ES2619032T3

ES2619032T3 - Métodos de detección del cáncer de vejiga

Info

Publication number: ES2619032T3
Application number: ES13718488.3T
Authority: ES
Inventors: Russell Higuchi; Stacey Ellen Wallace; Edwin Wei-Lung LAI
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2033-04-19
Also published as: US10202653B2; EP2839028B1; WO2013158972A1; US20190360050A1; EP2839028A1; CA2870679A1; US20150133325A1

Abstract

Un método para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende la detección de los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga consiste en ARNm de hormona liberadora de corticotropina (CRH), ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), ARNm de queratina 20 (KRT20) y ARNm de anexina (ANXA10), en el que el nivel de cada uno de los marcadores se compara con un nivel normal o de control del marcador, en el que un nivel normal o de control se determina como un nivel promedio o intervalo que es característico de las células uroteliales normales o de otros materiales de referencia, y en el que la detección de un nivel elevado de al menos un marcador indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto.

Description

5 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga. En particular, se proporcionan marcadores y paneles de marcadores del cáncer de vejiga útiles en la detección del cáncer de vejiga.

2. ANTECEDENTES

Cada año se diagnostican 386.000 casos de cáncer de vejiga a nivel mundial, incluyendo 70.500 casos anuales en Estados Unidos. La incidencia del cáncer de vejiga es tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. La mayor incidencia y prevalencia se encuentran en la Unión Europea, América del Norte, África del Norte y Oriente

15 Medio.

El tabaquismo es el mayor factor de riesgo para el cáncer de vejiga. Entre otros factores de riesgo se incluyen la exposición a sustancias químicas, la quimioterapia (tal como Cytoxan), la radioterapia y la infección crónica de la vejiga.

Los tumores de vejiga incluyen tumores papilares, que son carcinomas uroteliales que producen proyecciones estrechas similares a un dedo: y tumores no papilares (sésiles), tales como el carcinoma in situ, que son menos frecuentes, pero que tienen un alto riesgo de convertirse en invasivos.

25 Entre los síntomas del cáncer de vejiga se pueden incluir dolor abdominal, sangre en la orina, dolor o sensibilidad ósea, fatiga, dolor al orinar, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia y pérdida de peso. El diagnóstico se basa generalmente en la formación de imágenes, el análisis de orina, y/o la biopsia.

El pronóstico del cáncer de vejiga depende de la etapa del cáncer en el momento del diagnóstico. El pronóstico de los tumores tempranos es favorable, mientras que el pronóstico de los tumores avanzados es malo. Se recomienda el seguimiento a largo plazo para detectar la recurrencia del cáncer, que se produce en hasta el 70 % de los cánceres de vejiga. Durante los dos primeros años, se recomienda realizar cistoscopia y citología de orina cada 3 a 4 meses y, después, a intervalos más largos en los años siguientes, a menudo durante toda la vida del paciente. Estos métodos son invasivos y costosos, lo que hace del cáncer de vejiga uno de los cánceres más caros para tratar

35 desde el diagnóstico hasta la muerte.

Entre las pruebas de diagnóstico no invasivas existentes se incluyen ImmunoCyt™ (Scimedx, Denville, NJ) y UroVysion® (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). ImmunoCyt™ es un ensayo de citología que utiliza un cóctel de tres anticuerpos monoclonales marcados con marcadores fluorescentes para detectar determinados marcadores celulares de cáncer de vejiga en células exfoliadas aisladas a partir de muestras de orina. ImmunoCyt™ se utiliza junto con la citología de orina estándar para mejorar la sensibilidad de la citología en la detección de células tumorales. UroVysion® es también un ensayo basado en la citología, que detecta aneuploidía en ciertos cromosomas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH). La determinación de los resultados se lleva a cabo mediante la enumeración de señales a través de un examen microscópico del núcleo de las células en la orina.

45 Se necesitan mejores métodos para la detección precoz del cáncer de vejiga. En particular, una prueba de diagnóstico precisa basada en la orina que no se basa en la citología podría reducir la necesidad de una cistoscopia costosa e invasiva y que requiere mucha mano de obra y ensayos de citología potencialmente subjetivos.

En el documento EP2138848 se divulgan métodos para detectar cáncer de vejiga basados en firmas de genes marcadores.

3. SUMARIO

55 Se proporcionan composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga. En particular, se proporcionan marcadores y paneles de marcadores del cáncer de vejiga útiles en la detección del cáncer de vejiga. Específicamente, la invención proporciona un método para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende la detección de los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga consiste en ARNm de hormona liberadora de corticotropina (CRH), ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), ARNm de queratina 20 (KRT20) y ARNm de anexina 10 (ANXA10), en el que el nivel de cada uno de los marcadores se compara con un nivel normal o de control del marcador, en el que un nivel normal o de control se determina como un nivel promedio

o intervalo que es característico de las células uroteliales normales o de otros materiales de referencia, y en el que la detección de un nivel elevado de al menos un marcador indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. Los

65 niveles de cada uno de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 se miden, por ejemplo, mediante RT-PCR cuantitativa, y los resultados se utilizan para determinar si un sujeto tiene cáncer de vejiga o no. En algunas

realizaciones, los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20, y ANXA10 se normalizan con respecto a un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno es ARNm de ABL. En algunas realizaciones, se selecciona un control endógeno que se espera que se exprese a niveles similares en las células uroteliales de la vejiga de sujetos con y sin cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de orina. En algunas

5 realizaciones, los presentes métodos se utilizan para controlar a los sujetos con antecedentes de cáncer de vejiga para la recurrencia del tumor. En algunas realizaciones, el sujeto se ha tratado con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) en los últimos tres meses. En algunas realizaciones, los presentes métodos se usan para detectar el cáncer de vejiga en sujetos sin antecedentes de cáncer de vejiga. En algunas de tales realizaciones, los sujetos tienen síntomas de cáncer de vejiga. Entre los ejemplos no limitantes de síntomas de cáncer de vejiga se incluyen dolor abdominal, sangre en la orina, dolor o sensibilidad ósea, fatiga, dolor al orinar, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia y pérdida de peso.

Los métodos proporcionados son para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto. El método comprende detectar los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto, 15 en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga consiste en ARNm de hormona liberadora de corticotropina (CRH), ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), ARNm de queratina 20 (KRT20) y ARNm de anexina 10 (ANXA10), en el que el nivel de cada uno de los marcadores se compara con un nivel normal o de control del marcador, en el que un nivel normal o de control se determina como un nivel promedio o intervalo que es característico de las células uroteliales normales o de otros materiales de referencia, y en el que la detección de un nivel elevado de al menos un marcador indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, un método comprende además la detección de un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPk1. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, un método comprende la detección de un control exógeno. En algunas realizaciones, el control exógeno es un ARN. En algunas de estas realizaciones, el control exógeno es un Armored

25 RNA®.

En algunas realizaciones, la detección comprende RT-PCR. En algunas realizaciones, la detección comprende RT-PCR cuantitativa. En algunas realizaciones, un método comprende comparar un valor de Ct o un valor de ∆Ct con un valor de Ct umbral o un valor de ∆Ct. En algunas realizaciones, ∆Ct es el valor de Ct para el control endógeno menos el valor de Ct para el marcador. En algunas realizaciones, la reacción de RT-PCR dura menos de tres horas

o menos de 2 horas a partir de una etapa de desnaturalización inicial a través de un paso de extensión final.

En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de marcador del 35 cáncer de vejiga consiste en un primer par de cebadores para la detección de CRH, un segundo par de cebadores para la detección de IGF2, un tercer par de cebadores para la detección de KRT20 y un cuarto par de cebadores para la detección de ANXA10. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 35 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 16 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 17, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 45 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 32 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 33, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 14, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 27, en el

55 que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de marcador del 65 cáncer de vejiga consiste en un primer par de cebadores para la detección de CRH, un segundo par de cebadores para la detección de IGF2, un tercer par de cebadores para la detección de KRT20 y un cuarto par de cebadores

para la detección de ANXA10. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 5 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 16 y un segundo 15 cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14

o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 32 y un segundo debador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al

25 menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14

o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un

35 primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14

o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 27, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de

45 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14

o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, un método comprende además poner en contacto el ARN de la muestra con un par de cebadores de control endógeno. En algunas de estas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno es para detectar un control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPk1. En algunas realizaciones, 55 el par de cebadores de control endógeno es para detectar ABL. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 42, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 65 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas

realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos

5 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 42, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, un método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un par de cebadores de control exógeno. En algunas de estas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno es para detectar un ARN exógeno. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 24, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 44 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 45, en el que cada cebador tiene menos de 15 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 24, en el que cada cebador tiene una menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control exógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 44 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al

25 menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, el método comprende la formación de un conjunto de amplicones de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de amplicones de marcadores de cáncer de vejiga consiste en un amplicón de CRH, un amplicón de IGF2, un amplicón de KRT20 y un amplicón de ANXA10, y poner en contacto los amplicones de marcadores de cáncer de vejiga con un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga consiste en una primera sonda para detectar el amplicón de CRH, una segunda sonda para detectar el amplicón de IGF2, una tercera sonda para detectar el amplicón de KRT20 y una cuarta sonda para detectar el amplicón de ANXA10. En algunas realizaciones, la primera sonda 35 comprende SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende la SEQ ID NO: 34 o la SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la tercera sonda comprende la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la cuarta sonda comprende la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la primera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 21 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, 45 al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la tercera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 15 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al

55 menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la cuarta sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 28 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, cada sonda marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante, y en el que cada colorante se puede detectar de forma diferente de los otros tres marcadores. En algunas realizaciones, cada sonda marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante fluorescente y una molécula inactivadora.

65 En algunas formas de realización, un método comprende la formación de un amplicón de control endógeno y poner

en contacto el amplicón de control endógeno con una sonda de control endógeno. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 10, 11, 12 o 43, en el que la sonda de control endógeno tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos

5 de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende un colorante que es detectablemente diferente de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga.

En algunas formas de realización, un método comprende la formación de un amplicón de control exógeno y poner en contacto el amplicón de control exógeno con una sonda de control exógeno. En algunas realizaciones, la sonda de control exógeno comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 25 o 46, en el que la sonda de control exógeno tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sonda de control exógeno comprende un colorante que es detectablemente diferente de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga y la sonda de control endógeno.

15 En algunas realizaciones, el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga se. detecta en una única reacción multiplex

En algunas realizaciones, la muestra comprende células uroteliales. En algunas realizaciones, la muestra se selecciona de una muestra de orina y una muestra de lavado vesical. En algunas realizaciones, el sujeto tiene antecedentes de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el sujeto está siendo controlando para detectar la recurrencia de cáncer de vejiga.

Se proporcionan composiciones. Específicamente, la invención proporciona una composición que comprende un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de 25 marcador del cáncer de vejiga consiste en un primer par de cebadores para la detección de CRH, un segundo par de cebadores para la detección de IGF2, un tercer par de cebadores para la detección de KRT20 y un cuarto par de cebadores para la detección de ANXA10. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 35 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 16 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 17, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos 35 de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 32 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 33, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 14, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 27, en el

45 que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una composición comprende un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de marcador del cáncer de vejiga consiste en un 55 primer par de cebadores para la detección de CRH, un segundo par de cebadores para la detección de IGF2, un tercer par de cebadores para la detección de KRT20 y un cuarto par de cebadores para la detección de ANXA10. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y un 65 segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada

cebador tiene una menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 16 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al 5 menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 17, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 32 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 15 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 14, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al 25 menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 27, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud.

35 En algunas realizaciones, el cuarto par de cebadores comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una composición comprende adicionalmente un conjunto de sondas marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de sondas marcadores de cáncer de vejiga consiste en una primera sonda para detectar un amplicón de CRH, una segunda sonda para detectar un amplicón de IGF2, una tercera sonda para 45 detectar un amplicón de KRT20 y una cuarta sonda para detectar un amplicón de ANXA10. En algunas realizaciones, la primera sonda comprende la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende la SEQ ID NO: 34 o la SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la tercera sonda comprende la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la cuarta sonda comprende la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la primera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, 55 al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 21 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la segunda sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la tercera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 65 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 15 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ

ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35,

o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la cuarta sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 28 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al

5 menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, cada sonda marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante, y en el que cada colorante se puede detectar de forma diferente de los otros tres marcadores. En algunas realizaciones, cada sonda marcador de cáncer de vejiga comprende un colorante fluorescente y una molécula inactivadora.

En algunas realizaciones, una composición comprende adicionalmente un par de cebadores de control endógeno para la detección de un control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPk1. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 8 y un 15 segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 9, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el tercer par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende la SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende la SEQ ID NO: 42, en el que cada cebador tiene una menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 8 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 9, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de

25 longitud. En algunas realizaciones, el par de cebadores de control endógeno comprende un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 41 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una composición comprende adicionalmente una sonda de control endógeno para la detección de un amplicón de control endógeno. En algunas realizaciones, el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPk1. En algunas realizaciones, el control endógeno es ABL. En algunas realizaciones, la

35 sonda de control endógeno comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 10, 11, 12 o 43, en el que la sonda de control endógeno tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sonda de control endógeno comprende un colorante que es detectablemente diferente de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga.

En algunas realizaciones, una composición es una composición liofilizada. En algunas realizaciones, la composición es una solución. En algunas realizaciones, la composición comprende además células uroteliales. En algunas realizaciones, las células uroteliales son de una muestra de orina.

45 A continuación se describen otras realizaciones y detalles de las invenciones.

4. DESCRIPCIÓN DETALLADA 4.1 Definiciones

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases:

Tal como se usa en el presente documento, los términos "detectar", "que detecta" o "detección" pueden describir el acto general de descubrir o discernir o la observación específica de una composición marcada de forma detectable.

55 Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "diferente de forma detectable" se refiere a un conjunto de marcadores (tales como, colorantes) que puede usarse y distinguirse simultáneamente.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “sujeto” y “paciente" se usan de forma intercambiable para hacer referencia a un ser humano. Algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar en muestras de animales no humanos.

Tal como se usa en el presente documento, "cáncer de vejiga" es un tumor, tal como un carcinoma de células de transición, que surge del revestimiento de la vejiga e incluye los cánceres de vejiga de grado bajo y de grado alto, 65 así como el cáncer de vejiga metastásico. "Cáncer de vejiga de grado bajo" se refiere a tumores superficiales que se proyectan al interior de la cavidad de la vejiga. Los cánceres de vejiga de grado bajo tienen una tasa de recurrencia

alta. "Cáncer de vejiga de grado alto" se refiere a un tumor invasivo y/o de crecimiento que invade la pared de la vejiga. Los cánceres de vejiga de grado alto tienen el potencial de diseminarse (es decir, metastatizar) a otras zonas del cuerpo. “Cáncer de vejiga metastásico" se refiere al cáncer de vejiga invasivo que se ha diseminado a uno o más lugares en el cuerpo más allá de la vejiga.

5 Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "oligonucleótido", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico", y similares, se refieren a moléculas que contienen ácido nucleico, incluyendo, pero sin limitaciones, ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN, incluidos, entre otros, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5

15 oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster etílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido monocatenario que tiene menos de 500 nucleótidos. En algunas realizaciones, un oligonucleótido tiene una longitud de 8 a 200, 8 a 100, 12 a 200, 12 a 100, 12 a 75 o 12 a 50 nucleótidos. También se puede hacer referencia a los oligonucleótidos por su longitud, por ejemplo, un oligonucleótido de 24 residuos puede denominarse un "24-mero."

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complementario" de un ARN diana (u región diana del

25 mismo) y el porcentaje de "complementariedad" de la secuencia de la sonda con la de la secuencia de ARN diana es el porcentaje de "identidad" con la secuencia de ARN diana o con el complementario inverso de la secuencia del ARN diana. En la determinación del grado de "complementariedad" entre las sondas usadas en las composiciones descritas en el presente documento (o regiones de las mismas) y un ARN diana, tales como las divulgadas en el presente documento, el grado de "complementariedad" se expresa como el porcentaje de identidad entre la secuencia de la sonda (o una región de la misma) y la secuencia del ARN diana o la complementaria inversa de la secuencia del ARN diana que mejor se alinea con la misma. El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que son idénticas entre las 2 secuencias, dividiendo por el número total de nucleótidos contiguos en la sonda, y multiplicando por 100. Cuando se utiliza el término "complementario", el oligonucleótido sujeto es al menos un 90 % complementaria de la molécula diana, a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, el

35 oligonucleótido sujeto es al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % complementaria de la molécula diana.

Un "cebador" o "sonda", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria de una secuencia de al menos 8 nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico diana, tal como un ARNm o un ADN de transcripción inversa a partir de un ARNm. En algunas realizaciones, un cebador o sonda comprende una región que es complementaria de una secuencia de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una molécula diana. Cuando un

45 cebador o sonda comprende una región que es "complementaria de al menos x nucleótidos contiguos de una molécula diana", el cebador o sonda es al menos 95 % complementaria de al menos x nucleótidos contiguos de la molécula diana. En algunas realizaciones, el cebador o la sonda es al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % complementaria de la molécula diana.

Una "muestra", tal como se usa en el presente documento, incluye muestras de orina (incluyendo muestras derivadas de las muestras de orina), y otros tipos de muestras humanas. Tal como se usa en el presente documento, las muestras de orina incluyen, pero no se limitan a, orina entera, una muestra que comprende células de una muestra de orina, una muestra que comprende el sedimento celular aislado por centrifugación de una muestra de orina, una muestra que comprende células aisladas por filtración de una muestra de orina, y similares.

55 En algunas realizaciones, una muestra de orina comprende un conservante, tal como un conservante que causa daños, tales como lisis, de los glóbulos rojos y/o blancos de la sangre. En algunas realizaciones, una muestra es una muestra humana que no sea una muestra de orina, tal como una muestra de tejido (incluyendo un tejido de la vejiga y/o muestra de tumor de vejiga), una muestra de sangre (incluyendo sangre entera, suero, plasma, etc.), etcétera En algunas realizaciones, una muestra es una muestra de lavado vesical.

Como se usa en el presente documento, "hormona liberadora de corticotropina" o "CRH" se refiere a un ARNm que codifica CRH, así como la proteína de CRH. En algunas realizaciones, CRH es CRH humana. Ejemplos no limitantes de secuencias de ARNm de CRH humana se encuentran en n.º de acceso en GenBank NM_000756, y en la SEQ ID NO: 1.

65 Como se usa en el presente documento, "factor de crecimiento 2 similar a la insulina" o "IGF2" se refiere a un ARNm

que codifica "IGF2", así como la proteína IGF2. En algunas realizaciones, IGF2 es IGF2 humana. Ejemplos no limitantes de secuencias de ARNm de IGF2 humana se muestran en las SEQ ID NO: 2 a 4.

Como se usa en el presente documento, "queratina 20" o "KRT20" se refiere a un ARNm que codifica KRT20, así

5 como la proteína de KRT20. En algunas realizaciones, KRT20 es KRT20 humana. Ejemplos no limitantes de secuencias de ARNm de KRT20 humana se encuentran en n.º de acceso en GenBank NM_019010 y en la SEQ ID NO: 5.

