BR112013005046B1 - Métodos de diagnóstico in vitro - Google Patents

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Abstract

método para quantificar ácidos nucleicos livres de célula, método para calcular um índice de fragmentação, método para determinar o índice de integridade, método para a detecção qualitativa e quantitativa da presença de um polimorfismo genético, método para a análise de ácidos nucleicos livres de célula, métodos para identifica r fluido corporal, método para identificar ou analisar fluido corporal e métodos de diagnóstico a presente invenção refere-se a um método in vitro de detecção de ácidos nucleicos livres de célula, preferencialmente o dna livre de célula (cfdna) em uma amostra de fluido corporal a partir de um indivíduo ou paciente, em que o método compreende a etapa de determinação de maneira precisa e sensível a concentração de ácido nucleico livre de célula na amostra e/ou a determinação da concentração ou quantidade d o dito ácido nucleico livre de célula de um determinada faixa de tamanho e/ou o índice de integridade ou proporção da fração de tamanho (sfr) do dito ácido nucleico livre de célula e/ou a determinação da presença de polimorfismos genéticos (tal como um polimorfismo de nucleotídeo único (snps) ou mutações). a invenção abrange também um método para discriminar fluidos corporais de indivíduos onde os cfdnas são altamente liberados pela comparação do perfil de tamanho obtido por pelo menos uma das três faixas de tamanho de cfdna. a invenção também abrange um método para a análise de ácidos nucleicos livres de célula em indivíduos para o diagnóstico, prognóstico ou avaliação da evolução de um estado fisiológico, tal como a progressão de um tumor ou câncer metastático, ou para monitorar a eficácia de um tratamento contra o câncer em um paciente ou para fins teragnósticos realizando a análise desses biomarcadores.

Description

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO IN VITRO
[001] A presente invenção é direcionada a um método in vitro de detecção de ácidos nucleicos livres de célula, preferencialmente o DNA livre de célula (cfDNA) em uma amostra de fluido corporal a partir de um indivíduo ou paciente, em que o método compreende a etapa de determinação de maneira precisa e sensível a concentração de ácido nucleico livre de célula na amostra e/ou a determinação da concentração ou quantidade do dito ácido nucleico livre de célula de uma determinada faixa de tamanho e/ou índice de integridade ou proporção da fração de tamanho (SFR) do dito ácido nucleico livre de célula e/ou a determinação da presença de polimorfismos genéticos (tal como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNPs) ou mutações). A invenção abrange também um método para discriminar fluidos corporais individuais onde cfDNAs são altamente liberados pela comparação do perfil de tamanho obtido por pelo menos uma das três faixas de tamanho de cfDNA. A invenção também abrange um método para a análise de ácidos nucleicos livres de célula em indivíduos para o diagnóstico, prognóstico ou avaliação da evolução de um estado fisiológico, tal como a progressão de um tumor ou câncer metastático, ou para monitorar a eficácia de um tratamento contra o câncer em um paciente ou para fins teragnósticos realizando a análise desses biomarcadores.
[002] Nos próximos anos, a detecção de ácido nucleico livre de célula (cf - cell free), tal como o DNA circulante (cirDNA ou “ctDNA”), pode se tornar uma tecnologia inovadora não invasiva que permite o diagnóstico de um estado patológico ou fisiológico específico, o prognóstico e acompanhamento do câncer, a escolha da orientação terapêutica para cada paciente e o rastreio em massa como um complemento para os testes existentes. Os ácidos nucleicos livres de célula foram propostos como biomarcadores para diversas doenças (câncer, diabetes, doença falciforme, doenças autoimunes, infarto do miocárdio, esclerose múltipla, ...), e bem como para as condições fisiológicas específicas, tais como (exercício físico intenso, hemodiálise, gravidez), ou algumas condições clínicas (trauma, queimadura solar, sepse, ...).
[003] Existem duas formas previamente descritas na literatura de utilização de ácidos nucleicos livres de célula como biomarcadores: a primeira é pela medição da sua concentração e a segunda, estudando sua sequência nucleotídica.
[004] Os ácidos nucleicos extracelulares ou livres de células (DNA ou RNA), têm sido detectados em muitos fluidos biológicos, tais como o sangue, urina, fezes, leite, lavagem brônquica e ascite. Acredita-se que o cfDNA encontrado em outros fluidos corporais pode ser originado principalmente a partir de ácidos nucleicos circulantes. A maior parte do estudo sobre ácidos nucleicos livres de célula foi realizada pela detecção e quantificação de DNA circulante (DNA no sangue).
[005] O DNA circulante (DNA no sangue, cirDNA) foi inicialmente encontrado em amostras de plasma por Mandel e Metais (1) e um tempo depois, foi caracterizado em amostras de plasma de pacientes com câncer por Stroun et al (2). O progresso técnico que permitiu a detecção- e quantificação-específica de RNAs ou DNAs tornou possível o diagnóstico e o seguimento de doenças. Os cirDNAs carregam as alterações genéticas relacionadas com o desenvolvimento de algumas doenças (incluindo o câncer) e, portanto, por mais de dez anos eles têm sido considerados como potenciais marcadores diagnósticos não invasivos de diferentes estados fisiológicos (teste pré-natal, etc...) ou patológicos (câncer , etc...).
[006] A detecção de alterações genéticas no cirDNA parece ser uma abordagem diagnóstica particularmente atrativa (3-5) mas que no momento é limitada a abordagens invasivas dispendiosas e demoradas, tal como o sequenciamento de DNA a partir de cortes de tumor. Como os genes mutantes não são apenas marcadores do câncer, mas são também, pelo menos parcialmente, causadores do crescimento tumoral, eles apresentam vantagens em razão aos marcadores convencionais não invasivos, tais como sangue fecal ou PSA no soro. Particularmente, marcadores convencionais não estão envolvidos de uma forma patogênica no processo da tumorigênese e são menos específicos para a neoplasia do que as mutações. A análise genética de cirDNA nas amostras de sangue será fácil de ser posta em prática e pode potencialmente detectar diferentes tipos de cânceres de forma precoce e muito sensível. O câncer colorretal continua a ser um grave problema de saúde pública que ainda não foi resolvido. Apenas um rastreio precoce dos pacientes em risco (idade, hereditariedade, estilo de vida e doenças inflamatórias crônicas do cólon são os principais fatores de risco citados) permanece uma das formas mais seguras de se prevenir esta doença (6, 7). Por isso, na França, assim como na maioria dos países industrializados, a busca da melhor estratégia de rastreio em massa do câncer colorretal é uma prioridade de saúde pública. Apenas um teste é usado atualmente para o rastreamento em massa do câncer colorretal em indivíduos com mais de 50 anos: o teste Hemoccult II®. No entanto, o Hemoccult II® parece ser de baixa sensibilidade e exibe uma importante taxa de falsos positivos e falsos negativos. Um teste de segunda linha é a colonoscopia, que mostra uma sensibilidade e especificidade muito alta e uma baixa taxa, mas significativa, de falsos negativos. Entretanto, este teste é invasivo e pode conduzir a complicações graves (hemorragia 1/300, perfuração 1/800).
[007] Sabe-se que os níveis de DNA livre de célula no plasma de pacientes com câncer colorretal (CRC) são significativamente mais elevados em razão a um paciente saudável, e estes níveis diminuem progressivamente no período de acompanhamento nos pacientes livres de tumor, e aumentam nos pacientes com recidiva ou metástase (22). Assim o paciente com CRC representa um modelo útil de condições fisiológicas ou patológicas que resultam ou conduzem a uma grande liberação de DNA livre de célula.
[008] Os mecanismos de liberação de cfDNA são muito pouco compreendidos, mas foi sugerido que a necrose, apoptose, fagocitose ou a liberação ativa podem estar implicadas. O desenvolvimento tumoral está associado com a necrose de certas partes do tumor, como também de tecidos adjacentes, não tumorais. Por outro lado, os mecanismos de defesa do corpo conduzem à destruição de células cancerosas, pela fagocitose ou apoptose. No que diz respeito ao cirDNA, foi estabelecido que a necrose e fagocitose levam a degradação do DNA para tamanhos inferiores raramente menores que 1000 pares de base (pb) (5, 7, 9). No caso da apoptose a região entre os nucleossomos pode ser degradada e isto conduz à liberação de DNA na circulação com tamanho de 180-200 pb (o tamanho de um nucleossomo mais o ligante) ou múltiplos destes (7).
[009] Muitos estudos foram iniciados a fim de identificar formas anormais de DNA no plasma ou soro (4, 7). No momento, existem resultados contraditórios, apesar de taxas de detecção do câncer muito elevadas terem sido relatadas. Esses estudos, apesar de promissores, levantaram muitas questões sobre a confiança (ou: a confiabilidade) da utilização de cirDNA anormal como um biomarcador do câncer (4, 7). Particularmente, é imperativo desenvolver tecnologias que possam detectar o número (quantidade) de DNA mutante e a detecção específica de mutação(ões) na mesma amostra. No caso do câncer colorretal, muitas mutações foram identificadas e atualmente é possível definir a sequência de aparecimento de tais mutações, de fato, parece que o gene APC, em seguida o KRAS (e BRAF), em seguida o p53 são, entre outros, os alvos de mutações que conduzem a transformação do epitélio normal para o adenoma, e em seguida para a displasia e finalmente para o carcinoma metastático (8-11). É inegável pensar que esta abordagem será no futuro um método diagnóstico eficiente. Entretanto, no momento, os testes para a detecção de mutação(ões) gênicas não são suficientemente específicos para o uso diagnóstico, teragnóstico ou prognóstico. Atualmente, não há nenhum teste específico ou análise específica desenvolvida para a detecção de ácido nucleico livre de células, tal como o cirDNA. A tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (Q-PCR) é o método de escolha para a detecção e quantificação de variações ou mutações genéticas. Os SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) estão entre as mutações mais frequentes, eles podem permitir a discriminação de sujeitos (pacientes) e podem ser responsáveis pela progressão do tumor em muitos cânceres. Eles correspondem à alteração de um único nucleotídeo, tornando assim difícil a discriminação entre a sequência que carrega a mutação pontual e a sequência não mutada. Consequentemente, a sua detecção, e principalmente a sua quantificação, por Q-PCR são de baixa especificidade e sensibilidade.
[010] As terapias atuais contra o câncer estão focadas na doença do paciente ao invés de estarem direcionadas para os pacientes individuais. No entanto, as diferenças interindividuais na disposição de drogas ou farmocinéticos levaram a heterogeneidade na resposta do paciente à quimioterapia do câncer tradicional. Continua existindo assim uma necessidade de métodos teragnósticos capazes de tornar as terapias para o câncer mais precisas, eficazes e seguras para pacientes individuais. Além disso, a detecção de mutações ou marcador (tag) genético específico (por exemplo, polimorfismos) pode ajudar a avaliar a resposta individual de diversas terapias, tal como a terapia com anticorpos, terapia citostática ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo.
[011] O perfil de tamanho do cirDNA preciso foi constatado em apenas duas publicações:
[012] -A equipe de D. Lo é uma das duas melhores equipes de liderança neste campo e que analisou a distribuição de tamanho de DNA materno e fetal no plasma materno pelo uso da Q-PCR e desenvolvimento de um conjunto de primers para a amplificação da sequência de 105 a 798 pb (16). Eles sugeriram que "a maior parte das moléculas de cirDNA estavam no faixa de 145 a 201 pb” (que é aproximadamente o tamanho da nucleossomo). Em razão a isto, esses autores não estudaram ou não discutiram sobre a possibilidade da existência de cirDNA com tamanho inferior a 105 pb.
[013] -o perfil de tamanho do CirDNA foi estudado muito recentemente (Janeiro de 2010) utilizando um método de alta performance: a espectroscopia de molécula única microfluídica (20). Apesar da forma e perfil de tamanho do cirDNA extraído do soro de pacientes com câncer de pulmão nos estágios I e IV ser um pouco semelhante aos nossos resultados, eles concluíram que "o maior poder de distinção ocorreu em um limite de 800 pb”. Em razão a isto, os autores nunca mencionaram ou discutiram sobre ctDNAs de tamanhos inferiores a 320, argumentando que "abaixo 320 pb as duas curvas parecem semelhantes”.
[014] Antes desta invenção, não havia evidencias suficientes de que o amplicon de tamanho < 100 pb é melhor comparado ao que era convencionalmente estabelecido. Desde que foi previamente demonstrado que as moléculas de cirDNA de comprimentos mais curtos deveriam teoricamente ser > 180 pb (tamanho de um nucleossomo) e uma vez que a eficiência da PCR é convencionalmente (com o uso de DNA genômico) ótima quando é feita a amplificação de uma sequência na faixa de tamanho de 150-300 pb, todos os relatórios previamente descritos demonstraram a utilização da detecção do amplicon de cerca de 150 pb de tamanho quando era feita a análise de cfDNA. A Q-PCR foi muitas vezes utilizada no estudo de ácidos nucleicos livres de célula na literatura. O conjunto de primers desenhado foi principalmente definido sobre a eficiência destes na amplificação de uma região de ácidos nucleicos alvo, e por vezes, coincidiu com o fato de que alguns relatórios sugeriram uma alta proporção de mononucleosoma em ácidos nucleicos livres de célula (amplificação da região de ácidos nucleicos na faixa de tamanho de 100-180 pb em comparação com os 150-300 pb convencionalmente usados, tal como, pela análise do DNA genômico). Entre a vasta literatura apenas um par de relatórios descreveu a utilização da detecção de fragmentos amplificados < 100 pb, mas se basearam apenas nos aspectos técnicos ligados ao desenho de primers e/ou região do gene alvo específica, mas nunca com o pressuposto de que o aumento da proporção de cirDNA com tamanho <100 pb estava presente em uma condição fisiológica ou patologia específica.
[015] Por exemplo, Ellinger et al (BJU International, 2009, V.104, 5, 48-52) utilizaram um sistema de primer para PCR que amplificava uma região de 79 pb e 230 pb do ctDNA mitocondrial com a finalidade de determinar um índice de integridade pela comparação da quantificação usando o sistema de PCR para a amplificação da região DNA de um tamanho menor e maior do que o tamanho de um mononucleossomo (180-200 pb). Eles indicam que o par de primer de 79 pb amplificou um fragmento de 79 pb que corresponde ao mtDNA total e inclui o DNA truncado pela apoptose.
[016] De modo semelhante, o mesmo grupo (Ellinger et al, 2009, V.181, 1, 363-371) quantificou um amplicon ATBC de 106, um 193 e um 384 pb a partir de extratos de ctDNA e obtiveram níveis de DNA similares usando o conjunto de primer ACTB-106 e -193.
[017] Board et al (Annals of the New York academy of Sciences, 2008, 98-107) quantificaram por Q-PCR um amplicon de 272 e um 512 pb a partir de extratos de ctDNA com o mesmo propósito de Ellinger et al. Koide et al (Prenatal Diagnosis, 2005, V.25, 604-607) quantificaram um amplicon de 63, um 107, um 137, um 193, um 313, um 392 e um 524 pb do gene SYR de DNA fetal circulante livre de célula no plasma materno para estudar a degradação a partir do armazenamento e congelação, examinando adicionalmente a fragmentação do dito ctDNA.
[018] O DNA é uma cadeia de nucleotídeos e a modificação ou alteração de um ou mais nucleotídeos (polimorfismos genéticos) na sequência de um gene pode alterar a mensagem do gene e levar a uma proteína modificada ou inativa. As mutações genéticas são a causa ou o fator de risco de diversas patologias e a detecção destas mutações parece ser cada vez mais uma maneira eficiente de diagnosticar, acompanhar e orientar melhor a escolha terapêutica para um paciente. A tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (Q-PCR) é o método de escolha para a detecção e quantificação de mutações genéticas. As mutações pontuais (polimorfismos de nucleotídeo único - single nucleotide polymorphisms (SNPs)) correspondem à alteração de um único nucleotídeo em um dos dois alelos e, mais raramente, em ambos os alelos. Isto, entre outras razões (inerente a não especificidade da tecnologia Q-PCR), leva a uma baixa especificidade da Q-PCR para discriminar as sequências com mutações pontuais das sequências não mutantes que são chamadas de "tipo selvagem” (WT). Por outro lado, a detecção de mutações pontuais somáticas (que não interessam as células reprodutivas, gametas, e, portanto, não são hereditárias) deve ser muito sensível particularmente no caso do DNA circulante uma vez que foi estabelecido que apenas 0,1-10% do DNA circulante de um indivíduo com câncer carrega a mutação (7). É por esta razão que muitas modificações da tecnologia de Q-PCR foram descritas, tal como ARMS-PCR, TaqMAMA e FLAG-PCR. Estas tecnologias requerem o uso de bases modificadas, enzimas específicas ou procedimentos adicionais além dos reagentes.
[019] Atualmente, não há nenhum teste específico ou análise desenvolvida para a detecção de ácidos nucleicos livres de célula, e particularmente para a detecção de mutações tal com mutações associadas com a patologia do câncer, ou com a resistência ao tratamento do câncer.
[020] Em particular, existe a necessidade de fornece um método para a detecção de mutações genéticas, tal como mutações no gene KRAS, utilizando uma amostra de sangue. De fato, o câncer colorretal é uma das principais causas de câncer e comum causa de morte por câncer na Europa. Neste câncer, a terapia-alvo tem aparecido nos últimos anos com anticorpos para o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), mas vários estudos têm mostrado que o benefício destes anticorpos se limita apenas aos pacientes com gene KRAS tipo selvagem. Estes achados representam uma etapa importante no campo da medicina personalizada pelo método teragnóstico que pode determinar o tratamento ideal para cada paciente, a fim de evitar o excesso de tratamento com medicamentos que têm efeitos adversos potencialmente tóxicos, mas com poucos benefícios.
[021] A detecção de ácidos nucleicos livres de célula tem sido um tema frequente na literatura há mais de 10 anos. Entretanto, em parte devido à origem clínica das amostras analisadas, a origem e forma de ácidos nucleicos livres de célula foram pouco estudadas de maneira sistemática.
[022] Os autores demonstraram que o tamanho do fragmento nucleico é de importância crucial na análise do ácido nucleico livre de celular e em particular quando é determinada a sua concentração. Eles revelaram que a detecção específica de mutações pela medição da concentração cfDNA é possível em uma etapa pela comparação da concentração determinada objetivando um fragmento mutado curto (<100 pb) e um fragmento não mutado de tamanho semelhante, quando ambos os fragmentos são <100 pb e de tamanhos semelhantes (+/- 10%).
[023] Este modo de identificação da presença ou não de uma mutação genética é muito conveniente uma vez que é muito rápido e não muito dispendioso. Além disso, permite dispensar técnicas sofisticadas como o sequenciamento. Por outro lado, a sequenciamento leva a uma resposta sem possíveis dúvidas (mas por erros de contaminação ou de manutenção).
[024] O DNA livre de célula em um paciente com câncer é constituído de DNA do tumor e DNA que não é de origem tumoral. Muito pouco se sabe sobre a contribuição respectiva desses dois tipos de DNA livre de célula durante a progressão tumoral. O IntPlex deve permitir avançar nesta questão e essa informação irá trazer benefícios valiosos de diagnóstico e/ou prognóstico. De fato, a quantidade de DNA mutado, e, portanto DNA do tumor, pode ser ligada por meio deste método diretamente à quantidade de DNA não tumoral. O cálculo desta percentagem pode ser correlacionado tanto com a quantidade total de cirDNA liberado e com a progressão ou regressão do tumor.
[025] O índice de integridade do cirDNA tem sido associado com a concentração de mononucleossomos (180-200 pb), ou seja, para estimar da taxa de apoptose. Muito poucos trabalhos descreveram como calcular o índice de integridade e, geralmente, isso é feito de uma maneira não muito rigorosa. Isto conduziu a resultados contraditórios sobre o estudo de suas alterações durante a progressão tumoral (13-19). Além disso, o termo integridade parece ser inadequado quando se leva em consideração o fato de que muito pouco ou nenhum DNA genômico circula no sangue. Se os dados dos trabalhos anteriormente citados são contraditórias e confusos sobre o uso clínico do índice de integridade é porque eles não levaram em conta a possibilidade de que uma grande proporção de cirDNA é < 100 pb.
