EA029563B1 - Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор - Google Patents

Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор Download PDF

Info

Publication number
EA029563B1
EA029563B1 EA201590290A EA201590290A EA029563B1 EA 029563 B1 EA029563 B1 EA 029563B1 EA 201590290 A EA201590290 A EA 201590290A EA 201590290 A EA201590290 A EA 201590290A EA 029563 B1 EA029563 B1 EA 029563B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
subject
nucleic acid
generation
Prior art date
Application number
EA201590290A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590290A1 (ru
Inventor
Джеймс Дэвид Джозеф
Джеффри Х. Хэджер
Джон Ли Сенсинтаффар
Нхин Лу
Цзин Циань
Николас Д. Смит
Original Assignee
Арагон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арагон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Арагон Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201590290A1 publication Critical patent/EA201590290A1/ru
Publication of EA029563B1 publication Critical patent/EA029563B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4166—1,3-Diazoles having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. phenytoin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Abstract

В настоящем документе описаны модифицированные полипептиды андрогенного рецептора, которые являются резистентными к ингибированию ингибитором андрогенного рецептора. В настоящем документе описаны композиции, комбинации и наборы, содержащие модифицированные полипептиды андрогенного рецептора, а также способы применения модифицированных полипептидов андрогенного рецептора. В настоящем документе также описаны способы применения модифицированных полипептидов андрогенного рецептора в качестве агентов скрининга для выявления и конструирования модуляторов андрогенного рецептора третьего поколения. В настоящем документе также описаны модуляторы андрогенного рецептора третьего поколения, которые ингибируют активность модифицированных полипептидов андрогенного рецептора. Также описаны фармацевтические композиции и лекарственные средства, которые включают описанные в настоящем документе соединения, а также способы применения таких модуляторов андрогенного рецептора самостоятельно или в комбинации с другими соединениями для лечения заболеваний или состояний, включая онкологические заболевания, такие как кастрационно-резистентный рак предстательной железы, которые опосредованы или зависят от андрогенных рецепторов.

Description

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был подан в виде машиночитаемого текстового файла в формате Л§СП через сеть ΕΡδ-АеЬ и настоящим полностью включен в данный документ путем ссылки. Текстовый файл, созданный 16 июля 2013 г., имеет имя 38937-725-601_δΕΟ.ΐχΐ и размер 132 Кб.
Предпосылки создания изобретения
Андрогенный рецептор (АК) представляет собой активируемый лигандом транскрипционный регуляторный белок, который опосредует индукцию различных биологических воздействий за счет взаимодействия с эндогенными андрогенами. Эндогенные андрогены включают стероиды, такие как тестостерон и дигидротестостерон. Тестостерон во многих тканях преобразуется в дигидротестостерон под действием фермента 5-альфа-редуктазы.
Взаимодействия андрогенов с андрогенными рецепторами предполагаются при ряде заболеваний или состояний, таких как андроген-зависимые формы рака, вирилизация у женщин и, помимо прочего, угревая сыпь. Соединения, которые снижают воздействие андрогенной сигнализации через андрогенный рецептор и/или снижают концентрации андрогенных рецепторов, применяют для лечения заболеваний или состояний, в которых играют роль андрогенные рецепторы.
Изложение сущности изобретения
В настоящем документе описано выявление модификаций андрогенного рецептора (АК), которые обуславливают резистентность пациентов к лечению антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой замену фенилаланина в позиции 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид АК является резистентным к ингибированию антагонистом андрогенного рецептора второго поколения, выбранным среди ΛΡ.Ν-509. энзалутамида (М0У3100) и КО 162. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид АК является резистентным к ингибированию антагонистом андрогенного рецептора первого поколения, выбранным среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида или нилутамида. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид АК показывает один или более видов активности рецептора АК дикого типа, включая, без ограничений, связывание с коактиватором, связывание с ДНК, связывание с лигандом или ядерную транслокацию. В некоторых вариантах осуществления антагонист первого или второго поколения показывает пониженную антагонистическую активность в отношении модифицированного полипептида АК в сравнении с полипептидом АК дикого типа.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы определения резистентности или потенциальной резистентности субъекта к терапии антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения, включающие, состоящие из и/или состоящие по существу из: (а) тестирования образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид андрогенного рецептора, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид андрогенного рецептора по аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в δΕΟ ΙΟ N0:1; и (Ь) характеризации субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводили антагонист АК первого или второго поколения для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из прекращения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в δΕΟ ΙΟ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из продолжения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии в образце субъекта модификации в позиции 876 в δΕΟ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из введения антагониста андрогенного рецептора третьего поколения, который ингибирует модифицированный АК при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в δΕΟ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди АК^509, энзалутамида (МОУ3100) и КО162. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора первого поколения выбирают среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида или нилутамида.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы выбора субъекта для терапии антагонистом андрогенного рецептора третьего поколения, включающие, состоящие из
- 1 029563
и/или состоящие по существу из: (а) тестирования образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид андрогенного рецептора, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид андрогенного рецептора по аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО N0: 1; и (Ь) характеризации субъекта как кандидата на терапию антагонистом андрогенного рецептора третьего поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из прекращения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из продолжения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из введения антагониста андрогенного рецептора третьего поколения, который ингибирует модифицированный АЕ при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди ЛК.Я-5()9. энзалутамида (МЭУ3100) и ЕЭ162. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора первого поколения выбирают среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида или нилутамида.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы характеризации андрогенного рецептора субъекта, чтобы определить резистентность такого субъекта к ингибированию антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения, включающие, состоящие из и/или состоящие по существу из: (а) тестирования образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид андрогенного рецептора, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид андрогенного рецептора по аминокислотной позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1; и (Ь) при наличии у субъекта модификации по позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1 - характеризации андрогенного рецептора субъекта как резистентного к ингибированию антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления антагонист первого или второго поколения показывает пониженную антагонистическую активность в отношении модифицированного полипептида АЕ в сравнении с полипептидом АЕ дикого типа. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из прекращения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из продолжения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из введения антагониста андрогенного рецептора третьего поколения, который ингибирует модифицированный АЕ при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди АЕ^509, энзалутамида (М0У3100) и ЕО162. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора первого поколения выбирают среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида или нилутамида.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы контроля развития или потенциального развития резистентности к терапии у субъекта, получающего антагонист андрогенного рецептора первого или второго поколения для лечения рака, включающие: (а) тестирование образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид андрогенного рецептора, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид андрогенного рецептора по аминокислотной позиции 876 в 8Е0 ГО N0:1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из прекращения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из продолжения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из введения антагониста андрогенного рецептора третьего поколения, который ингибирует модифицированный АЕ при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8Е0 ГО N0:1. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди АЕ^509, энзалутамида (М0У3100) и ЕО162. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора первого поколения выбирают среди бикалутамида, флута- 2 029563
мида, гидроксифлутамида или нилутамида.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы оптимизации терапии субъекта, получающего антагонист андрогенного рецептора первого или второго поколения для лечения рака, включающие, состоящие из и/или состоящие по существу из: (а) тестирования образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид андрогенного рецептора, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид андрогенного рецептора по аминокислотной позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1; и (с) (ί) при наличии в образце модификации - прекращения лечения субъекта антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения, или (ίί) при отсутствии в образце модификации продолжения лечения субъекта антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из прекращения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают, состоят из и/или состоят по существу из продолжения лечения антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при отсутствии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из введения антагониста андрогенного рецептора третьего поколения, который ингибирует модифицированный ΆΚ при наличии в образце субъекта модификации в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди АКЫ-509, энзалутамида (МОУ3100) и ΚΌ162. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора первого поколения выбирают среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида или нилутамида.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΆΚ содержит, состоит из и/или состоит по существу из замены или делеции аминокислоты в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΆΚ содержит, состоит из и/или состоит по существу из замены фенилаланина на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΆΚ содержит, состоит из и/или состоит по существу из замены фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΆΚ содержит, состоит из и/или состоит по существу из замены фенилаланина на лейцин в позиции 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΆΚ содержит, состоит из и/или состоит по существу из делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную позицию 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный полипептид ΆΚ, имеет (ί) мутацию тимина (ΐ) на цитозин (с) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2626 в последовательности нуклеотидов, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 18; (ίί) мутацию цитозина (с) на аденин (а) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2628 в последовательности нуклеотидов, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 18; или (ίί) мутацию цитозина (с) на гуанин (д) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2628 в последовательности нуклеотидов, представленной в 8ЕЦ ГО N0:18.
В некоторых вариантах осуществления способа образец нуклеиновой кислоты представляет собой РНК или ДНК. В некоторых вариантах осуществления способа образец нуклеиновой кислоты представляет собой геномную ДНК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, состоит из и/или состоит по существу из выделения мРНК из образца РНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту выделяют из образца клеток опухоли, полученной от субъекта. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец биопсии опухоли, образец крови, образец сыворотки, образец лимфы или образец аспирата костного мозга, полученные от субъекта. В некоторых вариантах осуществления образец содержит циркулирующие опухолевые клетки. В некоторых вариантах осуществления образец содержит клетки диссеминированной опухоли. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту перед тестированием очищают из образца. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту перед тестированием амплифицируют.
В некоторых вариантах осуществления способа тестирование включает, состоит из и/или состоит по существу из проведения амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) образца нуклеиновой кислоты, кодирующей позицию 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления ПЦРамплификация включает, состоит из и/или состоит по существу из применения пары олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область, кодирующую аминокислотную позицию 876 в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает секвенирование амплифицированной с помощью ПЦР нуклеиновой кислоты с применением методик, известных специалистам в данной области.
- 3 029563
В некоторых вариантах осуществления тестирование включает, состоит из и/или состоит по существу из приведения нуклеиновой кислоты в контакт со специфичным к последовательности нуклеиновой кислоты зондом, причем специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд: (а) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный рецептор, который модифицирован в аминокислотной позиции 876; и (Ь) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор дикого типа, имеющий фенилаланин в позиции 876 в 8ЕО ГО N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления антагонист андрогенного рецептора первого или второго поколения ингибирует полипептид андрогенного рецептора дикого типа за счет конкурентного антагонизма. В некоторых вариантах осуществления антагониста андрогенного рецептора второго поколения выбирают среди ΆΚΝ-509, энзалутамида (МОУ3100) или КЭ162.
В некоторых вариантах осуществления субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное среди рака, воспалительного расстройства или пролиферативного расстройства. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется АКопосредованный рак. В некоторых вариантах осуществления рак выбирают из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака печени (т.е. гепатоцеллюлярного рака) или рака мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется солидная опухоль.
В некоторых вариантах осуществления субъект получает лечение антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения до получения образца от субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект чувствителен к лечению антагонистом андрогенного рецептора первого или второго поколения при его первом введении. В некоторых вариантах осуществления образец для применения в способах представляет собой образец, полученный через 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 14 месяцев, 16 месяцев, 18 месяцев, 20 месяцев, 22 месяца или 24 месяца после первого введения антагониста АК первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления образец получают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз в течение курса лечения антагонистом АК первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления субъект чувствителен к лечению антагонистом АК первого или второго поколения при его первом введении.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны способы проведения скрининга соединений, которые выступают в роли антагониста к модифицированному андрогенному рецептору, содержащие, состоящие из и/или состоящие по существу из: (а) экспрессии модифицированного андрогенного рецептора в клетке, причем модифицированный андрогенный рецептор модифицирован в аминокислотной позиции, соответствующей позиции 876 в 8Е0 ГО N0: 1; (Ь) приведения клетки в контакт с тестируемым соединением; и (с) детекции уровня активности андрогенного рецептора в клетке, причем выраженное снижение активности указывает на способность соединения выступать в роли антагониста к модифицированному АК. В некоторых вариантах осуществления тестируемое соединение показывает полную активность в качестве антагониста к модифицированному АК. В некоторых вариантах осуществления тестируемое соединение не показывает активность в качестве агониста к модифицированному АК. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан ингибитор андрогенного рецептора третьего поколения, выявленный способами, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления применяемая в способе модификация полипептида АК представляет собой замену или делецию аминокислоты в позиции 876 полипептида андрогенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяемая в способе модификация полипептида АК представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, в аминокислотной позиции 876 полипептида андрогенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяемая в способе модификация полипептида АК представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина, в аминокислотной позиции 876 полипептида андрогенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяемая в способе модификация полипептида АК представляет собой замену фенилаланина на лейцин в аминокислотной позиции 876 полипептида андрогенного рецептора.