Como se usa en el presente documento, "anexina A10" o "ANXA10" se refiere a un ARNm que codifica ANXA10, así como la proteína de ANXA10. En algunas realizaciones, ANXA10 es ANXA10 humana. Ejemplos no limitantes de secuencias de ARNm de ANXA10 humana se encuentran en n.º de acceso en GenBank NM_007193 y en la SEQ ID NO: 6.

Un "control endógeno," tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto que está naturalmente

15 presente en la muestra que se va a utilizar para la detección y que se puede utilizar para normalizar los niveles de los marcadores de cáncer de vejiga descritos en el presente documento (incluyendo, pero sin limitaciones, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10). Por lo tanto, un control endógeno es, típicamente, un resto que está presente a niveles similares de célula a célula, y a niveles similares en las células de los sujetos con cáncer de vejiga y las células de sujetos sin cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control endógeno es un ARN (tal como un ARNm, ARNt, ARN ribosómico, etc.). Ejemplos de controles endógenos no limitantes incluyen ARNm de ABL, ARNm de GUSB, ARNm de GAPDH, ARNm de TUBB y ARNm de UPK1a. Ejemplos no limitantes de secuencias de ARNm de ABL humana se encuentran en n.º de acceso en GenBank NM_007313y en la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, se selecciona un control endógeno que puede detectarse de la misma manera que se detectan los marcadores de cáncer de vejiga y, en algunas realizaciones, de forma simultánea con los marcadores de cáncer de vejiga.

25 Un "control exógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que se añade a una muestra para su uso para la detección. Un control exógeno se selecciona típicamente que no se espera que esté presente en la muestra que se va a usar para la detección, o está presente a niveles muy bajos en la muestra, de forma tal que la cantidad del resto presente de forma natural en la muestra es indetectable o es detectable a un nivel mucho más bajo que la cantidad añadida a la muestra como un control exógeno. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se espera que esté presente en el tipo de muestra utilizada para la detección de los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se sabe que está presente en la especie de la que se toma la muestra. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos de una especie diferente de la del sujeto

35 del que se tomó la muestra. En algunas realizaciones, un control exógeno comprende una secuencia de nucleótidos que no se sabe que está presente en ninguna especie. En algunas realizaciones, se selecciona un control exógeno que puede detectarse de la misma manera que se detectan los marcadores de cáncer de vejiga y, en algunas realizaciones, de forma simultánea con los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un control exógeno es un ARN. En algunas realizaciones, un ARN es un Armored RNA®, que comprende ARN empaquetado en una capa protectora de bacteriófago. Véase, por ejemplo, WalkerPeach et al., Clin. Chem. 45:12: 2079–2085 (1999).

En las secuencias de la presente memoria, "U" y "T" se utilizan indistintamente, de manera que ambas letras indican un uracilo o timina en esa posición. Un experto en la materia entenderá a partir del contexto y/o uso proyectado si un

45 uracilo o timina está destinado y/o debe utilizarse en esa posición en la secuencia. Por ejemplo, un experto en la materia entenderá que las moléculas de ARN nativas incluyen típicamente uracilo, mientras que las moléculas de ADN nativas incluyen típicamente timina. Por tanto, cuando una secuencia de ARN incluye "T", un experto en la materia entenderá que la que la posición en el ARN nativo es, probablemente, un uracilo.

En la presente descripción, "una secuencia seleccionada de" abarca tanto "una secuencia seleccionada de" como "una o más secuencias seleccionadas de”. Por lo tanto, cuando se utiliza “una secuencia seleccionada de", debe entenderse que se puede elegir una, o más de una, de las secuencias enumeradas.

En la presente descripción, un método que comprende la detección de un "un conjunto de marcadores de cáncer de

55 vejiga que consiste en..." implica la detección de solo los marcadores de cáncer de vejiga del conjunto y no cualquier marcador adicional de cáncer de vejiga. El método puede comprender componentes o etapas adicionales, sin embargo, tales como la detección de controles endógenos y/o exógenos. Del mismo modo, un método o una composición que comprende "un conjunto de pares de cebadores marcadores de cáncer de vejiga" y/o "un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga" puede incluir pares de cebadores y/o sondas para solo los marcadores de cáncer de vejiga del conjunto y no para otros marcadores de cáncer de vejiga. El método o composición puede comprender componentes adicionales, sin embargo, tales como uno o más pares de cebadores de control endógeno y/o uno o más pares de cebadores de control exógeno.

4.2 Detección de cáncer de vejiga

65 Los presentes inventores han desarrollado un ensayo para la detección de cáncer de vejiga que implica la detección

de solo cuatro marcadores, CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 (más uno o dos controles). Los ensayos descritos en el presente documento tienen varias ventajas sobre los diagnósticos existentes y descritos anteriormente para el cáncer de vejiga. Por ejemplo, los presentes ensayos no se basan en la citología, que puede ser costoso y requiere técnicos de citología capacitados para la correcta interpretación de los resultados. En cambio, los presentes ensayos 5 se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y pueden llevarse a cabo de una manera sustancialmente automática, por ejemplo, utilizando el sistema GeneXpert® (Cepheid, Sunnyvale, CA). Mengual et al., Clin Cancer Res (2010) 16: 2624–2633, describieron recientemente una "firma de expresión génica 12 + 2", que detecta de 12 a 14 genes en un formato de matriz. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que una firma mucho más pequeña, de solo cuatro marcadores (más uno o dos controles), es suficiente para proporcionar una sensibilidad y/o especificidad equivalentes o mejores sobre los ensayos de diagnóstico existentes para el cáncer de vejiga, incluyendo el de Mengual et al. Además, debido a que los presentes ensayos utilizan solo cuatro marcadores (más uno o dos controles), que se pueden llevar a cabo en una sola mezcla de reacción, utilizando de 4 a 6 colorantes detectablemente diferentes, tales como colorantes fluorescentes. Los presentes ensayos se pueden realizar en menos de 3 horas y, en algunas realizaciones, en menos de 2 horas, utilizando un

15 sistema automatizado, por ejemplo, el sistema GeneXpert®. Las pruebas existentes pueden requerir varios días para que un laboratorio las realice y envíe los resultados. Además, el presente ensayo puede llevarse a cabo en volúmenes de orina mucho más pequeños (en algunas realizaciones, 5 ml o menos). Por lo tanto, los presentes ensayos, que se basan en la PCR de solo cuatro marcadores (más uno o dos controles) en lugar de en la citología, permite una reacción rápida de un solo recipiente para el diagnóstico del cáncer de vejiga, que, en muchos casos, se puede llevar a cabo a la punto de atención usando un sistema automatizado tal como GeneXpert®.

4.2.1 Métodos generales

Se proporcionan composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, se

25 proporcionan composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga de grado bajo. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para detectar el cáncer de vejiga de grado alto. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para controlar la recurrencia del cáncer de vejiga.

El método de detección de cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en ARNm de CRH, ARNm de IGF2, ARNm de KRT20 y ARNm de ANXA10. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los

35 niveles de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un control endógeno y al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, al menos un control endógeno y al menos un control exógeno.

En algunas realizaciones, un método de detección de cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en ARNm de CRH, ARNm de IGF2, ARNm de KRT20 y ARNm de ANXA10. 45 En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un ARN de control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un ARN de control endógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de vejiga comprende detectar los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y al menos un ARN de control endógeno y al menos un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, un método para detectar el cáncer de

55 vejiga comprende detectar los niveles de un conjunto de marcadores que consisten en ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, al menos un ARN de control endógeno y al menos un ARN de control exógeno.

En la presente divulgación, la expresión "ARN diana" se utiliza por comodidad para referirse a los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y también a otros ARN diana, tales como ARN de control exógeno y/o endógeno. Por lo tanto, ha de entenderse que cuando se presenta una discusión en términos de un ARN diana, que la discusión está específicamente destinada a abarcar ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 y/u otros ARN diana.

En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se detecta en una muestra de orina. En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se determina en una muestra de orina que se ha conservado de una 65 manera que causa daños, tales como lisis, a los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos de la sangre. En algunas realizaciones, el nivel de uno o más ARN diana se detecta en las células uroteliales aisladas de una muestra de

orina, ya sea con o sin tratamiento conservante. En algunas realizaciones, las células uroteliales se aíslan por filtración.

La detección de un nivel elevado de uno o más ARN diana seleccionados de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en una

5 muestra de un sujeto indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección se realiza cuantitativamente. En algunas realizaciones, la detección se realiza cualitativamente. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende la formación de un complejo que comprende un polinucleótido y un ácido nucleico seleccionado de un ARN diana, un amplicón de ADN de un ARN diana y un complementario de un ARN diana. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende RT-PCR. En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende RT-PCR cuantitativa. En algunas realizaciones, el nivel del ARN diana se compara con un nivel normal o de control del ARN diana.

En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana, tales como de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, se puede medir en muestras recogidas una o más veces de un paciente para controlar el estado o la progresión del

15 cáncer de vejiga en el paciente. En algunas realizaciones, un paciente con antecedentes de cáncer de vejiga, tal como antecedentes de cáncer de vejiga de grado bajo o antecedentes de cáncer de vejiga de grado alto, se controla mediante la detección de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 a intervalos regulares o semiregulares. En algunas de tales realizaciones, el paciente se controla mediante la detección de los niveles de los ARN diana al menos una vez al mes, al lo menos una vez cada dos meses, al lo menos una vez cada tres meses, al lo menos una vez cada cuatro meses, al menos una vez cada cinco meses, al menos una vez cada seis meses, al menos una vez cada nueve meses, al menos una vez al año o por lo menos una vez cada dos años

En algunas realizaciones, una muestra que se va a analizar es una muestra de orina (tal como, una muestra de orina espontánea), o deriva de una muestra de orina. En algunas formas de realización, se añade un conservante a la

25 muestra de orina, por ejemplo, para dañar (por ejemplo, lisar), los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos presentes en la muestra de orina. Por dañar o lisar los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos antes de aislar las células uroteliales, la contaminación por los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos puede reducirse. En algunas realizaciones, la muestra de orina se centrifuga para concentrar las células uroteliales. En algunas realizaciones, la muestra de orina se filtra para aislar las células uroteliales de otros materiales de orina y conservantes. En algunas de tales realizaciones, el filtro es parte de un cartucho de GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA).

En algunas realizaciones, se utilizan menos de 5 ml, menos de 4 ml, menos de 3 ml o menos de 2 ml de orina en los presentes métodos. En algunas realizaciones, la muestra de orina se analiza sin una etapa de centrifugación. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los presentes métodos se llevan a cabo en ausencia de centrifugación. En algunas

35 realizaciones, se puede usar un mayor volumen de orina y, en algunas de tales realizaciones, se puede usar una etapa de centrifugación para concentrar las células uroteliales antes del análisis.

En algunas realizaciones, la muestra que se va a analizar es otro fluido corporal, tal como sangre, esputo, moco, saliva, semen, etc. En algunas realizaciones, una muestra que se va a analizar es una muestra de sangre. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es sangre entera. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de glóbulos rojos. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es plasma. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es suero.

La muestra clínica que se va a analizar es, en algunas realizaciones, fresca (es decir, nunca se ha congelado). En

45 otras realizaciones, la muestra es un espécimen congelado. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de tejido, tal como una muestra embebida fijado con formalina. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de citología líquida.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para la detección precoz del cáncer de vejiga en una muestra de células uroteliales, tales como los obtenidos de la orina miccionada. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para controlar la recurrencia del cáncer de vejiga usando una muestra de células uroteliales, tales como los obtenidos de la orina miccionada.

En algunas realizaciones, la muestra que se va a analizar se obtiene de un individuo que tiene uno o más de los

55 siguientes factores de riesgo: antecedentes de tabaquismo, hematuria, antecedentes de cáncer de vejiga o de otros tipos de cáncer y exposición a agentes carcinógenos conocidos, tales como el benceno. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un individuo que tiene signos diagnósticos o síntomas clínicos que pueden estar asociados con el cáncer de vejiga, tal como sangre en la orina, micción frecuente, urgencia urinaria, incontinencia, dificultad para orinar, dolor abdominal, pérdida de peso sin explicación y/o pérdida de apetito. En algunas realizaciones, la muestra que se va a analizar se obtiene de un individuo que ha sido previamente diagnosticado con cáncer de vejiga de grado bajo o de grado alto. En algunas realizaciones, el individuo está siendo controlando para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga.

El cáncer de vejiga se puede dividir en etapas, que indican el patrón de crecimiento del tumor primario. En la tabla A

65 se muestran las etapas del cáncer de vejiga, según el Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC). Las etapas mostradas solo cubren la parte de "T" del sistema "TNM". La parte de "T" se refiere al tumor primario, mientras que

"N" se refiere a la propagación del cáncer a los ganglios linfáticos y "M" se refiere a si el cáncer ha producido metástasis en sitios distantes.

Estadio: descripción

T0: No hay evidencia de tumor primario

Ta: Carcinoma papilar no invasivo

Tis/CIS: Carcinoma plano no invasivo (carcinoma in situ)

T1: Tumor ha crecido desde el revestimiento de la vejiga hacia el tejido conectivo, pero no ha crecido hasta la capa muscular de la vejiga

T2: El tumor ha crecido hacia la capa muscular

T2a: El tumor ha crecido hacia la mitad interior de la capa muscular

T2b: El tumor ha crecido hacia la mitad exterior de la capa muscular

T3: El tumor ha crecido a través de la capa muscular de la vejiga y hacia el tejido adiposo que lo rodea

T3a: La propagación del tumor hacia el tejido graso solo puede verse con un microscopio

T3b: La propagación del tumor hacia el tejido graso se puede ver en las pruebas de imagen o lo puede ver o sentir el cirujano

T4: El tumor se ha diseminado más allá del tejido graso a órganos o estructuras cercanas

T4a: El tumor se ha diseminado al estroma de la próstata o al útero y/o la vagina

T4b: El tumor se ha diseminado a la pared pélvica o a la pared abdominal

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para el cribado de

25 rutina de individuos sanos sin factores de riesgo. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para cribar individuos asintomáticos que tienen uno o más de los factores de riesgo descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para detectar el cáncer

30 de vejiga de grado bajo. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para detectar el cáncer de vejiga de grado alto. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento detectan al menos el 15 %, al menos el 17 %, al menos el 20 %, al menos el 22 %, al menos el 25 %, al menos el 27 %, al menos el 3 0%, al menos el 31 %, al menos el 32 %, al menos el 33 %, al menos el 34 % o al menos el 35 % de los cánceres de vejiga de grado bajo. En algunas realizaciones, los métodos descritos en el

35 presente documento detectan al menos el 85 %, al menos el 87 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94%, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %

o al menos el 99 % de los cánceres de vejiga de grado alto.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para evaluar la eficacia

40 de un tratamiento para el cáncer de vejiga en un paciente. En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana, tales como los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, se determinan en varios momentos durante el tratamiento y se comparan con los niveles de ARN diana de una muestra de archivo tomada del paciente antes del comienzo de tratamiento. En algunas realizaciones, los niveles de ARN diana se comparan con los niveles de ARN diana de una muestra normal de archivo tomada del paciente. Idealmente, los niveles de ARN diana en la muestra

45 normal no ponen de manifiesto cambios aberrantes en los niveles de ARN diana.

En algunas realizaciones, se proporciona el uso de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 para el control de la recurrencia del cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un nivel elevado de uno o más, dos o más, tres o más, o los cuatro ARNm indica que el cáncer de vejiga ha recurrido en el paciente.

50 En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, los niveles de ARN se pueden detectar de forma concurrente o simultánea en la misma reacción de ensayo o en reacciones de ensayo diferentes. En algunas realizaciones, los niveles de ARN se detectan a diferentes momentos, por ejemplo en reacciones de ensayo en serie.

55 El método proporcionado comprende detectar el nivel de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en una muestra de un sujeto, en el que la detección de un nivel de uno cualquiera de los cuatro ARNm que es mayor que un nivel normal del ARN indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección de niveles elevados de dos, tres, o cuatro ARNm marcadores de cáncer de vejiga indica la presencia de cáncer de

vejiga en el sujeto. En algunas realizaciones, la detección de niveles elevados de al menos dos, al menos tres o los cuatro ARNm marcadores de cáncer de vejiga indica un mayor riesgo de cáncer de vejiga de grado alto.

También se divulga un método para facilitar el diagnóstico de cáncer de vejiga en un sujeto. Tales métodos

5 comprenden la detección de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en una muestra del sujeto. En algunas realizaciones, la información relativa a los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y/o ANXA10 en la muestra del sujeto se comunica a un médico. Un "médico", como se usa en el presente documento, se refiere a un individuo o entidad que diagnostica y/o trata a los pacientes, tales como un hospital, una clínica, un consultorio médico, un médico, una enfermera, o un agente de cualquiera de las entidades e individuos mencionados

10 anteriormente. En algunas realizaciones, la detección de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 se lleva a cabo en un laboratorio que ha recibido la muestra del sujeto del médico o el agente del médico. El laboratorio lleva a cabo la detección mediante cualquier método, incluyendo los descritos en el presente documento, y luego comunica los resultados al médico. Un resultado se "comunica", tal como se usa en el presente documento, cuando se proporciona por cualquier medio para el médico. En algunas realizaciones, dicha comunicación puede ser oral o

15 escrita, puede ser por teléfono, en persona, por correo electrónico, por correo postal u otro servicio de mensajería, o puede realizarse depositando directamente la información en, por ejemplo, una base de datos accesible por el médico, incluyendo las bases de datos no controladas por el médico. En algunas realizaciones, la información se mantiene en forma electrónica. En algunas realizaciones, la información se puede almacenar en una memoria u otro medio legible por ordenador, tal como RAM, ROM, EEPROM, memoria flash, circuitos de ordenador, discos de vídeo

20 digital (DVD), discos compactos (CD), unidades de disco duro (HDD), cinta magnética, etc.

Se proporcionan métodos para detectar la presencia de cáncer de vejiga. En algunas formas de realización, se proporcionan métodos de diagnóstico de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el método comprende obtener una muestra de un sujeto y proporcionar la muestra a un laboratorio para la detección de niveles de ARNm de CRH, 25 IGF2, KRT20 y ANXA10 en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además la recepción de una comunicación desde el laboratorio que indica el nivel de al menos un ARN seleccionado de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en la muestra. El cáncer de vejiga está presente si el nivel de uno cualquiera de los cuatro ARNm es mayor que un nivel normal o de control del ARNm. A "laboratorio", tal como se usa en el presente documento, es cualquier instalación que detecta los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 en una muestra mediante

30 cualquier método, incluyendo los métodos descritos en el presente documento, y se comunica el nivel a un médico. En algunas realizaciones, un laboratorio está bajo el control de un médico. En algunas realizaciones, un laboratorio no está bajo el control del médico.