[026] Os presentes inventores, pela primeira vez, demonstraram a presença de uma proporção mais elevada de cirDNA com um tamanho < 100 pb que está diretamente correlacionada com o aumento da concentração de cirDNA, particularmente em amostras provenientes de pacientes com câncer. Os inventores mensuraram o índice de integridade medindo a concentração de cfDNA com a detecção de dois fragmentos amplificados: um curto de < 100 pb e um longo variando de 250-400 pb. Eles demonstraram que isto permitiu uma discriminação mais específica e sensível entre cirDNAs de indivíduos saudáveis e de pacientes com câncer. Em seguida, a identificação de algumas patologias (tal como câncer) ou estado fisiológico específico (como esforço intenso) pode ser conseguida pelos meios descobertos na presente invenção. Isto nunca foi observado ou previsto anteriormente.
[027] Ao concentrar-se particularmente no estudo do tamanho dos ácidos nucleicos livres de célula, com o objetivo de otimizar a sua medição e, especialmente, a especificidade e sensibilidade de detecção por Q-PCR, os inventores desenvolveram, por meio de novas maneiras ou métodos exemplares, primeiramente a quantificação de ácidos nucleicos livres de célula na amostra de fluido corporal, e em segundo lugar, a análise de polimorfismos genéticos, tal como a mutação dos genes KRAS e BRAF, nos ácidos nucleicos livres de célula. Em terceiro lugar, os inventores desenvolveram um teste integrado que combina a estimativa da taxa de fragmentação de ácidos nucleicos livres de célula (também denominado de "índice de integridade” ou "taxa de apoptose” na presente descrição) como um terceiro biomarcador. Tal detecção/quantificação de ácidos nucleicos livres de célula pode ser uma tecnologia inovadora para os próximos anos como um teste não invasivo que permite o diagnóstico, teragnóstico, prognóstico e acompanhamento de uma doença, e o rastreio em massa como um complemento para testes atualmente disponíveis.
[028] Os Exemplos abaixo apoiam fortemente o interesse da medição de tais ácidos nucleicos livres de célula por métodos da presente invenção como uma ferramenta inovadora em várias investigações pré-clínicas e clínicas.
[029] Os inventores propõem na presente invenção utilizar a técnica de PCR quantitativa em um procedimento analítico de "etapa única” que é específico para a análise de ácidos nucleicos livres de célula e conduz a um método simples, robusto e altamente sensível e seletivo de detecção/quantificação, que é compatível com um procedimento padronizado e que pode ser explorado industrialmente. Era conhecido anteriormente que os ácidos nucleicos livres de célula são altamente fragmentados para tamanhos inferiores a 180 pb, que correspondem geralmente ao comprimento das sequências amplificadas pelos primers que normalmente são escolhidos quando é otimamente usada a PCR (entre 100 e 300 pb). Assim, diferentemente da análise do DNA genômico em que a concentração de DNA quantificado é diretamente proporcional ao número de cópias amplificadas (do genoma), a quantidade de DNA circulante determinada pelo Q-PCR não é proporcional ao número de cópias. O nosso método leva em consideração a especificidade do tamanho e forma do DNA circulante. Isto permite a comparação exata e direta da concentração de duas sequências diferentes e também o cálculo da percentagem de uma sequência em razão à outra. Por meio da determinação do perfil de tamanho de ácidos nucleicos livres de célula presentes na amostra de fluido corporal, os inventores demonstraram que é possível discriminar os indivíduos saudáveis dos indivíduos que apresentam níveis elevados de cfDNA.
[030] Surpreendentemente, os inventores demonstraram pelo uso de um método de Q-PCR de etapa única, que é possível determinar simultaneamente três importantes biomarcadores para o seguimento e tratamento do câncer: (1) a quantidade específica de ácidos nucleicos livres de célula, (2) a presença de um polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou uma mutação), e (3) a taxa de apoptose (também denominada de "índice de integridade” ou "taxa de fragmentação”).
[031] O método da presente invenção exibe em particular as seguintes vantagens:
  • - A diminuição significativa do tempo necessário para a análise, particularmente em comparação com a análise de uma biópsia de tumor (sem necessidade de intervenção do serviço anatomopatológico, ...).
  • - Facilita a coleta de amostras e a manipulação da amostra biológica.
  • - Permite a análise não invasiva de tumores não acessíveis.
  • - Adiciona dois parâmetros clínicos não negligenciáveis, ou seja, a quantidade de ácidos nucleicos livres de célula e a taxa de apoptose (índice de fragmentação ou índice de integridade), cujo valor parece estar diretamente relacionado com o crescimento do tumor.
[032] O campo de aplicação da presente invenção diz respeito a todas as utilizações da detecção de ácidos nucleicos livres de célula, tais como, mas não se limitando a:
  • - Análise de genes parentais,
  • - Análise de gene com importância clínica (patologias como o câncer, ...),
  • - Teragnóstico, uma estratégia de tratamento que permite orientar a terapia em função de um marcador diagnóstico (ou seja, o estado mutacional de um ou diversos genes);
  • - Análise de origens étnicas,
  • -Determinação do sexo pelo cirDNA fetal,
  • -Evolução de um determinado estado fisiológico.
[033] Conforme discutido acima, há numerosas discrepâncias sobre o padrão de tamanho do ctDNA na literatura, conforme mencionado anteriormente em Ellinger et al. Os poucos relatos recentes que estudam ctDNA e descrevem que ctDNA se encontra principalmente em tamanho reduzido, sempre indicam que o menor tamanho é de aproximadamente o tamanho de mononucleossomos. Isto baseia-se em diversas e numerosas análises de gel de eletroforese que mostram claramente uma intensa banda próxima de 180 pb e uma inferior próxima de 360 pb e, por vezes, uma mancha de maior tamanho, enquanto que abaixo de 180 pb absolutamente nenhuma banda aparece.
[034] Nossos dados sobre o padrão de tamanho do ctDNA conforme apresentado na descrição da invenção discorda claramente dessa conclusão. Estando confiantes com a nossa conclusão demonstramos no Exemplo 8 que uma quantidade significativa de DNA com tamanho abaixo de 180 pb está presente no gel.
[035] Consequentemente, e tal como demonstrado pelos exemplos a seguir, principalmente o ctDNA pode ser de um tamanho inferior a 180 pb, e, em particular, inferior a 100 pb. De acordo com a presente invenção, os inventores propõem:
  • -determinar a quantidade ou concentração de ctDNA de tamanho inferior a 100 pb como um parâmetro essencial de análise de ctDNA;
  • - comparar quantidade de ctDNA a partir da fração compreendendo ctDNA de tamanho inferior a 100 pb, com a fração de tamanho entre 150 a 400 pb, ou fração de tamanho maior do que 300 ou 400 pb.
[036] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação da concentração ou quantidade do dito ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito ácido nucleico está em uma faixa de tamanho de ácido nucleico com um comprimento inferior a 100 pb.
[037] A expressão "cerca de” significa no presente ± 10% do valor definido.
[038] Em um exemplo de realização preferido, o método da presente invenção é realizado para determinar a concentração/quantidade de ácido nucleico livre de célula de tamanho inferior a 100 pb.
[039] Em um exemplo de realização preferido, a etapa c) é realizada pela aplicação do método de PCR, e em que a quantidade/concentração de ácido nucleico livre de célula de tamanho < 100 pb é determinada pelo uso de um conjunto de primers que amplifica uma região de DNA < 100 pb, e preferencialmente < 80 pb.
[040] Em um exemplo de realização preferido, na etapa c) a quantidade/concentração de frações de tamanho de ácidos nucleicos livre de célula < 100 pb é determinada pelo cálculo da diferença daqueles determinados pelo emprego de dois conjuntos de pares de primers para a detecção de amplicons de diferentes tamanhos, sendo um dos dois ou ambos < 100 pb.
[041] Em outro aspecto, a presente invenção está direcionada a um método para o cálculo de um índice de fragmentação de ácido nucleico livre de célula pela comparação da concentração/quantidade de frações de tamanho obtidas por um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em um fluido corporal de acordo com a invenção.
[042] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção é direcionada a um método para a determinação do perfil de tamanho específico de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação do perfil de tamanho específico do dito ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal pela:
-determinação, pelo menos, da concentração ou quantidade de ácidos nucleicos curtos com um comprimento inferior a 100 pb,
preferencialmente compreendido entre 40 e 99 pb, e
-determinação, pelo menos, da concentração ou quantidade de ácidos nucleicos longos com um comprimento superior a 100 pb,
preferencialmente compreendido entre 145 pb e 450 pb;
ou uma fração (razão) de cfDNA de uma faixa de tamanho específico.
[043] Por "determinação de uma fração (razão) de cfDNA de uma faixa de tamanho específico”, pretende-se designar a determinação da razão entre a concentração ou quantidade de ácidos nucleicos livres de célula possuindo, por exemplo, um comprimento inferior a 100 pb, preferencialmente entre 40 e 99 pb, e a concentração ou quantidade de ácidos nucleicos livres de célula possuindo um comprimento superior a 100 pb, preferencialmente entre 145 pb e 450 pb, ou a razão inversa.
[044] Mais preferivelmente, dito ácido nucleico livre de célula que se deseja quantificar pelo método da presente invenção é um ácido nucleico livre de célula do autossoma (ou derivado do autossoma).
[045] Por ácido nucleico livre de célula do autossoma, pretende-se designar o ácido nucleico livre de célula que não é proveniente ou derivado de cromossomos sexuais.
[046] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção é direcionada a um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação da concentração ou quantidade do dito ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal pela:
-determinação da concentração ou quantidade de ácidos nucleicos curtos com um comprimento inferior a 100 pb, preferencialmente compreendido entre 40 e 99 pb, e/ou, preferencialmente, e
-determinação da concentração ou quantidade de um ácido nucleico longo possuindo um comprimento compreendido entre 145 pb e 450 pb.
[047] Os inventores demonstraram que o perfil de tamanho do ácido nucleico livre de célula ("cf NA”) é específico quando o cf NA, particularmente o DNA circulante ("ct DNA”) é liberado em um nível mais elevado do que o nível normal, estando em uma proporção mais elevada nos comprimentos inferiores a 100 pb e, em proporção muito mais baixa nas faixas de comprimento de 250-400 pb, e estas características fazem parte da presente invenção.
[048] Em um exemplo de realização preferido, dito ácido nucleico livre de células é selecionado entre o grupo que consiste em DNA livre de célula, (cfDNA), RNA livre de célula, e siRNA livre de célula ou miRNA livre de célula.
[049] Na presente invenção, a expressão "taxa de apoptose”, "índice de fragmentação do DNA” e "índice de integridade” tem o mesmo significado; sendo o nível de fragmentação do DNA inverso ao índice do nível de integridade.
[050] Em um exemplo de realização preferido do método da presente invenção, ditos ácidos nucleicos livres de célula são ácidos nucleicos circulantes.
[051] Quando a presente invenção é direcionada a um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal de acordo com a presente invenção, dito método compreende duas etapas:
c)i) a determinação da concentração ou quantidade de ácido nucleico curto que tem um comprimento inferior a 100 pb, preferencialmente compreendido entre 40 e 99 pb; e c) ii), a determinação da concentração ou quantidade de ácido nucleico longo possuindo um comprimento compreendido entre 145 pb e 450 pb; e é preferível que dito ácido nucleico livre de célula longo compreenda parcial ou totalmente dito ácido nucleico livre de célula curto.
[052] Em outro aspecto, a invenção abrange um método para determinar o índice de integridade ou de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de flÍndice de Integridade do DNA (DII)/Proporção da Fração Tamanho (SFR)
uido corporal, em que dito método compreende:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação do índice de integridade do ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito índice de integridade é calculado como a razão da concentração ou quantidade de ácido nucleico livre de célula com uma faixa de tamanho "longo” e da concentração ou quantidade de ácido nucleico livre de célula com uma faixa de tamanho "curto”, sendo as ditas concentrações determinadas pelo método de quantificação de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal de acordo com a presente invenção,

em que dito ácido nucleico com faixa de tamanho curto tem um comprimento inferior a 100 pb, e em que dito ácido nucleico com faixa de tamanho do longo está compreendido entre 180 pb e 450 pb. ÍNDICE DE INTEGRIDADE DO DNA (DII)/PROPORÇÃO DA FRAÇÃO TAMANHO (SFR)
[053] De acordo com a presente invenção, os inventores desejam fornecer um novo cálculo do índice de integridade do DNA que pela primeira vez leva em consideração a quantidade de ctDNA com tamanho inferior a 100 pb. Os inventores querem também proporcionar, pela primeira vez o cálculo da Proporção da Fração de Tamanho do DNA (SFR), que inclui ainda em seu cálculo a razão entre a quantidade de ctDNA que possui uma faixa de tamanho específico, por exemplo, entre 200 e 450 e a quantidade de ctDNA de tamanho entre 60 pb e 100 pb ou 43 e 100 pb. O índice de integridade (correspondendo à quantidade de ácido nucleico livre de célula maior do que um comprimento longo pela quantidade de ácido nucleico livre de célula maior do que um comprimento mais curto) e a SFR (correspondendo à razão das duas frações de tamanho) são, ambos, índices de fragmentação de ácidos nucleicos.
[054] Assim, o cálculo do índice de integridade pode ser feito determinando a razão da quantidade de ctDNA de tamanho maior ou menor do que um tamanho específico, ou tamanho compreendido em uma faixa específica, pela quantidade de ctDNA de tamanho maior ou menor do que um outro tamanho específico, ou tamanho compreendido em uma outra faixa específica; ou pela quantidade de ctDNA total. Por exemplo, pela determinação da razão entre a quantidade de ctDNA de tamanho maior que 180-200 pb e a quantidade de ctDNA inferior a 100 pb.
[055] Pela determinação da razão de quantidades determinadas usando a detecção de um amplicon de 300 pb e de 60 pb, pode-se explicar esta noção de que o valor obtido corresponde à % da quantidade de ctDNA maior do que 300 pb a partir da quantidade de ctDNA maior que 60 pb.
[056] Na presente invenção, por "índice de integridade do DNA” (DII) pretende-se designar o novo cálculo do índice de integridade do DNA que leva em consideração a quantidade de ctDNA com tamanho inferior a 100 pb.
[057] Nos exemplos 11 A 15 abaixo, os inventores determinaram este novo cálculo do índice de integridade do DNA ou Proporção da Fração de Tamanho (SFR) do DNA pelo cálculo da razão da quantidade de ctDNA com tamanho superior a 200 e quantidade de ctDNA com tamanho entre 60 pb e 100 pb ou 43 e 100 pb. Este novo cálculo que determina a quantidade de ctDNA com o menor tamanho possível inferior que 100 pb permite realizar estimativas mais precisas do nível de fragmentação do ctDNA, que é mais preciso, especialmente para a distinção de pacientes com câncer e indivíduos saudáveis utilizando o plasma.
[058] Este novo cálculo do índice de integridade do DNA ou Proporção da Fração de Tamanho (SFR) do DNA pode ser realizado na presente invenção por um método que não utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como a eletroforese de zona capilar, eletroforese de zona capilar ou espectroscopia de massa baseadas em chip; ou por um método de execução que utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR) tal com a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (Q-PCR).
[059] Quando a PCR, tal como a Q-PCR, é implementada, a detecção de um amplicon possuindo X pb corresponde de fato, quantificar todos os fragmentos de ctDNA possuindo um tamanho superior ou igual a X pb.
[060] Do mesmo modo, quando a PCR, tal como a Q-PCR, é implementada, a detecção de um amplicon possuindo X pb corresponde de fato a quantificação de todos os fragmentos de ctDNA possuindo um tamanho superior ou igual a X pb.
[061] Quando a Q-PCR é implementada, a detecção de um amplicon com um tamanho inferior a 100 pb corresponde de fato, quantificar os fragmentos ctDNA que possuem um tamanho superior ou igual a este tamanho. Consequentemente, estes produtos da amplificação (amplicons) possuindo um tamanho inferior a 100 pb devem ser considerados na quantificação do ctDNA total.
[062] Por exemplo, quando a Q-PCR é implementada, a detecção de um amplicon possuindo um tamanho igual a 60 pb corresponde, de fato, quantificar os fragmentos ctDNA possuindo um tamanho superior ou igual a 60 pb, correspondente à concentração/quantificação máxima de ctDNA.
[063] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para a determinação da dita Proporção da Fração de Tamanho de DNA (SFR), do ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo dito método:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação da Proporção da Fração de Tamanho (SFR) do ácido nucleico livre de célula,

em que dita SFR é calculada como a razão da quantidade de ctDNA possuindo um tamanho específico ou a faixa de tamanho específica e quantidade de ctDNA possuindo outra faixa de tamanho específica ou tamanhos específicos.
[064] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para a determinação do novo cálculo do índice de integridade do DNA (DII) mencionado ou da Proporção da Fração de Tamanho (SFR) do ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo dito método:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação do DII ou da Proporção da Fração de Tamanho (SFR) do ácido nucleico livre de célula,

em que dito DII ou a SFR é calculado como a razão entre a quantidade de ctDNA com tamanho superior a 200 pb e a quantidade de ctDNA que está entre 60 pb e 100 pb ou entre 43 pb e 100 pb, ou entre 60-145 pb.
[065] Em um exemplo de realização preferido do método para a determinação do índice de integridade de ácido nucleico livre de células ou SFR em uma amostra de fluido do corporal da presente invenção, dito ácido nucleico livre de célula com faixa de tamanho longo compreende total, ou parcialmente, dito ácido nucleico livre de célula com faixa de tamanho curto.
[066] Em um exemplo de realização preferido do método para a determinação do índice de integridade ou SFR da presente invenção, dito faixa de tamanho longo está compreendido entre 250 pb e 350 pb, e dito faixa de tamanho curto está compreendido entre 50 pb e 99 pb.
[067] Em um exemplo de realização preferido do método da presente invenção, a concentração de ácido nucleico livre de célula ou o índice de integridade ou SFR de ácido nucleico livre de célula é determinado por um método que não emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como a eletroforese de zona capilar, eletroforese de zona capilar baseada em chip ou espectroscopia de massa.
[068] Tais métodos são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto (vide, por exemplo, “Comparisons between capillary zone electrophoresis and real-time PCR for quantification of circulating DNA levels in human sera”, Fuming Sang et al., Journal of Chromatography B Volume 838, fascículo 2, de 11 de julho de 2006, páginas 122-128; “Prenatal diagnosis of -thalassemia by chip-based capillary electrophoresis”, Hua Hu et al, Prenatal Diagnosis, Volume 28 fascículo 3, páginas 222-229, 2008).
[069] Em um exemplo de realização mais preferido do método da presente invenção, a concentração de ácido nucleico livre de célula ou o índice de integridade ou a SFR de ácido nucleico livre de célula é determinado por um método que emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR).
[070] Neste exemplo de realização mais preferido, o método de PCR é escolhido entre o grupo consistindo da reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (Q-PCR).
[071] Os métodos de PCR ou Q-PCR são métodos-padrão bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.
[072] Entre os métodos específicos de PCR ou Q-PCR, os métodos de "PCR alelo-específico”, de "Q-PCR alelo-específico” ou de "Q-PCR alelo-específico utilizando oligonucleotídeos bloqueadores” podem ser particularmente mencionados.
[073] Assim, quando a concentração de ácido nucleico livre de célula é determinada por um método que emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR), a presente invenção também é direcionada a um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) - a determinação da concentração do fragmento curto amplificado a partir do ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito fragmento curto de ácido nucleico tem um comprimento inferior a 100 pb, preferencialmente compreendido entre 40 e 99 pb, e/ou

-a determinação da concentração ou quantidade do fragmento longo amplificado a partir do ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito fragmento longo de ácido nucleico tem um comprimento superior ou igual a 100 pb, preferencialmente compreendido entre 145 e 450 pb, e/ou
[074] Em um exemplo de realização preferido, dita etapa c) é uma etapa de: c) determinação da quantidade de ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, subtraindo-se o valor resultante da amplificação de um fragmento > 100 pb de um fragmento que é < 100 pb, preferencialmente, subtraindo o valor resultante da amplificação de um fragmento com uma faixa de tamanho entre 100-145 pb pelo valor resultante da amplificação de um fragmento com uma faixa de tamanho entre 60-99 pb.
[075] Mais preferivelmente, dito fragmento curto amplificado a partir do ácido nucleico livre de célula tem um comprimento compreendido entre 55 e 65 pb, cerca de 60 pb (sendo mais preferido 60 pb ± 6 pb).
[076] Quando a presente invenção é direcionada a um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal de acordo com a presente invenção pelo uso de um método de reação em cadeia da polimerase (PCR), dito método compreende duas etapas: c) i) a de determinação da concentração ou quantidade do fragmento curto amplificado; e c) ii), a de determinação da concentração ou quantidade do fragmento longo amplificado, e prefere-se que dito fragmento longo amplificado compreenda parcial ou totalmente o fragmento curto.
