JP2017006124A - キャピラリー電気泳動のためのｐｃｒキット - Google Patents

Abstract

【課題】電気泳動図上で読み取られた情報の一片から試料中の目的の核酸モチーフの存在を検出するためのさらに信頼でき、さらに客観的な方法を提案すること。
【解決手段】本発明は、特定の核酸モチーフの検出を改善するためおよび得られた結果の信頼性を増加させるためのＰＣＲキットに関する。より正確には本発明は、電気泳動処理の際に核酸を含有する試料において特定の核酸モチーフの特徴的なコードの等価物を検出することを可能にする特定の特徴を有する修飾プライマーを使用することを提案し、このコードはこれらのモチーフの存在をより良く検出できるようにする。本発明は、このようなプライマーを使用して目的の核酸モチーフ（例えばＳＴＲ、ｍｉｎｉ−ＳＴＲまたはＶＮＴＲ）を検出するための方法も提案する。本発明は、これだけに限らないが、キャピラリー電気泳動の分野における応用を有利に見出す。
【選択図】図１

Description

本発明は、特定の核酸モチーフの検出を改善するためおよび得られた結果の信頼性を増加させるためのＰＣＲキットに関する。

より正確には本発明は、電気泳動処理の際に核酸を含有する試料において特定の核酸モチーフの特徴的なコードの等価物を検出することを可能にする特定の特徴を有する修飾プライマーを使用することを提案し、このコードはこれらのモチーフの存在をより良く検出できるようにする。

本発明は、このようなプライマーを使用して目的の核酸モチーフ（例えばＳＴＲ、ｍｉｎｉ−ＳＴＲまたはＶＮＴＲ）を検出するための方法も提案する。

本発明は、これだけに限らないが、キャピラリー電気泳動の分野における応用を有利に見出す。

一般的技術分野および先行技術
キャピラリーゲル電気泳動は、今日、対立遺伝子の多様性を検出し、それにより個体を識別するために使用され得るＤＮＡプロファイルを得るために広く使用されている（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９５年））。

ＮＩＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｓｔｒ＿ｆａｃｔ．ｈｔｍ）によると、合衆国において従来のＰＣＲキットによって検出可能な対立遺伝子の数（すなわち、合衆国における偏性（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）遺伝子マーカーを含有する）は対立遺伝子４２５個である（遺伝子座：ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＧＡ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ、ＶＷＡ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１において）。さらに欧州において一般的に使用され、合衆国において使用され得るＰＣＲキットに関して検出される対立遺伝子の数（すなわち、欧州および合衆国における偏性マーカーを含有する）は対立遺伝子５５２個である（上に引用の遺伝子座に、欧州マーカー：Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ１０Ｓ１２４８、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１９Ｓ４４３、Ｄ２２Ｓ１０４５、ＳＥ３３が加えられる。）。

より正確には、今日、個体は多数の遺伝子座の非翻訳部分において見出される短いタンデム反復（ＳＴＲ）配列のサイズによって区別可能である。これらのＳＴＲを標的化する多数の多重ＰＣＲキットが存在する（例えば次のリンク：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｍｕｌｔｉｐｌｘ．ｈｔｍを参照されたい。）。従来、ＰＣＲを受けた検査ＤＮＡ試料およびこのＰＣＲの産生物（すなわち生成されたアンプリコン）は、次いでキャピラリー電気泳動によって分析される。試料中に含有される各対立遺伝子は、個体に特徴的で、ＰＣＲによって生成されるアンプリコンのサイズに影響を与える明確な数のＳＴＲを含有する。各アンプリコンは、所与の標識およびサイズを有し、対応する電気泳動図上のピークによって検出可能である。これらのピークの組合せは、個体の同一性に関する情報を提供する。

電気泳動図は、キャピラリー電気泳動から生じる結果であり、ＣＣＤセンサーでのアナログデータ読み取り値を材料の量に関連付ける（増幅によっておよび１つ以上の蛍光色素を使用する標識によって検出可能にされる。）。ＣＣＤセンサーによって測定された値が大きいほど（飽和限界まで）、シグナルが目的の核酸の存在を明らかにする確率が高く、それにより情報をより信頼できるものにする。

この電気泳動図は、残念ながら、主に、
・ 検出されたシグナルに偽ピークの出現を生じる人為産物の存在、これらの人為産物は：
・ ポリメラーゼ機能不全。２つの現象が公知である：
・ ＳＴＲ上の反復が１個少ない配列（「ポリメラーゼスタッターリング」として公知）；
・ 複製物の末端でのＡヌクレオチドの付加（Ａ付加または得られたプロファイル上でのショルダー現象として公知、
・ 変動信号対雑音比を生じるデジタル／アナログバックグラウンドノイズ（ＣＣＤセンサー、センサーノイズ、迷光、熱関連光学障害（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）、振動、低性能センサーなどに関連する）、ならびに
・ 飽和現象（または「プルアップ」、ＣＣＤセンサーの不完全な較正、不完全な色チャネル分離、低性能センサーによる）
・ 遊離のままでキャピラリーに注入された蛍光色素（「色素ブロブ（ｄｙｅ ｂｌｏｂ）」として公知。）
・ キャピラリー電気泳動に影響を与える電気妨害（「スパイク」として公知。）
による可能性があり、
・ 電気泳動図の末端の解像度の喪失（キャピラリー中の材料の拡散による）
・ 変異原性ＤＮＡの領域上に位置付けられたプライマーに関連する増幅（ＰＣＲ）問題による特定のピークの欠如（「対立遺伝子ドロップアウト」として公知の現象
により品質においてさまざまに多様である傾向がある。

