JP2013536679A - 無細胞核酸の分析方法および用途 - Google Patents
無細胞核酸の分析方法および用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013536679A JP2013536679A JP2013526504A JP2013526504A JP2013536679A JP 2013536679 A JP2013536679 A JP 2013536679A JP 2013526504 A JP2013526504 A JP 2013526504A JP 2013526504 A JP2013526504 A JP 2013526504A JP 2013536679 A JP2013536679 A JP 2013536679A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cell
- free nucleic
- body fluid
- size
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Abstract
Description
-D.Loのチームは、この分野における2つのトップチームのうちの1つであり、Q-PCRアッセイおよび105〜798bpの配列を増幅するためのプライマーセットデザインを用いて母体血漿中の母体DNAおよび胎児DNAのサイズ分布を分析した(16)。彼らは、「cirDNA分子の大部分は145〜201bpの範囲にあった」(約leヌクレオソームサイズ)ことを示唆した。本発明に関して、著者らは105bp未満のサイズのcirDNAが存在する可能性を研究も議論もしなかった。
-つい最近(January 2010)、cirDNAサイズプロファイルが高性能の方法:マイクロ流体単一分子分光法(micro-fluidic single molecule spectroscopy)を用いて研究された(20)。I期およびIV期の肺癌患者血清から抽出されたcirDNAのサイズプロファイル形状は本発明者らの結果と若干、似ていたが、彼らは、「800bpの閾値において最も高い識別力(distinguishing power)が生じた」と結論づけた。本発明に関して、著者らは、「320bp未満では2つの曲線が同じように見える」と主張し、320未満のサイズのctDNAについて言及も議論もしていない。
・分析に必要な時間を、特に、腫瘍生検材料の分析と比較して大幅に短縮する(解剖医学サービスの介入を必要としない)。
・生物学的試料のサンプリングおよび取り扱いを容易にする。
・到達不可能な腫瘍の非侵襲的分析を可能にする。
・2つの無視できない臨床パラメータ、すなわち、無細胞核酸の量およびアポトーシス率(断片化指数または完全性指数)を加える。これらの値は腫瘍成長と直接関係があるように思われる。
-親遺伝子の分析、
-臨床遺伝子分析(病態、例えば、癌など)、
-セラグノスティックス(theragnostics)、診断マーカー(すなわち、1つまたはいくつかの遺伝子の変異状況)の関数として療法の方向付けを可能にする治療戦略、
-民族起源の分析
-胎児cirDNA中の性別判定
-特定の生理学的状況の進展
などがあるが、これに限定されない無細胞核酸の検出の全ての利用に関する。
-ctDNA分析の必須のパラメータとして、100bpより小さなサイズのctDNAの量または濃度を決定し、
-100bpより小さなサイズのctDNAを含む画分からのctDNAの量を、150〜400bpのサイズの画分または300bpまたは400bpより大きなサイズの画分と比較することを提唱する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程;
c)前記体液試料中の前記無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、前記核酸は短いサイズ範囲にある核酸であり、100bp未満の長さを有し、好ましくは、40〜99bpに含まれる、工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)-少なくとも、100bp未満、好ましくは40〜99bpに含まれる長さを有する短い核酸の濃度もしくは量を決定する工程、および
-少なくとも、100bp超、好ましくは145bp〜450bpに含まれる長さを有する長い核酸の濃度もしくは量を決定する工程
によって、前記体液試料中の前記無細胞核酸の特定のサイズプロファイルを決定する工程、または
特定のサイズ範囲のcfDNAの比率(比)を決定する工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)-100bp未満、好ましくは40〜99bpに含まれる長さを有する短い核酸の濃度もしくは量を決定する工程、および/または、好ましくは
-145bp〜450bpに含まれる長さを有する長い核酸の濃度もしくは量を決定する工程
によって、前記体液試料中の前記無細胞核酸の濃度または量を決定する工程
を含む、方法に関する。
c)i)100bp未満の、好ましくは40〜99bpに含まれる長さを有する短い核酸の濃度または量を決定する工程;および
c)ii)-145bp〜450bpに含まれる長さを有する長い核酸の濃度または量を決定する工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)前記体液試料中の無細胞核酸の完全性指数を決定する工程であって、前記完全性指数は、「長い」サイズ範囲の無細胞核酸の濃度または量と「短い」サイズ範囲の無細胞核酸の濃度または量との比として計算され、前記濃度は、本発明による体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって決定され、前記短いサイズ範囲の核酸は100bp未満の長さを有し、前記長いサイズ範囲は180bp〜450bpに含まれる、工程
を含む、方法を含む。
本発明によれば、本発明者らは、100bpより小さなctDNAサイズの量を初めて考慮に入れた新しいDNA完全性指数の計算を提供したい。本発明者らはまた、計算において、特定のサイズ範囲、例えば、200〜450を有するctDNAの量と60bp〜100bpまたは43〜100bpのctDNAサイズの量との比をさらに含めたDNA サイズ画分比(SFR)の計算を初めて提供したい。完全性指数(短い長さより長いcf核酸の量に対する、長い長さより長いcf核酸の量に相当する)およびSFR(2つのサイズ画分の比に相当する)は両方とも核酸断片化指数である。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)無細胞核酸のサイズ画分比(SFR)を決定する工程であって、前記SFRは、特定のサイズまたは特定のサイズ範囲を有するctDNAの量と別の特定のサイズまたは特定のサイズ範囲を有するctDNAの量との比として計算される、工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程、
c)無細胞核酸のDIIまたはサイズ画分比(SFR)を決定する工程であって、前記DIIまたはSFRは、200bpより大きなサイズのctDNAの量と60bp〜100bpまたは43〜100bpまたは60〜145bpのサイズのctDNAの量との比として計算される、工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)-前記体液試料中の無細胞核酸から短い増幅断片の濃度を決定する工程であって、前記短い核酸断片は100bp未満、好ましくは40〜99bpに含まれる長さを有する、工程、および/または
-前記体液試料中の無細胞核酸から長い増幅断片の濃度または量を決定する工程であって、前記長い断片は、100bpを超える、または100bpに等しい、好ましくは145bp〜450bpに含まれる長さを有する、工程
を含む、方法に関する。
c)<100bpの断片の増幅から得られた値から、>100bpの断片の増幅から得られた値を差し引くことによって、好ましくは60〜99bp範囲の断片の増幅から得られた値から、100〜145bp範囲の断片の増幅から得られた値を差し引くことによって、前記体液試料中の無細胞核酸の量を決定する工程
である。
c)i)短い増幅断片の濃度または量を決定する工程;および
c)ii)-長い増幅断片の濃度または量を決定する工程
を含む。前記長い増幅断片は短い断片を部分的または完全に含むことが好ましい。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程
c)前記体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定する工程であって、前記完全性指数またはSFRは、前記無細胞核酸からの長い増幅断片および短い増幅断片の濃度の比として計算され、前記短い断片は100bp未満の長さを有し、前記長い増幅断片は180bp〜450bpに含まれる、工程
を含む、方法に関する。
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)前記対象から体液を入手する工程、
c)前記体液試料中の無細胞核酸から短い増幅断片の濃度を決定する工程であって、増幅された前記無細胞核酸の短い断片は、検出される前記遺伝子多型を含有し、前記増幅された無細胞核酸の短い断片は、100bp未満、好ましくは40〜99bpに含まれる長さを有する、工程
を含む、方法を含む。より好ましくは、検出される前記遺伝子多型を含有する前記短い増幅断片は、55〜65bpに含まれる長さを有し、ほぼ60bpが最も好ましい。
a)体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程;
b)以下のパラメータおよび以下の工程:
-一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い配列を代表するものであり;
-A1A2およびB1B2の配列の長さが50〜100bpであり、長さが+/-20%異なるものとし;
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み;
-CB1B2が短い断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、
i)%CB1B2/CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程;または
ii)%CA1A2/CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程
を統合することによって、遺伝子多型の存在の定性検出を決定する工程、
任意で、%CB1B2/CA1A2または%CA1A2/CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめる工程
を含む、方法に関する。
a)本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、無細胞核酸の濃度または量はPCRを実行する方法によって決定される、工程;
b)以下のパラメータおよび以下の工程:
-一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い増幅配列を代表するものであり;
-A1A2およびB1B2の配列の長さが50〜100bpであり、長さが+/-20%異なるものとし;
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み;
-CB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い増幅断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、
i)%CB1B2/CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程;または
ii)%CA1A2/CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程
を統合することによって、遺伝子多型の存在の定性検出を決定する工程、
任意で、%CB1B2/CA1A2または%CA1A2/CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめる工程
を含む、方法に関する。
-個体または民族集団を識別することができる遺伝子多型、
-生物学的機能に影響を及ぼす非コード領域にある遺伝子多型、
-RNAエディティングなどの転写後修飾による遺伝子多型、または
-タンパク質配列の修飾を意味する変異などのコード領域にある遺伝子多型
を指定することが意図されるが、これに限定されない。
-前記無細胞核酸にある本発明による遺伝子多型を検出するための方法を実行する工程;および
-前記無細胞核酸の完全性指数を決定するために、本発明による方法を実行する工程
を含む。
-前記長い増幅断片は、短い非変異断片、および検出される前記遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を含有する短い変異断片を含み、
-前記長い増幅断片は250bp〜350bpに含まれ、前記短い増幅断片は100bp未満であり、好ましくは、50bp〜99bpに含まれる。
-無細胞核酸抽出物中にある非変異断片および変異断片の濃度を決定する工程;ならびに
-得られた、または得られなかった短い非変異断片に対する短い変異断片の量のパーセントを計算する工程であって、前記パーセント計算値が前記遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)に関連した閾値より大きい場合に、対象が前記遺伝子多型を有するとみなされる、工程
をさらに含む。
-無細胞核酸抽出物中にある増幅非変異断片および増幅変異断片の濃度を決定する工程;ならびに
-得られた、または得られなかった短い増幅非変異断片に対する短い増幅変異断片の量のパーセントを計算する工程であって、前記パーセント計算値が前記遺伝子多型に関連した閾値より大きい場合に、対象が前記遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を有するとみなされる、工程
をさらに含む。
a)定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸を定量する工程;および
b)Q-PCRを実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸の完全性指数を決定する工程;および
c)Q-PCRを実行する方法によって、本発明による前記無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を検出する工程
を含む、方法に関する。
-腫瘍関連遺伝子変化、好ましくは、CRC関連遺伝子変化を有するRASファミリー遺伝子、好ましくは、KRASまたはNRAS;および
-BRAF遺伝子