[077] Em um aspecto idêntico, quando o índice de integridade ou a SFR do ácido nucleico livre de célula é determinado por um método que emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR), a presente invenção também é direcionada a um método para determinar o índice de integridade de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, compreendendo dito método:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) a determinação do índice de integridade ou a SFR do ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito índice de integridade ou a SFR é calculado como a razão entre a concentração do fragmento longo amplificado e o fragmento curto amplificado a partir do dito ácido nucleico livre de célula, em que dito fragmento curto tem um comprimento inferior a 100 pb, e em que dito fragmento longo amplificado compreende entre 180 pb e 450 pb.
[078] Em um exemplo de realização preferido do método para a determinação do índice de integridade ou a SFR da presente invenção que emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR), dito fragmento longo amplificado está compreendido entre 250 pb e 350 pb, e dito fragmento curto amplificado está compreendido entre 50 pb e 99 pb.
[079] Em um exemplo de realização preferido do método de acordo com a presente invenção para a determinação do índice de integridade ou SFR de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, dito fragmento longo amplificado compreende parcial ou totalmente o fragmento curto.
[080] Em um exemplo de realização mais preferido do método para a determinação do índice de integridade ou da SFR da invenção, dito fragmento longo amplificado compreende totalmente ou parcialmente dito fragmento curto.
[081] Em outro aspecto, a presente invenção abrange um método para a detecção de um polimorfismo genético, tal como uma mutação ou SNP, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) a identificação de um sujeito de interesse;
  • b) a obtenção de um fluido corporal do dito sujeito;
  • c) determinação da concentração do fragmento curto amplificado a partir do ácido nucleico livre de célula na dita amostra de fluido corporal, em que dito fragmento curto de ácido nucleico livre de célula que é amplificado contém dito polimorfismo genético a ser detectado, e em que dito fragmento curto de ácido amplificado tem um comprimento inferior de 100 pb, preferencialmente um comprimento compreendido entre 40 e 99 pb. Mais preferivelmente, dito fragmento curto amplificado contendo dito polimorfismo genético a ser detectado tem um comprimento compreendido entre 55 e 65 pb, e mais preferivelmente cerca de 60 pb.
[082] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção é direcionada a um método para a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético em um ácido nucleico livre de célula, compreendendo dito método as etapas de: a) determinação da concentração ou quantidade de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal; b) determinar a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético, integrando os seguintes parâmetros e etapas:
  • -A1A2 por um lado e B1B2 por outro; são representações de duas sequências curtas;
  • -dado que o comprimento da sequência A1A2 e B1B2 varia entre 50 a 100 pb, e que elas são diferentes no comprimento em +/- 20%;
  • - quer A1A2 ou B1B2 compreendendo o polimorfismo genético;
  • - e considerando CB1B2 e CA1A2, respectivamente, a concentração inicial mensurada de ácido nucleico extraído correspondente à detecção do fragmento curto B1B2, e do fragmento curto A1A2, respectivamente,

i) calculando a % CB1B2/CA1A2, onde B1B2 é definido como a sequência contendo o polimorfismo genético; ou
ii) calculando a % CA1A2/CB1B2; onde A1A2 é definido como a sequência contendo o polimorfismo genético, e opcionalmente, a determinação de que a % CB1B2/CA1A2 ou % CA1A2/CB1B2 é maior do que um limiar específico é significativa da detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético.
[083] Preferencialmente, na etapa ii), a % dos mesmos é a detecção quantitativa de fragmentos de ácido nucleico livre de célula mutado.
[084] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção é direcionada a um método para a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético em um ácido nucleico livre de célula, compreendendo dito método as etapas de:
  • a)determinação da concentração ou quantidade de ácidos nucleicos livres de célula em uma amostra de fluido corporal por um método de quantificação de ácidos nucleicos livres de célula de acordo com a presente invenção e em que a concentração ou a quantidade de ácidos nucleicos livres de célula é determinada por um método que emprega a PCR;
  • b)determinação da detecção quantitativa da presença do polimorfismo genético, pela integração dos seguintes parâmetros e das seguintes etapas:

-A1A2 em uma mão e B1B2 na outra mão são representações de duas sequências curtas amplificadas;
-dado que o comprimento da sequência A1A2 e B1B2 varia entre 50 a 100 pb, e que elas são diferentes no comprimento em +/- 20%;
- quer A1A2 ou B1B2 compreendendo o polimorfismo genético;
-e considerando CB1B2 e CA1A2, respectivamente, a concentração inicial mensurada de ácido nucleico extraído correspondente à detecção do fragmento curto amplificado B1B2, e do fragmento curto amplificado A1A2, respectivamente,
i) calculando a % CB1B2/CA1A2, onde B1B2 é definido como a sequência amplicon contendo o polimorfismo genético; ou
ii) calculando a % CA1A2/CB1B2, onde A1A2 é definido como a sequência amplicon contendo o polimorfismo genético,
opcionalmente, a determinação que % CB1B2/CA1A2 ou % CA1A2/CB1B2 é maior do que um limiar específico é significativa da detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético.
[085] Preferencialmente, na etapa ii), a % dos mesmos é a detecção quantitativa de fragmentos de ácido nucleico livre de célula mutado.
[086] Em um exemplo de realização preferido, o limiar de positividade é determinado para cada mutação utilizando um número conveniente de amostras conhecidas, mais preferivelmente o limiar de positividade é de pelo menos 2%, 5%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12,5%, 15%.
[087] Também faz parte da presente invenção um método para a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético em um ácido nucleico livre de célula de acordo com a invenção; e em que o ácido nucleico correspondente com o polimorfismo genético de interesse na fita codificante está localizado na extremidade 3’ do primer começando na posição B1 ou A2, e em que o método que emprega a PCR é uma PCR alelo-específica.
[088] Em um exemplo de realização preferido, dito polimorfismo genético a ser detectado é um polimorfismo genético herdado ou um polimorfismo genético somático.
[089] Por polimorfismos genéticos, pretende-se designar particularmente, mas não se limitar a:
  • -polimorfismos genéticos capazes de discriminar um indivíduo ou população étnica,
  • -polimorfismos genéticos na região não codificante que impactam uma função biológica,
  • -polimorfismos genéticos devido a modificação pós-transcricional, tal como a edição de RNA; ou
  • -polimorfismos genéticos na região codificante, tal como uma mutação que implica a modificação da sequência de proteína.
[090] Entre esses polimorfismos genéticos, os polimorfismos genéticos preferidos são de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo do polimorfismo genético associado a uma patologia ou um estado fisiológico, ou polimorfismos genéticos específicos em ácido nucleico, particularmente exônico, intrônico ou nas regiões não codificantes da sequência de ácido nucleico.
[091] É também abrangido pela presente invenção, um método que preferencialmente emprega a PCR, em particular a Q-PCR, para a detecção do polimorfismo genético no dito ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal; para a determinação do índice de integridade ou SFR do ácido nucleico livre de célula, em que dito método compreendendo as etapas de:
  • -Aplicação do método para a detecção de um polimorfismo genético de acordo com a presente invenção, no dito ácido nucleico livre de célula, e
  • -Aplicação do método de acordo com a presente invenção para a determinação do índice de integridade do dito ácido nucleico livre de célula.
[092] Em um exemplo de realização preferido, dito método compreende a etapa de implementação do método da invenção para determinar o índice de integridade ou a SFR do ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, em que no dito método:
  • -dito fragmento longo amplificado compreende um fragmento curto não mutado e o fragmento curto mutado contendo dito polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou uma mutação) a ser detectado; e
  • - dito fragmento longo amplificado compreende entre 250 pb e 350 pb e dito fragmento curto amplificado é inferior a 100 pb e preferencialmente compreende entre 50 pb e 99 pb.
[093] Mais preferivelmente, dito fragmento amplificado mutado e não mutado têm um comprimento compreendido entre 55 e 65 pb, sendo mais preferido cerca de 60 pb.
[094] Mais especificamente, no método para a determinação do Índice de Integridade ou da SFR do ácido nucleio livre de célula em uma amostra de fluido corporal, dito fragmento longo amplificado compreende parcialmente ou totalmente dois fragmentos curtos, em que um dos fragmentos curtos amplificados contém um polimorfismo genético.
[095] Pela expressão de "compreendendo parcialmente um fragmento” pretende-se designar na presente invenção que o fragmento longo contém pelo menos 10 pb consecutivos, mais preferivelmente 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 pb consecutivos do fragmento curto referenciado.
[096] Em um exemplo de realização também preferido do método da presente invenção, a concentração do dito fragmento de ácido nucleico livre de célula do dito nucleico livre de célula é calculado para um fragmento de ácido nucleico livre de célula mutado e/ou um fragmento de ácido nucleico livre de célula não mutado.
[097] Por fragmento mutado e fragmento não mutado, pretende-se designar na presente invenção um fragmento que exibe e não exibe, respectivamente, o polimorfismo genético que se desejada detectar pelo método da presente invenção.
[098] Em um exemplo de realização preferido do método dito da presente invenção acima, a razão entre a concentração de fragmentos longos e fragmentos curtos é calculada para os fragmentos curtos mutados e/ou de fragmentos curtos não mutados.
[099] Em um exemplo de realização particular, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de determinação da concentração de fragmentos de ácido nucleico livre de célula que apresentam um polimorfismo genético específico, ditos fragmentos exibindo o polimorfismo genético com um comprimento definido e em que dita concentração é comparada com a concentração de fragmentos não mutados, e ditos fragmentos não mutados possuem aproximadamente o mesmo comprimento dos fragmentos mutados, preferencialmente o comprimento dos fragmentos amplificados mutados ou não mutados podem ser semelhantes em + ou - 20%.
[0100] Em um exemplo de realização preferido do método para a detecção de um polimorfismo genético específico da presente invenção, dito método compreende adicionalmente:
  • -uma etapa de determinação da concentração do fragmento não mutado e fragmento mutado no extrato de ácido nucleico livre de célula, e
  • -o cálculo da percentagem da quantidade de fragmentos curtos mutados em razão aos fragmentos curtos não mutados obtidos ou não, sendo o sujeito considerado como possuindo dito polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou mutação) se dita percentagem calculada é maior do que um valor limiar associado ao dito polimorfismo genético.
[0101] Quando o método implementa a PCR, particularmente a Q-PCR, para a detecção do polimorfismo genético no dito ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal, em um exemplo de realização ainda preferido do método da presente invenção, a concentração do dito fragmento amplificado do dito nucleico livre de célula é calculada para um fragmento mutado amplificado e/ou um fragmento não mutado amplificado.
[0102] Por fragmento mutado e fragmento não mutado, pretende-se designar na presente invenção um fragmento que exibe e não exibe, respectivamente, o polimorfismo genético que se desejada detectar pelo método da presente invenção.
[0103] Em um exemplo de realização preferido do método dito acima da presente invenção acima, a razão entre a concentração do fragmento longo amplificado e o fragmento curto amplificado é calculada para o fragmento curto mutado amplificado e/ou fragmento curto não mutado amplificado.
[0104] Em um exemplo de realização particular, o método da presente invenção compreende ainda uma etapa de determinação da concentração de um fragmento amplificado de ácido nucleico livre de célula que apresenta um polimorfismo genético específico, em que dito fragmento amplificado exibindo o polimorfismo genético tem um comprimento definido; e em que dita concentração é comparada com a concentração de fragmento amplificado não mutado, e dito fragmento não mutado possui aproximadamente o mesmo comprimento do fragmento mutado, preferencialmente o comprimento dos fragmentos amplificados mutados ou não mutados podem ser semelhantes em + ou - 20%.
[0105] Em um exemplo de realização também preferido do método para a detecção de um polimorfismo genético específico da presente invenção implementando a PCR, dito método compreende adicionalmente:
  • -uma etapa de determinação da concentração do fragmento amplificado não mutado e fragmento amplificado mutado no extrato de ácido nucleico livre de célula, e
  • -o cálculo da percentagem da quantidade de fragmento curto mutado amplificado em razão ao fragmento curto não mutado amplificado obtido ou não, sendo o sujeito considerado como possuindo dito polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou mutação) se dita percentagem calculada é maior do que um valor limiar associado ao dito polimorfismo genético.
[0106] Em outro aspecto particularmente preferido, a presente invenção é direcionada a um método para a análise de ácidos nucleicos livres de célula, particularmente DNA circulante, em um indivíduo, compreendendo dito método as etapas de:
  • a) quantificação do dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a invenção pela aplicação de um método de reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (Q-PCR); e
  • b) determinação do índice de integridade do dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a invenção através de um método que emprega a Q-PCR, e
  • c) detecção da presença do polimorfismo genético no dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a invenção por um método que emprega a Q-PCR.
[0107] Em um exemplo de realização preferido, dito ácido nucleico é um ácido nucleico que carrega alterações genéticas associadas a tumores.
[0108] Os ácidos nucleicos mais preferidos são selecionados a partir do grupo consistindo:
  • -dos genes da família RAS, preferencialmente KRAS ou NRAS, carregando alterações genéticas associadas a tumores, preferencialmente alterações genéticas associadas a CRC, e
  • - do gene BRAF.
[0109] A expressão "amostra de fluido corporal” pretende e preferencialmente designa os fluidos corporais selecionados a partir do grupo que consiste em sangue total, soro, plasma, urina, fuidos da expectoração, efluente colônico, efluente da medula óssea, linfa, fluido cerebrospinal, fluido lacrimal, suor, leite, fezes, lavagens brônquicas e ascite.
[0110] Em um exemplo de realização preferido, a amostra de fluido corporal é uma amostra de sangue selecionada a partir do grupo que consiste em plasma e soro.
[0111] Em um exemplo de realização preferido do método da presente invenção, dito ácido nucleico livre de célula é selecionado a partir do grupo de ácidos nucleicos livres de célula endógenos ou exógenos, e particularmente o ácido nucleico livre de célula é selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos nucleicos livres de célula obtidos a partir de vírus, bactérias, fungos, feto ou xenoenxertos.
[0112] Entre os ácidos nucleicos livres de célula endógenos a partir de um sujeito de interesse, é preferível que dito sujeito de interesse seja um indivíduo que sofre de, ou que tenha risco de desenvolver uma doença ou exibe um estado ou condição fisiológica.
[0113] Em um exemplo de realização preferido, dita doença é um câncer, mais preferencialmente, mas não se limitando a; um câncer selecionado a partir do grupo de câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer da tiroide, câncer de pâncreas, câncer do fígado ou câncer hematopoiético.
[0114] Em um exemplo de realização igualmente preferido, dito câncer é um câncer metastático.
[0115] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma) a partir de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluidos corporais por um método da presente invenção, do cfDNA com tamanho na faixa de 50-100 pb e tamanho superior a 101 pb;
  • b) comparação da razão obtida entre o nível destes duas faixas de tamanho de fragmentos para cada uma das duas amostras de fluido corporal, sendo a razão entre a faixa de tamanho longo/curto < 1, e preferencialmente < 0,75 indicativa da presença de um tumor.
[0116] A presente invenção é direcionada a um método para identificar se um fluido corporal (preferencialmente o plasma) da amostra de um indivíduo é de um paciente com câncer ou de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) na amostra de fluido corporal por um método da presente invenção, do cfDNA com tamanho na faixa de 50-100 pb e tamanho superior a 101 pb;
  • b) cálculo da razão obtida entre o nível destes duas faixas de tamanho de fragmentos para dita amostra de fluido corporal, sendo a razão entre a faixa de tamanho longo/curto < 1, e preferencialmente < 0,75 indicativa da presença de um tumor.
[0117] Em um exemplo de realização preferido, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) a partir de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de células (cfDNA) em duas amostras de fluido corporal através de um método da presente invenção, sendo o cfDNA de um tamanho que está dentro da faixa de 50-100 pb e um tamanho que está dentro da faixa de 100-145 pb, preferencialmente um tamanho que está dentro da faixa de 73 a 99 pb e dentro da faixa de 100-120 pb;
  • b) comparação da razão obtida entre estas duas faixas de tamanho de fragmentos das duas amostras de fluido corporal, em que a razão entre a faixa de tamanho longo/curto < 1, e preferencialmente < 0,5 é indicativa da presença de um tumor.
[0118] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, sendo o cfDNA de tamanho < 249 pb e tamanho > 249 pb, preferencialmente, cfDNA de tamanho < 100 pb e tamanho que está dentro da faixa de 249-409 pb, e mais preferivelmente um tamanho que está dentro da faixa de 73-100 pb e dentro da faixa de 300-357 pb;
  • b) comparação da razão obtida entre estas duas faixas de tamanho de fragmentos das duas amostras de fluido corporal, em que a razão entre a faixa de tamanho longo/curto < 0,5, e preferencialmente <0,1 é indicativa da presença de um tumor.
[0119] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula nas duas amostras de fluidos corporais por um método da presente invenção, em que os fragmentos cfDNA cuja concentração é determinada para cada amostra de fluido corporal são fragmentos com comprimentos superiores a 180 pb e fragmentos curtos com comprimentos inferiores a 100 pb;
  • b) comparação da razão obtida entre estas duas concentrações de fragmentos para cada uma das duas amostras de fluido corporal, em que a razão entre os tamanhos longo/curto < 0,4, e preferencialmente <0,1 é indicativa da presença de um tumor.
[0120] Em outro aspecto, quando a PCR, e particularmente a Q-PCR é implementada, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula nas duas amostras de fluidos corporais por um método da presente invenção, em que os fragmentos amplificados cuja concentração é determinada para cada amostra de fluido corporal são fragmentos com comprimentos superiores a 180 pb e fragmentos curtos com comprimentos inferiores a 100 pb;
  • b) comparação da razão obtida entre estas duas concentrações de fragmentos para cada uma das duas amostras de fluido corporal, em que a razão entre os tamanhos longo/curto < 0,4, e preferencialmente <0,1 é indicativa da presença de um tumor.
[0121] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma) de um paciente com câncer a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma) a partir de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, sendo o cfDNA com tamanho > 145 pb;
  • b) calculando a percentagem da quantidade de cfDNA obtida a partir da quantidade de cfDNA total, em que uma % que é inferior a 20%, e preferencialmente ?%, é indicativa da presença de um tumor.
[0122] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para identificar ou analisar o fluido corporal (preferencialmente o plasma) a partir de indivíduos onde o cfDNA é altamente liberado, tal como pacientes com câncer, a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, estando o cfDNA em uma faixa de tamanho de 60-80 pb, 100-145 pb e 180-400 pb;
  • b) comparação direta dos três níveis de quantificação obtidos entre os indivíduos saudáveis e não saudáveis.
[0123] Os inventores descobriram que existem três faixas de tamanho de cfDNA pelos quais a concentração/quantidade pode ser determinada, e que pode identificar, analisar ou discriminar entre cfDNA de indivíduos saudáveis e cfDNA de indivíduos onde o cfDNA é altamente liberado, tal como pacientes com câncer. A faixa de tamanho é de 60-80 pb, de 100-145 pb e de 180-400 pb. O diagnóstico, prognóstico, teragnóstico ou evolução de um estado fisiológico específico pode ser avaliada comparando o perfil de tamanho de cfDNA, preferencialmente pela combinação de pelo menos três valores de concentração obtidos quando se têm como alvos, fragmentos de cerca de 70 pb, cerca de 100 pb e cerca de 300 pb, e preferencialmente, combinando-os em uma função logística (logarítmica) .
[0124] Assim, em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para discriminar o fluido corporal (preferencialmente o plasma) a partir de indivíduos onde o cfDNA é altamente liberado, tal como em pacientes com câncer, a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, estando o cfDNA em uma faixa de tamanho de 60-80 pb, 100-145 pb e 180-400 pb;
  • b) determinação de um perfil de tamanho usando estes três valores como parâmetros em uma função logística.
[0125] Em um mesmo aspecto, a presente invenção também é direcionada a um método para discriminar o fluido corporal (preferencialmente o plasma) a partir de indivíduos onde o cfDNA é altamente liberado, tal como em pacientes com câncer, a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, sendo o cfDNA de diversos tamanhos na faixa de 50 - 400 pb;
  • b) comparação do perfil de tamanho obtido por estas três faixas de tamanho entre as duas amostras de fluidos corporais, preferencialmente pela combinação de pelo menos três valores de concentração obtidos quando se objetiva fragmentos de cerca de 70 pb, cerca de 100 pb e cerca 300 pb, e preferencialmente, combinando-os em uma função logística, tal como uma função logarítmica.