Cuando un laboratorio comunica el nivel de al menos un ARN seleccionado de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 a un

35 médico, en algunas realizaciones, el laboratorio se comunica un valor numérico que representa el nivel del ARN en la muestra, proporcionando o sin proporcionar un valor numérico para un nivel normal. En algunas realizaciones, el laboratorio comunica el nivel del ARN, proporcionando un valor cualitativo, tal como "alto", "bajo", "elevada", "disminuido", "positivo" (tal como "positivo para CRH" o "positivo para CRH y KRT20"), etc. En algunas realizaciones, el laboratorio comunica un diagnóstico sugerido, tal como "positivo para cáncer de vejiga" o "positivo para el cáncer",

40 y similares; o simplemente "positivo para cáncer" o "negativo para cáncer”.

Tal como se usa en el presente documento, cuando un método se refiere a la detección de cáncer de vejiga, la determinación de la presencia de cáncer de vejiga, el seguimiento del cáncer de vejiga y/o el diagnóstico de cáncer de vejiga, el método incluye actividades en las que se llevan a cabo las etapas del método, pero el resultado es

45 negativo para la presencia de cáncer de vejiga. Es decir, la detección, determinación, seguimiento y diagnóstico del cáncer de vejiga incluyen los casos de la realización de los métodos que dan lugar a cualquiera de los resultados positivos o negativos.

En algunas realizaciones, más de un ARN se detecta simultáneamente en una sola reacción. En algunas

50 realizaciones, los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 se detectan simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 y al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno se detectan simultáneamente en una sola reacción. En algunas realizaciones, los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un control endógeno y un control exógeno se detectan simultáneamente en una sola reacción.

4.2.2. Controles de ejemplo

En algunas realizaciones, un nivel normal (un "control") de un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10 se puede determinar como un nivel o intervalo promedio o rango que es característico de las células 60 uroteliales normales u otro material de referencia, contra el que se puede comparar el nivel medido en la muestra. El promedio o intervalo determinado de un ARN diana en sujetos normales se pueden utilizar como punto de referencia para la detección de niveles superiores a lo normal del ARN diana que son indicativos de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, los niveles normales de un ARN diana se pueden determinar a partir de muestras individuales

o agrupadas que contienen ARN de uno o más individuos, tales como de células uroteliales normales aisladas de la 65 orina de individuos sanos.

En algunas realizaciones, la determinación de un nivel normal de un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, comprende detectar un complejo que comprende un polinucleótido para detección hibridado con un ácido nucleico seleccionado de un ARN diana, un amplicón de ADN del ARN diana y un complementario del ARN diana. Es decir, en algunas realizaciones, un nivel normal se puede determinar mediante la detección de un

5 amplicón de ADN del ARN diana o un complementario del ARN diana en lugar del ARN diana en sí. En algunas realizaciones, se determina un nivel normal de tal complejo y se utiliza como control. El nivel normal del complejo, en algunas realizaciones, se correlaciona con el nivel normal del ARN diana. Por lo tanto, cuando un nivel normal de una diana se discute en el presente documento, dicho nivel puede, en algunas realizaciones, determinarse mediante la detección de dicho complejo.

En algunas realizaciones, un nivel normal de un ARN diana se determinado, o se ha determinado, mediante el mismo método que el nivel del ARN diana de una muestra del paciente. En algunas de tales realizaciones, el método es RT-PCR (tal como, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR cuantitativa, etc.).

15 En algunas realizaciones, un control comprende ARN de las células de un solo individuo, por ejemplo, de células uroteliales normales aisladas de la orina de un individuo sano. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de sangre, tal como de sangre entera o suero, de un solo individuo. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de un grupo de células de varios individuos. En algunas realizaciones, un control comprende ARN de un grupo de orina de varios individuos. En algunas realizaciones, un control comprende ARN humano comercialmente disponible (véase, por ejemplo, Ambion). En algunas realizaciones, un nivel normal o intervalo normal ya se ha predeterminado antes de analizar una muestra para determinar un nivel elevado.

En algunas realizaciones, el nivel normal de un ARN diana puede determinarse a partir de una o más líneas celulares continuas, típicamente líneas celulares que previamente se ha demostrado que tienen niveles de ARN que

25 se aproximan a los niveles en las células uroteliales normales.

En algunas realizaciones, la cuantificación de los niveles de ARN diana requiere realizar suposiciones sobre el ARN total por célula y el grado de pérdida de la muestra durante la preparación de la muestra. Con el fin de corregir las diferencias entre las diferentes muestras o entre las muestras que se preparan en condiciones diferentes, las cantidades de ARN diana en algunas realizaciones se normalizan hasta los niveles de al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno.

En algunas realizaciones, un ARN de control es un ARN de control endógeno. Un ARN de control endógeno puede ser cualquier ARN adecuado para el propósito, por ejemplo, los ARN que se encuentran presentes a niveles

35 aproximadamente constantes de célula a célula y en las células uroteliales, tanto de pacientes con cáncer de vejiga como de pacientes sin cáncer de vejiga. Entre los ejemplos no limitantes de ARN de control endógeno se incluyen ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1a. En algunas realizaciones, se usa un control endógeno para la normalización. En algunas realizaciones, se usa más de un control endógeno para la normalización.

En algunas realizaciones, los niveles de ARNm diana, tal como los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 se normalizan con respecto a un ARN de control endógeno. La normalización puede comprender, por ejemplo, la determinación de la diferencia del nivel del ARN diana con respecto al nivel del ARN de control endógeno. En algunas de tales realizaciones, el nivel de los ARN está representado por un valor Ct obtenido de la PCR cuantitativa. En algunas de tales realizaciones, la diferencia se expresa como ∆Ct. El ∆Ct se puede calcular como Ct

45 [ARN diana] -Ct [control endógeno] o Ct[control endógeno] -Ct [ARN diana]. En determinadas realizaciones, ∆Ct =Ct [control endógeno] -Ct [marcador]. En algunas realizaciones, se establece un valor de ∆Ct umbral, por encima o por debajo del cual indica cáncer de vejiga. En algunas de tales realizaciones, el ∆Ct umbral se establece como el valor de ∆Ct por debajo del cual el 95 % de las muestras normales se caracterizan correctamente. En algunas de tales realizaciones, un valor de ∆Ct que es mayor que el valor de ∆Ct umbral es indicativo de cáncer de vejiga.

En algunas realizaciones, se utiliza análisis discriminante lineal (LDA), por ejemplo, para combinar dos o más de los marcadores en una sola escala combinada. En algunas de tales realizaciones, se utiliza un solo valor umbral para los marcadores incluidos en el LDA.

55 En algunas realizaciones, un ARN de control es un ARN de control exógeno. En algunas de tales realizaciones, el ARN de control exógeno es un Armored RNA®, que está protegido por una cubierta de bacteriófago. Un ARN de control exógeno puede utilizarse, en algunas realizaciones, para determinar si la reacción del ensayo de detección ha fallado y, por lo tanto, los resultados no son significativos. Por ejemplo, si un ARN de control exógeno no se amplifica en la reacción de ensayo, es probable que un resultado negativo para los ARN diana no sea significativo porque los niveles reflejan la reacción que falla en lugar de niveles de ARN diana bajos. El fallo de la reacción se puede producir por una serie de razones, incluyendo, pero sin limitaciones, la presencia de un inhibidor de la reacción en la muestra (una "muestra inhibidora"), reactivos comprometidos, la presencia de una ARNasa, etc. Se puede añadir un control de ARN exógeno en cualquier etapa de la recolección y análisis de muestras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ARN de control exógeno se añade a la muestra al mismo tiempo que se añade el

65 conservante, se añade a la muestra cuando es recibido por el laboratorio de diagnóstico, se añade a la muestra inmediatamente antes del análisis o se añade a la muestra durante el análisis (como un ejemplo no limitativo,

durante o después de la lisis de las células uroteliales, pero antes de la adición de los reactivos de amplificación).

En algunas realizaciones, el nivel de un ARN diana, tal como, por ejemplo, ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, se compara con un nivel de referencia, por ejemplo, de un cáncer de vejiga confirmado. En algunas de tales 5 realizaciones, un nivel similar de un ARN diana en relación con la muestra de referencia indica cáncer de vejiga.

En algunas realizaciones, un nivel de un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, que es al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % mayor que un nivel normal del ARN diana respectivo indica la presencia de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, un nivel de un ARN diana, tal

10 como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, que es al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces o al menos aproximadamente 10 veces mayor que un nivel normal del ARN diana respectivo indica la presencia de cáncer de vejiga.

15 En algunas realizaciones, un nivel control de un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, se determina simultáneamente, tal como en el mismo ensayo o lote de ensayos, como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas realizaciones, un nivel control de un ARN diana no se determina simultáneamente como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas de tales realizaciones, el nivel control se ha determinado previamente.

20 En algunas realizaciones, el nivel de un control endógeno y/o un control exógeno se determina simultáneamente, tal como en el mismo ensayo o lote de ensayos, como el nivel del ARN diana en una muestra. En algunas realizaciones, un ensayo comprende los reactivos para la determinación de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un control endógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas

25 realizaciones, un ensayo comprende los reactivos para la determinación de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y un control exógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas realizaciones, un ensayo comprende los reactivos para la determinación de los niveles de ARNm de CRH, IGF2, KRT20, ANXA10, un control endógeno y un control exógeno simultáneamente en la misma reacción de ensayo. En algunas de tales realizaciones, por ejemplo, una reacción de ensayo comprende conjuntos de cebadores para

30 amplificar cada uno de los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, un conjunto de cebadores para amplificar un control endógeno y/o un conjunto de cebadores para amplificar un control exógeno, y sondas marcadas diferentes de forma detectable para detectar los productos de amplificación (tales como, por ejemplo, sondas TaqMan® con colorantes diferentes de forma detectable para cada amplicón que se va a detectar).

35 En algunas realizaciones, el nivel de un ARN diana no se compara con un nivel control, por ejemplo, cuando se sabe que el ARN diana está presente a niveles muy bajos, o nada en absoluto, en las células normales. En tales realizaciones, la detección de un nivel alto del ARN diana en una muestra es indicativa de cáncer de vejiga.

4.2.3. Preparación de muestras de ejemplo 4.2.3.1. Conservantes de orina de ejemplo

En algunas realizaciones, se añade un conservante para la muestra de orina. En algunas realizaciones, el conservante se añade en un plazo de una hora, dos horas, tres horas o seis horas desde el momento en que se

45 recogió la muestra de orina (por ejemplo, miccionada). En algunas realizaciones, se añade un conservante a la muestra de orina en un plazo de una hora, dos horas, tres horas o seis horas antes de analizar la muestra mediante los métodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, un conservante causa daños, tales como lisis, de los glóbulos rojos y/o los glóbulos

50 blancos, pero no daña las células uroteliales. Los glóbulos rojos y/o los glóbulos blancos pueden estar presentes en la orina como resultado de un tumor y/o infección. En algunas de tales realizaciones, la adición del conservante permite mejorar el enriquecimiento de las células uroteliales, por ejemplo mediante filtración. En algunas realizaciones, un conservante disminuye el pH de la muestra de orina y mejora la solubilidad de las sales de orina. En algunas de tales realizaciones, el conservante facilita el paso de las sales a través de un filtro en una etapa de

55 filtración. Un pH deseable de la orina conservada para su paso a través de un filtro está entre aproximadamente 2,5 y 4. En algunas realizaciones, un pH deseable de orina conservado está entre aproximadamente 2,7 y 3,7. En algunas realizaciones, un pH deseable de orina conservado está entre aproximadamente 3 y 3,5. En algunas realizaciones, un pH deseable de orina conservado es de aproximadamente 3,2.

60 En algunas realizaciones se añade un conservante tal que la muestra de orina/conservante comprende de hidrocloruro de guanidina 0,875 M a 2,625M, de 0,25 % a 0,75 % de N-acetil-L-cisteína, citrato de sodio de 6,25 a 18,75 mM, y de 0,625 % a 1,875 % de Tween-20 y tiene un pH de 3 a 3,5. En algunas realizaciones se añade un conservante de forma que la muestra de orina/conservante comprende aproximadamente hidrocloruro de guanidina 1,75 M, aproximadamente 0,5% de N-acetil-L-cisteína, citrato de sodio a aproximadamente 12,5 mM y

65 aproximadamente 1,25 % de Tween-20 y tiene un pH de aproximadamente 3,2.

Un ejemplo no limitante de conservante comercial es PreservCyt (Hologic, Bedford, MA).

4.2.3.2. Enriquecimiento celular de ejemplo

5 En algunas realizaciones, las células uroteliales se enriquecen mediante centrifugación. En algunas de tales realizaciones, el sedimento celular se resuspende en el sobrenadante y/o un conservante. La resuspensión del sedimento celular se puede utilizar para ajustar la concentración de las células en solución. El sedimento celular resuspendido puede utilizarse (por ejemplo, con lisis) en los métodos descritos en el presente documento, o puede someterse a una etapa de enriquecimiento adicional, tal como filtración.

En algunas realizaciones, las células uroteliales se enriquecen mediante filtración. Ejemplos no limitantes de tamaños de poro del filtro que pueden ser adecuados para la captura de células uroteliales incluyen 0,8 µm, 2 µm, 8 µm y 10 µm. En algunas realizaciones, se selecciona un tamaño de poro de filtro que permite de paso a su través de glóbulos rojos y/o de glóbulos blancos, al tiempo que retiene la mayoría de las células uroteliales. En algunas

15 realizaciones, un filtro se coloca dentro de un cartucho GeneXpert diseñado para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico del cáncer de vejiga descrito en el presente documento.

4.2.3.3. Preparación de ARNm de ejemplo

El ARN diana se puede preparar por cualquier método apropiado. El ARN total se puede aislar mediante cualquier método, incluyendo, pero sin limitaciones, los protocolos establecidos en Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22):10.933; y Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22): 10934, o mediante el uso de kits y reactivos comercialmente disponibles, tales como el reactivo TRIzol® (Invitrogen), el kit de extracción de ARN total (iNtRON Biotechnology), el kit de purificación de ARN total (Norgen Biotek Corp.), RNAqueous™ (Ambion), MagMAX™

25 (Ambion), RecoverAll™ (Ambion), RNeasy (Qiagen), etc.

En algunas realizaciones, los niveles de ARN se miden en una muestra en la que el ARN no se ha purificado primero a partir de las células. En algunas de tales realizaciones, las células se someten a una etapa de lisis para liberar el ARN. Entre los ejemplos no limitantes de métodos de lisis se incluyen sonicación (por ejemplo, por 2-15 segundos, 8–18 µm, con 36 kHz); lisis química, por ejemplo, usando un detergente; y diversos reactivos de lisis disponibles comercialmente (tal como el tampón de lisis RNeasy, Qiagen). En algunas realizaciones, los niveles de ARN se miden en una muestra en la que se ha aislado ARN.

En algunas realizaciones, el ARN se modifica antes de detectar un ARN diana, tal como el ARNm de CRH, IGF2,

35 KRT20 o ANXA10. En algunas realizaciones, se modifica todo el ARN en la muestra. En algunas realizaciones, solo se modifican los ARN diana concretos que se van a analizar, por ejemplo, de una manera específica de secuencia. En algunas realizaciones, el ARN sufre transcripción inversa. En algunas de tales realizaciones, el ARN se somete a transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa del MMLV. Entre los ejemplos no limitantes de las condiciones para la transcripción inversa del RN utilizando transcriptasa inversa del MMLV se incluyen incubación de 5 a 20 minutos a de 40 ºC a 50 ºC.

Cuando un ARN diana se somete a transcripción inversa se forma un ADN complementario del ARN diana. En algunas realizaciones, se detecta el complementario de un ARN diana en lugar del propio ARN diana (o una copia de ADN del propio ARN). Por lo tanto, cuando los métodos tratados en el presente documento indican que se

45 detecta un ARN diana, o se determina el nivel de un ARN diana, tal detección o determinación puede llevarse a cabo en un complementario de un ARN diana en lugar de, o además de, el propio ARN diana. En algunas realizaciones, cuando se detecta el complementario de un ARN diana en lugar del propio ARN diana, se utiliza un polinucleótido para la detección que es complementario al complementario del ARN diana. En algunas de tales realizaciones, un polinucleótido para detección comprende al menos una parte que tiene una secuencia idéntica a la del ARN diana, aunque puede contener timidina en lugar de uridina y/o comprender otros nucleótidos modificados.

4.2.4. Métodos analíticos de ejemplo

Como se ha descrito anteriormente, se presentan, métodos para la detección de cáncer de vejiga. Los métodos

55 comprenden la detección de un panel de marcadores de cáncer de vejiga que consiste en CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, y que incluye, opcionalmente, al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno. En algunas realizaciones, la detección de un nivel elevado de uno de los cuatro marcadores de cáncer de vejiga indica la presencia de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, la detección de un nivel elevado de dos, tres o los cuatro marcadores de cáncer de vejiga indica la presencia de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es cáncer de vejiga de grado bajo. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es cáncer de vejiga de grado alto. En algunas realizaciones, el cáncer de vejiga es una recurrencia de cáncer de vejiga en un paciente con antecedentes de cáncer de vejiga.

Se puede utilizar cualquier procedimiento analítico capaz de permitir la detección específica y cuantificable (o

65 semicuantificable) de un ARN diana, tal como los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, en los métodos presentados en el presente documento. Tales métodos analíticos incluyen, pero no se limitan a, métodos de RT

PCR y otros métodos conocidos por los expertos en la materia.

En algunas realizaciones, el método de detección de un ARN diana, tal como los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10, comprende la amplificación de ADNc complementario al ARN diana. Tal amplificación puede llevarse a

5 cabo por cualquier método. Entre los métodos de ejemplo se incluyen, pero sin limitaciones, PCR en tiempo real, PCR de punto final y amplificación usando polimerasa de T7 a partir de un promotor de T7 hibridado a un ADNc, tal como el proporcionado por el Kit SenseAmp Plus ™ disponible en Implen, Alemania.

Cuando se amplifica un ARN diana o un ADNc complementario de un ARN diana, en algunas realizaciones se forma un amplicón de ADN del ARN diana. Un amplicón de ADN puede ser monocatenario o bicatenario. En algunas realizaciones, cuando un amplicón de ADN es monocatenario, la secuencia del amplicón de ADN está relacionada con el ARN diana, ya sea en orientación sentido o en orientación antisentido. En algunas realizaciones, se detecta un amplicón de ADN de un ARN diana en lugar del propio ARN diana. Por lo tanto, cuando los métodos tratados en el presente documento indican que se detecta un ARN diana, o se determina el nivel de un ARN diana, tal detección

15 o determinación puede llevarse a cabo en un amplicón de ADN del ARN diana en lugar de, o además de, el propio ARN diana. En algunas realizaciones, cuando se detecta el amplicón de ADN del ARN diana en lugar del propio ARN diana, se utiliza un polinucleótido para la detección que es complementario al complementario del ARN diana. En algunas realizaciones, cuando se detecta el amplicón de ADN del ARN diana en lugar del propio ARN diana, se utiliza un polinucleótido para la detección que es complementario del ARN diana. Además, en algunas realizaciones, se pueden usar múltiples polinucleótidos para detección y algunos polinucleótidos pueden ser complementarios del ARN diana y algunos polinucleótidos pueden ser complementarios del complementario de ARN diana.