からなる群より選択される核酸がより好ましい。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズは50〜100bpの範囲内にあり、かつcfDNAのサイズは101bp超である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片範囲のレベル間で得られた比を比較する工程であって、<1、好ましくは<0.75の長いサイズ範囲/短いサイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズは50〜100bpの範囲内にあり、かつcfDNAのサイズは101bp超である、工程;
b)前記体液試料について、これらの2種類の断片間で得られた比を計算する工程であって、<1、好ましくは<0.75の長いサイズ範囲/短いサイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズが50〜100bpの範囲内であり、かつcfDNAのサイズが100〜145bpの範囲内であり、好ましくは、73〜99bpの範囲内であり、かつcfDNAのサイズが100〜120bpの範囲内である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片範囲のレベル間で得られた比を比較する工程であって、<1、好ましくは<0.5の長いサイズ範囲/短いサイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズが<249bpであり、かつcfDNAのサイズが>249bpであり、好ましくは、cfDNAのサイズが<100bpであり、かつcfDNAのサイズが249〜409bpの範囲内であり、より好ましくは、73〜100bpの範囲内であり、かつcfDNAのサイズが300〜357bpの範囲内である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片間で得られた比を比較する工程であって、<0.5、好ましくは<0.1の長いサイズ範囲/短いサイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、それぞれの体液試料について濃度が決定されるcfDNA断片が180bp超の長さの長い断片および100bp未満の長さの短い断片である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片濃度間で得られた比を比較する工程であって、<0.4、好ましくは<0.1の長い/短い比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNAを定量する工程であって、それぞれの体液試料について濃度が決定される増幅断片が180bp超の長さの長い断片および100bp未満の長さの短い断片である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片濃度間で得られた比を比較する工程であって、<0.4、好ましくは<0.1の長い/短い比が腫瘍の存在を示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズが>145bpである、工程;
b)cfDNA総量から得られたcfDNA量のパーセントを計算する工程であって、%が20%より小さく、好ましくは%が腫瘍の存在を示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60〜80bp、100〜145bp、および180〜400bpである、工程;
b)健康個体と非健康個体との間で得られた3種類の定量レベルを直接比較する工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であり、cfDNAのサイズ範囲が60〜80bp、100〜145bp、および180〜400bpである、工程;
b)ロジスティック関数におけるパラメータとして、これらの3種類の値を用いることによって、サイズプロファイルを決定する工程
を含む、方法に関する。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAは50〜400bp範囲の様々なサイズである、工程;
b)好ましくは、ほぼ70bpの断片、ほぼ100bpの断片、およびほぼ300bpの断片を標的とした時に得られた少なくとも3種類の濃度値を組み合わせることによって、好ましくは、ロジスティック関数、例えば、対数関数において、これらを組み合わせることによって、2種類の体液試料間のこれらの3種類のサイズ範囲について得られたサイズプロファイルを比較する工程
を含む、方法に関する。
変異断片および非変異断片について計算された長い断片および短い断片の濃度の比を決定および比較する工程を含む、方法に関する。前記方法において、
-前記比は、50〜450bp範囲の様々なサイズで比較され、好ましくは、前記長い断片は200bp〜450bpに含まれ、好ましくは、少なくとも2種類の濃度値は、例えば、ほぼ200bpおよびほぼ300bpであり、前記短い断片は145bp未満であり、好ましくは、50bp〜99bpに含まれる。
a)本発明の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60〜80bp、100〜145bp、および180〜400bpである、工程;
b)好ましくは、ほぼ70bpの断片、ほぼ100bpの断片、およびほぼ300bpの断片を標的とした時に得られた少なくとも3種類の濃度値を組み合わせることによって、好ましくは、ロジスティック関数、例えば、対数関数において、これらを組み合わせることによって、2種類の体液試料間のこれらの3種類のサイズ範囲について得られたサイズプロファイルを比較する工程を含む、方法も好ましい。
a)本発明による体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための方法によって、前記個体から得られた体液試料中の無細胞核酸の完全性指数を時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、前記核酸の存在が前記特定の生理学的状況に関連する、工程、および
b)得られた完全性指数またはSFRを比較し、この時間間隔にわたって無細胞核酸の前記完全性指数が変化したかどうか確かめる工程
を含む、方法に関する。
a)本発明による体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって、前記個体から得られた体液試料中の短い変異無細胞核酸または短い非変異無細胞核酸の濃度を時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、前記変異核酸または非変異核酸の存在が前記特定の生理学的状況に関連する、工程、および
b)得られた濃度を比較し、この時間間隔にわたって前記無細胞核酸の前記変異増幅断片または非変異増幅断片の濃度が変化したかどうか確かめる工程
を含む、方法に関する。
a)本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、少なくとも1種類の癌マーカー核酸について、前記患者から得られた体液試料中の遊離核酸の完全性指数を時間間隔の間に計算する工程、および
b)得られた完全性指数を比較し、この時間間隔にわたって前記無細胞核酸の前記完全性指数が増加または減少したかどうか確かめる工程であって、前記完全性指数の増加はこの癌治療の効力を示し、前記完全性指数の減少はこの癌治療の効力が無いこと示す、工程
を含む、方法に関する。
a)本発明に従って、前記無細胞核酸にある遺伝子多型、例えば、SNPまたは変異の存在を定性検出する工程;
b)本発明に従って、前記無細胞核酸を定量する工程;および
c)本発明に従って、前記無細胞核酸の完全性指数の決定を実行することによってアポトーシス率を決定する工程
を含む、方法に関する。前記方法は、以下のパラメータおよび計算:
-一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い増幅配列を代表するものであり;A1B2が長い増幅配列であり、
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み、
-CB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い増幅断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1B2が長い増幅断片だとすると、
-遺伝子多型の存在を定性検出する工程であって、
-%CB1B2/CA1A2は特定の閾値より大きく、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義されるか;または
-%CA1A2/CB1B2は特定の閾値より大きく、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程;
-比CB1B2/CA1B2またはCA1A2/CA1B2を決定することによって完全性指数を評価する工程、
XおよびYがプライマーの5'末端間の核酸上での距離であるか、増幅断片(もしくはアンプリコン)の長さであると考えると、
X<180およびY>X、好ましくは、50<X<100および200<Y<450
を統合する、方法に関する。
a)本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、前記患者からの体液試料中の無細胞核酸の濃度を決定する工程、および
b)本発明による方法によって、前記無細胞核酸の前記短い増幅断片にある遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を検出する工程
を含む、方法に関する。
a)以下:
-本発明による無細胞核酸を定量する方法によって、前記患者からの体液試料中の無細胞核酸の濃度を決定する工程;
-本発明による方法によって、前記無細胞核酸中の前記遺伝子多型を検出する工程であって、発見された変異無細胞核酸対非変異無細胞核酸のパーセントが閾値より大きいかどうか確かめることによって、患者は前記遺伝子多型がある、または前記遺伝子多型がないと分類され、好ましくは、前記閾値は所与の遺伝子多型に特有のものであり、非変異患者および変異患者のコホートから決定される、工程;ならびに
-本発明による方法によって、試料中の前記無細胞核酸の完全性指数を決定する工程
の群より選択される、少なくとも2種類のバイオマーカーを研究する工程、
b)前記少なくとも2種類のバイオマーカーを含むロジスティック関数によって、前記少なくとも2つの値を組み合わせる工程、ならびに
c)前記患者における病理学的状況または生理学的状況、例えば、腫瘍または腫瘍進行の診断または予後を行うために、前記ロジスティック関数の前記最終値を分析する工程
を含む、方法に関する。
a)A1(フォワードプライマー)およびA2(リバースプライマー)と呼ばれる、第1のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーA1およびA2は、
-最小サイズ15ヌクレオチドおよび最大サイズ30ヌクレオチドを有し、かつ
-2種類のプライマー間で、両プライマーの3'末端間で少なくとも5bpの最小間隔を有し、かつ
-35〜100bpに含まれるサイズ範囲を有するアンプリコンを得ることができ、前記アンプリコンは、関心対象の変異を示さない前記遺伝子の領域にある、第1のセットの2種類のプライマー、
b)B1(フォワードプライマー)およびB2(リバースプライマー)と呼ばれる、第2のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーB1およびB2は、
-最小サイズ15ヌクレオチドおよび最大サイズ30ヌクレオチドを有し、かつ
-2種類のプライマー間で、両プライマーの3'末端間で少なくとも5bpの最小間隔を有し、かつ
-35〜100bpに含まれるサイズ範囲を有するアンプリコンを得ることができ、前記アンプリコンは、関心対象の変異を示す前記遺伝子の領域にあり、
A1B2は250〜450bpサイズ範囲内にある、第2のセットの2種類のプライマー
を含むことを特徴とする、キットに関する。
・B2プライマーが前記関心対象の変異の位置から5〜85ヌクレオチド下流に位置する、前記関心対象の遺伝子の標的化領域。
・プライマー対A1A2が、前記関心対象の変異の位置から430〜100ヌクレオチド上流に位置する領域に設計されている、前記関心対象の遺伝子の領域。
・A1プライマーが前記関心対象の変異の位置から5〜85ヌクレオチド上流に位置する、前記関心対象の遺伝子の領域。
・プライマー対B1B2が、前記関心対象の変異の位置の100〜430ヌクレオチド下流に位置する領域に設計されている、前記関心対象の遺伝子の領域。
関心対象の遺伝子および/または関連する遺伝子変異は、以下:
A)障害、特に癌における変異:
(それぞれの遺伝子について、NCBI36:Ensembl Contig図のcDNAの中に変異を有するbpの位置番号が示されている)
<http://may2009.archive.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/)
B)癌以外の障害における変異:
a)単一遺伝子障害:
常染色体優性遺伝子:家族性高コレステロール血症、ハンチントン病、神経線維腫症1型、マルファン症候群、遺伝性非ポリポーシス、結腸直腸癌、遺伝性多発性外骨腫症、多発性嚢胞腎、軟骨無形成症、鎌状赤血球性貧血、軟骨無形成症、鎌状赤血球性貧血、
b)常染色体劣性対立遺伝子:嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、脊髄性筋萎縮症、ロバーツ症候群、フェニルケトン尿症、ムコ多糖症、糖原貯蔵症、
c)X染色体優性:レット症候群、色素失調症、アイカルディ症候群、クラインフェルター症候群、色素失調症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、
d)Y連鎖:男性不妊および耳介多毛症(hypertrichosis pinnae)、
e)ミトコンドリア病:レーバー遺伝性視神経萎縮症
f)多因子および多遺伝子(複合)障害:
喘息、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、癌、繊毛関連疾患、口蓋裂、糖尿病、心臓病、高血圧、炎症性腸疾患、精神遅滞、気分障害、肥満、屈折異常、不妊
より選択される、キットに関する。
a)A1(フォワードプライマー)およびA2(リバースプライマー)と呼ばれる、第1のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーA1およびA2は、
-A1については、SEQ ID NO 163-196、
-A2については、SEQ ID NO 250-256
からなる群より選択される、第1のセットの2種類のプライマー;または/ならびに
b)B1(フォワードプライマー)およびB2(リバースプライマー)と呼ばれる、第2のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーB1およびB2は、
-B1については、SEQ ID NO 244-249、
-B2については、SEQ ID NO 83-120
からなる群より選択される、第2のセットの2種類のプライマー
を含むことを特徴とする、キットに関する。