В некоторых вариантах осуществления используемая в способе клетка испытывает недостаточность по экспрессии андрогенного рецептора дикого типа, экспрессирует низкий уровень андрогенного рецептора дикого типа или экспрессирует модифицированный рецептор АК. В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана среди НеЬа, СУ1, С087, НерС2, НЕК-293, ΌΗ145, РС3, Τ8Υ-ΡΚ1, ЕХСаР. СУК, УСаР и ЬАРС4. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит репортерный ген, функционально связанный с чувствительным к андрогену промотором. В некоторых вариантах осуществления активность полипептида АК определяют путем анализа экспрессии репортерного гена. В некоторых вариантах осуществления промотор содержит чувствительный к андрогену элемент. В некоторых вариантах осуществления чувствительный к андрогену элемент представляет собой 4ХАКЕ или элемент пробазина. В
- 4 029563
некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой пробазин, простатспецифический антиген, ММТУ ЬТР, ΡΆδΝ, 8ΊΡΑΡ4, ТМРР§§2, 0РМ1 или промотор ΝΚΧ3.1. В некоторых вариантах осуществления репортерный ген кодирует белок, выбранный среди люциферазы, флуоресцентного белка, биолюминесцентного белка или фермента.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан выделенный полипептид андрогенного рецептора или его вариант, имеющий активность андрогенного рецептора, содержащий модификацию в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО N0: 1, причем модификация придает резистентность к антагонисту андрогенного рецептора на модифицированном полипептиде андрогенного рецептора или варианте. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит замену аминокислоты в позиции 876 в сравнении с андрогенным рецептором дикого типа, представленным в 8Е0 ГО N0:1. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит делецию аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ имеет последовательность аминокислот, представленную в 8Е0 ГО N0: 5. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ представляет собой рекомбинантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ содержит замену аминокислоты в позиции 876 в сравнении с андрогенным рецептором дикого типа, представленным в 8Е0 ГО N0:1, и одну или более дополнительных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ содержит замену аминокислоты в позиции 876, которая представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ содержит одну или более дополнительных аминокислотных замен, выбранных среди одной или более аминокислотных замен, связанных с кастрационно-резистентным раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления одну или более дополнительных аминокислотных замен выбирают среди одной или более замен в аминокислотных позициях 701, 741, 874 и 877 в сравнении с андрогенным рецептором дикого типа, представленным в 8Е0 ГО N0:1. В некоторых вариантах осуществления одну или более дополнительных аминокислотных замен выбирают среди Ί877ΑΑ, ^741С. ^741Ь, ^741Р, Ь701Н и Η874Υ. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ представляет собой рекомбинантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид ΑΡ содержит последовательность аминокислот, представленную в 8Е0 ГО N0: 5, или вариант, который имеет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 5, причем аминокислота в позиции 876 не является фенилаланином.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный полипептид андрогенного рецептора, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой продукт ПЦР-амплификации. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой рекомбинантную молекулу. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой синтетическую молекулу. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновых кислот, представленную в 8Е0 ГО N0:19, или вариант, который имеет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 19, причем кодон нуклеиновой кислоты, кодирующий аминокислоту в позиции 876, не кодирует фенилаланин.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления представлен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный полипептид андрогенного рецептора, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный или плазмидный вектор. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описана клетка-хозяин, содержащая вектор. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан мутантный полипептид ΑΡ, экспрессируемый клеткойхозяином.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описана фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор андрогенного рецептора третьего поколения, выявленный способами, предложенными в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны примеры применения ингибитора андрогенного рецептора третьего поколения, выявленного способами, предложенными в настоящем документе, для производства лекарственного средства. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления
- 5 029563
описаны способы лечения, включающие введение требующему лечения субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, причем композиция содержит подходящий фармацевтический носитель. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется АК-опосредованный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта экспрессируется мутантный АК. В некоторых вариантах осуществления мутантный АК содержит замену или делецию аминокислоты в аминокислотной позиции 876 в полипептиде андрогенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК третьего поколения вводят с дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят последовательно, одновременно или попеременно. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент выбирают среди гормонов, агонистов или антагонистов рецептора гормонов, кортикостероидов, противорвотных агентов, анальгетиков, противораковых агентов, противовоспалительных агентов, ингибиторов киназ, ингибиторов Н8Р90, ингибиторов гистондеацетилазы (ΗΌΑΟ). В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой агонист или антагонист гонадотропин-высвобождающего гормона (ОиКН). В некоторых вариантах осуществления агонист ОпКН представляет собой лейпролид, бусерелин или гозерелин.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан микрочип, содержащий мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный полипептид АК, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид АК содержит модификацию по аминокислоте 876. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны наборы, содержащие мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан набор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны наборы, содержащие один или более реагентов для детекции мутантного полипептида АК, содержащего модификацию в аминокислотной позиции 876. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описан набор, содержащий один или более реагентов для детекции нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления набор содержит пару олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоту 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления набор содержит олигонуклеотидный праймер, который (а) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный рецептор АК, который модифицирован в аминокислотной позиции 876; и (Ь) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей АК дикого типа, имеющий фенилаланин в аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат микрочип, содержащий (а) модифицированный полипептид АК, имеющий модификацию, которая представляет собой Р8768, или его часть, содержащую модификацию, которая представляет собой Р8768; или (Ь) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид АК, имеющий модификацию, которая представляет собой Р8768, или его часть, содержащую модификацию, которая представляет собой Р8768.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны системы детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащие: (а) образец, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта; и (Ь) микроматрицу, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид АК или его часть, который модифицирован в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления микроматрица содержится на микрочипе. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны системы детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащие: (а) образец, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта; и (Ь) специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд, причем специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд: (ί) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный АК, который модифицирован в аминокислотной позиции 876; и (ίί) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей АК дикого типа, имеющий фенилаланин в аминокислотной позиции 876. В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны системы детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащие: (а) образец, содержащий молекулу
- 6 029563
нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ЛК, от субъекта; и (Ь) пару олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоту 876 полипептида АК.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления описаны выделенные антитела, которые связываются с модифицированным полипептидом андрогенного рецептора, предложенным в настоящем документе, причем антитело не связывается или связывается с меньшей аффинностью с полипептидом АК дикого типа, имеющим последовательность аминокислот, представленную в 8ЕО ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный полипептид АК содержит модификацию по аминокислоте 876. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь.
В настоящем документе в некоторых вариантах осуществления представлены способы поддерживающей терапии у пациента, имеющего рак, включающие: (а) применение к пациенту схемы поддерживающей терапии, включающей введение терапевтически эффективной дозы антагониста АК первого или второго поколения; и (Ь) контроль пациента через заданные интервалы времени в течение курса схемы поддерживающей терапии, чтобы определить, есть ли у субъекта мутация в эндогенном гене, кодирующем рецептор АК, которая приводит к модификации в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления контроль включает: тестирование образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают прекращение схемы поддерживающей терапии при наличии у субъекта мутации или продолжение схемы поддерживающей терапии при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение антагониста АК третьего поколения, который ингибирует модифицированный АК при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления модификация в полипептиде АК представляет собой Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК первого или второго поколения ингибирует полипептид АК дикого типа за счет конкурентного антагонизма. В некоторых вариантах осуществления антагониста АК второго поколения выбирают среди АКЛ-509, энзалутамида (МЭУ3100) и КО162. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря или гепатоцеллюлярный рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления заданный интервал времени представляет собой каждую неделю, каждый месяц, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца, каждые 4 месяца, каждые 5 месяцев, каждые 6 месяцев, каждые 7 месяцев, каждые 8 месяцев, каждые 9 месяцев, каждые 10 месяцев, каждые 11 месяцев или каждый год.
Другие цели, особенности и преимущества полипептидов, нуклеиновых кислот, соединений, способов и композиций, описанных в настоящем документе, станут понятны из представленного ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя они и указывают конкретные варианты осуществления, приведены только в качестве примера, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего описания будут очевидны специалистам в данной области из данного подробного описания.
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 показана резистентность к АКЫ-509 и энзалутамиду. (А) Пролиферация клеток ΕΝί'τιΡ и ΕΝί'τιΡ ΛΒΝ-509ιΈ Клетки ΕΝί'τιΡ и ΕΝΡαΡ ΛΒΝ-509ιΊ культивировали в присутствии среды с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующим добавлением лиганда. Пролиферацию количественно оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток С.'е11ТПегО1о® (Рготеда Согр.) после обработки соединением в течение 7 дней. (В) Анализ на пролиферацию агониста для клеток линий ^NСаΡ/АК-^ис, ^NСаΡ/АК-^ис ΕΝΖγ2 и ΕΝί'τιΡ АКЛ-509г2. Клетки культивировали в присутствии среды с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующей обработкой лигандом в течение 7 дней. Пролиферацию количественно оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Се11Тйег-О1о®. (С) Анализ на пролиферацию антагониста для клеток родительских линий и клеток линий, резистентных к антагонистам андрогенного рецептора 2-го поколения. Клетки культивировали в присутствии среды с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующей обработкой лигандом в присутствии К1881 (конечная концентрация = 100 пМ). Пролиферацию количественно оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Се11ТПег-О1о. (Ό) Схематическое представление структуры домена АК, на котором показаны аминокислоты, мутация по которым приводит к изменению активности лигандов при кастрационнорезистентном раке предстательной железы (СКРС).
На фиг. 2 показаны уровни АК в клетках родительских линий и клетках линий, резистентных к антагонистам андрогенного рецептора 2-го поколения. Белковые экстракты создавали из клеток, культиви- 7 029563
рованных в среде с пониженным содержанием гормона в течение 3 дней. Уровни белка ЛК анализировали также с помощью вестерн-блоттинга. Уровни АК оценивали количественно, нормировали на атубулин и выражали относительно клеток ЬЬСаР.
На фиг. 3 показано, что ΑΚΝ-509 и энзалутамид являются частичными агонистами АК Р876Б. (А) Активность ΑΚΝ-509 и энзалутамида в качестве агониста и антагониста транскрипции на АК дикого типа или Р876Б. Измеряли транскрипционную активацию репортера 4Х АКЕ-люциферазы в присутствии повышающейся концентрации соединения в отсутствие или в присутствии 1 нМ К1881 (для АК дикого типа) или 5 нМ К1881 (для АК Р876Ь). (В) Измеряли активность в качестве агониста транскрипции антиандрогенов 1-го и 2-го поколений и преднизона на АК-зависимой активации репортера 4Х АКЕлюциферазы для АК дикого типа и АК Р876Ь, Т877А, Р876Ь/Т877А, Ь701Н, Η874Υ и \У741С АК во временно трансфицированных клетках НерС2.
На фиг. 4 показана активность АКИ-509 и энзалутамида в качестве агониста и антагониста на ΥΡ16АК (А) и УР16-АК Р876Ь (В). Контролировали активность репортера 4Х АКЕ-люциферазы в присутствии повышающейся концентрации соединения в отсутствие или в присутствии 90 пМ К1881 (для УР16АК дикого типа) или 1 нМ К1881 (для УР16-АК Р876Ь).
На фиг. 5 показаны результаты конкурентного анализа связывания АК дикого типа (А) в сравнении с АК Р876Ь (В). Анализ связывания с 3Н-К1881 проводили в экстрактах клеток РС3, экспрессирующих АК дикого типа или АК Р876Ь. Данные представляют результаты трех независимых экспериментов. Интервалы ошибок, СПС; η = 2.
На фиг. 6 показаны уровни АК в клеточных линиях с избыточной экспрессией АК. Белковые экстракты получали из клеток Б-Ж.’аР. ^NСар/ΑΚ(с8), ^NСаΡ/δΚαΡ876^ и ^NСаΡ/рС^NΑΡ876^, культивированных в среде с пониженным содержанием гормона в течение 3 дней. Уровни белка АК анализировали также с помощью вестерн-блоттинга. Уровни АК оценивали количественно, нормировали на актин и выражали относительно клеток Б-ХСаР.
На фиг. 7 показано, что АК Р876Ь придает АКЖ509 и энзалутамиду частичную активность в качестве агониста. (А) Пролиферация клеток Б-Ж.’аР/АК(с5) и ^NСаΡ/δΚαΡ876^. Клетки культивировали в присутствии среды с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующей обработкой лигандом в течение 7 дней. Пролиферацию количественно оценивали с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Се11Тйег-О1о. (В) Пролиферация клеток ^NСаΡ/ΑΚ(с8), ^NСаΡ/δΚαΡ876^ и Б-ХСаР/рСОХАЕ876Б. Клетки культивировали в среде с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующей обработкой лигандом в течение 7 дней. Для анализов на активность в качестве антагонистов добавляли соединения в присутствии 200 пМ К1881 (конечная концентрация 100 пМ). Пролиферацию количественно оценивали с помощью люминесцентного анализа Се11Тйет-О1о®.
На фиг. 8 показаны результаты анализа взаимодействия Ν/С-концов АК. Индуцированное лигандом взаимодействие Ν/С-концов контролировали посредством двухгибридного анализа на клетках НерО2. Антагонисты анализировали при 8 мкМ, К1881 - при 1 нМ.
На фиг. 9 показан результат анализа АК с иммунопреципитацией хроматина (СЫР) для геновмишеней АК. Анализы СЫР проводили на клетках Б-ХС.’аР/АК(с5) и ^NСаΡ/δΚαΡ876^, инкубированных в среде с пониженным содержанием гормона в течение 3 дней с последующей обработкой лигандом в течение 4 ч. Клетки обрабатывали антагонистом 10 мкМ в присутствии или в отсутствие 1 нМ К1881. Данные для АК и неспецифического контроля 1§О представлены в виде процентной доли вводных данных.
На фиг. 10 показано, что мутация АК Р876Б придает резистентность к АКИ-509 и энзалутамиду ίη νίνο. Опухолевые ксенотрансплантаты Б-ХС.’аР/АК(с5) и БХСаР/8Ка.Р876Б.
Кастрированные самцы мышей с опухолями ежедневно получали лечение несущей средой или 30 мг/кг/день соединения. Рост опухоли для каждой группы представлен в виде среднего объема опухоли ± СПС.
На фиг. 11 показан график дозирования для открытого исследования фазы 1/2 по безопасности, фармакокинетике и подтверждению правильности концепции АКИ-509 у пациентов с прогрессирующим метастазирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы на поздних стадиях.
На фиг. 12 показан результат выявления АК-Р876Ь у пациентов, получавших лечение АКИ-509. (А) Ответ простатспецифического антигена (ПСА) у 29 пациентов, проанализированных на мутацию Р876Б. Конечная точка линии ответа ПСА представляет собой момент времени, в который проводили скрининг плазмы пациента на мутацию Р876Б с применением анализа ВЕАМЫд. Применяемую в данном исследовании плазму исходно собирали, чтобы определить фармакокинетику АКИ-509, и как таковые образцы не готовили с применением методологии для достижения максимального отношения цоДНК к ДНК лимфоцитов. (В) Ответ ПСА у пациента, положительного на Р876Б. Ответ ПСА у пациента 7 на указанном цикле лечения. Циркулирующую плазму анализировали на Р876Б в указанные стрелками моменты времени. Образцы плазмы, не содержащие обнаружимого количества мутанта, отмечены как "д.т.", наличие мутации Р876Б представлено как "м.". Образец плазмы считали положительным на мутацию, если процентная доля гранул с мутантом превышала пороговое значение (0,02%), а число мутантных копий
- 8 029563
оценивали >0,5 (число геномных эквивалентов в образце плазмы х доля гранул с мутантом = >0,5).
На фиг. 13 показано относительное количество простатспецифического антигена (ПСА), обнаруженное в ходе клинического исследования фазы 1/2 ΆΚΝ-509 у каждого из трех пациентов (7, 10 и 13), имеющих обнаружимые соматические мутации Р876Б в ЛК. Стрелки указывают на образец, в котором была(-и) обнаружена(-ы) мутация(-и).
Подробное описание изобретения Некоторая терминология
Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области техники, к которой относится объект изобретения, представленный в пунктах формулы изобретения. Все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности ΟΕΝΒΆΝΚ, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые даны ссылки в тексте полного описания, представленного в настоящем документе, если не указано иное, полностью включены в настоящий документ путем ссылки. В случае наличия множества определений для терминов, представленных в настоящем документе, превалирующими являются приведенные в данном разделе. При предоставлении ссылки на ИКЬ или другой такой идентификатор или адрес следует понимать, что такие идентификаторы могут изменяться и конкретная доступная в сети интернет информация может появляться и исчезать, однако эквивалентная информация известна и может быть легко доступна, например, при поиске в сети интернет и/или в соответствующих базах данных. Ссылки на них подтверждают доступность и публичное распространение такой информации. По существу процедуры для культивации клеток, инфицирования клеток, наработки антител и способы молекулярной биологии являются способами, широко применяемыми в данной области. Такие стандартные методики можно найти, например, в справочном руководстве, таком как, например, 8атЬгоок е1 а1. (2000 г.) и Ли8иЬе1 е1 а1. (1994 г.).
