ES2708030T3 - Métodos para explorar a un individuo en busca de un cáncer - Google Patents

Abstract

Un método (A) para explorar a un individuo en busca de un cáncer, que comprende las etapas consistentes en i) extraer los ácidos nucleicos libres de una muestra obtenida del individuo, ii) determinar la concentración total de ácidos nucleicos libres mitocondriales, iii) determinar la concentración total de ácidos nucleicos libres nucleares, iv) calcular la relación del nivel determinado en la etapa ii) con respecto a la concentración determinada en la etapa iii) (relación de contenido de ADNCmCn), v) comparar la relación determinada en la etapa iv) con un valor de referencia correspondiente predeterminado y vi) concluir que el individuo padece un cáncer cuando la relación determinada en la etapa iv) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cáncer cuando la relación determinada en la etapa iv) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

Description

DESCRIPCION

Metodos para explorar a un individuo en busca de un cancer

Campo de la invencion:

La presente invencion se refiere a metodos para explorar a un individuo en busca de un cancer.

Antecedentes de la invencion:

El descubrimiento del ADN libre circulante (circulating cell-free DNA) (ADNlc) en el sistema circulatorio humano ha conducido a una investigacion intensiva sobre su uso en diversos campos clmicos. El ADNlc fue descubierto en 1948 por Mandel y Metais1, aunque en aquel momento no atrajo mucha curiosidad. Sin embargo, de 30 a 40 anos despues, el interes por el ADNlc fue demostrado por varios grupos: Leon et a l2 descubrieron que la concentracion de ADNlc era considerablemente mayor en individuos con cancer y Stroun et al.3 describieron una proporcion de ADNlc que se derivaba de un tumor y tema sus caractensticas moleculares, conduciendo asf al concepto de una “biopsia lfquida”. Adicionalmente, el interes por la fragmentacion del ADNlc ha crecido en terminos de diagnostico desde la revelacion de diferencias significativas entre individuos con cancer e individuos sanos4 (patente de EE.UU.

5,952,170 de Stroun). Por lo tanto, el analisis del ADNlc podna proporcionar informacion de diagnostico, pronostico y tratanostico5 Varios investigadores estan desarrollando intensivamente tecnicas que permiten la deteccion y caracterizacion de alteraciones geneticas y epigeneticas de celulas tumorales utilizando analisis del ADNlc en el plasma/suero de individuos con cancer. Dichas tecnicas podnan revolucionar la atencion dirigida de individuos con cancer a traves de la deteccion de mutaciones que conducen a resistencia a terapias dirigidas, control terapeutico personalizado y seguimiento no invasivo de la enfermedad. El analisis de ADNlc se utiliza actualmente en la practica de diagnostico prenatal6 y es un analisis prometedor en otros campos clmicos, como enfermedades autoinmunes, traumatismos, sepsis o infarto de miocardio7.

A pesar de la investigacion intensiva, pocas pruebas basadas en ADNlc se han traducido a la practica clmica. Se estan desarrollando diversas tecnicas para detectar y caracterizar el ADNlc en individuos con cancer, incluido el polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccion, la secuenciacion directa, el analisis de fusion de alta resolucion, la PCR digital, la PCR en fno y otras tecnicas habitualmente utilizadas para el analisis de tejido tumoral. Sin embargo, la concentracion de ADNlc todavfa no ha sido validada como un biomarcador del cancer, ya que la literatura revela datos contradictorios: las concentraciones plasmaticas de ADNlc en individuos con cancer vanan de unos pocos ng/ml a varios miles de ng/ml, lo que se superpone con el intervalo de concentracion de individuos sanos5. Ademas se ha comprobado que la estimacion de la fragmentacion del ADNlc en individuos con cancer es mas baja, equivalente o mas alta que en individuos control. Estas discrepancias se pueden explicar por la falta de conocimientos fundamentales sobre el ADNlc. De hecho, los aspectos cognitivos de ADNlc todavfa no han sido identificados ni dilucidados: las contribuciones respectivas de diferentes mecanismos de liberacion potencial de ADNlc (apoptosis, necrosis, fagocitosis, trampas de ADN extracelular, liberacion activa...) no estan claramente identificadas. De modo similar, las estructuras del ADNlc todavfa no estan claramente definidas (parte de la cromatina, nucleosomas, complejos de nucleoprotemas, exosomas, cuerpos apoptoticos...)8.

La concentracion total de ADN circulante se contemplo durante mucho tiempo como un biomarcador potencial para el cancer, pero se comprobo que los valores de concentracion de ADNlc de individuos sanos y con cancer se superpoman parcialmente, lo que excluye su desarrollo como uso clmico9. Con los metodos recientes y el diseno espedfico de sistemas de PCR, recientemente se ha demostrado una distincion estadfstica entre individuos sanos e individuos con cancer10. Ademas, nosotros revelamos que el ADN tumoral circulante esta altamente fragmentado en comparacion con el ADNlc de individuos sanos (US20130224740,11). Mediante la direccion de secuencias cortas se comprobo que hasta un 50% del ADNlc total se podna derivar del tumor 12, lo que contradice la declaracion de la literatura anterior que indicaba que el ADNlc derivado del tumor era una porcion minuscula del ADNlc total.

No obstante, las caractensticas estructurales y de tamano del ADNlc todavfa estan mal caracterizadas en la literatura, aunque podnan contribuir a mejorar el conocimiento cognitivo sobre el ADNlc y a disenar procesos analtticos precisos y espedficos. Ademas de la pujante investigacion actual sobre el analisis del ADNlc nuclear (ADNCn), el analisis del ADNlc mitocondrial (ADNCn) esta emergiendo como un campo de estudio muy atractivo. El ADN mitocondrial (ADNmt) esta compuesto por un ADN circular de 16.000 pb que se inserta en 37 genes, que codifican dos ARNr, 22 ARNt y 14 polipeptidos (presentados mas arriba, uno que codifica tanto el 16S ribosomico como la humanina). Hay de 5 a 10 copias de este ADN circular por mitocondria, y solo existen en eucariotas en todos los tipos de celulas excepto en los globulos rojos; cada celula contiene de 1.000 a 3.000 mitocondrias sobre tipos celulares. Por lo tanto, hay de cientos a miles de copias de ADNmt, estando la variacion del numero en funcion de las condiciones ambientales (tales como la hipoxia o la estimulacion de hormonas esteroideas)13. El ADNmt corresponde a aproximadamente un 1% del ADN celular total. Dado que se deriva de ADN bacteriano, contiene numerosos dinucleotidos CpG no metilados14. Debido a la falta de proteccion por histonas y a los mecanismos eficientes de reparacion del ADN, es sensible al estres genotoxico y oxidante15. Existe una tasa de mutacion de 10 a 200 veces mayor que la del ADN nuclear. Durante la tumorogenesis, el ADN mitocondrial es sometido a muchas mutaciones en una proporcion mucho mayor que el ADN nuclear debido a su falta de proteccion por histonas y la falta de mecanismos de reparacion del ADN. Ademas, este genoma poliploide esta sujeto a una variacion en el numero de copias durante la carcinogenesis. Estas alteraciones espedficas se podnan determinar facilmente a partir del ADNlc mitocondrial, ya que las copias del ADNmt estan presentes en mayor cantidad (de cien a mil copias por celula) que el ADN nuclear13. Se han publicado algunos estudios sobre la importancia clmica de la concentracion y la integridad del ADNlc mitocondrial en individuos con cancer16 En este momento, los datos publicados son discordes y es imposible llegar a una conclusion. La falta de procedimientos normalizados de trabajo preanaltticos y analtticos podna explicar en parte esta discordancia.

Poco se sabe acerca de las propiedades estructurales del ADNlc mitocondrial (ADNCm). Podemos suponer que son diferentes a las del ADNlc nuclear (ADNCn), ya que el ADNm no esta protegido por histonas y una parte de ADNlc nuclear esta formada por nucleosomas. Se ha demostrado que los neutrofilos liberaban ADNm de un modo ROS dependiente para formar las Trampas Extracelulares de Neutrofilos (NET) 17 De modo similar, los eosinofilos liberan ADNmt para formar las trampas extracelulares (EET), lo que contribuye a la defensa antibacteriana 18

Biologica y fisiologicamente, se ha demostrado que el ADNlc mitocondrial era un DAMP 14 Su patron de CpG no metilado espedfico y sus caractensticas similares a las del ADN bacteriano son reconocidos por TLR9 de las celulas inmunes y condujeron a respuesta inflamatoria a traves de p3819 Este punto es crucial, ya que se sabe poco sobre las propiedades biologicas del ADNlc y este descubrimiento podna conducir a agentes terapeuticos dirigidos contra el ADNlc. Por todas estas razones, el ADNlc mitocondrial es muy prometedor, y es necesario realizar mas estudios sobre este ADN en particular. Esta mal caracterizado 20 y se han notificado pocos resultados en comparacion con el ADNlc nuclear.

Compendio de la invencion:

La presente invencion se refiere a metodos para explorar a un individuo en busca de un cancer en un individuo que lo requiera. En particular, la presente invencion esta definida por las reivindicaciones.

Descripcion detallada de la invencion:

En la presente memoria, los inventores demuestran por primera vez que cuantificar y asociar el contenido de ADNmt y de ADNnuc permite distinguir a individuos con cancer de individuos sanos. Mas espedficamente, la relacion de contenido de ADNlc mitocondrial/ABDlc nuclear (ADNCmCn) es estadfsticamente mas baja en individuos con cancer que en individuos sanos. Como la capacidad de diagnostico es optima (ABC de 1), este valor es un biomarcador fuerte para explorar la presencia de un tumor y puede ser utilizado para detectar a individuos no sintomaticos o no diagnosticados. Ademas hemos demostrado que el mdice de fragmentacion (DII como se calcula aqd) del ADNlc mitocondrial (ADNCmt) es mas alto que el del ADNlc nuclear (ADNCnu), siendo la relacion de DII de ADNcmt/DII de ADNCnu mas alta en individuos con tumores que en individuos sanos. Dado que unicamente la concentracion de ADNlc nuclear total (ADNCn) presenta un potencial para el diagnostico de cancer, sena posible combinar la relacion de contenido de ADNCmCn unicamente con la concentracion de ADNlc nuclear total o tanto con la proporcion de DII y como con la concentracion de ADNlc de ADNlc nuclear total para mejorar la potencia de escrutinio, en especial para un escrutinio a gran escala. Un algoritmo podna ser util para este objetivo.

Hasta la fecha, ningun otro biomarcador ha mostrado un rendimiento tal como el de la relacion de contenido de ADNCmCn para diagnosticar cancer mediante un analisis de sangre. Se han hecho muchos intentos con biomarcadores basados en proternas o en acidos nucleicos, y se ha comprobado que todos ellos son inespedficos o no son suficientemente sensibles. Por ejemplo, el PSA es un biomarcador utilizado habitualmente para el cancer de prostata, pero requiere mucha precaucion, ya que no es espedfico de una enfermedad maligna y presenta inconvenientes analfticos en terminos de sensibilidad. Los biomarcadores CEA o CA15-3 tambien se utilizan de forma rutinaria en individuos con cancer, en especial para los individuos con cancer colorrectal (CCR) o con cancer de mama, respectivamente, pero solo se emplean para el pronostico, el seguimiento del tratamiento o la vigilancia de la recurrencia.

Ademas de su alta capacidad de escrutinio, la relacion de contenido de ADNCmCn puede ser util como biomarcador para el pronostico, el seguimiento del tratamiento o la vigilancia de la recurrencia en la atencion de la gestion del cancer.

Definiciones generales

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "cancer" tiene su significado general en la tecnica e incluye, pero no se limita a tumores solidos y tumores de origen sangurneo. El termino cancer incluye enfermedades de la piel, tejidos, organos, huesos, cartflagos, sangre y vasos. Ademas, el termino "cancer" abarca tanto canceres primarios como metastasicos. Los ejemplos de canceres incluyen, pero no se limitan a celulas cancerosas de la vejiga, sangre, hueso, medula osea, cerebro, mama, colon, esofago, tracto gastrointestinal, enda, cabeza, rinon, Idgado, pulmon, nasofaringe, cuello, ovario, prostata, piel, estomago, testfculos, lengua o utero. Ademas, el cancer puede ser espedficamente de los siguientes tipos histologicos, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de celulas gigantes y espinocelular; carcinoma de celulas pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de celulas escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de celulas basales; pilomatrixoma; carcinoma de celulas transicionales; carcinoma de celulas transicionales papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide qmstico; adenocarcinoma en polipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma solido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquial-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofobo; carcinoma acidofilo; adenocarcinoma oxifflico; carcinoma basofilo; adenocarcinoma de celulas claras; carcinoma de celulas granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma adrenocortical; carcinoma endometrioide; carcinoma de apendice cutaneo; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebaceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistoadenocarcinoma; cistoadenocarcinoma papilar; cistoadenocarcinoma seroso papilar; cistoadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de celulas en forma de anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, de mama; carcinoma de celulas acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovarico, maligno; tecoma, maligno; tumor de celulas granulosas, maligno; y roblastoma, maligno; carcinoma de celulas de Sertoli; tumor de celulas de Leydig, maligno; tumor de celulas lipfdicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanotico; melanoma de propagacion superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de celulas epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mulleriano mixto; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de celulas gigantes de hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogenico, maligno; odontosarcoma ameloblastico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblastico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmatico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; tumor neuroectodermico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogenico olfatorio; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de celulas granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocftico pequeno; linfoma maligno, de celulas grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoides; otros linfomas no Hodgkin especificos; histiocitosis maligna; mieloma multiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de celulas plasmaticas; eritroleucemia; leucemia de celulas de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofila; leucemia eosinofflica; leucemia monocftica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblastica; sarcoma mieloide; y leucemia de celulas pilosas. En algunas realizaciones, el individuo padece un cancer colorrectal, mas particularmente un cancer colorrectal metastasico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el concepto "acido nucleico" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a una secuencia nucleica codificadora o no codificadora. Los acidos nucleicos incluyen acidos nucleicos de ADN (acido desoxirribonucleico) y ARN (acido ribonucleico). Por lo tanto, los ejemplos de acido nucleico incluyen, pero no se limitan a ADN, ARNm, ARNt, ARNr, ARNtm, ARNmi, ARNpi, ARNsno y ARNsn. Por consiguiente, los acidos nucleicos abarcan la region codificadora y no codificadora de un genoma (es decir, nuclear o mitocondrial).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el concepto "acido nucleico nuclear" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a un acido nucleico procedente del nucleo de la celula. El concepto "acido nucleico nuclear" abarca todas las formas de los acidos nucleicos, excepto las procedentes de las mitocondrias. El concepto "acido nucleico nuclear" se define asf en oposicion al concepto "acido nucleico mitocondrial". Las mitocondrias son de hecho estructuras dentro de las celulas que convierten la energfa de los alimentos en una forma que puede ser utilizada por las celulas. Aunque la mayor parte del ADN esta empaquetado en cromosomas dentro del nucleo, las mitocondrias tambien tienen una pequena cantidad de su propio ADN. Este material genetico se conoce como "ADN mitocondrial" o "ADNmt". En los seres humanos, el ADN mitocondrial abarca aproximadamente 16.500 bloques de construccion de ADN (pares de bases), lo que representa una pequena fraccion del ADN total en las celulas. El ADN mitocondrial contiene 37 genes, siendo todos ellos esenciales para la funcion mitocondrial normal: ATP6; ATP8; COX1; COX2; COX3; CYTB; ND1; ND2; ND3; ND4; ND4L; ND5; ND6; RNR1, RNR2 TRNA; TRNA; TRNC; TRND; TRNE; TRNF; TRNG; TRNI; TRNK; TRNL1; TRNL2; TRNM; TRNN; TRNN; TRNP; TRNQ; TRNR; TRNS1; TRNS2; TRNT; TRNV; TRNW; y TRNY. Los genes que codifican la NADH deshidrogenasa (complejo I) incluyen MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5 y MT-ND6. Los genes que codifican la Coenzima Q - citocromo c reductasa/Citocromo b (complejo III) incluyen MT-CYB. El gen que codifica la citocromo c oxidasa (complejo IV) incluye MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3. El gen que codifica la ATP sintasa (complejo V) incluye MT-ATP6 y MT-ATP8. El gen que codifica la humanina incluye MT-RNR2 (que codifica tanto el 16S ribosomico como la humanina). Los genes MT-RNR1 y MT-RNR2 proporcionan instrucciones para producir 12S y 16S ribosomicos, respectivamente. Las 22 especies de ARNt mitocondriales (ARNt mt) codificadas por ADNmt que intervienen en la maquinaria de smtesis de protemas mitocondriales. El ADN mitocondrial humano (ADNmt) tiene tres promotores, H1, H2 y L (promotores de cadena pesada 1, de cadena pesada 2 y de cadena ligera). El genoma mitocondrial tambien comprende regiones de control o secuencias de lazo D. El experto en la materia conoce de por sf los acidos nucleares mitocondriales (por ejemplo, la secuencia de referencia NCBI: NC_012920.1, SEQ ID N°: 1). Trece de estos genes proporcionan instrucciones para producir enzimas que intervienen en la fosforilacion oxidante. La fosforilacion oxidante es un proceso que utiliza oxfgeno y azucares simples para crear trifosfato de adenosina (ATP), la principal fuente de energfa de la celula. Los genes restantes proporcionan instrucciones para producir moleculas denominadas ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosomal (ARNr), que son de la familia qmmica del ADN. Estos tipos de ARN ayudan a ensamblar bloques de construccion de protemas (aminoacidos) en protemas funcionales.

