 단리 또는 농축시키도록 구성될 수 있다. 따라서, 복수의 장 영역은 동일한 유형의 거대분자 또는 세포성 성분의 서브세트를 구별하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 이점에서, 복수의 장 영역을 사용하면 또한 동일한 유형의 거대분자 또는 세포 성분의 하나 이상의 서브세트를 정량화할 수 있다.
한 측면에서, (하기 제공되는 바와 같이) 세포 용해 후, 본원에 기술된 방법은 제2 DEP 장 영역에서 핵산을 농축시키는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 제2 DEP 장 영역에서 핵산을 농축시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 핵산을 농축시키는 데 적합한 임의의 장 영역이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 전극 어레이에서 농축된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 높은 유전영동장 영역이다. 제2 DEP 장 영역은 임의적으로 제1 DEP 장 영역과 동일한 것이다.
일부 실시양태에서, 제2 유전영동장 영역은 교류에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 교류는 핵산을 농축시키는 데 적합한 임의의 암페어수, 전압, 주파수 등을 가진다. 일부 실시양태에서, 제2 유전영동장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어 - 10 암페어; 전압이 1-50 볼트 피크 투 피크; 및/또는 주파수가 1 - 10,000,000 Hz인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 100 마이크로암페어 - 1 암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 500 마이크로암페어 - 500 밀리암페어인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전압이 1-25 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전압이 1-10 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전압이 25-50 볼트 피크 투 피인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 10-1,000,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 100-100,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 100-10,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 10,000-100,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 100,000-1,000,000 Hz인 주파수를 사용하여 생성된다.
일부 실시양태에서, 제2 유전영동장 영역은 직류에 의해 생성된다. 직류는 핵산을 농축시키는 데 적합한 임의의 암페어수, 전압, 주파수 등을 가진다. 일부 실시양태에서, 제2 유전영동장 영역은 암페어수가 0.1 마이크로암페어 - 1 암페어; 전압이 10 밀리볼트 - 10 볼트; 및/또는 펄스 폭이 1밀리초 - 1000초 및 펄스 주파수가 0.001 - 1000 Hz인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전압이 5-25 볼트 피크 투 피크인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 주파수가 3-15 kHz인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 1 밀리암페어 내지 1 amp인 교류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 암페인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 100 마이크로암페어 - 500 밀리암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 1 밀리암페어 - 1 암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 암페어수가 1 마이크로암페어 - 1 밀리암페어인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-500초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-100초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 펄스 폭이 1초 - 1000초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 펄스 폭이 500밀리초-1초인 직류를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 0.01-1000 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 0.1-100 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 1-100 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 100-1000 Hz인 펄스 주파수를 사용하여 생성된다.
일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전극 어레이 전체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전극 어레이 중 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전극 어레이의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 또는 약 10%를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역은 전극 어레이의 약 ⅓을 포함한다.
바이오마커 단리
일부 측면에서, 본원에서는 생물학적 복합체, 예를 들어, 소포, 예컨대, 세포외 소포, 엑소좀, 미세소포, 외피 입자, 및 다른 복합 입자, 또는 DNA, RNA, 단백질, 지질 및 다른 생물학적 분자를 비롯한, 생물학적 성분의 조합을 포함하는 생물학적 파슬로부터 바이오마커를 단리하기 위한 방법, 장치 및 시스템을 기술한다.
한 측면에서, 본원에서는 유체로부터의 엑소좀(예컨대, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 단백질, 및/또는 세포막 단편)로부터 바이오마커를 단리하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 무세포 핵산이다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 전극 어레이를 포함하는 장치에 유체를 적용하는 단계; 제1 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 복수의 엑소좀을 농축시키는 단계; 및 추가 분석(예컨대, 시퀀싱, 질량 분광법 등)을 위해 엑소좀을 장치로부터 용출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 전극 어레이를 포함하는 장치에 유체를 적용하는 단계; b. 제1 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 복수의 세포성 물질을 농축시키는 단계; c. 제2 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 핵산을 단리하는 단계; 및 d. 세포성 물질을 플러싱하는 단계를 포함하는, 유체로부터 무세포 핵산을 단리하는 방법을 개시한다. 일부 경우에서, 잔류 세포성 물질은 낮은 장 영역 근처에서 농축된다. 일부 실시양태에서, 잔류 물질은 장치로부터 세척되고/거나, 핵산으로부터 세척된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제2 AC 동전기적 장 영역에서 농축된다.
일부 실시양태에서, 바이오마커 핵산은 초기에 세포 내부에 존재한다. 도 3에 제시된 바와 같이, 본 방법은 일부 경우에서 높은 장 영역 근처에서 세포를 농축시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 전극 어레이를 포함하는 장치에 유체를 적용하는 단계; b. 제1 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 복수의 세포를 농축시키는 단계; c. 제2 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 핵산을 단리하는 단계; 및 d. 세포를 플러싱하는 단계를 포함하는, 세포를 포함하는 유체로부터 핵산을 단리하는 방법을 개시한다. 일부 경우에서, 세포는 높은 장 영역에서 용해된다. 용해 후, 핵산은 높은 장 영역에 그대로 남아 있고/거나, 높은 장 영역에서 농축된다. 일부 경우에서, 잔류 세포성 물질은 낮은 장 영역 근처에서 농축된다. 일부 실시양태에서, 잔류 물질은 장치로부터 세척되고/거나, 핵산으로부터 세척된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제2 AC 동전기적 장 영역에서 농축된다.
한 측면에서, 본원에서는 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 바이오마커를 단리하는 방법을 기술한다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 세포 내부에 존재하지 않는다(예컨대, 유체 중 무세포 DNA). 일부 실시양태에서, 본원에서는 a. 전극 어레이를 포함하는 장치에 유체를 적용하는 단계; b. 제1 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 복수의 세포를 농축시키는 단계; c. 제2 AC 동전기(예컨대, 유전영동) 장 영역에서 바이오마커(예컨대, 엑소좀, DNA, RNA, 뉴클레오솜, 세포외 소포, 단백질, 세포막 단편, 미토콘드리아 및 세포성 소포)를 단리하는 단계; 및 d. 세포를 플러싱하는 단계를 포함하는, 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 바이오마커를 단리하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 세포를 플러싱하는 단계 후 잔류 단백질을 분해하는 단계를 추가로 포함한다. 도 4는 세포를 포함하는 유체로부터 세포외 핵산을 단리하는 예시적인 방법을 보여주는 것이다. 세포, 예컨대, 소포, 예컨대, 세포외 소포, 엑소좀, 미세소포, 외피 입자, 및 다른 복합 입자, 또는 DNA, RNA, 단백질, 지질 및 다른 생물학적 분자를 비롯한, 생물학적 성분의 조합을 포함하는 생물학적 파슬로부터 다른 작은 미립자를 단리하는 데 유사한 방법이 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포는 낮은 장 영역에서 또는 그 근처에서 농축되고, 핵산(또는 다른 작은 미립자)은 높은 장 영역에서 또는 그 근처에서 농축된다. 일부 경우에서, 세포는 은 장치로부터 세척되고/거나, 핵산(또는 또는 다른 작은 미립자)으로부터 세척된다.
한 측면에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 및 장치는 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 핵산을 단리한다. 한 측면에서, 유전영동은 세포를 농축시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 유체는 액체, 임의적으로 물 또는 수성 용액 또는 분산액이다. 일부 실시양태에서, 유체는 체액을 포함하는 임의의 적합한 유체이다. 예시적인 체액으로는 혈액, 혈청, 혈장, 담즙, 젖, 뇌척수액, 위액, 사출액, 점액, 복막액, 타액, 땀, 눈물, 소변 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 의학적 치료 또는 진단 절차, 장치 또는 시스템의 부분으로서 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치를 사용하여 체액으로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 유체는 유체 중에 용해되고/거나, 분산된 조직 및/또는 세포이다. 예를 들어, 조직은 그로부터 핵산이 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템을 사용하여 단리될 수 있는 것인 암성 종양일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유체는 또한 다른 미립자 물질을 포함할 수 있다. 상기 미립자 물질은 예를 들어, 봉입체(예컨대, 세로이드 또는 말로리 소체(Mallory bodies)), 세포원주(예컨대, 과립원주, 초자원주, 세포원주, 납양원주 및 가원주), 픽소체(Pick's bodies), 루이소체(Lewy bodies), 섬유 매듭, 원섬유 형성물, 세포성 잔해물 및 다른 미립자 물질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 미립자 물질은 응집된 단백질(예컨대, 베타-아밀로이드)이다.
유체는 높은 또는 낮은 전도도를 비롯한, 임의의 전도도를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 1 μS/m 내지 약 10 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 10 μS/m 내지 약 10 mS/m이다. 다른 실시양태에서, 전도도는 약 50 μS/m 내지 약 10 mS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 약 100 μS/m 내지 약 10 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 8 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 6 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 5 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 4 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 3 mS/m, 약 100 μS/m 내지 약 2 mS/m, 또는 약 100 μS/m 내지 약 1 mS/m이다.
일부 실시양태에서, 전도도는 약 1 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 10 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 100 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 1 mS/m이다. 다른 실시양태에서, 전도도는 약 2 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 3 mS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 약 4 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 5 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 10 mS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 약 100 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 약 1 S/m이다. 다른 실시양태에서, 전도도는 약 10 S/m이다.
일부 실시양태에서, 전도도는 적어도 1 μS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 적어도 10 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 적어도 100 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 적어도 1 mS/m이다. 추가의 실시양태에서, 전도도는 적어도 10 mS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 적어도 100 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 적어도 1 S/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 적어도 10 S/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 1 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 10 μS/m이다. 다른 실시양태에서, 전도도는 최대 100 μS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 1 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 10 mS/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 100 mS/m이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전도도는 최대 1 S/m이다. 일부 실시양태에서, 전도도는 최대 10 S/m이다.
일부 실시양태에서, 유체는 10 ml 미만을 포함하는, 소량의 액체이다. 일부 실시양태에서, 유체는 8 ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 5 ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 2 ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 1 ml 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 500 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 200 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 100 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 50 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 10 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 5 ㎕ 미만이다. 일부 실시양태에서, 유체는 1 ㎕ 미만이다.
일부 실시양태에서, 장치에 적용되거나, 또는 본 방법에서 사용되는 정량의 유체는 약 100,000,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 약 10,000,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 약 1,000,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 약 100,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 약 10,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 약 1,000개 미만의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 무세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치, 시스템 및 방법을 사용하여 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 핵산을 단리하는 데에는 약 30분 미만, 약 20분 미만, 약 15분 미만, 약 10분 미만, 약 5분 미만 또는 약 1분 미만의 시간이 소요된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 장치, 시스템 및 방법을 사용하여 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 핵산을 단리하는 데에는 30분 이하, 약 20분 이하, 약 15분 이하, 약 10분 이하, 약 5분 이하, 약 2분 이하, 또는 약 1분 이하의 시간이 소요된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 장치, 시스템 및 방법을 사용하여 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 핵산을 단리하는 데에는 약 15분 미만, 바람직하게, 약 10분 미만, 또는 약 5분 미만의 시간이 소요된다.
일부 경우에서, (세포 밖의) 엑소좀, 세포외 DNA, 무세포 DNA 단편, 또는 다른 핵산은 세포 또는 다른 미립자 물질을 포함하는 유체로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 유체는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유체는 세포를 포함하지 않는다.
세포 용해
한 측면에서, 제1 유전영동장 영역에서 세포를 농축시킨 후, 본 방법은 세포로부터 핵산을 유리시키는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 세포로부터 핵산을 유리시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 DEP 장 영역에서 세포로부터 유리된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 세포를 용해시킴으로써 복수의 세포로부터 핵산을 유리시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 세포를 용해시킴으로써 복수의 세포로부터 핵산을 유리시킬 수 있다. 세포를 용해시키는 한 방법은 어레이 상에서 세포를 단리한 후, 세포에 직류를 인가하는 단계를 포함한다. 직류는 세포를 용해시키는 데 적합한 임의의 적합한 암페어수, 전압 등을 가진다. 일부 실시양태에서, 전류의 전압은 약 1 볼트 내지 약 500 볼트이다. 일부 실시양태에서, 전류의 전압은 약 10 볼트 내지 약 500 볼트이다. 다른 실시양태에서, 전류의 전압은 약 10 볼트 내지 약 250 볼트이다. 추가의 다른 실시양태에서, 전류의 전압은 약 50 볼트 내지 약 150 볼트이다. 높은 전기장은 막 무결성의 결함을 초래하기 때문에, 전압은 일반적으로 세포 용해의 구동인자가 된다.
일부 실시양태에서, 용해에 사용되는 직류는 세포를 용해시키는 데 적합한 임의의 지속 시간, 주파수 등을 갖는 하나 이상의 펄스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 용해시키기 위해 약 100 볼트의 전압이 약 1밀리초 동안 인가된다. 일부 실시양태에서, 약 100 볼트의 전압이 1초 동안 공급원 상에 2 또는 3회에 걸쳐 인가된다.