a)A1(フォワードプライマー)およびA2(リバースプライマー)と呼ばれる、第1のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーA1およびA2は、
-A1については、SEQ ID NO 65-81、
-A2については、SEQ ID NO 19
からなる群より選択される、第1のセットの2種類のプライマー;または/ならびに
b)B1(フォワードプライマー)およびB2(リバースプライマー)と呼ばれる、第2のセットの2種類のプライマーであって、前記2種類のプライマーB1およびB2は、
-B1については、SEQ ID NO 38、
-B2については、SEQ ID NO 40-63
からなる群より選択される、第2のセットの2種類のプライマー
を含むことを特徴とする、キットに関する。
a)配列SEQ ID NO:1を有するプライマー、および配列SEQ ID NO:2-8を有するプライマーの群より選択する少なくとも2つの異なるプライマー、好ましくは、3つの異なるプライマーを含むプライマーセット;
b)配列SEQ ID NO:1を有するプライマー、配列SEQ ID NO:8を有するプライマー、および配列SEQ ID NO:2-7を有するプライマーの群より選択する少なくとも1つのまたは2種類のプライマーを含むプライマーセット;
c)配列SEQ ID NO:1を有するプライマー、配列SEQ ID NO:7を有するプライマー、および配列SEQ ID NO:2-6を有するプライマーの群より選択するプライマーを含むプライマーセット;ならびに
d)SEQ ID NO:1-8を有するプライマーを含むプライマーセット
の群より選択する、核酸プライマーセットに関する。
(図2)アンプリコンサイズに対する、外科手術および化学療法(chimiotherapy)前の3人の転移性CRC患者から単離されたcirDNAのQ-PCRによる定量。図2A、血清試料(n=2患者)。図2B、1人の患者の血漿試料。各患者のcirDNAの濃度を2回繰り返して求めた。ヒストグラムはこの2回の平均に相当する。結果をng/μL cirDNAで表した。
(図3)20〜25歳の3人の健康個体の血漿試料から単離されたcirDNAのQ-PCRによる定量。60〜409bpのサイズの断片を増幅するQ-PCRシステムを用いてcirDNA濃度を求めた。ヒストグラムは、pg cirDNA/mL血漿で表した平均値を示す。例えば、プライマー対KRAS 101を用いて得られた最大値は4.8ng/ml血漿の濃度に相当する。
(図4)変異ctDNAの検出に関する短いDNA配列の増幅における利点の説明。ゲノムDNA、十分に断片化されていないDNA、および高度に断片化されたDNAを分析した時の、異なるサイズのアンプリコンを生じる3種類のプライマーセット(A、B、およびC)の使用を示した。
(図5)アンプリコンサイズに対する濃度値の相対的な割合。
(図6)血漿試料中の249bpの長い断片または60bpの短い断片を増幅することによって得られたcirDNAの濃度。1人の健康対象からの血漿試料中のcirDNAは低レベルであり(23ng/ml血漿)、1人のmCRC患者からの血漿試料中のcirDNAは中間レベルであり(450ng/ml血漿)、1人のmCRC患者からの血漿試料中のcirDNAの濃度は高い(1860ng/ml血漿)。細胞株試料は、HCT116-s細胞から単離されたゲノムDNAについて得られた値に相当する(4.8ng/ml、図1)。値は、漸増サイズ(60 bp、73 bp、101 bp、145 bp、185 bp、249 bp、300 bp、357 bp、および409bp)のDNA断片を増幅するためのプライマー対を用いて得られた最大値の割合として表した。
(図7)異種移植マウスにおける特異的腫瘍ctDNA濃度サイズプロファイル。2シリーズの7プライマーセットは、それぞれ、ヒト由来またはマウス由来の60〜409bpまたは60〜385bpの長さが漸増するアンプリコンを生じる。エンドポイントは、4つの異なるマウス血漿の3つのプールの平均に相当する。
(図8)異種移植マウス血漿中のcirDNA総量における腫瘍cirDNA量の寄与。
(図9)SNP分析のためのIntPlex法の使用の一例の模式図。
(図10)癌へのIntplexシステムの適用。
(図11)図11A)変異がセンスプライマーB1の3'末端にあるKRAS Conventional Intplexシステムの模式図。図11B)変異がアンチセンスプライマーA2の3'末端にあるKRAS Reverse Intplexシステムの模式図。
(図12)ヒト癌細胞SW620が異種移植されたマウスからcirDNAを定量するためのKinvシステムの効率。赤色の数字:アンプリコンのサイズ(bp)。
(図13)ヒト癌細胞SW620が異種移植されたマウスからcirDNAを定量するためのKconvシステムの効率。赤色の数字:アンプリコンのサイズ(bp)。
(図14)S4 HT29に由来するDNAのQ-PCR定量。
(図15)ヒトゲノムDNAで希釈(1/10)したS4 HT29 DNA。
(図16)データを最高濃度に対するパーセントとして連続して示した。
(図17)ヒト血漿DNAからのIntplexプロセスを用いて観察された、非変異断片濃度に対する変異断片濃度(%)。
(図18)健康個体からの血漿とCRC個体からの血漿との識別。cirDNA濃度値を表に示し、ng/mL血漿で表した。ヒストグラムは、サイズ画分中に含まれるcirDNA量の%である。
(図19)2人のCRC患者(CRC021、図19AおよびCRC019、図19B)から抽出されたctDNA 20μgのアガロースゲル電気泳動。
(図20)ゲノムDNAならびにヒト血漿(健康およびCRC)からのctDNAのDII値(A)の比較。
(図21)本発明のプライマーデザインを用いて計算されたDII値と、遠いDNA配列を標的とするプライマー対を用いて得られた値との比較。
(図22)ctDNA断片サイズパターンを示す様々なパラメータの測定。データをヒストグラムにプロットした。
(図23)BRAF遺伝子プライマー配列(従来システムおよびリバース(またはインバース)システム)の位置。BRAF V600E点変異が関心対象である時のIntPlex法において標的化されるDNA領域の例。図23は、本発明者らのマルチプレックス法がこの変異に適用された時に、プライマーなどの分子実体が標的とすることができる領域を示す。黄色:従来システム;緑色:リバースシステム;赤色:ブロッカー;ピンク色:SNP。
(図24)KRAS遺伝子のエキソン2領域ならびにプライマー配列(従来システムおよびリバース(またはインバース)システム)の位置。
図24A:KRAS遺伝子の2番目のエキソンの2番目および3番目のコドンのホットスポット点変異が関心対象である時のIntPlex法において標的化されるDNA領域の例。黄色:変異アンプリコン用のリバースプライマー:6156-6236。
緑色:非変異アンプリコン用のプライマー対:5721-6051。
図24Aは、マルチプレックス法がこの変異に適用された時に、プライマーなどの分子実体が標的とすることができる領域を示す。
図24B: KRAS従来システムおよびリバースシステム用のプライマー配列の位置。黄色:従来システム;緑色:リバースシステム;赤色:ブロッカー;ピンク色:SNP。
図24C:本発明のシステムのリバース配置の際のエキソン2 KRASホットスポット変異を検出するためのB1B2プライマー対デザイン用の選択されたDNA領域標的:
;A2:黄色および緑色。
図24E:rev配置の際のKRASエキソン2ホットスポット変異を検出するためのA1プライマー用の選択されたDNA領域標的:
A1:選択されたDNA領域標的。黄色および緑色。
図24D:conv配置の際のKRASエキソン2ホットスポット変異を検出するためのB2プライマー用の選択されたDNA領域標的。
B2:選択されたDNA領域標的。黄色および緑色。
Q-PCRによる特異的かつ高感度のcirDNA分析のためのアンプリコンの最適サイズを決定するために、本発明者らは、同じ領域内に60bp、73bp、101bp、145bp、185bp、249bp、300bp、357bp、および409bpのアンプリコンを増幅可能な9つのプライマー対を設計および使用した。これらは、さらに大きなアンプリコン配列の中に小さなアンプリコンが常に含まれるように設計されている。アンチセンスプライマーは、それぞれのプライマー対について同じである。この409bp増幅領域はKRASのイントロン2に位置する。オリゴヌクレオチドプライマー配列を表1に示した。
図1は、試験されたプライマー対の収量のばらつきについて述べる。全ての結果は、2回繰り返して実施された3回の実験からのものである。ある特定のDNA配列のQ-PCRによる増幅反応効率はプライマーの熱力学特性と関連し、特に、アンプリコンサイズの関数の点で異なる。図1に示したように、(非常に似たハイブリダイゼーション特性を有する)プライマー対の検出効率は、試験されたアンプリコンのサイズに比例する。図1に図示したように、検出は101〜185bpアンプリコンの場合に最適であるように思われる。従来より、文献中には150〜250bpの領域の増幅が選択されている。
従って、配列の長さが漸増するアンプリコンを増幅することによって確かめられたcirDNAのサイズプロファイルから、<100bpのアンプリコンを増幅した時に最適な検出がなされ、腫瘍cirDNAと比較して、非常に高い割合の150〜350bpのサイズのcirDNAが非腫瘍cirDNAに存在することが明らかになった。その結果、図4の図に示したように、増幅DNA領域のサイズの選択は重要であるように思われる。
・Q-PCRによる分析の感度(試料中のcirDNAの量に応じて10倍超〜50倍までの増加)
・特異性。理由は、アンプリコンサイズ(または最適な増幅の決定)に基づいてcirDNA濃度プロファイルを分析することによって、mCRC患者のcirDNAと健康対象のcirDNAを区別できるからである。50〜100のサイズのアンプリコンについて得られた量と100bpより大きなアンプリコンについて得られた量との比の測定値を用いて、腫瘍由来のcirDNAの存在を予想することができる。mCRC患者におけるcirDNA総量が一般的に多いことに加えて、断片サイズの点での量が、初めて、癌cirDNAの存在に特異的であり、かつ情報を与えてくれるように思われる。
1.増幅断片(アンプリコン)のサイズはcfDNA定量に大きな影響を及ぼす。
2.100bpより小さなアンプリコンの検出が最適である。
3.完全性指数の測定値を用いて、mCRC対象のcirDNAと健康個体のcirDNAを識別することができ、mCRC対象のcirDNAとゲノムDNAも識別することができる。
4.同一のサイズのアンプリコンを生じるプライマー対の増幅を比較することだけで、cirDNA抽出物をPCR増幅した結果を正確に比較することができる。
材料および方法:
a)細胞株および試薬
SW620 CRC細胞をRPMI+10%胎仔ウシ血清中で維持した。SW620細胞はホモ接合性KRAS G12V変異(GGT→GTT)を有する。
雌無胸腺ヌードマウス(6〜8週齢)の皮下に1x106個の癌細胞を異種移植した。移植して3週間後にマウスをCO2で安楽死させた。腫瘍重量は300〜650mgであった。末梢血を採決してEDTAチューブに入れ、血漿調製のためにすぐに(1時間以内に)使用した。
マウス血液試料を5ml BDバキュテナーKE35チューブ(Belliver Industrial)に収集した後に、CR 4jローターを備えたHeraeus Multifuge LR遠心機に入れて2000rpm、4℃で10分間、遠心分離した。上清を滅菌1.5mlエッペンドルフチューブの中に収集し、14000rpm(16000g)、4℃で10分間遠心分離した。次いで、DNA抽出するために上清をすぐに処理するか、または-80℃で保管した。Q-PCRアッセイにおいて、新鮮に単離された血漿または保管された血漿を比較した時に有意差は認められなかった。同じ2段階遠心分離プロセスを用いて血清を調製したが、EDTAを含まないチューブに血液を入れ、次いで、室温で1時間、放置した。マウスおよびヒトの血漿および血清をサンプリング後3時間以内に単離した。
同じ手順を用いて、異なる細胞株からのctDNAおよびゲノムDNAを抽出した。QIAmp DNA mini Blood kit(Qiagen, CA)を用いて溶出量60μlで「血液および体液プロトコール(Blood and body fluid protocol)」に従って、200μlの血漿からDNAを精製した。血漿調製中には試料を4℃に保った。使用するまでDNA試料を-20℃に凍結した。Q-PCRアッセイにおいて、新鮮に抽出されたDNAまたは保管されたDNAを比較した時に有意差は認められなかった。
DNAをQ-PCRアッセイによって定量した。リアルタイムPCR増幅を、My iCycler IQ 5IQまたはChromo4機器においてIQ5 Opticalシステムソフトウェア2.0およびMJ Opticon Monitor3ソフトウェア(Bio-Rad)を用いて反応体積25μlで実施した。それぞれのPCR反応混合物は、12.5μlのmix PCR(Bio-Rad Super mix SYBR Green=Taqポリメラーゼ、MgCl2);2.5μlのそれぞれの増幅プライマー(100pmol/μl);2.5μlのPCRによって分析された水、および5μlのDNA抽出物からなった。サーマルサイクリングは95℃3分の最初の変性工程から開始し、次に、95℃10秒および60℃30秒の40サイクルが行われた。融解曲線は、55℃〜90℃から0.2℃ごとに測定して得られた。定量のためのキャリブレーターとして、HCT116-s細胞およびMC38細胞に由来するゲノムDNAの段階希釈液を使用した。IQ5 Opticalシステムソフトウェア2.0またはMJ Opticon Monitor3ソフトウェアによって検量線から試料濃度を外挿した。MIQEガイドラインにおいて推奨されるような妥当な確実性(95%の確率)で検出することができる濃度である検出限界は3コピー/アッセイであった(21)。
IntPlex分析の一般的な適用
cirDNAは、健康細胞および病理学的細胞または感染因子の遺伝的な印を有する。従って、遺伝子変化は、臨床上の影響があるために一般に好まれる標的である。cirDNAに関する技術的問題の1つは、遺伝子多型、特に、SNP(一塩基多型)を検出するツールとしての用途である。
・遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)の存在の定性検出;
・cirDNAの特異的定量;
・アポトーシス率の評価;
図9の模式図における以下の計算による:
-遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)の存在の定性検出:
-特定の閾値より大きな%B1B2/A1A2;
-B1B2は、遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を含む配列と定義される
cirDNA総量:A1A2量の特異的定量
腫瘍cirDNA量:B1B2量の特異的定量
%:B1B2またはA1A2/A1B2でのcirDNA断片化の決定によるアポトーシス率の評価
を統合する、cfDNAを分析するための方法にある。
(A1A2)=(B1B2)=X
(A1B2)=Y
X<180およびY>X
理想的には、50<X<100および200<Y<350