Por "acido nucleico libre" se entiende que el acido nucleico es liberado por la celula y esta presente en la muestra. En algunas realizaciones, el acido nucleico libre es ADN libre circulante (ADNlc) y un experto en la tecnica puede distinguir de forma sencilla y rutinaria los acidos nucleicos lc mitocondriales o "ADNlc mitcondriales" de los "ADNlc nucleares". En realidad, el ADNlc mitocondrial abarca cualquier acido nucleico mitocondrial de ADN y, en cambio, el ADNlc nuclear abarca cualquier acido nucleico nuclear de ADN.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el concepto "secuencia de acido nucleico diana" se refiere a una secuencia de acido nucleico espedfica (codificadora o no codificadora) cuya amplificacion y cuantificacion se busca, por ejemplo, mediante Q-PCR y/o analisis por secuenciacion. En particular, una secuencia de acido nucleico nuclear diana es una secuencia procedente del genoma nuclear humano, y una secuencia de acido nucleico mitocondrial diana es una secuencia procedente del genoma mitocondrial humano (por ejemplo, SEQ ID N°: 1). De acuerdo con la invencion, una secuencia de acido nucleico diana tiene una longitud de 10 pares de bases. En particular, una secuencia de acido nucleico diana tiene una longitud de 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; o 110; 111; 112 113 114; 115; 116; 117; 118 119; 120 121 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128 129 130 131; 132 133; 134 135 136 137; 138; 139; 140; 141 142; 143 144 145; 146; 147; 148; 149; 150; 151 152 153 154; 155 156; 157 158 159 160; 161; 162; 163; 164 165; 166 167 168; 169; 170; 171; 172; 173; 174 175 176; 177; 178 179; 180 181 182 183; 184; 185; 186; 187 188; 189 190 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197 198 199; 200; 201 ; 202; 203 ; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210 211; 212; 213 ; 214; 215; 216; 217; 218; 219; 220 ; 221 ; 222; 223; 224 ; 225; 226 ; 227 ; 228; 229; 230; 231; 232; 233 ; 234; 235; 236 ; 237; 238; 239; 240; 241; 242; 243 ; 244; 245; 246; 247 ; 248; 249 ; 250; 251 ; 252; 253; 254; 255; 256 ; 257; 258; 259 ; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266 ; 267; 268; 269; 270 271; 272 ; 273; 274; 275; 276; 277; 278; 279 ; 280; 281 282 ; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289 ; 290; 291 ; 292; 293 ; 294; 295 ; 296; 297; 298; 299; 300; 301; 302; 303; 304; 305 ; 306; 307; 308; 309; 310; 311; 312; 313; 314 315; 316 ; 317; 318 319 ; 320 321; 322; 323; 324; 325; 326; 327 328 ; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 336; 337 339 341 ; 343; 344; 345 ; 347 ; 348; 349; 350 pares de bases. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico nuclear diana tiene un 5% de diferencia con la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana. De acuerdo con la invencion, una primera secuencia de acido nucleico que tiene al menos un 5% de diferencia con una segunda secuencia de acido nucleico significa que la primera secuencia tiene un 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; o 100% de diferencia con la segunda secuencia de aminoacidos. La diferencia de la secuencia de acido nucleico se determina por regla general utilizando un algoritmo de alineacion de secuencia adecuado y parametros por defecto, como BLAST P (Karlin y Altschul, 1990). En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico nuclear diana tiene un 10% de diferencia con la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico nuclear diana tiene un 20% de diferencia con la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico nuclear diana tiene un 50% de diferencia con la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "muestra" se refiere a cualquier muestra biologica obtenida del individuo que pueda contener acidos nucleicos libres. Por regla general, las muestras incluyen, pero no se limitan a muestras de fluidos corporales, como sangre, lfquido asdtico, orina, lfquido amniotico, heces, saliva o lfquidos cefalorraqrndeos. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. Por "muestra de sangre" se entiende un volumen de sangre total o una fraccion de la misma, por ejemplo, suero, plasma, etc. El experto en la materia puede utilizar cualquier metodo bien conocido en la tecnica para extraer el acido nucleico libre de la muestra preparada. Por ejemplo, se puede utilizar el metodo descrito en el EJEMPLO.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido, ya tenga lugar naturalmente como en una digestion de restriccion purificada, ya se produzca sinteticamente, que sea capaz de actuar como un punto de inicio de la smtesis de la secuencia de acido nucleico cuando se somete a condiciones en las que se induce la smtesis de un producto de extension por cebador que es complementario a una cadena de acido nucleico, es decir, en presencia de diferentes trifosfatos de nucleotido y una polimerasa en un tampon apropiado ("tampon" incluye pH, fuerza ionica, cofactores, etc.) y a una temperatura adecuada. Por regla general, un cebador tiene una longitud de 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; o 30 nucleotidos. Uno o mas de los nucleotidos del cebador se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adicion de un grupo metilo, un resto de biotina o de digoxigenina, una etiqueta fluorescente o mediante el uso de nucleotidos radiactivos. No es necesario que una secuencia de cebador refleje la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleotido no complementario puede estar unido al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementary a la cadena. Los cebadores se marcan por regla general con una molecula o sustancia detectable, tal como una molecula fluorescente, una molecula radiactiva o cualquier otra etiqueta conocida en la tecnica. En la tecnica se conocen etiquetas que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una senal. El termino "etiquetado" tiene la finalidad de abarcar el etiquetado directo de la sonda y los cebadores mediante el acoplamiento (es decir, la union ffsica) de una sustancia detectable, asf como el etiquetado indirecto por reactividad con otro reactivo que esta etiquetado directamente. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero no se limitan a agentes radiactivos o un fluoroforo (por ejemplo isotiocianato de fluorescema (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5)).

Metodos (A) basados en la relacion de contenido de ADNCmCn calculada:

Un objeto de la presente invencion se refiere a un metodo (A) para explorar a un individuo en busca de un cancer, que comprende las etapas consistentes en

- i) extraer los acidos nucleicos libres de una muestra obtenida del individuo,

- ii) determinar la concentracion total de acidos nucleicos libres mitocondriales,

- iii) determinar la concentracion total de acidos nucleicos libres nucleares,

- iv) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa ii) con respecto a la concentracion determinada en la etapa iii) (relacion de contenido de ADNCmCn),

- v) comparar la relacion determinada en la etapa iv) con un valor de referencia correspondiente predeterminado y

- vi) concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion determinada en la etapa iv) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion determinada en la etapa iv) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

En algunas realizaciones, los acidos nucleicos libres son acidos nucleicos de ADN libre (ADNlc). En esta realizacion, la relacion del nivel determinado en la etapa ii) con respecto al nivel determinado en la etapa iii) se denomina por regla general como la "relacion de contenido de ADNCmCn".

Los metodos para determinar la concentracion total de acidos nucleicos libres son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el metodo descrito en el documento WO2012/028746. Por lo tanto, la Q-PCR es el metodo preferente para determinar dicha concentracion.

En alguna realizacion, el metodo comprende las etapas consistentes en a) amplificar y cuantificar una secuencia de acido nucleico nuclear diana y b) amplificar y cuantificar una secuencia de acido nucleico mitocondrial diana. Por lo tanto, la relacion de contenido de ADNCmCn se representa mediante la relacion de la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana amplificada con respecto a la secuencia de acido nucleico nuclear diana amplificada. De acuerdo con la invencion, la secuencia de acido nucleico nuclear diana es una secuencia que se encuentra en el nucleo del genoma humano. En cambio, la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana es una secuencia que esta presente en el genoma humano mitocondrial (SEQ ID N°: 1). Normalmente, la secuencia de acido nucleico diana forma parte de una secuencia codificadora o no codificadora. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana esta comprendida en los siguientes genes mitocondriales: ND1; ND2; COX1; COX2; ATP8; ATP6; COX3; ND3; ND4L; ND4; ND5; ND6; CYTB; TRNF; TRND; RNR1 TRNV; TRNK; RNR2 TRNL1; TRNS1; TRN1; TRNP; TRNQ; TRNE; TRNM; TRNT TRNW; TRNL2 TRNA; TRNS2; TRNN; TRNR; TRNA; TRNG; TRNN; TRNC; y TRNY. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana esta comprendida en una region no codificadora del genoma mitocondrial tal como promotores de ADN mitocondrial, tales como H1, H2 y L (promotores de cadena pesada 1, de cadena pesada 2 y de cadena ligera) o regiones de control mitocondrial o secuencias de lazo D. Por lo tanto, el experto en la materia puede seleccionar facilmente las secuencias de acido nucleico nuclear y mitocondrial diana apropiadas. De acuerdo con la invencion, las secuencias de acido nucleico nuclear y mitocondrial diana tienen aproximadamente la misma longitud (es decir, tamano). Por regla general, la longitud de las secuencias de acido nucleico mitocondrial diana es un 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; o 15% mas larga o mas corta que la secuencia de acido nucleico nuclear diana. En algunas realizaciones, las dos secuencias de acido nucleico diana tienen la misma longitud. Por regla general, las secuencias de acido nucleico diana tienen una longitud inferior a 110 pares de bases. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico diana tiene una longitud de 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; o 110 pares de bases.

En algunas realizaciones, el metodo (A) de la presente invencion comprende ademas las etapas consistentes en comparar la concentracion total de ADNlc nuclear con un valor de referencia correspondiente predeterminado (ADNCnR) y concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion de contenido de ADNCmCn es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNIc nuclear es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion de contenido de ADNCmCn es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado.

De acuerdo con la invencion, el metodo (A) de la presente invencion implica por regla general el uso de 2 conjuntos de 2 cebadores: 1 conjunto de 2 cebadores (1 cebador homosentido y 1 cebador antisentido) para amplificar la secuencia de acido nucleico nuclear diana y 1 conjunto de 2 cebadores (1 cebador homosentido y 1 cebador antisentido) para amplificar la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana.

Metodos (B) basados en la relacion DII MITO/DII NUC:

Otro objeto de la presente invencion se refiere a un metodo (B) para explorar a un individuo en busca de un cancer, que comprende las etapas consistentes en

- i) extraer los acidos nucleicos libres de una muestra obtenida del individuo,

- ii) determinar el nivel de los acidos nucleicos mitocondriales que tienen una longitud inferior a 110

pares de bases,

- iii) determinar el nivel de los acidos nucleicos mitocondriales que tienen una longitud superior a 250

pares de bases,

- iv) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa iii) con respecto al nivel determinado en la

etapa ii) (DII MITO),

- v) determinar el nivel de los acidos nucleicos nucleares que tienen una longitud inferior a 110 pares de bases,

- vi) determinar el nivel de los acidos nucleicos nucleares que tienen una longitud superior a 250 pares

de bases,

- vii) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa vi) con respecto al nivel determinado en la

etapa v) (DII NUC),

- viii) calcular la relacion entre la relacion determinada en la etapa iv) y la relacion determinada en la

etapa vii) (relacion DII MITO/DII NUC),

- ix) comparar la relacion determinada en la etapa viii) con un valor de referencia correspondiente predeterminado y

- x) concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion determinada en la etapa viii) es mayor

que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion determinada en la etapa viii) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

En algunas realizaciones, los acidos nucleicos libres son acidos nucleicos de ADN libre (ADNlc).

La Q-PCR es tambien el metodo preferente para determinar el nivel de los acidos nucleicos que tienen una longitud inferior a 110 pares de bases y el nivel de los acidos nucleicos que tienen una longitud de al menos 250 pares de bases (por ejemplo, vease el metodo descrito en el documento WO2012/028746). En alguna realizacion, el metodo consiste en a) amplificar y cuantificar una primera secuencia de acido nucleico mitocondrial diana que tiene una longitud inferior a 110 pares de bases y una segunda secuencia de acido nucleico mitocondrial diana que tiene una longitud de al menos 250 pares de bases, y b) amplificar y cuantificar una primera secuencia de acido nucleico nuclear diana que tiene una longitud inferior a 110 pares de bases y una segunda secuencia de acido nucleico nuclear diana que tiene una longitud de al menos 250 pares de bases. Entonces es posible calcular las relaciones entre la secuencia de acido nucleico diana amplificada que tiene una longitud de al menos 250 pares de bases y la secuencia de acido nucleico diana amplificada que tiene una longitud inferior a 110 pares de bases, lo que posibilita la determinacion de las relaciones determinadas en las etapas iv) y vii). En algunas realizaciones, la primera secuencia de acido nucleico (mitocondrial o nuclear) diana tiene una longitud de 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28;

29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; o 110 pares de bases. En algunas realizaciones, la segunda secuencia de acido nucleico (mitocondrial o nuclear) diana tiene una longitud de

250; 251; 252; 253; 254; 255; 256; 257; 258; 259; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266; 267; 268; 269; 270; 271; 272

273; 274; 275; 276; 277; 278; 279; 280; 281; 282; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 290; 291; 292; 293; 294; 295

296; 297; 298; 299; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 309; 310; 311; 312; 313; 314; 315; 316; 317; 318

319; 320; 321; 322; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 336; 339; 340; 341

342; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350 pares de bases. De acuerdo con la invencion, la primera y la segunda secuencias nucleicas (mitocondrial o nuclear) diana estan ubicadas en el mismo gen. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencias nucleicas (mitocondrial o nuclear) diana estan ubicadas en el mismo exon.

De acuerdo con la invencion, la relacion del nivel de acidos nucleicos que tienen una longitud superior a 250 pares de bases con respecto al nivel de los acidos nucleicos que tienen una longitud inferior a 110 pares de bases se denomina por regla general 'Indice de Integridad de ADN" o "DU". Por lo tanto, es posible determinar el fndice de integridad de ADN mitocondrial ("DII MITO") y el mdice de integridad de ADN nuclear ("DII NUC").