일부 실시양태에서, 직류의 주파수는 볼트/cm, 펄스 폭, 및 유체 전도도에 의존한다. 일부 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 0.001 내지 약 1000 Hz이다. 일부 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 10 내지 약 200 Hz이다. 다른 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 0.01 Hz - 1000 Hz이다. 추가의 다른 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 0.1 Hz - 1000 Hz, 약 1 Hz - 1000 Hz, 약 1 Hz - 500 Hz, 약 1 Hz - 400 Hz, 약 1 Hz - 300 Hz, 또는 약 1 Hz - 약 250 Hz이다. 일부 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 0.1 Hz이다. 다른 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 1 Hz이다. 추가의 다른 실시양태에서, 펄스 주파수는 약 5 Hz, 약 10 Hz, 약 50 Hz, 약 100 Hz, 약 200 Hz, 약 300 Hz, 약 400 Hz, 약 500 Hz, 약 600 Hz, 약 700 Hz, 약 800 Hz, 약 900 Hz 또는 약 1000 Hz이다.
다른 실시양태에서, 펄스 지속 시간은 약 1밀리초(ms: millisecond) - 1000초(s: seconds)이다. 일부 실시양태에서, 펄스 지속 시간은 약 10 ms - 1000 s이다. 추가의 다른 실시양태에서, 펄스 지속 시간은 약 100 ms - 1000 s, 약 1 s - 1000 s, 약 1 s - 500 s, 약 1 s - 250 s 또는 약 1 s - 150 s이다. 일부 실시양태에서, 펄스 지속 시간은 약 1 ms, 약 10 ms, 약 100 ms, 약 1 s, 약 2 s, 약 3 s, 약 4 s, 약 5 s, 약 6 s, 약 7 s, 약 8 s, 약 9 s, 약 10 s, 약 20 s, 약 50 s, 약 100 s, 약 200 s, 약 300 s, 약 500 s 또는 약 1000 s이다. 일부 실시양태에서, 펄스 주파수는 0.2 내지 200 Hz이고, 듀티 사이클은 10-50%이다.
일부 실시양태에서, 직류는 1회, 또는 다중 펄스로서 인가된다. 약 1-20 펄스를 포함하여 임의의 적합한 수의 펄스가 인가될 수 있다. 약 1밀리초-1000초를 비롯한, 펄스 사이에 임의의 적합한 시간량이 존재한다. 일부 실시양태에서, 펄스 지속 시간은 0.01 내지 10초이다.
일부 실시양태에서, 세포는 단리된 세포에 인가된 직류와 함께 조합하여 다른 방법을 사용하여 용해된다. 추가의 다른 실시양태에서, 세포는 직류의 사용 없이 용해된다. 다양한 측면에서, 장치 및 시스템은 다른 수단과 함께 조합하여 직류를 사용하여 세포를 용해시킬 수 있거나, 또는 직류의 사용 없이 세포를 용해시킬 수 있다. 화학적 용해제(예컨대, 산), 효소적 용해제, 열, 압력, 전단력, 음파 에너지, 삼투압 충격, 또는 그의 조합의 적용을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 세포 용해 방법이 적합할 수 있다. 리소자임은 효소적 용해제의 예이다.
잔류 물질 제거
일부 실시양태에서, 제2 DEP 장 영역에서 표적화된 세포성 물질을 농축시킨 후, 본 방법은 표적화된 세포성 물질로부터 잔류 물질을 플러싱하는 단계를 임의적으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 또는 시스템은 표적화된 세포성 물질으로부터 잔류 물질을 플러싱하는 데 적합한 유체를 포함하는 저장소를 임의적으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화된 세포성 물질은 계속해서 전극에 동력을 공급함으로써 전극 어레이 근처에, 예컨대, 제2 DEP 장 영역에서 유지된다. "잔류 물질"은 원래 유체에 존재하던 것, 원래 세포에 존재하던 것, 절차 중에 첨가된 것, 세포의 용해를 포함하나, 이에 제한되지 않는 프로세스 중 임의의 단계를 통해 생성된 것(즉, 잔류 세포성 물질) 등이다. 예를 들어, 잔류 물질은 비용해 세포, 세포벽 단편, 단백질, 지질, 탄수화물, 무기질, 염, 완충제, 혈장 및 원치않는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포성 물질은 용해시 복수의 세포로부터 유리된 잔류 단백질을 포함한다. 모든 표적화된 세포성 물질이 제2 DEP 장에서 농축되지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 특정한 양의 표적화된 세포성 물질은 잔류 물질과 함께 플러싱된다.
일부 실시양태에서, 잔류 물질은 임의의 적합한 유체, 예를 들어, 물, TBE 완충제 등에서 플러싱된다. 일부 실시양태에서, 잔류 물질은 임의의 적합한 부피의 유체로 플러싱되거나, 임의의 적합한 기간 동안 플러싱되거나, 1 초과의 유체, 또는 임의의 다른 변형으로 플러싱된다. 일부 실시양태에서, 잔류 물질을 플러싱하는 방법은 원하는 수준으로 표적화된 세포성 물질을 단리하는 것과 관련이 있으며, 표적화된 세포성 물질의 순도를 더 높이 증가시키기 위해서는 더 엄격한 플러싱 및/또는 세척이 요구된다. 다른 실시양태에서, 잔류 물질을 플러싱하는 방법은 특정 출발 물질 및 그의 조성과 관련이 있다. 일부 경우에서, 지질 함량이 높은 출발 물질은 지질을 용해시키는 데 적합한 소수성 유체를 포함하는 플러싱 절차를 필요로 한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 잔류 단백질을 비롯한 잔류 물질을 분해하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 시스템은 잔류 단백질을 비롯한 잔류 물질을 분해할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 화학적 분해(예컨대, 산 가수분해) 및 효소 분해 중 하나 이상의 것에 의해 분해된다. 일부 실시양태에서, 효소 분해제는 프로테아제이다. 다른 실시양태에서, 단백질 분해제는 프로테이나제 K이다. 잔류 물질 분해의 임의적 단계는 임의의 적합한 시간, 온도 등에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 분해된 잔류 물질(분해된 단백질 포함)은 핵산으로부터 플러싱된다.
일부 실시양태에서, 잔류 물질을 분해시키는 데 사용되는 작용제는 불활성화되거나, 분해된다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 시스템은 잔류 물질을 분해시키는 데 사용되는 제제를 분해시키거나, 불활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 잔류 물질을 분해시키는 데 사용된 효소는 열(예컨대, 5-15분 동안 50 내지 95℃)에 의해 불활성화된다. 예를 들어, 프로테아제(예를 들어, 프로테이나제 K)를 포함한 효소는 열(전형적으로, 15분, 70℃)을 사용하여 분해되고/거나, 불활성화된다. 잔류 단백질이 효소에 의해 분해되는 일부 실시양태에서, 본 방법은 단백질 분해 후, 분해 효소(예컨대, 프로테이나제 K)를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 열은 장치에서 가열 모듈에 의해 제공된다(예컨대, 30 내지 95℃의 온도 범위).
본 방법의 특정 단계의 순서 및/또는 조합은 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 방법은 특정한 단계를 임의의 순서로 또는 조합으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 잔류 물질 및 분해된 단백질은 개별적 또는 동시 단계에서 플러싱된다. 즉, 잔류 물질이 플러싱된 후, 잔류 단백질이 분해되고, 이어서, 분해된 단백질이 핵산으로부터 플러싱된다. 일부 실시양태에서, 먼저 잔류 단백질을 분해한 후, 이어서, 조합된 단계에서 핵산으로부터 잔류 물질 및 분해된 단백질, 둘 모두를 플러싱한다.
일부 실시양태에서, 표적화된 세포성 물질은 장치에 보유되고, 예컨대, PCR, 또는 핵산을 조작하거나, 또는 증폭시키는 다른 절차와 같은 추가의 절차에서 임의적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 장치 및 시스템은 PCR 또는 다른 임의적 절차를 수행할 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적화된 세포성 물질은 장치로부터 수집 및/또는 용출된다. 일부 실시양태에서, 장치 및 시스템은 장치 또는 시스템으로부터 표적화된 세포성 물질을 수집 및/또는 용출시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포성 물질은 (i) 제2 유전영동장 영역을 끄고; (ii) 용리제 중에서 어레이로부터 물질을 용출시킴으로써 수집된다. 예시적인 용리제로는 물, TE, TBE 및 L-히스티딘 완충제를 포함한다.
생물학적 분자
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 장치 또는 시스템은 상기 방법, 장치 또는 시스템으로부터 수득될 수 있는 임의의 원하는 생물학적 물질, 예컨대, 세포외 소포, 엑소좀, 미세소포, 외피 입자, 및 다른 복합 입자, 또는 DNA, RNA, 단백질, 지질 및 다른 생물학적 분자를 비롯한, 생물학적 성분의 조합을 포함하는 생물학적 파슬을 수득, 단리, 또는 분리시키는 데 임의적으로 사용된다. 본원에 기술된 방법, 장치 및 시스템에 의해 단리된 핵산은 DNA(데옥시리보핵산), RNA(리보핵산), 및 그의 조합을 포함한다. DNA는 무세포 DNA 및 DNA 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 핵산의 시퀀싱, 또는 증폭, 라이게이션 또는 클로닝을 포함하는 추가 조작에 적합한 형태로 단리된다. 본원에 기술된 방법, 장치 및 시스템에 의해 단리된 단백질은 단백질 복합체, 전장 단백질, 프로세싱된 단백질, 및 단백질 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 질량 분광법 또는 항체 기반 분석(예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광)에 적합한 형태로 단리된다.
일부 실시양태에서, 단리, 분리, 또는 포획된 핵산은 그의 크기에 기초하여 선택적으로 또는 우선적으로 단리, 분리, 또는 포획된 DNA 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택적으로 또는 우선적으로 단리, 분리, 또는 포획된 DNA 단편의 길이는 250-600 bp, 250-275 bp, 275-300 bp, 300-325 bp, 325-350 bp, 350-375 bp, 375-400 bp, 400-425 bp, 425-450 bp, 450-475 bp, 475-500 bp, 500-525 bp, 525-550 bp, 550-575 bp, 575-600 bp, 300-400 bp, 400-500 bp, 및/또는 300-500 bp 길이이다. 일부 실시양태에서, 선택적으로 또는 우선적으로 단리, 분리, 또는 포획된 DNA 단편의 길이는 600-700 bp, 700-800 bp, 800-900 bp, 900-1000 bp, 1-2 kbp, 2-3 kbp, 3-4 kbp, 4-5 kbp, 5-6 kbp, 6-7 kbp, 7-8 kbp, 8-9 kbp, 또는 9-10 kbp 길이이다. 일부 실시양태에서, 선택적으로 또는 우선적으로 단리, 분리, 또는 포획된 DNA 단편의 크기는 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 bp 초과이다.
일부 실시양태에서, DNA 단편은 무세포 DNA 단편이다.
다양한 실시양태에서, 단리 또는 분리된 핵산은 적어도 99질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 99질량%의 잔류 세포성 물질(예컨대, 핵산 수득 기점이 되는 용해된 세포)을 함유하지 않거나, 적어도 98질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 98질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 95질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 95질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 90질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 90질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 80질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 80질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 70질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 70질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 60질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 60질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 50질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 50질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 30질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 30질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 10질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 적어도 10질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않거나, 적어도 5질량%의 다른 물질을 함유하지 않거나, 또는 적어도 5질량%의 잔류 세포성 물질을 함유하지 않는 핵산을 포함하는 조성물이다.
다양한 실시양태에서, 핵산은 임의의 적합한 순도를 가진다. 예를 들어, DNA 시퀀싱 절차를 약 20% 잔류 세포성 물질을 갖는 핵산 샘플로 수행할 수 있는 경우, 80%로 핵산을 단리하는 것이 적합하다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 약 80질량% 미만, 약 70질량% 미만, 약 60질량% 미만, 약 50질량% 미만, 약 40질량% 미만, 약 30질량% 미만, 약 20질량% 미만, 약 10질량% 미만, 약 5질량% 미만, 또는 약 2질량% 미만의 비핵산 세포성 물질 및/또는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 약 99질량% 초과, 약 98질량% 초과, 약 95질량% 초과, 약 90질량% 초과, 약 80질량% 초과, 약 70질량% 초과, 약 60질량% 초과, 약 50질량% 초과, 약 40질량% 초과, 약 30질량% 초과, 약 20질량% 초과, 또는 약 10질량% 초과의 핵산을 포함한다.