[0126] Em um aspecto idêntico, a presente invenção também é direcionada a um método para discriminar um fragmento de ácido nucleico livre de célula mutado a partir de um fragmento de ácido nucleico livre de célula não mutado em uma amostra/fluido biológico, em que dito método compreende as etapas de: determinação e comparação da razão entre a concentração de fragmentos longos e fragmentos curtos calculada para o fragmento mutado e para o fragmento não mutado, e em que no dito método:
-dita razão é comparada em vários tamanhos entre a faixa de 50450 pb, preferencialmente dito fragmento longo está compreendido entre 200 pb e 450 pb preferencialmente em pelo menos dois valores de concentração, tal como cerca de 200 pb e cerca de 300 pb, e ditos fragmentos curtos são menores do que 145 pb e estão compreendidos preferencialmente entre 50 pb e 99 pb.
[0127] Preferencialmente, a razão 80-145 pb/145-300 pb, ou 100145 pb/145-350 pb é comparada entre o fragmento de ácido nucleico livre de célula mutado e não mutado presente no fluido biológico.
[0128] Também preferido na presente invenção é um método para discriminar o fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de indivíduos onde o cfDNA é altamente liberado, tal como em pacientes com câncer, a partir do fluido corporal (preferencialmente o plasma ou soro) de indivíduos saudáveis, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) quantificação do DNA livre de célula (cfDNA) nas duas amostras de fluido corporal por um método da presente invenção, estando o cfDNA em uma faixa de tamanho de 60-80 pb, 100-145 pb e 180-400 pb;
  • b) comparação do perfil de tamanho obtido por estas três faixas de tamanho entre as duas amostras de fluidos corporais, preferencialmente pela combinação de pelo menos três valores de concentração obtidos quando se objetiva fragmentos de cerca de 70 pb, cerca de 100 pb e cerca 300 pb, e preferencialmente, combinando-os em uma função logística, tal como uma função logarítmica.
[0129] Em um exemplo de realização preferido, o método para discriminar o fluido corporal de acordo com a presente invenção, é implementado para o diagnóstico, prognóstico, teragnóstico, ou para monitorar a evolução de um estado fisiológico específico em um indivíduo, em que a comparação dos perfis de tamanho obtidos na etapa b) é indicativa daquele estado fisiológico específico.
[0130] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para o diagnóstico, prognóstico, teragnóstico ou para a avaliação da evolução de um estado fisiológico específico em um indivíduo, preferencialmente em um indivíduo onde o cfDNA é altamente liberado, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) cálculo repetidamente durante um intervalo de tempo do índice de integridade ou SFR de um ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal obtida do dito indivíduo, em que a presença do dito ácido nucleico está associada ao dito estado fisiológico específico, por um método para a determinação do índice de integridade ou SFR de um ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal de acordo com a presente invenção; e
  • b) comparação dos índices de integridade ou SFR obtidos e determinando se dito índice de integridade do ácido nucleico livre de célula variou ao longo deste um intervalo de tempo.
[0131] Em um exemplo de realização preferido, dito estado fisiológico específico é um estado fisiológico que resulta da liberação de cfDNA ou da apoptose de células, preferencialmente, selecionado a partir do grupo consistindo de câncer, diabetes, doença das células falciformes, trauma de tecidos, queimaduras solares, hemodiálise ou produção de esforço intenso.
[0132] Em um aspecto específico, o método acima da presente invenção é direcionado a um método para o prognóstico, diagnóstico ou teragnóstico da progressão tumoral e um paciente, em que na etapa a) dito ácido nucleico associado com o estado fisiológico específico está associado ao dito tumor; e em que na etapa b), uma diminuição do índice de integridade ao longo deste um intervalo de tempo indica a progressão do câncer.
[0133] Em um exemplo de realização preferido, uma diminuição do índice de integridade ou SFR para um valor inferior a 0,5, preferencialmente inferior a 0,1 é indicativa da progressão do câncer.
[0134] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para o diagnóstico, prognóstico, teragnóstico ou para a avaliação da evolução de um estado fisiológico específico em um indivíduo, preferencialmente em um indivíduo onde o cfDNA é altamente liberado, em que dito método compreende as etapas de:
  • a) cálculo, de maneira repetida durante um intervalo de tempo, da concentração de ácido nucleico livre de célula curto mutado ou não mutado em uma amostra de fluido corporal obtida do dito indivíduo, em que a presença do dito ácido nucleico está associada ao dito estado fisiológico específico, por um método de quantificação de ácido nucleico livre de célula em um fluido corporal de acordo com a presente invenção, e
  • b) comparação das concentrações obtidas e determinando se a concentração do dito fragmento mutado ou não mutado amplificado de ácido nucleico livre de célula variou ao longo deste intervalo de tempo.
[0135] Em um exemplo de realização preferido, dito estado fisiológico específico é um estado fisiológico que resulta da liberação de cfDNA, preferencialmente, selecionado a partir do grupo consistindo de lúpus autoimune, septicemia, infarto do miocárdio, esclerose múltipla ou produção de um esforço intenso.
[0136] Em um exemplo de realização também preferido do método acima, dito ácido nucleico associado a um estado fisiológico específico está associado ao dito tumor; e em que na etapa b) um aumento da concentração do dito fragmento amplificado mutado ou não mutado de ácido nucleico livre de célula durante este intervalo de tempo é indicativo da progressão do câncer.
[0137] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para monitorar a eficácia de um tratamento do câncer em uma paciente, compreendendo as etapas de:
  • a) calcular durante um intervalo de tempo o índice de integridade do ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal obtida a partir do dito paciente para pelo menos um ácido nucleico marcador do câncer utilizando um método de quantificação de ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção, e
  • b) comparando o índice de integridade obtido e determinando se dito índice de integridade do dito ácido nucleico livre de célula estava aumentado ou diminuído durante este intervalo de tempo, em que um aumento no dito índice de integridade é indicador da eficácia e uma diminuição no índice de integridade é indicadora de uma falta de eficácia do tratamento do câncer.
[0138] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para a análise de ácidos nucleicos livres de célula, particularmente de DNA circulante, em um indivíduo, tal como em um paciente que exibe um tumor ou que é susceptível de apresentar um tumor compreendendo dito método as etapas de:
  • a)a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético, tal como um SNP ou uma mutação, no dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção;
  • b) a quantificação do dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção; e
  • c) a determinação da taxa de apoptose pela implementação da determinação do índice de integridade do dito ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção, e dito método integra os seguintes parâmetros e cálculo:
-A1A2 por um lado e B1B2 por outro são representações das sequências curtas amplificadas; e A1B2 a sequência longa amplificada.
-A1A2 ou B1B2 compreendem o polimorfismo genético; -considerando CB1B2, CA1A2 e CA1B2, respectivamente, a concentração inicial mensurada de ácido nucleico extraído correspondente à detecção do fragmento curto amplificado B1B2, fragmento curto amplificado A1A2 e fragmento longo amplificado A1B2, respectivamente;
-a detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético: -% CB1B2/CA1A2 maior do que um limiar específico, onde B1B2 é definido como a sequência amplicon contendo o polimorfismo genético; ou
-% CA1A2/CB1B2 maior do que um limiar específico, onde A1A2 é definido como a sequência amplicon contendo o polimorfismo genético;
-a avaliação do índice de integridade através da determinação da razão CB1B2/CA1B2 ou CA1A2/CA1B2, em que, considerando que X e Y são as distâncias no ácido nucleico entre as extremidades 5' dos primers, ou o comprimento dos fragmentos amplificados (ou amplicons): (A1A2) = (B1B2) = X L (A1B2) = Y com X < 180 e Y > X, preferencialmente, 50 < X < 100 e 200 < Y < 450.
[0139] Em um exemplo de realização preferido, dito ácido nucleico correspondente com o polimorfismo genético de interesse na fita codificante está localizado na extremidade 3’ do primer iniciando na posição B1 ou A2, e em que o método que implementa a PCR é uma PCR alelo-específica.
[0140] Em um exemplo de realização preferido, dito fragmento longo A1B2 amplificado compreende parcial ou totalmente o fragmento curto não mutado e o fragmento mutado contendo dito polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou mutação) a ser detectado (A1A2 e B1B2 ou B1B2 e A1A2, respectivamente).
[0141] Em um exemplo de realização preferido, dito fragmento longo amplificado A1B2 é de 300 pb +/-20% de comprimento, e o fragmento curto não mutado (A1A2 ou B1B2) e o fragmento mutado (B1B2 ou A1A2) são de 60 pb +/- 20% de comprimento.
[0142] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para o diagnóstico ou o prognóstico da progressão tumoral em um paciente, ou um método teragnóstico que compreende a determinação da progressão tumoral em um paciente, compreendendo dito método a etapa de:
  • a) determinação da concentração de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal a partir do dito paciente por um método de quantificação de ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção; e
  • b) a detecção de um polimorfismo genético (por exemplo, um SNP ou mutação) no dito fragmento curto amplificado do dito ácido nucleico livre de célula por um método de acordo com a presente invenção.
[0143] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para o diagnóstico, prognóstico de um estado patológico ou fisiológico, tal como a presença de um tumor ou a progressão do tumor em um paciente, ou um método teragnóstico que compreende a determinação do dito estado patológico ou fisiológico em um paciente, e dito estado patológico ou fisiológico está associado a um polimorfismo genético em um ácido nucleico (tal como um SNP ou mutação), em que dito método compreende as etapas de:
  • a) estudo de pelo menos dois biomarcadores selecionados a partir do grupo de:

-determinação da concentração de ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal a partir do dito paciente por um método de quantificação de ácido nucleico livre de célula de acordo com a presente invenção;
-A detecção de um polimorfismo genético no dito ácido nucleico livre de célula por um método de acordo com a presente invenção, em que a classificação do paciente como tendo ou não dito polimorfismo genético é obtida determinando se percentagem de ácido nucleico livre de célula mutado versus não mutado encontrada é maior do que um valor limiar, e preferencialmente dito valor limiar é específico de um dado polimorfismo genético e é determinado a partir de um grupo de pacientes com e sem dita mutação; e
-a determinação do índice de integridade do dito ácido nucleico livre de célula na amostra, por um método de acordo com a presente invenção,
  • b) combinar pelo menos dois valores por meio de uma função logística incluindo ditos pelo menos dois biomarcadores, e
  • c) análise do dito valor final da dita função logística a fim de diagnosticar ou prognosticar o estado patológico ou fisiológico, tal como um tumor ou progressão do tumor no dito paciente.
[0144] Tal valor limiar associado ao dito SNP no presente método da invenção quando necessário pode ser determinado a partir de um coorte de dois grupos de pacientes, pacientes que exibem e pacientes que não exibem o polimorfismo genético específico (tal como SNP ou mutação) associado ao dito SNP. Dito limiar representa o valor mínimo, acima do qual é estabelecido sem ambiguidade que o gene está mutado.
[0145] A presente invenção é também direcionada a um kit que compreende dois conjuntos de primers de ácido nucleico, preferencialmente para a detecção ou quantificação da presença de um ácido nucleico livre de célula de um gene de interesse em uma amostra de fluido corporal, e dito gene de interesse é susceptível de apresentar uma mutação, mais preferencialmente, para o seu uso no sistema IntPlex da presente invenção, caracterizado pelo fato de que os dois conjuntos de primers compreendem:
  • a) um primeiro conjunto de dois primers, denominados de A1 (primer direto) e A2 (primer reverso), e ditos dois primers A1 e A2:
-Possuem um tamanho mínimo de 15 nucleotídeos e um tamanho máximo de 30 nucleotídeos; e
-possuem um espaçamento mínimo de pelo menos 5 pb entre os dois primers, entre as extremidades 3' de ambos primers, e
-permitem a obtenção de um fragmento amplificado (amplicon) possuindo uma faixa de tamanho compreendido entre 35 e 100 pb, estando dito amplicon em uma região do dito gene que não apresenta a mutação de interesse; e
  • b) um segundo conjunto de dois primers, denominados de B1 (primer direto) e B2 (primer reverso), e ditos dois primers B1 e B2:
-Possuem um tamanho mínimo de 15 nucleotídeos e um tamanho máximo de 30 nucleotídeos; e
-possuem um espaçamento mínimo de pelo menos 5 pb entre os dois primers, entre as extremidades 3' de ambos primers, e
-permitem a obtenção de um fragmento amplificado (amplicon) possuindo uma faixa de tamanho compreendido entre 35 e 100 pb, estando dito amplicon em uma região do dito gene que apresenta a mutação de interesse; e em que A1B2 esta na faixa de tamanho de 250-450 pb.
[0146] A presente invenção é também direcionada ao kit de acordo com a presente invenção, em que:
a região alvo do dito gene de interesse quando o primer B2 está localizado de 5 a 85 nucleotídeos a jusante da posição da dita mutação de interesse
a região do dito gene de interesse quando o par de primers A1A2 é concebido na região que está localizada dentro dos 430-100 nucleotídeos a montante da posição da dita mutação de interesse,
preferencialmente para seu uso no sistema IntPlex convencional da presente invenção.
[0147] A presente invenção é também direcionada ao kit de acordo com a presente invenção, em que:
a região do dito gene de interesse quando o primer A1 está localizado de 5 a 85 nucleotídeos a montante da posição da dita mutação de interesse.
a região do dito gene de interesse quando o par de primers B1B2 é desenhado para a região localizada dentro dos 100-430 nucleotídeos a montante da posição da dita mutação de interesse,
preferencialmente para a o uso deste no sistema IntPlex inverso da presente invenção.
[0148] A presente invenção é também direcionada para um kit que compreende dois conjuntos de primers de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que o gene e/ou a mutação gênica de interesse associada é/são selecionado(s) a partir do grupo de: A) Mutações em distúrbios em cânceres específicos::
(Para cada gene são apresentados o número da posição no cDNA dos pb que carregam a mutação com base no NCBI 36 Ensembl Contig view < http://may2009.archive.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/ )
TP53: 394, 395, 451,453, 455, 469, 517, 524, 527, 530, 586, 590, 637, 641, 724, 733,734, 743, 744, 817, 818,819, 820, 839, 844, 916
APC: 2626, 3340, 3907, 3934, 3964, 4012, 4099, 4132, 4133, 4285, 4286, 4348, 4729 MSH6: 1168 NF1: 3827, 3826
PIK3CA: 1530, 1624, 1633, 1634, 1636, 1656, 3140, 3140, 3140 SMAD4: 502, 931, 932, 988, 989, 1051, 1082, 1156, 1332, 1333, 1519, 1596, 1597, 1598, 1606
EGFR: 2155, 2155, 2156, 2303, 2369, 2573; deletions/loss: 2230 to 2244, from 2308 a 2328
CDKN2A: 172, 205, 238, 239, 298, 250, 322, 369, 427, 394 IDH1: 394; 395
PTEN: 125, 126,182, 302, 314, 387, 388,389, 1911, 577, 518, 519, 697, 698, 1003, 1004
SMARCB1: 118, 153, 154, 379, 380, 425, 471, 472, 473, 601, 618, 619, 777, 776, 778 CTNNB1: 7, 94, 95, 98, 100, 101, 110, 121, 122, 133, 134, 170
HNF1A: 82, 81, 83,196, 378, 379, 493, 494, 495, 526,527, 617, 618, 685, 710, 749, 787, 817
VHL: 194, 203, 241,266, 340, 343, 388, 452, 473, 480, 478
ATM: 1229, 1810, 2571,2572, 2573, 3925, 8774, 9023
EZH2: 1936, 1937
RET: 2753
NRAS: 181, 182, 183
PTCH1: 135, 338, 416, 417, 1242, 1243, 1244, 1280 1281, 1284, 1301, 1302, 1315 KIT: 1668, 1669, 1670, 1679, 1680, 1681, 1682, 1727, 1728, 1924, 1925, 1961, 1962, 2467, deleções de 1645 a 1727
NF2: 168, 169, 170, 459, 460, 586, 592, 634, 655, 656, 784, 1021, 1022, 1396 PDGFRA: 1680, 1681, 1682, 1975, 1976, 1977 MEN1: 124, 256, 291,292, 293 PPP2R1A: 536, 767 STK11: 196, 910
MLL3: 1097, 4432, 6301, 6851, 8911, 10040, 10495, 12048, 12165
FOXL2: 402
GNAS: 601,602, 680
HRAS: 34, 35, 36, 37, 39, 181,182
FGFR3: 742, 743, 744, 746, 1108, 1111, 1112, 1113, 1114, 1115, 1116, 1117, 1118, 1949
PTCH1: 549, 550, 584, 1093, 1249, 1804, 2446, 3054, 3944, 3945, 3946 CDH1: 367,368, 1000, 1057, 1108, 1204, 1436, 1437, 1742;
B) Mutação em outros distúrbios além do câncer:
a) distúrbios de único gene
[0149] Gene autossômico dominante: hipercolesterolemia familiar, doença de Huntington, a neurofibromatose tipo 1, síndrome de Marfan, não polipose hereditário, câncer colorretal, exostoses múltiplas hereditárias, doença renal policística, acondroplasia, anemia falciforme, acondroplasia, anemia falciforme
  • b) Autossômica alelo recessiva: fibrose cística, anemia falciforme, doença de Tay-Sachs, doença de Niemann-Pick, atrofia muscular espinhal, síndrome de Roberts, Fenilcetonúria, Mucopolissacaridoses, doenças de armazenamento de glicogênio;
  • c) ligada ao X dominante: síndrome de Rett, incontinência pigmentar, síndrome de Aicardi, síndrome de Klinefelter, incontinência pigmentar, distrofia muscular de Duchenne, hemofilia;
  • d) ligada ao Y: infertilidade masculina e hipertricose auricular;
  • e) doença mitocondrial: neuropatia óptica hereditária de Leber;
  • f) distúrbios multifatoriais e poligênicos (complexos): asma, doenças autoimunes como a esclerose múltipla, câncer, ciliopatias, fenda palatina, diabetes, doença cardíaca, hipertensão, doença inflamatória intestinal, retardo mental, transtorno de humor, obesidade, erro refrativo, infertilidade;
[0150] A presente invenção também é direcionada para o kit que compreende dois conjuntos de primers de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que a mutação gênica de interesse é selecionada a partir do grupo que consiste das mutações dos genes KRAS e BRAF, e particularmente a mutação V600E no gene BRAF.
[0151] A presente invenção é direcionada a um kit compreendendo um ou dois conjuntos de primers de ácido nucleico, preferencialmente para a detecção ou quantificação da presença de um ácido nucleico livre de célula do gene KRAS em uma amostra de fluido corporal, em que dito gene KRAS é susceptível de apresentar uma mutação selecionada a partir do grupo de mutação G12 do KRAS, preferencialmente as mutações, G12V, G12D, G12A, G12S e G12C, e G13D, mais preferencialmente, para o uso deste no sistema IntPlex, caracterizado pelo fato de que dito conjunto de primers ou os dois conjuntos de primers compreendem:
  • a) um primeiro conjunto de dois primers, denominados de A1 (primer direto) e A2 (primer reverso), e ditos dois primers A1 e A2 são selecionados a partir do grupo que consiste em:
- para A1, as SEQ ID NOs 163 a 196,
- para A2, as SEQ ID NOs 250 a 256; e/ou
  • b) um segundo conjunto de dois primers, denominados de B1 (primer direto) e B2 (primer reverso), e ditos dois primers B1 e B2 são selecionados a partir do grupo que consiste em:
-para B1, as SEQ ID NOs 244 a 249;
-para B2, as SEQ ID NOs 83 a 120.
[0152] A presente invenção é também direcionada a um kit compreendendo um ou dois conjuntos de primers de ácido nucleico, preferencialmente para a detecção ou quantificação da presença de um ácido nucleico livre de célula do gene BRAF em uma amostra de fluido corporal, e dito gene BRAF é susceptível de apresentar uma mutação V600E, preferencialmente, para o uso deste no sistema IntPlex, caracterizado pelo fato de que o um ou dois conjunto(s) de primer(s) compreende(m):
  • a) um primeiro conjunto de dois primers, denominados de A1 (primer direto) e A2 (primer reverso), e ditos dois primers A1 e A2 são selecionados a partir do grupo que consiste em:
-para A1, as SEQ ID NOs 65 a 81,
-para A2, a SEQ ID NO 19; e/ou
  • b) um segundo conjunto de dois primers, denominados de B1 (primer direto) e B2 (primer reverso), e ditos dois primers B1 e B2 são selecionados a partir do grupo que consiste em:
-para B1, a SEQ ID NO: 38;
-para B2, as SEQ ID NOs 40 a 63.