のようにモデル化することができる。
これらの3種類の診断パラメータは別々に研究することができるが、より著しく、(特に、バイオインフォマティクスソフトウェアの助けを借りて)マルチプレックス分析を行うことによって、癌患者の経過観察のために診断値および個別化された治療選択のためにセラグノスティック値が改善される(図10)。
1)癌診断の状況におけるヒト血液試料中のKRAS変異の検出
遺伝子RAS(KRASおよびNRAS)は、結腸腫瘍の50%超および直径が1cmより大きな腺腫の約50%において体細胞変異を受ける。逆に、これは小さな腺腫では非常に稀にしか変異しない(10%未満)。この変異、一般的にSNPはHRASに関係しないが、KRASのコドン12および13ならびにNRASの12、13、および61に影響を及ぼす。これらの変異の正確な役割は分かっていない。これらは小さな腺腫を大きな形成異常の腺腫に変えることがある、または非常に増殖する細胞において初めから存在することがある。KRAS変異は結腸直腸腫瘍の30〜40%に存在する。
従来Intplex(図11A)では、KRAS G12V変異を検出するために文献中に典型的に用いられるプライマーG12Vが用いられる。このプライマーは、変異が3'末端に位置するセンスオリゴヌクレオチドである。リバースIntplex(図11B)では、変異が3'末端にあるアンチセンスプライマーが用いられる。これらの2つのシステムのプライマーは全てソフトウェアによって選択された(材料および方法)。システムIntplex KconvおよびKrevは、KRAS変異G12Vを検出するために適用された。この変異を特異的に検出するプライマーは、KRAS遺伝子の変異領域をカバーするように設計されている(図11A〜11B)。
本実験において、本発明者らは、異種移植マウスの血漿試料から単離されたcirDNAを用いて、2つのIntplexシステムKrevおよびKconvを試験した。効力および感度を証明するために、またはKRAS G12VまたはBRAF V600E変異の存在を検出するために、Intplexシステム用に特別設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの配列および化学修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの配列を表2に示した。本実施例では、ブロッカー(ASB Q-PCR)法を用いたASまたはQ-PCRを使用した。「従来」IntPlexシステムおよび「インバース」IntPlexシステムを用いてBRAFおよびKRASの変異が検出された。
遺伝子BRAFはCRC腫瘍の14%超において体細胞変異を受ける。変異V600EはBRAF変異の90%超に相当する。KRAS変異と同様に、BRAF変異があると抗EGFR治療が効かなくなる。従って、転移性CRC患者の治療時に(または正確には治療の前に)、この変異の存在(または非存在)の評価が必要とされる。従って、本発明者らは、cirDNAの中のBRAF変異を検出するために従来 IntPlexシステム(変異はプライマーB1の3'末端にある)を設計および開発した(図14)。
KRASのSNP変異(G12V、G12D、G12C、G13D、およびG12A)ならびにBRAF変異V600Eは、孤発性変異CRC(すなわち、全てのCRCの75%)の約82%の原因である。これらの変異は、KRAS変異およびBRAF変異がCRCに関連し、抗EGFR療法に応答しない患者(全てのCRCの約50%)の94%に存在する。
3人のCRC患者および3人の健康個体からの血漿試料から、前記のように60bp、73bp、101bp、145bp、185bp、249bp、300bp、357bp、409bpの断片を増幅するプライマーセットを用いたq-PCRによってcirDNA濃度を決定した。得られた濃度プロファイルは、これらの全てについてCRC対象または健康対象のいずれかに特異的である。HHP対象の最大値平均は6.19ng/ml血漿であり、CRC対象の最大値平均は943.59ng/ml血漿であった。300/60比および300/73比を使用した時に、HHP/CRC完全性指数の比の計算による最良の識別が得られ(それぞれ、8.18および10.07)、以前のデータが裏付けられた。明らかに、409/60の比が最も高かったが、自由裁量によって考慮に入れなかった。なぜなら、CRC血漿中の409断片の増幅により得られた濃度が分析感度に近かったからである。ある断片サイズ増幅によって得られた濃度を、次のそれぞれの増加するサイズから差し引くことによって、60〜409bpの範囲内にあり、連続した2つのアンプリコンサイズ間のcirDNA量の%を評価することができる(サイズnの増幅断片を検出した時のctDNA濃度をCn、増加する増幅断片サイズシリーズにある、すぐ後ろの大きなサイズの増幅断片を検出した時のcirDNA濃度をCn+1と考えると、両サイズ間に存在する濃度はCn-Cn+1と計算される)。
診断または予後の内容に関連する最終値を得るために、少なくとも2種類のバイオマーカーを含む、ロジスティック関数によって組み合わせることができる値(図9を参照されたい)
(A1A2)=(B1B2)=X
(A1B2)=Y
X<180およびY>X
理想的には:50<X<100および200<Y<350
式中、
-B1B2は、遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を含有する配列と定義され、
-A1A2は、遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を含有せず、かつ同じDNA鎖に位置する配列と定義され、
-数字は、増幅配列(アンプリコン)のヌクレオチドの数に相当し、
-XおよびYは、それぞれ、
短いアンプリコンの増幅に用いられるプライマーの5'末端間のゲノムDNA上の距離、および長いアンプリコンの増幅に用いられるプライマーの5'末端間のゲノムDNA上の距離である。
1.それぞれの遺伝子多型プライマーセットについて、特定の閾値より大きなレベルの%B1B2/A1A2を決定することによる、遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)の存在の定性検出。
B1B2は、遺伝子多型(例えば、SNPまたは変異)を含有する配列と定義される。
2.総cirDNAと腫瘍cirDNAの特異的定量:それぞれ、A1A2量およびB1B2量
3.DNA断片化指数の評価(本発明では、「アポトーシス率」、「DNA断片化指数」、および「完全性指数」という言葉は同じ意味を有する):%B1B2またはA1A2/A1B2。
-全ての循環核酸(DNA、RNA、siRNA、miRNAなど)への適用可能性。
-Q-PCR較正用の核酸標準として、特定の長さ、例えば<180bp、理想的には<100bpの核酸の使用。
2人のCRC患者(CRC021およびCRC019)から抽出されたctDNA 20μgのアガロースゲル電気泳動。ラダーは複数の100bp DNA断片からなる。測定直後にゲルの一部を取り出した。CRC021の場合、10〜440bpに対応するゲルの1つの部分を取り出し、Q-PCRに供した。CRC019の場合、30〜130bpおよび130〜500bpに対応するゲルの2つの部分を取り出し、Q-PCRに供した。ctDNAを定量し、前記のKRASイントロンの73bp、145bp、および300bpアンプリコンを検出する時に、前記のようにQ-PCR分析の条件を実施した。CRC021血漿中に、総ctDNAの47%は73〜145bpに見出されたのに対して、36%および17%はそれぞれ145〜300bpおよび>300bp範囲に見出された。CRC019血漿中に、総ctDNAの61%は73〜145bpに見出されたのに対して、35%および5%はそれぞれ145〜300bpおよび>300bp範囲に見出された。30〜130bpのゲル部分において、総ctDNAの57%が観察された(図19Aおよび図19Bを参照されたい)。
1.180bpより小さなctDNA断片はヌクレオチドごとに異なる場合があり、そのため正確なサイズでは局所濃度が小さくなる。
2.Sybre greenなどの蛍光色素には最大インターカレーションレベルがあり(すなわち、23ヌクレオチドにつき1つのSybre Green分子)、そのため小さなサイズのctDNAのシグナル強度は厳しく限定される。例えば、69bp DNA断片のシグナルは207bp断片のシグナルの1/3である。
ゲノムDNAならびにマウス血漿(非異種移植および異種移植)ならびにヒト血漿(健康およびCRC)(図20を参照されたい)からのctDNAのDII値の比較(表5)。DIIは、KRAS領域中にある300bp配列および60bp配列を標的化することによって得られた濃度の比によって評価された。HHP(n=16)のDII平均値はCRC(n=12)のDII平均値とは有意に異なる(それぞれ、平均、0.565および0.122;p<0.001)。類似の差違が動物モデルにおいて観察された。この場合、平均DIIは健康血漿ctDNA(n=9)については0.447であり、非腫瘍由来ctDNA(n=9)については0.645であり、腫瘍由来ctDNA(n=9)については0.027であった。
本発明によるマルチプレックス法において用いられるプライマーのデザインについては2種類の構成:convおよびinvがある。ここで、本発明者らは、KRASおよびBRAF領域(それぞれ、2番目のエキソンホットスポット変異およびV600Eを含有する)におけるconv構成およびinv構成、KRAS遺伝子の2番目のイントロンにおけるconv構成(BRAF conv)を用いてCRC患者血漿からDIIを決定した。本発明者らは、これらのDIIを、同じ遺伝子内の離れた領域において計算されたDII(長いKRAS conv/短いKRAS int、KRAS convにおいて用いられた長い配列の増幅につながるプライマー対を用いて得られた濃度と、KRAS intにおいて用いられた短い配列の増幅につながるプライマー対を用いて得られた濃度との比に相当する)、および2つの異なる遺伝子の離れた領域において計算されたDII(長いKRAS conv/短いBRAF inv、KRAS convにおいて用いられた長い配列の増幅につながるプライマー対を用いて得られた濃度と、BRAF invにおいて用いられた短い配列の増幅につながるプライマー対を用いて得られた濃度との比に相当する)と比較した。
図18に示したデータから様々な指数が決定された。これらの指数は異なるサイズ画分から計算された(表6を参照されたい)。
DII300/60、300bpより大きなサイズのctDNA断片の濃度とctDNA総濃度との比;
SFR409/<100、409bpより大きなサイズのctDNA断片の濃度と60〜100bp画分の濃度との比;
SFR<100/145-409、60〜100bp画分のctDNA断片の濃度と145〜409bp画分のctDNA断片の濃度との比
本発明者らは、変異ctDNAのサイズパターンを非変異ctDNAのサイズパターンと比較して研究した。この目標に向けて、本発明者らは、同じ領域内にある、増加した標的サイズを増幅するプライマーセットを使用した。このセットは、KRAS遺伝子のホットスポット領域にある配列(2番目のエキソンの12番目および13番目のコドン)の増幅を生じる。この場合、全てのプライマー対のフォワードプライマーは、特異的に、この領域の点変異または野生型配列を標的とするように設計されている(以下の表7および図22A〜22Eを参照されたい)。これらのセットは、変異標的配列または非変異標的配列を定量するために高感度および高特異性を促進するように注意深く選択された(以下の表8を参照されたい)。
ctDNAの定量は、CRC40においてKRAS G12D、CRC50においてKRAS G12D、およびCRC60においてKRAS G13D変異を有する腫瘍細胞のある患者の血漿から、82bp、138bp、300bpの漸増するサイズの標的を増幅することによって決定された(表9を参照されたい)。変異ctDNAの定量は、3'に変異を含む同じリバースプライマー、ならびに5'末端から82bp、138bp、および300bp離れた領域を標的とするプライマーから構成されるプライマー対を用いて行われた。非変異ctDNAは、同じフォワードプライマーおよび野生型配列を有する同じリバースプライマー(前の実施例からのデータなど)を用いて定量された。総ctDNAは変異断片と非変異断片の合計に相当する。
非常に多くの報告が、変異を検出するように提唱した時に変異の下流または上流に位置する領域の標的化について説明した。例えば、この領域に対応するDNA配列とハイブリダイズするように様々なプライマー(18〜30ヌクレオチド)が設計された。ここで、本発明者らは、conv構成またはrev構成(それぞれ、従来構成およびインバース(inv)構成、それぞれ、これらのconv構成およびinv構成に関連する分子実体のconv設計およびrev(またはinv)設計とも呼ばれる)のいずれかで、この方法に用いられるプライマーデザインの説明に従って、他の領域を標的化する分子実体の使用を保護することを主張する(図11)。本発明者らは、以下のパラメータが与えられれば、検出される変異からこれらの領域について説明することができる。
・プライマー最小サイズ=15ヌクレオチド
・プライマー最大サイズ=30ヌクレオチド
・2種類のプライマー間の間隔(両プライマーの3'末端間の間隔)=5bp
・A1A2またはB1B2のアンプリコンサイズ範囲=35〜100bp
・A1B2は250〜450bpのサイズ範囲内にある。
・B2プライマーがハイブリダイズし、非センスDNA鎖にある変異の位置から5〜85ヌクレオチド下流に位置する領域
・検出される変異の位置から430〜100ヌクレオチド上流にプライマー対A1A2を設計することができる領域
を標的とする分子実体である。
・A1プライマーがハイブリダイズし、非センスDNA鎖にある変異の位置から5〜85ヌクレオチド上流に位置する領域
・検出される変異の位置から100〜430ヌクレオチド下流にプライマー対B1B2を設計することができる領域
を標的とする分子実体である。
a)プライマーなどの分子実体が、この変異に適用される本発明者らのマルチプレックス法の際に標的とすることができる領域を示した図23を参照されたい。
b)BRAF従来システム用のB2プライマー用の選択されたオリゴヌクレオチド(表13を参照されたい)
a)プライマーなどの分子実体が、この変異に適用される本発明者らのマルチプレックス法の際に標的とすることができる領域およびプライマーを示した図24A〜24Eを参照されたい。
KRAS領域の2番目のエキソン
Upon:EnsemblデータバンクからのKRAS(ENSG00000133703)
v-Ki-ras2 Kirstenラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ[Source:HGNC Symbol;Acc:6407
点変異;6151
Claims (32)
- 体液試料中の無細胞核酸を定量する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)該対象から体液を入手する工程;
c)該体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、該核酸の長さが100bp未満の核酸サイズ範囲内にある、工程。 - 100bp未満のcf核酸サイズの濃度/量を求める、請求項1記載の方法。