En algunas realizaciones, el método de detección de uno o más ARN diana, tal como el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, comprende RT-PCR, como se describe a continuación. En algunas realizaciones, la detección de

25 uno o más ARN diana comprende control en tiempo real de una reacción de RT-PCR, que se puede lograr por cualquier método. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la utilización de TaqMan®, baliza molecular o sondas Scorpion (es decir, sondas de transferencia de energía (ET), tales como sondas FRET) y la utilización de colorantes intercalantes, tales como verde SYBR, EvaGreen, naranja de tiazol, YO-PRO, TO-PRO, etc.

Ejemplos no limitantes de las condiciones de ejemplo para la amplificación del ADNc del que se ha realizado transcripción inversa a partir de los ARN diana son los siguientes. Un ciclo de ejemplo comprende una desnaturalización inicial a 90 ºC a 100 ºC durante de 2 a 5 minutos, seguido de ciclado que comprende desnaturalización a de 90 ºC a 100 ºC durante de 1 a 10 segundos, hibridación a 60 ºC a 70 ºC durante de 10 a 30 segundos y extensión a de 60 º C a 75 ºC durante de 10 a 40 segundos. En algunas realizaciones, para el primer 35 ciclo después de la etapa de desnaturalización inicial, se omite la etapa ciclo de desnaturalización. En algunas realizaciones, se usa la polimerasa Taq para la amplificación. En algunas realizaciones, el ciclo se lleva a cabo al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces

o al menos 45 veces. En algunas de tales realizaciones, la Taq se utiliza con una función de arranque en caliente. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación se produce en un cartucho GeneXpert y la amplificación de los cuatro ARN diana marcadores de cáncer de vejiga se produce en la misma reacción. En algunas realizaciones, la detección de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10 se produce en menos de 3 horas, menos de 2,5 horas o menos de 2 horas, desde la desnaturalización inicial a través de la última extensión.

En algunas realizaciones, la detección de un ARN diana comprende la formación de un complejo que comprende un

45 polinucleótido que es complementario de un ARN diana o de un complementario del mismo, y un ácido nucleico seleccionado de entre el ARN diana, un amplicón de ADN del ARN diana y un complementario del ARN diana. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un complementario del ARN diana, tal como un ADNc que se ha producido por transcripción inversa a partir del ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido forma un complejo con un amplicón de ADN del ARN diana. Cuando un amplicón de ADN bicatenario es parte de un complejo, tal como se usa en el presente documento, el complejo puede comprender una o ambas cadenas del amplicón de ADN. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un complejo comprende solamente una cadena del amplicón de ADN. En algunas realizaciones, un complejo es un triplex y comprende el polinucleótido y ambas cadenas del amplicón de ADN. En algunas realizaciones, el complejo se forma mediante hibridación entre el polinucleótido y el ARN diana,

55 complementario del ARN diana, o el amplicón de ADN del ARN diana. El polinucleótido, en algunas realizaciones, es un cebador o sonda.

En algunas realizaciones, un método comprende la detección del complejo. En algunas realizaciones, el complejo no tiene que estar asociado en el momento de la detección. Es decir, en algunas realizaciones, se forma un complejo, a continuación, el complejo se disocia o destruye de alguna manera, y se detectan los componentes del complejo. Un ejemplo de dicho sistema es un ensayo TaqMan®. En algunas realizaciones, cuando el polinucleótido es un cebador, la detección del complejo puede comprender la amplificación del ARN diana, un complementario del ARN diana o un amplicón de ADN de un ARN diana.

65 En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para la detección de al menos un ARN diana en los métodos establecidos en el presente documento incluye RT-PCR cuantitativa en tiempo real. En algunas realizaciones, el

método analítico utilizado para la detección de al menos un ARN diana incluye el uso de una sonda TaqMan®. El ensayo utiliza transferencia de energía ("ET"), tal como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ("FRET"), para detectar y cuantificar el producto de PCR sintetizado. Típicamente, la sonda TaqMan® comprende una molécula de colorante fluorescente acoplado al extremo 5' y una molécula inactivadora acoplada al extremo 3',

5 de manera que el colorante y el inactivador están en proximidad cercana, permitiendo que el inactivador suprima a señal de fluorescencia del colorante mediante FRET. Cuando la polimerasa replica el molde del amplicón quimérico al que está unida la sonda TaqMan®, la nucleasa 5' de la polimerasa escinde la sonda, desacoplando el colorante y el inactivador de modo que se detecta la señal del colorante (tal como, fluorescencia). La señal (tal como fluorescencia) aumenta con cada ciclo de RT-PCR de forma proporcional a la cantidad de sonda que se escinde.

En algunas realizaciones, la cuantificación de los resultados de los ensayos de RT-PCR en tiempo real se realiza mediante la construcción de una curva estándar a partir de un ácido nucleico de concentración conocida y, a continuación, extrapolando la información cuantitativa para los ARN diana de concentración desconocida. En algunas realizaciones, el ácido nucleico utilizado para generar una curva estándar es un ARN (por ejemplo, un

15 control endógeno o un control exógeno). En algunas realizaciones, el ácido nucleico utilizado para generar una curva estándar es un ADN plasmídico bicatenario purificado o un ADN monocatenario generado in vitro.

En algunas realizaciones, cuando las eficiencias de amplificación de los ácidos nucleicos diana y endógenos de referencia son aproximadamente iguales, la cuantificación se lleva a cabo mediante el método comparativo de Ct (umbral del ciclo, por ejemplo, el número de ciclos de PCR necesarios para que la señal de fluorescencia se eleve por encima del fondo). Los valores de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana en una muestra. En algunas realizaciones, los valores de Ct de un ARN diana se puede comparar con un control o calibrador, tal como dicho ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, los valores de Ct del control exógeno y el ARN diana se normalizan con un control endógeno apropiado. Ejemplos no limitantes de controles endógenos

25 se tratan en el presente documento.

En algunas realizaciones, un valor de Ct umbral (o un "Ct de corte") para un ARN diana, por debajo del cual se indica cáncer de vejiga, se ha determinado previamente. En tales realizaciones, una muestra de control puede no analizarse de forma simultánea con la muestra de ensayo. En algunas realizaciones, como se trata en el presente documento, anteriormente se ha determinado un valor umbral de ∆Ct por encima del cual se indica cáncer de vejiga.

Además de los ensayos TaqMan®, otras químicas de RT-PCR en tiempo real útiles para detectar y cuantificar los productos de PCR en los métodos presentados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, balizas moleculares, sondas Scorpion y colorantes intercalantes, tales como verde SYBR, EvaGreen, naranja de tiazol, YO

35 PRO, TO-PRO, etc., que se tratan a continuación.

En diversas realizaciones, se utiliza detección mediante RT-PCR en tiempo real para detectar, en una única reacción multiplex, los cuatro marcadores de cáncer de vejiga del panel descrito en el presente documento, y opcionalmente, al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno. En algunas realizaciones multiplex, se utiliza una pluralidad de sondas, tales como las sondas TaqMan®, cada una específica para un ARN diana diferente. En algunas realizaciones, cada sonda específica del ARN diana se puede distinguir en los espectros de las otras sondas utilizadas en la misma reacción multiplex.

En algunas realizaciones, la cuantificación de los productos de RT-PCR en tiempo real se realiza usando un

45 colorante que se une a los productos de ADN bicatenario, tales como verde SYBR, EvaGreen, naranja de tiazol, YO-PRO, TO-PRO, etc. En algunas realizaciones, el ensayo es el ensayo QuantiTect SYBR Green PCR de Qiagen. En este ensayo, el ARN total se aísla primero a partir de una muestra. El ARN total se poliadenila posteriormente en el extremo 3' y se realiza transcripción inversa utilizando un cebador universal con poli-dT en el extremo 5'. En algunas realizaciones, una sola reacción de transcripción inversa es suficiente para analizar múltiples ARN diana. A continuación, se realiza RT-PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos del ARN diana y un cebador universal miScript, que comprende una secuencia de poli-dT en el extremo 5'. El colorante verde SYBR se une de forma no específica al ADN bicatenario y, tras la excitación, emite luz. En algunas realizaciones, las condiciones del tampón que promueven la hibridación altamente específica de los cebadores al molde de la PCR (por ejemplo, disponible en el Kit QuantiTect SYBR Green PCR de Qiagen) se pueden utilizar para evitar la formación de dúplex

55 de ADN no específicos y dímeros de cebadores que se unirán al verde SYBR y afectan de forma negativa a la cuantificación. Por lo tanto, a medida que el producto de la PCR se acumula, la señal del verde SYBR aumenta, lo que permite la cuantificación de productos específicos.

La RT-PCR en tiempo real se realiza usando cualquier instrumento de RT-PCR disponible en la materia. Típicamente, los instrumentos utilizados en la recogida y análisis de los datos de la RT-PCR comprenden un ciclador térmico, óptica para la recogida de excitación y emisión de fluorescencia, y, opcionalmente, un ordenador y software de adquisición y análisis de datos.

En algunas realizaciones, el método analítico utilizado en los métodos descritos en el presente documento es un

65 ensayo DASL ® (hibridación, selección, extensión y ligadura mediada por ADNc). En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de una muestra que se va a analizar por cualquier método. A continuación, el ARN total se puede

poliadenilar (se añaden > 18 residuos de A a los extremos 3' de los ARN en la mezcla de reacción). El ARN se sometió a transcripción inversa usando un cebador de ADN marcado con biotina que comprende del extremo 5' al extremo 3', una secuencia que incluye un sitio para el cebador de la PCR y una región de poli-dT que se une a la cola de poli-dA del ARN de la muestra. Los transcritos de ADNc biotinilado resultantes se hibridaron después a un

5 soporte sólido a través de una interacción biotina-estreptavidina y en contacto con uno o más polinucleótidos específicos de ARN diana. Los polinucleótidos específicos del ARN diana comprenden, desde el extremo 5' al extremo 3', una región que comprende un sitio para el cebador de ka PCR, comprendiendo la región una secuencia de dirección, y una secuencia específica del ARN diana.

En algunas realizaciones de DASL®, la secuencia específica del ARN diana comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es la misma que, o complementaria a, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 nucleótidos contiguos del ARN diana marcador de cáncer de vejiga, un ARN

15 de control endógeno o un ARN de control exógeno.

Después de la hibridación, se extiende el polinucleótido específico del de ARN diana y, a continuación, los productos extendidos se eluyen de la matriz de ADNc inmovilizado. Una segunda reacción de PCR que utiliza un cebador universal marcado con fluorescencia genera un ADN marcado con fluorescencia que comprende la secuencia específica del ARN diana. Los productos de PCR marcados se hibridan después a una matriz de microperlas para la detección y cuantificación.

En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para detectar y cuantificar los niveles del al menos un ARN diana en los métodos descritos en el presente documento es un ensayo de citometría de flujo basado en perlas. 25 Véase, Lu J. et al. (2005) Nature 435:834–838. Un ejemplo de un ensayo de citometría de flujo basado en perlas es la tecnología xMAP® de Luminex, Inc. (Véase, http://www.luminexcorp.com/ technology/index.html). En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de una muestra y después se marca con biotina. El ARN marcado se hibrida después con sondas de captura específicas del ARN diana (por ejemplo, productos FlexmiR™ comercializados por Luminex, Inc. en http://www.luminexcorp.com/products/assays/index.html) que están unidas covalentemente a microperlas, cada una de los cuales está marcada con 2 colorantes que tienen diferentes intensidades de fluorescencia. Una molécula indicadora unida a estreptavidina (por ejemplo, estreptavidina-ficoeritrina, también conocido como "SAPE") se une al ARN diana capturado y la señal única de cada perla se lee usando citometría de flujo. En algunas realizaciones, la muestra de ARN se poliadenila primero y, posteriormente, se marca con un dendrímero biotinilado 3DNA™ (es decir, un ADN de brazos múltiples con numerosas moléculas de biotina unidas al

35 mismo), utilizando un polinucleótido de puente que es complementario al extremo 3' de la cola de poli-dA del ARN de la muestra y al extremo 5 'del polinucleótido unido al dendrímero biotinilado. A continuación, la molécula indicadora unida a estreptavidina se une al dendrímero biotinilado antes del análisis mediante citometría de flujo. En algunas realizaciones, el ARN marcado con biotina se expone primero a SAPE y el complejo ARN/SAPE se expone posteriormente a un anticuerpo anti-ficoeritrina unida a un dendrímero de ADN, que se puede unir incluso hasta a 900 moléculas de biotina. Esto permite que múltiples moléculas de SAPE se unan al dendrímero biotinilado a través de la interacción biotina-estreptavidina, aumentando de este modo la señal del ensayo.

En algunas realizaciones, el método analítico utilizado para detectar y cuantificar los niveles del al menos un ARN diana en los métodos descritos en el presente documento es mediante electroforesis en gel y la detección con

45 sondas marcadas (por ejemplo, sondas marcadas con un marcador radiactivo o quimioluminiscente), tal como mediante transferencia de tipo Northern En algunas realizaciones, el ARN total se aísla de la muestra y, después, se separa por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. A continuación, el ARN separado se transfiere a una membrana y se hibrida con sondas complementarias radiomarcadas. En algunas realizaciones, las sondas de ejemplo contienen uno o más análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad, como se trata a continuación, tales como análogos de ácido nucleico bloqueado ("LNA"), que contienen un resto de azúcar bicíclico en lugar de los azúcares desoxirribosa o ribosa. Véase, por ejemplo, Várallyay, E. et al. (2008) Nature Protocols 3(2):190–196.

En algunas realizaciones, la detección y cuantificación de uno o más ARN diana se lleva a cabo utilizando

55 dispositivos de microfluidos y detección de una sola molécula. En algunas realizaciones, los ARN diana en una muestra de ARN total aislado se hibridan con dos sondas, una que es complementaria a los ácidos nucleicos en el extremo 5' del ARN diana y la segunda que es complementaria del extremo 3' del ARN diana. Cada sonda comprende, en algunas realizaciones, uno o más análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad, tales como análogos de nucleótidos de LNA, y cada uno está marcado con un colorante fluorescente diferente que tiene diferentes espectros de emisión de fluorescencia (es decir, colorantes diferentes de forma detectable). A continuación, se hace fluir la muestra a través de un capilar de microfluidos en el que múltiples láseres excitan las sondas fluorescentes, de forma que una descarga coincidente única de fotones identifica un ARN diana concreto, y el número de descargas coincidentes únicas particulares de fotones se puede contar para cuantificar la cantidad de el ARN diana en la muestra. En algunas realizaciones alternativas, una sonda específica del ARN diana se puede

65 marcar con 3 o más marcadores diferentes seleccionados de, por ejemplo, fluoróforos, marcadores de espín de electrones, etc., y, después, se hibrida a una muestra de ARN.

De manera opcional, el ARN de la muestra se modifica antes de la hibridación. A continuación, el dúplex ARN diana/sonda se hace pasar a través de los canales en un dispositivo de microfluido y que comprende detectores que registran la señal única de los 3 marcadores. De esta manera, se detectan moléculas individuales mediante su señal

5 única y se cuentan. Véanse las patentes de Estados Unidos números 7.402,422 y 7.351.538 de Fuchs et al., U.S. Genomics, Inc.

4.2.5. Automatización y sistemas de ejemplo

En algunas realizaciones, la expresión génica se detecta utilizando una plataforma de análisis y/o manipulación automática de las muestras. En algunas realizaciones, se utilizan plataformas de análisis automatizadas disponibles comercialmente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se usa el sistema GeneXpert® (Cepheid, Sunnyvale, CA).

La presente invención se ilustra para su uso con el sistema GeneXpert. Los métodos de preparación y análisis de

15 muestras de ejemplo se describen a continuación. Sin embargo, la presente invención no se limita a un método de detección en particular o plataforma de análisis. Un experto en la materia reconoce que se puede utilizar cualquier número de plataformas y métodos.

El sistema GeneXpert® utiliza un cartucho de un solo uso independiente. La extracción, la amplificación y la detección de las muestras se pueden llevar a cabo todos ellos llevados en un "laboratorio en un cartucho" independiente. (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.958.349, 6.403.037, 6.440.725, 6.783.736, 6.818.185.)

Los componentes del cartucho incluyen, pero no se limitan a, cámaras de procesamiento que contienen reactivos,

25 filtros y tecnologías de captura útiles para extraer, purificar y amplificar los ácidos nucleicos diana. Una válvula permite la transferencia de fluido desde una cámara a otra y contiene los componentes de filtración y lisis de ácidos nucleicos. Una ventana óptica permite la detección óptica en tiempo real. Un tubo de reacción permite ciclos térmicos muy rápidos.

En algunas realizaciones, el sistema GenXpert® incluye una pluralidad de módulos para la escalabilidad. Cada módulo incluye una pluralidad de cartuchos, junto con los componentes de manipulación y análisis de muestras.

En algunas realizaciones, el método de preparación de muestras GeneXpert ® utiliza la filtración con el fin de capturar y concentrar las células a partir de la orina. En algunas realizaciones, se utiliza un filtro de tamaño de poro

35 de 0,8 µm. Este tamaño facilita la captura de todas las células en la orina. En otras realizaciones, se utilizan tamaños de porode 0,5 a 10 µm, de 0,5 a 5 µm,de 0,de 8 a10 µm, de 0, de 8 a 5 µm, de0, de8a 2 µm, de 2a 5 µm, de 2 a 10 µm, de 2 a 8 µm, de 5 a 8 µm, de o de 5 a 10 µm. Algunos filtros (tales como 5 µm, 8 µm, and 10 µm) permiten la eliminación de la mayoría de los glóbulos rojos y blancos de la muestra durante la captura de las células uroteliales más grandes, que son las células diana del ensayo. En algunas realizaciones, este método de preparación de muestras mejora la especificidad del ensayo mediante la eliminación de los glóbulos blancos que pueden estar presentes debido a una infección o inflamación. En algunos casos, los métodos de preparación de muestras, tales como la centrifugación de la orina entera, seguida de aislamiento del ARN del sedimento de orina no permiten la eliminación de los glóbulos blancos. En algunas realizaciones, la eficiencia de la captura de células por filtración es mayor en comparación con la centrifugación, y puede proporcionar resultados más consistentes.

45 Después de que las células de la orina son capturadas en el filtro, en algunas realizaciones, se lavan y, después, se lisan mediante sonicación (2-15 segundos, 8-16 µm a 36 kHz). El lisado celular se recoge después y se utiliza para reconstituir los reactivos de la RT-PCR, que están presentes en el cartucho como partículas liofilizadas.