En algunas realizaciones, el metodo (B) de la presente invencion comprende ademas las etapas consistentes en comparar la concentracion total de ADNlc nuclear con un valor de referencia correspondiente predeterminado (ADNCnR) y concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion DII MITO/DII NUC es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion DII MITO/DII NUC es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado.

De acuerdo con la invencion, el metodo (B) de la presente invencion implica por regla general el uso de 2 conjuntos de 3 cebadores: 1 conjunto de 3 cebadores (1 cebador homosentido y 2 cebadores antisentido) para amplificar las secuencias de acido nucleico nuclear diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb), y 1 conjunto de 3 cebadores (1 cebador homosentido y 2 cebadores antisentido) para amplificar las secuencias de acido nucleico mitocondrial diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb).

Metodos de combinacion:

En algunas realizaciones, los metodos (A) y (B) arriba descritos se pueden combinar. Otro objeto de la presente invencion se refiere a un metodo para explorar a un individuo en busca de un cancer, que combina en un solo ensayo realizado en una muestra obtenida del individuo la determinacion de la relacion de contenido de ADNCmCn, la relacion DII MITO/DII NUC y opcionalmente la concentracion total de ADNlc nuclear. Cuando se combinan los metodos (A) y (B), el uso de 2 conjuntos de 3 cebadores es suficiente: 1 conjunto de 3 cebadores (1 cebador homosentido y 2 cebadores antisentido) para amplificar las secuencias de acido nucleico nuclear diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb), y 1 conjunto de 3 cebadores (1 cebador homosentido y 2 cebadores antisentido) para amplificar las secuencias de acido nucleico mitocondrial diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb). La comparacion entre los valores determinados (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC ...) y los valores correspondientes predeterminados se puede realizar mediante herramientas informaticas. Estas herramientas informaticas implican por regla general el uso de un algoritmo para calcular una puntuacion que es el valor compuesto de los valores determinados. La puntuacion facilita la comprension de los resultados de las etapas de comparacion.

PCR cuantitativa (QPCR):

No es necesario purificar el acido nucleico molde. Los acidos nucleicos se pueden extraer de una muestra mediante tecnicas rutinarias tales como las descritas en Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington DC).

Las patentes de EE. UU. n° 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159 y 4,965,188 describen tecnicas de PCR convencionales. Por regla general, la PCR emplea dos cebadores de oligonucleotido que se unen a una secuencia de acido nucleico diana seleccionada. Los cebadores utiles en la presente invencion incluyen oligonucleotidos que pueden actuar como un punto de inicio de la smtesis de acido nucleico dentro de la secuencia de acido nucleico diana. Un cebador se puede purificar a partir de una digestion de restriccion mediante metodos convencionales, o se puede producir sinteticamente. Si el acido nucleico molde es bicatenario (por ejemplo, ADN), es necesario separar las dos cadenas antes de que pueda ser utilizado como molde en la PCR. La separacion de las cadenas se puede llevar a cabo mediante cualquier metodo de desnaturalizacion adecuado, incluyendo medios ffsicos, qmmicos o enzimaticos. Un metodo para separar las cadenas de acido nucleico consiste en calentar el acido nucleico hasta que este predominantemente desnaturalizado (por ejemplo, desnaturalizado mas de un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%). Las condiciones de calentamiento necesarias para desnaturalizar el acido nucleico molde dependeran, por ejemplo, de la concentracion de sal del tampon y de la longitud y la composicion de nucleotidos de los acidos nucleicos que se desnaturalizan, pero generalmente estan dentro del intervalo de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 105 °C, durante un tiempo que depende de caractensticas de la reaccion, como la temperatura y la longitud del acido nucleico. Por regla general, la desnaturalizacion se realiza durante aproximadamente 30 segundos a 4 minutos (por ejemplo, de 1 minuto a 2 minutos y 30 segundos, o 1,5 minutos). Si el acido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reaccion se deja enfriar a una temperatura que promueve la reasociacion de cada cebador con su secuencia diana en la secuencia de acido nucleico diana. Normalmente, la temperatura para la reasociacion es de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, aproximadamente de 40 °C a aproximadamente 60 °C; de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C). Los tiempos de reasociacion pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto (por ejemplo, de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 50 segundos; de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 40 segundos). Despues, la mezcla de reaccion se ajusta a una temperatura que promueve u optimiza la actividad de la polimerasa, es decir, una temperatura suficiente para que se produzca una extension a partir del cebador reasociado para generar productos complementarios al acido nucleico molde. La temperatura debe ser suficiente para sintetizar un producto de extension a partir de cada cebador que esta reasociado con un molde de acido nucleico, pero no ha de ser tan alta que desnaturalice un producto de extension a partir de su molde complementario (por ejemplo, por regla general la temperatura para la extension esta dentro del intervalo de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 80 °C (por ejemplo, de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C; aproximadamente 60 °C). Los tiempos de extension pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 5 minutos (por ejemplo de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 4 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 3 minutos; de aproximadamente 1 minuto y 30 segundos a aproximadamente 2 minutos).

La QPCR implica el uso de una polimerasa termoestable. El concepto "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa que es estable al calor, es decir, que la enzima cataliza la formacion de productos de extension de cebador complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando es sometida a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalizacion de acidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la smtesis se inicia en el extremo 3' de cada cebador y continua en la direccion de 5' a 3' a lo largo de la cadena molde. Se han aislado polimerasas termoestables de Thermus fiavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. No obstante, tambien es posible emplear polimerasas que no sean termoestables en ensayos de PCR siempre que la enzima se reponga. Por regla general, la polimerasa es una polimerasa Taq (es decir, Thermus aquaticus polymerase).

Los cebadores se combinan con reactivos de PCR en condiciones de reaccion que inducen la extension del cebador. Normalmente, las reacciones de extension de cadena incluyen por regla general KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl215 mM, gelatina al 0,001% (p/v), 0,5-1,0 |ig de ADN molde desnaturalizado, 50 pmoles de cada cebador de oligonucleotido, 2,5 U de polimerasa Taq, y 10% DMSO). Las reacciones contienen generalmente de 150 a 320 |iM de dATP, dCTP, dTTP, dGTP, o uno o mas analogos de los mismos.

Las cadenas recien sintetizadas forman una molecula bicatenaria que puede ser utilizada en etapas sucesivas de la reaccion. Las etapas de separacion de cadenas, reasociacion y alargamiento se pueden repetir tantas veces como sea necesario para producir la cantidad deseada de productos de amplificacion correspondientes a la molecula de secuencia de acido nucleico diana. Los factores limitativos en la reaccion consisten en las cantidades de cebadores, enzimas termoestables y trifosfatos de nucleosido presentes en la reaccion. Las etapas de ciclacion (es decir, desnaturalizacion, reasociacion y extension) se repiten preferiblemente al menos una vez. Para su uso en la deteccion, la cantidad de etapas de ciclacion dependera, por ejemplo, de la naturaleza de la muestra. Si la muestra consiste en una mezcla compleja de acidos nucleicos, se requeriran mas etapas de ciclacion para amplificar la secuencia diana en medida suficiente para la deteccion. Por regla general, las etapas de ciclacion se repiten al menos aproximadamente 20 veces, pero se pueden repetir tantas como 40, 60 o incluso 100 veces.

Generalmente, la PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad para iluminar cada muestra con un haz de luz de una longitud de onda espedfica y detectar la fluorescencia emitida por el fluoroforo excitado. El termociclador tambien puede calentar y enfriar rapidamente las muestras, aprovechando asf las propiedades fisicoqmmicas de los acidos nucleicos y la polimerasa termica.

Con el fin de detectar y medir la cantidad de amplicon (es decir, la secuencia de acido nucleico diana amplificada) en la muestra, se ha de generar una senal mensurable que sea proporcional a la cantidad de producto amplificado. Todos los sistemas de deteccion actuales utilizan tecnologfas fluorescentes. Algunas de ellas son tecnicas inespedficas y, en consecuencia, solo permiten la deteccion de una diana cada vez. Alternativamente, algunas tecnicas qmmicas de deteccion espedficas pueden distinguir entre amplificacion inespedfica y amplificacion de diana. Estas tecnicas espedficas pueden ser utilizadas para multiplexar el ensayo, es decir, detectar varias dianas diferentes en el mismo ensayo.

SYBR® Green I: El SYBR® Green I es el colorante mas utilizado para la deteccion inespedfica. Se trata de un colorante intercalante de ADN bicatenario, que es fluorescente una vez que se une al ADN. Para amplificar la diana con esta tecnica qmmica se requiere un par de cebadores espedficos. La cantidad de colorante incorporado es proporcional a la cantidad de diana generada. El colorante emite a 520 nm y la fluorescencia emitida se puede detectar y relacionar con la cantidad de diana. El inconveniente de esta tecnica consiste en que el SYBR® Green I se unira a cualquier ADNds amplificado. En consecuencia, los dfmeros de cebador o los productos inespedficos introducen un sesgo en la cuantificacion. Sin embargo, todavfa es posible verificar la especificidad del sistema ejecutando una curva de fusion al final de la ejecucion de la PCR. El principio consiste en que cada producto tiene una temperatura de disociacion diferente, dependiendo del tamano y del contenido de base, por lo que todavfa es posible comprobar la cantidad de productos amplificados. Un ensayo SYBR® valido - par de cebadores - debe producir un unico pico bien definido en la curva de fusion. Por estas razones, el SYBR® Green I casi nunca se utiliza para PCR cualitativa. Sin embargo, el SYBR® Green I se utiliza a menudo como la primera etapa para optimizar un ensayo de sistema de deteccion espedfico, para comprobar la especificidad de los cebadores y validar el diseno.

Colorantes de fusion de alta resolucion (colorantes HRM): El analisis de Curva de Fusion de Alta Resolucion es una nueva tecnologfa emergente que caracteriza muestras de acido nucleico en funcion de su comportamiento de disociacion. Combina el principio de colorantes intercalantes, analisis de curva de fusion y la aplicacion de analisis estadfsticos espedficos. La HRM utiliza la propiedad fundamental de la separacion de las dos cadenas de ADN con calor (fusion) y el seguimiento de esta fusion con un colorante fluorescente. Al contrario que el SYBR Green, los colorantes HRM no inhiben la PCR en altas concentraciones. En consecuencia, el colorante puede saturar el ADNds diana amplificado y emite fluorescencia. La temperatura de fusion de una diana de ADNds depende del contenido, la longitud y la secuencia de GC. Debido a la alta sensibilidad de los colorantes HRM, incluso un solo cambio de base inducira diferencias en la curva de fusion, y por consiguiente en la fluorescencia (Erali M. et al., 2008). Este metodo emergente es menos costoso y tan preciso como los metodos basados en sondas. Actualmente, solo unos pocos termocicladores existentes en el mercado permiten el uso de esta tecnologfa, entre ellos el Roche LightCycler®480, el Corbett Life Science Rotor-GeneTM 6000 y el ABI Prism®7500. Los principales colorantes HRM disponibles son EvaGreen, LCGreen®, SYTO® 9 y BEBO.

Sondas TaqMan® = sondas de Colorante Doble: Las sondas TaqMan®, tambien llamadas Oligonucleotidos de Colorante Doble, Sondas de Colorante Doble o sondas de Etiquetado Doble, son el tipo de sondas mas utilizado y con frecuencia son el metodo de eleccion para cientfficos que acaban de empezar a utilizar PCR en tiempo real. Fueron desarrolladas por Roche (Basilea, Suiza) y ABI (Foster City, EE. UU.) a partir de un ensayo que originalmente utilizaba una sonda radiomarcada (Holland et al. 1991), que consistfa en una secuencia de sonda monocatenaria que era complementaria a una de las cadenas del amplicon. Un fluoroforo se une al extremo 5' de la sonda y un desactivador de fluorescencia (quencher) al extremo 3'. El fluoroforo es excitado por la maquina y pasa su energfa, a traves de FRET (Transferencia de Energfa por Resonancia de Fluorescencia) al desactivador de fluorescencia. Tradicionalmente, el par de FRET ha consistido en FAM como el fluoroforo y TAMRA como el desactivador de fluorescencia. En una sonda bien disenada, el FAM no emite fluorescencia cuando pasa su energfa al TAMRA. Como la fluorescencia de TAMRA se detecta en una longitud de onda diferente a la de FAM, el nivel de fondo de FAM es bajo. La sonda se une al amplicon durante cada etapa de reasociacion de PCR. Cuando la polimerasa Taq se extiende desde el cebador que esta unido al amplicon, desplaza el extremo 5' de la sonda, que despues es degradado por la actividad de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq. La escision continua hasta que la sonda restante separa el amplicon por fusion. Este proceso libera el fluoroforo y el desactivador de fluorescencia en solucion, separandolos en el espacio (en comparacion con cuando la sonda los mantema unidos). Esto conduce a un aumento irreversible de la fluorescencia en la FAM y a una disminucion en el TAMRA.

Sondas de Colorante Doble LNA®: El LNA® (acido nucleico bloqueado) fue desarrollado por Exiqon® (Vedbaek, Dinamarca). El LNA® cambia la conformacion de la helice y aumenta la estabilidad del duplex. La integracion de las bases de LNA® en las sondas de Oligonucleotido de Colorante Doble abre grandes oportunidades para mejorar las tecnicas que requieren sondas de alta afinidad lo mas espedficas posible, como la deteccion por SNP, el perfil de expresion y la hibridacion in situ. El LNA® es un analogo de ARN bidclico, en el que el resto de ribosa en el esqueleto de azucar-fosfato esta restringido estructuralmente por un puente de metileno entre los atomos de 2'-oxfgeno y 4'-carbono. La integracion de bases de LNA® en sondas cambia la conformacion de la doble helice del tipo B al A (Ivanova A. et al, 2007). La conformacion del LNA® permite un apilamiento mucho mejor y por lo tanto una mayor estabilidad. Mediante el aumento de la estabilidad del duplex, la integracion de monomeros de LNA® en la secuencia de oligonucleotidos permite un aumento de la temperatura de fusion (Tf) del duplex. Por lo tanto, es posible reducir el tamano de la sonda, lo que aumenta la especificidad de la sonda y ayuda a disenar la misma (Karkare S. et al., 2006).