[0153] Em outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um primer de ácido nucleico, preferencialmente para a detecção ou quantificação da presença de um DNA KRAS livre de célula contendo uma sequência de uma mesma região intrônica de KRAS em uma amostra de fluido corporal, preferencialmente para a determinação do perfil de tamanho do dito ácido nucleico livre de célula em uma amostra de fluido corporal a partir de um paciente, e dito ácido nucleico é selecionando a partir do grupo de primers que possuem as sequências de SEQ ID NOs: 1 a 8 (vide a tabela 1).
[0154] A presente invenção também é direcionada a um conjunto de primers de ácido nucleico, preferencialmente para a detecção ou quantificação da presença de um ácido nucleico KRAS livre de célula em uma amostra de fluido corporal, mais preferencialmente de DNA KRAS, em que dito conjunto de primers é selecionando a partir do grupo dos seguintes conjuntos de primers:
  • a) um conjunto de primers compreendendo o primer possuindo a sequência de SEQ ID NO: 1; e pelo menos dois primers diferentes, preferencialmente três primers diferentes selecionando a partir do grupo de primers possuindo as sequências de SEQ ID NOS: 2 a 8;
  • b) um conjunto de primers compreendendo o primer possuindo a sequência de SEQ ID NO: 1, o primer possuindo a sequência de SEQ ID NO: 8, e pelo menos um ou dois primers selecionados a partir do grupo de primers possuindo as sequências de SEQ ID NOs: 2 a 7;
  • c) um conjunto de primers compreendendo o primer possuindo a sequência de SEQ ID NO: 1, o primer possuindo a sequência de SEQ ID NO: 7, e um primer selecionados a partir do grupo de primers possuindo as sequências de SEQ ID NOs: 2 a 6; e
  • d) um conjunto de primers compreendendo os primers que possuem as sequências de SEQ ID NOs: 1 a 8.
[0155] A presente invenção também é direcionada a um conjunto de primers de ácido nucleico, preferencialmente para o uso deste no sistema IntPlex para demonstrar a presença da mutação G12V KRAS em uma amostra de fluido corporal, e dito conjunto de primers de ácido nucleico compreende os primers possuindo as sequências de SEQ ID NOs: 9 a 14, preferencialmente de 9 a 15 (vide tabela 2).
[0156] Mais preferencialmente, a presente invenção é direcionada a um conjunto de primers de ácido nucleico, preferencialmente para o uso deste no sistema IntPlex para demonstrar a presença da mutação G12 de KRAS (G12V, G12D, G12A, G12S e G12C) e a mutação G13D em uma amostra de fluido corporal, e dito conjunto de primers de ácido nucleico compreende os primers possuindo as sequências de SEQ ID NOS: 28 a 36, preferencialmente 29 a 37 (vide a tabela 4).
[0157] A presente invenção é finalmente direcionada a um conjunto de primers de ácido nucleico, preferencialmente para a utilização deste no sistema IntPlex para demonstrar a presença da mutação V600E no BRAF em uma amostra de fluido corporal, e dito conjunto de primers de ácido nucleico compreende os primers possuindo as sequências de SEQ ID NOs: 16 a 21, preferencialmente de 16 a 22 (vide tabela 2).
[0158] Mais preferivelmente, a presente invenção é direcionada a um conjunto de primers de ácido nucleico, preferencialmente para o uso deste no sistema IntPlex para demonstrar a presença da mutação V600E no BRAF em uma amostra de fluido corporal, e dito conjunto de primers de ácido nucleico compreende os primers possuindo as sequências de SEQ ID NOs: 23 a 26, preferencialmente de 23 a 27 (vide tabela 4).
[0159] Finalmente, a presente invenção é direcionada a um kit para a detecção ou quantificação da presença de ácido nucleico KRAS de BRAF livre de célula em uma amostra de fluido corporal, mais preferencialmente DNA livre de célula, opcionalmente DNA livre de célula exibindo um polimorfismo genético, ou determinar o perfil de tamanho do dito ácido nucleico KRAS de BRAF livre de célula em uma amostra biológica, compreendendo dito kit um conjunto de primers conforme indicado acima de acordo com a presente invenção.
[0160] Os exemplos a seguir bem como as figuras e legendas a seguir, foram escolhidos para proporcionar aos técnicos hábeis no assunto uma descrição completa a fim capacitar a execução e uso da presente invenção. Estes exemplos não tem a finalidade de limitar o escopo que o inventor considera como sendo a sua invenção, nem tem a finalidade de demonstrar que apenas os experimentos a seguir foram realizados.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0161] Figura 1: Quantificação por Q-PCR do DNA genômico isolado a partir de células HCT-116-s de CRC (câncer colorretal) usando os pares de primers que levam à amplificação de amplicons de diferentes tamanhos do gene KRAS. Os valores são obtidos pela quantificação de uma amostra a uma diluição que corresponde a 45 pg/µL A concentração da amostra de DNA genômico foi mensurada por densidade óptica antes do uso na Q-PCR. Os histogramas representam os valores médios de três experimentos diferentes. Os experimentos foram realizados em duplicatas e os resultados são expressos em pg/µL de extrato.
[0162] Figuras 2A e 2B: Quantificação por Q-PCR de cirDNA isolado a partir de 3 pacientes com CRC metastático antes da cirurgia e quimioterapia em razão ao tamanho do amplicon. A Figura 2A, amostras de soro (n = 2 pacientes). Figura 2B, amostra de plasma de um paciente. A determinação das concentrações de cirDNA de cada paciente foi realizada em duplicatas. O histograma corresponde à média das duplicatas. Os resultados são expressos em ng/µL de cirDNA.
[0163] Figura 3: Quantificação por Q-PCR de cirDNA isolado a partir de amostras de plasma de três indivíduos saudáveis com idades entre 20 e os 25 anos. A concentração de cirDNA foi determinada utilizando um sistema de Q-PCR que amplifica fragmentos de dimensões que variam entre 60-409 pb. Os histogramas mostram os valores médios expressos em pg cirDNA/mL de plasma. Por exemplo, o valor máximo obtido com o par de primer KRAS 101 corresponde a uma concentração de plasma de 4,8 ng/ml.
[0164] Figura 4: Ilustração da vantagem na amplificação da sequência curta de DNA com razão à detecção de ctDNA mutado. O uso de três conjuntos de primers (A, B e C), produzindo amplicons de tamanhos diferentes é representado quando se analisa o DNA genômico, DNA pouco e muito fragmentado.
[0165] Figura 5: As proporções relativas dos valores de concentração em razão ao tamanho do amplicon.
[0166] Figura 6: Concentrações de cirDNA obtidos pela amplificação de um fragmento longo de 249 pb ou um fragmento curto de 60 pb em amostras de plasma de um indivíduo saudável, com baixo nível de cirDNA (23 ng/ml plasma), um sujeito com mCRC com nível intermédio de cirDNA (450 ng/ml plasma) e um paciente com mCRC com alta concentração de cirDNA (1860 ng/ml plasma). A amostra da linhagem de células corresponde aos valores obtidos para o DNA genômico isolado a partir de células HCT116-S (4,8 ng/ml, Figura 1). Os valores são expressos como frações do valor máximo obtido com os pares de primers para a amplificação de fragmentos de DNA de tamanhos crescentes (60, 73, 101, 145, 185, 249, 300, 357 e 409 pb).
[0167] Figuras 7A e 7B: A concentração de ctDNA especifico tumoral pelo perfil de tamanho em camundongos xenoenxertados. Foram usadas duas séries de 7 conjuntos de primers gerando amplicons com comprimentos crescentes entre 60 e 409 pb ou 60 e 385 pb de origem humana ou de camundongo, respectivamente. Cada ponto corresponde à média de três grupos de quatro plasmas de camundongos diferentes.
[0168] Figuras 8A e 8B: A contribuição da quantidade de cirDNA tumoral para o cirDNA total no plasma de camundongos xenoenxertados.
[0169] Figura 9: Representação esquemática de um exemplo de uso do método IntPlex para a análise de SNPs.
[0170] Figura 10: Aplicação do sistema IntPlex para o câncer.
[0171] Figuras 11A e 11B:
[0172] A Figura 11A: Representação esquemática do sistema IntPlex KRAS convencional no qual a mutação está na extremidade 3' do primer sense B1.
[0173] A Figura 11B: Representação esquemática do sistema IntPlex KRAS Reverso no qual a mutação está na extremidade 3' do primer antisense A2.
[0174] Figura 12: Eficiência do sistema Kinv para a quantificação de cirDNA a partir de camundongos xenoenxertados com células de câncer humano SW620. Números vermelhos: tamanho dos amplicons (em pb).
[0175] Figura 13: Eficiência do sistema Kconv para a quantificação de cirDNA a partir de camundongos xenoenxertados com células de câncer humano SW620. Números vermelhos: tamanho dos amplicons (em pb).
[0176] Figura 14: quantificação por Q-PCR do DNA S4 HT29.
[0177] Figura 15: S4 HT29DNA diluído (1/10) em DNA genômico humano.
[0178] Figura 16: Os dados são apresentados como uma percentagem da concentração mais elevada na série.
[0179] Figura 17: Concentrações de fragmentos mutados (em %) em função da concentração de fragmentos não mutados observados utilizando o processo IntPlex a partir do DNA de plasma humano.
[0180] Figura 18: Discriminação do plasma entre indivíduos saudáveis e com CRC. Os valores da concentração de cirDNA são apresentados na tabela e expressos em ng/mL de plasma. Os histogramas representam a % da quantidade de cirDNA contida na fração de tamanho.
[0181] Figuras 19A - 19B: Eletroforese em gel de agarose de 20 μg de ctDNA extraídos de dois pacientes com CRC (CRC021, Fig 19A e CRC019, Fig. 19B).
[0182] Figura 20: Comparação dos valores do DII (A) a partir de DNA genômico, e ctDNA de plasmas humanos (saudável e CRC).
[0183] Figura 21: Comparação dos valores do DII calculados com os primers desenhados da presente invenção, com o valor obtido pelo uso de pares de primers que objetivam sequências de DNA distantes.
[0184] Figuras 22A - 22E: Determinação de diversos parâmetros indicativos do padrão de tamanho do fragmento de ctDNA (os dados são representados graficamente em histogramas).
[0185] Figura 23: Localização das sequências de primers para o gene BRAF (sistema convencional e reverso (ou inverso)).
[0186] Exemplo da região do DNA a ser objetivada pelo método IntPlex quando a mutação pontual V600E no BRAF é de interesse. A Figura 23 mostra as regiões onde entidades moleculares, tal como primers, podem ser direcionadas em nosso método multiplex aplicado a esta mutação. Amarelo: sistema convencional; Verde: sistema reverso; Vermelho: bloqueador; Rosa: SNP. Figuras 24A - 22E: Localização das regiões do éxon 2 e sequências de primers para o gene KRAS (sistema convencional e reverso (ou inverso)).
[0187] Figura 24A: Exemplo de região do DNA a ser objetivada no método IntPlex quando as mutações pontuais nos hot spots do 2° e 3° códon do segundo éxon do gene KRAS é de interesse.
[0188] Amarelo: primer reverso para o amplicon mutado: 6156 a 6236;
[0189] Verde: par de primers para amplicon não mutado: 5721 a 6051
[0190] A Figura 24A mostra as regiões onde entidades moleculares, tal como primers, podem ser direcionadas no método multiplex aplicado a esta mutação.
[0191] Figura 24B: Localização das sequências de primers para KRAS nos sistemas convencional e reverso.
[0192] Amarelo: sistema convencional;
[0193] Verde: sistema de reverso;
[0194] Vermelho: bloqueador;
[0195] Rosa: SNP.
[0196] Figura 24C: Região de DNA selecionada como alvo para o par de primers B1B2 desenhado para a detecção das mutações hot spot no éxon 2 do KRAS na configuração reversa do sistema da presente invenção. A1: GCCTGCTGAAAATGACTG; A2: e amarelo e em verde.
[0197] Figura 24E: Região de DNA selecionada como alvo para o primer A1 para detectar mutações no hot spot no éxon 2 do KRAS na configuração reversa:
[0198] A2: GTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTT;
[0199] A1: região de DNA selecionada como alvo em amarelo e verde.
[0200] Figura 24D: Região de DNA selecionada como alvo para o primer B2 para detectar mutações hot spot no éxon 2 do KRAS na configuração convencional:
[0201] B1: ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG
[0202] B2: região de DNA selecionada como alvo em amarelo e verde.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 DETERMINAÇÃO DA FAIXA DE TAMANHO DE CIRDNAS
[0203] A fim de determinar o tamanho ideal das amplicons para uma análise mais específica e sensível dos cirDNAs por Q-PCR, nós preparamos e utilizamos 9 pares de primers que permitem a amplificação de amplicons com 60, 73, 101, 145,185, 249, 300, 357 e 409 pb dentro da mesma região. Eles foram concebidos de tal modo que um pequeno amplicon está sempre compreendido dentro da sequência de um amplicon maior, o primer antisense é o mesmo para cada par de primers. Esta região amplificada de 409 pb está localizada no íntron 2 do KRAS. As sequências dos primers de oligonucleotídeos são apresentadas na Tabela 1.
Figure img0001
CONCENTRAÇÃO OBTIDA PELO USO DE CADA PAR DE PRIMERS PARA A ANÁLISE DO DNA GENÔMICO
[0204] A Figura 1 descreve a variação no rendimento dos pares de primers testados. Todos os resultados são de três experimentos realizados em duplicatas. A eficiência da reação de amplificação pela Q-PCR de uma dada sequência de DNA está relacionada com as propriedades termodinâmicas dos primers e ela difere, dentre outras coisas, em função do tamanho do amplicon. Conforme exibido na Figura 1, a eficácia de detecção dos pares de primers (com as propriedades de hibridação similares) é em razão ao tamanho dos amplicons testados. Conforme ilustrado na Figura 1, a detecção parece ser ótima para os amplicons com tamanhos entre 101 e 185 pb. Na literatura, tem sido convencionalmente escolhida a amplificação de regiões que vão de 150 a 250 pb.
[0205] A presença de monômeros ou múltiplos nucleossomos que têm um tamanho de cerca de 180-200 pb foi já descrita e é indicativa de um mecanismo de apoptose para a liberação de cirDNA.
[0206] A Figura 2A resume os resultados obtidos com duas amostras de soro de dois pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC). As curvas de concentração de cirDNA destas duas amostras de soro exibem perfis comparáveis que apresentam aproximadamente três fases. A primeira, na qual a concentração de amplicons de tamanhos entre 60 e 73 pb (até valores que variam entre 0,2 e 0,3 ng/µL) é semelhante, uma segunda para amplicons de tamanhos entre 101 e 145 pb, em que a concentração decresce acentuadamente para valores de cerca de 0,05 ng/μL e, finalmente, uma terceira fase de amplicons de tamanhos entre 145 e 409 pb, em que a concentração de cirDNA forma um platô ou decresce muito lentamente até 0,02 ng/µL.
[0207] A Figura 2B mostra a concentração de cirDNA determinado pelo uso do mesmo sistema de amplificação com amplicons de tamanhos crescentes no plasma de um paciente com CRC. Os dados mostram o mesmo perfil de tamanho.
[0208] Deve se observar que os soros e plasma utilizados são de pacientes à espera da sua primeira cirurgia de ressecção do tumor e não submetidos à quimioterapia no momento da amostragem.
[0209] A Figura 3 resume os perfis de concentração de cirDNA nas amostras de plasma de indivíduos saudáveis com razão aos tamanhos dos amplicons. Estes resultados indicam que as concentrações mais elevadas de cirDNA são detectadas com amplicons de tamanhos entre 101 e 145 pb. Diferentemente dos resultados para os pacientes com mCRC, nos indivíduos saudáveis os resultados não indicam a presença de uma variação significativa na detecção de amplicons maiores ou menores do que 101-145 pb.
[0210] Nós podemos discriminar o plasma de pacientes com câncer do plasma de um indivíduo saudável, comparando quantificação de cfDNA ao detectar uma sequência amplificada (amplicon) de 145-409 e outra na faixa de tamanho de 50-73 pb. Uma razão longo/curto <0,5 e, preferencialmente <0,1 é indicativa da presença de um tumor.
A RAZÃO PELA QUAL O TAMANHO DO AMPLICON É CRUCIAL NA ANÁLISE DO CIRDNA VS DNA GENÔMICO
[0211] Assim, o perfil de tamanho do cirDNA, conforme determinado pela amplificação do amplicon possuindo comprimentos da sequência crescentes, revela que a detecção ótima é feita quando a amplificação do amplicon é < 100 pb, e que uma proporção muito maior de cirDNA com tamanhos variando entre 150 e 350 pb está presente no cirDNA não tumoral quando comparado com o cirDNA tumoral. A escolha do tamanho da região de DNA amplificado consequentemente parece crucial conforme ilustrado pelo esquema da figura 4.
[0212] Assim, a escolha do tamanho do amplicon é crucial para:
  • - a sensibilidade da análise pela Q-PCR (um aumento de mais de 10 vezes e até 50 vezes de acordo com a quantidade de cirDNA na amostra),
  • -a especificidade, pois a análise do perfil de concentração do cirDNA baseada no tamanho do amplicon (ou a determinação da amplificação ótima) pode distinguir o cirDNA de um paciente com mCRC do cirDNA de um indivíduo saudável. A medida da razão entre a quantificação obtida por amplicons de tamanhos entre 50 e 100 e a quantificação obtida por amplicons maiores do que 100 pb pode ser usada para a hipótese da presença de cirDNA de origem tumoral. Além da quantidade total mais elevada de cirDNA em pacientes com mCRC, a qualidade em termos de tamanho do fragmento aparece, pela primeira vez, como sendo específica e informativa sobre a presença de cirDNA de câncer.
[0213] Além disso, é possível determinar a especificidade deste através da medição do índice de integridade, que é calculada pela comparação das concentrações de amplicons de tamanhos específicos (Figura 5).
[0214] A razão 145/60 ou 300/60 é sempre menor do que 1, no caso da análise dos cirDNA de pacientes com mCRC. Por outro lado, a razão 145/60 é 2,07 para o DNA genômico.
[0215] O índice de integridade para 300/60 é mais baixo do que para 145/60 no cirDNA de pacientes com mCRC. Na verdade, é < 0,344 nos pacientes com mCRC, enquanto é > 0,45 no cirDNA de indivíduos saudáveis. A razão 300/60 é de 0,38 no DNA genômico.
[0216] O estudo inicial da análise da razão 145/60 e 300/60, em indivíduos saudáveis e pacientes com mCRC, mostra uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 100%. A razão 145/60 parece, assim, discriminar melhor entre indivíduos saudáveis e pacientes com mCRC do que a razão 300/60, especialmente quando o desvio padrão da média é considerado, mas tem uma menor diferenciação quando a especificidade é considerada. A razão 300/145 não é ótima para discriminar pacientes saudáveis / câncer e, em geral, fornece resultados que são opostos aos obtidos com a razão 300/60, ou seja, a média dos valores obtidos para 300/145 é mais elevada para o cirDNA de pacientes com mCRC; contudo este é o tipo de razão (fragmento curto > 100 pb e < 180), que tem sido convencionalmente utilizado nos poucos estudos realizados anteriormente sobre o índice de integridade (13-19).
[0217] É importante indicar que a escolha dos pares de primers utilizados (e, assim, em particular, o tamanho da sequência amplificada) para a detecção do cirDNA baseia-se apenas no seu rendimento de amplificação de fragmentos entre 100 e 300 pb de acordo com a sequência alvo. O cálculo dos índices de integridade pode ser utilizado para discriminar entre cirDNAs de indivíduos saudáveis e de pacientes com mCRC. Deve-se salientar que outras relações (razões) ou índices de integridade podem ser calculados em função do desenvolvimento do tumor ou da concentração total de cirDNA.
[0218] Os histogramas da Figura 5 mostram que as proporções relativas dos valores obtidos com a amplificação dos fragmentos de 60 e 145 pb são opostas nos indivíduos saudáveis quando comparados com pacientes com mCRC.
[0219] Nós descobrimos que quanto maior a quantidade de cirDNA, menor é o índice de integridade. Por exemplo, o valor da amplificação do fragmento longo de 249 pb diminui enquanto a amplificação do fragmento curto com 60 pb aumenta em função da quantidade total de cirDNA (Figura 6).
[0220] Em resumo, os resultados deste exemplo permitem pela primeira vez determinar características inovadoras com razão à detecção de cfDNA pela Q-PCR:
  • 1. O tamanho do fragmento amplificado (amplicon) influencia grandemente a quantificação de cfDNAs.