En algunas realizaciones, la RT-PCR se utiliza para amplificar y analizar la presencia o los niveles de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, la transcripción inversa utiliza la enzima RT del MMLV y una incubación de 5 a 20 minutos a 40 ºC a 50 ºC. En algunas realizaciones, la PCR utiliza la Taq polimerasa con función de arranque en caliente, tal como AptaTaq (Roche). En algunas realizaciones, la desnaturalización inicial se realiza a de 90 ºC a 100 ºC durante de 2 a 5 minutos; la temperatura de

55 desnaturalización del ciclo es de 90 ºC a 100 ºC durante de 1 a 10 segundos; la temperatura de hibridación del ciclo es de 60 ºC a 70 ºC durante de 10 a 30 segundos; y la temperatura de extensión del ciclo es 60 ºC a 75 ºC durante de 10 a 40 segundos; y se realizan hasta 50 ciclos.

La presente invención no se limita a secuencias concretas de cebadores y/o de sondas. Ejemplos de cebadores de amplificación y sondas de detección se describen en los ejemplos.

En algunas realizaciones, se usa una centrifugación fuera de línea para mejorar los resultados del ensayo con muestras con bajo contenido celular. La muestra, con o sin el conservante añadido, se centrifuga y se elimina el sobrenadante. A continuación, se resuspende el sedimento en un volumen más pequeño de cualquiera del

65 sobrenadante o el conservante. El sedimento resuspendido se añade a continuación a un cartucho de GeneXpert ® como se ha descrito anteriormente.

4.2.6. Análisis de datos de ejemplo

En algunas realizaciones, se usa un programa de análisis basado en ordenador para traducir los datos en bruto

5 generados por el ensayo de detección (por ejemplo, el nivel de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga descritos en el presente documento) en datos de valor predictivo para un clínico. El clínico puede acceder a los datos predictivos usando cualquier medio adecuado. Por tanto, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona el beneficio adicional de que el clínico, que no es probable que esté formado en genética o en biología molecular, no necesita entender los datos brutos. Los datos se presentan directamente al clínico en su forma más útil. Después, el clínico podrá usar inmediatamente la información con el fin de optimizar los cuidados del sujeto.

La presente invención contempla cualquier método capaz de recibir, procesar y transmitir la información a y desde los laboratorios que realizan los ensayos, proveedores de información, personal médico y sujetos. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente invención, se obtiene una muestra (por ejemplo, una muestra de biopsia o de 15 suero o de orina) de un sujeto y se somete a un servicio de perfiles (por ejemplo, el laboratorio clínico en un centro médico, negocios de perfil genómico etc.) localizado en cualquier parte del mundo (por ejemplo, en un país diferente al país en el que reside el sujeto o en el que la información se va a usar en última instancia) para generar los datos brutos. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica, el sujeto puede acudir a un centro médico para que se le extraiga la muestra, que se enviará al centro de realización del perfil, o los sujetos pueden obtener ellos mismos la muestra (por ejemplo, una muestra de orina) y enviarla directamente a un centro de realización de perfiles. Cuando la muestra comprende información biológica determinada previamente, el sujeto puede enviar la información se puede enviar directamente al servicio de realización de perfiles (por ejemplo, un ordenador puede escanear una tarjeta de información que contiene la información y transmitir los datos a un ordenador del centro de realización de perfiles usando un sistema de comunicación electrónica). Una vez recibida por el servicio de perfiles,

25 la muestra se procesa y se produce un perfil (es decir, los datos de expresión), específico para la información de diagnóstico o pronóstico deseada para el sujeto.

Después, los datos del perfil se preparan en un formato adecuado para su interpretación por un clínico encargado del tratamiento. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos de expresión brutos, el formato preparado puede representar un diagnóstico o evaluación de riesgos (por ejemplo, el nivel de expresión de los marcadores de cáncer de vejiga descritos en el presente documento o diagnóstico de cáncer de vejiga) para el sujeto, junto con recomendaciones de opciones terapéuticas concretas. Los datos se pueden mostrar al clínico mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el servicio de realización de perfiles genera un informe que se puede imprimir para el clínico (por ejemplo, en el centro de atención) o mostrar al clínico en un monitor de

35 ordenador.

En algunas realizaciones, la información se analiza primero en el centro de atención o en una instalación regional. Después, los datos brutos se envían a una instalación de procesamiento central para su posterior análisis y/o para convertir los datos brutos en información útil para un clínico o un paciente. La instalación de procesamiento central proporciona la ventaja de privacidad (todos los datos se almacenan en una instalación central con protocolos de seguridad uniformes), velocidad y uniformidad de los análisis de datos. A continuación, la instalación de procesamiento central puede controlar el destino de los datos tras el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, usando un sistema de comunicación electrónica, la instalación central puede proporcionar datos al clínico, al sujeto o a los investigadores.

45 En algunas realizaciones, el sujeto puede acceder directamente a los datos usando el sistema de comunicación electrónica. Según los resultados, el sujeto puede elegir intervención o asesoramiento adicionales. En algunas realizaciones, los datos se utilizan para uso en investigación. Por ejemplo, los datos se pueden usar para optimizar aún más la inclusión o eliminación de marcadores como indicadores útiles de una afección o estado de enfermedad concreto o como un compañero de diagnóstico para determinar un curso de tratamiento de acción particular.

4.2.7. Polinucleótidos de ejemplo

En el presente documento se divulgan polinucleótidos. También se divulgan polinucleótidos sintéticos. Los

55 polinucleótidos sintéticos, tal como se usa en el presente documento, se refieren a polinucleótidos que se han sintetizado in vitro ya sea química o enzimáticamente. La síntesis química de polinucleótidos incluye, pero no se limita a, síntesis usando sintetizadores de polinucleótidos, tales como OligoPilot (GE Healthcare), sintetizador ABI 3900 DNA (Applied Biosystems), y similares. La síntesis enzimática incluye, pero no se limita a la misma, la producción de polinucleótidos mediante amplificación enzimática, por ejemplo, PCR. Un polinucleótido puede comprender uno o más análogos de nucleótidos (es decir, nucleótidos modificados) tratados en el presente documento.

En algunas realizaciones, se proporciona un polinucleótido que comprende una región que es idéntica a, o complementaria a, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al 65 menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos

contiguos de una secuencia seleccionada del ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. En algunas realizaciones se proporciona un polinucleótido que comprende una región que es idéntica a, o complementaria a, un tramo de 6 a 100, de 8 a 100, de 8 a 75, de 8 a 50, de 8 a 40 o de 8 a 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. Ejemplos no limitantes de polinucleótidos se muestran en las tablas 1 y

5 6.

En diversas realizaciones, un polinucleótido que comprende menos de 500, menos de 300, menos de 200, menos de 150, menos de 100, menos de 75, menos de 50, menos de 40 o menos de 30 nucleótidos. En diversas realizaciones, un polinucleótido tiene una longitud de entre 6 y 200, entre 8 y 200, entre 8 y 150, entre 8 y 100, entre 8 y 75, entre 8 y 50, entre 8 y 40 o entre 8 y 30 nucleótidos.

En algunas realizaciones, el polinucleótido es un cebador. En algunas realizaciones, el cebador se marca con un resto detectable. En algunas realizaciones, un cebador no está marcado. Un cebador, tal como se usa en el presente documento, es un polinucleótido que es capaz de hibridarse específicamente a un ARN diana o a un ADNc

15 producido por transcripción inversa a partir del ARN diana o a un amplicón que se ha amplificado a partir de un ARN diana o un ADNc (denominado colectivamente como "molde") y, en presencia del molde, una polimerasa y tampones y reactivos adecuados, puede extenderse para formar un producto de extensión del cebador.

En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda. En algunas realizaciones, la sonda se marca con un resto detectable. Un resto detectable, tal como se usa en el presente documento, incluye restos directamente detectables, tales como colorantes fluorescentes, y restos indirectamente detectables, tales como miembros de pares de unión. Cuando el resto detectable es un miembro de un par de unión, en algunas realizaciones, la sonda puede ser detectable mediante la incubación de la sonda con un marcador detectable unido al segundo miembro del par de unión. En algunas realizaciones, una sonda no está marcada, tal como cuando una sonda es una sonda de captura,

25 por ejemplo, en una micromatriz o perla. En algunas realizaciones, una sonda no se puede extender, por ejemplo, mediante una polimerasa. En otras realizaciones, una sonda se puede extender.

En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda FRET que, en algunas realizaciones, está marcado en el extremo 5' con un colorante fluorescente (donante) y en el extremo 3' con un inactivador (aceptor), un grupo químico que absorbe (es decir, suprime) la emisión de fluorescencia del colorante cuando los grupos están en estrecha proximidad (es decir, unidos a la misma sonda). En otras realizaciones, el colorante y el inactivador no están en los extremos de la sonda FRET. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el espectro de emisión del colorante debería superponerse considerablemente con el espectro de absorción del inactivador.

35 4.2.7.1. Modificaciones de polinucleótidos de ejemplo

En algunas realizaciones, los métodos de detección de al menos un ARN diana descrito en el presente documento emplean uno o más polinucleótidos que se han modificado, tales como polinucleótidos que comprenden uno o más análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad. Los polinucleótidos modificados útiles en los métodos descritos en el presente documento incluyen cebadores para la transcripción inversa, cebadores de amplificación por PCR y sondas. En algunas realizaciones, la incorporación de nucleótidos potenciadores de la afinidad aumenta la afinidad de unión y la especificidad de un polinucleótido por su ácido nucleico diana, en comparación con los polinucleótidos que contienen solo desoxirribonucleótidos, y permite el uso de polinucleótidos más cortos o para las regiones más cortas de la complementariedad entre el polinucleótido y el ácido nucleico diana.

45 En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad incluyen nucleótidos que comprenden una o más modificaciones de bases, modificaciones de azúcares y/o modificaciones del esqueleto.

En algunas realizaciones, las bases modificadas para su uso en análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad incluyen 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2aminopurina, inosina, diaminopurina, 2-cloro-6-aminopurina, xantina e hipoxantina.

En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad incluyen nucleótidos que tienen azúcares modificados, tales como azúcares 2'-sustituidos, tales como azúcares 2'-O-alquil-ribosa, azúcares 2'

55 amino-desoxirribosa, azúcares 2'-fluoro-desoxirribosa, azúcares 2'-fluoro-arabinosa y azúcares 2'-O-metoxietil-ribosa (2'MOE). En algunas realizaciones, los azúcares modificados son azúcares arabinosa, o azúcares d-arabino-hexitol.

En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos potenciadores de la afinidad incluyen modificaciones del esqueleto, tales como el uso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por ejemplo, un oligómero que incluye bases nucleotídicas unidas entre sí por una cadena principal de aminoácidos). Otras modificaciones del esqueleto incluyen enlaces fosforotioato, ácidos nucleicos modificados con fosfodiéster, combinaciones de ácidos nucleicos fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, alquilfosfonatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos.

65 En algunas realizaciones, un polinucleótido incluye al menos un análogo de nucleótido potenciador de la afinidad

que tiene una base modificada, al menos un nucleótido (que puede ser el mismo nucleótido) que tiene un azúcar modificado, y/o al menos un enlace internucleotídico que es de origen no natural.

En algunas realizaciones, un análogo de nucleótido potenciador de la afinidad contiene un azúcar de ácido nucleico

5 bloqueado ("LNA"), que es un azúcar bicíclico. En algunas realizaciones, un polinucleótido para su uso en los métodos descritos en el presente documento comprende uno o más nucleótidos que tienen un azúcar LNA. En algunas realizaciones, un polinucleótido contiene una o más regiones que consisten en nucleótidos con azúcares de LNA. En otras realizaciones, un polinucleótido contiene nucleótidos con azúcares de LNA intercalados con desoxirribonucleótidos. Véase, por ejemplo, Frieden, M. et al. (2008) Curr. Pharm. Des. 14(11): 1138–1142.

4.2.7.2. Cebadores de ejemplo

En algunas realizaciones, se proporciona un cebador. En algunas realizaciones, un cebador es idéntico a, o complementaria a, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al

15 menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. En algunas realizaciones se proporciona un cebador que comprende una región que es idéntica a, o complementaria a, un tramo de 6 a 100, de 8 a 100, de 8 a 75, de 8 a 50, de 8 a 40 o de 8 a 30 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. Ejemplos no limitantes de cebadores se muestran en las Tablas 1 y 6. En algunas realizaciones, un cebador puede comprender también partes o regiones que no son idénticas ni complementarias al ARN diana. En algunas realizaciones, una región de un cebador que es idéntica o complementaria de un ARN diana es contigua, de manera que cualquier región de un cebador que no sea idéntica o complementaria del ARN diana no interrumpe la región idéntica o complementaria.

25 En algunas realizaciones, un cebador comprende una parte que está presente de forma idéntica en un ARN diana. En algunas de tales realizaciones, un cebador que comprende una región que está presente de forma idéntica en el ARN diana es capaz de hibridarse selectivamente con un ADNc que se ha producido por transcripción inversa a partir del ARN, o a un amplicón que se ha producido mediante amplificación del ARN diana o el ADNc. En algunas realizaciones, el cebador es complementario a una parte suficiente del ADNc o amplicón, de modo que hibrida selectivamente con el ADNc o amplicón en las condiciones del ensayo particular que se utilice.

Tal como se usa en el presente documento, "hibridar selectivamente" significa que un polinucleótido, tal como un cebador o sonda, hibridará con un ácido nucleico particular en una muestra con una afinidad al menos 5 veces

35 mayor de lo que hibridará con otro ácido nucleico presente en la misma muestra que tiene una secuencia de nucleótidos diferente en la región de hibridación. Los ejemplos de condiciones de hibridación se tratan en el presente documento, por ejemplo, en el contexto de una reacción de transcripción inversa o una reacción de amplificación por PCR. N algunas realizaciones, un polinucleótido hibridará con un ácido nucleico particular en una muestra con una afinidad al menos 10 veces mayor de lo que hibridará con otro ácido nucleico presente en la misma muestra que tiene una secuencia de nucleótidos diferente en la región de hibridación.

En algunas realizaciones, se usa un cebador para la transcripción inversa de un ARN diana, por ejemplo, como se trata en el presente documento. En algunas realizaciones, se usa un cebador para amplificar un ARN diana o un ADNc producido por transcripción inversa del mismo. Tal amplificación, en algunas realizaciones, es PCR

45 cuantitativa, por ejemplo, como se trata en el presente documento. En algunas realizaciones, un cebador comprende un resto detectable.

En el presente documento se divulgan pares de cebadores. Tales pares de cebadores se diseñan para amplificar una porción de un ARNm diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, o un ARN de control endógeno,

o un ARN de control exógeno. En algunas realizaciones, se diseña un par de cebadores para producir un amplicón que es de 50 a 1.500 nucleótidos de longitud, de 50 a 1.000 nucleótidos de longitud, de 50 a 750 nucleótidos de longitud, de 50 a 500 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 50 a 300 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 150 nucleótidos de longitud o de 50 a 100 nucleótidos de longitud. Ejemplos no limitantes de pares de cebadores ejemplares se muestran en las Tablas 1 y 6. En algunas 55 realizaciones, se diseña un par de cebadores que abarca un intrón en la secuencia genómica de manera que el ARNm, sin el intrón, se amplifica más preferiblemente que la secuencia genómica. Por "abarca un intrón" se quiere decir que un cebador del par de cebadores es complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc producido por transcripción inversa a partir del ARNm que está situado al menos parcialmente en 5' de un intrón en la secuencia genómica y un cebador del par de cebadores es complementario de una secuencia en el ARNm o un ADNc producido por transcripción inversa a partir del ARNm que está situado al menos parcialmente en 3' del misma intrón en la secuencia genómica. En algunas realizaciones, un cebador del par de cebadores es complementario a una secuencia en el ARNm o un ADNc producido por transcripción inversa a partir del ARNm que está situado en 5' de un intrón en la secuencia genómica y un cebador del par de cebadores es complementario de una secuencia en el ARNm o un ADNc producido por transcripción inversa a partir del ARNm que está situado en 3' del misma intrón

65 en la secuencia genómica. En algunas realizaciones, uno de los cebadores en el par de cebadores puede ser complementario de una secuencia en el ARNm o un ADNc producido por transcripción inversa a partir del ARNm

que se corta y empalma cuando se elimina el intrón, de tal manera que la secuencia complementaria contigua no se encuentra en la secuencia genómica. Un par de cebadores que comprende un cebador de este tipo todavía se considera que abarca un intrón.

5 4.2.7.3. Sondas de ejemplo

En diversas realizaciones, los métodos de detección de la presencia de cáncer de vejiga comprenden hibridar los ácidos nucleicos de una muestra con una sonda. En algunas realizaciones, la sonda comprende una porción que es complementaria a un ARN diana, tal como el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. En algunas realizaciones, la 10 sonda comprende una parte que está presente de forma idéntica en el ARN diana. En algunas de tales realizaciones, una sonda que es complementaria de un ARN diana es complementaria a una parte suficiente del ARN diana de forma que hibrida selectivamente con el ARN diana en las condiciones del ensayo concreto que se utilice. En algunas realizaciones, una sonda que es complementaria de un ARN diana comprende una región que es complementaria de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al 15 menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos del ARN diana, tal como el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. Ejemplos no limitantes de sondas se muestran en las Tablas 1 y 6. Una sonda que es complementaria de un ARN diana también puede comprender porciones o regiones que no son complementarias del ARN diana. En algunas realizaciones, una región de una

20 sonda que es complementaria de un ARN diana es contigua, de manera que cualquier región de una sonda que no sea complementaria al ARN diana no interrumpe la región complementaria.

En algunas realizaciones, la sonda comprende una porción que está presente de forma idéntica en el ARN diana, tal como el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. En algunas de tales realizaciones, una sonda que comprende una 25 región que está presente de forma idéntica en el ARN diana es capaz de hibridarse selectivamente con un ADNc que se ha producido por transcripción inversa a partir del ARN, o a un amplicón que se ha producido mediante amplificación del ARN diana o el ADNc. En algunas realizaciones, la sonda es complementaria de una parte suficiente del ADNc o amplicón, de modo que hibrida selectivamente con el ADNc o amplicón en las condiciones del ensayo particular que se utilice. En algunas realizaciones, una sonda que es complementaria de un ADNc o 30 amplicón comprende una región que es complementaria de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29 o al menos 30 nucleótidos contiguos del ADNc o amplicón. Una sonda que es complementaria de un ADNc o amplicón también puede comprender partes o regiones que no son complementarias del ADNc o amplicón.

35 En algunas realizaciones, una región de una sonda que es complementaria de un ADNc o amplicón es contigua, de manera que cualquier región de una sonda que no sea complementaria del ADNc o amplicón no interrumpe la región complementaria.

En algunas realizaciones, el método de cuantificación de manera detectable de uno o más ARN diana comprende:

40 (a) transcripción inversa de un ARN diana para producir un ADNc que es complementario del ARN diana; (b) amplificar el ADNc a partir de (a); y (c) detectar la cantidad de un ARN diana usando RT-PCR en tiempo real y una sonda de detección (que puede ser simultánea con la etapa de amplificación (b)).

Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, la detección mediante RT-PCR en tiempo real se

45 puede realizar utilizando una sonda FRET, que incluye, pero no se limita a, una sonda TaqMan®, una sonda de baliza molecular y una sonda Scorpion. En algunas realizaciones, la detección y cuantificación mediante RT-PCR en tiempo real se realiza con una sonda TaqMan®, es decir, una sonda lineal que tiene típicamente un colorante fluorescente unido covalentemente a un extremo del ADN y una molécula inactivadora unida covalentemente en el otro extremo del ADN. La sonda FRET comprende una secuencia que es complementaria de una región del ADNc

50 de tal manera que, cuando la sonda FRET se hibrida con el ADNc, la fluorescencia del colorante se inactiva y cuando la sonda se digiere durante la amplificación del ADNc, se libera el colorante desde la sonda y produce una señal de fluorescencia. En tales realizaciones, la cantidad de ARN diana en la muestra es proporcional a la cantidad de fluorescencia medida durante la amplificación del ADNc.

55 La sonda TaqMan® comprende típicamente una región de nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es complementaria de una región de un ARN diana o su ADNc complementario que se producir por transcripción inversa a partir del molde de ARN diana (es decir, la secuencia de la región de la sonda es complementaria de o está presente de forma idéntica en el ARN diana que se va a detectar), de forma tal que la sonda puede hibridar específicamente con el amplicón resultante de la PCR. En algunas realizaciones, la sonda comprende una región de

60 al menos 6 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es totalmente complementaria o está presente de forma idéntica en una región de un ADNc que se ha producido por transcripción inversa a partir de un molde de ARN diana, tal como que comprende una región de al menos 8 nucleótidos contiguos, al menos 10 nucleótidos contiguos, al menos 12 nucleótidos contiguos, al menos 14 nucleótidos contiguos o al menos 16 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es complementaria de o está presente de forma idéntica en una región de un ADNc

65 producido por transcripción inversa a partir de un ARN diana que se va a detectar.

En algunas realizaciones, la región del ADNc que tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de la sonda TaqMan® está en o cerca del centro de la molécula de ADNc. En algunas realizaciones, existen de forma independiente al menos 2 nucleótidos, tal como al menos 3 nucleótidos, tales como al menos 4 nucleótidos, tal como al menos 5 nucleótidos del ADNc en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región de complementariedad.

5 En algunas realizaciones, se pueden usar balizas moleculares para detectar y cuantificar los productos de PCR. Como las sondas TaqMan®, las balizas moleculares utilizan FRET para detectar y cuantificar un producto de PCR a través de una sonda que tiene un colorante fluorescente y un inactivador unido en los extremos de la sonda. A diferencia de las sondas TaqMan®, las balizas moleculares permanecen intactas durante los ciclos de PCR. Las sondas de balizas moleculares forman una estructura tallo-bucle cuando están libre en solución, permitiendo de este modo que el colorante y el inactivador estén en estrecha proximidad suficiente para causar la inactivación de la fluorescencia. Cuando la baliza molecular hibrida con una diana, la estructura de tallo-bucle se suprime de manera que el colorante y el inactivador se separan en el espacio y el colorante brilla. Las balizas moleculares están disponibles, por ejemplo, de Gene Link™ (véase http://www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp).

15 En algunas realizaciones, las sondas Scorpion se pueden utilizar tanto como cebadores específicos de la secuencia como para la detección y cuantificación del producto de la PCR. Como las balizas moleculares, las sondas Scorpion forman una estructura tallo-bucle cuando no ha hibridado con un ácido nucleico diana. Sin embargo, a diferencia de las balizas moleculares, una sonda Scorpion consigue tanto cebado específico de secuencia como la detección de productos de la PCR. Una molécula de colorante fluorescente está unida al extremo 5' de la sonda Scorpion y un inactivador está unido al extremo 3'. La parte 3' de la sonda es complementaria del producto de extensión del cebador de PCR, y esta parte complementaria está ligada al extremo 5' de la sonda por un resto no amplificable. Después de que la sonda Scorpion se ha extendido, la secuencia específica de la diana de la sonda se une a su complementaria dentro del amplicón extendido, de modo que se abre la estructura de tallo-bucle y permite que el

25 colorante en el extremo 5' brille y genere una señal. Las sondas están disponibles en, por ejemplo, Premier Biosoft International (véase http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html).

En algunas realizaciones, los marcadores que se pueden utilizar en las sondas FRET incluyen colorantes colorimétricos y fluorescentes, tales como colorantes Alexa Fluor, colorantes BODIPY, tales como BODIPY FL; azul cascada; amarillo Cascade; cumarina y sus derivados, tales como 7-amino-4-metil-cumarina, aminocumarina e hidroxicumarina; colorantes de cianina, tales como Cy3 y Cy5; eosinas y eritrosinas; fluoresceína y sus derivados, tales como isotiocianato de fluoresceína; quelatos macrocíclicos de iones lantánidos, tales como colorante Quantum™; azul Marina; verde Oregón; colorantes de rodamina, tales como rojo rodamina, tetrametilrodamina y rodamina 6G; rojo Texas; colorantes fluorescentes de transferencia de energía, tales como naranja de tiazol

35 heterodímero de etidio; y TOTAB.

Entre los ejemplos específicos de colorantes se incluyen, pero no se limitan a los mismos, los identificados anteriormente y los siguientes: Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700 y Alexa Fluor 750; colorantes BODIPY reactivos de amina, tales como BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/655, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, y BODIPY–TR; Cy3, Cy5, 6–FAM, isotiocianato de fluoresceína, HEX, 6–JOE, verde Oregón 488, verde Oregón 500, verde Oregón 514, azul Pacific, REG, verde rodamina, rojo rodamina, renografina, ROX, SYPRO,

45 TAMRA, 2',4',5',7'–tetrabromosulfonefluoresceína y TET.

Entre los ejemplos de pares de colorantes/inactivadores (es decir, pares de donantes/aceptores) se incluyen los colorantes, pero no se limitan a estos, fluoresceína/tetrametilrodamina; IAEDA S/fluoresceína; EDANS/DABCYL; fluoresceína/fluoresceína; BODIPY FL/BODIPY FL; fluoresceína/QSY 7 o QSY 9. Cuando el donante y aceptor son los mismos, FRET puede detectarse, en algunas realizaciones, mediante la despolarización de la fluorescencia. Ciertos ejemplos específicos de pares de colorantes/inactivadores (es decir, pares de pares donantes/aceptores) incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor 350/Alexa Fluor488; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 555; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor

55 555/Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 594/Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 350/QSY35; Alexa Fluor 350/dabcyl; Alexa Fluor 488/QSY 35; Alexa Fluor 488/dabcyl; Alexa Fluor 488/QSY 7 o QSY 9; Alexa Fluor 555/QSY 7 o QSY9; Alexa Fluor 568/QSY 7 o QSY 9; Alexa Fluor 568/QSY 21; Alexa Fluor 594/QSY 21; y Alexa Fluor 647/QSY 21. En algunos casos, el mismo inactivador puede usarse para múltiples colorantes, por ejemplo, un inactivador de amplio espectro, tal como un inactivador Iowa Black® (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)) p un inactivador Black Hole Quencher™ (BHQ™; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO).

En algunas realizaciones, por ejemplo, en una reacción multiplex en la que se detectan dos o más restos (tales como amplicones) de forma simultánea, cada sonda comprende un colorante detectable diferente de tal manera que los colorantes se pueden distinguir cuando se detectan de manera simultánea en la misma reacción. Un experto en

65 la materia puede seleccionar un conjunto de colorantes diferentes de forma detectable para su uso en una reacción multiplex.

Los ejemplos específicos de ribonucleótidos marcados con fluorescencia útiles en la preparación de sondas de RT-PCR para su uso en algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento están disponibles en Molecular Probes (Invitrogen) e incluyen Alexa Fluor 488–5–UTP, fluoresceína–12–UTP, BODIPY FL–14–UTP,

5 BODIPY TMR–14–UTP, tetrametilrodamina–6–UTP, Alexa Fluor 546–14–UTP, rojo Texas–5–UTP y BODIPY TR– 14–UTP. Otros ribonucleótidos fluorescentes están disponibles en Amersham Biosciences (GE Healthcare), tales como Cy3–UTP y Cy5–UTP.

Entre los ejemplos de desoxirribonucleótidos marcados con fluorescencia útiles en la preparación de sondas de RT-PCR para su uso en los métodos descritos en el presente documento se incluyen dinitrofenilo (DNP)–1'–dUTP, azul Cascade–7–dUTP, Alexa Fluor 488–5–dUTP, fluoresceína–12–dUTP, verde Oregón 488–5–dUTP, BODIPY FL–14– dUTP, verde rodamina–5–dUTP, Alexa Fluor 532–5–dUTP, BODIPY TMR–14–dUTP, tetrametilrodamina–6–dUTP, Alexa Fluor 546–14–dUTP, Alexa Fluor 568–5–dUTP, rojo Texas –12–dUTP, rojo Texas–5–dUTP, BODIPY TR–14– dUTP, Alexa Fluor 594–5–dUTP, BODIPY 630/650–14–dUTP, BODIPY 650/665–14–dUTP; Alexa Fluor 488–7–

15 OBEA–dCTP, Alexa Fluor 546–16–OBEA–dCTP, Alexa Fluor 594–7–OBEA–dCTP, Alexa Fluor 647–12–OBEA– dCTP. Los nucleótidos marcados con fluorescencia están disponibles comercialmente y se pueden adquirir en, por ejemplo, Invitrogen.

En algunas realizaciones, se introducen colorantes y otros restos, tales como desactivadores, en el polinucleótido usado en los métodos descritos en el presente documento, tales como sondas FRET, mediante nucleótidos modificados. Un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que se ha modificado químicamente, pero todavía funciona como un nucleótido. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado tiene un resto químico, tal como un colorante o inactivador, unido covalentemente, y se puede introducir en un polinucleótido, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida del polinucleótido. En otras realizaciones, el nucleótido modificado incluye uno o más grupos 25 reactivos que pueden reaccionar con un colorante o inactivador antes, durante o después de la incorporación del nucleótido modificado en el ácido nucleico. En realizaciones específicas, el nucleótido modificado es un nucleótido modificado con amina, es decir, un nucleótido que se ha modificado para que tenga un grupo amina reactivo. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado comprende un resto de base modificada, tales como uridina, adenosina, guanosina y/o citosina. En realizaciones específicas, el nucleótido modificado con amina se selecciona de entre 5-(3-aminoalil)-UTP; 8-[(4-amino)butil]-amino-ATP y 8-[(6-amino)butil]-amino-ATP; N6-(4-amino)butil-ATP, N6-(6-amino)butil-ATP, N4-[2,2-oxi-bis-(etilamina)]-CTP; N6-(6-amino)hexil-ATP; 8-[(6-amino)hexil]amino-ATP; 5propargilamino-CTP, 5-propargilamino-UTP. En algunas realizaciones, los nucleótidos con diferentes restos de bases nucleotídicas se modifican de manera similar, por ejemplo, 5-(3-aminoalil)-GTP en lugar de 5-(3-aminoalil)-UTP. Muchos nucleótidos modificados con amina están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Applied

35 Biosystems, Sigma, Jena Bioscience y TriLink.

Entre los ejemplos de restos detectables se incluyen, pero no se limitan a, los miembros de pares de unión. En algunas de tales realizaciones, un primer miembro de un par de unión está unido a un polinucleótido. El segundo miembro del par de unión está unido a un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente. Cuando se incuba el polinucleótido unido al primer miembro del par de unión con el segundo miembro del par de unión unido al marcador detectable, el primer y segundo miembros del par de unión se asocian y se puede detectar el polinucleótido. Entre los pares de unión de ejemplo se incluyen, pero no se limitan a, biotina y estreptavidina, anticuerpos y antígenos, etc.

45 En algunas realizaciones, se detectan múltiples ARN diana en una sola reacción multiplex. En algunas de tales realizaciones, cada sonda que está dirigida a un ADNc único se puede distinguir espectralmente cuando se libera de la sonda. Por lo tanto, cada ARN diana se detecta mediante una señal de fluorescencia única.

Un experto en la materia puede seleccionar un método de detección adecuado para un ensayo seleccionado, por ejemplo, un ensayo de RT-PCR en tiempo real. El método de detección seleccionado no tiene por qué ser un método descrito anteriormente y puede ser cualquier método.

4.3. Composiciones y kits de ejemplo

55 En otro aspecto, se proporcionan composiciones. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

Se divulgan composiciones que comprenden al menos un cebador específico del ARN diana. La expresión "cebador específico del ARN diana" abarca cebadores que tienen una región de nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que está (i) presente de forma idéntica en un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, o (ii) complementaria de la secuencia de una región de nucleótidos contiguos que se encuentran en un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. Se divulga una composición que comprende al menos un par de cebadores específicos del ARN diana. La expresión "par de cebadores específicos del ARN diana" abarca pares de cebadores que son adecuados para la amplificación de una región definida de un ARN diana, tal 65 como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. Un par de cebadores específicos del ARN diana comprende típicamente un primer cebador que comprende una secuencia que es idéntica a la secuencia de una región de un

ARN diana (aunque el cebador comprenderá típicamente ADN o nucleósidos modificados en lugar de ARN) y un segundo cebador que comprende una secuencia que es complementaria de una región de un ARN diana. Típicamente, un par de cebadores es adecuado para amplificar una región de un ARNm diana que tiene de 50 a

1.500 nucleótidos de longitud, de 50 a 1.000 nucleótidos de longitud, de 50 a 750 nucleótidos de longitud, de 50 a

5 500 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 50 a 300 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud, de 50 a 150 nucleótidos de longitud o 50 a 100 nucleótidos de longitud. En las Tablas 1 y 6 se muestran ejemplos no limitantes de cebadores y pares de cebadores.

En algunas realizaciones, una composición comprende cuatro pares de cebadores específicos del ARN diana, un par para amplificar cada uno de los ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXAIO. En algunas realizaciones, una composición comprende adicionalmente un par de cebadores específicos del ARN diana para la amplificación de un ARN de control endógeno y/o un par de cebadores específicos del ARN diana para la amplificación de un ARN de control exógeno.

15 En algunas realizaciones, una composición comprende al menos una sonda específica del ARN diana. La expresión "sonda específica del ARN diana" abarca cebadores que tienen una región de nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que está (i) presente de forma idéntica en un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10, o (ii) complementaria de la secuencia de una región de nucleótidos contiguos que se encuentran en un ARN diana, tal como ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. Ejemplos no limitantes de sondas específicas de la diana se muestran en las tablas 1 y 6.

En algunas realizaciones, una composición (que incluye una composición descrita anteriormente que comprende cuatro o más pares de cebadores específicos del ARN diana) comprende cuatro sondas, una sonda para detectar cada uno de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXAIO. En algunas realizaciones, una composición comprende,

25 además, una sonda para la detección de un ARN de control endógeno y/o una sonda para la detección de un ARN de control exógeno.

En algunas realizaciones, una composición es una composición acuosa. En algunas realizaciones, la composición acuosa comprende un componente tampón, tales como fosfato, tris, HEPES, etc., y/o componentes adicionales, como se trata a continuación. En algunas realizaciones, una composición está seca, por ejemplo, liofilizada, y adecuada para la reconstitución mediante la adición de fluido. Una composición seca puede incluir uno o más componentes de tampón y/o componentes adicionales.

En algunas realizaciones, una composición comprende además uno o más componentes adicionales. Los

35 componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, sales, tales como NaCl, KCl, y MgCl2; polimerasas, incluyendo polimerasas termoestables tales como Taq; dNTP; transcriptasas inversas, tales como la transcriptasa inversa del MMLV; inhibidores de la ENASA; seroalbúmina bovina (BSA) y similares; agentes reductores, tales como β-mercaptoetanol; EDTA y similares; etc. Un experto en la materia puede seleccionar los componentes adecuados de la composición dependiendo del uso previsto de la composición.

En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden al menos un polinucleótido para la detección de al menos un ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido se utiliza como cebador para una reacción de transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, el polinucleótido se utiliza como cebador para la amplificación. En algunas realizaciones, el polinucleótido se utiliza como cebador para la RT-PCR. En algunas

45 realizaciones, el polinucleótido se utiliza como sonda para la detección de al menos un ARN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido está marcado de forma detectable. En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda FRET. En algunas realizaciones, el polinucleótido es una sonda TaqMan ®, una baliza molecular o una sonda Scorpion.

En algunas realizaciones, una composición comprende al menos una sonda FRET que tiene una secuencia que está presente de forma idéntica en, o complementaria de, una región del ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. En algunas realizaciones, una sonda FRET está marcada con un par donante/aceptor de tal manera que cuando la sonda se digiere durante la reacción de PCR, se produce una emisión de fluorescencia única que está asociada con un ARN diana específico. En algunas realizaciones, cuando una composición comprende múltiples sondas FRET,

55 cada sonda está marcada con un par donante/aceptor diferente, de tal manera que cuando la sonda se digiere durante la reacción de PCR, cada una produce una emisión de fluorescencia única que está asociada con una secuencia de la sonda específica y/o el ARN diana. En algunas realizaciones, la secuencia de la sonda FRET es complementaria de una región diana de un ARN diana. En otras realizaciones, la sonda FRET tiene una secuencia que comprende uno o más desapareamientos de bases en comparación con la secuencia de la región diana mejor alineada de un ARN diana.

En algunas realizaciones, una composición comprende una sonda FRET que consiste en al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos, en la que al 65 menos una parte de la secuencia está presente de forma idéntica en, o complementaria a una región de, el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. En algunas realizaciones, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al

menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos de la sonda FRET están presentes de forma idéntica en, o complementaria a una región de, el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10. En algunas realizaciones, la sonda FRET tiene una secuencia con uno, dos o tres desapareamientos de bases en comparación

5 con la secuencia o complementaria de un ARNm pequeño de CRH, IGF2, KRT20 o ANXA10.

En el presente documento se divulga un kit que comprende un polinucleótido tratado anteriormente. Un kit puede comprender al menos un cebador y/o sonda tratados anteriormente. Un kit puede comprender al menos una polimerasa, tal como una polimerasa termoestable. Un kit puede comprender dNTP. Los kits para su uso en los

10 métodos de RT-PCR en tiempo real descritos en el presente documento pueden comprender una o más sondas FRET específicas del ARN diana y/o uno o más cebadores para la transcripción inversa de los ARN diana y/o uno o más cebadores para la amplificación de los ARN diana o ADNc producidos por transcripción inversa de los mismos.

En algunas realizaciones, uno o más de los cebadores y/o sondas es "lineal". Un cebador "lineal" se refiere a un

15 polinucleótido que es una sola molécula monocatenaria y, por lo general, no comprende una región corta de, por ejemplo, al menos 3, 4 o 5 nucleótidos contiguos, que es complementaria de otra región dentro del mismo polinucleótido, de forma que el cebador forma un dúplex interno. En algunas realizaciones, los cebadores para su uso en la transcripción inversa comprenden una región de al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7 o más nucleótidos contiguos en el extremo 3' que tiene una secuencia que es complementaria de

20 la región de al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, tal como al menos 7 o más nucleótidos contiguos en el extremo 5' de un ARN diana.