В рамках настоящего документа применение форм единственного числа включает ссылки на множественное число, если из контекста четко не следует иное. В настоящей заявке применение формы единственного числа включает объекты во множественном числе, если явным образом не указано иное. В рамках настоящего документа применение союза "или" означает "и/или", если не указано иное. Более того, применение термина "включая", а также других форм (например, "включают", "включает" и "включал") не имеет ограничительного характера.
В настоящем документе диапазоны и количества могут выражаться как "приблизительно" конкретное значение или диапазон. "Приблизительно" также включает точное количество.
Таким образом, "приблизительно 5 мкг" означает "приблизительно 5 мкг", а также "5 мкг". По существу термин "приблизительно" включает количество, которое можно ожидать в пределах погрешности эксперимента.
В настоящем документе термин "полипептид андрогенного рецептора (АК)" относится к любому белку или полипептиду андрогенного рецептора, включая, без ограничений, полученный рекомбинантным способом белок, полученный синтетическим способом белок, нативный белок андрогенного рецептора и белок андрогенного рецептора, экстрагированный из клеток или тканей. Полипептид АК включает родственные полипептиды от разных видов, включая, без ограничений, животных человеческого и нечеловеческого происхождения. Полипептиды АК нечеловеческого происхождения включают, без ограничений, полипептиды АК отличных от человека приматов (например, шимпанзе и человекообразных обезьян), представителей мышиных (например, мышь и крыса), псовых (собака), кошачьих (кошка), заячьих (кролик), птичьих (птица), бычьих (корова), овечьих (овца), свиных (свинья), лошадиных (лошадь), рыбьих (рыба), лягушачьих (лягушка), а также полипептидов АК других млекопитающих и немлекопитающих. Примеры полипептидов АК включают, например, 8ЕЦ ГО N08: 1-17. Полипептид андрогенного рецептора включает андрогенный рецептор дикого типа, изоформы аллельных вариантов, соматические мутации, включая присутствующие в опухолях, синтетические молекулы из нуклеиновых кислот, выделенный из человеческих тканей и клеток белок, а также их модифицированные формы. Предложенные в настоящем документе полипептиды андрогенного рецептора могут быть дополнительно модифицированы путем модификации первичной аминокислотной последовательности, путем делеции, добавления или замены одной или более аминокислот. Полипептид андрогенного рецептора включает любой полипептид АК или его часть, имеющую активность АК, включая, например, слитые полипептиды лигандсвязывающего домена АК и гетерологического ДНК-связывающего домена.
В настоящем документе термины "мутантный полипептид андрогенного рецептора (АК)", "мутантный белок АК", "модифицированный полипептид АК" или "модифицированный белок АК" применяются в настоящем документе как взаимозаменяемые и относятся к полипептиду андрогенного рецептора, который модифицирован по одной или более аминокислотным позициям. Примеры модификаций включают, без ограничений, замены, делеции или добавления аминокислот.
В настоящем документе термин "антиандрогенный" относится к группе соединений-антагонистов рецептора гормона, которые способны предотвращать или ингибировать биологические воздействия андрогенов в нормально чувствительных тканях организма.
В настоящем документе термины "ингибитор АК" и "антагонист АК" применяются как взаимозаме- 9 029563
няемые в настоящем документе и относятся к агенту, который ингибирует или снижает по меньшей мере один тип активности полипептида ЛК. Примеры типов активности полипептида ЛК включают, без ограничений, связывание с коактиватором, связывание с ДНК, связывание с лигандом или ядерную транслокацию.
В настоящем документе термин "полный антагонист" относится к антагонисту, который в эффективной концентрации по существу полностью ингибирует активность полипептида АК. В настоящем документе термин "частичный антагонист" относится к антагонисту, который способен частично ингибировать активность полипептида АК, но который даже в наивысшей концентрации не является полным антагонистом. Под термином "по существу полностью" понимается ингибирование активности полипептида АК по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99% или более.
В настоящем документе термины "ингибитор АК третьего поколения" и "антагонист АК третьего поколения" применяются как взаимозаменяемые в настоящем документе и относятся к агенту, который ингибирует по меньшей мере один тип активности полипептида АК, содержащего одну или более аминокислотных модификаций, которые придают резистентность к ингибированию антагонистом АК второго поколения, таким как, например, ΛΡ.Ν-509 (номер СА§ 956104-40-8), энзалутамид (также известный как МИУ3100; номер СА§: 915087-33-1) или КИ162 (номер СА§ 915087-27-3). В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК третьего поколения ингибирует по меньшей мере один тип активности полипептида АК дикого типа, такой как, без ограничений, связывание с коактиватором, связывание с ДНК, связывание с лигандом или ядерная транслокация. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК третьего поколения ингибирует активность мутантного полипептида АК, которая также ингибируется ингибитором АК первого или второго поколения.
В настоящем документе фраза "резистентный к ингибированию" относится к снижению способности антагониста АК ингибировать (т. е. выступать в качестве антагониста) один или более типов активности модифицированного полипептида АК в сравнении с полипептидом АК дикого типа. Например, антагонист АК является менее эффективным при ингибировании модифицированного полипептида АК в сравнении с полипептидом АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления сниженная антагонистическая активность в отношении модифицированного полипептида АК составляет приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 100% в сравнении с антагонистической активностью в отношении полипептида АК дикого типа. Примеры типов активности полипептида АК включают, без ограничений, связывание с коактиватором, связывание с ДНК, связывание с лигандом или ядерную транслокацию. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК неспособен к связыванию или связывается со сниженной аффинностью с модифицированным полипептидом АК.
В настоящем документе термины "ингибитор АК второго поколения" и "антагонист АК второго поколения" применяются как взаимозаменяемые в настоящем документе и относятся к агенту, который показывает активность полного антагониста к полипептиду АК дикого типа, но не показывает активность полного антагониста к полипептиду АК, содержащему одну или более аминокислотных модификаций, которые придают резистентность к ингибированию, таких как модификация в аминокислотной позиции 876 в полипептиде АК. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК второго поколения не показывает активность полного антагониста к полипептиду АК, имеющему аминокислотную замену, которой является Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК второго поколения индуцирует активность АК (т. е. является агонистом АК) при концентрациях, которые эквивалентны или превышают концентрацию, необходимую для ингибирования АК дикого типа. Ингибиторы АК второго поколения отличаются от ингибиторов АК первого поколения, таких как бикалутамид и флутамид, тем, что ингибиторы АК второго поколения функционируют как полные антагонисты в клетках, экспрессирующих повышенные уровни АК, таких как, например, клетки кастрационно-резистентного рака предстательной железы (СКРС). Ингибиторы АК первого поколения, такие как бикалутамид и флутамид, при СКРС функционируют как агонисты. Примеры ингибиторов АК второго поколения включают АК^509, энзалутамид и КО 162. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК второго поколения представляет собой агонист мутантного полипептида АК, предложенного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК второго поколения связывается с полипептидом АК в сайте связывания лиганда полипептида АК или рядом с ним.
Термин "нуклеиновая кислота" относится к дезоксирибонуклеотидам, дезоксирибонуклеозидам, рибонуклеозидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, аналогичные нуклеиновой кислоте, на которую дана ссылка, и метаболизируются образом, аналогичным встречающимся в естественных условиях нуклеотидам. Если нет иных конкретных ограничений, термин также относится к аналогам олигонуклеотидов, включая ПНК (пептидонуклеиновая кислота), аналогам ДНК, применяемым в антисмысловой технологии (например, тиофосфаты, фосфорамидаты). Если не указано иное, конкрет- 10 029563
ная последовательность нуклеиновых кислот также неявным образом охватывает ее консервативно модифицированные варианты (включая, без ограничений, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явным образом указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов достигают путем создания последовательностей, в которых третья позиция одного или более выбранных (или всех) кодонов заменяется на остатки со смешанными основаниями и/или дезоксиинозиновые остатки (Ва1/ег е! а1. (1991 г.) ЫисШс Λείά Кек. 19:5081; Ой!кика е! а1. (1985 г.) 1. ΒίοΙ. Сйет. 260:2605-2608; и Сакко1 е! а1. (1992 г.) Мо1. Се11. РгоЬек 6, 327-331; и Κοδδοίίηί е! а1. (1994 г.) Мо1. Се11. РгоЬек 8:91-98).
Термин "аминокислота" относится к встречающимся в естественных условиях и не встречающимся в естественных условиях аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогично встречающимся в естественных условиях аминокислотам. Кодируемыми в естественных условиях аминокислотами являются 20 распространенных аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин), а также пиролизин и селеноцистеин. Термин "аналоги аминокислот" относится к агентам, которые имеют такую же базовую химическую структуру, как и встречающаяся в естественных условиях аминокислота, т.е. содержат α-углерод, связанный с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и К-группу, такую как гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные К-группы (такие как норлейцин) или модифицированные пептидные структуры, но сохраняют такую же базовую химическую структуру, как и встречающаяся в естественных условиях аминокислота.
Ссылки на аминокислоты в настоящем документе даны с использованием либо их распространенных известных трехбуквенных обозначений, либо однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по биохимической номенклатуре ИЮПАК-ИЮБ. Аналогичным образом, ссылки на нуклеотиды даны с использованием их общепринятых однобуквенных кодов.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в настоящем документе применяются как взаимозаменяемые и относятся к полимеру из аминокислотных остатков. Термины применимы как к полимерам из встречающихся в естественных условиях аминокислот, так и к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков представляет собой не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, например аналог аминокислоты. Термины охватывают аминокислотные цепи любой длины, включая полноразмерные белки, причем аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями.
В настоящем документе термин "модификация" относится к модификации последовательности аминокислот полипептида или последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты и включает делеции, вставки и замены аминокислот и нуклеотидов соответственно.
Для определения процентной доли гомологии двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности можно выровнять для целей оптимального сравнения (например, в последовательность первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности вводят гэпы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем можно выполнить сравнение аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих аминокислотных позициях или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция во второй последовательности, молекулы являются идентичными по этой позиции. Процентная доля гомологии между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = число идентичных позиций/полное число позиций (например, перекрывающихся позиций)х100). В некоторых вариантах осуществления две последовательности имеют одинаковую длину.
Для определения процентной доли гомологии между двумя последовательностями применяют алгоритм, описанный в публикации Каг1ш апй А11кс1ш1 (1990 г.) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. δει. υδΑ 87:2264-2268, с модификациями из публикации Кагйп апй А1!ксйи1 (1993 г.) Ргос. №!1. Асай. δα. υδΑ 90:5873-5877. Такой алгоритм встроен в программы ΝΒΤΑδΤ и ΧΒΤΑδΤ, описанные в публикации А1!ксйи1 е! а1. (1990 г.) 1. Мо1. Вю1. 215:403-410. Поиск нуклеотидов по алгоритму ВБ-ΛδΤ проводят с использованием программы ΝΒΡ-ΛδΤ с параметрами ксоге = 100, \уогй1епд1й = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным или раскрытым в настоящем документе. Поиск белков по алгоритму Β^ΑδΤ проводят в программе XΒ^ΑδΤ с параметрами ксоге = 50, \уогй1епд!й = 3. Для получения выравниваний с гэпами для целей сравнения используют алгоритм Саррей Β^ΑδΤ, описанный в публикации А1!ксйи1 е! а1. (1997 г.) №с1ею Аайк Кек. 25:3389-3402. При использовании программ Β^ΑδΤ и Саррей Β^ΑδΤ применяют параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XΒ^ΑδΤ и NΒ^ΑδΤ). Дополнительная информация представлена на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (по адресу псЬгп1т.шй.доу в сети интернет). Белки, подходящие для применения в способах, описанных в настоящем документе, также включают белки,
- 11 029563
имеющие от 1 до 15 изменений аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных замен, делеций или добавлений, в сравнении с аминокислотной последовательностью любого белка, описанного в настоящем документе. В других вариантах осуществления измененная аминокислотная последовательность является по меньшей мере на 75% идентичной, например на 77, 80, 82, 85, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотной последовательности любого белка, описанного в настоящем документе. Такие белки с вариантами последовательности являются подходящими для способов, описанных в настоящем документе при условии, что измененная аминокислотная последовательность сохраняет достаточную биологическую активность для обеспечения функциональности в композициях и способах, описанных в настоящем документе. При выполнении аминокислотных замен замены должны быть консервативными аминокислотными заменами. Среди распространенных аминокислот, например, "консервативной аминокислотной заменой" может быть замена среди аминокислот внутри каждой из следующих групп: (1) глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин, (2) фенилаланин, тирозин и триптофан, (3) серин и треонин, (4) аспартат и глутамат, (5) глутамин и аспарагин и (6) лизин, аргинин и гистидин. Специалистам в данной области будет понятно, что по существу отдельные аминокислотные замены в незначимых областях полипептида по существу не изменяют биологическую активность (см., например, ХУаЦоп е1 а1. Мо1еси1аг Вю1оду оГ 1Пс Сепе, 4-я редакция, 1987 г., ТЬе Веи)ат1п/Ситтш§8 РиЬ. со., с. 224). Таблица ВЬОЗиМ62 представляет собой матрицу аминокислотных замен, полученную из приблизительно 2000 локальных множественных выравниваний сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные области более чем 500 групп родственных белков (НешкоГГе1 а1. (1992 г.) Ргос. Ναΐί. Асаб. 8с1. ИЗА, 89:10915-10919). Соответственно, частоты замен из ВЬОЗИМ62 применяют, чтобы определить консервативные аминокислотные замены, которые в некоторых вариантах осуществления вводят в аминокислотные последовательности, описанные или раскрытые в настоящем документе. Хотя аминокислотные замены можно конструировать на основе только химических свойств (как описано выше), фраза "консервативная аминокислотная замена" предпочтительно относится к замене, представленной значением ВЬОЗИМ62, превышающим -1. Например, аминокислотная замена является консервативной, если замена характеризуется значением ВЬОЗИМ62, равным 0, 1, 2 или 3. В соответствии с данной системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются значением ВЬОЗИМ62, равным по меньшей мере 1 (например, 1, 2 или 3), в то время как более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются значением ВЬОЗИМ62, равным по меньшей мере 2 (например, 2 или 3).