Sondas de Baliza Molecular: Las Balizas Moleculares son sondas que contienen una estructura de tallo-lazo, con un fluoroforo y un desactivador de fluorescencia en sus extremos 5' y 3', respectivamente. El tallo suele tener 6 bases de longitud, debena consistir principalmente en C y G, y mantiene la sonda en la configuracion de horquilla (Li Y. et al., 2008). La secuencia de 'tallo' mantiene el fluoroforo y el desactivador de fluorescencia muy proximos entre sf, pero solo en ausencia de una secuencia complementaria a la secuencia de 'lazo'. Mientras el fluoroforo y el desactivador de fluorescencia estan muy proximos entre sf, el desactivador de fluorescencia absorbe cualquier foton emitido por el fluoroforo. Este fenomeno se denomina desactivacion de fluorescencia de colision (o de proximidad). En presencia de una secuencia complementaria, la Baliza se despliega y se hibrida con la diana, y entonces el fluoroforo se aleja del desactivador de fluorescencia, de modo que ya no puede absorber los fotones emitidos por el fluoroforo, y la sonda comienza a emitir fluorescencia. La cantidad de senal es proporcional a la cantidad de secuencia diana, y se mide en tiempo real para permitir la cuantificacion de la cantidad de secuencia diana (Takacs T. et al, 2008). El aumento en la fluorescencia que se produce es reversible (a diferencia de las sondas TaqMan®), ya que no hay escision de la sonda, que se puede cerrar de nuevo en la estructura de horquilla a baja temperatura. La estructura del tallo anade especificidad a este tipo de sonda, ya que el dbrido formado entre la sonda y la diana ha de ser mas fuerte que la asociacion del tallo intramolecular. Un buen diseno de Balizas Moleculares puede dar buenos resultados; sin embargo, la senal puede ser deficiente, ya que no se produce ninguna separacion ffsica entre el fluoroforo y el desactivador de fluorescencia. Las Balizas Moleculares de Cambio de Longitud de Onda son mas brillantes que las Balizas Moleculares estandar debido a una mayor intensidad de fluorescencia del fluoroforo emisor. Estas sondas contienen un fluoroforo recolector que presenta una fuerte absorcion en el rango de longitudes de onda de la fuente de luz monocromatica, un fluoroforo emisor del color de emision deseado y un desactivador de fluorescencia no fluorescente (oscuro). En ausencia de dianas de acido nucleico complementarias, las sondas no son fluorescentes, mientras que en presencia de dianas, emiten fluorescencia, no en el rango de emision del fluoroforo recolector, que absorbe la luz, sino en el rango de emision del fluoroforo emisor. Este cambio en el espectro de emision se debe a la transferencia de la energfa absorbida desde el fluoroforo recolector al fluoroforo emisor por FRET, que solo tiene lugar en sondas que estan unidas a las dianas. Las Balizas Moleculares de Cambio de Longitud de Onda son sustancialmente mas brillantes que las Balizas Moleculares convencionales, que no pueden absorber eficientemente la energfa de la fuente de luz monocromatica disponible (Tyagi S. et al, 2000).

Cebadores Scorpions®: Los cebadores Scorpions® son adecuados tanto para PCR en Tiempo Real cuantitativa como para genotipado/analisis de punto final de dianas de ADN espedficas. Se trata de cebadores de PCR con una cola de "tallo-lazo" que consiste en una secuencia de sonda espedfica, un fluoroforo y un desactivador de fluorescencia. La cola de "tallo-lazo" esta separada de la secuencia del cebador de PCR por un "bloqueador de PCR", una modificacion qrnmica que evita que la polimerasa Taq copie la secuencia del tallo lazo del cebador Scorpions®. Dicha ultralectura conducina a una apertura inespedfica del lazo, produciendo una senal fluorescente inespedfica. El lazo de la horquilla esta unido al extremo 5' de un cebador a traves de un bloqueador de PCR. Despues de la extension del cebador durante la amplificacion por PCR, la secuencia de la sonda espedfica se puede unir a su complemento dentro de la misma cadena de ADN. Este evento de hibridacion abre el lazo de la horquilla, de modo que la fluorescencia ya no se desactiva y se observa un aumento en la senal. El sondeo unimolecular es cineticamente favorable y altamente eficiente. La union covalente de la sonda al amplicon diana asegura que cada sonda tenga una diana en sus inmediaciones. No se requiere escision enzimatica, lo que reduce el tiempo necesario para la senalizacion en comparacion con las sondas TaqMan®, que se han de unir y dividir antes de que se observe un aumento de la fluorescencia. Hay tres tipos de cebadores Scorpions®. Standard Scorpions®, que consisten en una sonda bi-etiquetada con un colorante fluorescente en el extremo 5' y un desactivador de fluorescencia interno no fluorescente. FRET Scorpions®, para uso en un sistema LightCycler®. Como el sistema capilar solo se excitara a 470 nm (longitud de onda de absorcion de FAM), es necesario incorporar un FAM dentro del tallo. Se dispone un ROX en el extremo 5' del cebador Scorpions®, el FAM se excita y pasa su energfa al ROX. Tambien se han desarrollado Duplex Scorpions® para proporcionar una intensidad de senal mucho mejor que el formato de Scorpions® normal. En Standard Scorpions®, el desactivador de fluorescencia y el fluoroforo permanecen dentro de la misma cadena de ADN y se puede producir cierta desactivacion de fluorescencia incluso en forma abierta. En el Duplex Scorpions® el desactivador de fluorescencia esta en un oligonucleotido diferente y la separacion ffsica entre el desactivador de fluorescencia y el fluoroforo aumenta considerablemente, reduciendo la desactivacion de fluorescencia cuando la sonda se une a la diana.

Sondas de hibridacion (tambien llamadas sondas FRET): Roche ha desarrollado sondas de hibridacion (Caplin et al.

1999) para utilizarlas con su LightCycler®. Dos sondas estan disenadas para unirse una junto a la otra en el amplicon. Una tiene una etiqueta 3' de FAM, mientras que la otra tiene un colorante 5' LC, LC rojo 640 o 705. Cuando las sondas no estan unidas a la secuencia diana, la senal fluorescente del colorante indicador no se detecta. Sin embargo, cuando las sondas se hibridan con la secuencia diana durante la etapa de reasociacion de PCR, la proximidad de los dos fluoroforos permite la transferencia de energfa del donador al colorante aceptor, dando como resultado una senal fluorescente, que es detectada.

Sondas TaqMan® MGB®: Las sondas TaqMan® MGB® han sido desarrolladas por Epoch Biosciences (Bothell, EE. UU.) y Applied Biosystems (Foster City, EE. UU.). Se unen al surco menor de la helice de ADN con gran especificidad y afinidad. Cuando la sonda TaqMan® MGB® se complementa con ADN, forma un duplex muy estable con ADN. La sonda porta el resto MGB® en el extremo 3'. La MGB aumenta fuertemente la Tf de la sonda, permitiendo disenos mas cortos y por lo tanto mas espedficos. La sonda funciona particularmente bien con regiones ricas en A/T y tiene muy buenos resultados en la deteccion de SNP (Walburger et al., 2001). Tambien puede ser una buena alternativa cuando se intenta disenar una sonda que debena estar ubicada en la union de empalme (para lo que las sondas convencionales son diffciles de disenar). Las sondas mas pequenas se pueden disenar con una Tf tal como 65-67 °C, lo que produce una mejor distincion (la sonda es mas espedfica para un solo apareamiento erroneo). Una buena alternativa a las sondas MGB son las sondas LNA®, en las que el aumento de la Tf inducido por la adicion de bases LNA® es espedfico, al contrario que el resto MGB (vease p. 15). Durante la etapa de extension de cebador, la actividad de exonucleasa 5' de la polimerasa Taq escinde la sonda hibridada y se observa un aumento en la fluorescencia. La fluorescencia de la sonda escindida durante la PCR se controla en Tiempo Real mediante el termociclador.

Sondas MGB Eclipse®: Las sondas MGB Eclipse®, tambien conocidas como QuantiProbes, fueron desarrolladas originalmente por Epoch Biosciences (Bothell, EE. UU.). Las sondas MGB Eclipse® portan un resto de ligante de surco menor que permite el uso de sondas cortas para una especificidad muy alta. Se trata de sondas lineales cortas que tienen un ligante de surco menor y un desactivador de fluorescencia en el extremo 5' y un fluoroforo en el extremo 3'. Esta es la orientacion opuesta a las sondas TaqMan® MGB® y se cree que el ligante de surco menor evita que la actividad exonucleasa de la polimerasa Taq escinda la sonda. El desactivador de fluorescencia es un Desactivador de Fluorescencia No Fluorescente tambien conocido como Eclipse Dark Quencher. La desactivacion de fluorescencia se produce cuando el enrollamiento aleatorio de la sonda en la forma libre acerca el desactivador de fluorescencia y el fluoroforo entre sr La sonda se endereza cuando se une a su diana y se reduce la desactivacion de fluorescencia, lo que conduce a un aumento de la senal fluorescente. Las tecnologfas que se han discutido mas arriba son las mas utilizadas en la actualidad, pero muchas otras tecnologfas se han presentado en publicaciones, o estan disponibles en el mercado, tales como: sondas Resonsense, sondas Light-up, sondas HyBeacon®, cebadores LUX, sondas Yin-yang, o Amplifluor®. Pueden ponerse en contacto con nosotros para mas informacion sobre cualquiera de ellas.

La mayona de los termocicladores existentes ahora en el mercado ofrecen caractensticas similares. Por regla general, los termocicladores implican un formato de capilares de vidrio, tubos de plastico, placas de 96 pocillos o placas de 384 pocillos. El termociclador tambien implica un analisis por software.

En general, la PCR cuantitativa implica el uso de:

- Polimerasa Taq: Una polimerasa HotStart Taq esta inactiva a bajas temperaturas (temperatura ambiente). Un calentamiento a 95 °C durante varios minutos, generalmente de 5 a 10, activa la enzima, y la amplificacion puede comenzar una vez que los cebadores estan reasociados. La enzima no esta activa hasta que se desnaturaliza todo el ADN. Existen dos modificaciones principales de HotStart, el Taq bloqueado por anticuerpos y el Taq bloqueado qmmicamente. El Taq bloqueado por anticuerpos esta inactivo porque esta unido a un inhibidor termolabil que se desnaturaliza durante la etapa inicial de la PCR. El Taq bloqueado qmmicamente proporciona una clara ventaja sobre el Taq bloqueado por anticuerpos, ya que es completamente inactivo a 60 °C (la temperatura de hibridacion de los cebadores), evitando asf la formacion de amplificacion inespedfica y reduciendo la formacion de dfmeros de cebador.

- dNTp/dUTp: Algunos kits contienen una mezcla de dNTP y dUTP, otros solo contienen dNTP. El uso unicamente de dNTP aumenta la sensibilidad. La razon de ello consiste en que la Taq incorpora dNTP mas facilmente que dUTP. Sin embargo, el uso de una mezcla que contiene dUTP proporciona seguridad al ensayo en caso de contaminacion de un producto de PCR anterior. Esta contaminacion se puede eliminar gracias a la actividad de UNG en asociacion con las dUTP incorporadas. - Uracil-N-Glicosilasa: La Uracil-N-Glicosilasa es una enzima que hidroliza todo el ADN monocatenario y bicatenario que contiene dUTP. En consecuencia, si todas las amplificaciones por PCR se realizan en presencia de una mezcla de dNTP/dUTP, cualquier producto de PCR anterior se puede eliminar llevando a cabo una etapa UNG antes de cada ejecucion.

- Colorante de referencia ROX: Algunos termocicladores requieren MasterMix que contiene colorante ROX para la normalizacion. Este es el caso de las maquinas ABI y Eppendorf, y es opcional en las maquinas Stratagene. Si se trabaja con estas maquinas, es mas facil trabajar con el colorante ROX ya incorporado en el MasterMix en lugar de anadirlo manualmente. Esto garantiza un mayor nivel de reproducibilidad y homogeneidad de los ensayos.

- Fluorescema: para las maquinas iCycler iQ®, My iQ® e iQ5 (termocicladores BioRad), el metodo de normalizacion para el ensayo SYBR® Green utiliza Fluorescema para crear un "fondo virtual". Al igual que en el caso del ROX, es mejor y mas facil utilizar un MasterMix que contenga Fluorescema previamente diluida, lo que garantiza una mayor reproducibilidad y homogeneidad de los ensayos. - MgCh: El MgCh es necesario para la actividad de Taq. La concentracion de MgCl en MasterMixes se optimiza de acuerdo con la cantidad de Taq y tambien la composicion del tampon. Sin embargo, a veces puede ser necesario agregar MgCh y la mayona de los MasterMixes incluyen un tubo adicional de MgCl2.

- Colorante de color inerte: Algunos tampones tambien incluyen un colorante de color inerte para permitir la visualizacion del tampon cuando se carga en los pocillos. Este colorante de color no tiene ningun efecto en la sensibilidad del ensayo y es una herramienta de trabajo conveniente. Se ha de tener en cuenta que dichas mezclas, en combinacion con las placas de plastico blancas, proporcionan mejores niveles de fluorescencia y una forma de trabajar realmente sencilla.

Unos cebadores y sondas bien disenados son un requisito previo para el exito de una PCR cuantitativa. Mediante el uso de cebadores y sondas bien disenados se pueden obtener eficiencias de PCR de un 100%. Por lo general, los cebadores se disenan utilizando un software de diseno (por ejemplo, el Oligo® Primer Analysis Software). La mayona de los softwares de termocicladores ofrecen ahora herramientas para ayudar en el diseno de cebadores con las mejores caractensticas. Algunos de los mejores softwares son Beacon Designer, Primer Express y DNA Star ... Algunas otras herramientas estan disponibles gratuitamente en la web, por ejemplo:

- http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ (base de datos de sondas y cebadores humanos)

- http://firontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/ (para probar estructuras secundarias)

- http://www.ebi.ac.uk/~lenov/meltinghome.html (calculadoras de Tf)

- http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

- http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2

- http://www.premierbiosoft.com/qpcr/index

Por regla general, la Q PCR implica la preparacion de una curva patron para cada secuencia de acido nucleico diana amplificada. De hecho, la preparacion de una curva patron puede proporcionar una buena idea del rendimiento de la qPCR y, por lo tanto, sirve como control de calidad. La curva patron debena cubrir el rango completo de la expresion esperada. Utilizando material estandar, la curva patron debena incluir al menos 5 puntos de dilucion, cada uno de ellos por duplicado (al menos). El rango de dilucion de 10 o 2 veces debena cubrir el rango mas grande de niveles de expresion. El trazado de estos puntos en una curva patron determinara la linealidad, la eficiencia, la sensibilidad y la reproducibilidad del ensayo. De acuerdo con la presente invencion, la curva patron se prepara a partir de una muestra de ADN genomico. Tal como se usa en la presente memoria, "muestra de ADN genomico" o "ADNg" se refiere a una muestra de ADN genomico preparada a partir de una preparacion de ADN. Los metodos para la purificacion de ADN son muy conocidos en la tecnica. El ADN genomico se puede preparar a partir de una celula que sea del mismo organismo que la celula utilizada para preparar la muestra de acido nucleico de la invencion (es decir, una celula humana). Ademas, la celula a partir de la cual se prepara la muestra genomica debe presentar la misma ploidfa que la celula utilizada para preparar la muestra de acido nucleico de la invencion; es decir, las celulas presentan las mismas anomalfas cromosomicas (por ejemplo, en caso de celulas cancerosas). Por regla general, la muestra de ADN genomico se prepara a partir de una celula para la cual el DII tal como se define mas arriba es de aproximadamente 1.

Valores de referencia correspondientes predeterminados:

Por regla general, el valor de referencia correspondiente predeterminado puede ser relativo a un numero o valor derivado de estudios de poblacion, incluidos, entre otros, individuos del mismo o similar rango de edad, individuos del mismo o similar grupo etnico, individuos con riesgo de cancer e individuos que presentan la misma gravedad de cancer. Dichos valores de referencia correspondientes predeterminados se pueden derivar de analisis estadfsticos y/o de datos de prediccion de riesgo de poblaciones obtenidos a partir de algoritmos matematicos e indices calculados de la enfermedad.