今日、センサーによって測定されたデータのアナログの性質および電気泳動図の構築中に作用する種々の破壊的パラメーターは、対象への一般的知識および経験によってプロファイルの品質を保証するべきである技術分野の専門家による２回目の読み取りを回避できるようにしない。一般に専門家は、プロファイルの抽出を確証するためにその判断をデータの振幅およびその形状に基づく（有効なシグナルは、当業者に公知の特定の形状を有し、電気泳動図全体にわたる解像度の喪失現象のために、末端に向かってさらに顕著になる。）。それにより、結果を分析するための現在の方法は、それが事実上完全には客観的でないことから自動化され得ない。さらに、専門家によって選択されたデータがどれほどの確率で現実に近いかを評価することは不可能である。

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｓｔｒ＿ｆａｃｔ．ｈｔｍ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｍｕｌｔｉｐｌｘ．ｈｔｍ

本発明の全般的提示
本発明の全般的目的は、電気泳動図上で読み取られた情報の一片から試料中の目的の核酸モチーフの存在を検出するためのさらに信頼でき、さらに客観的な方法を提案することである。

より正確には本発明は、電気泳動図上で読み取られた情報の各一片の非常に高い客観的確率を確実にする、シグナル誤差に非常に強く（スタッター、ショルダーおよびプルアップ現象の排除など）アナログバックグラウンドノイズにあまり感受性でない核酸プロファイルを読み取るための方法を提案する。この方法は、専門家による２回目の読み取りを回避し、それにより自動化され得る。

この目的のため、本発明の方法は、探索されるモチーフに特異的な、以後ｎ−ＡＭＣと称されるプライマーセットの使用を必要とする。

これらのプライマーセット（ｎ−ＡＭＣ）は、本発明の目的でもあるいわゆる「コード」ＰＣＲキットに有利に組み入れられる。このＰＣＲキットは、いくつかの変数（塩基サイズ、色）の観点から、高度に特異的な様式で探索される各モチーフを「コードする」ことを可能にする（下の例を参照されたい。）。このキットは、短いタンデム反復（ＳＴＲ）、例えば５０から４５０塩基対（ｂｐ）のサイズを有するＳＴＲを検出するために具体的には使用され得る。それによりこのキットは、具体的には法科学において使用され得る。

本発明は、このようなプライマーまたはこのようなキットを使用して、試料中の目的のモチーフを検出するための方法にも関する。

本発明は、このようなキットによって産生された電気泳動図を読み取るための方法にも関する。

最後に、本発明は、これらの方法を使用するための、より具体的には本発明のプライマーのパラメーターに関する助言を提供する。

本発明の意味内で３−ＡＭＣ（目的の遺伝子座の各対立遺伝子を検出するための３個のプライマー）を使用し、３個の色（Ｃ−１、ＣおよびＣ＋１）を使用する、本発明のＰＣＲキットで得ることができる例示的電気泳動図である。実線は市販のキットで従来的に得られた代表的ピークを表す（「従来の」キットで得られた電気泳動図、下の図最後のパネルも参照されたい。）。実線および点線は、本発明のＰＣＲキットを使用して得られたピークを表す（Ｔ_ｘ＝遺伝子座Ｘの対立遺伝子に対するサイズＴのアンプリコンに対応するピーク、Ｔ_ｘｂ＝遺伝子座Ｘの第２の対立遺伝子のアンプリコンに対応するピーク、個体がヘテロ接合性である場合、Ｔ_ｘ＋１＝遺伝子座Ｘの対立遺伝子に対するサイズＴ＋１塩基対のアンプリコンに対応するピーク、Ｔ_ｘ−１＝遺伝子座Ｘの対立遺伝子に対するサイズＴ−１塩基対のアンプリコンに対応するピーク）。ここでＸは１から６の間の整数である。 ｎ＝３で本発明のＰＣＲキットを使用し、探索されるモチーフが組合せ：Ｔ／Ｃ、Ｔ＋１／ＣおよびＴ−１／Ｃ−１である本出願に記載のモチーフ法の例示的実施形態を示す図である。２つのグラフは、色Ｃ−１（上）およびＣ（下）について得られた電気泳動図を表す。実線は市販のキットで従来的に得られたピークを表し（サイズＴのアンプリコンに対応する。）、点線は本発明の標識で得られたものを表す（色Ｃ−１およびＣでサイズＴ−１およびＴ＋１のアンプリコンをそれぞれ生成する。）。 本発明による遺伝子プロファイルを検出するための技術を表す論理図である。ＤＮＡを含有する個体の試料（１）から、ＤＮＡを従来の技術で抽出し（２）、次いで本発明のＰＣＲキットの構成成分（ｄＮＴＰ、プライマー、ポリメラーゼなど）と接触させる（３）。ＰＣＲを実行し（４）、次いでアンプリコンを含有する試料はキャピラリー電気泳動によって分析され（５）、電気泳動図を作り（６）、その上で標識アンプリコンに対応するピークが収集される（７）。これらのピークの分析は辞書的方法によって（８）またはモチーフ方法によって（９）、実際には両方の方法の組合せによって、個体の遺伝子プロファイル（１０）を検出するために実行され得る。この検出は現在の技術よりもさらに信頼でき自動的に行うことができる。

本発明のプライマーセットの記載（ｎ−ＡＭＣ）
本発明の意味の内で「ｎ−ＡＭＣ」は、核酸上に検出される目的のモチーフを特異的に増幅するための識別可能なプライマーのセットである。「ｎ−ＡＭＣ」中の数「ｎ」は前記セットに含有される前記モチーフに特異的なプライマー対の数を示している。したがって、「３−ＡＭＣ」は同じモチーフを特異的に増幅するための３個のプライマー対を含有し、「４−ＡＭＣ」は同じモチーフを特異的に増幅するための４個のプライマー対を含有するなど。

本発明の意味の内で「核酸」によって意味されるのは、核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列であり、用語は本明細書において区別せずに使用される。この用語は、非天然ヌクレオチドを含む（または含まない）ヌクレオチドの明確な配列決定を指し、同様に２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡにまたは前記ＤＮＡの転写産生物に対応する。好ましくはそれは１本鎖または２本鎖ＤＮＡである。