В настоящем документе термин "соответствующие остатки" относится к остаткам, попадающим в выровненные локусы. Родственные или вариантные полипептиды выравнивают любым способом, известным специалистам в данной области. Такие способы, как правило, максимизируют совпадения и включают способы, такие как применение выравниваний вручную и с применением множества доступных программ для выравнивания (например, ВЬАЗТР), а также другие способы, известные специалистам в данной области. Выравнивая последовательности полипептидов, специалист в данной области может выявить соответствующие остатки, применяя в качестве указателей консервативные и идентичные аминокислотные остатки.
Соответствующие позиции также могут быть основаны на структурных выравниваниях, например, с применением выравниваний структуры белка с помощью компьютерного моделирования. В других случаях можно выявить соответствующие области.
В настоящем документе ссылки на "аллельный вариант" или "аллельную вариацию" относятся к полипептиду, кодируемому геном, который отличается от эталонной формы гена (т.е. кодируется аллелем). Как правило, эталонная форма гена кодирует форму дикого типа и/или преобладающую форму полипептида в популяции или одном стандартном члене вида. Как правило, аллельные варианты, которые включают варианты между и среди видов, имеют степень аминокислотной идентичности по меньшей мере 80%, 90% или более с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида из того же вида; степень идентичности зависит от гена и от того, проводится ли сравнение внутри вида или между видами. По существу внутривидовые аллельные варианты имеют идентичность по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90 или 95% или более с формой дикого типа и/или преобладающей формой, включая идентичность 96, 97, 98, 99% или более с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида.
В настоящем документе термин "видовые варианты" относится к вариантам одного и того же полипептида между и среди видов. По существу межвидовые варианты имеют идентичность по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80, 85, 90 или 95% или более с формой дикого типа и/или преобладающей формой другого вида, включая идентичность 96, 97, 98, 99% или более с формой дикого типа и/или преобладающей формой полипептида.
В настоящем документе термины "лечить", "проведение лечения", "лечение" и другие грамматические эквиваленты включают ослабление, смягчение или облегчение одного или более симптомов заболевания или состояния, облегчения, профилактики или уменьшения выраженности, степени тяжести или частоты одного или более дополнительных симптомов заболевания или состояния, облегчения или профилактики лежащих в основе метаболических причин одного или более симптомов заболевания или со- 12 029563
стояния, ингибирования заболевания или состояния, такого как, например, остановка развития заболевания или состояния, облегчения течения заболевания или состояния, обращения развития заболевания или состояния, облегчения состояния, вызванного заболеванием или состоянием, или ингибирование симптомов заболевания или состояния профилактически и/или терапевтически. В не имеющем ограничительного характера примере для пользы профилактики описанное в настоящем документе соединениеингибитор ЛК третьего поколения вводят лицу с риском развития конкретного расстройства, предрасположенного к развитию конкретного расстройства, или лицу, сообщающему об одном или более физиологических симптомах расстройства. В некоторых вариантах осуществления описанное в настоящем документе соединение-ингибитор АК третьего поколения вводят субъекту после лечения одним или более терапевтическими агентами. В некоторых вариантах осуществления описанное в настоящем документе соединение-ингибитор АК третьего поколения вводят субъекту в комбинации с лечением одним или более терапевтическими агентами.
В настоящем документе термины "предотвращение" или "профилактика" относятся к снижению риска развития заболевания или состояния. В настоящем документе термины "эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" относятся к количеству соединения-ингибитора АК, которое достаточно для лечения расстройства. В некоторых вариантах осуществления результатом является снижение и/или ослабление признаков, симптомов или причин расстройства или любое другое желательное изменение биологической системы. Например, "эффективным количеством" для терапевтического применения является количество композиции, содержащей описанное в настоящем документе соединение-ингибитор АК, необходимое для обеспечения клинически значимого ослабления расстройства. Соответствующее "эффективное" количество в любом отдельном случае определяют с применением любой подходящей методики (например, исследования с увеличением дозы).
В настоящем документе термин "фармацевтически приемлемый" относится к материалу (например, носителю или разбавителю), который не подавляет биологическую активность или свойства описанного в настоящем документе соединения-ингибитора АК и является относительно нетоксичным (т. е. материал вводят лицу, что не вызывает нежелательных биологических воздействий или взаимодействия нежелательным образом с любым из компонентов композиции, в которой он содержится).
В настоящем документе термин "контроль" относится к образцу, который по существу идентичен тестируемому образцу, за исключением того, что он не проходил обработку по тестируемому параметру, или если речь идет об образце плазмы, который может быть взят у обычного добровольца, не имеющего исследуемого состояния. Контроль также может представлять собой внутренний контроль.
В настоящем документе термины "субъект", "лицо" и "пациент" применяются как взаимозаменяемые. Ни один из этих терминов не следует интерпретировать как требующий наблюдения профессионального медработника (например, врача, медсестры, помощника врача, санитара, работника больницы). В настоящем документе "субъект" может относиться к любому животному, включая млекопитающих (например, человека или животное, не относящееся к человеку) и немлекопитающих. В одном варианте осуществления способов и композиций, предложенных в настоящем документе, млекопитающее представляет собой человека.
В настоящем документе термин "приведение в контакт" относится к действию касания, установления контакта или приведения веществ в непосредственную близость друг к другу. "Приведение в контакт" может быть достигнуто путем смешивания компонентов в текучей или полутекучей смеси.
Общее описание: функция АК и резистентность к лекарственному средству при раке
Андрогенный рецептор (АК) является членом суперсемейства стероидных и ядерных рецепторов. В данном обширном семействе белков известны лишь пять стероидных рецепторов позвоночных, которые включают андрогенный рецептор, эстрогенный рецептор, прогестероновый рецептор, глюкокортикоидный рецептор и минералокортикоидный рецептор. АК представляет собой растворимый белок, который функционирует как внутриклеточный транскрипционный фактор. Функция АК регулируется путем связывания андрогенов, которое инициирует последовательные конформационные изменения рецептора, которые влияют на взаимодействия рецептор-белок и взаимодействия рецептор-ДНК.
АК в основном экспрессируется в тканях-мишенях андрогена, таких как предстательная железа, скелетные мышцы, печень и центральная нервная система (ЦНС), с наивысшим уровнем экспрессии, наблюдаемым в предстательной железе, надпочечнике и эпидидимисе. В некоторых случаях АК активируется путем связывания эндогенных андрогенов, включая тестостерон и 5а-дигидротестостерон (5 аΌΗΤ).
АК представляет собой ядерный рецептор с массой 110 кДа, который при активации андрогенами опосредует транскрипцию генов-мишеней, модулирующих рост и дифференцировку эпителиальных клеток предстательной железы. АК кодируется геном АК, размещенным на Х-хромосоме в Хс|11-12. Ген АК содержит 8 экзонов, кодирующих полноразмерный андрогенный рецептор. Аналогично другим стероидным рецепторам, несвязанный АК в основном размещен в цитоплазме и связан с комплексом белков теплового шока (Η8Ρ) за счет взаимодействий с лиганд-связывающим доменом. При связывании агониста АК проходит через серию конформационных изменений: белки теплового шока отделяются от АК, и
- 13 029563
трансформированный ЛК проходит димеризацию, фосфорилирование и транслокацию в ядро, которые опосредуются сигналом внутриядерной локализации. Затем транслоцированный рецептор связывается с чувствительным к андрогену элементом (АКЕ), который характеризуется двумя шестинуклеотидными гексамерными консенсусными последовательностями полусайта 5'-ТСТТСТ-3', размещенными как инвертированные повторы, разделенные тремя случайными нуклеотидами, и размещен в промоторной или энхансерной области генов-мишеней АК. Рекрутинг других корегуляторов транскрипции (включая коактиваторы и корепрессоры) и механизма транскрипции дополнительно обеспечивает соответствующую модуляцию регулируемой АК экспрессии гена. Данные процессы инициируют лиганд-индуцированными конформационными изменениями в лиганд-связывающем домене.
Сигнализация АК имеет большое значение для развития и сохранения мужских репродуктивных органов, включая предстательную железу, так как у генетических самцов с утратой функции вследствие мутаций АК и генно-инженерных мышей с дефектами АК предстательная железа не развивается. Данная зависимость клеток предстательной железы от сигнализации АК сохраняется даже после неопластической трансформации. Снижение уровня андрогенов (например, с применением агонистов гонадотропинвысвобождающего гормона (СиКН)) продолжает оставаться основой лечения рака предстательной железы. Однако снижение уровня андрогенов, как правило, эффективно в течение ограниченного периода времени, и рак предстательной железы вновь обретает способность к развитию, несмотря на низкие уровни андрогенов в системе кровообращения.
Рак предстательной железы является наиболее распространенной формой рака у мужчин. Рак предстательной железы представляет приблизительно 29% всех новых диагностируемых случаев рака и 10% смертей от рака у мужчин. Кроме того, для американских мужчин существует вероятность приблизительно 17 процентов развития инвазивного рака предстательной железы в течение их жизни. При первичном диагнозе большая процентная доля случаев рака предстательной железы относится к категории низкого или среднего риска, что означает относительно низкий риск смертности (до 24%) в течение 10 лет без значительного вмешательства. Однако пациенты с поздними стадиями и метастазирующим раком предстательной железы имеют среднюю выживаемость 2,5-3 года и получают агрессивное лечение, включая хирургическую терапию и химическую кастрацию.
Учитывая, что для большинства клеток опухоли предстательной железы их пролиферация и выживаемость зависят от АК, лечение по существу состоит из введения агентов, которые блокируют продукцию тестостерона (например, агонистов СиКН) по отдельности или в комбинации с антиандрогенами (например, бикалутамидом), который играет роль антагониста при воздействии на любой остаточный тестостерон. К сожалению, зачастую при исходном успехе, который проявляется падением уровня простатспецифического антигена (ПСА) и регрессией видимой опухоли (в случае ее наличия), метастазирующие опухоли неизбежно становятся резистентными к гормональной терапии, и на этой стадии не существует эффективного лечения.
Резистентный к видам гормональной терапии рак предстательной железы в настоящее время называют "кастрационно-резистентным", предполагая, что он пересек черту, когда лекарственные препараты, направленные на любой участок андрогенной оси, могли бы иметь какой-либо клинический эффект. Доклинический и клинический опыт указывает на то, что АК является эффективной терапевтической мишенью даже в случае кастрационно-резистентного рака. Была получена информация о том, что мутации АК наблюдаются максимум в 33 процентах случаев рака предстательной железы и чаще всего наблюдаются после лечения в АК-зависимом кастрационно-резистентном состоянии. Были найдены мутации, которые изменяют специфичность и эффективность связывания с лигандом и которые приводят к независимой от лиганда активности рецептора. Конкретные мутации варьируются в широких пределах, но, предположительно, зависят от схемы лечения. Кроме того, положительная регуляция самого АК была связана с прогрессированием в кастрационно-резистентное состояние как у пациентов, так и в животных моделях.
Два агента - абиратерона ацетат (ΖνΙφα; номер СА8 154229-19-3) и МОУ3100 (энзалутамид; номер СА8 915087-33-7) - недавно использовали в клиническом испытании поздней стадии для лечения мужчин с кастрационно-резистентным раком предстательной железы (СКРС). Мишенью абиратерона ацетата является 7-а-гидроксилаза/17,20-лиаза (СУР17А), таким образом ингибируя остаточный биосинтез андрогенов. МЭУ3100 представляет собой антиандроген, выявленный при скрининге на сильный антиандроген без активности в качестве агониста в контексте избыточной экспрессии АК. Показатели клинической эффективности МЭУ3100 и абиратерона ацетата поддерживают гипотезу о том, что АК продолжает стимулировать рост и выживаемость клеток кастрационно-резистентного рака предстательной железы. К сожалению, аналогично андроген-аблирующим видам терапии первого поколения, продолжительное лечение абиратерона ацетатом или антагонистами АК второго поколения в конечном итоге приводит к резистентности.
Резистентность к абиратерона ацетату и МЭУ3100 наблюдали как в моделях рака предстательной железы, так и у пациентов. Предварительные данные указывают на то, что, аналогично кастрационнорезистентному раку предстательной железы, резистентность к антиандрогенам второго поколения развивается по множеству механизмов, и считается, что в этих условиях АК остается терапевтической мише- 14 029563
нью. Как в моделях с ксенотрансплантатами, так и у пациентов в популяциях с резистентностью была отмечена положительная регуляция СУР17А и присутствие пикограммовых уровней андрогенов. Положительная регуляция СУР17А, предположительно, стимулирует резистентность посредством активации ЛК внутриопухолевым синтезом андрогенов. В других случаях резистентность коррелирует с повышенными уровнями АК, а также ядерной локализацией. Кроме того, резистентность к терапии второго поколения могут обуславливать множество путей клеточной сигнализации, которые активируют АК в отсутствие эндогенных лигандов. Наблюдение того, что опухоли с высокими уровнями активированного 8гс плохо отвечают на лечение М0У3100 и абиратерона ацетатом, подтверждают данную гипотезу. К настоящему времени не были описаны мутации АК, придающие резистентность к М0У3100, ΑΚΝ-509 или абиратерону.
ΑΚΝ-509 представляет собой синтетическое тиогидантоиновое соединение, открытое с применением подходов медицинской химии на основе корреляций структура-активность (8АК) при выявлении нестероидных антиандрогенов, которые сохраняют активность полного антагониста в условиях повышенной экспрессии АК. АК№509 показывает противоопухолевую активность в кастрационночувствительных и резистентных моделях с ксенотрансплантатами рака предстательной железы и антиандрогенное воздействие у собак с фенокопией кастрации.
Выявление резистентных к ингибитору АК клеточных линий и мутантный полипептид АК
В настоящем документе описаны рабочие примеры, демонстрирующие продукцию резистентных к лекарственному средству клеточных линий. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы используются для создания клеточной линии, которая является резистентной к ингибированию антагонистом АК второго поколения, таким как, без ограничений, АК№509, энзалутамид (МЭУ3100) или КЭ162. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы используются для создания клеточной линии, которая является резистентной к ингибированию антагонистом АК, который ингибирует продукцию андрогена и показывает связывание с рецептором АК. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК, который ингибирует продукцию андрогена, представляет собой ингибитор СУР17А и показывает связывание с АК. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК, который ингибирует продукцию андрогена и показывает связывание с АК, представляет собой галетерон (ТОК001) или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК, который ингибирует продукцию андрогена и показывает связывание с АК, представляет собой ТАК-700.