- PCR法を実行する方法によって工程c)が実施され、<100bp、好ましくは<80bpのDNA領域を増幅するプライマーセットを用いて<100bpのサイズのcf核酸の量/濃度が決定される、請求項1または2記載の方法。
- 工程c)において、異なるサイズのアンプリコンを検出する2セットのプライマー対を用いて決定された量/濃度の差違を計算することによって、<100bpのcf核酸サイズ画分の量/濃度が決定され、2つのうちの一方または両方が<100bpである、請求項3記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載の方法によって得られたサイズ画分の濃度/量を比較することによって断片化指数を計算するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 無細胞核酸が循環核酸である、請求項1〜5のいずれか一項記載の体液中の無細胞核酸を定量する方法。
- 無細胞核酸が、無細胞DNA(cfDNA)、無細胞RNA、または無細胞siRNAからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)関心対象の対象を特定する工程;
b)該対象から体液を入手する工程;
c)該体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定する工程であって、該完全性指数またはSFRは、長いサイズ範囲の無細胞核酸の濃度または量と短いサイズ範囲の無細胞核酸の濃度または量との比として計算され、該濃度は、請求項1〜7のいずれか一項記載の体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって決定され、該長いサイズ範囲は180bp〜450bpに含まれる、工程。 - 無細胞核酸の濃度または量が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、好ましくは、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)法を実行する方法によって決定される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- コード鎖上にある関心対象の遺伝子多型に対応する核酸が、位置B1またはA2で開始するプライマーの3'末端に位置し、PCRを実行する方法がアレル特異的PCRである、請求項1および9記載の方法。
- 工程b)が、c)体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定する工程であって、該完全性指数またはSFRは、該無細胞核酸からの長い増幅断片の濃度と短い増幅断片の濃度との比として計算され、該短い断片の長さが100bp未満であり、該長い増幅断片は180bp〜450bpに含まれ、好ましくは、該長い増幅断片は250bp〜350bpに含まれ、かつ、該短い断片は50bp〜99bpに含まれる、工程である、体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための請求項9記載の方法。
- 長い増幅断片が短い断片を部分的または完全に含む、体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための請求項11記載の方法。
- a)請求項1〜7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法によって体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程、
b)以下のパラメータおよび以下の工程を統合することによって、遺伝子多型の存在を示す遊離核酸を検出する工程:
-一方でA1A2および他方でB1B2が2種類の短い配列を代表するものであり;
-A1A2およびB1B2の配列の長さが50〜100bpであり、長さが+/-20%異なるものとし;
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み;
-CB1B2が短い断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、
i)%CB1B2/CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程;または
ii)%CA1A2/CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有する配列と定義される、工程、
%CB1B2/CA1A2または%CA1A2/CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめること
を含む、無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出および定量検出するための方法。 - a)請求項1〜7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法によって、体液試料中の無細胞核酸の濃度または量を決定する工程であって、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、好ましくは定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)法を実行する方法によって無細胞核酸の濃度または量を決定する、工程、
b)以下のパラメータおよび以下の工程を統合することによって、遺伝子多型の存在を示す遊離核酸を検出する工程:
-一方でA1A2他方でB1B2が2種類の短い増幅配列を代表するものであり;
-A1A2およびB1B2の配列の長さが50〜100bpであり、長さが+/-20%異なるものとし;
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み;
-CB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い増幅断片A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとすると、
i)%CB1B2/CA1A2を計算する工程であって、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程;または
ii)%CA1A2/CB1B2を計算する工程であって、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義される、工程、
%CB1B2/CA1A2または%CA1A2/CB1B2が、遺伝子多型の存在の定性検出にとって有意な特定の閾値より大きいことを確かめること
を含む、無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出および定量検出するための請求項13記載の方法。 - 体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための請求項12記載の方法を実行する工程を含み、
-長い増幅断片が短い断片を部分的または完全に含む;ならびに
-該長い増幅断片が250bp〜350bpに含まれ、該短い増幅断片が100bp未満であり、好ましくは、50bp〜99bpに含まれる、請求項10、13、および14記載の方法。 - 体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定するための方法において、長い増幅断片が2種類の短い断片を部分的または完全に含み、短い増幅断片の一方が遺伝子多型を含有する、請求項15記載の方法。
- 以下の工程を含む、個体において無細胞核酸、特に循環DNAを分析するための方法:
a)定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)を実行する方法によって、請求項1〜7のいずれか一項記載の該無細胞核酸を定量する工程;ならびに
b)Q-PCRを実行する方法によって、請求項8、9、11および12または10に記載の該無細胞核酸の完全性指数またはSFRを決定する工程;ならびに
c)請求項10、13、および14のいずれか一項記載の方法によって、該無細胞核酸にある遺伝子多型の存在を定性検出する工程。 - 以下のパラメータおよび計算を統合して、腫瘍を示す患者または腫瘍を示す可能性のある患者において請求項17記載の無細胞核酸を分析するための方法:
-一方でA1A2および他方でB1B2が短い増幅配列を代表するものであり;A1B2が長い増幅配列であり、A1A2およびB1B2、好ましくはA1B2を部分的または完全に含み、
-A1A2またはB1B2のいずれかが遺伝子多型を含み、
-CB1B2が短い増幅断片B1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1A2が短い断片増幅A1A2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値であり、CA1B2が長い増幅断片A1B2の検出による抽出核酸の初期濃度測定値だとし、
-遺伝子多型の存在の定性検出:
-%CB1B2/CA1A2は特定の閾値より大きく、B1B2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義されるか;または
-%CA1A2/CB1B2は特定の閾値より大きく、A1A2は、遺伝子多型を含有するアンプリコン配列と定義され、
-比CB1B2/CA1B2またはCA1A2/CA1B2を決定することによる、完全性指数の評価
ここで、XおよびYがプライマーの5'末端間の核酸上での距離であるか、増幅断片(もしくはアンプリコン)の長さであると考えると、
X<180およびY>X、好ましくは、50<X<100および200<Y<450、より好ましくは、50<X<100および200<Y<350である。 - 体液試料が、全血、血清、血漿、尿、唾液、痰、結腸流出液、骨髄、リンパ液、脳脊髄液、涙液、汗、乳、糞便、気管支洗浄液、および腹水からなる群より選択される、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- 無細胞核酸が、内因性無細胞核酸または外因性無細胞核酸、特に、ウイルス、細菌、真菌、胎児、および異種移植片に由来する無細胞核酸の群から選択される外因性無細胞核酸の群から選択される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- 無細胞核酸が内因性無細胞核酸であり、関心対象の対象が、疾患に罹患している対象、または疾患を発症するリスクのある対象、または生理学的状況もしくは生理学的状態を示す対象である、請求項20記載の方法。
- 疾患が癌である、請求項21記載の方法。
- 健康個体からの体液(好ましくは、血漿)から、癌患者の体液(好ましくは、血漿)を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズは50〜100bpの範囲および101bpを超えるサイズである、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片範囲のレベル間で得られた比を比較する工程であって、<1、好ましくは<0.75の長いサイズ範囲/短いサイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程。 - 健康個体からの体液(好ましくは、血漿)から、癌患者の体液(好ましくは、血漿)を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7記載の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズが<249bpおよび>249bpのサイズ、好ましくはcfDNAのサイズが<100bpおよび249〜409bpの範囲内のサイズ、より好ましくは73〜100bpの範囲内および300〜357bpの範囲内である、工程;
b)2種類の体液試料のそれぞれについて、これらの2種類の断片範囲のレベル間で得られた比を比較する工程であって、<0.5、好ましくは<0.1の長いサイズ範囲/サイズ範囲の比が腫瘍の存在を示す、工程。 - 健康個体からの体液(好ましくは、血漿)から、癌患者の体液(好ましくは、血漿)を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズが>145bpである、工程;
b)cfDNA総量から得られたcfDNA量のパーセントを計算する工程であって、%が20%より小さく、好ましくは5%が腫瘍の存在を示す、工程。 - 健康個体からの体液(好ましくは、血漿)から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば癌患者からの体液(好ましくは、血漿)を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって、2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であって、cfDNAのサイズ範囲が60〜80bp、100〜145bp、および180〜400bpである、工程;
b)健康個体と非健康個体との間で得られた3種類の定量レベルのうち少なくとも2種類、好ましくは3種類の定量レベルを直接比較する工程。 - 生物学的試料中で変異断片と非変異cf核酸断片を識別するための方法であって、以下の工程を含む方法:
変異断片および非変異断片について計算された長い断片および短い断片の濃度の比を決定および比較する工程であって、
-前記長い断片は200bp〜450bpに含まれ、かつ、前記短い断片は145bp未満であり、好ましくは50bp〜99bpに含まれる、工程。 - 健康個体からの体液(好ましくは、血漿)から、cfDNAが高度に放出されている個体、例えば癌患者からの体液(好ましくは、血漿)を特定または分析する方法であって、以下の工程を含む方法:
c)請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって2種類の体液試料中の無細胞DNA(cfDNA)を定量する工程であり、cfDNAのサイズ範囲が60〜80bp、100〜145bp、および180〜400bpである、工程;
d)ロジスティック関数におけるパラメータとして、これらの3種類の値のうちの2つを用いることによってサイズプロファイルを決定する工程であって、工程b)において得られたサイズプロファイル比較が特定の生理学的状況を示す、工程。 - 個体の特定の生理学的状況、好ましくはcfDNAが高度に放出されている個体における特定の生理学的状況の診断、予後、セラグノスティック(theragnostic)、または進展を行うための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法によって、該個体から得られた体液試料中の無細胞核酸の完全性指数またはSFRをある時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、該核酸の存在が該特定の生理学的状況に関連する、工程、および