上に示したとおり各ｎ−ＡＭＣは、目的の同じモチーフ（以降「モチーフＡ」と称される。）に特異的ないくつかのプライマー対を含有する。

「目的のモチーフ」によって意味されるのは、検出するためおよび／または同定するために探索する特徴的なヌクレオチド断片を含有する核酸の領域である。前記断片は、例えばある種の塩基の特徴的な配列決定であってよい。代替的に前記断片は、その数を測定するために探索する、反復とも称される（短いタンデム反復（ＳＴＲ）、ミニＳＴＲまたはＶＮＴＲなど）特徴的な配列の繰り返しであってよい。最終的に前記断片は、対照集団と比較してヌクレオチド挿入または逆にヌクレオチド欠失を受けている場合がある。目的のこれらモチーフは、好ましくは市販のキット（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘなど）によって検出されるものと同じである。本発明の内容では前記断片は、好ましくは上に説明のとおり、法科学において個体を識別するために使用され得るＳＴＲ対立遺伝子である。

「プライマー」によって本明細書において意味されるのは、例えば上に規定の目的のモチーフの末端に位置する標的核酸配列とのハイブリダイゼーション複合体を形成するための特定の条件下でハイブリダイゼーションの特異性を有する例えば１５から４０ヌクレオチド、具体的には１８から３０ヌクレオチドを含むヌクレオチド断片である。これらのプライマーは、好ましくは１本鎖ＤＮＡである。ＰＣＲによる増幅を実行するためにこれらのプライマーを「対」で使用する必要があり、対の内の１つのプライマーは増幅される目的の領域の上流に、他方は下流にハイブリダイズする。

「モチーフＡに特異的なプライマー対」によって本明細書において意味されるのは、「モチーフＡの特異的増幅を可能にする」プライマー対である。実際に目的のモチーフのいずれかの側に特異的にハイブリダイズする２つのプライマーは問題であり、２つのハイブリダイゼーション領域は最大で２０００塩基対離れている（Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ、２００９年）。「特異的に」によって意味されるのは、前記プライマーのハイブリダイゼーションが関連する領域に８０％未満の相同性を有する配列を有する核酸では生じないことである。適切なストリンジェンシー条件を規定するパラメーターは、対になった鎖の５０％が離れる温度（Ｔｍ）に依存する。３０塩基より短い配列についてＴｍは関係：Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）によって規定される。適切なストリンジェンシー条件（すなわち非特異的配列がハイブリダイズしない）下においてハイブリダイゼーション温度は、好ましくはＴｍより５から１０℃低く、使用されるハイブリダイゼーション緩衝液は好ましくは高イオン強度（例えば６Ｘ ＳＳＣ溶液など）の溶液である。当業者は、その配列が公知であれば、所与のヌクレオチド断片に対する特異的プライマーを同定する能力が十分にある。法科学では、ＳＴＲを含有する領域のいずれかの側に結合する、すなわち個体により異なるアンプリコンを生成することを可能にするプライマー対は当業者に周知である（リンク：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍで提案されている表を参照されたい。）。

本発明の内容では、各ｎ−ＡＭＣ内で同じモチーフに特異的な少なくとも２個のプライマー対が識別可能なアンプリコンを生成することは重要である。

「アンプリコン」によって本明細書において意味されるのは、適切な重合条件下で目的のモチーフに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で検査試料中で行われる重合反応によって産生されるヌクレオチド断片である。このアンプリコンは、目的のモチーフと事実上同じヌクレオチド配列を有する（それを生成するために使用されたプライマーおよび目的の領域周辺の潜在的隣接領域からなるその末端を除く。）。

「識別可能」によって本明細書において意味されるのは、各アンプリコンを現在の核酸分離技術によって、例えば電気泳動（アガロースもしくはポリアクリルアミドゲルでの、場合によりキャピラリー）によってまたはクロマトグラフィーによって検出可能であるその客観的特徴に基づいて識別できることである。この特徴は、そのサイズ、標識などである。

したがって各ｎ−ＡＭＣは目的の各モチーフについて、
−サイズＴのアンプリコンを産生し、電気泳動の際に色Ｃで検出できるモチーフＡに特異的なプライマー対。このプライマー対は本明細書以下でモチーフＡに対するｎ−ＡＭＣの「基準」プライマー対と規定される。それは、好ましくはモチーフＡを検出するための先行技術のキットおよび方法において一般的に使用されるプライマー対である、ならびに
−基準対によって産生されたものから識別可能なアンプリコンを生成するモチーフＡに特異的な少なくとも１つの別のプライマー対。この別のプライマー対は本明細書以下で「修飾プライマー」対と称される、
を含む少なくとも２個のプライマー対を含有する。

好ましい実施形態では、これら２個のプライマー対によって生成されるアンプリコンはそれらのサイズ（少なくとも１塩基の差異）によって、またはそれらの標識によって、またはそれらのサイズおよびそれらの標識によって特徴付けられる。

さらにより好ましい実施形態では修飾プライマー対は、基準プライマーによって生成されるものと比較して１つ多いもしくは少ない塩基を含有するアンプリコンを生成するまたは基準プライマーによって生成されるアンプリコンによって担持されるものとは異なるシグナル（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’）によって検出可能であるアンプリコンを生成する。

本発明のキット
第一の態様では本発明は、ＰＣＲにおいて一般的に使用される試薬（ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなど）に加えて、上に規定のｎ−ＡＭＣを含有し、ここでｎは２以上である、ＰＣＲキットに関する。

より正確には本発明は、核酸において同定される目的の各モチーフについて前記モチーフに特異的な少なくとも２個のプライマー対を含有し、前記対は各モチーフについて少なくとも２つの識別可能なアンプリコンを生成する、ＰＣＲキットに関する。

このようにキャピラリー電気泳動の実施の際に、モチーフ検出情報における重複性を有する（具体的にはｎ＝２について）。デジタルドメインへの置き換えでは、重複性および訂正符号を有するコードに相当する（具体的にはｎ＞２について）。