Как описано в настоящем документе, резистентные клеточные линии создавали ίη νίνο в клеточном ксенотрансплантате кастрационно-резистентного рака предстательной железы (СКРС) и ίη νίΐτο в клеточных линиях чувствительного к андрогенам рака предстательной железы путем обработки повышающимися концентрациями антиандрогенных лекарственных средств АК№509 или МЭУ3100. По результатам анализов клеточной пролиферации и транскрипции клеточные линии разделяли на два отдельных класса.
Клеточные линии класса 1 экспрессировали повышенный уровень АК в сравнении с их родительскими клеточными линиями и пролиферировали в отсутствие добавленных андрогенов. Лиганднезависимый рост клеток класса 1 не изменялся в присутствии АК№509. М0У3100 или бикалутамида. Синтетический андроген К1881 ингибировал пролиферацию в клетках класса 1, а либо М0У3100, либо АК№509 проявляли к нему антагонистическую активность, что указывает на то, что АК в данных клеточных линиях по-прежнему связывается с М0У3100 и АК№509.
Резистентные клеточные линии класса 2 оставались андроген-зависимыми по росту, аналогично их родительским клеточным линиям. Несмотря на то что АК№509 и МЭУ3100 ингибировали пролиферацию родительской клеточной линии, оба соединения показывали активность в качестве агониста и стимулировали пролиферацию клеточных линий класса 2. Анализ нуклеиновой кислоты, кодирующей АК в клеточных линиях класса 2, позволил выявить, что клеточные линии экспрессировали мутантный АК с мутацией в лиганд-связывающем домене. Мутация представляла собой мутацию с потерей смысла тимидина (Т) на цитозин (С), которая приводила к аминокислотной замене фенилаланина в позиции 876 АК дикого типа на лейцин (Р876Ь).
Как описано в настоящем документе в примерах, были выявлены мутации в гене АК в образцах плазмы от пациентов с раком предстательной железы, участвующих в клинических исследованиях фазы 1/2 АК№509. Выявленные мутации включают мутацию с потерей смысла тимидина (Т) на цитозин (С) в позиции 2988 (первая позиция кодона, кодирующего фенилаланин, который кодируется в экзоне 8 гена АК) и мутацию с потерей смысла цитозина (С) на аланин (А) в позиции 2990 (третья позиция кодона, кодирующего фенилаланин) в аминокислотной замене фенилаланина в позиции 876 АК дикого типа на лейцин (Р876Ь). У пациентов, у которых были выявлены данные мутации, на протяжении исследования также наблюдали повышающиеся уровни простатспецифического антигена (ПСА), что указывает на повышающуюся резистентность к лечению.
В настоящем документе описаны мутантные полипептиды АК, которые содержат аминокислотную замену фенилаланина в позиции 876 АК дикого типа на лейцин (Р876Ь), и кодирующие полипептиды нуклеиновые кислоты. В настоящем документе также описаны способы продукции нуклеиновых кислот
- 15 029563
и полипептидов мутантного ЛК, описанные в настоящем документе. В настоящем документе также описаны композиции, комбинации и наборы, содержащие нуклеиновые кислоты и полипептиды мутантного АК, описанные в настоящем документе. Также предложены способы применения мутантных полипептидов АК для выявления молекул, взаимодействующих с мутантным АК, включая андрогенные ингибиторы, включая соединения-ингибиторы АК третьего поколения. Также предложены композиции, содержащие молекулы, взаимодействующие с мутантным АК, включая их фармацевтические композиции. Также предложены способы лечения с применением выявленных молекул, взаимодействующих с мутантным АК. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые являются синтетическими нуклеиновыми кислотами. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые являются молекулами кДНК. В настоящем документе также описаны мутантные полипептиды АК, продуцируемые нуклеиновыми кислотами мутантного АК, которые являются синтетическими нуклеиновыми кислотами. В настоящем документе также описаны мутантные полипептиды АК, продуцируемые нуклеиновыми кислотами мутантного АК, которые являются молекулами кДНК. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые не содержат геномной ДНК АК. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые являются неметилированными. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые не содержат интронные последовательности АК. В настоящем документе также описаны нуклеиновые кислоты мутантного АК, которые содержат последовательность нуклеотидов из одного или более экзонов геномной последовательности АК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК содержат последовательность нуклеотидов, которая кодирует фенилаланин в позиции, соответствующей позиции 876 полипептида АК дикого типа.
Как описано в настоящем документе, выявление мутации в позиции 876 в АК, такой как, например, Р876Ь, позволяет выполнить конструирование и скрининг ингибиторов, эффективных для ингибирования мутантного АК, имеющего одну или более мутаций резистентности. Такие ингибиторы могут подходить для клинических и терапевтических сфер применения. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы могут подходить для лечения рака, такого как, например, АК-опосредованный рак, такой как, например, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или рак мочевого пузыря, такой как, например, резистентный к лекарственному средству рак предстательной железы, молочной железы, печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или мочевого пузыря.
Как описано в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления субъекты проходят скрининг на выявление мутации в позиции 876 в АК, такой как, например, Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления выявление такой мутации позволяет назначить лечение рака или модифицировать лечение рака. В некоторых вариантах осуществления выявление такой мутации применяют для разделения субъектов на группы конкретной терапии, такой как, например, терапии ингибитором, который ингибирует активность мутантного АК (т.е. ингибитора АК третьего поколения). В некоторых вариантах осуществления выявление такой мутации применяют для характеризации субъекта как имеющего высокий риск рецидива заболевания или состояния, такого как, например, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак) или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления выявление такой мутации применяют для характеризации субъекта как не имеющего чувствительности к конкретному ингибитору АК, такому как, например, АКН-509, МЭУ3100 или КО162. В некоторых вариантах осуществления выявление такой мутации применяют для характеризации субъекта как не имеющего чувствительности к ингибитору АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, такой как, например, галетерон (ТОК001), ТАК-700 или абиратерона ацетат.
Мутантные полипептиды АК
В настоящем документе предложены мутантные полипептиды АК. В некоторых вариантах осуществления выделенные мутантные полипептиды АК представляют собой выделенные мутантные полипептиды АК. В некоторых вариантах осуществления выделенные мутантные полипептиды АК представляют собой ненативные мутантные полипептиды АК. В некоторых вариантах осуществления выделенные мутантные полипептиды АК представляют собой рекомбинантные мутантные полипептиды АК. В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем документе мутантные полипептиды АК показывают активность андрогенного рецептора. Например, мутантные полипептиды АК связываются с чувствительными к андрогену элементами и стимулируют экспрессию чувствительных к АК генов. В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды АК содержат одну или более аминокислотных замен, которые придают резистентность к проявлению полного антагонизма антиандрогеном. В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды АК содержат одну или более аминокислотных замен, которые придают резистентность к проявлению полного антагонизма ингибитором АК второго поколения, таким как, без ограничений, АКЫ-509, энзалутамид (МЭУ3100) или КЭ162. В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды АК содержат одну или более аминокислотных замен, которые придают резистентность к ингибированию АКЫ-509. В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды АК содержат одну или более аминокислотных замен, которые придают резистентность к ингибированию энзалутамидом (МЭУ3100). В некоторых вариантах осуществления мутантные полипептиды АК содержат одну или более аминокислотных замен, которые придают рези- 16 029563
стентность к ингибированию КЭ162.
В некоторых вариантах осуществления обработка предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК ингибитором АК второго поколения индуцирует активность АК. Например, ингибитор АК второго поколения действует как агонист мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления обработка предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК АК^509 индуцирует активность АК. В некоторых вариантах осуществления обработка предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК энзалутамидом (МЭУ3100) индуцирует активность АК. В некоторых вариантах осуществления обработка предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК ΡΌ162 индуцирует активность АК.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1 (номер доступа Р10275), или соответствующей позиции в полипептиде АК дикого типа, представленном в δΕΟ ΙΌ N0: 2 (номер доступа № 000035.2). В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой замену аминокислоты фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид андрогенного рецептора (АК) не содержит фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой замену аминокислоты фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1, и замененную аминокислоту выбирают среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид андрогенного рецептора (АК) содержит лейцин, изолейцин, валин, аланин, глицин, метионин, серин, треонин, цистеин, триптофан, лизин, аргинин, гистидин, пролин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой замену аминокислоты фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1, и замененную аминокислоту выбирают среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина и триптофана. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид андрогенного рецептора (АК) содержит лейцин, изолейцин, валин, аланин, глицин, метионин или триптофан в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой замену аминокислоты фенилаланин на лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления модификация содержит делецию аминокислоты фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в δΕΟ ΙΌ N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит последовательность аминокислот, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 5. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит полипептид, имеющий лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876, и имеющий 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность аминокислотной последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 5. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит полипептид, не имеющий фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876, и имеющий 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность аминокислотной последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ N0: 5.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в аминокислотной позиции 876 и модификацию в одной или более дополнительных аминокислотных позициях. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в аминокислотной позиции 876 и модификацию в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислотных позициях. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию в одной дополнительной аминокислотной позиции. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в аминокислотной позиции 876 и модификацию в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дополнительных аминокислотных позициях. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и модификацию в одной дополнительной аминокислотной позиции. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 876 является заменой, которая представляет собой Р876Ь.
- 17 029563
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию в дополнительной аминокислотной позиции, что придает резистентность к антагонисту АК первого или второго поколения или антагонисту АК, который ингибирует продукцию андрогена. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции дополнительно к модификации в аминокислотной позиции 876 повышает резистентность полипептида АК к антагонисту АК первого или второго поколения или антагонисту АК, который ингибирует продукцию андрогена, в сравнении с полипептидом АК, содержащим только модификацию в аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 876 является заменой, которая представляет собой Р876Ь.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию, выбранную среди модификаций АК, описанных, например, в публикациях Сга55О е1 а1. (2012 г.) Уинге 487 (7406):239-43; Νϊιιμ е1 а1. (2012 г.) Иго1оду 80 (1) :216-8; Сону е1 а1. (2012 г.) Сепе 500(2):220-3; Нау е1 а1. (2012 г.) РЬо8 Опе 2012; 7 (3) :е32514; Кооскекроиг (2010 г.) А51ап 1. Апаго1. 12 (5) :639-57; ^аИеппд е1 а1. (2012 г.) Мо1 Се11 Епаосппо1. 360:38-43; КоЬЫпз (2012 г.) Мо1 Се11 Епаосппок 352 (1-2) :26-33; или СоИПеЬ е1 а1. (2012 г.) Нит Ми1а1. 33 (5) :887-94. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 876 является заменой, которая представляет собой Р876Ь.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию, выбранную среди модификаций АК, связанных с кастрационно-резистентным раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления модификация, связанная с кастрационно-резистентным раком предстательной железы, представляет собой аминокислотную замену, такую как, например, Т877А, \У741С. \ν741Η \У741К. Ь701Н или Η874Υ. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 876 является заменой, которая представляет собой Р876Ь.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в аминокислотной позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 877. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 877. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 877 представляет собой замену аминокислоты треонин. В некоторых вариантах осуществления замененную аминокислоту в аминокислотной позиции 877 выбирают среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, фенилаланина, глицина, метионина, серина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления замененная аминокислота в аминокислотной позиции 877 представляет собой аланин. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и аланин в аминокислотной позиции 877. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и аланин в аминокислотной позиции 877.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 741 представляет собой замену аминокислоты триптофан. В некоторых вариантах осуществления замененную аминокислоту в аминокислотной позиции 741 выбирают среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, фенилаланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления замененная аминокислота в аминокислотной позиции 741 представляет собой лейцин, цистеин или аргинин. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и лейцин в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и цистеин в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и аргинин в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и лейцин в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и цистеин в аминокислотной позиции 741. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и аргинин в аминокислотной позиции 741.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 701. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 701. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 701 представляет собой замену аминокислоты лейцин. В некоторых вариантах осуществления замененную аминокислоту в аминокислотной позиции 701 выбирают среди изолейцина, валина, аланина, фенилаланина, глицина, метионина, гистидина, серина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществле- 18 029563
ния замененная аминокислота в аминокислотной позиции 701 представляет собой гистидин. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и гистидин в аминокислотной позиции 701. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и гистидин в аминокислотной позиции 701.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 874. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и модификацию в аминокислотной позиции 874. В некоторых вариантах осуществления модификация в аминокислотной позиции 874 представляет собой замену аминокислоты гистидин. В некоторых вариантах осуществления замененную аминокислоту в аминокислотной позиции 874 выбирают среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, фенилаланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, лизина, аргинина, триптофана, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления замененная аминокислота в аминокислотной позиции 874 представляет собой тирозин. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в позиции 876 и тирозин в аминокислотной позиции 874. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в позиции 876 и тирозин в аминокислотной позиции 874.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК представляет собой вариант полипептида АК, который содержит модификацию в позиции 876 и одной или более дополнительных аминокислотных позициях относительно полипептида АК дикого типа, представленного в §ЕЦ ГО N0:1. Примеры вариантов включают, например, видовые варианты, аллельные варианты, варианты сплайсинга РНК и варианты, содержащие консервативные и неконсервативные аминокислотные мутации. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглутаминовый тракт от приблизительно 6 последовательных остатков глутамина до приблизительно 39 последовательных остатков глутамина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглутаминовый тракт от приблизительно 16 последовательных остатков глутамина до приблизительно 29 последовательных остатков глутамина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглутаминовый тракт из приблизительно 21 последовательного остатка глутамина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглутаминовый тракт из приблизительно 22 последовательных остатков глутамина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглутаминовый тракт из приблизительно 23 последовательных остатков глутамина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглициновый тракт от приблизительно 10 последовательных остатков глицина до приблизительно 27 последовательных остатков глицина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглициновый тракт из приблизительно 23 последовательных остатков глицина. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида АК содержит полиглициновый тракт из приблизительно 24 последовательных остатков глицина.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит часть мутантного полипептида АК, представленного в §ЕЦ ГО N0: 5. В некоторых вариантах осуществления часть показывает активность полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит ДНК-связывающий домен полипептида АК и лиганд-связывающий домен полипептида АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 мутантного полипептида АК, представленного в §ЕЦ ГО N0: 5. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК состоит по существу из ДНК-связывающего домена полипептида АК и лиганд-связывающего домена полипептида АК, содержащего модификацию в аминокислотной позиции 876 мутантного полипептида АК, представленного в §ЕЦ ГО N0: 5. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит последовательность аминокислот от приблизительно аминокислотной позиции 554 до приблизительно аминокислотной позиции 919 мутантного полипептида АК, представленного в §ЕЦ ГО N0: 5. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК состоит по существу из лиганд-связывающего домена мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит последовательность аминокислот от приблизительно аминокислотной позиции 554 до приблизительно аминокислотной позиции 919.