b)得られた完全性指数またはSFRを比較し、この時間間隔にわたって無細胞核酸の該完全性指数またはSFRが変化したかどうか確かめる工程。 - 0.5未満、好ましくは0.1未満の値への完全性指数の減少が個体の癌の進行または特定の生理学的状況の進展を示す、請求項29記載の診断もしくは予後を行うための方法またはセラグノスティック方法。
- 個体の特定の生理学的状況、好ましくはcfDNAが高度に放出されている個体における特定の生理学的状況の診断、予後、セラグノスティック、または進展のための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の体液試料中の無細胞核酸を定量する方法によって、該個体から得られた体液試料中の短い変異無細胞核酸または非変異無細胞核酸の濃度をある時間間隔の間にくりかえし計算する工程であって、該変異核酸または非変異核酸の存在が該特定の生理学的状況に関連する、工程、および
b)得られた濃度を比較し、この時間間隔にわたって該無細胞核酸の該変異増幅断片または非変異増幅断片の濃度が変化したかどうか確かめる工程。 - 患者において、核酸多型に関連する病理学的状況もしくは生理学的状況、例えば、腫瘍の存在もしくは腫瘍の進行の診断、予後を行うための方法、または患者において、核酸多型に関連する病理学的状況もしくは生理学的状況を確かめる工程を含むセラノスティック方法であって、以下の工程を含む方法:
a)-請求項3〜7のいずれか一項記載の無細胞核酸を定量する方法による、該患者からの体液試料中の無細胞核酸の濃度の決定;
-請求項10、13、および14のいずれか一項記載の方法による、該無細胞核酸中の該遺伝子多型の検出であって、発見された変異無細胞核酸対非変異無細胞核酸のパーセントが閾値より大きいかどうか確かめることによって、患者は該変異がある、または該変異がないと分類され、好ましくは、該閾値は所与の変異に特有のものであり、非変異患者および変異患者のコホートから決定される、検出;ならびに
-請求項8、9、11、および12のいずれか一項記載の方法による、試料中の該無細胞核酸の完全性指数またはSFRの決定
の群より選択される少なくとも2種類のバイオマーカーを研究する工程、
b)該少なくとも2種類のバイオマーカーを含むロジスティック関数によって、該少なくとも2つの値を組み合わせる工程、ならびに
c)該患者における病理学的状況または生理学的状況、例えば、癌の診断または予後を行うために、該ロジスティック関数の最終値を分析する工程。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US38008410P | 2010-09-03 | 2010-09-03 | |
EP10305952A EP2426217A1 (en) | 2010-09-03 | 2010-09-03 | Analytical methods for cell free nucleic acids and applications |
EP10305952.3 | 2010-09-03 | ||
US61/380,084 | 2010-09-03 | ||
PCT/EP2011/065333 WO2012028746A1 (en) | 2010-09-03 | 2011-09-05 | Analytical methods for cell free nucleic acids and applications |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016181248A Division JP6608788B2 (ja) | 2010-09-03 | 2016-09-16 | 無細胞核酸の分析方法および用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013536679A true JP2013536679A (ja) | 2013-09-26 |
JP6010537B2 JP6010537B2 (ja) | 2016-10-19 |
Family
ID=43033199
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013526504A Active JP6010537B2 (ja) | 2010-09-03 | 2011-09-05 | 無細胞核酸の分析方法および用途 |
JP2016181248A Active JP6608788B2 (ja) | 2010-09-03 | 2016-09-16 | 無細胞核酸の分析方法および用途 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016181248A Active JP6608788B2 (ja) | 2010-09-03 | 2016-09-16 | 無細胞核酸の分析方法および用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9580755B2 (ja) |
EP (3) | EP2426217A1 (ja) |
JP (2) | JP6010537B2 (ja) |
BR (1) | BR112013005046B1 (ja) |
CA (1) | CA2809914C (ja) |
WO (1) | WO2012028746A1 (ja) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016540508A (ja) * | 2013-12-02 | 2016-12-28 | バイオカーティス エヌ ヴイ | 循環核酸の抽出 |
JP2017006124A (ja) * | 2015-06-23 | 2017-01-12 | サフラン・アイデンティティ・アンド・セキュリティー | キャピラリー電気泳動のためのpcrキット |
WO2017014177A1 (ja) * | 2015-07-17 | 2017-01-26 | 凸版印刷株式会社 | 健康状態の評価方法及び抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法 |
JP2017525371A (ja) * | 2014-08-22 | 2017-09-07 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
CN109689891A (zh) * | 2016-07-06 | 2019-04-26 | 夸登特健康公司 | 用于无细胞核酸的片段组谱分析的方法 |
JP2020096601A (ja) * | 2014-04-21 | 2020-06-25 | ナテラ, インコーポレイテッド | 変異の検出および染色体分節の倍数性 |
JP2020188767A (ja) * | 2014-08-22 | 2020-11-26 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
JP2021509266A (ja) * | 2017-12-19 | 2021-03-25 | バイオロジカル ダイナミクス,インク. | 無細胞dna断片を検出および定量化するための方法とデバイス |
JP2021531016A (ja) * | 2018-07-23 | 2021-11-18 | ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン | 無細胞dna損傷分析およびその臨床応用 |
US11319594B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-05-03 | Resolution Bioscience, Inc. | Methods for the detection of genomic copy changes in DNA samples |
US11339391B2 (en) | 2015-11-11 | 2022-05-24 | Resolution Bioscience, Inc. | High efficiency construction of DNA libraries |
Families Citing this family (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10337054B2 (en) | 2004-02-02 | 2019-07-02 | Quantum-Si Incorporated | Enrichment of nucleic acid targets |
ATE406463T1 (de) | 2005-04-06 | 2008-09-15 | Maurice Stroun | Methode zur krebsdiagnose mittels nachweis von dna und rna im kreislauf |
US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
US20120185176A1 (en) | 2009-09-30 | 2012-07-19 | Natera, Inc. | Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling |
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
AU2011255641A1 (en) | 2010-05-18 | 2012-12-06 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
EP2426217A1 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-07 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Analytical methods for cell free nucleic acids and applications |
AU2011348100B2 (en) | 2010-12-22 | 2016-08-25 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
WO2013060762A1 (en) * | 2011-10-25 | 2013-05-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for diagnosing a disease based on plasma-dna distribution |
US9892230B2 (en) * | 2012-03-08 | 2018-02-13 | The Chinese University Of Hong Kong | Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma |
US9862995B2 (en) | 2012-03-13 | 2018-01-09 | Abhijit Ajit Patel | Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing |
US10077474B2 (en) | 2012-05-29 | 2018-09-18 | Abbott Molecular, Inc. | Method of designing primers, method of detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs), method of distinguishing SNPs, and related primers, detectable oligonucleotides, and kits |
US11261494B2 (en) | 2012-06-21 | 2022-03-01 | The Chinese University Of Hong Kong | Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA |
RU2650790C2 (ru) * | 2012-07-24 | 2018-04-17 | Натера, Инк. | Способы и композиции для высокомультиплексной пцр |
US10876152B2 (en) | 2012-09-04 | 2020-12-29 | Guardant Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
US11913065B2 (en) | 2012-09-04 | 2024-02-27 | Guardent Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
US20160040229A1 (en) | 2013-08-16 | 2016-02-11 | Guardant Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
CN104781421B (zh) | 2012-09-04 | 2020-06-05 | 夸登特健康公司 | 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法 |
SG10201609080WA (en) * | 2013-02-28 | 2016-12-29 | Univ Hong Kong Chinese | Maternal plasma transcriptome analysis by massively parallel rna sequencing |
EP2984185B1 (en) * | 2013-04-08 | 2019-06-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods and compositions for treating cancer |
WO2014202696A1 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for determining the quality of an embryo |
US10174375B2 (en) | 2013-09-20 | 2019-01-08 | The Chinese University Of Hong Kong | Sequencing analysis of circulating DNA to detect and monitor autoimmune diseases |
US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
WO2015058176A1 (en) * | 2013-10-19 | 2015-04-23 | Trovagene, Inc. | Detecting mutations in disease over time |
WO2015063121A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | Region Syddanmark | Method for analyzing body fluid samples |