実施形態により、核酸において同定される目的の各モチーフについて前記モチーフに特異的な少なくとも２個のプライマー対を含有し、前記対が各モチーフについて少なくとも２つの識別可能なアンプリコンを生成するように適合されている、ＰＣＲキット。好ましい実施形態では前記キットは、２−ＡＭＣ、すなわち検出される各モチーフに特異的な２個のプライマー対を含有し、前記対は検出される各モチーフについて２つの識別可能なアンプリコンを生成する。

好ましい実施形態では前記キットは、３−ＡＭＣ、すなわち検出される各モチーフに特異的な３個のプライマー対を含有し、前記対は検出される各モチーフについて３つの識別可能なアンプリコンを生成する。

好ましくは前記アンプリコンは、それらのサイズによってまたはそれらの標識によってまたはこれらの特徴の組合せによって識別可能である。

より好ましくは前記プライマー対は、そのサイズが少なくとも１塩基異なるアンプリコンを生成するおよび／または異なるように標識されたアンプリコンを生成する。

具体的にはそのサイズが１塩基対、２塩基対、３塩基対、実際に４塩基対、または任意の数の塩基対異なるアンプリコンを生成する修飾プライマー対を使用できる。

実施形態によりＰＣＲキットは、核酸において同定される目的のモチーフに特異的な少なくとも２個のプライマー対を含有し、前記プライマー対は前記モチーフについて、それらのサイズによって識別可能な少なくとも２つのアンプリコンを生成し前記サイズは１塩基対、２塩基対、３塩基対、または４塩基対異なる。

さらに、異なるように標識されたアンプリコンを生成する修飾プライマー対を使用できる。アンプリコンによって担持される「標識」は、放射性同位元素、酵素（具体的にはペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、発色化学化合物、発色、蛍光発生または発光化合物、ヌクレオチドに基づく類似物またはビオチンなどのリガンドまたは任意の他の同等の手段であってよい。使用される放射性同位元素の内、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈまたは^１２５Ｉは言及される。非放射性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン、色素などのリガンド、放射線発光（ｒａｄｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、化学発光、生物発光などの発光薬剤、蛍光またはリン光薬剤から選択される。好ましくはＰＣＲによって生成されたアンプリコンは、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンレッド、カルボキシ−Ｘローダミン（ＣＸＲ）、シアニン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはサイトｈｔｔｐ：／／ｆｒ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅに引用される任意の他のものなどのキャピラリー電気泳動によって検出可能な蛍光標識を担持する。Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ、２００９年に記載の標識、具体的には５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロフルオレセイン）、ＲＯＸ（ＣＸＲ；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、フルオレセイン、ＴＭＲ（ＴＡＭＲＡ；Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシローダミン、ＴＥＴ（４，７，２，７−テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセインまたはＨＥＸ（４，７，２，４，５，７−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）を使用できる。

このようなアンプリコンは、具体的なプライマー、例えば異なるサイズのプライマーまたは異なる標識を担持するプライマーを使用して得ることができる。

使用されるプライマーのサイズを直接調節することによってＰＣＲによって得られるアンプリコンのサイズを非常に正確に制御することは実際にできる。具体的には、基準プライマーと比較して塩基Ｘ個多くまたは少なく含有する修飾プライマーを使用してそのサイズが塩基対Ｘ個異なるアンプリコンを生成できる。より正確には、塩基約Ｘ個以内で同一である（基準プライマー対における同等のプライマーと比較して修飾プライマー対の１つのプライマーにおいて塩基Ｘ個多いまたは少ない）２個のプライマー対を使用して塩基対Ｘ個の差異を有する２つのアンプリコンを得ることができる。

好ましい実施形態では本発明のキットは、そのヌクレオチド配列が塩基約Ｘ個以内で基準プライマーのものと同一である修飾プライマーを含有する。好ましくはＸは１から１０の間の整数である。

目的の核酸上のそのハイブリダイゼーション領域が基準プライマーのものと比較して（塩基Ｘ個まで）シフトされているプライマーを使用して異なるサイズのアンプリコンを生成することもできる。好ましくはＸは１から１０の間の整数である。

さらに、それ自体が標識されているプライマーを使用してアンプリコンに付着された標識の性質を非常に正確に制御できる。より正確には、異なる標識（例えば異なる蛍光色素）を担持する２個のプライマー対を使用してそれらが担持する標識によって識別可能な２つのアンプリコンを得ることができる。

別の好ましい実施形態では、それにより本発明のキットは、少なくとも１つのプライマーが基準プライマーによって担持される標識とは異なる標識を担持する修飾プライマー対を含有する。

ｎ−ＡＭＣに加えて本発明のＰＣＲキットは、ＰＣＲを実行するために使用される任意の試薬、すなわち組換えＴａｑポリメラーゼ、反応媒体ｐＨを安定に保つための緩衝剤（典型的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２などを含有できる。核酸を増幅するための条件およびこの目的のために使用される試薬は、当業者に周知である。この課題についてＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；第３版、２００１年）などの分子生物学研究を参考にすることができる。

実施形態によりキットは、前記キットの各プライマーについて別個の容器を含有する。この実施形態では各プライマーはキット内の別個の容器に配置されている。

別の実施形態によりキットは、前記キットの各プライマー対について別個の容器を含有する。この実施形態ではキットの各プライマー対のプライマーは、各プライマー対について別個の容器中で２個ずつ予備混合される。

別の実施形態によりキットは、前記キットのすべてのプライマー対について単一の容器を含有する。この実施形態ではキットの各プライマー対のプライマーは単一の容器中で予備混合される。

「容器」によって本明細書において意味されるのは、レセプタクル（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）、チューブ、アンプル、シリンジ、カートリッジ、ビン、フラスコ、バイアル、箱、カプセル、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、ウェル、チャンバー、バッグ、小包またはパッチである。容器は、例えば栓、カプセル、シール、フィルムによって閉じられたまたは閉じられていない気密性または非気密性であってよい。