Por regla general, el valor de referencia correspondiente predeterminado es un valor umbral o un valor de corte. Un "valor umbral" o "valor de corte" se puede determinar experimental, emprnca o teoricamente. Un valor umbral tambien se puede seleccionar arbitrariamente sobre la base de las condiciones experimentales y/o clmicas existentes, tal como lo reconocena un experto en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar la medicion retrospectiva del nivel de expresion del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear) en muestras historicas de individuos correctamente acumuladas para establecer el valor de referencia correspondiente predeterminado. En algunas realizaciones, el valor de referencia correspondiente predeterminado es la mediana medida en la poblacion de los individuos para el marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear). En algunas realizaciones, el valor umbral se debe determinar para obtener la sensibilidad y especificidad optimas de acuerdo con la funcion de la prueba y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clmicas de falso positivo y falso negativo). Por regla general, la sensibilidad y especificidad optimas (y, por lo tanto, el valor umbral) se pueden determinar utilizando una curva Caractenstica Operativa del Receptor (ROC) basada en datos experimentales. Por ejemplo, despues de determinar el nivel de expresion del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear) en un grupo de referencia, se puede utilizar un analisis algontmico para el tratamiento estadfstico de los niveles de expresion determinados en las muestras que se han de probar, para de este modo obtener un patron de clasificacion significativo para la clasificacion de la muestra. El nombre completo de la curva ROC es curva caractenstica del operador del receptor, que tambien se conoce como curva caractenstica operativa del receptor. Se utiliza principalmente para pruebas de diagnostico bioqmmico clmico. La curva ROC es un indicador integral que refleja las variables continuas de la tasa de positivos reales (sensibilidad) y la tasa de positivos falsos (1-especificidad). Revela la relacion entre sensibilidad y especificidad con el metodo de composicion de imagenes. Una serie de valores de corte diferentes (umbrales o valores cnticos, valores lfmite entre los resultados normales y anomalos de la prueba de diagnostico) se establece como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad se utiliza despues como la coordenada vertical y la especificidad se utiliza como la coordenada horizontal para dibujar una curva. Cuanto mayor es el area bajo la curva (ABC), mayor es la precision del diagnostico. En la curva ROC, el punto mas cercano a la esquina superior izquierda del diagrama de coordenadas es un punto cntico que tiene valores tanto de alta sensibilidad como de alta especificidad. El valor ABC de la curva ROC esta entre 1,0 y 0,5. Cuando ABC > 0,5, el resultado del diagnostico mejora progresivamente a medida que el ABC se aproxima a 1. Cuando el ABC esta entre 0,5 y 0,7, la precision es baja. Cuando la ABC esta entre 0,7 y 0,9, la precision es moderada. Cuando la ABC es mayor de 0,9, la precision es bastante alta. Este metodo algontmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Para dibujar la curva ROC se pueden utilizar softwares o sistemas existentes en la tecnica, tales como: el software estadfstico medico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., EE. UU.), etc.

En algunas realizaciones, el valor de referencia correspondiente predeterminado se determina por regla general mediante la realizacion de un metodo que comprende las etapas consistentes en:

a) proporcionar una coleccion de muestras de individuos;

b) proporcionar, para cada muestra provista en la etapa a), informacion relativa al perfil clmico real del individuo (sano o con cancer);

c) proporcionar una serie de valores de cuantificacion arbitrarios;

d) determinar el nivel del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear) para cada muestra incluida en la coleccion proporcionada en la etapa a);

e) clasificar dichas muestras de sangre en dos grupos para un valor de cuantificacion arbitrario espedfico proporcionado en la etapa c), respectivamente: (i) un primer grupo que comprende muestras que presentan un valor de cuantificacion para un nivel mas bajo que dicho valor de cuantificacion arbitrario incluido en el dicha serie de valores de cuantificacion; (ii) un segundo grupo que comprende muestras que presentan un valor de cuantificacion para dicho nivel que es mas alto que dicho valor de cuantificacion arbitrario contenido en dicha serie de valores de cuantificacion; con lo que se obtienen dos grupos de muestras para dicho valor de cuantificacion espedfico, enumerandose las muestras de cada grupo por separado;

f) calcular la significacion estadfstica entre (i) el valor de cuantificacion obtenido en la etapa e) y (ii) el perfil clmico real de los individuos de los que se derivan las muestras incluidas en el primer y segundo grupo definidos en la etapa f);

g) repetir las etapas f) y g) hasta haber probado cada valor de cuantificacion arbitrario proporcionado en la etapa d); h) establecer dicho valor de referencia correspondiente predeterminado como el valor de cuantificacion arbitrario para el que se ha calculado la mayor significacion estadfstica (el mas significativo) en la etapa g).

Por lo tanto, en algunas realizaciones, el valor de referencia correspondiente predeterminado permite la distincion entre individuos sanos e individuos que padecen cancer. En la practica, los valores de alta significacion estadfstica (por ejemplo, valores P bajos) se obtienen generalmente para un rango de valores de cuantificacion arbitrarios sucesivos, y no solo para un unico valor de cuantificacion arbitrario. Por lo tanto, en una realizacion alternativa de la invencion, en lugar de utilizar un valor de referencia correspondiente predeterminado definitivo se proporciona un rango de valores. Por consiguiente, se establece arbitrariamente un valor de significacion estadfstica minima (umbral mmimo de significacion, por ejemplo, valor P umbral maximo) y se conserva un rango de una pluralidad de valores de cuantificacion arbitrarios para los cuales el valor de significacion estadfstica calculado en la etapa g) es mayor (mas significativo, por ejemplo, valor P mas bajo), con lo que se proporciona un rango de valores de cuantificacion. Este rango de valores de cuantificacion incluye un valor "de corte" tal como se ha descrito mas arriba. Por ejemplo, de acuerdo con esta realizacion espedfica de un valor "de corte", el diagnostico se puede determinar comparando el nivel del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear) con el rango de valores identificados. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, un valor de corte consiste en un rango de valores de cuantificacion, por ejemplo centrado en el valor de cuantificacion para el que se ha encontrado el valor de significacion estadfstica mas alto (por ejemplo, generalmente el valor p mmimo encontrado). Por ejemplo, en una escala hipotetica de 1 a 10, si el valor de corte ideal (el valor con la mayor significacion estadfstica) es 5, un rango adecuado (ejemplar) puede ser de 4-6. Por lo tanto, un individuo puede ser evaluado comparando valores obtenidos a traves de la medicion del nivel del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear), en donde los valores mayores (o menores, dependiendo del marcador seleccionado) de 5 revelan que el individuo padece cancer y los valores menores (o mayores, dependiendo del marcador seleccionado) de 5 revelan que el individuo no padece cancer. En algunas realizaciones, un individuo puede ser explorado en busca de un cancer comparando los valores obtenidos a traves de la medicion del nivel del marcador de interes (por ejemplo, relacion de contenido de ADNCmCn, relacion DII MITO/DII NUC, concentracion total de ADNlc nuclear) y comparando los valores en una escala, en donde los valores mayores (o menores, dependiendo del marcador seleccionado) que el rango de 4-6 indican que el individuo padece un cancer y los valores menores (o mayores, dependiendo del marcador seleccionado) que el rango de 4-6 indican que el individuo no padece un cancer, y los valores que entran dentro del rango de 4-6 indican que se requiere mas investigacion para determinar si el individuo padece un cancer.

Aplicaciones terapeuticas:

El metodo de la presente invencion permite distinguir a individuos sanos de individuos que padecen un cancer. Despues se busca el origen del cancer en el individuo para determinar su ubicacion y estadio. Un metodo para investigar la ubicacion del cancer por regla general implica tecnicas de imagen. Una vez que ha localizado el cancer en el individuo, se podnan realizar investigaciones adicionales, como biopsias, para determinar el origen, la diseminacion y el estadio del cancer.

Los metodos de la presente invencion tambien pueden ser adecuados para determinar si un individuo reune o no las condiciones necesarias para un tratamiento anticanceroso. Por regla general, un tratamiento anticanceroso consiste en radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o una combinacion de las mismas. El tratamiento tambien puede consistir en una terapia adyuvante (es decir, tratamiento despues de la reseccion quirurgica del tumor primario), o en una terapia neoadyuvante (es decir, tratamiento antes de la reseccion quirurgica del tumor primario).

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion son adecuados para determinar si un individuo reune o no las condiciones necesarias para un tratamiento con un agente quimioterapeutico. Por ejemplo, cuando se determina que el individuo tiene un diagnostico deficiente, el medico puede optar por administrarle un agente quimioterapeutico.

El concepto "agente quimioterapeutico" se refiere a compuestos qmmicos que son eficaces para inhibir el crecimiento de tumores. Algunos ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfanon y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamilaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (en especial bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); brioestatina; calliestatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratiestatina; una sarcodictina; espongiestatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibioticos tales como los antibioticos enediina (por ejemplo, caliqueamicina, en especial caliqueamicina (11 y caliqueamicina 211, vease, por ejemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una espiramicina; asf como cromoforo de neocarzinoestatina y cromomoforos de antibiotico de enediina cromoprotema relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinoestatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenergicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de acido folico, tal como acido frolmico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentoestatina; fenamet; pirarrubicina; acido podofilmico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.].) y doxetaxel (TAx Ot ERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbine; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-1 1; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); acido retinoico; capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En esta definicion tambien estan incluidos agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion de hormonas en tumores, tales como los antiestrogenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifen, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion son adecuados para determinar si un individuo reune o no las condiciones necesarias para una terapia dirigida. Por ejemplo, cuando se determina que el individuo tiene un diagnostico deficiente, el medico puede optar por administrarle una terapia dirigida.

Las terapias dirigidas contra el cancer son farmacos u otras sustancias que bloquean el crecimiento y la propagacion del cancer al interferir con moleculas espedficas ("dianas moleculares") que intervienen en el crecimiento, la progresion y la propagacion del cancer. Las terapias dirigidas contra el cancer se designan a veces como "farmacos dirigidos molecularmente", "terapias dirigidas molecularmente", "medicamentos de precision" o nombres similares.

En algunas realizaciones, la terapia dirigida consiste en administrar al individuo un inhibidor de la tirosina quinasa. El concepto "inhibidor de la tirosina quinasa" se refiere a cualquiera de una variedad de agentes terapeuticos o farmacos que actuan como inhibidores selectivos o no selectivos de las tirosina quinasas receptoras y/o no receptoras. Los inhibidores de la tirosina quinasa y los compuestos relacionados son muy conocidos en la tecnica y se describen en la publicacion de patente de EE. UU. 2007/0254295, que se incorpora en su totalidad por referencia en la presente memoria. Un experto en la tecnica entendera que un compuesto relacionado con un inhibidor de la tirosina quinasa recapitulara el efecto del inhibidor de la tirosina quinasa, por ejemplo, el compuesto relacionado actuara sobre un miembro diferente de la via de senalizacion de la tirosina quinasa para producir el mismo efecto que un inhibidor de la tirosina quinasa de dicha tirosina quinasa. Los ejemplos de inhibidores de la tirosina quinasa y compuestos relacionados adecuados para su uso en metodos de realizaciones de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a dasatinib (BMS-354825), PP2, BEZ235, saracatinib, gefitinib (Iressa), sunitinib (Sutent; SU11248), erlotinib (Tarceva; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (CI 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec; ST1571), leflunomida (SU101), vandetanib (Zactima; ZD6474), Mk-2206 (clorhidrato de 8- [4-aminociclobutil)fenil]-9-fenil-1,2,4-triazolo[3,4-f][1,6]naftiridin-3(2H)-ona) derivados de los mismos, analogos de los mismos y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en la publicacion de patente de EE. UU. 2007/0254295 y en las patentes de EE. UU. n° 5,618,829, 5,639,757, 5,728,868, 5,804,396, 6,100,254, 6,127,374, 6,245,759, 6,306,874, 6,313,138, 6,316,444, 6,329,380, 6,344,459, 6,420,382, 6,479,512, 6,498,165, 6,544,988, 6,562,818, 6,586,423, 6,586,424, 6,740,665, 6,794,393, 6,875,767, 6,927,293 y 6,958,340, todas ellas incorporadas en su totalidad por referencia en la presente memoria, se describen inhibidores de la tirosina quinasa adicionales y compuestos relacionados adecuados para su uso en la presente invencion. En determinadas realizaciones, el inhibidor de la tirosina quinasa es un inhibidor de quinasa de molecula pequena que ha sido administrado por via oral y que ha sido objeto de al menos un ensayo clmico de Fase I, mas preferiblemente de al menos un clmico de Fase II, incluso mas preferiblemente de al menos un ensayo clmico de Fase III, y de forma totalmente preferible aprobado por la FDA para al menos una indicacion hematologica u oncologica. Algunos ejemplos de dichos inhibidores incluyen, pero no se limitan a Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Canertinib, BMS-599626 (AC-480), Neratinib, KRN-633, CEP-11981, Imatinib, Nilotinib, Dasatinib, AZM-475271, CP-724714, TAK-165, Sunitinib, Vatalanib, CP-547632, Vandetanib, Bosutinib, Lestaurtinib, Tandutinib, Midostaurina, Enzastaurina, AEE-788, Pazopanib, Axitinib, Motasenib, OSI-930, Cediranib, KRN-951, Dovitinib, Seliciclib, SNS-032, PD-0332991, MKC-I (Ro-317453; R-440), Sorafenib, ABT-869, Brivanib (BMS-582664), SU-14813, Telatinib, SU-6668, (TSU-68), L-21649, MLN-8054, AEW-541 y PD-0325901.

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion son adecuados para determinar si un individuo reune o no las condiciones necesarias para un tratamiento con un agente inmunoterapeutico. Por ejemplo, cuando se determina que el individuo tiene un diagnostico deficiente, el medico puede optar por administrarle un agente inmunoterapeutico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el concepto "agente inmunoterapeutico" se refiere a un compuesto, composicion o tratamiento que indirecta o directamente mejora, estimula o aumenta la respuesta inmunitaria del cuerpo contra las celulas cancerosas y/o que disminuye los efectos secundarios de otras terapias contra el cancer. Por lo tanto, la inmunoterapia es una terapia que directa o indirectamente estimula o mejora las respuestas del sistema inmunitario a las celulas cancerosas y/o disminuye los efectos secundarios que pueden haber sido causados por otros agentes anticancerosos. La inmunoterapia tambien se designa en la tecnica como terapia inmunologica, terapia modificadora de respuesta biologica a terapia biologica y bioterapia. Algunos ejemplos de agentes inmunoterapeuticos comunes conocidos en la tecnica incluyen, pero no se limitan a citocinas, vacunas contra el cancer, anticuerpos monoclonales y adyuvantes no citocmicos. Alternativamente, el tratamiento inmunoterapeutico puede consistir en administrar al individuo una cantidad de celulas inmunitarias (celulas T, celulas NK, celulas dendnticas, celulas B...).

Los agentes inmunoterapeuticos pueden ser inespedficos, es decir, reforzar el sistema inmunitario en general, de modo que el cuerpo humano se vuelve mas eficaz en la lucha contra el crecimiento y/o la propagacion de las celulas cancerosas, o pueden ser espedficos, es decir, dirigidos a las propias celulas cancerosas. Los regfmenes de inmunoterapia pueden combinar el uso de agentes inmunoterapeuticos inespedficos y espedficos.

Los agentes inmunoterapeuticos inespedficos son sustancias que estimulan o mejoran indirectamente el sistema inmunitario. Los agentes inmunoterapeuticos inespedficos se han utilizado solos como terapia principal para el tratamiento del cancer, asf como de forma adicional a una terapia principal, en cuyo caso el agente inmunoterapeutico inespedfico actua como un adyuvante para mejorar la eficacia de otras terapias (por ejemplo, vacunas contra el cancer). Los agentes inmunoterapeuticos inespedficos tambien pueden actuar en este ultimo contexto para reducir los efectos secundarios de otras terapias, por ejemplo, la supresion de la medula osea inducida por determinados agentes quimioterapeuticos. Los agentes inmunoterapeuticos inespedficos pueden actuar sobre celulas clave del sistema inmunitario y provocar respuestas secundarias, como un aumento de la produccion de citocinas e inmunoglobulinas. Alternativamente, los propios agentes pueden comprender citocinas. Los agentes inmunoterapeuticos se clasifican generalmente como citocinas o adyuvantes no citodnicos.