  • 2. A detecção de amplicons menores que 100 pb é o ideal.
  • 3. A determinação de um índice de integridade pode ser utilizada para discriminar entre o cirDNA de um sujeito com mCRC e o cirDNA de um indivíduo saudável e também o DNA genômico.
  • 4. A comparação dos resultados da amplificação por PCR de extratos de cirDNA pode ser realizada com precisão apenas comparando a amplificação de pares de primers que produzem amplicons de tamanhos idênticos.
EXEMPLO 2 DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO PELA ANÁLISE DE Q-PCR DO CIRDNA EXTRAÍDO A PARTIR DE UM MODELO DE XENOENXERTO DE CRC EM CAMUNDONGO MATERIAIS E MÉTODOS a) Linhagens celulares e reagentes
[0221] As células de CRC; SW620 foram mantidas em meio RPMI + 10% de soro bovino fetal. As células SW620 possuem a mutação homozigota G12V no KRAS (GGT para GTT).
b) Modelo de xenoenxerto
[0222] Camundongos nude fêmeas atímicos (de 6-8 semanas de idade) foram xenoenxertados por via subcutânea com 1x106 células cancerosas. Os camundongos foram sacrificados com CO2 três semanas após o enxerto, e o peso dos tumores estavam entre 300-650 mg. O sangue periférico foi coletado em tubos com EDTA e imediatamente (dentro de uma hora) utilizado para a preparação do plasma.
c) Preparação do plasma e soro
[0223] Após a coleta em tubos de 5 mL “BD vacutainer KE35" (Belliver Industrial), as amostras de sangue dos camundongos foram centrifugadas em 2000 rpm a 4 °C, em uma centrífuga Heraeus LR Multifuge com um rotor 4j CR por 10 minutos. Os sobrenadantes foram coletados em tubos Eppendorf de 1,5 ml estéreis e centrifugados a 14000 rpm (16.000 g) a 4 °C durante 10 min. Em seguida, os sobrenadantes foram imediatamente manuseados para a extração de DNA ou armazenado a -80 °C. Não foi encontrada diferença significativa nos ensaios por Q-PCR comparando o plasma fresco isolado ou plasma armazenado. O soro foi preparado usando o mesmo processo de centrifugação de 2 etapas, mas os sangues foram coletados em tubos sem EDTA, e em seguida foram deixados em temperatura ambiente durante uma hora. Os plasmas e soros de camundongos e humanos foram isolados em 3 horas após a coleta.
d) Extração de DNA
[0224] O ctDNA e o DNA genômico de diferentes linhagens de células foram extraídos seguindo o mesmo procedimento. O DNA foi purificado a partir de 200 μL de plasma utilizando o kit de extração “QIAmp DNA mini Blood kit’ (Qiagen, CA) seguindo o protocolo “Blood and body fluid protocol’, com um volume de eluição de 60 μL As amostras foram mantidas a 4 °C durante a preparação do plasma. As amostras de DNA foram congeladas a -20 °C até o momento do uso. Não foi encontrada diferença significativa nos ensaios por Q-PCR comparando o DNA fresco ou armazenado.
e)Quantificação de ctDNA por Q-PCR
[0225] O DNA foi quantificado pelo ensaio de Q-PCR. As amplificações por PCR em tempo real foram realizadas em volume de reação de 25 μL em um instrumento MyiCycler IQ 5IQ ou um instrumento Chromo4 utilizando o sistema óptico IQ5 software 2.0 e o software MJ Opticon Monitor 3 (Bio-Rad). Cada mistura de reação da PCR consistiu de 12,5 μL de mistura para PCR (Bio-Rad Super mix SYBR Green = Taq polimerase, MgCl2), 2,5 μL de cada um dos primers de amplificação (100 pmol/μL), 2,5 μL de água analisada por PCR e 5 μL de DNA extraído. Ciclagem térmica iniciou por uma primeira etapa de desnaturação de 3 min a 95 °C, seguida por 40 ciclos de 95 °C durante 10 segundos e 60 °C durante 30 segundos. As curvas de dissociação (melting curves) foram obtidas a partir de 55 °C até 90 °C com leituras a cada 0,2 °C. Como calibradores para a quantificação, foram utilizadas diluições seriadas de DNA genômico a partir de células HCT116-S e células MC38. As concentrações das amostras foram extrapoladas a partir da curva padrão pelo sistema de software QI 5 Optical 2.0 ou MJ Opticon Monitor 3. O limite de detecção, como a concentração que pode ser detectada com certeza razoável (uma probabilidade de 95%), tal como recomendado nas diretrizes MIQE, foi de 3 cópias/ensaio (21).
[0226] O extrato dom plasma foi ensaiado pela amplificação das mesmas sequências de DNA de 60-409 pb do íntron 2 do KRAS humano conforme utilizado anteriormente para a análise da amostra clínica de CRC. Além disso, cirDNA não tumoral foi testado pelo mesmo método por amplificação com as sequências de DNA de 60-385 pb do íntron 1 do KRAS de camundongo. Os extratos de plasma a partir de camundongos nude controle não xenoenxertados foram também testados pelo uso desse método.
[0227] As figuras 7A e 7B mostram primeiro que uma discriminação significativa entre o cirDNA derivado de tumor e não derivado de tumor pela amplificação de sequências varia entre 200 e 300 pb. Em segundo, a concentração foi encontrada como sendo máxima quando é feita amplificação da região < 100 pb para o cirDNA tumoral, embora uma amplificação máxima foi atingida quando foi amplificada a sequência de 105 pb para o cirDNA não tumoral e 60 pb para o cirDNA tumoral.
[0228] A determinação do índice de integridade do cirDNA (300/60) é, portanto, muito mais baixa para o cirDNA tumoral do que para o cirDNA não tumoral e para o cirDNA do camundongo controle não xenoenxertado; sendo de 0,05 quando comparado com 0,57 e 0,48, respectivamente.
[0229] As Figuras 8A e 8B apresentam a contribuição da quantidade de ctDNA tumoral em comparação com a quantidade de cirDNA total (quantidade cirDNA tumoral + não tumoral) a partir dos dados obtidos no mesmo experimento. Os dados mostram claramente que a proporção de cirDNA tumoral diminuiu acentuadamente a partir da região amplificada de 60250 pb e, em seguida, ficou mais ou menos estabilizada.
[0230] Essas observações confirmam os resultados anteriormente obtidos com a análise de amostras humanas.
[0231] Além disso, os dados evidenciam a diferença entre os perfis de concentração em razão ao comprimento do amplicon entre o cirDNA tumoral vs não-tumoral/controle.
EXEMPLO 3 MÉTODO INTPLEX APLICAÇÃO GERAL DA ANÁLISE INTPLEX
[0232] Os cirDNAs carregam marcas genéticas de células saudáveis e patológicas, ou de agentes infecciosos. Assim, as alterações genéticas são alvos de escolha devido às suas repercussões clínicas. Um dos desafios técnicos em razão aos cirDNAs é o uso destes como uma ferramenta para detectar polimorfismos genéticos, especialmente SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único).
[0233] Os SNPs são as mais abundantes variações genéticas no genoma humano. Eles representam mais de 90% de todas as diferenças entre os indivíduos. É um tipo de polimorfismo de DNA em que dois cromossomos diferem sobre um dado segmento por uma única base. Em dois genomas humanos de forma aleatória, 99,9% das sequências de DNA são idênticas. O 0,1% restante inclui variações de sequências, em que o tipo mais comum é um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Os SNPs são estáveis, muito abundantes e distribuídos de maneira uniforme em todo o genoma. Estas variações estão associadas com a diversidade dentro de uma população ou entre indivíduos, com as diferenças de susceptibilidade a doenças e resposta individual a fármacos. Alguns são responsáveis por perturbações do ciclo celular, que pode resultar na proliferação de células e, finalmente, no desenvolvimento do câncer.
[0234] A maioria dos métodos para a análise dos SNPs estão baseados na possibilidade de desnaturação do DNA em cadeias de fitas simples pelo aquecimento e a renaturação pelo arrefecimento sob condições precisas a uma fita que possui sequência complementar (métodos de PCR). Assim, a PCR permite a identificação e quantificação de uma sequência de DNA através da análise da sua amplificação graças primeiro a uma polimerase especifica, e também a oligonucleotídeos específicos que irão "delimitar” a sequência a ser amplificada.
[0235] A PCR foi previamente adaptada para detectar SNP. Um dos métodos mais simples de PCR para a detecção de SNPs conhecido é a hibridação alelo-específica, que também é conhecida sob o nome de hibridização de oligonucleotídeos alelo-específicos (ASO). Neste método, são utilizadas duas sondas de oligonucleotídeos curtos, que diferem apenas por um nucleotídeo. O DNA estudado é hibridizado separadamente com estas duas sondas marcadas. O DNA genômico irá hibridizar apenas com a sonda que possui a sequência perfeitamente complementar. A técnica de PCR alelo-específica pode ser realizada utilizando um marcador de DNA dupla-fita cuja intensidade de sinal permite a quantificação da amplificação do DNA. A análise por SYBR Green de uma mutação tem a vantagem considerável de simplicidade e rapidez.
[0236] No entanto, a simples análise pelo SYBR Green gera, particularmente para a identificação de mutações pontuais, uma detecção específica não negligenciável que torna esta abordagem não é muito fiável quando o objetivo é um kit clínico ou industrial. Diversos outros métodos foram desenvolvidos para contornar este efeito de não especificidade, mas consistem de métodos de duas ou mais etapas, tornando-os mais demorados.
[0237] Consequentemente, nós concebemos e desenvolvemos um método analítico que leva a uma conclusão qualitativa sobre a presença ou não de um polimorfismo genético. A determinação da positividade do estado mutacional de um gene será estabelecida por meio do cálculo da percentagem de cirDNA mutado em razão ao cirDNA não mutado. Para cada mutação, será possível determinar a percentagem de "não especificidade”, denominada de "limiar”, acima do qual será estabelecido sem ambiguidade que o gene contém um polimorfismo.
[0238] No entanto, a utilização de uma amplificação denominada de "referência” pode ser perigosa para a análise de cirDNA, pois nossos resultados demonstraram que a quantificação de DNA amplificado neste caso varia muito significativamente em função do comprimento de fragmento amplificado (o amplicon). Assim, tendo em mente nossos resultados, no método IntPlex vamos comparar a amplificação de um amplicon inferior a 100 pb, que contém a mutação a ser detectada, e a amplificação de um amplicon de tamanho idêntico.
[0239] A fim de limitar tanto quanto possível o potencial disparidade nas sequências incluídas no cirDNA, o amplicon controle estará localizado próximo da sequência amplificada. A quantificação do amplicon de referência também permitirá a determinação/confirmação da quantidade específica total de cirDNA.
[0240] Uma vez que os mononucleossomos têm um tamanho que varia de 180 e 220 pb, a razão entre a quantidade de um amplicon maior que 220 pb e a quantidade de um amplicon inferior a 180 pb, corresponde convencionalmente a um grau de integridade ou de apoptose. Nós desenhamos o IntPlex de modo que tais extremidades dos amplicons mutados e de controle estejam separadas por uma distância mínima de 220 pb.
[0241] O índice de integridade (amplificação de um fragmento longo/amplificação de um fragmento curto) pode ser mais otimizado para discriminar de modo geral os indivíduos saudáveis de indivíduos com uma patologia (por exemplo, câncer), pela diminuição do tamanho do fragmento longo para um tamanho > que o fragmento curto, e > 180 pb.
[0242] A Figura 9 exibe um exemplo do uso do método IntPlex para a análise de SNPs. Neste exemplo, o Primer B1 inclui em sua extremidade 3' a alteração de base em razão ao estado "tipo selvagem”. A amplificação com os primers A1 e A2 produz um fragmento de 60 pb. O fragmento mutado é amplificado pelo primers B1 e B2. A amplificação utilizando os primers A1 e B2 irá produzir um fragmento de 300 pb.
[0243] Consequentemente, a invenção consiste num método para a análise de cfDNA que irá integrar, com base no esquema mostrado como um exemplo:
  • -A detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação);
  • -A quantificação específica de cirDNA;
  • -A avaliação da taxa de apoptose; Pelos seguintes cálculos no esquema da Figura 9:
  • -A detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação);
  • -% B1B2/A1A2 maior do que um limiar específico;
  • -com B1B2 definido como a sequência que contém a polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação).
[0244] A quantificação específica do cirDNA total: quantidade. A1A2.
[0245] A quantificação específica do cirDNA total: quantidade B1B2.
[0246] A avaliação da taxa de apoptose por meio da determinação de fragmentação de cirDNA em termos de %: B1B2 ou A1A2/A1B2.
[0247] Se modelarmos o sistema integrado considerando que X e Y é a distância no DNA entre as extremidades 5' dos primers, o sistema integrado IntPlex pode ser modelado da seguinte forma: (A1A2) = (B1B2) = X
(A1B2) = Y
com X < 180 e Y > X,
Idealmente: 50 < X < 100 e 200 < Y < 350.
[0248] Este modo de identificação da presença ou não de uma mutação genética é muito conveniente uma vez que é muito rápido e não muito dispendioso. Além disso, permite dispensar técnicas sofisticadas como o sequenciamento. Por outro lado, a sequenciamento leva a uma resposta sem possíveis dúvidas (mas por erros de contaminação ou de manutenção).
[0249] O cirDNA é constituído de DNA de tumor e de origem não tumoral. Muito pouco se sabe sobre a contribuição respectiva desses dois tipos de cirDNA durante a progressão tumoral. O IntPlex deve permitir avançar nesta questão e essa informação irá trazer benefícios valiosos de diagnóstico e/ou prognóstico. De fato, a quantidade de DNA mutado, e, portanto DNA do tumor, pode ser ligada por meio deste método diretamente à quantidade de DNA não tumoral. O cálculo desta percentagem pode ser correlacionado tanto com a quantidade total de cirDNA liberado e com a progressão ou regressão do tumor.
EXEMPLO 4 CONTRIBUIÇÃO DA COMBINAÇÃO “IDENTIFICAÇÃO DE MUTAÇÃO/QUANTIFICAÇÃO/ÍNDICE DE INTEGRIDADE” PARA O DIAGNÓSTICO DO CÂNCER
[0250] Estes três parâmetros diagnósticos podem ser estudados separadamente, mas uma análise multiplexada mais sensível (em particular com o auxílio de softwares de bioinformática) irá aumentar o seu valor diagnóstico para o acompanhamento de pacientes com câncer e o valor teragnóstico destes para a escolha terapêutica individualizada (Figura 10).
[0251] A contribuição destes três fatores pode ser modelada usando um algoritmo que permitirá avaliar o risco incorrido para cada paciente de câncer individual.
[0252] Como um simples exemplo, podemos calcular um fator de diagnóstico como = ([Mi + 1) x (Q + A).
[0253] Em que M, Q e A são fatores de risco determinados pela detecção de uma mutação, quantificando de cirDNA tumoral e avaliação do índice apoptótico, respectivamente.
EXEMPLO 5 EXEMPLOS DE APLICAÇÃO DA TECNOLOGIA INTPLEX 1) DETECÇÃO DE MUTAÇÕES KRAS EM AMOSTRAS DE SANGUE HUMANO NO CONTEXTO DE DIAGNÓSTICO DO CÂNCER
[0254] O gene RAS (KRAS e NRAS) está sujeito a mutações somáticas em mais de 50% dos tumores do cólon, e em cerca de 50% dos adenomas maiores do que 1 cm de diâmetro. Por outro lado, ele muito raramente está mutado em adenomas pequenos (menos de 10%). As mutações, geralmente SNPs, não têm implicações sobre o HRAS, mas afetam os códons 12 e 13 do KRAS e 12, 13 e 61 do NRAS. O papel exato destas mutações não é conhecido. Elas podem transformar um pequeno adenoma em um grande adenoma displásico, ou podem estar presentes desde o início em células muito proliferativas. As mutações de KRAS estão presentes em 30 a 40% dos tumores colorretais.
[0255] Assim, há uma forte necessidade de um ensaio simples e rápido para detectar as mutações do tipo SNP n KRAS a fim de orientar individualmente os pacientes com CRC para uma terapia anti-EGFR direcionada (6). De fato, a atividade de inibidores potentes específicos de EGFR é bloqueada quando as células tumorais transportam um gene KRAS mutado. Durante a reunião anual da ASCO em 2008 chegou-se a um consenso geral defendendo que todos os pacientes elegíveis para as terapias direcionadas ao EGFR devem primeiramente serem testados quanto a presença de mutações KRAS antes do início da terapia de primeira linha (6).
[0256] O sequenciamento de DNA obtido a partir de secções tumorais representa no momento o "padrão ouro” para a identificação de SNPs. Este método é realizado após a exérese, requer a presença de um laboratório de anatomopatologia e um laboratório de análise, e é um método demorado e caro. O cirDNA poderia ser uma ferramenta não invasiva e de grande poder diagnóstico se um método específico de análise puder permitir a quantificação e detecção de mutações de uma forma simples e rigorosa, particularmente dos SNPs no KRAS no contexto teragnóstico dos tratamentos anti-EGFR.
[0257] Dessa forma, nós adaptamos a metodologia IntPlex para a detecção mais específica dos SNPs no KRAS, no contexto teragnóstico de tratamento direcionado no CRC. Isso traria uma resposta à necessidade clínica urgente sobre o uso de potentes inibidores específicos do EGFR e o estado mutacional de KRAS.
[0258] Neste sistema a mutação está localizada na extremidade 3', o que leva a dois modelos possíveis: O IntPlex convencional e IntPlex reverso. Conforme descrito antes, o sistema IntPlex inclui dois pares de primers (Figura 9) que amplificam fragmentos de DNA de um tamanho menor do que 100 pb. Esta amplificação dá fragmentos que estão 300 pb distantes de uma extremidade para a outra. Este desenho inclui um par de primers para a amplificação da sequência "tipo selvagem” que constitui a amplificação de referência ou padrão (A1A2) e outro par de primers para amplificar a sequência mutada (B1B2) (Figura 4). Será possível determinar, pela utilização do amplicon de "referência” exatamente com o mesmo tamanho e com uma sequência próxima à outra, a percentagem de DNA mutado pelo do cálculo das relações: (A1G12Vrev16 / B1B2) e (G12Vconv19 / A1A2; nas figuras os nomes dos primers são diferentes) (vide a Figura 11 e A), por exemplo, para os sistemas KRAS “reverso” (Krev) e KRAS “convencional” (Kconv), respectivamente. Os nosso resultados anteriores demonstram a enorme importância do tamanho dos fragmentos amplificados gerados pela Q-PCR utilizando uma amostra de cirDNA. Além disso, a análise por Q-PCR dos fragmentos obtidos com os primers A1B2 (tamanho = 300 pb) nos permitiu determinar o índice de integridade (Índice de Integridade do DNA (DII)) (razão entre os fragmentos longos e curtos). O DII indica o estado de fragmentação da cirDNA. O índice de integridade corresponde ao inverso da taxa de apoptose (denominado também como o índice de fragmentação do ctDNA).
a)Projeto dos sistemas Q-PCR IntPlex
[0259] O IntPlex convencional (Figura 11 A) usa o primer G12V normalmente utilizado na literatura para a detecção da mutação G12V do KRAS e este primer é um oligonucleotídeo sense com a mutação localizada na extremidade 3' desse gene. O IntPlex reverso (Figura 11B) usa o primer antisense com a mutação na extremidade 3'. Todos os primers destes dois sistemas foram selecionados pelo software (Material e Métodos). Os sistemas IntPlex Kconv e Krev foram aplicados para detectar a mutação G12V no KRAS. Os primers que detectam especificamente esta mutação foram desenhados para cobrir a área mutada do gene KRAS (Figuras 11 A - 11 B).
[0260] O primer sense é convencionalmente definido como contendo uma sequência incluída na fita codificante do DNA. Os sistemas IntPlex convencional e reverso se diferenciam pela orientação sense ou antisense do primer direcionado para a mutação.
b)Ilustração da importância do parâmetro de tamanho para a quantificação do cirDNA.
[0261] Neste experimento, foram testados dois sistemas IntPlex Krev e Kconv usando o cirDNA isolado a partir de amostras de plasma de camundongos xenoenxertados. Sequências de primers oligonucleotídeos e de oligonucleotídeos bloqueadores quimicamente modificados desenvolvidos especificamente para o sistema IntPlex na demonstração de sua eficácia e sensibilidade, ou a detecção da presença das mutações G12V KRAS ou V600E BRAF são apresentadas na Tabela 2. Neste exemplo foi utilizado AS ou Q-PCR usando o método bloqueador (ASB Q-PCR). As mutações BRAF e KRAS foram detectadas utilizando os sistemas IntPlex “convencional” e "Inverso”.