US11286519B2 (en) | 2013-12-11 | 2022-03-29 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for enrichment of amplification products |
US11859246B2 (en) | 2013-12-11 | 2024-01-02 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for enrichment of amplification products |
JP6571665B2 (ja) | 2013-12-28 | 2019-09-04 | ガーダント ヘルス, インコーポレイテッド | 遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム |
WO2015181213A1 (en) * | 2014-05-27 | 2015-12-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer |
EP3161151A1 (en) * | 2014-06-24 | 2017-05-03 | Abbott Molecular Inc. | Detection of single nucleotide polymorphisms in human kras |
US10184150B2 (en) | 2014-06-27 | 2019-01-22 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Free nucleic acids and miRNA as non-invasive method for determining embryo quality |
US10400282B2 (en) | 2014-06-27 | 2019-09-03 | Inserm (Institut National De La Santéet De La Recherche Médicale) | Methods employing circulating DNA and miRNA as biomarkers for female infertility |
JP2017522908A (ja) | 2014-07-25 | 2017-08-17 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | セルフリーdnaを生じる組織及び/又は細胞タイプを決定する方法、並びにそれを用いて疾患又は異常を識別する方法 |
WO2016063122A1 (en) | 2014-10-20 | 2016-04-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for screening a subject for a cancer |
US10364467B2 (en) | 2015-01-13 | 2019-07-30 | The Chinese University Of Hong Kong | Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer |
ES2908347T3 (es) | 2015-02-10 | 2022-04-28 | Univ Hong Kong Chinese | Detección de mutaciones para cribado de cáncer y análisis fetal |
WO2016168844A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | The Translational Genomics Research Institute | Quality assessment of circulating cell-free dna using multiplexed droplet digital pcr |
CN104762399A (zh) * | 2015-04-17 | 2015-07-08 | 上海产业技术研究院 | 肿瘤循环dna kras突变检测方法 |
US11479812B2 (en) | 2015-05-11 | 2022-10-25 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
JP6873921B2 (ja) | 2015-05-18 | 2021-05-19 | カリウス・インコーポレイテッド | 核酸の集団を濃縮するための組成物および方法 |
WO2016185284A1 (en) | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Boreal Genomics, Inc. | Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins |
CN104894268B (zh) * | 2015-06-05 | 2018-02-09 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 定量样本中源自细胞凋亡的dna浓度的方法及其应用 |
CN114807323A (zh) | 2015-10-09 | 2022-07-29 | 安可济控股有限公司 | 用于富集扩增产物的方法及组合物 |
US20180318337A1 (en) * | 2015-11-04 | 2018-11-08 | Duke University | Polycationic polymers for use in treating and detecting cancer |
EP3390668A4 (en) | 2015-12-17 | 2020-04-01 | Guardant Health, Inc. | METHODS OF DETERMINING THE NUMBER OF TUMOR GENE COPIES BY ACELLULAR DNA ANALYSIS |
US11427866B2 (en) | 2016-05-16 | 2022-08-30 | Accuragen Holdings Limited | Method of improved sequencing by strand identification |
WO2017223366A1 (en) * | 2016-06-23 | 2017-12-28 | Accuragen Holdings Limited | Cell-free nucleic acid standards and uses thereof |
WO2018035170A1 (en) | 2016-08-15 | 2018-02-22 | Accuragen Holdings Limited | Compositions and methods for detecting rare sequence variants |
US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
EP3535415A4 (en) | 2016-10-24 | 2020-07-01 | The Chinese University of Hong Kong | TUMOR DETECTION METHODS AND SYSTEMS |
US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
SG11201906397UA (en) | 2017-01-25 | 2019-08-27 | Univ Hong Kong Chinese | Diagnostic applications using nucleic acid fragments |
EP3610034B1 (en) | 2017-04-12 | 2022-06-08 | Karius, Inc. | Sample preparation methods, systems and compositions |
WO2019013613A2 (es) * | 2017-07-09 | 2019-01-17 | Hakken Enterprise Sa De Cv | Métodos y kits para determinar el riesgo de cáncer |
WO2019020057A1 (en) * | 2017-07-26 | 2019-01-31 | The Chinese University Of Hong Kong | ENHANCING CANCER SCREENING WITH ACELLULAR VIRAL NUCLEIC ACIDS |
CN107447013B (zh) * | 2017-08-31 | 2020-06-05 | 上海伯豪生物技术有限公司 | 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 |
WO2019060716A1 (en) | 2017-09-25 | 2019-03-28 | Freenome Holdings, Inc. | SAMPLE EXTRACTION METHODS AND SYSTEMS |
US11814686B2 (en) | 2017-12-07 | 2023-11-14 | Institut National de la Santéde la Recherche Médicale | Method for screening and treating a subject for a cancer |
CN116121340A (zh) | 2017-12-19 | 2023-05-16 | 生物动力学公司 | 用于从生物样品中检测多种分析物的方法和装置 |
WO2019133752A1 (en) * | 2017-12-28 | 2019-07-04 | Development Center For Biotechnology | A method for predicting drug efficacy |
EP3743518A4 (en) * | 2018-01-24 | 2021-09-29 | Freenome Holdings, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR DETECTING ANOMALY IN PATTERNS OF NUCLEIC ACIDS |
CN108179191A (zh) * | 2018-02-05 | 2018-06-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测人类ctDNA基因突变的试剂盒 |
US11629375B2 (en) * | 2018-02-21 | 2023-04-18 | Nucleix Ltd. | Methods and kits for determining the efficiency of plasma separation from whole blood |
US11203782B2 (en) | 2018-03-29 | 2021-12-21 | Accuragen Holdings Limited | Compositions and methods comprising asymmetric barcoding |
JP2021520218A (ja) | 2018-04-02 | 2021-08-19 | バイオロジカル ダイナミクス,インク. | 誘電体材料 |
TW202012639A (zh) * | 2018-04-24 | 2020-04-01 | 美商格瑞爾公司 | 使用病原體核酸負荷確定個體是否患有癌症病況的系統及方法 |
US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
WO2020076957A1 (en) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | Tai Diagnostics, Inc. | Cell lysis assay for cell-free dna analysis |
WO2020172566A1 (en) * | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Accuragen Holdings Limited | Methods and compositions for early cancer detection |
WO2021001431A1 (en) | 2019-07-02 | 2021-01-07 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer |
US20220290244A1 (en) | 2019-08-02 | 2022-09-15 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for screening a subject for a cancer |
US11427874B1 (en) | 2019-08-26 | 2022-08-30 | Epi One Inc. | Methods and systems for detection of prostate cancer by DNA methylation analysis |
WO2021061640A1 (en) * | 2019-09-23 | 2021-04-01 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Compositions and methods for modulating genomic complex integrity index |
EP4162082A1 (en) | 2020-06-04 | 2023-04-12 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Methods for diagnosing and treating autism |
EP4172621A1 (en) | 2020-06-30 | 2023-05-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for predicting the risk of recurrence and/or death of patients suffering from a solid cancer after preoperative adjuvant therapies |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008519606A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-12 | アンビオン インコーポレーティッド | miRNAおよびmiRNA阻害分子に関する方法および組成物 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6020124A (en) * | 1992-04-27 | 2000-02-01 | Trustees Of Dartmouth College | Detection of soluble gene sequences in biological fluids |