Un kit puede comprender uno o más pares de cebadores lineales (un "cebador directo" y un "cebador inverso") para la amplificación de un ADNc producido por transcripción inversa a partir de un ARN diana, tal como ARNm de CRH, 25 IGF2, KRT20 o ANXA10. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un primer cebador comprende una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es idéntica a la secuencia de una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al 30 menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos en una primera ubicación en el ARNm. Adicionalmente, en algunas realizaciones, un segundo cebador comprende una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos que tienen una secuencia que es

35 complementaria de la secuencia de una región de al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24 o al menos 25 nucleótidos contiguos en una segunda ubicación en el ARNm, de manera que una reacción de PCR usando los dos cebadores da como resultado un amplicón que se extiende desde la primera ubicación del ARNm a la segunda ubicación del ARNm.

40 El kit puede comprender al menos, al menos tres o al menos cuatro conjuntos de cebadores cada uno de los cuales es para la amplificación de un ADNc producido por transcripción inversa a partir de un ARN diana diferente, incluyendo el ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXA10. El kit puede comprender además al menos un conjunto de cebadores para la amplificación de un ARN de control, tal como un control endógeno y/o un control exógeno.

45 En algunas realizaciones, las sondas y/o cebadores para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria comprenden desoxirribonucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas y/o cebadores para su uso en las composiciones descritas en el presente documento comprenden desoxirribonucleótidos y uno o más análogos de nucleótidos, tales como análogos de LNA u otros análogos de nucleótidos de estabilización de dúplex descritos

50 anteriormente. En algunas realizaciones, las sondas y/o cebadores para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria comprenden todos los análogos de nucleótidos. En algunas realizaciones, las sondas y/o cebadores comprenden uno o más análogos de nucleótidos de estabilización de dúplex, tales como análogos de LNA, en la región de complementariedad.

55 En algunas realizaciones, los kits para su uso en los métodos de RT-PCR en tiempo real descritos en el presente documento comprenden además reactivos para su uso en las reacciones de transcripción inversa y de amplificación. En algunas realizaciones, los kits comprenden enzimas, tales como la transcriptasa inversa, y una ADN polimerasa termoestable, tal como la Taq polimerasa. En algunas realizaciones, los kits comprenden además desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) para su uso en la transcripción inversa y amplificación. En realizaciones

60 adicionales, los kits comprenden tampones optimizados para la hibridación específica de las sondas y los cebadores.

Los siguientes ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.

65 5. EJEMPLOS

5.1 Ejemplo 1: Detección de cáncer de vejiga de grado alto y de grado bajo

Se evaluaron más de 30 marcadores de ARNm y 20 marcadores de microARN en muestras de tejido de la vejiga y de orina para determinar el panel más preciso para la detección de cáncer de vejiga. Según los resultados de más 5 de 200 muestras de orina utilizando ocho marcadores y el sistema GeneXpert (Cepheid, Sunnyvale, CA), se seleccionó un panel que consiste en marcadores de ARNm de CRH, IGF2, KRT20, y ANXA10 (con o sin al menos un control endógeno y/o al menos un control exógeno).

Se diseñaron varias composiciones de reacción para su uso en el sistema de GeneXpert ®, para la detección de varias combinaciones de ARNm de CRH, IGF2, KRT20 y ANXAIO. En la Tabla 1 se muestran las secuencias de los cebadores y las sondas utilizados para detectar cada uno de los ARN diana mediante RT-PCR cuantitativa en las diversas composiciones de reacción.

Tabla 1: Secuencias de los cebadores y las sondas

Nombre del oligo: Diana Secuencia SEQ ID NO Formul. del reactivo ("TSR")

Ceb. dir. 4 ABLa3a4: ABL GATCAACACTGCTTCTGATGGCAA 8 CL3, CL4, CL1

Ceb. inv. I ABLa3a4: ABL CCACCGTTGAATGATGATGAACCAA 9 CL3, CL4, CL1

Sonda 1 ABLa3a4: ABL F4–CCTCCGAGAGCCGCTTCAAC–Q4 10 CL3

Sonda F6 ABL: ABL F6–CCTCCGAGAGCCGCTTCAAC–Q6 11 CL4

Sonda F1 ABL: ABL F1–CCTCCGAGAGCCGC(T–dabsyl)TCAAC– Q1 12 CL1

Dir KRT20: KRT20 TTGAAGAGCTGCGAAGTCAGAT 13 CL3, CL4

Inv KRT20: KRT20 TGAAGTCCTCAGCAGCCAGTT 14 CL3, CL4

Sonda KRT20 (F3): KRT20 F3–TCAACTGCAAAATGCTCGGTGTGTCC– Q3 15 CL3, CL4

Dir_4 de IGF2: IGF2 CGCGGCTTCTACTTCAGCAG 16 CL3, CL4

Inv_ 4 de IGF2: IGF2 GCGGAAACAGCACTCCTCAA 17 CL3, CL4

Sonda_ 2 de IGF2: IGF2 F5–TGTGAGCCGTCGCAGCCGTG–Q5 18 CL3, CL4

Dir de CRH: CRH ACCCGGCTCACCTGCGAA 19 CL3, CL4, CL1

Inv de CRH: CRH GGACTCCCGCGGACACAA 20 CL3, CL4, CL1

Sonda 3 de CRH: CRH F2–TCCTGGGAAGCGAGTGCCCCTAA–Q2 21 CL3, CL1

Sonda_F1 de CRH: CRH F1–CCTGGGAAGCGAG(T– Dabsyl)GCCCCTAA–Q1 22 CL4

Directo de Armored RNA®: control exógeno GGCTATTCTCCTCTTGGCAGAT 23 CL1

Inverso de Armored RNA®: control exógeno TGCTTGAGCTCCAGTCCCTAAG 24 CL1

Sonda de Armored RNA: control exógeno F6–AGCCGAGAAGGCGGAGTCTGGC–Q6 25 CL1

ANXA10–DIR: ANXA10 GTGAAACAAGTTTATGCAATCGATCAA 26 CL1

ANXA10–INV3: ANXA10 GATTGAAATTGGGAGCTGGGAA 27 CL1

ANXA10–F3: ANXA10 F3– TCATCCCTGAGGTTAACAATTACCATCAA– Q3 28 CL1

De F1 a F6 son colorantes diferentes de forma detectable que pueden detectarse y distinguirse simultáneamente en

una reacción multiplex y de Q1 a Q6 son inactivadores (en el presente ejemplo, Q2, Q4, Q5 y Q6 son el mismo inactivador).

Las composiciones finales del cebador y la sonda de tres composiciones de reacción diferentes se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Cebadores y sondas en TSR CL3, CL4 y CL1

TSR CL3

Objetivo: Marcador Objetivo Conc. final del cebador directo Conc. final del Cebador inverso Conc. final de la sonda

ABL: F4 Normalización (control endógeno) 400 nM 400 nM 150 nM

KRT20: F3 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 75 nM

IGF2: F5 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 200 nM

CRH: F2 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 200 nM

TSR CL4

Diana: Marcador Objetivo Conc. final del cebador directo Conc. final del cebador inverso Conc. final de la sonda

ABL: F6 Normalización (control endógeno) 400 nM 400 nM 400 nM

KRT20: F3 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 75 nM

IGF2: F5 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 300 nM

CRH: F1 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 600 nM

TSR CL1

ABL: F1 Normalización (control endógeno) 400 nM 400 nM 600 nM

Armored RNA®: F6 Control exógeno 400 nM 400 nM 400 nM

ANXA10: F3 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 75 nM

CRH: F2 Marcador de cáncer de vejiga 400 nM 400 nM 300 nM

Cada reacción contenía KCl 50-90 mM, MgCl2 3-5 mM, dNTP 400-825 µΜ, Tris 20 mM, pH 8,5, azida sódica al 0,01 % y 0,9 unidades/µl de inhibidor de la ARNasa. Se utilizaron la transcriptasa inversa del MMLV (0,375 unidades/µl) y AptaTaq (0,25 unidades/µl; Roche) para la transcripción inversa y la amplificación, respectivamente. TSR CL1 incluyó un control exógeno Armored RNA® (SEQ ID NO: 47; Asuragen, Austin, TX).

Para cada muestra que se va a analizar, se añadieron 5 ml de orina miccionada a 5 ml de conservante (guanidina HCl 3,5 M, 1 % de N-acetil-L-cisteína, citrato de sodio 25 mM y 2,5 % de Tween-20, pH 3,2), preferiblemente en un plazo de 1 hora desde la obtención de la muestra. Las muestras conservadas se transportaron en hielo y se

55 almacenaron a 4 ºC. El centro de obtención proporcionó la información clínica para cada muestra. El número de glóbulos rojos por mililitro se determinó mediante evaluación microscópica.

Antes de su uso, se invirtió la orina conservada tres veces para mezclar. Se cargaron 1,2 ml de orina conservada en un cartucho GeneXpert para su análisis. El cartucho contenía un filtro de 0,8 µm para capturar las células uroteliales. Las células capturadas se lavaron y se lisaron mediante sonicación (2-15 segundos, 8-16 µm a 36 kHz) dentro del cartucho. A continuación se utilizó el lisado para reconstituir los reactivos utilizados para la RT-PCR en tiempo (descrito anteriormente). El ciclo de reacción utilizado fue: 10 minutos a 45 ºC, seguido de 2 minutos a 95 ºC, y, después, 45 ciclos de (a) de 5 segundos a 95 ºC, 20 segundos a 60 ºC y 20 segundos a 72 ºC, utilizando un cartucho GeneXpert ® en un sistema GeneXpert ®. Se calculó el Delta Ct (∆Ct) como la Ct (ABL) – Ct (marcador). El 65 valor de corte de ∆Ct se fijó como el ∆Ct que dio una especificidad mínima del 95 % con muestras de pacientes que no se espera que tengan cáncer de vejiga (datos no mostrados). Un ∆Ct por encima del valor de corte ∆Ct para uno

cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga.

Algunas muestras también se analizaron usando UroVysion® (Abbott Laboratorios, Abbott Park, IL). Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 3 (cáncer de vejiga de grado alto) y en la Tabla 4 (cáncer de vejiga de 5 grado bajo). Los valores de ∆Ct por encima del umbral, indicativos de un resultado positivo, se resaltan. Cada uno de los tres lotes de TSR, CL3, CL4 y CL1, detectaron el 100 % de las muestras de cáncer de vejiga de grado alto, al igual que UroVysion®.

Para el cáncer de vejiga de grado bajo, la tasa de detección fue del 37 % (7/19), en comparación con solo el 16 % 10 (3/19) para UroVysion®.

En la tabla 5 se muestra un resumen de la sensibilidad para el cáncer de de vejiga de grado alto y el cáncer de vejiga de grado bajo, y la especificidad en pacientes con un riesgo bajo de cáncer de vejiga para cada uno de los marcadores individuales analizados en las tablas 3 y 4.

Tabla 5: Resumen de la sensibilidad y especificidad de los marcadores individuales

Marcador: Sensibilidad, cáncer de vejiga de grado alto Sensibilidad, cáncer de vejiga de grado bajo Especificidad, cáncer de vejiga de bajo riesgo

CRH: 15/30 (50 %) 9/53 (17 %) 220/221 (99 %)

KRT20: 11/21 (52 %) 6/34 (18 %) 144/145 (99 %)

IGF2: 13/21 (62 %) 8/34 (24 %) 144/145 (99 %)

ANXA10: 5/9 (56 %) 2/19(11 %) 74/76 (97 %)

Combinación de 4 marcadores: 12/12 (100 %) 7/19 (37 %) 83/88 (94 %)

20

En la Tabla 6 se muestran ejemplos de cebadores y sondas alternativos para la detección de los cuatro marcadores,

KRT20, IGF2, CRH, y ANXAIO. En la Tabla 6 también muestra un conjunto de cebadores y sondas de ejemplo para

la detección de un control exógeno y un control endógeno, ABL. Los colorantes e inactivadores que se muestran en

la Tabla 6 son genéricos y dos o más de inactivadores Q1 a Q6 pueden ser el mismo. Un experto en la materia

25: podría seleccionar un conjunto adecuado, por ejemplo un conjunto de colorantes diferentes de forma detectable para

su uso en un ensayo multiplex. También se muestra la longitud del amplicón previsto para cada conjunto de

cebadores, así como la longitud de cualquier intrón o intrones intermedios entre los sitios de los cebadores en la

copia genómica de la diana.

30: Tabla 6: Secuencias de los cebadores y las sondas

35

40

45

50

55

Nombre: 5' mod Secuencia 3' mod SEQ ID NO Longitud del amplicón (pb) Longitud del intrón (pb)

KRT20 Dir_3: CGACTACAGTGCATATTACAGACAA 29 113 2142

KRT20 Inv_2: CAGCAGCCAGTTTAGCATTATCAA 30

Sonda KRT20: F1 TCAACTGCAAAA(T–dabsyl) GCTCGGTGTGTCC Q1 31

Dir_5 de IGF2: GGACCGCGGCTTCTACTTCA 32 95 1701

Inv_ 5 de IGF2: CCAGGTCACAGCTGCGGAA 33

Sonda_ 2_F4 de IGF2: F4 TGTGAGCCGTCGCAGCCGTG Q4 34

CRH_Dir 4: TGCGAAGCGCCTGGGAAGC 35 66 801

CRH Rev: GGACTCCCGCGGACACAA 36

CRH_sonda_F2: F2 TGCCCCTAACATGCGGCTGCC Q2 37

ANXA10_Dir_3: TCAGCGCTGCAATGCACAA 38 122 22.947

ANXA10_Dir_4: CTGCAATGCACAAAGGATGA 48 117 22.947

ANXA10_Inv_5: GGCCAGCCATCACATCTTTGAA 39

ANXA10_Sonda_3: F3 TAGAGCATGTATGGCCGGGACCT Q3 40

Ceb. dir. 4 ABLa3a4: GATCAACACTGCTTCTGATGGCAA 41 92 7666

Ceb. Inv. 1 de ABLa3a4: CCACCGTTGAATGATGATGAACCAA 42

Sonda F5 de ABL: F5 CCTCCGAGAGCCGCTTCAAC Q5 43

Directo de Armored RNA®: GGCTATTCTCCTCTTGGCAGAT 44 101 NA

Inverso de Armored RNA®: TGCTTGAGCTCCAGTCCCTAAG 45

Sonda de Armored RNA®: F6 AGCCGAGAAGGCGGAGTCTGGC Q6 46

5.2 Ejemplo 2: Sensibilidad del ensayo para la detección de cáncer de vejiga mediante el uso del panel de marcadores KRT20, IGF-2, CRH y ANXA10 en una cohorte más amplia

Se obtuvieron muestras de orina de los sujetos en siete centros diferentes. Los criterios de elegibilidad para la inclusión en el estudio fueron:

• 18 años o más;

55 • consentimiento informado documentado como lo exige la revisión del IRB o el HREC y una declaración de derechos de los sujetos de experimentación firmada para pacientes en California;

• al menos uno de los siguientes criterios:

∘: antecedentes o recurrencia de cáncer de vejiga;

∘: remisión a evaluación por cistoscopia debido a microhematuria o macrohematuria en la orina;

∘: remisión a evaluación urológica, pero sin antecedentes de cáncer de vejiga o pruebas clínicas de cáncer de vejiga;

• consentimiento para proporcionar al menos 15 ml de orina miccionada, además de la requerida para los cuidados 65 de referencia;

• consentimiento para permitir la revelación de los resultados de patología para cualquier espécimen de biopsia tomada durante el procedimiento de cistoscopia y otros registros médicos.

Los criterios de exclusión incluían sólo menores de 18 años de edad y la primera orina miccionada. Los pacientes

5 tratados actualmente o previamente con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y los pacientes tratados actualmente o previamente con terapia intravesical o resección transuretral de la vejiga o radioterapia para el cáncer de vejiga fueron elegibles para el estudio. Además, también se permitió repetir el reclutamiento durante el curso del estudio.

Dos de los centros de recolección proporcionaron los resultados del análisis UroVysion® en las muestras de orina.

10 Para cada muestra que se va a analizar, se añadieron 15 ml de orina miccionada a hasta 15 ml de conservante (guanidina HCl 3,5 M, 1 % de N-acetil-L-cisteína, citrato de sodio 25 mM y 2,5 % de Tween-20, pH 3,2), preferiblemente en un plazo de 1 hora desde la obtención de la muestra. Las muestras conservadas se transportaron en hielo y se almacenaron a 4 ºC. El centro de obtención proporcionó la información clínica para cada muestra.

15 Antes de su uso, se invirtió la orina conservada tres veces para mezclar. Se cargaron 4 ml de orina conservada en un cartucho GeneXpert para su análisis. El cartucho contenía un filtro de 0,8 µm para capturar las células uroteliales. Las células capturadas se lavaron y se lisaron mediante sonicación (2-15 segundos, 8-16 µm a 36 kHz) dentro del cartucho. A continuación se utilizó el lisado para reconstituir los reactivos utilizados para la RT-PCR en tiempo

20 (descrito anteriormente). El ciclo de reacción utilizado fue: 10 minutos a 45 ºC, seguido de 2 minutos a 95 ºC, y, después, 45 ciclos de (a) de 5 segundos a 95 ºC, 20 segundos a 60 ºC y 20 segundos a 72 ºC, utilizando un cartucho GeneXpert ® en un sistema GeneXpert ®. Para ANXA10, KRT20 y IGF2, Se calculó el Delta Ct (∆Ct) como la Ct (ABL) – Ct (marcador). El valor de corte de ∆Ct se fijó como el ∆Ct que dio una especificidad alta (> 90 %) con muestras de pacientes que no se espera que tengan cáncer de vejiga (datos no mostrados). Un ∆Ct por encima del

25 valor de corte ∆Ct para uno cualquiera de los marcadores se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga. Para CRH, se utilizaron los valores de Ct en lugar de ∆Ct para determinar la positividad para el marcador de CRH. Un valor de Ct <45 para CRH se consideró un resultado positivo, indicativo de la presencia de cáncer de vejiga. Además de los cuatro marcadores de cáncer de vejiga (KRT20, IGF2, CRH y ANXA10), el ensayo GeneXpert® para cáncer de vejiga incluyó dos controles: cebadores y la sonda para la

30 detección del ARNm de ABL en las muestras, y los cebadores y la sonda para la detección de un ARN de control exógeno Armored RNA®.

En el primer análisis, se analizaron 132 muestras obtenidas de pacientes con resultados positivos en la cistoscopia para el cáncer de vejiga con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert®. Sesenta de esas muestras también se

35 habían analizado usando UroVysion®. En la Tabla 7 se muestran los resultados para dichas 132 muestras.

Tabla 7: Sensibilidad del ensayo por estadio y grado del cáncer de vejiga

Vejiga Xpert: UroVysion

POS: NEG Inválido/ Error** Sensibilidad POS NEG No concluyente Sensibilidad

Estadio:

Todos: 94 35 3 72,9 % 29 26 5 52,7 %

Ta, grado bajo: 29 23 2 55,8 % 5 18 4 21,7 %

Ta, grado alto: 20 2 90,9 % 4 6 1 40,0 %

T1: 13 2 86,7 % 6 1 85,7 %

T2: 11 2 84,6 % 4 0 100,0 %

T3: 3 0 100,0 % 1 0 100,0 %

T4: 2 0 100,0 %

CIS: 11 1 91,7 % 7 0 100,0 %

DES: 5 5 1 50,0 % 2 1 66,7 %

Grado:

Todos: 94 35 3 72,9 % 29 26 5 52,7 %

Grado bajo: 33 28 2 54,1 % 6 19 4 24,0 %

Grado alto: 61 7 1 89,7 % 23 7 1 76,7 %

**Dos resultados no válidos se debieron a la Ct baja de ABL, lo que sugiere un número bajo de células de la muestra y uno de los resultados no válidos se debió a la mala calidad de la muestra.

Como se muestra en la Tabla 7, para estas muestras, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una sensibilidad del 54,1 % para el cáncer de vejiga de grado bajo y una sensibilidad del 89,7 % para el cáncer de vejiga de grado alto. Por el contrario, UroVysion® tuvo una sensibilidad de tan solo un 24 % para el cáncer de vejiga de

5 grado bajo y una sensibilidad del 76,6 % para el cáncer de vejiga de grado alto. Además, el ensayo de cáncer de vejiga la GeneXpert ® pudo detectar todos los grados y estadios del cáncer de vejiga.

A continuación, el mismo conjunto de datos se dividió en función de tres grupos de pacientes: (A) pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga que en la actualidad estaban siendo controlados para detectar recurrencia del 10 cáncer de vejiga, (B) pacientes que habían sido tratados con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) en los tres meses anteriores a la obtención de las muestras y (C) pacientes que presentaban síntomas de cáncer de vejiga y que no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Los resultados para dichos grupos de pacientes se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Sensibilidad del ensayo por población de pacientes

Control (población A)

Vejiga Xpert*: UroVysion

Grado:

Todos: 50 20 1 71,4 % 11 12 47,8 %

Grado bajo: 21 18 53,8 % 2 11 1 15,4 %

Grado alto: 29 2 1 93,5 % 9 1 90,0 %

Tratado con BCG en los últimos 3 meses (población B)

Vejiga Xpert*: UroVysion

Grado:

Todos: 4 2 66,7 % 1 100,0 %

Grado bajo

Grado alto: 4 2 66,7 % 1 100,0 %

Sintomáticos (población C)

Vejiga Xpert*: UroVysion

Grado:

Todos: 40 13 2 75,5 % 17 14 4 54,8 %

Grado bajo: 12 10 2 54,5 % 4 8 3 33,3 %

Grado alto: 28 3 90,3 % 13 6 1 68,4 %

60 Como se muestra en la Tabla 8, el ensayo para cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una sensibilidad similar para el cáncer de vejiga de grado bajo y de grado alto en pacientes que están siendo controlados para detectar cáncer de vejiga y en pacientes con síntomas de cáncer de vejiga como en el grupo de pacientes como un todo (véase la Tabla 7). En los pacientes tratados con BCG en los últimos tres meses, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert ® tenía una sensibilidad del 66,7 %, aunque el tamaño de la muestra era demasiado pequeño (6 muestras) para extraer

65 conclusiones a partir de dicho resultado.

Con el fin de tener una comparación directa ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® y UroVysion®, se seleccionó un conjunto de datos que incluía solo las muestras que se habían analizado en ambos ensayos. En la Tabla 9 se muestran los resultados para ese conjunto de datos, con los pacientes separados en dos grupos: (A y B) pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga que en la actualidad estaban siendo controlados para detectar recurrencia del

5 cáncer de vejiga combinados con pacientes tratados con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) en los tres meses anteriores a la obtención de las muestras (estos grupos se combinaron porque solo se había analizado con los dos ensayos una muestra de un paciente tratado con BCG) y (C) pacientes que presentaban síntomas de cáncer de vejiga y que no tenían antecedentes de cáncer de vejiga.

10 Tabla 9: Sensibilidad del ensayo para muestras analizadas con GeneXpert® y UroVysion®

Control y tratados con BCG (poblaciones A y B)

Vejiga Xpert: UroVysion

Grado:

Todos: 18 7 1 72,0 % 12 13 1 48,0 %

Grado bajo: 6 7 1 46,2 % 2 12 14,3 %

Grado alto: 12 0 100,0 % 10 1 1 90,9 %

Sintomáticos (población C)

Vejiga Xpert: UroVysion

Grado:

Todos: 26 8 1 76,5 % 17 14 4 54,8 %

Grado bajo: 7 7 1 50,0 % 4 8 3 33,3 %

Grado alto: 19 1 95,0 % 13 6 1 68,4 %

40 45: Como se muestra en la Figura 9, para las muestras que se han analizado tanto con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® como con UroVysion®, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® demostró una mayor sensibilidad que UroVysion ® para la detección de cáncer de grado bajo y de grado alto en ambos grupos de pacientes. A continuación, el conjunto de datos se dividió en muestras que se habían archivado, lo que significa que se analizaron más de una semana después de la obtención (las muestras variaron de 8 días de edad hasta nueve meses de edad) y las muestras que eran frescas, lo que significa que se analizaron una semana después de la obtención. Los resultados de dicho análisis se muestran en la tabla 10.

50

55

Tabla 10: sensibilidad del ensayo en muestras archivadas y recién preparadas

35 Como se muestra en la Tabla 10, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una sensibilidad similar para la detección de vejiga de grado bajo y de grado alto en muestras recién preparadas y archivadas.

Muestras archivadas

Vejiga Xpert

n: POS NEG Inválido/ Error** Sensibilidad

Grado:

Todos: 89 61 25 3 70,9 %

Grado bajo: 46 23 21 2 52,3 %

Grado alto: 43 38 4 1 90,5 %

Muestras recién preparadas

Vejiga Xpert

n: POS NEG Inválido/ Error** Sensibilidad

Grado:

Todos: 43 33 10 76,7 %

Grado bajo: 17 10 7 58,8 %

Grado alto: 26 23 3 88,5 %

5.3 Ejemplo 3: Especificidad del ensayo para la detección de cáncer de vejiga mediante el uso del panel de 40 marcadores KRT20, IGF-2, CRH y ANXA10 en una cohorte más amplia

Además de las muestras de pacientes con resultados positivos en la cistoscopia para el cáncer de vejiga, las muestras de orina se recogieron en los siete centros de pacientes con resultados negativos en la cistoscopia para el cáncer de vejiga, pero que se estaban controlado para detectar recurrencia del cáncer de vejiga, habían recibido

45 BCG en los últimos tres meses antes de la obtención de las muestras y que parecían presentar síntomas de cáncer de vejiga, pero no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Además, las muestras de orina se recogieron de pacientes con remisiones a urología por sospecha de otras afecciones, tales como cálculos renales. Finalmente, se obtuvieron muestras de orina de individuos sanos. Las muestras de orina se conservaron y se analizaron usando el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert®, tal como se describe en el Ejemplo 2.

50 Para las muestras de pacientes con resultados negativos en la cistoscopia para el cáncer de vejiga, los resultados de los ensayos se dividieron de acuerdo con los tres grupos de pacientes: (A) pacientes con antecedentes de cáncer de vejiga que en la actualidad estaban siendo controlados para detectar recurrencia del cáncer de vejiga, (B) pacientes que habían sido tratados con el bacilo de Calmette-Guerin (BCG) en los tres meses anteriores a la

55 obtención de las muestras y (C) pacientes que presentaban síntomas de cáncer de vejiga y que no tenían antecedentes de cáncer de vejiga. Los resultados para dichos grupos de pacientes se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11: Especificidad del ensayo en pacientes con cistoscopia negativa por población

Control (población A)

Vejiga Xpert

POS: NEG Inválido/ Error Especificidad

55: 156 17 73,9 %

Tratados con BCG (población B)

Vejiga Xpert

POS: NEG Inválido/ Error Especificidad

1: 6 0 85,7 %

Sintomáticos (población C)

Vejiga Xpert

POS: NEG Inválido/ Error Especificidad

16: 86 10 84,3 %

30 35 40: Como se muestra en la Tabla 11, el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® tenía una especificidad del 73,9 %, 85,7 % y 84,3 % para los grupos de pacientes (A), (B) y (C), respectivamente. A continuación, se determinó la especificidad del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® en pacientes que eran sospechosos de tener otras afecciones urológicas, pero no cáncer de vejiga. Se recolectaron setenta muestras de pacientes en esta categoría. Los resultados con el ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® fueron 14 resultados positivos, 50 negativos y 6 no válidos. Por tanto, la especificidad del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® para esta población de pacientes fue del 78,1 %. Por último, la especificidad del ensayo de cáncer de vejiga GeneXpert® se determinó en individuos sanos. Se recolectaron cincuenta y cinco muestras en esta categoría. Los resultados fueron 4 positivos y 51 negativos, lo que indica una especificidad del 92,7 % para esta categoría de sujetos.

45

50

55

Tabla de determinadas secuencias

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

1: ARNm de la CRH humana

2: Variante 2 del transcrito del ARNm de IGF2 humana

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

3: Variante 1 del transcrito del ARNm de IGF2 humana

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

4: Variante 3 del transcrito del ARNm de IGF2 humana

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

5: ARNm del KRT20 humano

6: ARNm de ANXA10 humana

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

7: ARNm del ABL humano

(continuación)

SEQ ID NO: Descripción Secuencia

47: Secuencia de Armored RNA®

Listado de secuencias

<110> Cepheid 5 <120> MÉTODOS DE DETECCIÓN DE CÁNCER DE VEJIGA

<130> CEPHD–32468/WO–1/ORD

<150> US 61/636.194 10 <151> 2012–04–20

<150> US 61/770.803

<151> 2013–02–28 15 <160> 48

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 1434 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 10 <211> 5156

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 5182

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

55 <210> 4

<211> 4856

<212> ADN

<213> Homo sapiens

60 <400> 4

<210> 5

<211> 1805 35 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 1447 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7 35 <211> 5881

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

a 5881

<210> 8

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 8 gatcaacact gcttctgatg gcaa 24

<210> 9

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 9 ccaccgttga atgatgatga accaa 25

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 10 cctccgagag ccgcttcaac 20

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 11 cctccgagag ccgcttcaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 12 cctccgagag ccgcttcaac 20

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 13 ttgaagagct gcgaagtcag at 22

<210> 14

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 14 tgaagtcctc agcagccagt t 21

<210> 15

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 15 tcaactgcaa aatgctcggt gtgtcc 26

<210> 16

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 16 cgcggcttct acttcagcag 20

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 17 gcggaaacag cactcctcaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 18 tgtgagccgt cgcagccgtg 20

<210> 19

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 19 acccggctca cctgcgaa 18

<210> 20

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 20 ggactcccgc ggacacaa 18

<210> 21

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 21 tcctgggaag cgagtgcccc taa 23

<210> 22

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 22 cctgggaagc gagtgcccct aa 22

<210> 23

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 23 ggctattctc ctcttggcag at 22

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 24 tgcttgagct ccagtcccta ag 22

<210> 25

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 25 agccgagaag gcggagtctg gc 22

<210> 26

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 26 gtgaaacaag tttatgcaat cgatcaa 27

<210> 27

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 27 gattgaaatt gggagctggg aa 22

<210> 28

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 28 tcatccctga ggttaacaat taccatcaa 29

<210> 29

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 29 cgactacagt gcatattaca gacaa 25

<210> 30

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 30 cagcagccag tttagcatta tcaa 24

<210> 31

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 31 tcaactgcaa aatgctcggt gtgtcc 26

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 32 ggaccgcggc ttctacttca 20

<210> 33

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 33 ccaggtcaca gctgcggaa

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 34 tgtgagccgt cgcagccgtg

<210> 35

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 35 tgcgaagcgc ctgggaagc

<210> 36

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 36 ggactcccgc ggacacaa

<210> 37

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 37 tgcccctaac atgcggctgc c

<210> 38

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 38 tcagcgctgc aatgcacaa

<210> 39

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 39

ggccagccat cacatctttg aa 22

<210> 40

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 40 tagagcatgt atggccggga cct 23

<210> 41

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 41 gatcaacact gcttctgatg gcaa 24

<210> 42

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 42 ccaccgttga atgatgatga accaa 25

<210> 43

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 43 cctccgagag ccgcttcaac 20

<210> 44

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 44 ggctattctc ctcttggcag at 22

<210> 45

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 45 tgcttgagct ccagtcccta ag 22

<210> 46

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 46 agccgagaag gcggagtctg gc 22

<210> 47

<211> 500

<212> RNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 47

<210> 48

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintética

<400> 48 ctgcaatgca caaaggatga 20

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un método para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende la detección de los niveles de cada marcador de un conjunto de marcadores de cáncer de vejiga en una muestra del sujeto, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga consiste en ARNm de hormona liberadora de corticotropina (CRH), ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2), ARNm de queratina 20 (KRT20) y ARNm de anexina 10 (ANXA10), en el que el nivel de cada uno de los marcadores se compara con un nivel normal o de control del marcador, en el que un nivel normal o de control se determina como un nivel promedio o intervalo que es característico de las células uroteliales normales o de otros materiales de referencia, y en el que la detección de un nivel elevado de al menos un marcador indica la presencia de cáncer de vejiga en el sujeto.
2.

El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende además detectar un control endógeno y/o un control exógeno.
3.

El método de la reivindicación 2, en el que el control endógeno se selecciona de ABL, GUSB, GAPDH, TUBB y UPK1; y/o en el que el control exógeno es un ARN.
4.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la detección comprende RT-PCR, en la que la RT-PCR es, opcionalmente, RT-PCR cuantitativa.
5.

El método de la reivindicación 4, en el que la reacción de RT-PCR tarda menos de 2 horas desde una etapa de desnaturalización inicial hasta una etapa de extensión final.
6.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el método comprende poner en contacto el ARN de la muestra con un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga consiste en un primer par de cebadores para detectar CRH, un segundo par de cebadores para detectar IGF2, un tercer par de cebadores para detectar KRT20 y un cuarto par de cebadores para detectar ANXA10; en el que cada par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga produce un amplicón que tiene de 50 a 500 nucleótidos de longitud, de 50 a 400 nucleótidos de longitud, de 50 a 300 nucleótidos de longitud, de 50 a 200 nucleótidos de longitud o de 50 a 150 nucleótidos de longitud; en el que cada par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga abarca, opcionalmente, un intrón en la secuencia genómica.
7.

El método de la reivindicación 6, en el que:

(a)

el primer par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(b)

el segundo par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 16 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 17, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 32 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 33, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(c)

el tercer par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 14, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(d)

el cuarto par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que

comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 27, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o

(iii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.
8.

El método de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el método comprende además poner en contacto el ARN de la muestra con: (a) un par de cebadores de control endógeno, en el que el par de cebadores de control endógeno es, opcionalmente, para detectar ABL; y/o (b) un par de cebadores de control exógeno, en el que el par de cebadores de control exógenos es, opcionalmente, para detectar un ARN exógeno.
9.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el método comprende además la formación de un conjunto de amplicones de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de amplicones de marcadores de cáncer de vejiga consiste en un amplicón de CRH, un amplicón de IGF2, un amplicón de KRT20 y un amplicón de ANXA10, y poner en contacto los amplicones de marcadores de cáncer de vejiga con un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga consiste en una primera sonda para detectar el amplicón de CRH, una segunda sonda para detectar el amplicón de IGF2, una tercera sonda para detectar el amplicón de KRT20 y una cuarta sonda para detectar el amplicón de ANXA10.
10.

El método de la reivindicación 9, en el que:

(a)

la primera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 21 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(b)

la segunda sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(c)

la tercera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 15 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(d)

la cuarta sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 28 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y
11.

El método de la reivindicación 10, en el que cada sonda marcadora de cáncer de vejiga comprende un colorante, y en el que cada colorante es diferente de forma detectable de los otros tres colorantes; y en el que cada sonda comprende un colorante fluorescente y una molécula inactivadora.
12.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que el método comprende además formar un amplicón de control endógeno y/o un amplicón de control exógeno y poner en contacto el amplicón de control endógeno con una sonda de control endógena y/o poner en contacto el amplicón de control exógeno con una sonda de control exógena, en el que la sonda de control endógena comprende un colorante que es diferente de forma detectable de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga y la sonda de control exógena comprende un colorante que es diferente de forma detectable de los colorantes de las sondas marcadoras de cáncer de vejiga y la sonda de control endógena.
13.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el conjunto de marcadores de cáncer de vejiga se detecta en una única reacción multiplex.
14.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra comprende células uroteliales y en el que la muestra se selecciona, opcionalmente, de una muestra de orina y una muestra de lavado de la vejiga.
15.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto tiene al menos un síntoma de cáncer de vejiga, en el que al menos un síntoma se selecciona de entre dolor abdominal, sangre en la orina, micción dolorosa, micción frecuente, urgencia urinaria e incontinencia.
16.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto tiene antecedentes de cáncer de vejiga y está siendo controlado para detectar la recurrencia del cáncer de vejiga, y en el que el sujeto se ha tratado, opcionalmente, con el bacilo de Calmette -Guerin (BCG) en los últimos tres meses.
17.

Una composición que comprende un conjunto de pares de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de pares de cebadores de marcadores del cáncer de vejiga consiste en un primer par de cebadores para la detección de CRH, un segundo par de cebadores para la detección de IGF2, un tercer par de cebadores para la detección de KRT20 y un cuarto par de cebadores para la detección de ANXA10.
18.

La composición de la reivindicación 17, en la que:

(a)

el primer par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 19 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 20, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 35 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 36, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(b)

el segundo par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 16 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 17, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 32 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 33, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(c)

el tercer par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 13 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 14, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 29 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 30, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(d)

el cuarto par de cebadores de marcadores de cáncer de vejiga comprende (i) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 26 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 27, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, o menos de 30 nucleótidos de longitud; o (ii) un primer cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 38 y un segundo cebador que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; o

(iii) un primer cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 48 y un segundo cebador que comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 39, en el que cada cebador tiene una longitud de menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos.
19.

La composición de la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en la que la composición comprende

adicionalmente un conjunto de sondas marcadoras de cáncer de vejiga, en el que el conjunto de sondas marcadores de cáncer de vejiga consiste en una primera sonda para detectar un amplicón de CRH, una segunda sonda para detectar un amplicón de IGF2, una tercera sonda para detectar un amplicón de KRT20 y una cuarta sonda para detectar un amplicón de ANXA10, y, opcionalmente, en la que:

(a)

la primera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 21 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 37, en el que la primera sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(b)

la segunda sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en el que la segunda sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(c)

la tercera sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 15 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 31, en el que la tercera sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y

(d)

la cuarta sonda comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17, o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 28 o al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15, al menos 16, al menos 17 o al menos 18 nucleótidos de SEQ ID NO: 40, en el que la cuarta sonda tiene menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35 o menos de 30 nucleótidos de longitud; y