ｎ＝２について、本発明のキットは２−ＡＭＣを含有する。

この具体的な実施形態では本発明のキットは、標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、および
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、Ｔとは異なるサイズＴ’を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、
または
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、サイズＴを有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対
を含有する。

好ましくはアンプリコンのサイズＴ’は、１、２、３、実際に４塩基対（多いまたは少ない）、Ｔとは異なる。

Ｔ’がＴとは１塩基対異なるさらに具体的な場合に、本発明のキットは、
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、および
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）でまたはＭとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、サイズＴ±１塩基対のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対
を含有する。

この場合例えば、プライマーの１つが基準対の同等のプライマーと比較して１つ多いまたは少ない塩基を含有する修飾プライマー対を使用できる。

これらのパラメーターは、本発明のキットの信頼性を変化させないが、
・ 色ＣでのサイズＴ−１ｂｐがショルダー現象のため好ましくは回避される。
・ 色ＣでのサイズＴ−４ｂｐがスタッターリング現象のため好ましくは回避される。
・ Ｃとは異なる色でのサイズＴがプルアップ現象のため好ましくは回避される
ことは注目されるべきである。

この２−ＡＭＣに加えてこのＰＣＲキットは、ＰＣＲを実行するために使用される任意の試薬、すなわち組換えＴａｑポリメラーゼ、反応媒体ｐＨを安定に保つための緩衝剤（典型的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２などを含有できる。

ｎ＝３について、本発明のキットは３−ＡＭＣを含有する。

別の具体的な実施形態では本発明のキットは、３−ＡＭＣを含有する。これは、読み取り値誤差の数を限定しながら電気泳動図で読み取られる情報片の数を最大化できる。

この場合本発明のキットは、核酸において同定される目的の各モチーフについて、前記モチーフに特異的な３個のプライマー対を含有し、前記プライマー対はサイズおよび／または標識によって識別可能な３個のアンプリコンを生成する。

具体的な実施形態では本発明のキットは、標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、および
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、Ｔとは異なるサイズＴ’を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、サイズＴを有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、および
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、Ｔとは異なるサイズＴ’を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対
から選択される少なくとも２つのプライマー対を含有する。

好ましくはアンプリコンのサイズＴ’は、１、２、３、実際に４塩基対（多いまたは少ない）、Ｔとは異なる。

さらに具体的な場合ではＴ’がＴとは１塩基対異なる場合、本発明のキットは、標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、および
−サイズＴ±１塩基対を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、ここで、前記アプリコンは、標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識されている、
−サイズＴを有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、ここで、前記アプリコンは、Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識されている、および
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識されている、サイズＴ±１塩基対を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、ここで、前記アプリコンは、Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識されている、
から選択される少なくとも２個のプライマー対を含有する。

具体的には本発明のキットは、
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴのアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、サイズＴのアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、および
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ＋１塩基対のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、
を含有できる。

別の具体的な実施形態では本発明のキットは、
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴのアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、
−標識Ｍ（例えば色Ｃの蛍光色素）で標識され、サイズＴ＋１塩基対のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対、および
−Ｍとは異なる標識Ｍ’（例えば色Ｃとは異なる色Ｃ’の蛍光色素）で標識され、サイズＴ±１塩基対のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる修飾プライマー対
を含有できる。

この３−ＡＭＣに加えてこのＰＣＲキットは、ＰＣＲを実行するために使用される任意の試薬、すなわち組換えＴａｑポリメラーゼ、反応媒体ｐＨを安定に保つための緩衝剤（典型的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２などを含有できる。

本発明のキットを使用する目的のモチーフの検出
本発明の意味においてｎ−ＡＬＣは、２次元系でのｎ−ＡＭＣの検出の可視の結果である。より正確には、キャピラリー電気泳動の場合、アンプリコンに対して予測されるサイズＴの近傍に現れる電気泳動図上で検出されるｎ個のピークのセットである。各ｎ−ＡＬＣは、非常に高い確率で核酸試料中の目的のモチーフの存在（または非存在）を明らかにする。このｎ−ＡＬＣは、具体的にはどの対立遺伝子が検査した個体によって担持されているかを客観的に特徴付けられるようにする。

第二の態様では本発明は、本発明のキットを使用して得られたｎ−ＡＬＣから生物学的試料中の少なくとも１つの目的の核酸モチーフを検出するための方法に関する。必然的にこの方法は、目的の遺伝子座と同じ数のｎ−ＡＭＣを使用する必要があるようにする。

それにより本方法は、上に記載の本発明のキットを使用し、ここでｎ−ＡＭＣの数は、検出されるモチーフの数に調整される。

一実施形態では生物学的試料中の少なくとも１つの目的の核酸モチーフを検出するための方法は、上に定義のキットを使用することおよび前記モチーフについて、使用される前記モチーフの特異的プライマー対あたり少なくとも１つのアンプリコンが検出される場合に、前記目的の核酸モチーフが検出されることを特徴とする。

したがって、より正確には本発明は
ａ）核酸を含有する生物学的試料を得るステップ、
ｂ）生物学的試料を、上に記載のｎ−ＡＭＣのプライマー対および前記核酸を増幅するために必要とされる試薬に接触させるステップ、
ｃ）適切な条件下で前記核酸を増幅するステップ、
ｄ）得られたアンプリコンをそれらのサイズおよび／もしくはそれらの標識または２次元検出系によって検出するステップ、
ｅ）ステップｄ）で検出されたアンプリコンにより遺伝子プロファイルを作成するステップ
を含む。

「生物学的試料」によって本明細書において意味されるのは、核酸を含有すると考えられる任意の試料、具体的には細胞（動物、ヒト、植物、微生物など）を含有する試料である。好ましくは法科学での応用の内容においてそれは血液の試料、さらに具体的には個体（ヒトまたは動物）から非侵襲性のステップで採取された血清または血漿の試料である。唾液、精子、毛髪または尿の試料を使用できる。最終的には接触証拠（ｃｏｎｔａｃｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ）（例えば皮膚細胞）を使用できる。