핵산은 비변형된 형태, 유도체화된 형태, 단편화된 형태, 비단편화된 형태 등을 비롯한, 임의의 적합한 형태로 단리된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 시퀀싱에 적합한 형태로 수집된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 샷건-시퀀싱, 증폭 또는 다른 조작에 적합한 단편화된 형태로 수집된다. 핵산은 예컨대, 합성 방법에 의하여 시퀀싱에서 사용된 바와 같은 뉴클레오티드와 같은 DNA 시퀀싱 절차에서 사용되는 시약을 포함하는 용액 중에서 장치로부터 수집될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 통해 출발 샘플의 핵산의 거의 대표적인 핵산 샘플이 단리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 장치 및 시스템은 출발 샘플의 핵산의 거의 대표적인 핵산을 샘플로부터 단리할 수 있다. 즉, 본 방법에 의해 수집되거나, 또는 장치 또는 시스템에 의해 수집될 수 있는 핵산 집단은 실질적으로 유체 중의 세포에 존재하는 핵산 집단에 비례한다. 일부 실시양태에서, 상기 측면은 유체가 다수의 세포 유형의 복합 혼합물이고, 실시자가 다양한 세포 유형의 상대적인 집단을 밝혀내는 핵산 기반 절차를 원하는 적용 분야에서 유리하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 단리되거나, 또는 본원에 기술된 장치에 의해 단리될 수 있는 핵산은 고품질이고/거나, 하류 절차, 예컨대, DNA 시퀀싱, 핵산 증폭, 예컨대, PCR, 또는 다른 핵산 조작, 예컨대, 라이게이션, 클로닝 또는 추가의 번역 또는 형질전환 검정에서 직접 사용되는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 0.01% 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 0.5% 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 0.1% 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 1% 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 2% 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 3% 단백질. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 4% 단백질. 일부 실시양태에서, 수집된 핵산은 최대 5% 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나, 또는 본원에 기술된 장치에 의해 단리될 수 있는 핵산의 농도는 적어도 0.5 ng/mL이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나, 또는 본원에 기술된 장치에 의해 단리될 수 있는 핵산의 농도는 적어도 1 ng/mL이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나, 또는 본원에 기술된 장치에 의해 단리될 수 있는 핵산의 농도는 적어도 5 ng/mL이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 의해 단리되거나, 또는 본원에 기술된 장치에 의해 단리될 수 있는 핵산의 농도는 적어도 10 ng/ml이다.
일부 실시양태에서, 약 50 피코그램의 핵산이 일부 실시양태에서, 핵산 약 50 피코그램을 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치를 사용하여 약 5,000개의 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 10 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 20 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 50 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 75 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 100 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 200 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 300 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 400 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 500 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 1,000 피코그램의 핵산을 수득한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법, 시스템 또는 장치는 약 5,000개의 세포로부터 적어도 10,000 피코그램의 핵산을 수득한다.
검정 및 적용
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)에 의해 단리된 핵산을 임의로 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PCR 반응은 전극의 어레이 상에서 또는 근처에서 또는 장치 내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 시스템은 히터 및/또는 열순환에 적합한 온도 제어 메커니즘을 포함한다.
PCR은 임의적으로 2개의 효율적인 열전도성 부재(예컨대, 알루미늄 또는 은) 사이에 반응 화학 분석물을 위치시키고, TEC를 사용하여 반응 온도를 조절함으로써 종래 열순환을 사용하여 수행된다. 추가의 디자인은 임의적으로 유리 또는 열 중합체와 같은 광학적으로 투명한 물질을 통한 적외선 가열을 사용한다. 일부 경우에서, 디자인은 기판을 통해 네트워크화된 전도성 배선을 포함하는 스마트 중합체 또는 스마트 유리를 사용한다. 이러한 전도성 배선은 물질의 신속한 열 전도를 가능하게 하고, (적절한 DC 전압을 인가함으로써) 효율적인 PCR 반응을 지속시키는 데 필요한 온도 변화 및 구배를 제공한다. 특정 경우에서, 가열은 저항 칩 히터 및 다른 저항 부재를 사용하여 가해지고, 상기 저항 칩 히터 및 다른 저항 부재는 이들을 통과하는 전류의 양에 비례하여 신속하게 온도를 변화시킬 것이다.
종래 형광분석(ccd, pmt, 다른 광학 검출기, 및 광학 필터)과 함께 사용된 일부 실시양태에서, 증폭 배수는 실시간으로 또는 시간 간격을 두고 모니터링된다. 특정 경우에서, 최종 증폭 배수의 정량화는 AFU(더블링을 분석하기 위해 상관된 임의적인 형광 단위)로 전환된 광학 검출을 통해 기록되거나, 또는 임피던스 측정 또는 다른 전기화학적 감지를 통해 전기 신호로 번역된다.
미세전극 어레이의 작은 크기를 감안하며, 상기 부재는 미세전극 어레이 주변에 임의적으로 첨가되고, PCR 반응은 (DEP 어레이 상의) 주요 샘플 프로세싱 챔버에서 수행되거나, 또는 증폭시키고자 하는 분석물은 임의적으로 온-카트리지가 가능하도록 유체공학적 성질을 통해 유체 카트리지 내의 또 다른 챔버로 수송된다.
랩-온-칩 프로세싱
일부 경우에서, 광 전달 스킴은 광학 여기 및/또는 방출 및/또는 증폭 배수 검출을 제공하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 이는 외부 성분을 사용할 필요성을 제거하기 위한 광학파 가이드로서 유동 셀 물질(예컨대, 아크릴(PMMA) 사이클릭 올레핀 중합체(COP: cyclic olefin polymer)와 같은 열적 중합체, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC: cyclic olefin co-polymer) 등)을 사용하는 것을 포함한다. 추가로, 일부 경우에서, 광원-발광 다이오드-LED, 수직-공동 표면-방출 레이저- VCSEL, 및 다른 조명 스킴은 유동 셀 내부에 직접적으로 통합되거나, 미세전극 어레이 표면 상에 직접적으로 설치되어 광원을 내부적으로 제어하고 동력을 공급한다. 소형 PMT, CCD, 또는 CMOS 검출기 또한 유동 셀 내에 설치될 수 있다. 이러한 최소화 및 소형화를 통해 유사한 종래 장치(즉, 표준 벤치 탑 PCR/QPCR/형광계)의 풋프린트를 감소시키면서, 소형 장치는 신호를 신혹하게 전달하고, 검출할 수 있다.
칩 상의 증폭
일부 경우에서, 실리콘 미세전극 어레이는 PCR에 필수적인 열 순환을 견딜 수 있다. 일부 적용에서, 온-칩 PCR은 수송 단계 동안 소량의 표적 핵산이 손실될 수 있기 때문에 유리하다. 본원에 기술된 장치, 시스템 또는 프로세스의 특정 실시양태에서, 임의의 하나 이상의 다중 PCR 기술이 임의적으로 사용되고, 이러한 기술은 하기 중 임의의 하나 이상의 것을 임의적으로 포함한다: 유동 셀에서의 직접적인 열 순환; 상이한 온도 구역을 갖는 마이크로채널을 통한 물질의 이동; 및 시스템 상에서 증폭될 수 있거나, PCR 기계로 수송될 수 있는 PCR 튜브 내로의 부피 이동. 일부 경우에서, 소적 PCR은 배출구가 비혼화성 유체 및 계면 안정화제(계면활성제 등)를 함유하는 T-접합을 함유하는 경우에 수행된다. 특정 실시양태에서, 소적은 임의의 적합한 방법에서 열 순환된다.
일부 실시양태에서, 증폭은 등온 반응, 예를 들어, 전사 매개 증폭, 핵산 서열 기반 증폭, RNA 기술의 신호 매개 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, DNA의 루프 매개 등온 증폭, 등온 다중 치환 증폭, 헬리카제 의존 증폭, 단일 프라이머 등온 증폭 또는 고리형 헬리카제 의존 증폭을 사용하여 수행된다.
다양한 실시양태에서, 증폭은 균질 용액에서 또는 고정된 프라이머(들)를 포함하는 비균질 시스템으로서 수행된다. 후자의 일부 실시양태에서, 수득된 앰플리콘은 더 높은 정도의 다중화를 위하여 표면에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 변성되어 전극 상에서 또는 그 근처에서 단일 가닥 생성물을 제공한다. 이어서, 임의적으로 하이브리드화 반응을 수행하여 예컨대, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: single nucleotide polymorphism), 짧은 탠덤 반복부(STR: Short Tandem Repeat), 돌연변이, 삽입/결실, 메틸화 등과 같은 유전적 정보를 얻는다. 메틸화는 임의적으로 하나의 DNA 샘플이 비술파이트 처리되고, 하나는 그렇지 않은 병렬 분석에 의해 결정된다. 비술파이트는 U가 되는 비변형된 C를 탈퓨린화시킨다. 메틸화된 C는 일부 경우에서 영향을 받지 않는다. 일부 실시양태에서, 대립유전자 특이적 염기 연장은 관심 염기를 기록하는 데 사용된다.
특이적 상호작용 이외에, 표면은 임의적으로 포획을 위해 비특이적 잔기로 변형된다. 예를 들어, 표면은 폴리양이온, 즉, 폴리리신에 의해 변형되어 역 바이어스(-V)의 의해 유리될 수 있는 DNA 분자를 포획할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면에 대한 변형은 표면 상에서 균일하거나, 특히, 전극 또는 비전극 영역을 관능화하기 위하여 패턴화된다. 특정한 실시양태에서, 이는 사진평판술, 전기화학 활성화, 스폿팅 등에 의해 달성된다.
일부 적용에서, 칩은 각 영역이 특정 또는 다른 크기의 DNA 단편을 포획하도록 구성된 다중 영역을 포함할 수 있다. 칩 영역은 종종 전압, 암페어수, 주파수, 피치, 전극 직경, 웰 깊이 또는 다양한 영역에서 상이한 크기의 단편을 선택적으로 포획하는 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 각 영역은 다중 전극 어레이를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 장치 또는 영역은 순차적으로 또는 동시에 작동된다. 일부 실시양태에서, 다중 칩 디자인은 수집된 물질의 크기 범위를 좁게 하여 대역 통과 필터를 생성하는 데 사용된다. 일부 경우에서, 전류 칩 기하 구조(예컨대, 200 um 중심-중심 피치 상에 80 um 직경 전극(80/200))는 500 bp 컷오프 필터(예컨대, 약 10 Vpp 및 10 kHz의 전압 및 주파수 조건을 사용)로서 작용한다. 상기 경우에서, 500 bp 초과의 핵산이 포획되고, 500 bp 미만의 핵산은 포획되지 않는다. 대안적인 전극 직경 및 피치 기하 구조는 칩 조합이 원하는 단편 크기를 제공하도록 상이한 컷 오프 크기를 가진다. 일부 경우에서, 유사한 조건하에서 80/200 기하 구조와 비교하여, 100 um 중심-중심 피치 상에 40 um 직경 전극(40/100)은 더 낮은 컷오프 임계값을 갖는 반면, 400 um 중심-중심 피치 상에 160 um 직경 전극(160/400)은 더 높은 컷오프 임계값을 가진다. 다양한 실시양태에서, 단일 칩 또는 다중 칩 상의 기하 구조는 조합되어 특정한 크기의 단편 또는 입자를 선택한다. 예를 들어, 600 bp 컷오프 칩은 용액 중에 600 bp 미만의 핵산을 남길 것이고, 이후 물질은 임의적으로 (600 bp 칩과 대립하고 있는) 500 bp 컷오프 칩에 의해 다시 포획된다. 이를 통해 용액 중에 500 - 600 bp를 포함하는 핵산 집단이 남게 된다. 이어서, 상기 집단은 임의적으로 동일한 챔버, 측부 챔버, 또는 임의의 다른 구성에서 증폭된다. 일부 실시양태에서, 크기 선별은 단일 전극 기하 구조를 사용하여 달성되고, 여기서 >500 bp의 핵산이 전극 상에서 단리되고, 이어서, 세척 후, <600 bp의 핵산을 방출시키기 위한 높은 ACEK 장 강도의 감소(전압, 주파수, 전도도 변화)로 500-600 bp의 상청액 핵산 집단이 생성된다. 일부 실시양태에서, 장치는 길이가 250-600 bp, 250-275 bp, 275-300 bp, 300-325 bp, 325-350 bp, 350-375 bp, 375-400 bp, 400-425 bp, 425-450 bp, 450-475 bp, 475-500 bp, 500-525 bp, 525-550 bp, 550-575 bp, 575-600 bp, 300-400 bp, 400-500 bp, 및/또는 300-500 bp인 핵산 단편을 선택적으로 포획하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 칩 장치는 온도 구배 칼럼을 생성하는 하부 에지에서 히터와 수직으로 배향되어 있다. 특정 경우에서, 하부는 변성 온도에 있고, 중간 부분은 어닐링 온도에 있고, 상부는 연장 온도에 있다. 일부 경우에서, 대류는 연속적으로 프로세스를 구동시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에서는 구체적으로 프로세스를 가속화하고, 전열을 유동시키는 전극 디자인을 포함하는 방법 또는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 디자인은 임의적으로 동일 장치 상에 또는 적절하게 배치된 별개의 장치 상에 있다. 일부 경우에서, 핀 또는 팬 등을 통한 상부에서의 능동 또는 수동 냉각은 가파른 온도 구배를 제공한다. 일부 경우에서, 본원에 기술된 장치 또는 시스템은 장치 상에 또는 반응 챔버 내에 온도 감지기를 포함하거나, 또는 본원에 기술된 방법은 그를 사용하여, 온도를 모니터링하고, 상기 감지기는 임의적으로 피드백 기반으로 온도를 조정하는 데 사용된다. 일부 경우에서, 상기 감지기는 상이한 열 전달 특성을 보유하는 물질과 커플링되어 연속적인 및/또는 비연속적인 구배 프로파일을 생성한다.
일부 실시양태에서, 증폭은 일정한 온도로 진행된다(즉, 등온 증폭).
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 바와 같이 단리된 핵산을 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 생어 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱(NGS: next generation sequencing)에 의해 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 차세대 시퀀싱 방법은 파이로시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, 폴로니 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 또는 단일 분자 시퀀싱을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 핵산은 생어 시퀀싱에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 생어 시퀀싱은 핵산 단리와 동일한 장치 내에서 수행된다(랩-온-칩). 샘플 제조 및 생어 시퀀싱 결과를 위한 랩-온-칩 워크플로우는 하기 단계를 포함할 수 있다: a) ACE 칩을 사용하여 샘플을 추출하는 단계; b) 칩 상에서 표적 서열의 증폭을 수행하는 단계; c) ACE에 의해 PCR 생성물을 포획하는 단계; d) 순환 시퀀싱을 수행하여 표적 가닥을 강화시키는 단계; e) 강화된 표적 가닥을 포획하는 단계; f) 생어 쇄 종결 반응을 수행하는 단계; 온 칩 다색 형광 검출과 모세관 전기영동에 의한 표적 서열의 전기영동 분리를 수행하는 단계. 핵산 세척, 시약 첨가 및 전압 끄기는 필요에 따라 수행된다. 반응은 복수의 포획 구역이 있는 단일 칩 상에서 또는 별개의 칩 및/또는 반응 챔버 상에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 핵산에 대한 반응(예컨대, DNA 또는 RNA의 단편화, 제한 분해, 라이게이션)을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응은 본원에 개시된 바와 같이, 어레이 상에서 또는 그 근처에서 또는 장치에서 발생한다.
다른 검정법
본원에 개시된 단리된 핵산은 다양한 검정 포맷으로 추가로 이용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 프로브 또는 앰플리콘을 다루는 장치는 도트 블롯 또는 역 도트 블롯 분석, 염기 중첩 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 분석, 전자적 엄격성을 갖는 SNP 분석에서, 또는 STR 분석에서 이용될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 장치는 효소적 핵산 변형, 또는 단백질-핵산 상호작용, 예컨대, 효소적 리포팅에 의한 유전자 발현 분석, 고정된 핵산 증폭, 또는 제한 엔도뉴클레아제 절단, 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 절단, 마이너 그루브 결합 단백질 검정법, 말단 트랜스페라제 반응, 폴리뉴클레오티드 키나제 또는 포스파타제 반응, 리가제 반응, 토포이소머라제 반응, 및 다른 핵산 결합 또는 변형 단백질 반응을 비롯한 고체상 포맷에 적합한 다른 핵산 변형을 위한 포맷으로 이용될 수 있다.
추가로, 본원에 개시된 장치는 면역검정법에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 장치의 위치는 샌드위치 검정법, 경쟁적 검정법, 또는 다른 포맷에 의해 체액 샘플 중의 항체를 검정하기 위하여 항원(예컨대, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 프로테오글리칸, 당단백질 등)과 연결될 수 있다. 대안적으로, 장치의 위치는 샌드위치 검정법, 경쟁적 검정법, 또는 다른 검정 포맷에 의해 샘플 중에 항원을 검출하기 위하여 항체로 처리될 수 있다. 항체 및 단백질의 등전점이 실험 또는 pH/전하 계산에 의해 매우 용이하게 측정될 수 있기 때문에, 장치의 전자적 지정 및 전자 농도 이점은 지정된 종 또는 분석물 종이 하전되도록 완충제의 pH를 간단히 조정함으로써 이용될 수 있다.
추가 측면에서, 본원에 개시된 장치는 질량 분광법을 통해 바이오마커를 분석하는 데 유용하다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 면역검정형 어레이 또는 핵산 어레이에서의 사용에 유용하다.
정의 및 약어
"하나"("a," "an") 및 "그"라는 관사는 비제한적인 것이다. 예를 들어, "그 방법"은 상기 어구의 의미에 대해 가장 광범위한 정의를 포함하며, 이는 1 초과의 방법일 수 있다.
"Vpp"는 피크에서 피크까지의 전압이다.
"DEP"는 유전영동에 대한 약어이다.
실시예
실시예 1: 칩 제작
200 um 중심-중심 피치 상에 45x20 맞춤 80 ㎛ 직경 고리형 백금 미세전극 어레이를 이전 결과를 기반으로 제작하였다(하기 참고문헌 1 - 3 참조). 모든 900 미세전극을 함께 활성화시키고, AC 편향시켜 바둑판 필드 기하 구조를 형성한다. 양의 DEP 영역은 미세전극 상에 직접적으로 발생하고, 음의 낮은 장 영역은 미세전극 사이에서 발생한다. 어레이를 200 nm-500 nm 두께의 다공성 폴리-Hema 하이드로겔 층으로 오버-코팅한다(절차: 에탄올을 사용하여 5%로 희석된, (PolySciences Inc.)로부터 구입한 에탄올 스톡 용액 중의 12% pHema). 스핀 코터를 사용하여 6K RPM 스핀 속도로 상기 언급된 칩 상에서 5% 용액 70 uL를 회전킨다. 이어서, 칩+하이드로겔 층을 45분 동안 60℃ 오븐에 넣고, 미세유체 카트리지에 봉입하여 아크릴 창으로 커버된 50 ㎕ 샘플 챔버를 형성한다. 미세전극으로의 전기 접속부는 유동 셀 내의 PCB 보드로부터의 몰렉스(Molex) 연결 장치로부터 접속된다. 함수 발생기(function generator)(HP 3245A)는 용액 전도도에 따라 10 KHz 및 10 - 14 V 피크-피크에서 정현파 전기 신호를 제공하였다. 이미지는 형광 현미경(Leica) 및 EGFP 큐브로 캡쳐하였다(485 nm 방출 및 525 nm 여기 대역통과 필터). 여기 공급원은 PhotoFluor II 200W Hg 아크등이었다.
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실시예 2: 바이오마커 발견 방법
췌장암을 앓는 개체로부터 혈장 샘플을 수득하였다. 혈장 샘플의 일부로부터 세포외 소포를 단리하고, AC 유전영동 방법을 사용하여 혈장 샘플로부터 무세포 핵산을 수득하였다. 세포외 소포로부터의 핵산 및 무세포 핵산을 차세대 시퀀싱을 통해 게놈 프로파일링을 수행하였다. 동시에, 세포외 소포로부터의 단백질에 대해서는 질량 분광학을 통해 프로테오믹 분석을 수행하였다. 건강한 개체의 혈장 샘플과 비교했을 때 조합된 분석을 통해 샘플에서 과다발현되거나, 과소발현된 바이오마커를 발견하고, 이는 췌장암에 대한 바이오마커인 것으로 확인하였다. 본 방법의 흐름도가 도 5에 제시되어 있다. 다양한 바이오마커의 발현에 대한 클러스터 다이어그램 및 히트 맵이 도 6에 제시되어 있다.
실시예 3: 다중 암 검사
단일 검사로 개체가 4개의 다른 암 중 하나를 앓는지 여부를 결정하기 위해 다중 암 검사를 개발하였다. 이 접근법을 검증하기 위해, 247명의 조기 단계 암 환자 및 건강한 대조군을 다양한 바이오마커에 대해 검사하였다. 실험 피험체에 대한 통계적 분석 결과는 도 7에 제시되어 있다. 결과는 도 8에 제시되어 있으며, 여기서, 97% 특이도 및 87% 민감도를 보였고, 전반적으로, 각 암 유형 및 병기에 대한 특이도가 확립되었다. 본 실시예는 다중 암이 단일 검정법으로 검사될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4: 암 검출
치료를 받은 적이 없는 134명의 암 환자(42-난소암, 44-췌장암, 48-방광암) 및 110명의 건강한 개체의 혈액 혈장으로부터 엑소좀을 단리하였다(도 9a)(상세한 내용은 방법 참조). 모든 암 환자는 미국 암 연합회(AJCC: American Joint Commission on Cancer)에 따라 조직병리학적으로 I기 또는 II기인 것으로 확인되었고, 연령 중앙값은 59세였다(표 1-2). 특히, 전체 암 환자 중 63%(48%-췌장암, 88%-난소암 및 56%-방광암)는 I기였고; 나머지 37%는 II기였다. 난소암 코호트에서 25명은 IA기였다(난소암 중 60%). 건강한 개체는 암 또는 자가면역 질환의 병력이 없었고, 연령 중앙값은 53였다.
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암 관련 단백질에 관한 기존 문헌을 사용하여 42개의 단백질 바이오마커를 선택하고, 평가를 위해 2개의 다른 인자(연령 및 성별)를 선택하였다(표 4). 이들 단백질은 면역검정 플랫폼을 통해 재현가능하게 평가될 수 있는 것으로 나타났고, 모든 피험체의 혈장에서 42개 마커의 엑소-단백질 수준을 측정하였다(표 5). 입자 크기 분포 및 농도를 통해 두 코호트 모두에서 엑소좀 단리가 등가인 것으로 확인되었다(표 3; 도 12). 엑소-단백질 및 유리-단백질(전체 순환 혈장 단백질)에 대한 단백질 존재비 히트맵이 도 13에 제시되어 있다. 표 4의 모든 바이오마커를 조기 단계에서 암을 검출하기 위해 개발된 로지스틱 회귀 모델인 EXPLORE 테스트에 포함되는지에 평가하였다.
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전체 평균 ROC(도 9b, 방법)를 계산하기 위해 100회의 계산 반복을 수행하였다. 각 반복마다 표 5의 전체 데이터세트를 2/3 훈련 세트 및 1/3 테스트 세트로 무작위로 분할하였다. 훈련 세트는 각 바이오마커에 대한 회귀 계수를 생성하는 데 사용하였고; 테스트 세트는 수신자-조작자-특성(ROC: Receiver-Operator-Characteristic) 곡선 및 AUC 통계를 작성하는 데 사용하였다. 상기 엄격한 통계 분석을 통해 환자 연령과 조합하여 조기 암을 효과적으로 확인할 수 있는 13개의 단백질을 확인하였다(도 9c, 표 2, 6). 생성된 평균 ROC 곡선은 도 10a에 제시되어 있다. EXPLORE 테스트를 사용하여 전체 암 코호트를 건강한 개체와 비교하였을 때, 평균 AUC는 0.95(95% CI = 0.94-0.97)이고, 여기서 특이도 >99%에서 평균 민감도는 71.2%였다.
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EXPLORE 테스트에 사용된 13개의 엑소-단백질 바이오마커는 암 발생에서 중추점을 나타낼 수 있는 광범위한 생물학적 기능을 포괄한다. 뉴로필린-1 및 HER2는 조기 악성종양에서 비정상적인 성장 인자 신호전달을 매개하는 것으로 간주된다(문헌 [Niland, S. & Eble, J.A. Neuropilins in the Context of Tumor Vasculature. International Journal of Molecular Sciences 20, 639 (2019)]; [Moasser, M.M. The oncogene HER2: its signaling and transforming functions and its role in human cancer pathogenesis. Oncogene 26, 6469-6487 (2007)]). CA 19-9, MPO 및 TIMP-1은 이전에 또 다른 다중 암 검정에서 확인되었다(문헌 [Liu, M.C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology 31, 745-759 (2020)]). VEGFR1, sc-kit/SCFR 및 sE-셀렉틴은 혈관신생에 영향을 미칠 수 있는 반면(문헌 [Dvorak, H.F. Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor: A Critical Cytokine in Tumor Angiogenesis and a Potential Target for Diagnosis and Therapy. Journal of Clinical Oncology 20, 4368-4380 (2002)]; [Lennartsson, J. & Ronnstrand, L. Stem cell factor receptor/c-Kit: from basic science to clinical implications. Physiol Rev 92, 1619-1649 (2012)]; [Kjaergaard, A.G., Dige, A., Nielsen, J.S., Tønnesen, E. & Krog, J. The use of the soluble adhesion molecules sE-selectin, sICAM-1, sVCAM-1, sPECAM-1 and their ligands CD11a and CD49d as diagnostic and prognostic biomarkers in septic and critically ill non-septic ICU patients. Apmis 124, 846-855 (2016)]), 엑소좀 카텝신-D, MIA, IGFBP3, sFas 및 페리틴은 종양 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(문헌 [Hoshino, A., et al. Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. Cell 182, 1044-1061.e1018 (2020)]; [Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature 527, 329-335 (2015))(표 6, 7). 언급된 각 엑소-단백질에 대한 워터폴 플롯은 도 14에 제시되어 있고, 도 15는 EXPLORE 엑소-단백질이 그의 등가의 유리 단백질보다 암의 존재를 더 정확하게 예측한다는 것을 보여준다(0.95 대 0.85 AUC).
실행가능한 스크리닝 테스트의 중요한 특징은 조기 암을 정확하게 검출할 수 있는 능력이다. >99% 특이도(110명 중 단 1명만이 양성인 것으로 잘못 확인되는 경우 - 표 2)에서, EXPLORE 테스트는 모든 암에 걸쳐 I기 및 II기 환자에 대해 각각 70.4% 및 72.3%의 민감도를 보여주었다(도 10b). >99% 특이도에서 암 유형별로 분석하였을 때, EXPLORE 테스트는 난소암 및 방광암에서 각각 69% 및 51%의 민감도를 보였고, 조기 췌장암을 검출하는 데 있어서 주목할 만한 96%의 민감도를 보여주었다(도 10c). 이전에 기술된 다중 암 검정과 달리, EXPLORE는 상기의 도전과제가 되는 암에서의 조기 질환을 검출하는 데 있어 탁월한 민감도를 보여주었다.
EXPLORE 테스트의 잠재적인 임상적 중요성을 추가로 이해하기 위해, 각 암의 단계 및 조직학적 통계적 분석 결과에서 성능을 평가하였고, 다양한 스크리닝 검정에서 사용된 3개의 특이도 수준(99%, 97%, 95%)에서 평균 민감도를 비교하였다.
본 테스트는 최고 수준의 특이도에서 PDAC 환자 중 21명의 I기(97%, 98%, 99%) 및 23명의 II기(95%, 96%, 97%)를 검출하는 데 있어서 거의 완벽한 민감도를 보였고(도 11a), 이는 잠재적으로 극적인 임상적 영향을 나타낸다. I기 난소암(N=37)의 검출 또한 잠재적으로 임상적으로 영향을 미치는 수준(65%, 69%, 76%)이었으며, 특이도가 낮을수록 민감도가 유의적으로 증가한 것으로 관찰되었다. 결정적으로 IA기(n=25, 66%, 69%, 75%) 및 치명적으로 공격적인 장액성 선암종 조직(I/II기, n=22, 69%, 73%, 80%), 둘 모두에 대한 높은 검출 민감도는 난소암에서 EXPLORE 테스트의 잠재적인 가치를 명확하게 입증한다(도 11b). 어느 서브타입이든 그를 조기 검출하면, 수술로 치유될 수 있는 바, 생존율에 크게 영향을 미칠 수 있다. 방광암에서, 테스트는 3개의 특이도에서 모두 95% CI 이내에서 27명의 I기 환자(56%, 61%, 67%), 15건의 저등급 암(52%, 58%, 68%), 및 33건의 고등급 암(50%, 54%, 62%)을 동일하게 검출할 수 있었다(도 11c). 흥미롭게도, 특이도가 >99%에서 95%로 ~4% 감소한 경우, 3개의 서브타입 모두 평균 민감도가 11%-16%로 극적으로 증가한 것으로 나타났다. 전체적으로 볼 때, 이러한 결과는 EXPLORE 테스트가 각 암 내의 임의의 서브코호트로 편향되지 않음을 시사하는 것이다.
췌장암 및 난소암 검출은 집단 수준의 스크리닝이 실행가능하도록 하기 위해서는 ~99% 특이도가 요구되지만, 방광암은 더 낮은 특이도 임계값으로부터 이익을 얻을 수 있다는 주장이 제기될 수 있다. 말기 방광암은 삶의 질에 큰 영향을 미치며 미국에서 치료 비용이 가장 많이 드는 암 중 하나이다. 민감도가 더 높은 테스트는 치료가 더 간단한 조기 단계에서 양성을 더 많이 검출함으로써 환자와 의료 시스템 둘 모두의 부담을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. (더 낮은 특이도에 기인하여) 추가의 위양성은 비침습적 소변 기반 확증 테스트를 사용함으로써 완화될 수 있다.
요약하면, I기 및 II기의 췌장암, 난소암, 및 방광암을 검출하기 위해 암에서 공지된 보조인자인 연령과 13개의 엑소좀 단백질을 조합한 비침습적 테스트를 개발하였다.
본원에서 연구된 3개의 암 유형(췌장암, 난소암 및 방광암)은 2021년 미국에서 대략 88,000건의 사망의 원인이 되는 것으로 추정되며, 이는 모든 암 관련 사망의 약 14%를 차지한다.
방법
샘플 수집 및 프로세싱
본 연구를 위한 모든 시료는 상업용 생물저장소(ProteoGenex: 미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재)로부터 입수하였다. 말초 혈액은 적절한 기관 심사 위원회(Institutional Review Board)/독립 윤리 위원회(Independent Ethical Committee)의 승인하에 수집하고, 모든 피험체는 사전 동의서를 제출하였다. 암 확진을 받은 피험체는 모두 치료를 받은 적이 없는 피험체였다(수술, 국소 및/또는 전신 항암 요법 전). 인구통계, 수술 및 병리 정보와 AJCC 병기(7판)는 생물 저장소로부터 제공받았고, 연구 저자가 정확성에 대해 리뷰하였다. 난소암 환자에 대해서는 일률적인 종합 외과적 병기 결정이 수행되지 않았기 때문에 명시된 병기보다 높은 잠복 질환을 배제할 수 없다. 본 연구에는 2014년 1월부터 2020년 9월 사이에 3개의 암 중 하나로 진단받은 136명의 피험체('암 코호트 환자')를 포함하여 총 249명의 피험체가 포함되었다. 암 코호트에서는 암 진단 직후(중앙값 1일, 평균 2.7일), 및 외과적 개입, 방사선 요법, 또는 암 관련 전신 요법 전에 전정맥 혈액 시료를 수집하였다. 공지된 암 진단을 받은 피험체(n=136, 56명 남성, 82명 여성)에서 연령(중앙값)은 59세[IQR 54-67]이고, 공지된 암 병력이 없는 피험체(n=113, 49명 남성 및 64명 여성, 표 S1)에서는 53세[IQR 45-61]였다. 전혈 샘플을 K2EDTA 혈장 진공채혈관에 수집하고, 수집 후 4시간 이내에 혈장으로 프로세싱하였다. 전혈을 1,500 x g로 4℃에서 10분 동안 브레이크를 사용하지 않고 이중 회전시켰다. 1차 회전 후, 혈장을 새 튜브로 옮기고, 1,500 x g로 10분 동안 2차 회전을 수행하였다. 2차 회전 후, 혈장을 1 mL 튜브에 분취하고, -80℃에서 1시간 이내에 동결시켰다. 본 연구에서 사용된 모든 시료는 동일한 조건하에서 프로세싱하였다.
엑소좀 단리 및 입자 특징화
AC 동전기 기반 단리 방법(Biological Dynamics: 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 240 ㎕의 혈장으로부터 엑소좀을 추출하였다. 간략하면, 희석되지 않은 혈장을 베리타™ 칩에 도입하였고, 여기서 엑소좀이 미세전극에 포획되었다. AC 동전기장은 계속 활성화시켜 포획을 유지시키면서, 남은 혈장은 세척해냈다. 이어서, AC 동전기장을 비활성화시켜 미세전극으로부터 엑소좀을 유리시키고, 프로테오믹 분석을 위해 단리된 엑소좀을 포함하는 용액을 용출시켰다. 이 방법은 또한 이전에 무세포 DNA, 엑소좀 RNA의 단리와 고형 종양 및 혈액 악성종양, 둘 모두의 검출에도 사용되었다. 추출 후, EV는 제타뷰(ZetaView) 기기(Particle Metrix, Inning am Ammersee: 독일 소재)를 통해 나노입자 추적 분석(NTA: nanoparticle tracking analysis)을 사용하여 특징화하였다. 표 3은 단리된 엑소좀의 입자 크기와 농도 값을 보여주는 것이다.
프로테오믹 분석
비드 기반 면역검정 키트(Human Circulating Biomarker Magnetic Bead Panel 1(카탈로그 번호 HCCBP1MAG-58K), Human Angiogenesis Magnetic Bead Panel 2(카탈로그 번호 HANG2MAG-12K), 및 Human Circulating Cancer Biomarker Panel 3(카탈로그 번호 HCCBP3MAG-58K))를 상업적 공급원(Millipore Sigma: 미국 매사추세츠주 버링턴 소재)으로부터 입수하였다. 추출된 엑소좀 샘플 및 유리 단백질을 MAGPIX 시스템(Luminex Corp: 미국 텍사스주 오스틴 소재) 상에서 표적 단백질 농도에 대하여 시험하였다. 소프트웨어 v. 3.0(Luminex)을 사용하여 최종 단백질 농도를 측정하였다.
EXPLORE 테스트 개발
54개 단백질의 초기 평가 이후, 추가 분석을 위해 42개의 상이한 바이오마커를 선택하였다(표 4 및 5). 값이 누락되거나, 또는 결과가 검출 한계(LOD: limit of detection) 미만인 경우, 해당 단백질에 대한 값을 LOD로 설정(전가)하였다. 모든 바이오마커에 대한 분포를 평가하였다. 광범위한 관련 농도 및 바이오마커 간의 전가된 LOD 값을 고려할 때, 분포는 매우 편향된 것으로 나타났다. 따라서, 후속 분석을 위해 모든 엑소좀 단백질 바이오마커 값의 log2 변환을 사용하였다. R 모듈 '이상치' 및 'GmAMisc'는 표준 Grubbs 및 관련 테스트를 기반으로 한 외부 값을 평가하는 데 사용하였고, 일부 극단 값에 대한 증거를 찾았지만, 계속 수행된 테스트 수와 관련 p 값의 보수적인 본페로니(Bonferroni) 보정을 고려할 때 통계적 유의성에 도달하지 못하였다. 샘플 중의 다른 개체 대비 외부 개체의 그의 바이오마커 프로파일에 기초한 분석 또한 계속 수행하였다. R의 'hclust' 모듈을 사용하여 개체 전체에 걸쳐 유클리드 거리 행렬을 구축하였다. 한 개체는 다른 개체에 비해 프로파일이 극단적인 것으로 확인었으며, 이 개체는 추가 분석에서 제거되었다. 분류 모델 구축에서 다중공선성에 대한 가능성을 결정하기 위해 R 모듈 'Corrplot'을 사용하여 바이오마커 간의 상관관계를 탐색하였다(모든 바이오마커 측정값으로부터의 상관관계 플롯이 도 16에 제시되어 있다). R 모듈 'stats'를 사용하여 암 진단과의 연관성을 탐색하기 위해 각 바이오마커에 대한 표준 스튜던트 t-검정, 월콕슨(Wilcoxon) 비모수적 t-검정 및 ANOVA 둘 모두를 계속 수행하였다(표 8). 상기 분석, 누락된 값과 전가된 값의 평가, 각 바이오마커의 생물학적 관련성에 대한 문헌 기반의 정질 평가의 결과를 사용하여 로지스틱 회귀 분석에서 평가하고자 하는 바이오마커를 선택하는 데 가이드하였다.
로지스틱 회귀 및 수신자-조작자 특성 곡선(ROC) 분석.
R의 'caret' 패키지와 바이오마커를 사용하여 'EXPLORE'로 지칭되는 로지스틱 회귀 기반 분류 모델을 개발하였다. 상대적으로 작은 표본 크기를 고려하여 모델에 대한 공정한 평가를 추구하고, 과적합을 막기 위해, 데이터의 무작위 파티션 100개를 생성하였고, 66%는 훈련 세트에 사용하고, 33%는 테스트 세트에 사용하여 EXPLORE 분류 모델의 성능을 평가하였다(도 9b). 수신자-조작자 특성 ROC 곡선, 곡선하 면적(AUC), 및 관련 지표를 계산하였다. 훈련 세트의 ROC 곡선 및 AUC 분석을 통해 예상대로 테스트 세트 분석에서 얻은 것보다 더 우수한 예측 값을 얻었지만, 과적합 가능성을 명확하게 반영하였다. 따라서, 모델의 성능은 훈련 데이터 세트를 기반으로 보고되고, 테스트 세트의 성능에 중점을 둔다. 또한 생성된 모델을 사용하여 앓는 암이 상이하고, 암 병기가 상이한 개체를 정확하게 검출할 수 있는 EXPLORE의 능력을 평가하고, 엑소좀 단백질 수준이 아닌 유리 단백질 수준에 기초하여 모델을 비교하였다. 로지스틱 회귀 모듈을 평가하는 동안, 예컨대, R 모듈 'car'의 레버리지 통계를 사용하여 각 개체의 프로필이 생성된 모듈에 미치는 영향을 평가하였다. 상기 분석에 따르면, 4명의 개체는 모델에 일관되게 큰 영향을 미쳤고, 이들 개체가 분석에서 제외되었을 때, 모델 성능이 개선되었지만, 이러한 개선된 성능은 상기 개체가 유지한 모델의 성능에서는 통계적으로 유의적이지 않았다(데이터는 제시되지 않음). 암 및 병기가 상이한 개체의 서브세트에서 모델의 강건성 및 그의 성능 평가를 보장하기 위해, 상기 개체를 모든 추가 분석에서 배제시켰다.
자동 분류기 분석.