В некоторых вариантах осуществления полипептид АК представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен полипептида АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в §ЕЦ ГО N0: 1, связанный с гетерологическим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь. Способы создания слитых белков известны в данной области и включают стандартные рекомбинантные методики работы с ДНК. Например, в некоторых вариантах осуществления фрагменты ДНК, кодирующие разные полипептидные последовательности, связываются вместе с сохранением рамки считывания в соответствии с традиционными методиками, например, с использованием для связывания тупых или ступенчатых концов, расщепление рестрикционным ферментом для получения соответствующих концов, при необходимости заполнение липких кон- 19 029563
цов, обработка щелочной фосфатазой для предотвращения нежелательных соединений и ферментативное связывание. В некоторых вариантах осуществления слитый ген можно синтезировать по стандартным методикам, включая использование автоматических синтезаторов ДНК. В некоторых вариантах осуществления ПЦР-амплификацию фрагментов генов можно проводить с применением якорных праймеров, которые дают комплементарные липкие концы между двумя последовательными фрагментами генов, которые впоследствии можно гибридизировать и повторно амплифицировать для создания химерной генной последовательности (см., например, Сштеп) РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ред. Ли8иЬе1 с1 а1. ίοΐιη АПеу & δοηδ: 1992 г.). В некоторых вариантах осуществления в продаже доступны векторы экспрессии, которые кодируют фрагмент для слияния (например, полипептид С8Т). Кодирующую модифицированный полипептид АЕ нуклеиновую кислоту можно клонировать в такой вектор экспрессии так, что фрагмент для слияния свяжется с сохранением рамки считывания с модифицированным полипептидом АЕ.
В некоторых вариантах осуществления полипептид АЕ представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0:1, связанный с гетерологическим ДНК-связывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления полипептид АЕ представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связанный с гетерологическим ДНК-связывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления гетерологический ДНК-связывающий домен представляет собой ДНК-связывающий домен САЬ4. В некоторых вариантах осуществления гетерологический ДНК-связывающий домен представляет собой ДНК-связывающий домен ЬехА. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0: 1, связан с гетерологическим ДНК-связывающим доменом посредством пептидного линкера. В некоторых вариантах осуществления полипептид АЕ представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связанный с гетерологическим ДНК-связывающим доменом посредством пептидного линкера.
В некоторых вариантах осуществления полипептид АЕ представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0: 1, связанный с гетерологическим пептидом, для применения в анализе белкового взаимодействия, такого как, без ограничений, дрожжевой двухгибридный анализ, двухгибридная система на основе клеток млекопитающих (М2Н), анализ Ферстеровского (флуоресцентного) резонансного переноса энергии (РЕЕТ), биолюминесцентный анализ резонансного переноса энергии (ВЕЕТ) или анализ гомогенной флуоресценции с временным разрешением (НТЕР®). В некоторых вариантах осуществления полипептид АЕ представляет собой слитый белок, содержащий лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связанный с гетерологическим пептидом, для применения в анализе белкового взаимодействия, таком как, без ограничений, дрожжевой двухгибридный анализ, двухгибридная система на основе клеток млекопитающих (М2Н), анализ Ферстеровского (флуоресцентного) резонансного переноса энергии (РЕЕТ), биолюминесцентный анализ резонансного переноса энергии (ВЕЕТ) или анализ гомогенной флуоресценции с временным разрешением (НТЕР®).
В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0: 1, связан с обнаружимым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления лигандсвязывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связан с обнаружимым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0:1, связан с флуоресцентным белком, таким как, без ограничений, зеленый (СРР), красный (ЕРР), голубой (СРР), желтый (УРР) или синий (ВРР) флуоресцентный белок. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связан с флуоресцентным белком, таким как, без ограничений, зеленый (СРР), красный (ЕРР), голубой (СРР), желтый (УРР) или синий (ВРР) флуоресцентный белок. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8ЕС ГО N0: 1, связан с биолюминесцентным белком. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связан с биолюминесцентным белком. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен полипептида АЕ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876 полипептида АЕ дикого типа, представленного в 8 ЕС ГО N0: 1, связан с пептидной меткой. В некоторых вариантах осуществления лиганд-связывающий домен мутантного полипептида АЕ, представленного в 8ЕС ГО N0: 5, связан с пептидной меткой. В некоторых вариантах осуществления пептидная метка представляет собой эпитопную метку, распознаваемую специфичным к метке антителом. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой эпитопную метку,
- 20 029563
такую как, без ограничений, с-тус, У-5, гемагглютинин (НА), РЬАО. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой аффинную метку, такую как, без ограничений, биотин, метку 51гер-1ад. хитин-связывающий белок (СВР), мальтоза-связывающий белок (ΜΒΡ), глутатион-8-трансферазу (О8Т) или полигистидиновую метку.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложена матрица, содержащая мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК связан с микрочипом. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК связан непосредственно с микрочипом. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК связан с микрочипом опосредованно посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложена микрочиповая матрица, содержащая мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе.
Нуклеиновые кислоты
В настоящем документе предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные полипептиды АК. В настоящем документе предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из мутантных полипептидов АК, описанных в настоящем документе. Способы получения нуклеиновых кислот, которые кодируют конкретные полипептиды, известны в данной области и включают стандартные молекулярнобиологические методики. В настоящем документе предложены примеры нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные полипептиды АК, предложенные в настоящем документе. Следует понимать, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество вариантов нуклеиновых кислот, которые кодируют один и тот же полипептид. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют предложенные в настоящем документе мутантные полипептиды АК, охватывают такие варианты. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК представляют собой синтетические нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК представляют собой молекулы кДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК не содержат геномной ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК являются неметилированными. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК не содержат интронные последовательности геномной ДНК АК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК содержат последовательность нуклеотидов из двух или более экзонов геномной последовательности АК, включая экзон 8 или его часть, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую позицию 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты мутантного АК содержат последовательность нуклеотидов, которая кодирует фенилаланин в позиции, соответствующей позиции 876 полипептида АК дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантные полипептиды АК, содержит модификацию относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит модификацию, в которой кодированный полипептид содержит замену аминокислоты фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит модификацию, в которой кодированный полипептид не содержит фенилаланина в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в 8ЕЦ ГО N0:1.
В некоторых вариантах осуществления модификация нуклеиновой кислоты представляет собой мутацию с потерей смысла или делецию одного или более кодонов, которые кодируют полипептид. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, представляет собой ТТС или ТТТ. В некоторых вариантах осуществления кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, представляет собой ТТС. В некоторых вариантах осуществления кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, представляет собой ТТТ. В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТС на кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует лейцин. В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТТ на кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует лейцин. В некоторых вариантах осуществления кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует лейцин, выбирают среди ТТА, ТТО, СТТ, СТС, СТА или СТО.
В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С). В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТС на СТС. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С) в нуклеотидной
- 21 029563
позиции 2626 нуклеотидной последовательности ЛК, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 18.
В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на аденин (А). В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТТ на ТТА. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на аденин (А) в нуклеотидной позиции 2628 нуклеотидной последовательности АК, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 18.
В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на гуанин (С). В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТТ на ТТС. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на гуанин (С) в нуклеотидной позиции 2628 нуклеотидной последовательности АК, представленной в 8ЕЦ ГО N0:18.
В некоторых вариантах осуществления модификация содержит мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С) в первой позиции кодона, который кодирует Р876 полипептида АК, и вторую мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на аденозин (А) в третьей позиции кодона, который кодирует Р876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТТ на СТА. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С) в нуклеотидной позиции 2626, и вторую мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на аденозин (А) в нуклеотидной позиции 2628 нуклеотидной последовательности АК, представленной в 8ЕЦ ГО N0:18.
В некоторых вариантах осуществления модификация содержит мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С) в первой позиции кодона, который кодирует Р876 полипептида АК, и вторую мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на гуанин (С) в третьей позиции кодона, который кодирует Р876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления модификация изменяет кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует фенилаланин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК, с ТТТ на СТС. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на цитозин (С) в нуклеотидной позиции 2626, и вторую мутацию с потерей смысла, которая содержит замену тимина (Т) на гуанин (С) в нуклеотидной позиции 2628 нуклеотидной последовательности АК, представленной в 8ЕЦ ГО N0: 18.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит последовательность нуклеотидов, представленную в 8ЕЦ ГО N0:19. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит нуклеиновую кислоту, имеющую 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность нуклеотидов, представленную в §ЕЦ ГО N0: 19, где кодированный мутантный АК содержит модификацию относительно полипептида АК дикого типа в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит нуклеиновую кислоту, имеющую 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность нуклеотидов, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 19, где кодированный мутантный АК не содержит фенилаланин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, содержит нуклеиновую кислоту, имеющую 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность нуклеотидной последовательности с нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность нуклеотидов, представленную в 8ЕЦ ГО N0: 19, где кодированный мутантный АК содержит лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876.
В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, представляет собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, представляет собой молекулу кДНК. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, представляет собой молекулу РНК. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, представляет собой молекулу ингибиторной РНК (т.е. РНКи). В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая комплементарна или связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный полипептид АК.
В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота,
- 22 029563
кодирующая мутантный полипептид АК или его часть, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислоту в позиции 876, которая не является фенилаланином. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК или его часть, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую лейцин в аминокислотной позиции 876.
В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид, который кодирует часть мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид, который кодирует часть мутантного полипептида АК, которая содержит нуклеотидный кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую аминокислотной позиции 876. В некоторых вариантах осуществления кодон кодирует аминокислоту, которая не является фенилаланином. В некоторых вариантах осуществления кодон кодирует аминокислоту, которая представляет собой лейцин.
В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота представляет собой вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из предложенных в настоящем документе мутантных полипептидов АК. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, которая представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из предложенных в настоящем документе мутантных полипептидов АК, является вектором экспрессии. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе нуклеиновая кислота, которая представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из предложенных в настоящем документе мутантных полипептидов АК, функционально связана с промотором для экспрессии мутантных полипептидов АК.
В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ДНК-или РНК-вирусный вектор. Примеры вирусных векторов включают, без ограничений, вектор на основе вируса осповакцины, аденовируса, аденоассоциированного вируса (ААУ), ретровируса или вируса герпеса.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложена матрица, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из мутантных полипептидов АК, предложенных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления мутантная нуклеиновая кислота АК связана с микрочипом. В некоторых вариантах осуществления мутантная нуклеиновая кислота АК связана непосредственно с микрочипом. В некоторых вариантах осуществления мутантная нуклеиновая кислота АК связана с микрочипом опосредованно посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложена матрица в форме микрочипа, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую любой из мутантных полипептидов АК, предложенных в настоящем документе.
Получение нуклеиновых кислот и полипептидов
В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, создана стандартными рекомбинантными способами. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, создана путем амплификации мутантной последовательности АК из геномной ДНК. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, создана полимеразной цепной реакцией с применением праймеров, специфичных к последовательности АК. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, создана обратной транскрипцией мРНК, кодирующей мутантный полипептид АК.
В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, вводится в вектор экспрессии и экспрессируется в клетке-хозяине или неклеточном экстракте. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, функционально связана с промотором для экспрессии кодирующего полипептида в клетке или неклеточном экстракте. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой конститутивный промотор. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой индуцируемый промотор.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК, является "экзогенной" для клетки, что означает, что она является чужеродной для клетки, в которую вводят вектор, или что последовательность гомологична последовательности в клетке, но в позиции внутри нуклеиновой кислоты клетки-хозяина, в которой последовательность обычно не присутствует. Векторы включают плазмиды, космиды, вирусы (бактериофаги, вирусы животных и вирусы растений) и искусственные хромосомы (например, искусственные дрожжевые хромосомы). Специалист в данной области будет в достаточной мере оснащен, чтобы сконструировать вектор с использованием стандартных рекомбинантных методик, которые описаны в публикациях 8атЬгоок е1 а1., 1989 г. и АикиЬе1 е1 а1., 1996 г., обе из которых включены в настоящий документ путем ссылки.
- 23 029563
Способы экспрессии белка в клетке хорошо известны в данной области и включают, например, экспрессию в клетках, таких как животные и растительные клетки. Примеры животных клеток для экспрессии мутантных полипептидов АК, предложенных в настоящем документе, без ограничений, включают бактерии, дрожжи, клетки насекомых и клетки млекопитающих, такие как, например, клетки человека, приматов, грызунов, бычьих и овечьих. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный АК, встроена в геном клетки-хозяина.
В некоторых вариантах осуществления способ экспрессии мутантного полипептида АК, предложенного в настоящем документе, включает культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, кодирующий мутантный полипептид АК так, что мутантный полипептид АК продуцируется клеткой. В некоторых способах нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид, соединена с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальную последовательность так, что сигнальная последовательность экспрессируется в виде слитого пептида с мутантным полипептидом АК. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность обеспечивает секрецию мутантного полипептида АК клеткой-хозяином.
В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК выделен из клетки-хозяина, экспрессирующей мутантный полипептид. В некоторых вариантах осуществления из клетки-хозяина готовят экстракт и мутантный полипептид АК выделяют с помощью способов очистки, таких как, без ограничений, хроматография или иммуноаффинность с антителом, которое специфично к полипептидам АК или специфично, в частности, к мутантному полипептиду АК.
Антитела
В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с мутантным полипептидом АК, предложенным в настоящем документе, и связывается с меньшей аффинностью или не связывается с полипептидом АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с мутантным полипептидом АК при наличии ингибитора второго поколения, такого как, без ограничений, АК№ 509, энзалутамид (МЭУ3100) или КО162.
В некоторых вариантах осуществления предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК детектируется с применением антител, которые специфически распознают мутантные полипептиды АК, но не распознают полипептиды АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления предложенный в настоящем документе мутантный полипептид АК детектируется с применением антител, которые специфически распознают мутантный полипептид АК, имеющий лейцин в аминокислотной позиции 876, но не распознают полипептиды АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления антитела вырабатываются против одной или более аллельных форм мутантного полипептида АК, предложенного в настоящем документе. Методики применения специфичного белка или олигопептида в качестве антигена для стимуляции антител, которые специфически распознают эпитопы на пептиде или белке, хорошо известны. В одном варианте осуществления последовательность ДНК желательной аллельной формы гена-мишени клонируют путем вставки в соответствующий вектор экспрессии и транслируют в белок в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Белок можно извлечь и применять в качестве антигена для стимуляции продукции специфичных антител. В другом варианте осуществления ДНК желательной аллельной формы гена-мишени амплифицируют с помощью технологии ПЦР и впоследствии транслируют ίη νίΙΐΌ в белок для применения в качестве антигена для стимуляции продукции специфичных антител. В другом варианте осуществления последовательность ДНК альтернативных аллелей применяют в качестве основы для создания синтетических пептидов, представляющих аминокислотную последовательность аллелей, для применения в качестве антигена для стимуляции продукции специфичных антител.