Figure img0002
Figure img0003
[0262] Nossos resultados deram perfis idênticos com Krev e Kconv (Figuras 12 e 13).
[0263] As Figuras 12 e 13 mostram claramente que a determinação da concentração de cirDNA é equivalente quando o amplicon é do mesmo tamanho, independentemente das sequências-alvo. Além disso, os resultados indicam que o valor obtido para os amplicons de 67 pb (A1A2 e B1B2) é 2,2 vezes maior e 1,4 vezes maior do que o valor obtido para o amplicon de 189 pb (KrasH2) e 7,9 vezes e 9,0 vezes maior quando comparado com os valores para os amplicons de 312 e 320 pb (A1B2) do Kconv e Krev, respectivamente. Assim, a análise cruzada desses resultados confirma a acurácia da quantificação de cirDNA pela Q-PCR com os sistemas de primers que geram fragmentos amplificados com tamanhos idênticos, e, consequentemente, valida os dois sistemas de análise Krev e Kconv.
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[0264] O índice de integridade (inversamente em razão à taxa de apoptose) corresponde à razão entre a concentração de fragmentos de DNA curtos (menor do que 180 pb) e a concentração de fragmentos de DNA longos (maiores que 220 pb), ou seja, A1B2/B1B2 para Krev e A1B2/A1A2 para Kconv. A taxa de apoptose permite uma estimativa da percentagem de DNA de origem apoptótica e originada da necrose e, desse modo, determina a origem do cirDNA. Com o sistema Krev obtivemos uma taxa de apoptose de 0,78 para o DNA genômico da placenta (um DNA que não é liberado e não está mutada), e de 2,00 para o DNA mutado de culturas de células de CRC; SW620. Com o sistema Kconv obtivemos uma taxa de 1,28 para DNA da placenta e de 1,92 para o DNA de células SW620 (Tabela 3).
[0265] Nós também calculamos a taxa de apoptose (equivalente ao inverso do índice de integridade) do cirDNA isolado a partir de amostras plasmáticas de camundongos xenoenxertados (com células SW620 que produzem tumores), utilizando os dois sistemas, Krev e Kconv. Com Krev a taxa de apoptose obtida foi de 8,33 e com Kconv foi de 8,34. A taxa de apoptose do cirDNA é maior (cerca de 8 e 4 vezes) do que a do DNA genômico (DNA de placenta e DNA de células SW620, respectivamente). A taxa de apoptose pode ser diferente quando comparamos as taxas de DNA da placenta e das células por serem de origens diferentes, tecido (placenta) e células, portanto, são métodos de amostragem diferentes.
[0266] De forma surpreendente, as taxas de apoptose para a mesma amostra são muito semelhantes com os dois sistemas, Krev e Kconv, destacando a robustez desta medição. Além da comparação direta entre a amplificação de duas sequências de tamanho idêntico, esta robustez vem da extrema proximidade de tais sequências. Apesar de o mesmo tamanho, uma sequência de "referência” que está distante da sequência mutada (por exemplo, localizada em outro cromossomo) não permitiria um nível semelhante de precisão.
2) Detecção de mutações BRAF em amostras de sangue
[0267] O gene BRAF está sujeito a mutações somáticas em mais de 14% dos tumores CRC. A mutação V600E representa mais de 90% das mutações no BRAF. Tal como para as mutações KRAS, as mutações BRAF tornam ineficaz o tratamento com anti-EGFR. A avaliação da presença (ou não) desta mutação é, desse modo, necessária no momento (ou mais precisamente antes) do tratamento de um paciente com CRC metastático. Consequentemente, concebemos e desenvolvemos um sistema IntPlex convencional (mutação na extremidade 3' do primer B1) para a detecção de mutações BRAF em cirDNA (Figura 14).
[0268] As amostras de plasma de um camundongo xenoenxertado com células HT29 humanas de CRC que possuem no seu genoma a mutação BRAF V600E foram analisadas com este sistema IntPlex (Figura 15).
[0269] A concentração média do amplicon curto de referência (A1A2) foi de 31,5 ng/ml e, desse modo, estava cerca de 8 vezes mais elevada do que a concentração do amplicon longo (4,2 ng/ml) no cirDNA da amostra S4 HT29 (figura 14). Da mesma forma, a concentração do fragmento obtido com o par de primers humano WT BRAF foi de 15 ng/ml e foi cerca de 2 vezes mais baixa do que a concentração do amplicon BRAF curto. Estes resultados confirmam claramente que objetivando uma sequência de DNA curta (<100 pb) produz-se uma amplificação mais importante de extratos de cirDNA do que se tivermos como alvo sequências maiores (149 e 288 pb). A percentagem de DNA humano mutado em razão à sequência WT de referência (A1A2) foi de 77,5%. Teoricamente deveria ter sido de 50% quando se leva em consideração a heterozigocidade da mutação BRAF nesta linhagem de células HT29 (apenas um dos dois alelos do par de cromossomos tem a mutação). A fim de avaliar a sensibilidade do sistema de IntPlex a amostra S4 de DNA a partir do plasma de camundongos xenoenxertados foi diluída 1/10 em uma amostra de DNA genômico de placenta (Figura 15). Os resultados resumidos na Figura 15 indicam que o DNA mutado corresponde a 6,95% do DNA não mutado e este é aproximadamente 10 vezes menor do que o obtido com a amostra S4 não diluída. A amplificação da sequência de comprimento longo é pouco menor, mas significativamente, do que a da sequência de referência (82,5%).
[0270] Os resultados (apresentados como percentagens das concentrações obtidas pela amplificação da sequência de referência A1A2) destes dois experimentos mostram a importância de se levar em conta com precisão o tamanho dos fragmentos amplificados e a validade do sistema IntPlex (Figuras 15 e 16). De fato, o cálculo da percentagem de cirDNA mutado pode ser dramaticamente diferente em função do sistema de amplificação utilizado como referência: 77,5% quando se utiliza uma referência do mesmo tamanho (101 pb) e 56,7% quando se utiliza uma referência de 288 pb. A descoberta de que quando cirDNA é diluído em DNA genômico (1/10) a percentagem de cirDNA é de 6,95% com a referência do mesmo tamanho, e de 8,45% com a referência ao tamanho de 288 pb, mostra que o parâmetro de tamanho é menos importante quando o cirDNA é diluído em DNA genômico.
[0271] A taxa de apoptose varia consideravelmente em função da quantidade de cirDNA porque corresponde a 7,41 no caso do cirDNA não diluído e 1,21 no caso de cirDNA diluído (ou seja, mais do que 6 vezes maior). Essa diferença é importante em muitos aspectos, e é característica de cirDNAs.
3) DESCRIÇÃO DA UTILIZAÇÃO DO MÉTODO INTPLEX PARA A ANÁLISE DE CIRDNA EM AMOSTRAS DE PLASMA HUMANO
[0272] As mutações SNP do KRAS (G12V, G12D, G12C, G13D e G12A) e a mutação V600E do BRAF são as causas de aproximadamente 82% dos casos esporádicos de CRCs mutados (ou seja, 75% de todos os CRCs). Estas mutações estão presentes em 94% dos pacientes, os quais as mutações KRAS e BRAF estão associadas com o CRC e que não respondem às terapias anti-EGFR (cerca de 50% de todos os casos de CRCs).
[0273] Nós adaptamos a tecnologia IntPlex para a detecção dessas mutações em extratos de cirDNA. As sequências dos primers oligonucleotídeos e dos oligonucleotídeos bloqueadores quimicamente modificados especificamente desenvolvidos para o sistema IntPlex para detectar a presença das mutações ditas acima estão apresentadas na Tabela 4. Neste exemplo foi utilizado AS Q-PCR usando o método bloqueador (ASB Q-PCR). A mutação BRAF e as 6 mutações KRAS foram detectadas utilizando os sistemas IntPlex “convencional” e "Inverso” IntPlex ASB Q-PCR systems, respectivamente.
Figure img0005
[0274] Como um exemplo, a Figura 17 exibe os resultados obtidos com as amostras plasmáticas de um paciente com CRC que, aparentemente, carrega a mutação G12V KRAS (CRC1), um paciente com CRC que aparentemente não tem essa mutação (CRC2) e um indivíduo saudável (HHP1).
[0275] No CRC1, 68% dos fragmentos de cirDNA carregam a mutação G12V KRAS, enquanto a porcentagem para as outras mutações KRAS não chega a 1,2% para este paciente.
[0276] No CRC2, 0 a 6,6% dos fragmentos de cirDNA parecem carregar mutações BRAF ou KRAS.
[0277] No HHP1, 0 a 3,2 % dos fragmentos de cirDNA parecem carregar mutações BRAF ou KRAS.
[0278] Os dados CRC2 mostram uma significativa % de cirDNA aparentemente mutado mas o nível aparece o mesmo para as 4 mutações. Dado o fato de que, com a exceção de casos muito raros, estas mutações são mutuamente exclusivas, o limiar da % de cirDNA mutado para definir especificamente o estado mutacional não é atingido no caso do CRC2. Assim, os valores obtidos para a quantificação de cirDNA mutado no plasma do CRC2 correspondem a um efeito não específico. O limiar de positividade pode ser fixado aqui em, pelo menos, 7%, mas um estudo utilizando um número significativo de amostras é necessário, a fim de determinar este limiar para cada mutação. Além disso, um algoritmo pode ser utilizado para integrar o limiar dentro de uma amostra a fim de estimar a discriminação da percentagem de uma mutação em razão à percentagem de outras. No entanto, esta figura mostra que apenas o CRC1 carrega uma mutação (G12V).
[0279] Surpreendentemente, estes e outros resultados em várias amostras clínicas (não mostrados) indicam que a proporção de fragmentos de cirDNA mutado parece ser extremamente elevada (entre 17% e 70%) quando comparados com os resultados descritos na literatura (em média 1% e nunca superior a 10%) (5, 7). Isto ilustra a capacidade de nosso método em produzir uma análise sensível e específica de cirDNA tumoral e de seu caráter inovador.
[0280] Como consequência o paciente CRC1 em contraste com o paciente CRC2 infelizmente não pode ser tratado com inibidor de EGFR.
[0281] Assim, este método IntPlex adaptado, que faz parte da presente invenção, parece ser um método simples para a análise de cirDNAs com base no conhecimento preciso do tamanho de sua população. Ele depende de uma escolha precisa de primers oligonucleotídicos, que permitem a análise direta em uma única etapa de Q-PCR. Três conjuntos de dados independentes a partir da análise de ácidos nucleicos circulantes (NA) (1. Detecção de mutação(ões), 2. Quantificação exata da concentração de cirDNA tumoral e total e 3. Estimativa de uma razão em razão à origem apoptótica do cirDNA) podem ser integrados no mesmo teste.
EXEMPLO 6 PERFIS DE CONCENTRAÇÃO DE CIRDNA PARA SUJEITOS HHP E CRC
[0282] As concentrações de cirDNA foram determinadas a partir de amostras plasmáticas de três pacientes com CRC e três indivíduos saudáveis por Q-PCR utilizando conjuntos de primers que amplificam um fragmento de 60, 73, 101, 145, 185, 249, 300, 357, 409 pb, conforme descrito anteriormente. Os perfis de concentração obtidos são específicos tanto para sujeitos com CRC como para todos os sujeitos saudáveis. O valor médio máximo foi de 6,19 e 943,59 ng/ml no plasma para sujeitos HHP e CRC, respectivamente. A maior discriminação pelo cálculo da razão do índice de integridade HHP/CRC foi obtida quando se utilizou a razão 300/60 e 300/73 (8,18 e 10,07, respectivamente), confirmando os dados anteriores. A razão 409/60, aparentemente, é a mais elevada, mas foi arbitrariamente não considerada uma vez que a concentração obtida pela amplificação do fragmento 409 no plasma CRC estava próximo do limiar de sensibilidade da análise. Ao subtrair a concentração obtida pela amplificação de um tamanho de fragmento partir do seguinte, em razão ao aumento de tamanho, a % da quantidade de cirDNA dentro da faixa de 60-409 pb entre ambos os tamanhos de amplicon sucessivos pode ser estimada (dado o Cn como a concentração de ctDNA quando se detecta um fragmento amplificado de tamanho n; e Cn+1 a concentração cirDNA quando se detecta o fragmento amplificado de tamanho maior aproximado na série de tamanho de fragmento amplificado crescente, a concentração existente entre ambos tamanhos é calculada como Cn - Cn+1).
[0283] Os valores expressos em % de ctDNA vs fração de comprimento de ctDNA (faixa) são apresentados na Figura 18 em histogramas. Os dados sugerem que os plasmas de CRC e HHP apresentam o mesmo perfil de quantidade de cirDNA, nas faixas de 60-73, 73-101 e 101-145 pb, com um nível notavelmente mais elevado para os plasmas CRC na faixa de 73-101. Em contraste, com a ausência de cirDNA de HHP a partir das faixas 145-185 a 357-409 pb, o nível de cirDNA é significativamente detectado, diminuindo de 9 a 2%. Uma alta proporção (35%) foi encontrada para o cirDNA de HHP de tamanho superior a 409 pb, em contraste com o nível muito baixo determinado para o cirDNA de CRC (2%).
[0284] Claramente, estes dados mostram a discriminação elevada entre plasmas de HHP e CRC, resultado que não eram esperados para os técnicos do assunto no momento.
EXEMPLO 7 PARÂMETROS PARA A FUNÇÃO LOGÍSTICA PROPOSTA EM UM MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO OU O PROGNÓSTICO DE UM ESTADO PATOLÓGICO OU FISIOLÓGICO, TAL COMO A PRESENÇA DE UM TUMOR OU A PROGRESSÃO DE UM TUMOR EM UM PACIENTE, ESTANDO DITO ESTADO PATOLÓGICO OU FISIOLÓGICO ASSOCIADO A UM MARCADOR GÊNICO SNP (OU SEJA, A PRESENÇA DE UMA MUTAÇÃO ASSOCIADO A UM CÂNCER)
[0285] Valores que podem ser combinados por meio de uma função logística, incluindo pelo menos dois biomarcadores a fim de se obter um valor final que é relevante do ponto de vista diagnóstico ou prognóstico.
[0286] (Vide a Figura 9).
[0287] (A1A2) = (B1B2) = X
(A1B2) = Y
com X < 180 e Y > X,
Idealmente: 50<X<100 e 200<Y<350
[0288] Onde:
  • - B1B2 é definido como a sequência que contém a polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação).
  • - A1A2 é definido como a sequência que não contém um polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação) e está localizada sobre a mesma fita de DNA;
  • - Os números correspondem ao número de nucleotídeos da sequência amplificada (amplicon);
  • - X e Y são as distâncias no DNA genômico entre as extremidades 5' dos primers utilizados para amplificar o amplicon curto e longo, respectivamente.
[0289] Estes biomarcadores permitem:
1. A detecção qualitativa da presença de um polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação) pela determinação da % B1B2/A1A2 em um nível mais elevado do que um limiar específico, ou de cada conjunto de primers de polimorfismos genéticos.
[0290] Sendo B1B2 definido como a sequência que contém a polimorfismo genético (por exemplo, SNP ou mutação).
  • 2. A quantificação específica de cirDNA total e tumoral: quantidade de A1A2 e B1B2, respectivamente.
  • 3. A avaliação do índice de fragmentação do DNA (na presente invenção, as expressões "taxa de apoptose”, "índice de fragmentação do DNA” e "índice de integridade” têm o mesmo significado):% B1B2 ou A1A2/A1B2.
[0291] Sendo aplicável para todos os ácidos nucleicos circulantes (DNA, RNA, siRNA, miRNA ...).
- A utilização de ácido nucleico de comprimento específico, por exemplo, < 180 pb e idealmente < 100 pb, como padrão de ácido nucleico para a calibração da Q-PCR.
EXEMPLO 8 DEMONSTRAÇÃO DE QUE CTDNAS DE TAMANHOS INFERIORES A 100 PB SÃO DE PROPORÇÕES SIGNIFICATIVAS E QUE A HIPÓTESE ANTERIORMENTE ESTABELECIDA COM BASE NA ANÁLISE POR ELETROFORESE ESTÁ CORRETA
[0292] Eletroforese em gel de agarose de 20 μg de ctDNA extraídos de dois pacientes com CRC (CRC021 e CRC019). O padrão de tamanho (ladder) foi feito com diversos fragmentos 100 pd de DNA. Porções do gel foram removidos imediatamente após o final da corrida. Para CRC021 uma porção do gel correspondente a 10-440 pb foram removidos e submetidos a Q-PCR. Para o CRC021 uma porção do gel correspondente a 30-130 e 130-500 pb foram removidos e submetidos a Q-PCR. As condições da Q-PCR foram conforme descrito anteriormente para a quantificação de ctDNA; detectando os amplicons de 73 pb, 145 pb e 300 pb do íntron KRAS, conforme descrito anteriormente.
[0293] No plasma do CRC021, 47% de ctDNA total foram encontrados entre 73 e 145 pb, enquanto 36% e 17% foram encontrados nas faixas de 145-300 e > 300 pb, respectivamente. No plasma do CRC019, 61% de ctDNA total foram encontrados entre 73 e 145 pb, enquanto 35% e 5% foram encontrados nas faixas de 145-300 e > 300 pb, respectivamente. Na porção do gel entre 30 e 130 pb de 57% de ctDNA total foram detectados (vide as figuras 19A e 19B).
[0294] Estes dados provam que o ctDNA de tamanho inferior a 180 pb e, particularmente, inferior a 100 pb existe em quantidades significativas. Assim, a eletroforese não é um método de análise apropriado para apreciar o tamanho de ctDNAs. Esta é a primeira demonstração de que a hipótese anteriormente estabelecida baseada na análise por eletroforese demonstrando que aparentemente os ctDNA são de tamanho superiores a 180 pb não está correta.
[0295] Nós postulamos a hipótese de que fragmentos de ctDNA de tamanhos inferiores a 180 pb não são visíveis após a eletroforese e marcação com corante fluorescente, pois eles estão abaixo do limiar de sinal devido a:
  • 1. fragmentos de ctDNA abaixo de 180 pb podem variar de um nucleotídeo para outro levando a baixa concentração naquele tamanho preciso;
  • 2. o corante fluorescente, tal como o verde Sybre, têm um nível máximo de intercalação (ou seja, uma molécula de verde Sybre a cada 23 nucleotídeos) que limita drasticamente a intensidade do sinal no ctDNA de tamanho reduzido. Por exemplo, um fragmento de DNA de 69 pb tem 3 vezes menos sinal do que um de 207 pb.
EXEMPLO 9 DII, CONFORME DETERMINADO A PARTIR DA CONCENTRAÇÃO DE CTDNA COM CTDNAS DE TAMANHOS INFERIORES A 100 PB, TAL COMO 60 PB, DISCRIMINA DE FORMA SIGNIFICATIVA INDIVÍDUOS SAUDÁVEIS DE INDIVÍDUOS COM CRC
[0296] Comparação dos valores DII (Tabela 5) a partir do DNA genômico, e ctDNA a partir do plasma de camundongos (xenoenxertados e não xenoenxertados) e (vide a figura 20) a partir de plasmas humanos (saudáveis e com CRC). O DII foi estimado pela razão entre a concentração obtida que tinha por objetivo uma sequência de 300 pb e uma sequência de 60 pb na região KRAS. O valor médio do DII de HHP (n = 16) é significativamente diferente do valor médio do DII de CRC (n = 12) (média de 0,565 e 0,122, respectivamente, p <0,001). Uma diferença semelhante foi observada no modelo animal onde a média do DII é de 0,447 para o ctDNA plasmático de saudáveis (n = 9), 0,645 para o ctDNA não derivados de tumor (n = 9); e de 0,027 para o ctDNA derivado de tumor (n = 9).
[0297] Isto apoia a descoberta da detecção de amplicons de tamanhos inferiores a 100 pb, em especial, 60 pb, conforme usado aqui para a determinação de um DII.