Una serie de citocinas tienen aplicacion en el tratamiento del cancer, bien como inmunoterapias inespedficas generales disenadas para reforzar el sistema inmunitario, bien como adyuvantes administrados con otras terapias. Las citocinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a interferones, interleucinas y factores estimulantes de colonias.

Los interferones (IFN) contemplados por la presente invencion incluyen los tipos comunes de IFN, IFN-alfa (IFN-a), IFN-beta (IFN-beta) e IFN-gamma (FN-y). Los IFN pueden actuar directamente sobre las celulas cancerosas, por ejemplo disminuyendo su crecimiento, promoviendo su desarrollo hacia celulas con un comportamiento mas normal y/o aumentando su produccion de antfgenos, lo que hace que las celulas cancerosas sean mas faciles de reconocer y destruir por el sistema inmunitario. Los IFN tambien pueden actuar indirectamente sobre celulas cancerosas, por ejemplo ralentizando la angiogenesis, reforzando el sistema inmunitario y/o estimulando las celulas asesinas naturales (NK), las celulas T y los macrofagos. El IFN-alfa recombinante esta disponible comercialmente como Roferon (Roche Pharmaceuticals) e Intron A (Schering Corporation). El uso de IFN-alfa, solo o en combinacion con otros agentes inmunoterapeuticos o con agentes quimioterapeuticos, ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de diversos canceres, incluyendo melanoma (incluyendo melanoma metastasico), cancer de rinon (incluyendo cancer de rinon metastasico), cancer de mama, cancer de prostata y cancer de cuello uterino (incluyendo cancer de cuello uterino metastasico).

Las interleucinas contempladas por la presente invencion incluyen IL-2, IL-4, IL-11 e IL-12. Algunos ejemplos de interleucinas recombinantes disponibles comercialmente incluyen Proleukin® (IL-2; Chiron Corporation) y Neumega® (IL-12; Wyeth Pharmaceuticals). Zymogenetics, Inc. (Seattle, Washington) esta probando actualmente una forma recombinante de IL-21, que tambien se contempla para utilizarla en las combinaciones de la presente invencion. Las interleucinas, solas o en combinacion con otros agentes inmunoterapeuticos o con agentes quimioterapeuticos, han demostrado ser eficaces en el tratamiento de diversos canceres, incluyendo cancer de rinon (incluyendo cancer de rinon metastasico), melanoma (incluyendo melanoma metastasico), cancer de ovario (incluyendo cancer de ovario recurrente), cancer de cuello uterino (incluyendo cancer de cuello uterino metastasico), cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, cancer de cerebro y cancer de prostata.

Las interleucinas tambien han mostrado una buena actividad en combinacion con IFN-alfa en el tratamiento de diversos canceres (Negrier et al., Ann Oncol. 200213 (9): 1460-8; Touranietal, J. Clin. Oncol. 200321(21): 398794).

Los factores estimulantes de colonias (CSF) contemplados por la presente invencion incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF o filgrastim), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF o sargramostim) y la eritropoyetina (epoetina alfa, darbepoetina). El tratamiento con uno o mas factores de crecimiento puede ayudar a estimular la generacion de nuevas celulas sangumeas en individuos sometidos a quimioterapia tradicional. Por consiguiente, el tratamiento con CSF puede ser util para disminuir los efectos secundarios asociados con la quimioterapia y puede permitir el uso de dosis mayores de agentes quimioterapeuticos. Diversos factores estimulantes de colonias recombinantes estan disponibles comercialmente, por ejemplo Neupogen® (G-CSF; Amgen), Neulasta (pelfilgrastim; Amgen), Leukine (GM-CSF; Berlex), Procrit (eritropoyetina; Ortho Biotech), Epogen (eritropoyetina; Amgen), Arnesp (eritropoyetina). Algunos factores estimulantes de colonias han demostrado ser eficaces en el tratamiento de canceres, incluyendo melanoma, cancer colorrectal (incluyendo cancer colorrectal metastasico) y cancer de pulmon.

Los adyuvantes no citocmicos adecuados para utilizarlos en las combinaciones de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a Levamisol, hidroxido de alumbre (alumbre), bacilo Calmette-Guerin (ACG), Adyuvante de Freund incompleto (IFA), QS-21, DETOX, hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) y dinitrofenilo (DNP). Los adyuvantes no citocmicos en combinacion con otros agentes inmunoterapeuticos y/o quimioterapeuticos han demostrado ser eficaces contra diversos canceres, incluyendo, por ejemplo, cancer de colon y cancer colorrectal (Levimasol); melanoma (BCG y QS-21); cancer de rinon y cancer de vejiga (BCG).

Ademas de tener dianas espedficas o no espedficas, los agentes inmunoterapeuticos pueden ser activos, es decir, estimular la respuesta inmunitaria propia del cuerpo, o pueden ser pasivos, es decir, comprender componentes del sistema inmunitario generados fuera del cuerpo.

Por regla general, la inmunoterapia espedfica pasiva implica el uso de uno o mas anticuerpos monoclonales que son espedficos para un antfgeno particular que se encuentra en la superficie de una celula cancerosa o que son espedficos para un factor de crecimiento celular en particular. Los anticuerpos monoclonales se pueden utilizar en el tratamiento del cancer de diversos modos, por ejemplo para mejorar la respuesta inmunitaria de un individuo a un tipo espedfico de cancer, para interferir en el crecimiento de las celulas cancerosas dirigiendose a factores de crecimiento celular espedficos, como los que intervienen en la angiogenesis, o mejorando el suministro de otros agentes anticancerosos a celulas cancerosas cuando estan unidos o conjugados con agentes tales como agentes quimioterapeuticos, partmulas radiactivas o toxinas.

Los anticuerpos monoclonales utilizados actualmente como agentes inmunoterapeuticos contra el cancer que son adecuados para su inclusion en las combinaciones de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a rituximab (Rituxan®), trastuzumab (Herceptin®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), tositumomab (Bexxar®), cetuximab (C-225, Erbitux®), bevacizumab (Avastin®), gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg®), alemtuzumab (Campath®) y BL22. Los anticuerpos monoclonales se utilizan en el tratamiento de una amplia gama de canceres, incluido cancer de mama (incluyendo cancer de mama metastasico avanzado), cancer colorrectal (incluyendo cancer colorrectal avanzado y/o metastasico), cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata, cancer de cuello uterino, melanoma y tumores cerebrales. Otros ejemplos incluyen anticuerpos anti-CTLA4 (por ejemplo, Ipilimumab), anticuerpos anti-PD1, anticuerpos anti-PDL1, anticuerpos anti-TIMP3, anticuerpos anti-LAG3, anticuerpos anti-B7H3, anticuerpos anti-B7H4 o anticuerpos anti-B7H6.

Por regla general, la inmunoterapia espedfica activa implica el uso de vacunas contra el cancer. Se han desarrollado vacunas contra el cancer que comprenden celulas cancerosas enteras, partes de celulas cancerosas o uno o mas antigenos derivados de celulas cancerosas. Algunas vacunas contra el cancer, solas o en combinacion con uno o mas agentes inmunoterapeuticos o quimioterapeuticos, estan siendo investigadas en el tratamiento de diversos tipos de cancer, incluyendo melanoma, cancer de rinon, cancer de ovario, cancer de mama, cancer colorrectal y cancer de pulmon. Algunos agentes inmunoterapeuticos inespedficos son utiles en combinacion con vacunas contra el cancer para mejorar la respuesta inmunitaria del cuerpo.

El tratamiento inmunoterapeutico puede consistir en una inmunoterapia adoptiva de acuerdo con la descripcion de Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley y Steven A. Rosenberg "Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volumen 12, abril de 2012). En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos circulantes del individuo o los linfocitos infiltrados en el tumor se afslan in vitro, se activan mediante linfocinas tales como la IL-2 o se exudan con genes para necrosis tumoral, y se vuelven a administrar (Rosenberg et al., 1988; 1989). De forma totalmente preferible, los linfocitos activados son las celulas del propio individuo previamente aisladas de una muestra de sangre o de tumor y activadas (o "expandidas") in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresion de melanoma y de carcinoma renal.

En algunas realizaciones, los metodos de la presente invencion son adecuados para determinar si un individuo reune o no las condiciones necesarias para un tratamiento con un agente radioterapeutico. Por ejemplo, cuando se determina que el individuo tiene un diagnostico deficiente, el medico puede optar por administrarle un agente radioterapeutico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el concepto "agente radioterapeutico" tiene la finalidad de referirse a cualquier agente radioterapeutico conocido por un experto en la tecnica por ser eficaz para tratar o mejorar el cancer, sin limitacion. Por ejemplo, el agente radioterapeutico puede ser un agente tal como los administrados en braquiterapia o terapia por radionucleidos. Dichos metodos tambien pueden comprender opcionalmente la administracion de una o mas terapias contra el cancer adicionales, tales como, entre otras, quimioterapias y/u otra radioterapia.

Los metodos de la presente invencion tambien son adecuados para determinar la eficacia de un tratamiento anteriormente mencionado en el individuo.

En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba) que comprende las etapas (o una de cada) consistentes en i) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn antes del tratamiento, ii) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn despues del tratamiento, iii) comparar la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) con la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) y concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) es mayor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es menor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i).

En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba) que comprende las etapas consistentes en i) determinar la relacion DII MITO/DII NUC antes del tratamiento, ii) determinar la relacion DII MlTO/DII NUC despues del tratamiento, iii) comparar la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) con la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) y concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) es menor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es mayor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i).

En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba) que comprende las etapas (o una de cada) consistentes en i) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn antes del tratamiento, ii) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn despues del tratamiento, iii) comparar la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) con la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) y concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) es mayor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es menor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i). En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba) que comprende las etapas consistentes en i) determinar la relacion DII MITO/DII NUC antes del tratamiento, ii) determinar la relacion DII MlTO/DII NUC despues del tratamiento, iii) comparar la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) con la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) y concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) es menor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es mayor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i).

Los metodos de la presente invencion arriba mencionados son particularmente adecuados para distinguir al respondedor del no respondedor. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "respondedor" en el contexto de la presente descripcion se refiere a un individuo que lograra una respuesta, es decir, un individuo en el que el cancer se erradica, reduce o mejora, o se estabiliza de modo que la enfermedad no progresa despues del tratamiento. En los respondedores, en los que el cancer se estabiliza, el penodo de estabilizacion es tal que la calidad de vida y/o la esperanza de vida de los individuos aumenta (por ejemplo, enfermedad estable durante mas de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o mas meses) en comparacion con un individuo que no recibe el tratamiento. Los individuos no respondedores o resistentes al tratamiento incluyen individuos en los el cancer no muestra reduccion o mejona despues del tratamiento. Opcionalmente, la caracterizacion del individuo como respondedor o no respondedor se puede realizar por referencia a un patron o un conjunto de adiestramiento. El patron puede consistir en el perfil de un individuo del que se sabe que es respondedor o no respondedor, o alternativamente puede consistir en un valor numerico. Dichos patrones predeterminados se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, como una lista o diagrama impreso, un programa de software de ordenador, u otros medios. Cuando se concluye que el individuo es no respondedor, el medico podna tomar la decision de interrumpir el tratamiento para evitar mas efectos secundarios adversos.

En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo que ha padecido un cancer tiene una recafda despues de un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba e incluyendo la reseccion del tumor) que comprende las etapas (o una de cada) consistentes en i) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn despues del tratamiento, ii) comparar la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) con un valor de referencia correspondiente predeterminado, iii) y concluir que el individuo tiene una recafda cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no ha recafdo cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

En particular, la presente invencion se refiere ademas a un metodo para determinar si un individuo que ha padecido un cancer tiene una recafda despues de un tratamiento (tal como se ha mencionado mas arriba e incluyendo la reseccion del tumor) que comprende las etapas consistentes en i) determinar la relacion DII MITO/DII NUC, ii) comparar la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) con un valor de referencia correspondiente predeterminado, iii) y concluir que el individuo tiene una recafda cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no ha recafdo cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "recafda" se refiere a la reaparicion de un cancer o de los signos y smtomas de un cancer despues de un penodo de mejona en el que no se podfa detectar ningun cancer. La causa de la recafda probable consiste en que algunas de las celulas cancerosas originales sobrevivieron al tratamiento inicial. Algunas veces, esto se debe a que las celulas cancerosas se diseminaron a otras partes del cuerpo y eran demasiado pequenas para ser detectadas durante el seguimiento que se tiene lugar despues del tratamiento (metastasis).

Por regla general, la relacion de contenido de ADNCmCn y/o la relacion DII MITO/DII NUC se determina despues de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 meses o mas despues de finalizar el tratamiento. La invencion se ilustrara adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no han de ser interpretados en modo alguno como limitativos del alcance de la presente invencion.

Figuras:

Figura 1: Diseno de conjunto de cebadores para estudiar la cuantificacion y la fragmentacion del ADN nuclear y mitocondrial.

Figura 2: A. Grafico de puntos de la relacion de contenido de ADNCmCn en sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con CCR desde el estadio I al IV (n = 146). B. Grafico de puntos de la relacion de contenido de ADNCmCn en sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con CCR en los estadios I/M/IM (n = 74). C. Grafico de puntos de la relacion de contenido de ADNCmCn en sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con CCR en los estadios I/N/IM (n = 72).

Figura 3: A. Capacidad predictiva de diagnostico de la de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir plasma de pacientes con CCR (n = 138) y de individuos sanos (n = 80). Representacion de la curva ROC derivada del analisis logfstico univariante correspondiente al ADNlc total (ABC = 0,98). B. Capacidad predictiva de diagnostico de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir plasmas de pacientes con CCR en los estadios I-III (n = 74) y de individuos sanos (n = 80). Representacion de la curva rOc derivada del analisis logfstico univariante correspondiente al ADNlc total (ABC = 0,98). C. Capacidad predictiva de diagnostico de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir plasmas de pacientes con CCR en el estadio IV (n = 72) y de individuos sanos (n = 80). Representacion de la curva ROC derivada del analisis logfstico univariante correspondiente al ADNlc total (ABC = 0,98).

Figura 4: Grafico de puntos de la relacion de contenido de ADNCmCn en sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con cancer de pulmon desde el estadio I al IV (n = 73).

Figura 5: Capacidad predictiva de diagnostico de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir plasma de pacientes con cancer de pulmon (n = 73) y de individuos sanos (n = 80). Representacion de la curva ROC derivada del analisis logfstico univariante correspondiente al ADNlc total (ABC = 0,99).

Figura 6: Valores de la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en plasma de pacientes con cancer (cfrculo) y de individuos sanos (cuadrado).

Figura 7: Comparacion entre la concentracion de ADN mitocondrial circulante en la sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con cancer (n = 207).

Figura 8: A. Comparacion entre la concentracion de ADN nuclear circulante en la sangre de individuos sanos (n = 80) y de pacientes con cancer (n = 207). B. Capacidad predictiva de diagnostico de la concentracion de ADNlc nuclear para distinguir plasma de pacientes con cancer (n = 207) y de individuos sanos (n = 80). Representacion de la curva ROC derivada del analisis logfstico univariante correspondiente al ADNlc total (ABC = 0,82).

Figura 9: Analisis de la curva ROC del contenido de ADNCm con comparacion de 80 pacientes sanos y 207 con cancer.

Figura 10: Esquema del diseno del murido dirigido a secuencias mitocondriales y nucleares detectadas en el ensayo Q-PCR.