採取された試料中の核酸の量が少なすぎる、または前記核酸が細胞に含有されている具体的な場合にステップｂ）の前に前記核酸の抽出および／または精製および／または濃縮のステップを加えることができる。それによりこの目的のために当業者に公知の任意の技術が使用され得る（Ｃｈｅｌｅｘ抽出、ＦＴＡ紙、シリカカラムまたは磁気ビーズを使用する固相抽出）。そのような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；第３版、２００１年）に記載されている。一般に本発明の方法は、少量のＤＮＡ（例えばＤＮＡ ０．１から０．５ｎｇ）を含有する試料に実施され得る。精製または濃縮のこのようなステップが実行される場合、ステップｂ）において使用される生物学的試料は精製されているおよび／または濃縮されているものであることは明らかである。

第２のステップの際にこの生物学的試料に適切な数のｎ−ＡＭＣ（検出されるモチーフと同じ数のｎ−ＡＭＣ）および予測されるアンプリコンを生成するために不可欠である試薬（組換えＴａｑポリメラーゼ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ_２など）が加えられる。

次に本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が当業者によって通常使用される条件下で実行される増幅のステップｃ）を含有する（Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ．ら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ、２００９年）。従来のＰＣＲへのいくつかの代替技術は、このステップにおいても使用され得る。これらの技術は、例えば鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベース増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）またはＱ−ベータ複製酵素増幅である。一般に、このステップにおいて標的核酸の増幅を生じる任意の技術を使用できる。当業者は、予測されるアンプリコンを生成するために本発明のｎ−ＡＭＣに加えてどの試薬が反応媒体において必要とされているかも同定できる。

この増幅ステップに続いて産生されたアンプリコンは２次元検出系（例えばサイズ／色）によって検出される。好ましくはこの検出系は、電気泳動またはクロマトグラフィーである。より好ましくは検出系はキャピラリー電気泳動である。

最終的に標識アンプリコンに対応するシグナルは、試料中の目的のモチーフの存在または非存在を決めるために分析される。

この分析ステップは、例えばシグナル（またはｎ個のピークのセットまたはｎ−ＡＬＣ）を認識でき、それらを表現型に帰属できる（下に記載の分析の２つの方法の１つによる）ソフトウェアを使用して好ましくは自動的に行われる。

本発明は、本発明の方法によって得られたシグナル／ｎ個のピークのセット／ｎ−ＡＬＣを分析するためおよびそれにより目的のモチーフの存在を決めるための２つの異なる方法を提案する。

分析の第１の方法（いわゆる「辞書的」方法）：
この分析の第１の方法は、目的の各モチーフについて分析の前に、使用したｎ−ＡＭＣを使用して理論的に検出できるすべてのｎ−ＡＬＣの「辞書的」または「一覧」リストを構築するまたは得ることを必要とする。

言い換えると、選択された各ｎ−ＡＭＣについて予測されるすべてのシグナル組合せのリストを収集するまたは取得することは望ましい。ｎ−ＡＬＣのこのリストは、有効な対立遺伝子の辞書を構成する。それは、例えば市販のキット（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘなど）において典型的に提供されるリストから作られる。これらの組合せは、この選択が目的のモチーフの存在下対その非存在下で予測されるアンプリコンのサイズおよび各型のアンプリコンについて予測される標識を決定することから、一度基準プライマーおよび修飾プライマーが選ばれると、目的の各モチーフについて容易に同定可能である。

例えば、米国の規制によって必要とされる４２５個の可能性がある対立遺伝子を検出するために、前記辞書は４２５個のｎ−ＡＬＣを列挙する。さらに、欧州および米国の規制によって必要とされる５５２個の可能性がある対立遺伝子を検出するために、前記辞書は５５２個のｎ−ＡＬＣを列挙する。

試料中に実際に存在するモチーフのリストを得るために、試料の各ｎ−ＡＬＣについて検出されたｎ個のピークのすべての組合せは、次いでこれらのモチーフについて予測されたｎ−ＡＬＣ（すなわちリスト中で予め収集されたもの）と比較される。ｎ−ＡＬＣのこのリストは、有効な対立遺伝子の辞書を構成する。

この方法によって有効なｎ−ＡＬＣを得る確率は、１−Ｘ／Ｃ^ｎ _Ｒであり、式中Ｘは検出されたモチーフの数であり、Ｒは検出可能な異なるサイズの数（すべての色の組合せ）であり、ｎは各モチーフについて使用されるプライマー対の数である。

各色チャネルが（ｂｐにおいて）可能な限り多いピークの鎖サイズを産生できることから、５色のチャネル（ＧｌｏｂａｌＦｉｌｅｒによって提案されているものなど）を含有する従来の系において、電気泳動図上で検出され得るピークの数が１８５０であることが算出され得る。

それによりこのような系についてＲ＝１８５０、それによりＣ^ｎ _１８５０ ｎ−ＡＬＣを作成できる。すべてがアナログシグナルとして電気泳動図上に存在する同一の確率を有し、それによりｎ−ＡＬＣが有効な／予測される確率は１−４２５／Ｃ^ｎ _１８５０（米国系）または１−５５２／Ｃ^ｎ _１８５０（米国および欧州系）である。３−ＡＭＣが使用される場合、検出された組合せが有効なｎ−ＡＬＣである確率は１−（４２５／Ｃ^３ _１８５０）＝１−４．０３４×１０^−７もしくは９９．９９９９６％（米国系）または１−（５５２／Ｃ^３ _１８５０）もしくは９９．９９９９５％（米国および欧州系）である。

この「辞書的」に基づく方法で、同定されたそれぞれの有効な組合せは、目的のモチーフが検査した試料中に存在したことを確実に結論付けられるようにする。要約すると、前記目的の核酸モチーフを検出するために、各ｎ−ＡＬＣについての試料中で検出されたｎ個のピークのすべての組合せを予め収集したリストに含まれる予測されるｎ−ＡＬＣと比較する方法が本明細書において提案される。