WO2005092038A2 (en) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | The Johns Hopkins University | Methods for the detection of nucleic acid differences |
JP2006304611A (ja) * | 2005-04-26 | 2006-11-09 | Daiyukai | Pcr法、プライマー及びpna。 |
WO2009051842A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | The Johns Hopkins University | Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna |
EP2426217A1 (en) * | 2010-09-03 | 2012-03-07 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Analytical methods for cell free nucleic acids and applications |
-
2010
- 2010-09-03 EP EP10305952A patent/EP2426217A1/en not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-09-05 US US13/820,302 patent/US9580755B2/en active Active
- 2011-09-05 EP EP21214078.4A patent/EP4036251A1/en active Pending
- 2011-09-05 WO PCT/EP2011/065333 patent/WO2012028746A1/en active Application Filing
- 2011-09-05 JP JP2013526504A patent/JP6010537B2/ja active Active
- 2011-09-05 CA CA2809914A patent/CA2809914C/en active Active
- 2011-09-05 BR BR112013005046-2A patent/BR112013005046B1/pt active IP Right Grant
- 2011-09-05 EP EP11752546.9A patent/EP2611935A1/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-09-16 JP JP2016181248A patent/JP6608788B2/ja active Active
-
2017
- 2017-02-24 US US15/441,293 patent/US20170166982A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-08-05 US US16/531,287 patent/US11674183B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008519606A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-12 | アンビオン インコーポレーティッド | miRNAおよびmiRNA阻害分子に関する方法および組成物 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6015039871; Gastroenterology, 2009, Vol. 136, No. 5, p. A-165, 1070 * |
JPN6015039875; J. Am. Chem. Soc., 2010 [Available online on 2010.04.05], Vol. 132, No. 16, pp. 5793-5798 * |
JPN6015039876; BJU Int., 2009, Vol. 104, No. 1, pp. 48-52 * |
JPN6015039879; Prenat. Diagn., 2005, Vol. 25, No. 7, pp. 604-607 * |
JPN6015039881; Nucleic Acids Res., 2010 [Available online on 2010.05.21], Vol. 38, No. 18, pp. 6159-6175 * |
JPN6015039889; J. Urol., 2009, Vol. 181, No. 1, pp. 363-371 * |
JPN6015039892; PLoS One, 2011, Vol. 6, No. 9, e23418. doi: 10.1371/journal.pone.0023418. * |
JPN6015039894; Transl. Oncol., 2013, Vol. 6, No. 3, pp. 319-328 * |
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10385330B2 (en) | 2013-12-02 | 2019-08-20 | Biocartis N.V. | Extraction of circulating nucleic acids |
JP2016540508A (ja) * | 2013-12-02 | 2016-12-28 | バイオカーティス エヌ ヴイ | 循環核酸の抽出 |
JP6994058B2 (ja) | 2014-04-21 | 2022-01-14 | ナテラ, インコーポレイテッド | 変異の検出および染色体分節の倍数性 |
AU2021209221B2 (en) * | 2014-04-21 | 2022-03-10 | Natera, Inc. | Detecting mutations and ploidy in chromosomal segments |
JP2022028949A (ja) * | 2014-04-21 | 2022-02-16 | ナテラ, インコーポレイテッド | 変異の検出および染色体分節の倍数性 |
JP2020096601A (ja) * | 2014-04-21 | 2020-06-25 | ナテラ, インコーポレイテッド | 変異の検出および染色体分節の倍数性 |
JP2017525371A (ja) * | 2014-08-22 | 2017-09-07 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
JP7441584B6 (ja) | 2014-08-22 | 2024-03-15 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
JP2020188767A (ja) * | 2014-08-22 | 2020-11-26 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
JP7441584B2 (ja) | 2014-08-22 | 2024-03-01 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
JP2017006124A (ja) * | 2015-06-23 | 2017-01-12 | サフラン・アイデンティティ・アンド・セキュリティー | キャピラリー電気泳動のためのpcrキット |
JPWO2017014177A1 (ja) * | 2015-07-17 | 2018-04-26 | 凸版印刷株式会社 | 健康状態の評価方法及び抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法 |
WO2017014177A1 (ja) * | 2015-07-17 | 2017-01-26 | 凸版印刷株式会社 | 健康状態の評価方法及び抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法 |
US11339391B2 (en) | 2015-11-11 | 2022-05-24 | Resolution Bioscience, Inc. | High efficiency construction of DNA libraries |
CN109689891A (zh) * | 2016-07-06 | 2019-04-26 | 夸登特健康公司 | 用于无细胞核酸的片段组谱分析的方法 |
JP2019531700A (ja) * | 2016-07-06 | 2019-11-07 | ガーダント ヘルス, インコーポレイテッド | セルフリー核酸のフラグメントームプロファイリングのための方法 |
US11319594B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-05-03 | Resolution Bioscience, Inc. | Methods for the detection of genomic copy changes in DNA samples |
JP2021509266A (ja) * | 2017-12-19 | 2021-03-25 | バイオロジカル ダイナミクス,インク. | 無細胞dna断片を検出および定量化するための方法とデバイス |
JP2021531016A (ja) * | 2018-07-23 | 2021-11-18 | ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン | 無細胞dna損傷分析およびその臨床応用 |
JP2021182940A (ja) * | 2020-05-25 | 2021-12-02 | レゾリューション バイオサイエンス, インコーポレイテッド | 無細胞DNA(cfDNA)の定量的遺伝子解析のための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2611935A1 (en) | 2013-07-10 |
US20130224740A1 (en) | 2013-08-29 |
US20170166982A1 (en) | 2017-06-15 |
US11674183B2 (en) | 2023-06-13 |
JP6608788B2 (ja) | 2019-11-20 |
CA2809914A1 (en) | 2012-03-08 |
JP2017042165A (ja) | 2017-03-02 |
BR112013005046B1 (pt) | 2020-09-08 |
EP2426217A1 (en) | 2012-03-07 |
CA2809914C (en) | 2023-06-13 |
EP4036251A1 (en) | 2022-08-03 |
US9580755B2 (en) | 2017-02-28 |
JP6010537B2 (ja) | 2016-10-19 |
US20190352725A1 (en) | 2019-11-21 |
WO2012028746A1 (en) | 2012-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6608788B2 (ja) | 無細胞核酸の分析方法および用途 | |
JP5843840B2 (ja) | 新しい癌マーカー | |
US20160115547A1 (en) | Use of free circulating dna for diagnosis, prognosis, and treatment of cancer | |
JP2010279394A (ja) | 疾患検出のための方法 | |
JP2019504618A5 (ja) | ||
CA2328616A1 (en) | Methods for disease diagnosis from stool samples | |
TWI807306B (zh) | 血漿粒線體dna分析之應用 | |
JP6438119B2 (ja) | ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 | |
KR101857227B1 (ko) | 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 암 유전자 분석 방법 및 이를 위한 암 유전자 분석용 키트 | |
JP6054750B2 (ja) | 肝細胞癌のリスク評価方法 | |
JP2011509688A (ja) | 前立腺癌におけるgstp1高メチル化の発見 | |
WO2004113574A2 (en) | Methods for disease screening | |
JP6608424B2 (ja) | 前癌性結腸直腸ポリープおよび結腸直腸癌を特定するための方法およびキット | |
JP2022008193A (ja) | リンチ症候群大腸がん検査方法、及びそれに用いるリンチ症候群大腸がん検査用キット | |
JP2011097833A (ja) | 特定の遺伝子のメチル化の頻度を、頭頸部腫瘍のバイオマーカーとして使用する方法 | |
SG185254A1 (en) | 3.4 kb mitochondrial dna deletion for use in the detection of cancer | |
KR20100090702A (ko) | 암의 검출에 사용하기 위한 약 12317-16254 잔기의 미토콘드리아 dna 결손 | |
JP2010239899A (ja) | 潰瘍性大腸炎患者の癌化リスクを決定する方法 | |
JP4042826B2 (ja) | Dna変異の検出法 | |
CN116656808A (zh) | 检测apc基因大片段缺失的核酸组合物、试剂盒及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140818 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150526 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151005 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160330 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160727 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160812 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160916 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6010537 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |