CN113801964A - 一种病毒rna的无探针检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒RNA的无探针检测方法，包括以下步骤：步骤1：用RT‑PCR试剂和RT‑PCR模板将病人样本进行孵育；步骤2：从孵育得到的产物中通过介电泳效应DEP分离出PCR产物；步骤3：采用紫外吸收检测得到的PCR产物；本发明不需要探针和荧光染色，成本降低50％以上；并且检测信号基于无样本的正检测、集中信号和低背景信号而增加。此外，RT‑PCR反应的孵育时间因灵敏度高而缩短，检测速度远快于现有的探针检测法。并且采用紫外吸收进行检测，降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种病毒RNA的无探针检测方法。
背景技术
新的、致命的和高度流行的病毒比上个世纪发生的更频繁，目前RT-PCR是检测病毒RNA最成熟的方法之一。例如在新冠病毒爆发过程中，RT-PCR的荧光探头检测方法是快速筛查可能感染人员的重要方法。这种荧光探头检测技术能在6小时内给出数以百万计的人提供检测结果，并且准确性达到了95％。其过程如图1所示，首先用RT-PCR试剂和带有探针(荧光染料)的RT-PCR模板(针对SARS-Cov-2 RNA)在37℃时(＞4小时)将采集的病人样本(即鼻拭子或咽拭子取得的样本)进行孵育。在此过程中，RT-PCR模板与SARS-Cov-2 RNA靶位点结合，同时PCR产物正在扩增。由于竞争性的结合，探针标记的SS(单链)DNA会被从RT-PCR模板中去除。然后，对样品洗涤或荧光猝灭，检测PCR反应引起的荧光丢失，从而探测患者样本中是否存在SARS-Cov-2 RNA。但是这种方法存在相应的缺陷，由于染料本身、染料附着程序和纯化，与探针结合的RT-PCR模板(荧光染料)的成本即大于50％、反应时间长(＞4小时)、此外由于来自样本的负检测、稀释信号和高背景信号，检测信号存在缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种成本较低、灵敏度高的病毒RNA的无探针检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种病毒RNA的无探针检测方法，包括以下步骤：
步骤1：用RT-PCR试剂和RT-PCR模板将病人样本进行孵育；
步骤2：从孵育得到的产物中通过介电泳效应DEP分离出PCR产物；
步骤3：采用紫外吸收检测得到的PCR产物。
进一步的，所述步骤1中的孵育条件如下：
在-10℃～80℃条件下，孵育0min～60min。
进一步的，所述步骤2中的介电泳效应通过施加振荡电场来获取。
进一步的，所述步骤2中将孵育得到的产物置于管道中，通过注射器泵使产物在管道中流动；管道外部电场区域对应位置设置有金属薄膜，通过电压发生器向管道施加振荡电场。
进一步的，所述步骤3中还包括通过凝胶电泳对DNA分离进行定性检测。
进一步的，所述管的直径为0～1m，管的长度为0～10m，管道中产物的流速为0～1米/秒。
进一步的，所述病毒为SARS-CoV-2。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用介电泳效应分离PCR产物，PCR产物由感应偶极子产生的力分离，其力的大小由外加电场强度决定，电场强度大小可以根据实际情况决定；
(2)本发明由于没有探针，其成本大大降低，可以降低50％以上的成本；
(3)本发明检测信号基于无样本的正检测、集中信号和低背景信号而增加，检测灵敏度高；由于检测灵敏度高，可以大大降低孵育时间，检测速度更快；
(4)本发明采用紫外吸收进行检测，检测成本低于荧光发射检测方法。
附图说明
图1为现有RT-PCR检测方法和本发明检测方法对比示意。
图2为本发明检测方法流程示意图。
图3为本发明实施例中得到的数据，a为DEP分子半径和理论阈值场强的关系示意图，b为显微镜载玻片上的100条垂直金膜的电极图案的放大图，c为分离的荧光染色λDNA分子的随机运动，d为通过介电泳DEP力捕获λDNA分子。
图4为实施例中管中的电场示意图。
图5为实施例的模拟结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种病毒RNA的无探针检测方法，包括以下步骤：
步骤1：用RT-PCR试剂和RT-PCR模板将病人样本在-10℃～80℃条件下，孵育0min～60min。