好ましい実施形態では本発明のキットは、上に規定の要素に加えて、試料中の予測されるすべてのｎ−ＡＬＣを記載しており、検出されたｎ−ＡＬＣがどのモチーフに対応するかを同定できるようにする文書（上に記載の「一覧」または「辞書的」）を含む。

分析の第２の方法（いわゆる「モチーフ」方法）：
上に記載の分析の第１の方法はその構造が予測される（例えば、「辞書的」に列挙されているＳＴＲ内の所与の数の反復）目的のモチーフの存在を検出できるようにする。しかし、「辞書的」が天然に存在するすべてのモチーフについて網羅的ではありえないことから、検出されたモチーフが列挙されたもののいずれにも対応しない状況が存在する場合がある。

具体的にはこの第１の方法は、個体に特異的であり、結果として「辞書的」に列挙されないモチーフの実在を同定できるようにしない（例えば稀なミクロ変異）。

これらの稀なモチーフを検出することは、法科学において現在使用されている方法での課題である。実際に、それらが真にミクロ変異であるのかまたは検出されたシグナルがあまり移動しなかったピークに実際には対応するのかを知ることは時には困難である。

この点を改善するために本発明は、ｎ−ＡＭＣを使用して本発明の方法によって得られたｎ−ＡＬＣを分析するための第２の方法を、具体的には試料内の稀なモチーフの存在を検出する目的で提案する。

この第２の方法は、ｎ個のピークの各セットが特異的ｎ−ＡＬＣを形成する事実に基づいている。検出されたそれぞれの有効なｎ−ＡＬＣは、探索される目的のモチーフに対応する（例えば、上に記載の３−ＡＭＣについて、ｎ−ＡＬＣは：色ＣでのサイズＴ、色ＣでのサイズＴ＋１および色Ｃ−１でのサイズＴ−１であり得る）。

一般に、この「モチーフ」方法で有効なｎ−ＡＬＣを得る確率は１−（（１／Ｒ）^＊（１／Ｒ−１）^＊（…）^＊（１／Ｒ−（ｎ−１）））であり、Ｒは検出可能な異なるサイズの数（すべての色の組合せ）であり、ｎは各モチーフについて使用されるプライマー対の数である。

電気泳動図上に１８５０個の可能性があるピークを含有する系について、検出された組合せが有効なｎ−ＡＬＣに対応する確率は１−（１^＊（１／１８４９）^＊（１／１８４８））＝９９．９９９９７％である。

したがってこの第２の方法では目的のモチーフの存在は、確実に同定され得る。目的のモチーフのサイズを測定することも可能である。

要約すると、前記目的の核酸モチーフを検出するために、
ａ）検査される試料中のすべての有効なｎ−ＡＬＣを検出するステップ
ｂ）探索される目的のモチーフに有効な各ｎ−ＡＬＣを帰属させるステップ
が実行される方法が本明細書で提案される。

分析のこれら２つの方法のいずれかの使用は、人為産物に関連するピークが有効なｎ−ＡＬＣを形成せず、それにより目的のモチーフと混同される可能性がない有利点を有する。そのためそれぞれの検出された有効なｎ−ＡＬＣ（すなわち、ｎ−ＡＭＣによって生成された各シグナル組合せ）は、目的のモチーフが試料中に存在する（「辞書的」方法）またはこのモチーフの変種が試料中に存在する（「モチーフ」方法）ことを結論できるようにする。

分析の２つの方法が組み合わされ、連続的にまたは同時に実行されてよいことは注目されるべきである。

さらにそれらは自動的に実行され得る。

さらに一般に本発明の方法は、遺伝子プロファイルを検出するステップおよび作成するステップ、ｄ）およびｅ）、ならびに必要に応じて増幅するステップおよび接触させるステップが自動的に実行されることを特徴とする。

好ましい実施形態では本発明のキットは、ｎ＞２でｎ−ＡＭＣを含有する。実際にこの場合各ｎ−ＡＬＣは、ノイズからわずかにしか識別可能でなくても目的のモチーフを検出するための「エラー訂正コード」として作用するコードの一部を有する。

ｎ＞２の場合、実際にｎ−１個の要素（「ｎ−１個のＡＬＣ」）の固有の組合せを含有するｎ−ＡＬＣを作ることができ、予測されるｎ−ＡＬＣのリスト中に見出すことができる。

分析の「辞書的」方法では、ｎ−ＡＬＣ（および対応する目的のモチーフ）を同定するためにｎ−ＡＬＣのｎ−１個の要素を有すれば十分である。情報の有効な一片を有する確率は、１−（Ｘ／Ｃ^ｎ−１ _Ｒ）であり、式中Ｘは検出される目的のモチーフの数であり、Ｒは検出可能なさまざまなサイズの数（すべての色の組合せ）であり、ｎは各モチーフについて使用されるプライマー対の数である。電気泳動図上に１８５０個の可能性があるピークを含有する系について、訂正された組合せ（訂正コードを介して）が妥当である確率は、米国系について１−（４２５／Ｃ^２ _１８５０）＝１−２．４８５×１０^−４＝９９．９７５２％であり、米国および欧州系については１−（５５２／Ｃ^２ _１８５０）＝９９．９６７７％である。

分析の「モチーフ」法では、情報の有効な一片を有する確率は、１−（（１／Ｒ）^＊（１／Ｒ−１）^＊（…）^＊（１／Ｒ−（ｎ−２）））であり、式中、Ｒは検出可能なさまざまなサイズの数（すべての色の組合せ）であり、ｎは各モチーフについて使用されるプライマー対の数である。電気泳動図上に１８５０個の可能性があるピークを含有する系について、訂正された組合せが（訂正コードを介して）妥当である確率は、１−（１^＊（１／１８４９））または９９．９４６％である。

本発明の方法によって得られたシグナルの分析の際にシグナル対雑音分離は、典型的には１０σ閾値およびピーク形状検出で実行される。しかしこれらの方法は、読み取られた情報の現実性の客観的確率を作成できるようにしない。１０σ閾値は作成できるが、ノイズ分布は、電気泳動図上で周知の法則（正規分布）に従わない。さらにピーク形状検出は、ピークが持つはずである形状の記載および経験的観察に基づいている。

本発明の内容では偽ｎ−ＡＬＣを得ることの低確率を考慮して、実際に行われたものを大きく下回るような分析されたシグナルの選択を行うことができる（１０σ閾値およびピーク形状検出）。具体的には、３σ閾値は、現在の方法よりも多い情報を作成しながら、本発明の方法の内容でノイズからシグナルを分離するために十分である。実際に１０σよりも３σ閾値がｎ−ＡＬＣが妥当である確率と比較してノイズの実質的な許容を提供する。

３σ閾値に関して、ｎ−ＡＬＣを読み取る前に、エコーキャンセルフィルターを電気泳動図シグナルに使用することは好ましい。探索されたエコーはスタッターおよびショルダー現象に対応する。エコーキャンセル法はシグナル処理（電話技術、ネットワーク通信など）に関連する当業者に公知である。使用される方法は最も単純である：エコーパラメーターは：ショルダーのために−１ｂｐでのエコー、スタッターのために−４ｂｐのエコーに固定される。ピークよりもｎ−ＡＬＣでの頻度多様性を探索することも可能である（ノイズは比較的一定の頻度を有し、核酸の長さとともに減少する。）。これは、検出されたポリヌクレオチドが大きい場合に特に好ましい。

ピークおよび頻度多様性についての探索は組合せで実行され得る。

本発明の方法によって得られたシグナルの分析の際に、ｎ−ＡＬＣの一部が（完全にまたは部分的に）他のｎ−ＡＬＣによって覆われる場合が存在する。本発明の方法が見出されたｎ個のピークのすべての組合せ／モチーフを考慮することを必要とすることからこれは問題ではない。有効なｎ−ＡＬＣだけが上に示した関連する確率に保持される。

Claims (12)

1. 核酸において同定される目的のモチーフに特異的な少なくとも２個のプライマー対を含有し、前記プライマー対が、前記モチーフについて、サイズによって識別可能な少なくとも２個のアンプリコンを生成し、前記サイズは、１塩基対、２塩基対、３塩基対または４塩基対異なる、ＰＣＲキット。
2. 前記プライマー対が、各モチーフについて、異なる標識を担持するアンプリコンを生成するように適合されていることを特徴とする、請求項１に記載のＰＣＲキット。
3. −標識Ｍで標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅するために適合されている基準プライマー対、および
   −Ｍとは異なる標識Ｍ’で標識され、１、２、３または４塩基対多いまたは少ない、Ｔとは異なるサイズＴ’のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅するために適合されている修飾プライマー対
   を含有する、請求項１または２に記載のキット。
4. 核酸において同定される目的の各モチーフについて、前記モチーフに特異的な３個のプライマー対を含有し、前記プライマー対はサイズおよび／または標識によって識別可能な少なくとも３個のアンプリコンを生成するように適合されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のキット。
5. 標識Ｍで標識され、サイズＴ（塩基対Ｔ個）のアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅できる基準プライマー対、および少なくとも２個の他のプライマー対を含有するキットであって、前記少なくとも２個の他のプライマー対が、
   −１、２、３または４塩基対多いまたは少ない、Ｔとは異なるサイズＴ’を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅するために適合されている修飾プライマー対、ここで、前記アンプリコンは、標識Ｍで標識されている、
   −サイズＴを有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅するために適合されている修飾プライマー対、ここで、前記アンプリコンは、Ｍとは異なる標識Ｍ’で標識されている、および
   −１、２、３または４塩基対多いまたは少ない、Ｔとは異なるサイズＴ’を有するアンプリコンを産生する、モチーフＡを特異的に増幅するために適合されている修飾プライマー対、ここで、前記アンプリコンは、Ｍとは異なる標識Ｍ’で標識されている、
   から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のキット。
6. 生物学的試料中の少なくとも１つの目的の核酸モチーフを検出する方法であって、請求項１から５のいずれか一項に記載のキットを使用し、前記モチーフについて前記モチーフに特異的な使用されたプライマー対あたり少なくとも１つのアンプリコンが検出される場合に前記目的の核酸モチーフが検出されることを特徴とする方法。
7. ａ）核酸を含有する生物学的試料を得るステップ、
   ｂ）生物学的試料を、請求項１から５のいずれか一項に記載のプライマー対および前記核酸を増幅するために必要とされる試薬に接触させるステップ、
   ｃ）適切な条件下で前記核酸を増幅するステップ、
   ｄ）得られたアンプリコンをそれらのサイズおよび／またはそれらの標識によって検出するステップ、
   ｅ）ステップｄ）において検出されたアンプリコンにより遺伝子プロファイルを作成するステップ
   を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記アンプリコンがキャピラリー電気泳動によって検出される、請求項６または７に記載の方法。
9. 前記目的のモチーフがＳＴＲである、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記目的の核酸モチーフを検出するために、得られたｎ個のピークの各セットについて試料中で検出されたｎ個のピークのすべての組合せが、事前に収集されたリストに含有されるｎ個のピークの予測されるセットと比較される、請求項６に記載の方法。
11. 前記目的の核酸モチーフを検出するために、
    ａ）検査した試料中のｎ個のピークのすべての有効なセットを検出するステップ、
    ｂ）ｎ個のピークの有効な各セットを、探索される目的のモチーフに帰属させるステップ
    が実行される、請求項６に記載の方法単独または請求項１０と組合せた請求項６に記載の方法。
12. 遺伝子プロファイルを検出するステップおよび作成するステップ、ｄ）およびｅ）、ならびに必要に応じて増幅するステップおよび接触させるステップが自動的に実行される、請求項７に記載の方法単独または請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法と組合せた請求項７に記載の方法。

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