R 모듈 'caret' 및 'glmnet'를 이용하는 분류 모델에서 바이오마커의 자동화된 선택을 위해 분류기에 사용하기 위한 바이오마커 선택에 대한 보완으로서, 단계적 로지스틱 회귀 및 LASSO 기반 로지스틱 회귀의 사용이 고려되었다. 상기 방법을 적용하여 얻은 분류기의 성능은 결과를 유의적으로 개선시키지 못했는데, 이는 아마도 작은 표본 크기와 바이오마커 간의 다중공선성 때문일 것이다.
추가 분석 및 플롯팅
메인 텍스트 및 보충 정보, 둘 모두에 대한 추가 분석 및 플롯팅은 GraphPad Prism(버전 9.0.2) 및 JMP(버전 14.1.0)에서 수행하였다.
실시예 5: 질량 분석법 분석을 위한 ACE 정제된 엑소좀 샘플 제조
질량 분석법 분석을 위한 기존의 표준 단백질 샘플 제조 방법은 엑소좀의 부력 밀도가 매우 낮고, 지질 외부가 거칠기 때문에 엑소좀으로부터 단백질을 추출하는 데 충분하지 않다. 추가로, ACE 칩으로부터 엑소좀을 수집하는 데 사용된 일부 용출 완충제의 성분은 종종 질량 분석법을 위한 표준 샘플 제조 방법에 도전과제를 제기한다. 따라서, 분석하고자 하는 전체 범위의 단백질을 효율적으로 추출하기 위해 하기 방법을 사용하였다.
상기 기술된 용출 프로토콜을 사용하여 엑소좀을 3개의 별개 칩을 사용하여 인간 혈장으로부터 정제하고, 용출 완충액에서 수집한 후, 이어서, 풀링하였다. 엑소좀을 용해시키기 위해, 샘플 100 ㎕를 하기: (1) 예컨대, 2% 옥틸글루코시드와 같은 계면활성제; (2) 예컨대, 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 류펩틴 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 프로테아제 억제제; (3) 예컨대, 소듐 오르토바나데이트와 같은 포스파타제 억제제; 및 (4) 예컨대, 4-8 M 우레아와 같은 변성제를 포함하는 용해 완충제 900 ㎕에 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 와동시킨 후, 프로브를 최대 전력의 20%로 설정하여 각각 5초씩 3개의 별개의 펄스로 구성된 프로브 초음파 처리를 수행하였다. 불용성 잔해물을 제거하기 위해, 단백질 샘플에 대해 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리를 수행한 후, 추출된 단백질을 포함하는 상청액을 수집하였다. 100 mM 디티오트레이톨(DTT)을 첨가한 후, 아이오도아세트아미드를 사용하여 알킬화함으로써 단백질 이황화 결합을 환원시켰다. 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 샘플 혼합물로부터 모든 단백질을 침전시켰다.
잔류 TCA를 제거하기 위해, 침전된 샘플을 빙냉 아세톤으로 2회 세척하였다. 샘플 pH가 너무 낮게 유지되면, NH4HCO3을 첨가하여 중성으로 조정하였다. 이어서, 먼저 37℃에서 밤새도록 Lys C 효소를 사용한 후, 이어서, 37℃에서 6시간 동안 트립신을 사용하여 샘플에 대해 2회에 걸쳐 별개의 효소 분해를 수행하였다. 생성된 펩티드 혼합물을 탈염시키기 위해, 샘플을 워터스(Waters) C18 HPLC 칼럼에 통과시키고, 수용액으로 세척한 후, 아세토니트릴을 사용하여 용출시켰다. 피어스 펩콴트(Pierce PepQuant) 키트를 사용하여 펩티드를 정량화하고, 각 샘플 50 ㎍에 대하여 질량 분석법 분석을 수행하였다.
상기 개요된 샘플 제조 방법을 이용하여 ACE 정제된 엑소좀의 질량 분석법 분석을 통해 확인된 바이오마커 단백질(표 7):
Figure pct00135
실시예 6: 세포외 소포 단백질 기반 혈액 검사를 이용한 조기 다중 암 검출
대조군 혈장, 및 I기 및 II기 췌장암, 난소암, 및 방광암 사례로부터의 혈장으로부터 세포외 소포(EV: extracellular vesicle)를 단리하였다(도 17). 교류 동전기(ACE) 교류 동전기학(ACE) 기술을 사용하여 단리된 EV 집단은 ISEV 2018 가이드라인24에 따른 엑소좀의 존재와 일치한다(평균 입자 크기 ~120 nm; CD63 양성; TSG101은 막 투과화 후에만 검출될 수 있고; 주사 전자 현미경(SEM: scanning electron microscope) 이미지는 둥근 컵 모양의 형태를 나타내며; 기능성 RNA를 포함한다). EV 단리 후, 입자 크기 분포 및 농도를 측정하였고, 두 코호트 모두에 대한 단리가 등가인 것으로 확인되었다(도 22a-22c). 실제 스크리닝 시나리오를 모의하기 위해, 모든 암 사례는 치료를 받은 적이 없었고; 이들이 환자인지 확인하기 위해 미국 암 연합회(AJCC) 가이드라인을 사용하여 조직병리적 병기 결정을 확인하였다. 암 사례의 연령(중앙값)은 60세(59.7% 여성, 40.3% 남성)였다. 특히, 전체 암 사례 중 63.3%는 I기였고, 남은 36.7%는 II기였다. 추가로, I기 난소암 코호트는 주로(60%) IA기 샘플로 구성되었다. 대조군의 경우, 공지된 암 또는 자가면역 질환 병력은 없었고, 연령(중앙값)은 57세(50.0% 여성, 50.0% 남성)였다.
프로테오믹 분석을 위해 ACE 단리된 EV를 사용하는 것의 이점을 평가하기 위해, ACE 또는 분별 초원심분리 방법을 사용하여 사례 및 대조군 환자 샘플의 서브세트로부터 EV를 단리하였다(도 17). 단리 후, 두 방법 사이에 관찰된 유일의 물리적 차이는 ACE를 사용하여 단리된 EV의 평균 입자 크기가 약간 감소되었다는 것이었다(UC의 경우, 138 nm 대 ACE EV의 경우, 120 nm; 도 18a). 입자 크기 분포의 추가 분석은 도 23a-23b에 제시되어 있다. 두 방법에 의해 제조된 EV를 전체 혈장 단백질 함량에 대해 평가하였을 때, UC EV 제제는 ACE EV보다 훨씬 더 높은 수준을 함유하는 것으로 나타났다(도 18b). 예를 들어, 혈장 단백질 IgG에 의한 오염은 UC 단리된 물질에서 훨씬 더 높았다(도 23a-23b). 이는 UC로 제조된 EV가 단백질 및 핵산 응집체와 함께 공동 정제된다는 이전 보고서와 일치한다. 다른 두 방법으로 정제된 EV를 그의 단백질 바이오마커 신호에 대해 비교하였을 때, 본 발명자들은 UC 단리된 EV가 아닌 ACE 단리된 EV로부터의 2개의 중요한 바이오마커(CA19-9 및 CA 125)가 사례와 대조군 사이에 강력한 차이가 있다는 것을 발견하였다(도 18c). 두 단리 기술 모두에서 얻은 EV에 대한 측정 요약은 표 8에 제시되어 있다. 이 결과는 ACE EV 단리가 혈장으로부터 직접 EV를 정제하는 데 적합한 도구가 될 수 있고, 따라서, 프로테오믹 분석과 관련하여 적절한 길을 제공할 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, ACE를 사용한 EV 단리는 더 효율적이며, 추가의 전처리 또는 후처리 단계가 필요하지 않기 때문에 전체 프로세스는 약 2시간 정도 소요되고, 면역친화성에 의존하지 않으며, EV를 손상시킬 수 있는 샘플 처리가 적다. 가장 중요한 것은 UC와 달리, EV의 ACE 단리는 고처리량의 자동화 시스템에 통합될 수 있는 잠재성이 있다.
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Figure pct00139
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사례-대조군 연구는 다중 면역검정을 통한 연구 코호트 암 사례(47건의 췌장암, 44건의 난소암, 48건의 방광암) 및 대조군(184명의 대조군), 둘 모두에 대한 42개의 EV 연관 단백질 바이오마커 수준 측정을 포함하였고, 각 단백질 수준의 개별 평가를 수행하였다(정규화된 단백질 수준의 히트맵은 도 24a-24b에 제시되어 있다). 추가로, 정제되지 않은 전체 순환 혈장 단백질("유리 단백질")의 수준을 동일한 연구 코호트로부터 측정하였다(도 24a-24b). 가장 큰 차이를 보일 가능성이 있는 EV 연관 단백질 바이오마커를 확인하기 위해, 교차 검증과 함께 반복 피처 제거(RFE)를 사용하여 매우 높은 특이도(> 99%)에 기초하여 관련성이 가장 높은 바이오마커를 선택하는 데 선택 프로세스를 이용하였다. 반복된 교차 검증을 사용하였을 때, 상기 파일럿 연구에 대한 표본 크기 제한 내에서 가장 잘 작동하였다(N=323). 5겹 교차 검증을 100회 반복하였고(도 19), 모든 반복에 걸쳐 RFE 알고리즘은 단계적 역방향 선택을 사용하여 부분 AUC(pAUC: partial AUC)를 최대화하는 최적의 바이오마커 수에 도달하였다31. 위양성 테스팅과 연관된 비용을 감소시키기 위해서는 MCED 타입의 접근법 경우에 중요하기 때문에 0.75 내지 1.00의 특이도에서 p(AUC)를 최적화함으로써, 위양성(대조군을 암으로 잘못 호출) 발생빈도가 감소되는 방향으로 바이오마커 선택을 적합화시켰다. 상기 전략법을 통해 13개의 EV 단백질 마커가 선택되었다. 바이오마커 선택 후, 코호트를 암 유형(췌장암, 난소암, 및 방광암)별로 계층화된 훈련 세트(샘플 중 67%)와 "홀드 아웃" 세트(샘플 중 33%)로 무작위로 분할하여 조기에 암 검출 가능성을 탐색하는 로지스틱 회귀 모델에서 각 바이오마커에 대한 각각의 계수를 추정하였다(도 19). 개별 로지스틱 회귀 계수는 훈련 세트를 사용하여 추정한 반면, 성능은 홀드 아웃 테스트 세트에서 평가하였다. 13개의 선택된 바이오마커에 대해 사례와 대조군을 비교하는 박스 플롯은 도 25에 제시되어 있고, 그의 계수 및 중요도 점수는 표 9에 제시되어 있고, 그의 피어슨 상관계수는 표 10 및 도 26에 제시되어 있다.
Figure pct00142
Figure pct00143
더 큰 데이터 세트가 실행되는 방식을 더 잘 나타내는 널리 사용되는 리샘플링의 통계 프로세스를 사용함으로써 상기 성능 평가를 강화시켰다. 리샘플링을 통해 초기 무작위 분할이 해당 초기 분할에서 피험체가 드물게 분포하기 때문에 비현실적인 모델을 생성했는지 여부를 평가하였다. 100개의 훈련 세트 및 테스트 세트를 전체 데이터로부터 무작위로 리샘플링하였고(각각 피험체의 2/3 및 1/3), 훈련 부분에 대해 100개의 개별 로지스틱 적합도가 생성되었고; 이들 적합도로부터 테스트 세트에 대한 개별 ROC 곡선이 작성되었다(도 20a). 유사하게, 홀드 아웃 테스트 세트에서 피험체가 피처링될 때마다, 해당 로지스틱 모델에 대한 적합도가 생성되었고, 이어서, 특정 피험체가 테스트 세트에 사용된 모든 시간들 간의 평균값을 구하였고, 상기 평균 적합도로부터 모델의 전체 성능을 평가하였다. 무작위로 분할된 100개의 테스트 세트 각각에 대한 성능을 개별적으로 평가하였고, > 99% 표적 특이도에 대한 평균 임계값이 계산되면, 전체 평균 민감도 및 신뢰 구간을 결정할 수 있다.
전체 암 사례 코호트를 EV 단백질 바이오마커 테스트를 사용하여 대조군 개체와 비교하였을 때, 평균 AUC는 도 20a에 제시된 바와 같이 0.95(95% CI = 0.92 내지 0.97)인 것으로 밝혀졌으며, 표 11에 제시된 바와 같이 99.5%(95% CI: 97.0 내지 99.9)의 특이도에서 평균 민감도는 71.2%(95% CI: 63.2 내지 78.1)였다. 100개 테스트 세트의 평균에 대해 엑소-단백질에 대한 AUC는 각각 0.87 대비 0.95로 등가의 혈장 유리 단백질의 AUC보다 더 큰 것으로 밝혀졌다(도 27). 연구된 3개의 암을 모두 고려했을 때, 본 발명자들의 EV 단백질 테스트를 통해 I기 및 II기 환자에 대해 각각 70.5%(95% CI: 60.2 내지 79.0) 및 72.5%(95% CI: 59.1 내지 82.9)의 민감도를 나타내었다(도 20b, 표 11). 추가로, 본 발명자들은 각 개별 암에 대해 > 99% 특이도에서 민감도를 분석하였고, 방광암의 경우, 값은 43.8%(95% CI: 30.7 내지 57.7)이고, 난소암의 경우, 75.0%(95% CI: 60.6 내지 85.4)이고, 췌장암의 경우, 95.7%(95% CI: 85.8 내지 98.8)인 것으로 나타났다(도 20c). 이러한 결과는 EV 단백질이 스크리닝 관련 민감도로 조기 암을 검출할 가능성이 있다는 것을 시사한다.