В некоторых вариантах осуществления антитела создают либо с использованием стандартных методик получения моноклональных антител, либо с использованием экспрессирующих систем рекомбинантного типа. См. по существу публикацию АЬЬак, ЫсШтап. апй РоЬег, Се11и1аг апй Мо1еси1аг 1ттипо1оду, А. В. §аипйег8 Со. (1991 г.). Термин "антитела" призван включать молекулы интактных антител, а также фрагменты или производные антител, такие как РаЬ и Р(аЬ')2, которые способны специфически связываться с антигеном. Продуцируемые таким образом антитела предпочтительно связываются только с мутантным белком, продуцируемым в аллельной форме, которая применялась в качестве антигена для создания антитела. Способы создания аллельспецифичных антител также описаны в патенте США № 6200754 и патенте США № 6054273, полное содержание которых включено в настоящий документ путем ссылки.
В некоторых вариантах осуществления предложенное в настоящем документе антитело представляет собой гуманизированное антитело. Термин "гуманизированное антитело" относится к типу сконструированного антитела, гипервариабельные участки (СОК) которого получены из иммуноглобулина от донора, отличного от человека, а остальные полученные из иммуноглобулина части молекулы получены из одного или более иммуноглобулинов человека. В некоторых вариантах осуществления поддерживающие каркас остатки изменяют для сохранения аффинности связывания (см., например, Оиееп е( а1. Ргос. Ν;·ι(1. Асай δα И8А, 86:10029-10032 (1989 г.), Нойдкоп е( а1. Вю/ТесЬпо1оду, 9:421 (1991 г.)). В некоторых вариантах осуществления подходящее человеческое антитело-акцептор выбрано из традиционной
- 24 029563
базы данных, например базы данных ΚΑΒΑΤ®, базы данных Ьо8 Л1ато8 или базы данных §№188 Рго!еш, по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями антитела-донора. В некоторых вариантах осуществления антитело человека, характеризуемое гомологией с каркасными областями антитела-донора (на аминокислотной основе), может подходить для создания константной области тяжелой цепи и/или вариабельной каркасной области тяжелой цепи для вставки СОК донора. В некоторых вариантах осуществления подходящее антитело-акцептор, способное дать константные или вариабельные каркасные области легкой цепи, выбирают аналогичным образом. В некоторых вариантах осуществления источником тяжелых и легких цепей антитела-акцептора является одно и то же антитело-акцептор. В некоторых вариантах осуществления источниками тяжелых и легких цепей антитела-акцептора являются разные антитела-акцепторы. На предшествующем уровне техники описаны несколько способов получения таких гуманизированных антител - см., например, патенты ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
В некоторых вариантах осуществления антитела, специфичные к предложенному в настоящем документе мутантному полипептиду ΑΚ, можно применять для детекции наличия предложенного в настоящем документе мутантного полипептида ΑΚ в образце, например анализируемом образце, клеточном образце, клеточном экстракте, биологическом образце или образце пациента, применяя методики, известные в данной области. Данные методики включают, например, вестерн-блоттинг, иммуногистохимию, непрямую иммунофлуоресценцию и микроматрицы с антителами. В некоторых вариантах осуществления антитела, которые специфично распознают мутантный полипептид ΑΚ, представляют собой ингибиторы ΑΚ третьего поколения. В некоторых вариантах осуществления способность антитела, которое специфично распознает мутантный полипептид ΑΚ, к ингибированию биологической активности мутантного полипептида ΑΚ, может быть определена с применением способов, описанных в настоящем документе, для выявления ингибиторов ΑΚ третьего поколения.
Диагностические анализы для детекции мутантных полипептидов ΑΚ и нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные полипептиды ΑΚ
В настоящем документе предложены диагностические способы, которые включают детекцию мутантного полипептида ΑΚ у субъекта или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид ΑΚ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется ΑΚ-опосредованное заболевание или состояние. В некоторых вариантах осуществления диагностические способы используют для скрининга субъектов, у которых имеется рак, резистентный к терапии антиандрогеном, таким как антагонист ΑΚ первого или второго поколения, выявления субъектов для лечения антиандрогеном, таким как антагонист ΑΚ первого или второго поколения, контроля за терапией субъектов, получающих антиандрогенную терапию, такую как антагонист ΑΚ первого или второго поколения, оптимизации терапии субъектов, получающих антиандрогенную терапию, такую как антагонист ΑΚ первого или второго поколения, а также их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления способы включают выбор субъекта для терапии антагонистом ΑΚ третьего поколения. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают введение субъекту антагониста ΑΚ третьего поколения, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления обнаруженный мутантный полипептид ΑΚ содержит модификацию в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида ΑΚ дикого типа, представленного в §Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления обнаруженный мутантный полипептид ΑΚ содержит замену аминокислоты фенилаланин на лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида ΑΚ дикого типа, представленного в §Е0 ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию антагонистом первого или второго поколения.
В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию антагонистом первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию антагонистом первого и второго поколения. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий лейцин в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию антагонистом первого или второго поколения. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий лейцин в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию антагонистом первого и второго поколения. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию ингибитором СΥΡ17Α, который связывается с ΑΚ, таким как, например, галетерон (ТОК001), ТАК-700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления субъект, имеющий мутантный полипептид ΑΚ, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, является резистентным к ингибированию ингибитором СΥΡ17Α, который связывается с ΑΚ, таким как, например, галетерон (ТОК001), ТАК-700 или абиратерона ацетат.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы характеризации полипептида ΑΚ, который является резистентным к ингибированию антагонистом ΑΚ второго поколения, у субъекта, вклю- 25 029563
чающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Еф ГО N0:1; и (Ь) характеризацию АК как резистентного к ингибированию антагонистом АК второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает невведение антагониста АК второго поколения. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы характеризации АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого поколения, у субъекта, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:1; и (Ь) характеризацию АК как резистентного к ингибированию антагонистом АК первого поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает невведение антагониста АК второго поколения. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы характеризации АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, у субъекта, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1; и (Ь) характеризацию АК как резистентного к ингибированию антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает невведение антагониста АК второго поколения. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А представляет собой галетерон (Τ0Κ001), ТАК-700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы выбора субъекта для терапии антагонистом АК второго поколения, включающие (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как кандидата на терапию антагонистом АК второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает характеризацию субъекта как не кандидата на терапию антагонистом АК второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы выбора субъекта для терапии антагонистом АК первого поколения, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой
- 26 029563
кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в ЗЕф ГО NО: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как кандидата на терапию антагонистом АК первого поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает характеризацию субъекта как не кандидата на терапию антагонистом АК первого поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы выбора субъекта для терапии антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в ЗЕф ГО NО: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как кандидата на терапию антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает характеризацию субъекта как не кандидата на терапию ингибитором СУР17А при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А представляет собой галетерон (ТОК001), ТАК700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы выбора субъекта для терапии антагонистом АК третьего поколения, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в ЗЕф ГО NО: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как кандидата на терапию антагонистом АК третьего поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы определения имеющейся или потенциальной резистентности субъекта к терапии антагонистом АК второго поколения, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в ЗЕф ГО NО:1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение ингибитора АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы определения имеющейся или потенциальной резистентности субъекта к терапии антагонистом АК первого поколения, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в ЗЕф ГО NО:1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК первого поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение ингибитора АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществ- 27 029563
ления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы определения имеющейся или потенциальной резистентности субъекта к терапии антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО N0:1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение ингибитора АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А представляет собой галетерон (Т0К001), ТАК-700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы контроля развития или потенциального развития у субъекта, получающего антагонист АК второго поколения для лечения рака, резистентности к терапии, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК второго поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы контроля развития или потенциального развития у субъекта, получающего антагонист АК первого поколения для лечения рака, резистентности к терапии, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК первого поколения при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы контроля развития или потенциального развития у субъекта, получающего антагонист АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, для лечения рака, резистентности к терапии, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0:1; и (Ь) характеризацию субъекта как резистентного или потенциально резистентного к терапии антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, при наличии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антагониста АК третьего поколения, предложенного в настоящем документе, для ингибирования мутантного АК. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А представляет собой галетерон (Т0К001), ТАК-700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы оптимизации терапии субъекта, получающего антагонист АК второго поколения для лечения рака, включающие: (а) анализ образца, содер- 28 029563
жащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §Е0 ГО N0: 1; и (Ь) прекращение лечения антагонистом АК второго поколения при наличии у субъекта модификации или продолжение лечения антагонистом АК второго поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы оптимизации терапии субъекта, получающего антагонист АК первого поколения для лечения рака, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §Е0 ГО N0: 1; и (Ь) прекращение лечения антагонистом АК первого поколения при наличии у субъекта модификации или продолжение лечения антагонистом АК первого поколения при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы оптимизации терапии субъекта, получающего антагонист АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, для лечения рака, включающие: (а) анализ образца, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §Е0 ГО N0: 1; и (Ь) прекращение лечения антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А, при наличии у субъекта модификации или продолжение лечения антагонистом АК, который представляет собой ингибитор СУР17А при отсутствии у субъекта модификации. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А представляет собой галетерон (Т0К001), ТАК-700 или абиратерона ацетат. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию получения образца нуклеиновой кислоты от субъекта.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный АК является резистентным к проявлению полного антагонизма со стороны антагониста АК второго поколения, такого как, например, ΆΡΝ509, энзалутамид (МЭУ3100) или КЭ162. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК второго поколения, такой как, например, АК№509, энзалутамид (МЭУ3100) или КЭ162, показывает активность в качестве агониста к модифицированному АК. В некоторых вариантах осуществления модифицированный АК является резистентным к проявлению полного антагонизма со стороны антагониста АК первого поколения. В некоторых вариантах осуществления модифицированный АК является резистентным к проявлению полного антагонизма со стороны антагониста АК, который представляет собой СУР17А.
В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется АК-зависимое или АК-опосредованное заболевание или состояние. В некоторых вариантах осуществления АК-зависимое или АКопосредованное заболевание или состояние представляет собой доброкачественную гиперплазию предстательной железы, гирсутизм, угревую сыпь, аденомы и неоплазмы предстательной железы, доброкачественные или злокачественные опухолевые клетки, содержащие АК, сверхволосатость, себорею, эндометриоз, синдром поликистоза яичников, андрогенную плешивость, гипогонадизм, остеопороз, подавление сперматогенеза, либидо, истощение, анорексию, андрогенную поддерживающую терапию при возрастном снижении уровней тестостерона, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак печени, рак эндометрия, рак матки, приливы, болезнь Кеннеди, мышечную атрофию и слабость, кожную атрофию, утрату костной ткани, анемию, атеросклероз, сердечно-сосудистое заболевание, утрату энергии, утрату хорошего самочувствия, диабет 2 типа или накопление брюшного жира.
В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется рак. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется солидная опухоль. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак печени или рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы.
В некоторых вариантах осуществления образец получают из любой ткани или текучей среды организма. Образцы включают, без ограничений, цельную кровь, отторгнутый костный мозг, аспират костного мозга, плевральную текучую среду, перитонеальную текучую среду, центральноспинальную текучую среду, брюшинную текучую среду, панкреатическую текучую среду, цереброспинальную текучую среду, мозговую текучую среду, асцит, перикардиальную текучую среду, мочу, слюну, бронхиальный лаваж, пот, слезы, ушной секрет, мокроту, текучую среду гидроцеле, сперму, вагинальный секрет, молоко, амниотическую текучую среду и секреты дыхательного, желудочно-кишечного или мочеполового тракта. В конкретных вариантах осуществления образец представляет собой образец биопсии опухоли. В конкретных вариантах осуществления образец представляет собой образец текучей среды или ткани, которая является частью или связана с лимфатической системой или системой кровообращения. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец крови, который представляет собой образец венозной, артериальной, периферической, тканевой или пуповинной крови. В конкретных вариантах
- 29 029563
осуществления образец представляет собой образец сыворотки. В некоторых вариантах осуществления образец содержит одну или более циркулирующих опухолевых клеток (СТС). В некоторых вариантах осуществления образец содержит одну или более клеток диссеминированной опухоли (ЭТС, например в образце аспирата костного мозга).
Способы выделения нуклеиновых кислот и белков из клеток, содержащихся в образцах ткани и текучей среды, хорошо известны в данной области. В конкретных вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты, полученный от субъекта, выделяют из клеток, содержащихся в биопсии опухоли субъекта. В конкретных вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты, полученный от субъекта, выделяют из клеток аспирата костного мозга. В конкретных вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты, полученный от субъекта, выделяют из клеток, содержащихся в образце сыворотки. В конкретных вариантах осуществления образец нуклеиновой кислоты, полученный от субъекта, выделяют из клеток, содержащихся в образце лимфы.
В некоторых вариантах осуществления образцы получают от субъекта с помощью любого подходящего средства получения образца с применением хорошо известных стандартных клинических способов. Процедуры получения образцов текучей среды от субъекта хорошо известны. Например, процедуры забора и обработки цельной крови и лимфы хорошо известны и могут использоваться для получения образца для применения в предложенных способах. Как правило, для сбора образца крови добавляют антикоагулирующий агент (например, ЭДТА, или цитрат и гепарин, или СРЭ (цитрат, фосфат, декстроза), или сравнимые соединения) для предотвращения коагуляции крови. В некоторых примерах образец крови собирают в пробирку для сбора, которая содержит количество ЭДТА для предотвращения коагуляции образца крови.
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой биопсию ткани и получен, например, с помощью пункционной биопсии, пункционной биопсии под контролем КТ, аспирационной биопсии, эндоскопической биопсии, бронхоскопической биопсии, бронхиального лаважа, инцизионной биопсии, эксцизионной биопсии, пункционной биопсии, бритвенной биопсии, кожной биопсии, биопсии костного мозга и процедуры электрохирургической эксцизии петлей (ΤΕΕΡ). Как правило, получают ненекротические стерильные биопсии или образцы более 100 мг, но которые могут быть меньше, например менее 100 мг, 50 мг или менее, 10 мг или менее или 5 мг или менее; или больше, например более 100 мг, 200 мг или более, или 500 мг или более, 1 г или более, 2 г или более, 3 г или более, 4 г или более или 5 г или более. Размер экстрагируемого для анализа образца зависит от ряда факторов, включая, без ограничений, число анализов, которые необходимо выполнить, состояние здоровья образца ткани, тип рака и состояние пациента. В некоторых вариантах осуществления ткань помещают в стерильный сосуд, такой как стерильная пробирка или культуральный планшет, и необязательно погружают в соответствующую среду. Как правило, клетки диссоциируют в клеточные суспензии с помощью средства механической обработки и/или ферментативной обработки, как хорошо известно специалистам в данной области. Как правило, клетки собирают, и затем проводят с ними стандартные процедуры для выделения нуклеиновой кислоты для анализа.