Figura 11: Comparacion de la relacion de contenido de ADNCmCn de ADNlc derivado de tumor y no derivado de tumor en ratones con injerto heterologo HCT 116.

Figura 12: Comparacion de la relacion de contenido de ADNCmCn de ADNlc derivado de tumor y no derivado de tumor en ratones con injerto heterologo de SW620 (n = 14).

Figura 13: Comparacion entre la relacion de contenido ADNCmCn en el sobrenadante de varias lmeas de celulas tumorales y lmeas de celulas normales.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Determinacion de la relacion de contenido de ADNCmCn en individuos sanos y con cancer.

Material y metodos:

Las muestras de sangre de individuos sanos se obtienen en el Etablissement frangais du sang (convencion EFS n° 21/PLER/MTP/INSERM02/2013-0073). La sangre de pacientes con CCR se obtiene del estudio clmico Kplex 1 y Kplex2, habiendo firmado los pacientes un consentimiento informado para el analisis genetico de su sangre. Tambien obtuvimos muestras de sangre de cohortes de los centros hospitalarios de Clermont-Ferrand y Limoges en Francia, habiendo firmado los pacientes un consentimiento informado para el analisis genetico de su sangre. Las muestras de plasma de cancer de pulmon proceden del Manchester Hospital (Reino Unido), habiendo firmado los pacientes un consentimiento informado para el analisis genetico de su sangre. Las muestras de plasma de cancer hepatocelular (CHC°) se obtuvieron en la CHU de Montpellier), habiendo firmado los pacientes un consentimiento informado para el analisis genetico de su sangre.

Aislamiento de plasma y extraccion de ADNlc: Las muestras se manejaron de acuerdo con la pauta preanaMtica establecida por nosotros (CCA). Se recogio una muestra de 4 ml de sangre de pacientes en tubos con EDTA. La sangre se centrifugo a 1.200 g a 4 °C en una centnfuga Heraeus Multifuge LR durante 10 min. Los sobrenadantes se aislaron en tubos Eppendorf esteriles de 1,5 ml y se centrifugaron a 16.000 g a 4 °C durante 10 minutos (Mouliere et al, 2011). Posteriormente, el plasma se manipulo inmediatamente para la extraccion de ADN o se almaceno a -80 °C. El ADNlc se extrajo de 200 |il de plasma utilizando el kit QIAmp DNA Mini Blood (Qiagen, CA) de acuerdo con el "Protocolo de sangre y fluidos corporales" y nuestro protocolo detallado (Mouliere et al, 2013). Las muestras de ADN se guardaron a -20 °C hasta su uso.

Diseno de cebadores: Los cebadores se disenaron utilizando el software Primer 3 y todas las secuencias se comprobaron en cuanto a autorreasociacion o reasociacion intermolecular con software de plegamiento de acidos nucleicos (mfold y oligoAnalyzer 1.2). Realizamos analisis de alineacion local con el programa BLAST para confirmar la especificidad de los cebadores disenados. Se sintetizaron oligonucleotidos y se purificaron en HPLC mediante Eurofins (Ebersberg, Alemania) y el control de calidad de los oligonucleotidos se realizo mediante MALDI TOF. Las secuencias y caractensticas de los cebadores seleccionados se presentan en la Tabla 1 (SEQ ID N°: 2; SEQ ID N°: 3; SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 6; y SEQ ID N°: 7).

Tabla 1. Caractensticas de los cebadores seleccionados para estudiar el ADN libre nuclear y mitocondrial Cuantificacion de ADN genomico y ADNlc mediante Q-PCR: Nuestros experimentos de Q-PCR siguieron la pauta MIQE (Bustin et al., 2009). En un instrumento CFX96 se llevaron a cabo amplificaciones por Q-PCR al menos por duplicado en un volumen de reaccion de 25 |il utilizando el software de gestion CFX (Bio-Rad). Cada mezcla de reaccion de PCR estaba compuesta por 12,5 |il de mezcla de PCR (Bio-Rad Supermix So Advanced), 2,5 |il de cada cebador de amplificacion (0,3 pmol/^l), 2,5 |il de agua analizada por PCR y 5 |il de extracto de ADN. La ciclacion termica consistfa en tres etapas repetidas: una etapa de 3 minutos de activacion-desnaturalizacion de polimerasa de arranque en caliente a 95 °C, seguida por 40 ciclos repetidos a 90 °C durante 10 segundos, y despues a 60 °C durante 30 segundos. Se obtuvieron curvas de fusion aumentando la temperatura de 55 °C a 105 °C con una lectura de placa cada 0,2 °C. La concentracion se calculo a partir de Cq detectada por Q-PCR y tambien una curva patron de control en ADN de la lmea celular Difi de concentracion y numero de copias conocidos. Como patron de cuantificacion se utilizaron diluciones en serie del ADN genomico de las celulas Difi, y su concentracion y calidad se evaluaron utilizando un espectrofluonmetro Qubit (Invitrogen). La subunidad III de la citocromo c oxidasa (COIII o MTCO3) es 1 de 3 subunidades codificadas por el ADN mitocondrial (ADNmt) (MTCO1, MTCO2, MTCO3) del Complejo respiratorio IV, una enzima de la cadena de transporte de electrones de la fosforilacion oxidante mitocondrial. Como tal, es puramente espedfica del ADN mitocondrial.

Estudio de cuantificacion y fragmentacion de ADN nuclear y mitocondrial mediante Q-PCR: En la Figura 1 estan representados disenos de conjuntos de cebadores nucleares y mitocondriales. Para cada extracto de ADN, se cuantifico por separado un amplicon nuclear KRAS corto de 67 pb y un amplicon mitocondrial MT-CO3 corto de 67 pb. Cada medicion se presento en una curva patron realizada con el mismo conjunto de cebadores. Cada conjunto de cebadores presenta una eficacia cercana a un 100%. Cada medicion se realizo portriplicado.

Para estudiar la relacion relativa entre el ADN mitocondrial y el nuclear, los resultados de la PCR cuantitativa se expresaron como la relacion entre el valor medio del ADN mitocondrial de experimentos por triplicado y el valor medio del ADN nuclear de experimentos por triplicado (ADNm/ADNn). Tanto para las curvas patron de KRAS nuclear de 67 pb y 305 pb como para la curva patron de MT-CO3 mitocondrial de 67 pb y 296 pb se utilizaron las mismas concentraciones de ADN genomico.

Resultados:

Con el fin de comparar el contenido relativo del ADNIc mitocondrial frente al ADNIc nuclear, los datos se expresan como la relacion de la concentracion de ADNlc mitocondrial con respecto a la concentracion de ADNlc nuclear (relacion de contenido de ADNCmCn) en 80 individuos sanos y en 146 con CCR. El grafico de puntos de la Figura 2A muestra una diferencia significativa de la relacion de contenido de ADNCmCn de contenido relativo entre muestras de individuos sanos y con CCR. La mediana de ADNCmCn en individuos sanos (3,8) era considerablemente mas alta que la de pacientes con CCR (0,18) (prueba de la t de Student: p < 0,0001). Esta observacion se confirma al separar los pacientes en el estadio IV (n = 72) de los pacientes en los estadios I-III (n = 74). Al analizar la relacion de contenido de ADNCmCn, existe una diferencia significativa entre los pacientes con CCR en los estadios I-III y los individuos sanos. La mediana en pacientes con CCR en los estadios I-III era de 0,17, mientras que en individuos sanos era de 3,8 (prueba de la t de Student p < 0,0001) (Figura 2B). En pacientes en el estadio IV, la mediana era de 0,25 y era considerablemente menor que en individuos sanos (p < 0,0001) (Figura 2C). Esta fuerte capacidad de diagnostico se ilustro en el analisis por curva ROC, que muestra un ABC de 0,98, que es claramente optimo cuando se comparan individuos sanos y pacientes con CCR (Figuras 3 A, B, C). Tambien estudiamos la relacion de contenido de ADNCmCn en una cohorte de pacientes con cancer de pulmon (n = 73). La relacion de contenido de ADNCmCn era considerablemente mayor en los donantes sanos (n = 80) que en los pacientes con cancer de pulmon. La mediana de la relacion de contenido de ADNCmCn era de 3,8 en individuos sanos, mientras que en pacientes con cancer de pulmon era de 0,09 (prueba de la t de Student p < 0,0001) (Figura 4). Esos resultados confirmaban la fuerte capacidad de diagnostico de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir a individuos sanos y pacientes con cancer (ABC curva Roc = 0,99) (Figura 5). Tal como se presenta en la Figura 6, no hay superposicion entre los valores encontrados en pacientes sanos y con cancer. Se ha de senalar que el contenido de ADNCm solo muestra una capacidad de diagnostico estadfsticamente significativa, pero en menor medida que la relacion de contenido de ADNCmCn, ya que existe una superposicion entre los valores de individuos sanos y pacientes con cancer (Figura 7).

La relacion de base de ADN en el ADNmt se parece a la de las celulas procariotas, y es mas que la del ADN nuclear. El ADNmt forma un lazo a partir del cual la replicacion comienza y se extiende en una direccion. El ADN mitocondrial incluye mas contenido de guanina-citosina (GC) que el ADN nuclear y es de mayor densidad. Como resultado de ello, analizando el contenido o la densidad de GC se puede llevar a cabo una comparacion entre el ADNCm y el ADNCn. Por ejemplo, la temperatura de desnaturalizacion o de fusion del ADNmt (y en consecuencia del ADNcm) es mas alta que la del ADN nuclear.

De modo similar al ADNmt, entre el ARN mitocondrial (ARNmt) y el ARNnuc existen diferencias. Se sintetiza dentro de las mitocondrias en un molde de ADN. Es diferente al ARN de origen nuclear, ya que es resistente a la enzima ribonucleasa. Como tal, el nivel de resistencia a la ribonucleasa del contenido total de ADNlc es un biomarcador potencial para la deteccion del cancer, mediante el uso de un patron de referencia.

Estos resultados sorprendentes tienen una importancia incomparable en lo que respecta a la deteccion del cancer. El ADN mitocondrial se presenta no fragmentado en comparacion con el ADN nuclear en la circulacion sangumea. La explicacion se basa en tres hipotesis: (1) en las celulas cancerosas hay menos liberacion de ADNm en la circulacion; (2) en las celulas cancerosas hay mas liberacion de ADNn en la circulacion; y (3) el ADNm liberado es menos estable que el ADNn en sangre. Esto sugerina que la apoptosis desempena un papel muy importante en las celulas cancerosas. No se observa ningun cambio morfologico obvio de las mitocondrias hasta la etapa final de la apoptosis (Ozawa T, Bioscience reports, 17, 337-250, 1997). La fragmentacion del ADN durante la apoptosis se presenta como un evento nuclear espedfico. Dado que las mitocondrias pueden liberar protemas apoptogenicas de mitocondrias espedficas, como la caspasa o el citocromo C, es posible que las mitocondrias y su ADN se conserven para preservar el proceso completo de la apoptosis. Dado que el ADNm de la apoptosis no se puede degradar, el evento apoptotico es el fenomeno biologico implicado en esta diferencia encontrada entre individuos con cancer e individuos sanos. Sin duda alguna, el evento de apoptosis se produce en gran medida en las celulas cancerosas, como el cancer CCR.

Ejemplo 2: Combinacion de la relacion de contenido de ADNCmCn y la concentracion del ADN nuclear circulante total para distinguir entre individuos sanos y con cancer

Se calculo la concentracion total de ADN nuclear circulante (concentracion de ADNCn) en la misma cohorte de individuos sanos (n = 80) y en pacientes con cancer (n = 207) y se presento en la Figura 8A. Existe una diferencia estadfstica muy importante del contenido de ADNCn en sangre entre individuos sanos y con cancer (p < 0,0001). En la Figura 8B se presenta la capacidad predictiva de diagnostico de la concentracion de ADNlc total para distinguir plasmas de pacientes con CCRm y de individuos sanos. La representacion de la curva ROC derivada del analisis iogfstico univariante correspondiente al ADNlc total (Figura 8B, ABC = 0,82) lo confirma, aunque es ligeramente inferior cuando se utiliza la relacion de contenido de ADNCmCn. Esta observacion ya habfa sido realizada (Patente CNRS y Mouliere et al, Mol. Oncol). El objeto de la invencion consiste en combinar los dos analisis para mejorar la potencia de prueba de la exploracion. La combinacion de los dos biomarcadores se puede prever, por ejemplo, mediante el uso de un algoritmo. Se ha de tener en cuenta que el analisis de correlacion entre la relacion de contenido de ADNCmCn y el contenido de ADNCn es deficiente en individuos sanos (Spearman, p = 0,64) y parece mejor en pacientes con cancer (p = 0,08). Se ha de tener en cuenta que hay una menor capacidad de diagnostico cuando se analiza solo el ADNCm tal como se presenta en la Figura 9.

Los valores de la relacion de contenido de ADNCmCn en 3 pacientes con cancer hepatocelular (CHC) eran considerablemente mas bajos (0,004; 0,152 y 0,084; media = 0,080) que la mediana de individuos sanos (3,8) y no se superponen con valores obtenidos de individuos sanos.

Tabla 2: Determinacion de la relacion CmCn a partir de la medicion por triplicado de Cm y Cn en plasma de tres pacientes con pacientes con CHC diagnosticado

Los datos obtenidos de plasma de diferentes tipos de cancer (CCR, CHC, canceres de pulmon o de mama) muestran el potencial de la determinacion de la relacion de contenido de ADNCmCn para distinguir a individuos sanos y pacientes con cualquier tipo de cancer.

Ejemplo 3: Determinacion de la relacion ADNCmCn DII en individuos sanos y con cancer

La integridad se puede evaluar determinando el mdice de integridad de ADN (DII) calculado como la relacion del contenido del fragmento de ADN circulante sobre el contenido del fragmento de ADN circulante de un tamano menor. Por regla general se puede utilizar el analisis Q-PCR: para cada extracto de ADN se cuantificaron en una ejecucion separada el amplicon KRAS nuclear largo de 305 pb y el amplicon MT-CO3 mitocondrial largo de 296 pb. Los DII nuclear y mitocondrial se calcularon mediante la relacion de la concentracion determinada con el conjunto de cebadores dirigido a una secuencia larga con respecto a la concentracion determinada con el grupo de cebadores dirigido a una region de 67 pb. En la Tabla 3 se muestra el DII de cada muestra de los dos grupos de individuos. Aunque la capacidad de diagnostico es mucho mas baja que la de la relacion de contenido de ADNCmCn, la relacion ADNCmCn DII tiene un poder de diagnostico que se puede combinar o asociar con la relacion de contenido de ADNCmCn.

Tabla 3: Capacidad de diagnostico de la relacion ADNCmCn DII. DII, Indice de Integridad de ADN. SANOS, individuos sanos. CCR, pacientes con cancer colorrectal.

Ejemplo 4: Demostracion experimental en un modelo animal del interes de la utilizacion de ADNCm para distinguir el origen tumoral y no tumoral

Con el fin de confirmar nuestra hipotesis, evaluamos la relacion de contenido de ADNCmCn en sangre de un modelo experimental de injerto heterologo de raton previamente disenado (Thierry et al, NAR, 2010), que permite distinguir en el mismo individuo el ADNlc derivado no tumoral (de origen murido) y el ADNlc derivado de tumor (de origen humano). Estudiamos nuestra hipotesis en un raton con injerto heterologo HCT116 y en 14 ratones con injerto heterologo SW620. El ADNCmCn humano (origen tumoral del ADNcir) y el ADNCmCn murido (origen no tumoral del ADNcir) se determinaron en las mismas muestras de plasma murido utilizando conjuntos de cebadores adecuados para cada amplificacion. El ADNCmCn humano se calculo mediante la relacion entre la concentracion de ADNmtlc humano y la concentracion de ADNnlc humano. El ADNCmCn murido se calculo mediante la relacion entre la concentracion de ADNmtlc murido y la concentracion de ADNnlc murido.