Figure pct00144
본원에서 확인된 13개의 EV 단백질 바이오마커는 암 발생에서 중추점을 나타낼 수 있는 광범위한 생물학적 기능을 포괄한다. 뉴로필린-1 및 CA15-3은 조기 악성종양에서 비정상적인 성장 인자 신호전달을 매개한다. 암 구동인자로 공지된 CA 19-9, MPO 및 TIMP-1은 이전에 또 다른 다중 암 검사에서도 사용된다. 뉴로필린-1 및 sE-셀렉틴은 혈관신생 프로세스의 공지된 구동인자인 반면37, 38, 엑소좀 카텝신-D, MIA, IGFBP3, sFas 및 페리틴은 종양 진행에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. sFAS는 암 줄기 세포 생존을 촉진하는 것으로 밝혀졌고, bHCG는 난소암 세포 진행에서 상피에서 중간엽으로의 전이 이벤트를 조절할 수 있다. 이전에 여러 단백질이 EV에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 전체 혈청 CA-125는 난소암에 대한 치료 반응 및 재발을 모니터링하는 데 사용하도록 승인되었지만, 스크리닝 마커로 사용하는 것은 권장되지 않고 있다. 유사하게, 전체 혈청 CA19-9는 췌장암 치료 및 재발 모니터링에 대해서는 FDA 승인을 받았지만, 중요한 것은 CA19-9 그 자체가 여러 양성 병태에서 상승할 수 있기 때문에 스크리닝에 대해서는 승인을 받지 못한 상태이다.
EV 단백질 기반 테스트의 잠재적 유용성을 추가로 이해하기 위해, 각 암에 대한 병기에서 성능을 평가하고, 전체 분석에서 결정된 99.5% 특이도에서 민감도를 비교하였다. 각 암 유형에 대한 표본 크기가 상대적으로 작다는 점을 고려하였을 때, 이 테스트는 22명의 I기 PDAC 환자(95.5%; CI: 78.2 내지 99.2) 및 25명의 II기 PDAC 환자(96.0%, CI: 80.5 내지 99.3), 둘 모두를 검출하는 데 매우 높은 민감도를 보였고(도 21a), 이는 상기 악성종양의 조기 검출을 위한 잠재적 돌파구를 나타낸다. I기 난소암(N=39) 검출 또한 도 21b에 제시된 바와 같이 잠재적인 임상적 영향을 미치는 수준(74.4%, CI: 58.9 내지 85.4)에서 이루어졌다. 난소암 코호트는 치명적으로 공격적인 장액성 선암종 조직(I기/II기, N=22) 및 IA기(N=26)로 추가로 세분화되었으며, 민감도 범위는 각각 >99% 특이도에서 68.2%(CI: 47.3 내지 83.6) 내지 73.1%(CI: 53.9 내지 86.3 CI)인 것으로 나타났다. 어느 서브타입이든 그를 조기 검출하면, 수술로 치유될 수 있는 바, 생존율에 영향을 미칠 수 있다. 방광암에서, 테스트는 도 21c에 제시된 바와 같이 44.4%(CI: 27.6 내지 62.7)로 27명의 I기 환자 및 42.9%(CI: 24.5 내지 63.5)로 21명의 II기 환자를 검출할 수 있었다. 췌장암 및 난소암의 경우, 민감도가 높은 것과 비교하여 방광암의 경우, 민감도가 더 낮다는 것은 평가된 패널에서 조기 방광암을 발견하는 데 적합한 바이오마커의 이용가능성이 제한되어 있다는 것을 반영할 수 있다. 추가로, 방광암은 분자적, 조직학적 이질성이 높은 것으로 알려져 있다.
전체적으로 볼 때, 이러한 결과는 EV 기반 단백질 바이오마커 테스트가 각 암 내의 임의의 서브코호트로 편향되지 않음을 시사하는 것이다. 췌장 관 선암종(PDAC) 및 난소암 검출은 집단 수준의 스크리닝이 실행가능하도록 하기 위해서는 ~99% 특이도가 요구되지만, 방광암은 더 낮은 특이도 임계값으로부터 이익을 얻을 수 있다는 주장이 제기될 수 있다. 다중 암 조기 검출(MCED: multi-cancer early detection) 검사라는 신흥 분야에서, 다른 테스트가 말기 암의 예후를 개선시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있는 반면, I기 및 II기 PDAC 사례에 대하여 본 발명자들의 96% 민감도로 예시되는 바와 같이, 본 테스트는 조기 암 검출에 더 높은 민감도를 제공할 수 있는 바, 본 테스트는 유일무이한 것이다.
임의의 파일럿 연구와 같이, 인정하는 데 한계가 있다. 첫째, 바이오마커 발견 목적으로는 유익하지만 상대적으로 작은 표본 코호트와 100%의 조기 종양의 포함은 현실적인 암 집단 특징을 반영하지 않으며, 대규모의 무증상 집단을 스크리닝할 때 민감도가 더 낮을 수 있다.5,8 그러나, 생존은 암 조기 발견과 직접적으로 연관되어 있는 바, 본 발명자들은 본 발명자들의 코호트를 I기 및 II기에만 전적으로 집중시키기로 결정하였다. 둘째, 두 코호트 모두 인종적으로 균일하며, 남성과 여성 사이의 암에서 관찰되는 일반적인 빈도와 비교하여 성비는 편향될 수 있다.5 셋째, 본 발명자들의 대조군 집단은 암 병력이 없거나, 또는 실제 스크리닝 환경에서는 추가의 위양성 결과를 가져올 수 있는 공지된 교란 동반이환(예컨대, 만성 췌장염) 병력이 없는 개체로 구성되었다. 마지막으로, 이 파일럿 연구에서는 상기 MCED 접근법의 잠재적 유용성을 확인하기 위해 더 큰 규모의 맹검 샘플 코호트를 사용하여 독립적인 외부 검증이 필요할 것이다.
요약하면, 본 발명자들은 혈액 기반 EV 단백질 검출 테스트를 개발하였고, MCED에서 그의 잠재적인 역할을 입증하였다. EV 단백질 바이오마커 테스트는 500 ㎕ 미만의 혈장을 필요로 하며, 자동화된 워크플로우 내로의 통합을 허용한다. 비침습적 혈액 기반 접근법을 사용하여 본 발명자들은 암에서 공지된 보조인자인 연령과 함께,54 높은 진단 잠재능(AUC = 0.95)으로 I기 및 II기 췌장암, 난소암, 및 방광암을 검출할 수 있는 13개의 EV 단백질 패널을 선택하였다. 가장 중요한 것은 본 발명자들은 향후 스크리닝 노력의 핵심 요소인 높은 특이도(99.5%)에서 71.2%의 민감도를 수득하였다는 점이다. 본 테스트는 AC 동전기적, 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 확장가능한 플랫폼을 통해 조기 암 검출에서 EV를 효과적으로 이용한 최초의 것이다. 베리타™ 플랫폼은 멀티-오믹(multi-omic) 검출 능력이 있는 바, 다른 엑소-단백질, 엑소좀 mRNA, 및/또는 순환 DNA 바이오마커를 추가할 수 있다.
물질 & 방법
샘플 수집 및 프로세싱
본 후향 연구를 위한 모든 시료는 수년에 걸쳐 상업용 생물저장소(ProteoGenex, Inglewood: 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 수집하였다. I기 및 II기 샘플은 이용가능한 재고에서 선택적으로 수득하였다. 샘플을 병원 환경에서 환자로부터 수집하였고, 수집 후, 상업용 생물저장소에 의해 유지하였다. 병원 환경에서는 환자 증상에 대한 반응으로 또는 정기적인 연간 검사의 일부로 수행된 이미징 중에 발생하는 임의의 의심스러운 소견을 통해 잠재적인 암 환자를 확인하였다. 어떤 환자가 증상이 있고, 어떤 환자가 무증상인지에 대한 정보는 이용할 수 없었다. 후속 조직 생검을 통해 암을 확인하였고, 원위부로의 확산을 평가하는 이미징과 함께, AJCC(7판) 가이드라인에 따라 병리 및 수술 보고서를 사용하여 병원의 병리학자에 의해 병기를 결정하였다. 암 확진을 받은 피험체는 모두 혈액 수집 시점에 치료를 받은 적이 없었다(수술, 국소 및/또는 전신 항암 요법 전). 생물 저장소는 인구통계, 수술 및 병리 정보와 함께 환자 샘플을 제공하였다. 상기 데이터 분석을 통해 환자에 대한 병기 결정을 정확성에 대해 재차 리뷰하였다. 난소암 환자에 대해서는 일률적인 종합 외과적 병기 결정이 수행되지 않았기 때문에 명시된 병기보다 높은 잠복 질환을 배제할 수 없다. 대조군은 공지된 암 병력, 공지된 자가면역 질환, 또는 신경퇴행성 질환이 없을 뿐만 아니라, 당뇨병(1형 및 2형)도 존재하지 않는다. 본 연구에는 2014년 1월부터 2020년 9월 사이에 3개의 암 중 하나로 진단받은 139명의 피험체('암 사례 환자 코호트')를 포함하여 총 323명의 피험체가 포함되었다. 암 사례 코호트에서는 생검 직전(중앙값 -1일, 평균 -2.7일), 및 외과적 개입, 방사선 요법, 또는 암 관련 전신 요법 전에 전정맥 혈액 시료를 수집하였다. 연령(중앙값)은 암 사례 코호트(N=139, 56명의 남성, 83명의 여성)에서는 60세[최소 - 최대 21-76]였고, 대조군 코호트(N=184, 82명의 남성 및 82명의 여성)에서는 57세[최소 - 최대 40-71]였다. 전혈 샘플을 K2EDTA 혈장 진공채혈관에 수집하고, 수집 후 4시간 이내에 혈장으로 프로세싱하였다. 전혈을 먼저 1,500 x g로 4℃에서 10분 동안 브레이크를 사용하지 않고 회전시켰다. 1차 회전 후, 혈장을 새 튜브로 옮기고, 1,500 x g로 10분 동안 2차 회전을 수행하였다. 2차 회전 후, 혈장을 1 mL 튜브에 분취하고, -80℃에서 1시간 이내에 동결시켰다. 본 연구에서 사용된 모든 시료는 동일한 조건하에서 프로세싱하였다.
EV/ 엑소좀 단리 및 입자 특징화
AC 동전기를 이용한 EV 단리
AC 동전기(ACE: AC Electrokinetic) 기반 단리 방법(Biological Dynamics: 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 혈장으로부터 엑소좀을 비롯한 EV를 추출하였다. 간략하면, 희석되지 않은 각 혈장 240 ㎕를 베리타™ 칩에 도입하였고, 120 min 동안 3 ㎕/min로 칩 전체에 혈장을 유동시키면서, 7 Vpp 및 14 KHz의 전기 신호를 적용하였다. EV는 동력을 공급받은 미세전극 어레이에 포획되었고, 비결합 물질은 용출 완충제(Elution Buffer) I(Biological Dynamics)을 사용하여 3 ㎕/min으로 30 min 동안 칩으로부터 세척되었다. 전기 신호를 끄고 칩에 남아 있는 용액(35 ㎕)에 EV를 유리시킨 후, 이어서, 수집하고, 정제, 농축/용출된 EV를 포함하는 용액을 추가 분석에 직접 사용하였다. 이 방법은 이전에 고형 종양 및 혈액 악성종양, 둘 모두에서 무세포 DNA, 엑소좀 RNA 및 엑소좀 단백질 마커를 단리하는 데에도 사용되었다.25,26,55-58. 베리타 정제된 EV는 제타뷰 기기(Particle Metrix, Inning am Ammersee: 독일 소재)를 통해 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 특징화하였다. 도 22a-22c는 사례 코호트와 대조군 코호트 사이에 비교된 엑소좀에 대한 입자 크기와 농도 값을 보여주는 것이다.
분별 초원심분리를 통한 EV 단리
사례 샘플 및 대조군 샘플의 서브세트에 대하여 종래 EV 단리 수단으로서 분별 초원심분리를 수행하였다. 간략하면, 760 ㎕의 1x PBS를 240 ㎕의 각 혈장에 첨가한 후, 이어서, 500 x g로 10 min 동안, 3000 x g로 20 min 동안, 및 12,000 x g로 20 min 동안 연속하여 회전시키고, 각 단계 후에는 상청액을 수집하였다. 이어서, 생성된 상청액에 대해 100,000 x g로 70 min 동안 초원심분리를 수행하고, 펠릿을 1x PBS 중에서 세척한 후, 다시 100,000 x g로 70분 동안 초원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 생성된 펠릿을 추가 분석을 위해 120 ㎕의 1x PBS 중에 재현탁시켰다.