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EXEMPLO 10 DII CALCULADO COM OS PRIMERS CONCEBIDOS DA INVENÇÃO E EM DIVERSAS REGIÕES DO GENE EXIBE ALTA PRECISÃO E BAIXA VARIABILIDADE
[0298] Existem duas configurações sobre o desenho dos primers utilizados no método multiplex de acordo com a invenção: conv e inv. Nós determinado o DII a partir do plasma de um paciente com de CRC utilizando a configuração conv e inv na região KRAS e BRAF (contendo a mutação nos hot spots do 2° éxon e o V600E, respectivamente), a configuração conv no 2° íntron do gene KRAS (BRAF conv). Nós comparamos estes DII com os calculados na região distante dentro do mesmo gene (KRASconv longo/KRASint curto, representando a razão entre a concentração obtida com a utilização do par de primers que leva a amplificação da sequência longa tal como utilizado no KRAS conv; com a concentração obtida com o uso do par de primers que leva a amplificação da sequência curta tal como utilizado no KRAS int) e com aquele calculado na região distante de dois genes diferentes (KRAS conv longo/BRAF inv curto, representando a razão entre a concentração obtida com a utilização do par de primers que leva a amplificação da sequência longa como a utilizada na KRAS conv e a concentração obtida com a utilização do par de primers que leva a amplificação da sequência curta, tal como usado no BRAF inv).
[0299] Primeiro, os dados demonstram claramente a alta precisão e a baixa variabilidade do valor DII calculado em nossa invenção seja qual for a região do gene utilizada, devido ao valor DII variar de 0,077 a 0,094 (coeficiente de corrazão = 9,1%) (vide a figura 21).
[0300] Em segundo lugar, os valores obtido com a utilização de pares de primers que objetivam sequências de DNA distantes, tanto dentro do mesmo gene quanto em genes diferentes, são diferentes e mais precisamente significativamente mais baixos (0,061 e 0,048, respectivamente), do que aqueles encontrados utilizando os primers desenhados da presente invenção.
[0301] O coeficiente de corrazão máxima do valor a partir da análise de Q-PCR e extração do DNA, sob as condições experimentais descritas anteriormente, é de 23% (n = 12).
EXEMPLO 11 DETERMINAÇÃO DE DIVERSOS ÍNDICES ENVOLVENDO A QUANTIDADE DO CTDNA COM A FRAÇÃO DE TAMANHO INFERIOR A 100 PB
[0302] Diversos índices foram determinados a partir dos dados apresentados na Figura 18. Estes índices foram calculados a partir de diferentes frações de tamanho (vide a Tabela 6).
Figure img0007
% < 100 pb; porcentagem de fragmentos de ctDNA com tamanho inferior a 100 pb (mais precisamente com frações de 60 a 100 pb);
DII 300/60; razão entre a concentração de fragmentos de ctDNA de tamanhos maiores que 300 pb e a concentração de ctDNA total;
SFR 409/<100, razão entre a concentração de fragmentos de ctDNA de tamanhos maiores que 409 pb e a concentração de frações entre 60-100 pb;
SFR <100/145-409, razão entre a concentração de fragmentos de ctDNA da fração de 60-100 pb e a concentração de fragmentos de ctDNA da fração de 145-409 pb.
[0303] Os dados mostram claramente que a determinação da concentração da fração de ctDNA abaixo 100 pb é de grande interesse e torna possível em grande parte discriminar entre o plasma de indivíduos saudáveis e pacientes com CRC. Em segundo lugar, a utilização da razão da fração de tamanho de ctDNA, tal como a SFR, contribui muito para este objetivo.
EXEMPLO 12 DETERMINAÇÃO DE DIVERSOS PARÂMETROS, TAL COMO A SFR, INDICATIVOS DO PADRÃO DE TAMANHO DO FRAGMENTO DE CTDNA
[0304] Nós estudamos o padrão de tamanho do ctDNA mutado em comparação com o padrão de tamanho de ctDNA não mutado. Para atingir este objetivo foi utilizado um conjunto de primers amplificando o tamanho alvo dentro da mesma região. Este conjunto gera a amplificação de sequências na região de hot spot do gene KRAS (12° e 13° códons do éxon 2), onde o primer direto para cada par de primers é concebido especificamente para uma mutação pontual desta região, ou para a sequência tipo selvagem (vide a Tabela 7 a seguir e as Figuras 22A-22E). Estes conjuntos foram cuidadosamente selecionados para promover a alta sensibilidade e alta especificidade, seja para a quantificação de sequências alvo mutadas ou não mutadas (vide a Tabela 8 abaixo).
Figure img0008
[0305] Os primers utilizados para a realização deste experimento são os seguintes: (vide a Tabela 8):
Figure img0009
Figure img0010
[0306] Em seguida determinou-se a % de ctDNA mutado pela determinação da concentração utilizando um conjunto de primers que amplifica o alvo mais curto (82 pb) a partir da concentração de ctDNA total (sendo a soma da concentração do do ctDNA mutado e não mutado).
[0307] A determinação de diversos parâmetros indicativos do padrão de tamanho do fragmento de ctDNA, uma base de dados, são apresentados na tabela (Tabela 7) ou plotados em histogramas (vide as Figura 22A-22E). Fração de tamanho é expressa em % para o maior valor obtido em cada conjunto. A proporção de fragmentos de ctDNA < 138 pb ou 145 pb foi determinada subtraindo a concentração determinada utilizando-se o conjunto de primers que amplifica o alvo de 82 pb pela concentração determinada utilizando o conjunto de primers que amplifica o alvo de 138 pb. Quando o valor é negativo os dados são arbitrariamente expressos como 0. A proporção de fragmentos ctDNA > 300 pb foi determinada utilizando o conjunto de primers que amplifica o alvo de 300 pb. O índice de integridade do ctDNA (DII) foi determinado calculando a razão da concentração determinada utilizando o conjunto de primers que amplifica o alvo de 300 pb e a concentração determinada utilizando o conjunto de primers que amplifica o alvo de 82 pb. A proporção da fração de tamanho (SFR) foi determinada calculando a razão entre a concentração de fragmentos <138 ou 145 pb, e a concentração de fragmentos entre 138-145 pb e 300 pb. Número sob dos histogramas: 4,5,6,14, plasmas de pacientes com CRC com status mutacional positivo para KRAS (CRC4-6 e CRC 14). H, indivíduos saudáveis (n = 9).
[0308] A proporção de diferentes frações de tamanhos de ctDNA, o índice de integridade e uma proporção da fração de tamanho (denominada SFR) dos plasmas humanos a partir de indivíduos saudáveis e de quatro pacientes com CRC com uma mutação pontual em KRAS estão resumidos na figura. Os ctDNAs mutantes são na sua maioria compostos de fragmentos < 138 pb, enquanto que os ctDNAs não mutantes são na sua maioria constituídos de fragmentos na faixa de tamanho de 138-300 pb e muito poucos fragmentos < 138 pb. Alternativamente, o ctDNA de indivíduos saudáveis parece ser claramente constituído por fragmentos < 138 pb e > 300 pb, sem nenhum fragmento aparente entre 138 e 300 pb.
[0309] Os dados mostram claramente que a análise da fração de tamanho do ctDNA, especialmente pela determinação da proporção da fração de tamanho, tal como a SFR, que foi calculada neste estudo pode auxiliar na distinção de ctDNAs com KRAS mutado versus não mutado. Além disso, a análise da fração de tamanho poderia revelar uma indicação sobre a natureza do mecanismo de liberação do ctDNA. No entanto, os dados sugerem que o ctDNA não derivado de tumor no paciente com CRC pode se originar principalmente da apoptose em contraste com ctDNA de indivíduos saudáveis, e em menor grau do ctDNA derivado do tumor. O cálculo de tais índices deverá facilitar a análise do padrão de tamanho uma vez que os experimentos de amplificação utilizando a nested Q-PCR seriada, conforme realizado no presente, são demorados.
EXEMPLO 13 COMPARAÇÃO DA DETERMINAÇÃO DA % DE FRAGMENTOS MUTADOS A PARTIR DO CTDNA TOTAL MEDIANTE O USO DO COMPRIMENTO DO AMPLICON
[0310] A quantificação de ctDNA foi determinada pela amplificação de sequências alvos de tamanhos cada vez maiores de 82, 138, 300 pb (vide a Tabela 9) a partir do plasma de pacientes com células tumorais que carregavam as mutações G12D KRAS, G12D KRAS e G13D KRAS em CRC40, CRC50 e CRC60, respectivamente. A quantificação de ctDNA mutado foi realizada com os pares de primers constituído pelo mesmo primer reverso contendo na fita 3' a mutação alvo e com os primers de uma região distante de 82, 138 e 300 pb a partir de ambas extremidades 5'. O ctDNA não mutado foi quantificado utilizando os mesmos primers diretos (forward) e o mesmos primers reversos (reverse) com a sequência tipo selvagem (dados do exemplo anterior). O ctDNA total corresponde à soma dos fragmentos mutados e fragmentos não mutados.
[0311] Claramente os dados mostram que a determinação da % de fragmentos de ctDNA mutantes varia de acordo com o tamanho do amplicon detectado, e demonstra que a quantificação de fragmentos de ctDNA mutantes é muito mais elevada quando os tamanhos dos amplicons é inferior a 100 pb. Isto conduz a uma detecção mais precisa da presença de uma mutação no ctDNA pela determinação da percentagem de fragmentos mutantes; uma detecção positiva é determinada quando esse valor é superior à percentagem de um limiar. Existe, para cada plasma CRC, um aumento de cerca de 2,5, 3,4 e 6,3 vezes a % mutada quando se detecta um amplicon de 82 pb, em comparação com a detecção de um amplicon com 138 pb, enquanto que a proporção da % de ctDNA sobre a qual o valor é calculado foi 3,3, 3,9 e 9,3 vezes superior no CRC4, CRC5 e CRC6, respectivamente (vide a Tabela 9).
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[0312] Nós determinamos o DII com a amplificação por PCR de diversas sequências curtas e longas a partir do experimento com animais (vide a Tabela 11 abaixo e os Exemplos acima) e o perfil de tamanho do ctDNA de amostras clínicas (vide a Tabela 12 abaixo e os Exemplos acima).
[0313] Se considerarmos que a concentração determinada pela detecção do amplicon curto tal como 60 pb corresponde à concentração de ctDNA total, o DII corresponde à % da fração do ctDNA de tamanho maior do que o amplicon longo.
[0314] Os dados mostram que a maior diferença entre plasmas de pacientes saudáveis e com CRC foram observados no cálculo do DII com detecção de amplicons com tamanhos < 100 pb, tal como 60 ou 73 pb, e amplicons com tamanhos > 249 pb. O DII calculado a partir do experimento com camundongos confirma esta observação.
[0315] Quando comparado, mais precisamente, o DII que é calculado utilizando a detecção por Q-PCR do amplicon de tamanho maior que 100 pb, tal como 101 ou 145 pb, com o DII calculado utilizando amplicons com tamanhos de 60 ou 73 pb, o primeiro é cerca de 1,5 vezes mais baixo nas amostras clínicas, e cerca de 17 vezes mais baixo em amostras de camundongos xenoenxertados. Assim, a utilização da detecção de amplicons de tamanhos menores do que 100 pb e, em particular, menores que 73 pb, permite uma maior discriminação entre indivíduos saudáveis e pacientes com CRC.
[0316] Deve-se salientar que a utilização da fração > 409 pb mostrou maior discriminação entre indivíduos saudáveis e pacientes com CRC e do que a utilização da fração > 300 pb.
EXEMPLO 16 DESCRIÇÃO DAS REGIÕES DE DNA LOCALIZADAS A JUSANTE OU A MONTANTE DE UMA MUTAÇÃO UTILIZANDO O MÉTODO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO PARA DETECTAR UMA MUTAÇÃO (PARTICULARMENTE PELO DITO MÉTODO INTPLEX)
[0317] Diversos relatórios descreveram métodos que têm como alvo a região situada a jusante ou a montante de uma mutação ao propor a detecção de tal mutação. Por exemplo, diversos primers (de 18 a 30 nucleotídeos) foram desenhados para hibridizar com a sequência de DNA correspondente a tal região. No presente, nós reivindicamos a proteção do uso de entidades moleculares que tem com alvo outras regiões de acordo com a descrição do desenho dos primers utilizados para este método (Figura 11) tanto na configuração conv quanto na configuração rev. (respectivamente, configuração convencional e inversa (inv), também denominado conv e rev (ou inv) desenhados para entidades moleculares associadas, respectivamente, com essas configurações conv e inv.). Podemos descrever tais regiões a partir da mutação a ser detectada tendo em consideração os seguintes parâmetros:
  • • tamanho mínimo do primer = 15 nucleotídeos;
  • • tamanho máximo do primer = 30 nucleotídeos;
  • • espaçamento entre dois primers (entre as extremidades 3' de ambos os primers) = 5 pb;
  • • faixa de tamanho do amplicon para A1A2 ou B1B2 = 35 a 100 pb;
  • • estando o A1B2 na faixa de tamanho de 250-450 pb.
[0318] No caso da concepção conv, tal como apresentado na figura 11 A, as entidades moleculares a serem protegidas são aquelas que têm como alvo:
  • • a região onde o primer B2 deve hibridizar, e que está localizada de 5 a 85 nucleotídeos a jusante da posição onde se encontra a mutação na fita de DNA non sense.
  • • a região onde o par de primers A1A2 pode ser desenhado dentro dos 430-100 nucleotídeos a montante a partir da posição da mutação a ser detectada.
[0319] No caso da concepção inv, conforme apresentado na figura 11B, as entidades moleculares a serem protegidas são aquelas que têm como alvo:
  • • a região onde o primer A1 deve hibridizar, e que está localizada de 5 a 85 nucleotídeos a montante da posição onde se encontra a mutação na fita de mutação na fita de DNA non sense.
  • • a região onde o par de primers B1B2 pode ser desenhado dentro dos 100-430 nucleotídeos a jusante a partir da posição da mutação a ser detectada.
A) Exemplo da região do DNA a ser utilizada como alvo por nosso método QUANDO A MUTAÇÃO PONTUAL V600E NO BRAF É DE INTERESSE
a) Vide a Figura 23 que mostra as regiões onde as entidades moleculares, tal como primers, podem ser direcionadas em nosso método multiplex aplicado a esta mutação.
[0320] Oligonucleotídeos selecionados úteis para tal método aplicado a esta mutação (vide as Tabelas 13 e 14).
  • b) Oligonucleotídeos selecionados para os primers B2 para BRAF no sistema convencional (vide a Tabela 13)
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Figure img0017
[0321] c) Primers de oligonucleotídeos selecionados para A1 para BRAF no sistema reverso (inverso) (vide a Tabela 14);
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B). EXEMPLO DE REGIÃO DO DNA A SER UTILIZADA COMO ALVO EM NOSSO MÉTODO QUANDO AS MUTAÇÕES PONTUAIS NOS HOT SPOTS DO 2° E 3° CÓDON DO SEGUNDO ÉXON DO GENE KRAS É DE INTERESSE
  • a) Vide as Figuras 24A-24E que exibem as regiões e os primers onde as entidades moleculares, tal como primers, podem ser direcionadas em nosso método multiplex aplicado a esta mutação.
[0322] Região de KRAS no 2° éxon
[0323] No: KRAS (ENSG00000133703) a partir do banco de dados Ensembl;
v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog [Source:HGNC Symbol;Acc:6407]
Mutação Pontual; 6151
[0324] Desenho para KRAS convencional e inverso: vide as Figuras 24A-24E.
  • b) Oligonucleotídeos de DNA selecionados para o par de primers A1A2 para a detecção de mutações KRAS em hot spots no 2° éxon na configuração conv (vide a Tabela 15).
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C) OLIGONUCLEOTÍDEOS DE DNA SELECIONADOS PARA O PAR DE
PRIMERS A1A2 PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES KRAS EM HOT SPOTS NO ÉXON 2
NA CONFIGURAÇÃO INVERSA (VIDE A TABELA 16)
Figure img0021
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REFERÊNCIAS
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Claims (15)

  1. MÉTODO IN VITRO DE DIAGNÓSTICO, prognóstico, ou de acesso à evolução de um câncer em uma amostra de um indivíduo, caracterizado por dito método compreender calcular o índice de integridade de DNA livre de célula em uma amostra de fluido corporal obtida de um indivíduo,
    em que o índice de integridade é calculado por um método que compreende (i) determinar, a partir de uma amplificação por PCR de uma sequência curta de DNA livre de célula em dita amostra de fluido corporal, a concentração ou quantidade de um amplicon curto, em que dita sequência curta tem um comprimento inferior a 100 pb, (ii) determinar, a partir de uma amplificação por PCR de uma sequência longa de DNA livre de célula em dita amostra de fluido corporal, a concentração ou quantidade de um amplicon longo, em que dita sequência longa tem um comprimento compreendido entre 180 e 450 pb, e (iii) calcular a razão da concentração ou da quantidade de ditos amplicons de tamanho longo e de tamanho curto, e
    em que a razão do tamanho longo/curto é indicativa da presença de um tumor.
  2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dita sequência curta em (i) ter um comprimento compreendido entre 50 e 100 pb.
  3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dita sequência curta em (i) ter um comprimento compreendido entre 60 e 100 pb, ou entre 43 e 100, e dita sequência longa em (ii) ter um comprimento superior a 200 pb.
  4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo índice de integridade ser calculado repetidamente durante um intervalo de tempo em amostras de fluido corporal de um indivíduo, em que uma diminuição do índice de integridade ao longo do intervalo é indicativa da progressão de câncer no sujeito.
  5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela amostra de fluido corporal ser selecionada a partir do grupo que consiste em sangue total, soro, plasma, urina, saliva, fuidos da expectoração, efluente colônico, efluente da medula óssea, linfa, fluido cerebrospinal, fluido lacrimal, suor, leite, fezes, lavagens brônquicas ou ascite.
  6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo DNA livre de célula ser DNA circulante.
  7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela sequência longa compreender parcial ou totalmente a sequência curta
  8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo PCR ser Q-PCR.
  9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo câncer ser câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer do fígado, dentre outros.
  10. MÉTODO IN VITRO DE DIAGNÓSTICO, prognóstico, ou de acesso à evolução de um câncer em uma amostra de um paciente, caracterizado por dito método compreender:
    • a) calcular a proporção da fração de tamanho (SFR) de DNA livre de célula em uma amostra de fluido corporal obtida de um indivíduo, e
    • b) comparar a SFR obtida com a de um indivíduo saudável,

    em que uma SFR diminuída é indicativa da presença de câncer, e
    em que a SFR é calculada por um método que compreende (i) calcular, a partir de uma amplificação por PCR de dita amostra de fluido corporal, a concentração ou quantidade de uma faixa do DNA livre de célula de tamanho curto em dita amostra de fluido corporal, (ii) calcular, a partir de uma amplificação por PCR de dita amostra de fluido corporal, a concentração ou quantidade de uma faixa de DNA livre de célula de tamanho longo em dita amostra de fluido corporal, e (iii) calcular a razão da concentração ou da quantidade de dito DNA livre de célula de tamanho longo e de tamanho curto, e em que:
    a faixa de DNA de célula livre de tamanho curto está compreendida entre 60 e 100 pb e a faixa de DNA de célula livre de tamanho longo está compreendida entre 145 e 409 pb, ou
    a faixa de DNA de célula livre de tamanho curto está compreendida entre 60 e 100 pb, ou entre 43 e 100 pb, ou entre 60 e 145 pb, e
    a faixa de DNA de célula livre de tamanho longo é superior a 200 pb, ou
    a faixa de DNA de célula livre de tamanho curto é inferior a 100 pb, e a faixa de DNA de célula livre de tamanho longo está compreendida entre 180 e 450 pb;
    a faixa de DNA de célula livre de tamanho curto é inferior a 100 pb, e a faixa de DNA de célula livre de tamanho longo está compreendida 249 e 409 pb, de preferência a faixa de DNA de célula livre de tamanho curto está dentro da faixa de 73 a 100 pb, e a faixa de DNA de célula livre de tamanho longo está dentro da faixa de 300 a 357 pb.
  11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela amostra de fluido corporal ser selecionada a partir do grupo que consiste em sangue total, soro, plasma, urina, saliva, fuidos da expectoração, efluente colônico, efluente da medula óssea, linfa, fluido cerebrospinal, fluido lacrimal, suor, leite, fezes, lavagens brônquicas ou ascite.
  12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo DNA livre de célula ser DNA circulante.
  13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pela sequência longa compreender parcial ou totalmente a sequência curta.
  14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo PCR ser Q-PCR.
  15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pela SFR ser calculada repetidamente durante um intervalo de tempo em amostras de fluido corporal de um indivíduo, em que uma diminuição da SFR ao longo do intervalo é indicativa da progressão de câncer no sujeito.
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