步骤2：从孵育得到的产物中通过介电泳效应DEP分离出PCR产物；介电泳效应通过施加振荡电场来获取；将孵育得到的产物置于管道中，通过注射器泵使产物在管道中流动；管道外部电场区域对应位置设置有金属薄膜，通过电压功能发生器向管道施加振荡电场。管的直径为0～1m，管的长度为0～10m，管道中产物的流速为0～1米/秒。具体的参数可以根据实际情况或者实验结果进行设置。
在病人样本处于流动状态的情况下，在管道中(本实施例选择的管道直径约为2mm)施加电场梯度，可以实现PCR产物的分离。可以利用塑料管外涂覆的金属带产生的电场；可以利用商用模拟工具(电磁场模拟，EMWORKS)将电场梯度用于管道中。管道外电场区域对应位置(如图4所示)涂覆金属薄膜或者是金属带，通过电压发生器施加电场梯度。电场区域的位置和数量根据实际情况施加，无电场区域的位置和数量根据情况施加。电场方向的角度根据具体情况施加，可以根据实验结果调整具体的参数，参数的设置不影响结果的实现。电场强度的大小也根据具体的情况设置，如图5所示，本实施例选择了三个对应的电场强度进行模拟(E＝103V/m，E＝104V/m，E＝105V/m)，从模拟结果可以看出，DNA和PCR产物均可以较好的分离。
为了能够实时监控DNA的运动，对DNA进行染色(可以选择现有的方法进行)，荧光发射到激光上，在CCD摄像机下进行监控。采用二极管泵浦固体激光器532nm绿激光线激发DNA上的染料，用光学元件对激光线进行对准，并将其传送到显微镜上。
步骤3：采用紫外吸收检测得到的PCR产物。用紫外检测器和凝胶电泳对分离进行复核。用常规紫外吸收检测器对分离的PCR片段进行定量，并用凝胶电泳对DNA进行定性检测。在产生的PCR产物(短DNA约150个碱基对)上进行UV吸收。然而紫外吸收不能区分DNA的大小，因为它只测量碱基对的吸收情况。因此在RT-PCR反应后，将患者样本中的人类DNA(约29亿对碱基对)分离PCR产物。
本实施例中病毒为SARS-CoV-2。当然并不限定这种病毒，任何病毒都可以采用本发明方法进行检测。
本发明通过施加相对强的振荡电场(大于10V/m)，介电力在溶液中迁移了中等大小的DNA。可以利用可控的DEP力和弱流力，将PCR产物从病人样本中的人DNA中分离出来，浓缩，甚至除去比PCR产物更大的物质，使检测信号更加清晰。
施加的振荡电场梯度的强度和面积可以控制，并且在普通的塑料管中即可实现。随着电场和电场梯度的增大，电场梯度的应用域变窄。DEP力与电场方向无关，但是在具体检测过程中需要防止振荡电场在溶液中产生热量。本发明方法不需要探针和荧光染色(本发明中提到的染色是为了观察DNA的运动，不是必需的步骤)，成本降低50％以上。并且检测信号基于无样本的正检测、集中信号和低背景信号而增加。此外，RT-PCR反应的孵育时间因灵敏度高而缩短，检测速度远快于现有的探针检测法。并且采用紫外吸收进行检测，降低了检测成本。
Claims (7)
1.一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：用RT-PCR试剂和RT-PCR模板将病人样本进行孵育；
步骤2：从孵育得到的产物中通过介电泳效应DEP分离出PCR产物；
步骤3：采用紫外吸收检测得到的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述步骤1中的孵育条件如下：
在-10℃～80℃条件下，孵育0min～60min。
3.根据权利要求1所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述步骤2中的介电泳效应通过施加振荡电场来获取。
4.根据权利要求1所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述步骤2中将孵育得到的产物置于管道中，通过注射器泵使产物在管道中流动；管道外部电场区域对应位置设置有金属薄膜，通过电压发生器向管道施加振荡电场。
5.根据权利要求1所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述步骤3中还包括通过凝胶电泳对DNA分离进行定性检测。
6.根据权利要求4所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述管的直径为0～1m，管的长度为0～10m，管道中产物的流速为0～1米/秒。
7.根据权利要求1所述的一种病毒RNA的无探针检测方法，其特征在于，所述病毒为SARS-CoV-2。
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