단백질 오염 분석
베리타™ 플랫폼 및 분별 초원심분리 프로세스, 둘 모두로부터의 EV 제제 중의 전체 단백질 오염 존재를 확인하기 위해, 제조업체 사양에 따라 실행되는 큐비트™ 단백질(Qubit™ Protein) 정량화 검정법(카탈로그 번호 Q33212, ThermoFisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬 소재)과 함께 큐비트 4(Qubit 4) 형광계(ThermoFisher Scientific: 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 이용하여 샘플을 분석하였다. 단리 생성물 상의 오염 단백질 조성에 대해 추가로 이해하기 위해, 단백질 분석용 단백질 230(Protein 230) 키트(카탈로그 번호 5067-1517)가 포함된 2100 바이오애널라이저(2100 Bioanalyzer)(Agilent: 미국 캘리포니아주 산타 클라라)를 제조업체의 지시에 따라 사용하였다.
단백질 바이오마커 분석
베리타 단리된 EV 샘플 뿐만 아니라, 동일한 환자로부터의 정제되지 않은 원래의 혈장 샘플을 상업용 다중 면역검정에 직접 사용하여 마커 단백질의 존재를 정량화하였다. 간략하면, 정제된 각 EV 샘플 2 x 35 ㎕를 각 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 3개의 상이한 각 비드 기반 면역검정 키트(Human Circulating Biomarker Magnetic Bead Panel 1(카탈로그 번호 HCCBP1MAG-58K), Human Angiogenesis Magnetic Bead Panel 2(카탈로그 번호 HANG2MAG-12K), 및 Human Circulating Cancer Biomarker Panel 3(카탈로그 번호 HCCBP3MAG-58K); Millipore Sigma: 미국 매사추세츠주 버링턴 소재)에 의해 분석하는 데 사용하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 MAGPIX 시스템(Luminex Corp: 미국 텍사스주 오스틴 소재)을 이용하여 단백질 바이오마커 농도를 평가하였다. Belysa 소프트웨어 v. 3.0(EMD Millipore)을 사용하여 보정 곡선으로부터 최종 단백질 농도를 측정하였다. 각 바이오마커에 대한 검출 한계(LOD) 및 측정 단위가 표 12에 열거되어 있다.
Figure pct00145
EV 바이오마커 신호에 대한 스파이크 EV 단리 모델
EV 상의 관련 단백질 바이오마커의 존재를 추가로 이해하기 위해, 상이한 두 세포주를 대표하는 세포 배양 상청액으로부터 정제된 EV를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포주 H1975(ATCC CRL-5908™)는 CA19-9 마커를 발현하는 것으로 알려져 있는 반면, 세포주 HeLa(ATCC CRM-CCL-2™)는 CA 125 마커를 발현하는 것으로 알려져 있다. 간략하면, H1975 EV를 K2EDTA 혈장에 3개의 상이한 희석비(원래의 UC 프렙(UC prep)으로부터 1:200, 1:400 및 1:800)로 스파이킹하고, 베리타™ 플랫폼을 이용하여 EV를 단리한 후, 이어서, 루미넥스(Luminex) 플랫폼 상에서 CA 19-9 바이오마커의 존재에 대하여 분석하였다(도 28a-28b). 또 다른 실험에서, H1975 EV 및 HeLa EV를 K2EDTA 혈장에 스파이킹하고, 베리타™ 플랫폼을 이용하여 단리하였다. 바이오마커 판독 결과를 통해 CA19-9가 H1975 EV에 대해 상승하고 CA 125가 HeLa EV에 대해 상승하는 각각의 예상 신호의 양성 검출이 확인된다(도 28a-28b).
EV/ 엑소 -단백질 바이오마커 테스트 개발
바이오마커 선택
42개 EV 단백질의 초기 평가로부터, 누락되거나, 또는 검출 한계(LOD) 미만인 50% 미만의 샘플을 포함하는 34개의 상이한 바이오마커를 고려하였다(표 12). 값이 누락되거나, 또는 결과가 LOD 미만인 경우, 값을 LOD로 설정(전가)하였다. 모든 바이오마커에 대한 분포를 평가하였고, 분포는 광범위한 것으로 나타났으며; 따라서, 후속 분석에서 모든 EV 단백질 바이오마커 값에 대해 Log2 변환을 사용하였다. 분류 모델 구축에서 다중공선성에 대한 가능성을 결정하기 위해 R 모듈 'Corrplot'을 사용하여 바이오마커 간의 상관관계를 탐색하였다(모든 바이오마커 측정값으로부터의 상관관계 히트맵이 도 29a-29b에 제시되어 있다). 이어서, 교차 검증과 함께 반복 피처 제거를 이용하여 가장 유익한 바이오마커를 결정하였다. 본 방법론에서는 단계적 역방향 선택을 사용하여 바이오마커의 서브세트를 선택하는 데 5겹 중 4겹이 사용된다. 상기 프로세스는 홀드 아웃 테스트 세트로서 각 겹을 1번씩 사용하여 5회 반복하였다. 교차 검증의 겹은 무작위로 선택되었는 바, 이를 100회 반복하였고, 모든 테스트 세트 간에 75% 내지 100%의 특이도 범위에 걸쳐 부분 AUC(pAUC: partial AUC)를 최대화하는 바이오마커의 서브세트를 선택하였다.
계수 결정 및 성능 평가
일단 바이오마커를 선택하고 나면, 암 유형별로 계층화된 훈련 세트(67%) 및 테스트 세트(33%)로의 데이터의 초기 분할을 통해 훈련 세트를 사용하여 모델에 대하여 회귀 계수를 추정하고, 홀드 아웃 테스트 세트에서 분류 성능을 평가함으로써 선택된 바이오마커의 성능을 결정할 수 있었다(도 19). 본 발명자들의 상대적으로 작은 표본 크기를 고려하여 모델에 대한 공정한 평가를 추구하고, 과적합을 막기 위해, 100개의 독립 훈련 세트 및 테스트 세트(암 유형별로 계층화된 323명의 개체 중 2/3 및 1/3으로 구성)를 전체 데이터 세트로부터 리샘플링하였다. 각 리샘플을 위해 훈련 세트 중의 피험체는 모델에서 바이오마커 회귀 계수를 추정하는 데 사용한 반면, 홀드 아웃 테스트 세트 중의 피험체에서는 독립적으로 진단 성능을 평가하였다. 각각의 각 분할에서 각각의 피험체에 대한 개별 적합도에 기초하여 테스트 세트에 대해 수신자-조작자 특성(ROC) 곡선, 곡선하 면적(AUC), 민감도, 특이도 및 관련 지표를 계산하였다. 각 테스트 세트에 대해, > 99% 특이도의 임계값 결정을 계산하였고(각 테스트 세트에 61명의 대조군 피험체가 존재하였기 때문에, 이는 효과적으로 61명 중 61명을 올바르게 호출했다는 것을 의미한다), 이어서, 평균 임계값을 계산하였다. 각 피험체에 대한 테스트 세트에서 평균 임계값 및 평균 적합도를 이용하여, 전체 코호트에 대해서 뿐만 아니라, 서브코호트(예컨대, 췌장암)에 대해 성능을 평가하였다. AUC에 대한 95% 신뢰 구간은 편향 보정된 부트스트래핑 방법을 사용하여 계산한 반면(N = 2000), 성능 지표, 즉, 민감도 및 특이도에 대한 신뢰 구간은 윌슨 양측 방법을 기반으로 계산하였다. 로지스틱 회귀 모델을 평가하는 동안, 선택된 각 바이오마커의 중요도는 평균 표준화 계수를 사용하여 평가하였다(표 9). 여기서 "중요도"는 예측인자 간의 정량적 비교로 이해될 수 있다. 하나의 예측인자가 회귀에서 고려되는 모든 모델에 걸쳐 반응 변수 예측에 더 많이 기여하는 경우 또 다른 예측인자보다 더 중요하다.
본원에서는 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되어 기술되어 있지만, 그러한 실시양태는 단지 일례로만 제공되는 것이라는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 이에, 당업자는 본 발명으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환을 착안해 낼 수 있을 것이다. 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범주를 정의하고, 이러한 청구범위의 범주 내에 속하는 방법 및 구조 및 그의 등가물은 그러한 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (25)

  1. 질환 상태와 연관된 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
    (a) AC 유전영동장(dielectrophoretic field)을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 질환 상태를 갖는 것으로 알려진 개체의 제1 생물학적 샘플 중 제1 복수의 분석물을 단리하는 단계;
    (b) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 건강한 개체의 제2 생물학적 샘플 중 제2 복수의 분석물을 단리하는 단계; 및
    (c) 제1 복수의 분석물의 서브세트를 확인하는 단계로서, 여기서 서브세트는 제2 생물학적 샘플과 비교하여 제1 생물학적 샘플에서 정량적으로 상이하고,
    여기서 서브세트는 질환 상태와 연관이 있는 것으로 확인되는 것인 단계
    를 포함하는, 질환 상태와 연관된 바이오마커를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단리하는 단계가 낮은 유전영동장 영역 및 높은 유전영동장 영역을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단리하는 단계가 하나 이상의 전극에서 제1 복수의 분석물 또는 제2 복수의 분석물을 포획하는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 서브세트를 확인하는 단계가 제1 복수의 분석물 및 제2 복수의 분석물의 질량 분석법 분석을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 서브세트를 확인하는 단계가 제1 복수의 분석물 및 제2 복수의 분석물을 각각 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 분석물이 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분석물이 핵산을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 분석물이 엑소좀을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, (c)가 제1 복수의 분석물 및 제2 복수의 분석물에 대하여 질량 분광법을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 질환 상태가 암, 신경계 질환, 감염, 또는 염증성 질환인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 암이 췌장암, 난소암, 방광암, 결장직장암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 유방암, 피부암, 림프종, 설암, 입암(mouth cancer), 인두암, 구강암, 식도암, 위암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 항문직장암, 간암, 간내 담관암, 담낭암, 담도암, 소화기암, 후두암, 기관지암, 호흡기암, 골암, 관절암, 연조직암, 심장암, 흑색종, 비상피 피부암, 자궁암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 생식기암, 고환암, 신장암, 신우암, 요관암, 비뇨기암, 안암, 안와암, 신경계암, 내분비암, 갑상선암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 또는 백혈병인 방법.
  12. (a) 개체로부터의 생물학적 샘플 중 분석물의 양을 측정하는 단계; 및
    (b) 분석물의 양이 대조군 샘플에서 관찰되는 양보다 더 많거나 또는 더 적을 때, 개체는 질환 발병 위험이 있는 것으로 확인하는 단계
    를 포함하는 분석 방법.
  13. 제12항에 있어서, 분석물이 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에서 확인된 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 분석물이 표 5에 제공된 하나 이상의 단백질을 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하는 단계가 AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 생물학적 샘플 중 분석물을 단리하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단리하는 단계가 낮은 유전영동장 영역 및 높은 유전영동장 영역을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 단리하는 단계가 하나 이상의 전극에서 제1 복수의 분석물 또는 제2 복수의 분석물을 포획하는 것을 포함하는 것인 방법.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하는 단계가 분석물의 질량 분석법 분석을 포함하는 것인 방법.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  20. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 핵산을 포함하는 것인 방법.
  21. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분석물이 엑소좀을 포함하는 것인 방법.
  22. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 암, 신경계 질환, 감염, 또는 염증성 질환인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 암이 췌장암, 난소암, 방광암, 결장직장암, 폐암, 뇌암, 전립선암, 유방암, 피부암, 림프종, 설암, 입암, 인두암, 구강암, 식도암, 위암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 항문직장암, 간암, 간내 담관암, 담낭암, 담도암, 소화기암, 후두암, 기관지암, 호흡기암, 골암, 관절암, 연조직암, 심장암, 흑색종, 비상피 피부암, 자궁암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 생식기암, 고환암, 신장암, 신우암, 요관암, 비뇨기암, 안암, 안와암, 신경계암, 내분비암, 갑상선암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 또는 백혈병인 방법.
  24. 치료 표적을 확인하는 방법으로서,
    (a) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극 어레이를 사용하여 질환 상태를 갖는 것으로 알려진 개체의 제1 생물학적 샘플 중 제1 복수의 분석물을 단리하는 단계;
    (b) AC 유전영동장을 발생시키도록 구성된 전극을 사용하여 건강한 개체의 제2 생물학적 샘플 중 제2 복수의 분석물을 단리하는 단계; 및
    (c) 제1 복수의 분석물의 서브세트를 확인하는 단계로서, 여기서 서브세트는 제2 생물학적 샘플과 비교하여 제1 생물학적 샘플에서 정량적으로 상이하고,
    여기서 서브세트는 치료 표적으로서 확인되는 것인 단계
    를 포함하는, 치료 표적을 확인하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, (c)가 제1 및 제2 복수의 분석물의 질량 분광법을 포함하는 것인 방법.
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