En la Figura 10 se muestran el diseno del sistema de Q-PCR y la secuencia de cebador. La Tabla 4 presenta la secuencia de cebadores dirigida a una secuencia mitocondrial y nuclear detectada en el ensayo de Q-PCR (SEQ ID N°: 8; SEQ ID N°: 9; SEQ ID N°: 10; SEQ ID N°: 11; SEQ ID N°: 12; y SEQ ID N°: 13).

Tabla 4. Caractensticas de los cebadores seleccionados para estudiar el ADN libre nuclear y mitocondrial de origen murido

Los datos se muestran en las Figuras 11 y 12.

En el modelo de raton con injerto heterologo HCT116, la relacion de contenido de ADNCmCn de ADNlc derivado de tumor es de 0,007, mientras que la de ADNlc no derivado de tumor es de 1,08 (diferencia en un factor 154), lo que sugiere que este biomarcador es de alto valor para la exploracion (Figura 11). En los 14 ratones con injerto heterologo SW620, la mediana de ADNCmCn murido (0,047) era considerablemente mas alta que la mediana de ADNCmCn humano (0,0020) (prueba de la t pareada p = 0,023) (Figura 12).

Pueden indicar que existe una gran diferencia de liberacion en la circulacion del ADN mitocondrial entre las celulas tumorales y las celulas no tumorales, o una gran diferencia de su estabilidad respectiva debido a sus estructuras y naturalezas. Se ha de tener en cuenta que, en el modelo de injerto heterologo HCT116, la relacion ADNCmCn DII es mucho mayor en ADNlc derivado de tumor (~ 20) que en ADNlc no tumoral (~ 4).

Ejemplo 4: Demostracion experimental in vitro del interes de la utilizacion de ADNCm para distinguir celulas de origen tumoral y no tumoral

Como se ha demostrado que el sobrenadante de cultivos celulares presenta ADN extracelular, evaluamos la relacion de contenido de ADNCmCn en el sobrenadante de cultivos celulares. Probamos nuestra hipotesis en ADN extracelular liberado por lmeas celulares tumorales y lmeas celulares normales. Analizamos 14 lmeas celulares tumorales de diversos ongenes (5 lmeas celulares de prostata, 3 lmeas celulares de cancer de mama, 3 lmeas celulares de CCR, 2 lmeas celulares de linfoma, 1 lmea celular de cancer de pulmon) y 6 lmeas celulares normales de diversos ongenes (mama, prepucio, piel, pulmon, hepatocitos humanos y fibroblastos embrionarios muridos). Los resultados se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 13.

La mediana de la relacion de contenido de ADNCmCn era considerablemente mayor en el sobrenadante de lmeas celulares normales (0,20) que la mediana de la relacion de contenido de ADNCmCn en el sobrenadante de lmeas celulares tumorales (0,020) (prueba t de Student, p = 0,0011). Esto puede confirmar nuestras otras observaciones en muestras clmicas y muestras experimentales muridas consistentes en que puede haber una gran diferencia de liberacion en la circulacion de ADN mitocondrial entre celulas tumorales y celulas no tumorales.

Origen Identificacion Relacion de contenido de ADNCmCn

Tabla 5. Relacion de contenido de ADNCmCn en el sobrenadante de varias lmeas celulares tumorales y lmeas celulares normales

Como se ejemplifica en el ejemplo 5, en el que el sobrenadante de celulas sanas demostro ser estadfsticamente diferente en terminos de relacion de CmCn en comparacion con lmeas celulares de cancer de varios tipos (cancer de mama, colorrectal, prostata, pulmon y linfoma), la relacion de CmCn parece util para discriminar el ADNlc de muchos tipos de cancer, ya sean tumores solidos o tumores lfquidos. Por lo tanto, parece que el analisis mediante el calculo de la relacion de CmCn permite distinguir el ADNlc que se deriva de celulas normales del ADNlc procedente de celulas cancerosas, destacando su capacidad en la deteccion del cancer.

Referencias:

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo (A) para explorar a un individuo en busca de un cancer, que comprende las etapas consistentes en

i) extraer los acidos nucleicos libres de una muestra obtenida del individuo,

ii) determinar la concentracion total de acidos nucleicos libres mitocondriales,

iii) determinar la concentracion total de acidos nucleicos libres nucleares,

iv) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa ii) con respecto a la concentracion determinada en la etapa iii) (relacion de contenido de ADNCmCn),

v) comparar la relacion determinada en la etapa iv) con un valor de referencia correspondiente predeterminado y

vi) concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion determinada en la etapa iv) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion determinada en la etapa iv) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que los acidos nucleicos libres son acidos nucleicos de ADN libre (ADNlc).

3. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende las etapas consistentes en a) amplificar y cuantificar una secuencia de acido nucleico nuclear diana y b) amplificar y cuantificar una secuencia de acido nucleico mitocondrial diana.

4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el acido nucleico nuclear diana o mitocondrial forma parte de una secuencia codificadora o no codificadora.

5. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana esta incluida en un gen mitocondrial seleccionado entre el grupo consistente en ND1; ND2; COX1; COX2; ATP8; ATP6; COX3; ND3; ND4L; ND4; ND5; ND6; CYTB; TRNF; TRND; RNR1 TRNV; TRNK; RNR2 TRNL1; TRNS1; TRN1; TRNP; TRNQ; TRNE; TRNM; TRNT TRNW; TRNL2 TRNA; TRNS2; TRNN; TRNR; TRNA; TRNG; TRNN; TRNC; y TRNY, o esta comprendida en una region no codificadora del genoma mitocondrial tal como promotores de ADN mitocondrial tales como H1, H2 y L (promotores de cadena pesada 1, de cadena pesada 2 y de cadena ligera) o regiones de control mitocondrial o secuencias de lazo D.

6. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las secuencias de acido nucleico mitocondrial diana y nuclear tienen aproximadamente la misma longitud (es decir, tamano).

7. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la mitocondrial diana es un 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13;

14; o 15% mas larga o mas corta que la secuencia de acido nucleico nuclear diana.

8. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las dos secuencias de acido nucleico diana tienen la misma longitud.

9. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las secuencias de acido nucleico diana tienen una longitud inferior a 110 pares de bases.

10. El metodo de la reivindicacion 3, en el que las secuencias de acido nucleico diana tienen una longitud de 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 10C; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; o 110 pares de bases.

11. El metodo de la reivindicacion 1, que adicionalmente comprende las etapas consistentes en comparar la concentracion total de ADNlc nuclear con un valor de referencia correspondiente predeterminado (ADNCnR) y concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion de contenido de ADNCmCn es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion de contenido de ADNCmCn es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado.

12. El metodo de la reivindicacion 3, que implica el uso de 2 conjuntos de 2 cebadores, en donde 1 conjunto de 2 cebadores se utiliza para amplificar la secuencia de acido nucleico nuclear diana y 1 conjunto de 2 cebadores se utiliza para amplificar la secuencia de acido nucleico mitocondrial diana.

13. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra es una muestra de fluido corporal, tal como sangre, lfquido ascftico, orina, lfquido amniotico, heces, saliva o lfquidos cefalorraqmdeos.

14. Un metodo (B) para explorar a un individuo en busca de un cancer, que comprende las etapas consistentes en

i) extraer los acidos nucleicos libres de una muestra obtenida del individuo,

ii) determinar el nivel de los acidos nucleicos mitocondriales que tienen una longitud inferior a 110 pares de bases,

iii) determinar el nivel de los acidos nucleicos mitocondriales que tienen una longitud superior a 250 pares de bases,

iv) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa iii) con respecto al nivel determinado en la etapa ii) (DII MITO),

v) determinar el nivel de los acidos nucleicos nucleares que tienen una longitud inferior a 110 pares de bases,

vi) determinar el nivel de los acidos nucleicos nucleares que tienen una longitud superior a 250 pares de bases,

vii) calcular la relacion del nivel determinado en la etapa vi) con respecto al nivel determinado en la etapa v) (DII NUC),

viii) calcular la relacion entre la relacion determinada en la etapa iv) y la relacion determinada en la etapa vii) (relacion DII MITO/DII NUC),

ix) comparar la relacion determinada en la etapa viii) con un valor de referencia correspondiente predeterminado ("relacion DII MITO/DII NUC") y

x) concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion determinada en la etapa viii) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion determinada en la etapa viii) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que los acidos nucleicos libres son acidos nucleicos de ADN libre (ADNlc).

16. El metodo de la reivindicacion 14, que comprende las etapas consistentes en a) amplificar y cuantificar una primera secuencia de acido nucleico mitocondrial diana que tiene una longitud inferior a 110 pares de bases y una segunda secuencia de acido nucleico mitocondrial diana que tiene una longitud de al menos 250 pares de bases, y b) amplificar y cuantificar una primera secuencia de acido nucleico nuclear diana que tiene una longitud inferior a 110 pares de bases y una segunda secuencia de acido nucleico nuclear diana que tiene una longitud de al menos 250 pares de bases.

17. El metodo de la reivindicacion 16, en el que i) la primera secuencia de acido nucleico mitocondrial o nuclear diana tiene una longitud de 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 35; 36; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 49; 50; 51; 52; 53; 54; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; o 110 pares de bases y/o ii) la segunda secuencia de acido nucleico mitocondrial o nuclear diana tiene una longitud de 250; 251; 252; 253; 254; 255 ; 256; 257; 258; 259 260 261 ; 262; 263; 264; 265; 266; 267; 268; 269; 270; 271; 272; 273; 274; 275 276 ; 277; 278; 279; 280 281 ; 282; 283; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 290; 291; 292; 293; 294; 295; 296 297 ; 298; 299; 300; 301 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 309; 310; 311; 312; 313; 314; 315; 316; 317 318 319; 320; 321 322 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 333; 334; 335; 336; 337; 338 339 ; 340; 341; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350 pares de bases.

18. El metodo de la reivindicacion 16, en el que la primera y la segunda secuencias nucleicas mitocondrial o nuclear diana estan ubicadas en el mismo gen o en el mismo exon.

19. El metodo de la reivindicacion 16, que adicionalmente comprende las etapas consistentes en comparar la concentracion total de ADNlc nuclear con un valor de referencia correspondiente predeterminado (ADNCnR) y concluir que el individuo padece un cancer cuando la relacion DII MITO/DII NUC es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNIc nuclear es mayor que su valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no padece cancer cuando la relacion DII MITO/DII NUC es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado y la concentracion total de ADNlc nuclear es menor que su valor de referencia correspondiente predeterminado.

20. El metodo de la reivindicacion 16, que implica el uso de 2 conjuntos de 3 cebadores, en donde 1 conjunto de 3 cebadores se utiliza para amplificar las secuencias de acido nucleico nuclear diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb), y 1 conjunto de 3 cebadores se utiliza para amplificar las secuencias de acido nucleico mitocondrial diana corta (< 110 pb) y larga (> 250 pb).

21. El metodo de la reivindicacion 14, en el que la muestra es una muestra de fluido corporal, tal como sangre, lfquido ascftico, orina, lfquido amniotico, heces, saliva o lfquidos cefalorraqmdeos.

22. Un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento, que comprende las etapas consistentes en

i) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn antes del tratamiento,

ii) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn despues del tratamiento,

iii) comparar la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) con la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) y

iv) concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) es mayor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es menor que la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i).

23. Un metodo para determinar si un individuo logra una respuesta con un tratamiento, que comprende las etapas consistentes en

i) determinar la relacion DII MITO/DII NUC antes del tratamiento,

ii) determinar la relacion DII MITO/DII NUC despues del tratamiento,

iii) comparar la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) con la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) y

iv) concluir que el individuo logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) es menor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i), o concluir que el individuo no logra una respuesta con su tratamiento cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa ii) esta por encima de la misma o es mayor que la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i).

24. Un metodo para determinar si un individuo que ha padecido un cancer tiene una recafda despues de un tratamiento, que comprende las etapas consistentes en

i) determinar la relacion de contenido de ADNCmCn despues del tratamiento,

ii) comparar la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) con un valor de referencia correspondiente predeterminado,

iii) y concluir que el individuo tiene una recafda cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, y iv) concluir que el individuo no ha recafdo cuando la relacion de contenido de ADNCmCn determinada en la etapa i) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

25. Un metodo para determinar si un individuo que ha padecido un cancer tiene una recafda despues de un tratamiento, que comprende las etapas consistentes en

i) determinar la relacion DII MITO/DII NUC,

ii) comparar la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) con un valor de referencia correspondiente predeterminado, y

iii) concluir que el individuo tiene una recafda cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) es mayor que el valor de referencia correspondiente predeterminado, o concluir que el individuo no ha recafdo cuando la relacion DII MITO/DII NUC determinada en la etapa i) es menor que el valor de referencia correspondiente predeterminado.

El metodo de la reivindicacion 24 o 25, en el que la relacion de contenido de ADNCmCn y/o la relacion DII MITO/DII NUC se determina despues de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 meses o mas despues de finalizar el tratamiento.

El metodo de la reivindicacion 1, 14, 22, 23, 24 o 25, en el que el individuo padece un cancer seleccionado entre un cancer de celulas de la vejiga, sangre, hueso, medula osea, cerebro, mama, colon, esofago, tracto gastrointestinal, encfa, cabeza, rinon, tngado, pulmon, nasofaringe, cuello, ovario, prostata, piel, estomago, testfculos, lengua o utero, y en el que el tipo histologico del cancer se selecciona entre el grupo consistente en neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de celulas gigantes y espinocelular; carcinoma de celulas pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de celulas escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma de celulas basales; pilomatrixoma; carcinoma de celulas transicionales; carcinoma de celulas transicionales papilar; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular y colangiocarcinoma combinados; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide qrnstico; adenocarcinoma en polipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis coli familiar; carcinoma solido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma branquial-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromofobo; carcinoma acidofilo; adenocarcinoma oxifflico; carcinoma basofilo; adenocarcinoma de celulas claras; carcinoma de celulas granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma adrenocortical; carcinoma endometrioide; carcinoma de apendice cutaneo; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebaceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistoadenocarcinoma; cistoadenocarcinoma papilar; cistoadenocarcinoma seroso papilar; cistoadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de celulas en forma de anillo de sello; carcinoma ductal infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, de mama; carcinoma de celulas acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma ovarico, maligno; tecoma, maligno; tumor de celulas granulosas, maligno; y roblastoma, maligno; carcinoma de celulas de Sertoli; tumor de celulas de Leydig, maligno; tumor de celulas lipfdicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanotico; melanoma de propagacion superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de celulas epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mulleriano mixto; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de celulas gigantes de hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogenico, maligno; odontosarcoma ameloblastico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblastico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmatico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; tumor neuroectodermico primitivo; sarcoma cerebeloso; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogenico olfatorio; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de celulas granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; linfoma de Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocftico pequeno; linfoma maligno, de celulas grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoides; otros linfomas no Hodgkin especificos; histiocitosis maligna; mieloma multiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de celulas plasmaticas; eritroleucemia; leucemia de celulas de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofila; leucemia eosinofflica; leucemia monocftica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblastica; sarcoma mieloide; y leucemia de celulas pilosas.

El metodo de la reivindicacion 1, 14, 22, 23, 24 o 25, en el que el individuo padece un cancer colorrectal, un cancer colorrectal metastasico o un cancer hepatocelular.