В некоторых вариантах осуществления образцы получают от субъекта через равные интервалы, такие как, например, один день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, одна неделя, две недели, три недели, четыре недели, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, один год, раз в день, раз в неделю, два раза в месяц, раз в квартал, два раза в год или раз в год. В некоторых вариантах осуществления сбор образцов проводят через заданное время или через равные интервалы для лечения одним или более противораковыми агентами. В некоторых вариантах осуществления сбор образцов проводят через заданное время или через равные интервалы для лечения антагонистом АК, таким как антагонист АК первого или второго поколения. Например, образец собирают через заданное время или через равные интервалы до, во время или после лечения или между последовательными курсами лечения. В конкретных примерах образец получают от субъекта до начала противораковой терапии и затем повторно через равные интервалы после начала лечения. В конкретных примерах образец получают от субъекта до начала терапии антагонистом АК, таким как антагонист АК первого или второго поколения, и затем повторно через равные интервалы после начала лечения. В некоторых вариантах осуществления антагониста АК выбирают среди бикалутамида, флутамида, гидроксифлутамида, нилутамида, АК№509, энзалутамида (МЭУ3100) и КО 162. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК представляет собой ингибитор СУР17А. В некоторых вариантах осуществления ингибитор СУР17А выбирают среди галетерона (Т0К001), ТАК-700 или абиратерона ацетата.
Объем образца текучей среды может представлять собой любой объем, подходящий для обнаружения мутантного АК в предложенных способах. В некоторых примерах объем образца текучей среды зависит от конкретного применяемого способа анализа. Например, конкретные способы анализа могут требовать большего или меньшего объема образца текучей среды в зависимости от факторов, таких как, без ограничений, емкость устройства или применяемый способ и уровень пропускной способности способа анализа. В некоторых примерах образец текучей среды разбавляют в соответствующей среде перед применением способа анализа. В некоторых примерах образец текучей среды получают от субъекта и в способе анализа применяют часть или аликвоту образца. Часть или аликвоту можно разбавить в соответ- 30 029563
ствующей среде перед применением способа анализа.
В некоторых вариантах осуществления образец получают от субъекта, который является млекопитающим. Примеры субъектов-млекопитающих, без ограничений, включают приматов, таких как люди, человекообразные обезьяны и обезьяны; грызунов, таких как мыши, крысы, кролики и хорьки; жвачных, таких как козы, коровы, олени и овцы; лошадей, свиней, собак, кошек и других животных. В некоторых вариантах осуществления образец получают от пациента. В некоторых примерах пациент представляет собой пациента-человека.
В некоторых вариантах осуществления полученный от субъекта образец нуклеиновой кислоты представляет собой образец геномной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полученный от субъекта образец нуклеиновой кислоты представляет собой образец РНК. В некоторых вариантах осуществления мРНК выделяют из общей РНК в образце РНК. В некоторых вариантах осуществления проводят обратную транскрипцию образца РНК в кДНК. В некоторых вариантах осуществления образец геномной нуклеиновой кислоты амплифицируют с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления способ амплификации нуклеиновых кислот представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В некоторых вариантах осуществления образец геномной нуклеиновой кислоты амплифицируют с помощью набора нуклеотидных праймеров, специфичных к гену АК. В некоторых вариантах осуществления набор нуклеотидных праймеров фланкирует нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоту 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления продукт амплификации представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную позицию 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления специфичный к последовательности праймер конъюгируют с обнаружимой молекулой, такой как флуоресцентная метка, биолюминесцентная метка, хемилюминесцентная метка, радиометка, ферментная метка, обнаружимый субстрат или пептид или молекула, которые связываются со второй обнаружимой молекулой.
В некоторых вариантах осуществления анализ содержит секвенирование образца нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления кодирующую АК нуклеиновую кислоту в образце нуклеиновой кислоты сначала амплифицируют способом, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР), применяя специфичные к последовательности праймеры, и затем амплифицированный ПЦР-фрагмент секвенируют. Примеры способов секвенирования для применения в способах, предложенных в настоящем документе, хорошо известны в данной области и включают, без ограничений, способы обрыва цепи дидезоксирибонуклеотидами, секвенирование по Максаму-Гилберту, массивно-параллельное опознавательное секвенирование (или ΜΡδδ), полони-секвенирование, пиросеквенирование, секвенирование с обрывом цепи красителем Шишта, секвенирование лигированием (§ОЫБ), ионное полупроводниковое секвенирование, секвенирование с наношариками ДНК, секвенирование НеШЗсоре и секвенирование отдельных молекул в реальном времени (§МКТ).
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец плазмы или сыворотки, содержащий ДНК (цоДНК), РНК (цоРНК) или микроРНК циркулирующей опухоли (см., например, СНап е! а1. (2007 г.) Вг ί. Сапсег. 96 (5) :681-5). В некоторых вариантах осуществления кодирующую мутантный АК ДНК анализируют по способу ПЦР-секвенирования ВЕАМшд (гранулы, амплификация, эмульсия, магнит) (см., например, Ы е! а1. (2006 г.) Ν;·ιΙ МеШойк. 3(2):95-7; Ы е! а1. (2006 г.) Ν;·ιΙ Ме!Нойк. 3(7):551-9; и Б1еЫ е! а1. (2008 г.) Ν;·ιΙ Мей. 14(9): 985-990). ВЕАМшд представляет собой методику, в которой индивидуальные молекулы ДНК прикрепляют к магнитным гранулам в эмульсиях типа "вода в масле" и затем после компартментализации подвергают ПЦР-амплификации. Затем мутационный статус связанной с гранулами ДНК определяют путем гибридизации с флуоресцентными аллельспецифичными зондами для мутантных АК или АК дикого типа. После этого для количественного определения уровня мутантной ДНК, присутствующей в плазме или сыворотке, применяют проточную цитометрию (см., например, Шддшк е! а1. (2012 г.) Сйп Сапсег Кек 18: 3462-3469).
В некоторых вариантах осуществления анализ образца для детекции наличия кодирующей мутантный АК ДНК содержит детекцию мутации с помощью специфичного к последовательности олигонуклеотидного зонда, который специфичен к нуклеиновой кислоте, которая кодирует мутантный АК, но не АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления анализ содержит (а) приведение образца в контакт с олигонуклеотидным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности мутантного АК, где при наличии в образце мутантной нуклеотидной последовательности образуется комплекс зонд-ДНК, и (Ь) детекцию комплекса зонд-ДНК. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидный зонд специфичен к нуклеиновой кислоте, кодирующей лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления специфичный к последовательности зонд конъюгирован с обнаружимой молекулой, такой как флуоресцентная метка, биолюминесцентная метка, хемилюминесцентная метка, радиоизотопная метка, ферментативная метка, обнаружимый субстрат или пептид или молекула, которая связывается со второй обнаружимой молекулой.
В некоторых вариантах осуществления однонуклеотидные изменения обнаружимы за счет ПЦР с применением ПЦР-маркеров рестрикционного полиморфизма амплифицированных последовательностей (САР§), которые создают сайты рестрикции в мутантных последовательностях (Мюйае1к е! а1. (1998 г.) Р1ап! ί. 14(3):381-5), или специфичные к последовательности шпилькообразные зонды, прикрепленные к
- 31 029563
обнаружимым фрагментам, таким как, без ограничений, флуорофор (МЫапда апй Ма1тЬег§ (2001 г.) МсЙюЙ5 25:463-471). В некоторых вариантах осуществления специфичный к последовательности зонд конъюгирован с обнаружимой молекулой, такой как флуоресцентная метка, биолюминесцентная метка, хемилюминесцентная метка, радиоизотопная метка, ферментативная метка, обнаружимый субстрат или пептид или молекула, которая связывается со второй обнаружимой молекулой. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидный зонд специфичен к нуклеиновой кислоте, кодирующей лейцин в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
В некоторых вариантах осуществления анализ образца для детекции наличия кодирующей мутантный АК ДНК проводят с применением олигонуклеотидной матрицы (см., например, Накйа е1 а1. (1999 г.) I. Мей ОепеЕ 36(10):730-6). В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий нуклеиновую кислоту от субъекта, гибридизуют непосредственно на чип. В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий нуклеиновую кислоту от субъекта, амплифицируют по способу амплификации, такому как, без ограничений, полимеразная цепная реакция (ПЦР), и амплифицированную нуклеиновую кислоту гибридизуют на чип. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотидная матрица содержится на микрочипе. В некоторых вариантах осуществления однонуклеотидные изменения обнаружимы с применением микрочипов. В некоторых вариантах осуществления анализ образца содержит детекцию мутации антителом, специфичным к мутантному полипептиду АК. В некоторых вариантах осуществления способ детекции мутантного полипептида АК включает получение образца от субъекта, причем образец содержит полипептид АК, и тестирование образца на наличие мутантного полипептида АК путем приведения образца в контакт с антителом, которое специфично для связывания с мутантным полипептидом АК и не связывается или связывается со сниженной аффинностью с полипептидом АК дикого типа, причем наличие мутантного полипептида АК создает комплекс антитело-мутантный полипептид АК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает детекцию комплекса антитело-мутантный полипептид АК. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает детекцию комплекса антитело-мутантный полипептид АК проявляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления специфичное к мутантному АК антитело конъюгировано с обнаружимой молекулой, такой как флуоресцентная метка, биолюминесцентная метка, хемилюминесцентная метка, радиоизотопная метка, ферментативная метка, обнаружимый субстрат или пептид или молекула, которая связывается со второй обнаружимой молекулой (например, вторичным антителом). В некоторых вариантах осуществления связывание специфичного к мутантному АК антитела обнаружимо с помощью анализа на обнаружимую молекулу. В некоторых вариантах осуществления связывание специфичного к мутантному АК антитела детектируется с применением вторичного антитела (например, анти-1§С). В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец биопсии опухоли, образец аспирата костного мозга, образец крови, образец сыворотки или образец лимфы.
Выявление молекул, которые взаимодействуют с мутантным андрогенным рецептором
В настоящем документе предложены способы применения мутантных полипептидов АК для скрининга соединений, которые ингибируют мутантный рецептор (т.е. соединений-ингибиторов АК третьего поколения). В некоторых вариантах осуществления способы используют для выявления соединенийингибиторов АК третьего поколения для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления способы используют для выявления соединений-ингибиторов АК третьего поколения для лечения резистентных раков, таких как рак предстательной железы, резистентный к лечению антагонистами АК второго поколения, такими как АК№509, энзалутамид (МОУ3100) или КО 162.
В некоторых вариантах осуществления способ выявления соединений-ингибиторов АК третьего поколения включает (а) экспрессию предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК в клетке, (Ь) приведение клетки в контакт с тестируемым соединением и (с) детекцию уровня активности АК в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт с агонистом АК до или одновременно с приведением клетки в контакт с тестируемым соединением. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт с агонистом АК приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч или более до приведения клетки в контакт с тестируемым соединением. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт с агонистом АК одновременно с приведением клетки в контакт с тестируемым соединением. В некоторых вариантах осуществления агониста АК выбирают среди метилтриенолона (К1881), ΏΗΤ, миболерона (МЬ) и тестостерона. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит аминокислотную замену в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в 8ЕО ГО ΝΟ: 1. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК не содержит фенилаланин в аминокислотной позиции 876 в полипептиде. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в аминокислотной позиции 876 в полипептиде.
В некоторых вариантах осуществления применяют клеточную линию, которую можно трансфицировать нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный полипептид АК, и в которой можно контролировать активность АК. В некоторых вариантах осуществления клетка не экспрессирует АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует низкий уровень АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует эндогенный мутантный полипептид АК. В некоторых
- 32 029563
вариантах осуществления эндогенный мутантный полипептид АК содержит модификацию в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 877 полипептида АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эндогенный мутантный полипептид АК содержит модификацию, которая представляет собой замену треонина на аланин в аминокислотной позиции 877 (Т877А). В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 874 полипептида АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит модификацию, которая представляет собой замену гистидина на тирозин в аминокислотной позиции 874 (Η874Υ). В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана среди НеЬа, СУ1, С087, НерО2, НЕК-293, Όυ145, РС3 и ΤδΥ-РКК В некоторых вариантах осуществления клеточная линия представляет собой клеточную линию рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления клеточную линию выбирают среди САК, Ь-КСаР. УСаР и ЬАРС4.
В некоторых вариантах осуществления клетка стабильно экспрессирует мутантный полипептид АК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид АК, встроена в геном клетки.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности АК детектируют с применением репортерного гена, функционально связанного с чувствительным к АК промотором. В некоторых вариантах осуществления чувствительный к АК промотор содержит один или более чувствительных к андрогену элементов (АКЕ), с которыми связан мутантный полипептид АК. В некоторых вариантах осуществления промотор выбирают среди пробазина (РЬ), простатспецифического антигена (ПСА), длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мышей (ММТУ ЬТК), синтазы жирных кислот (РА§№), шестого трансмембранного эпителиального антигена предстательной железы 4 (8ТЕАР4), сериновой трансмембранной протеазы 2 (ТМРК882), альфа-1-кислого гликопротеина 1 (0КМ1) или промотора человеческого гомеобоксного гена N14X3. 1. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой синтетический промотор, содержащий один или более АКЕ.
В некоторых вариантах осуществления чувствительный к АК промотор функционально связан с подходящим репортерным геном, который кодирует обнаружимый белок. Примеры обнаружимых белков, без ограничений, включают люциферазу, флуоресцентные белки, биолюминесцентные белки, βгалактозидазу, щелочную фосфатазу и хлорамфеникол-ацетилтрансферазу. В некоторых вариантах осуществления снижение экспрессии репортерного гена после воздействия тестируемого соединения в сравнении с соответствующим контролем указывает на то, что тестируемое соединение является эффективным для ингибирования мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой базальную экспрессию репортерного гена до воздействия на клетку тестируемого соединения. В некоторых вариантах осуществления экспрессию репортерного гена анализируют с применением клеточного экстракта, полученного из тестируемых клеток.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности АК детектируют путем измерения экспрессии одного или более эндогенных чувствительных к андрогену генов в клетке. В некоторых вариантах осуществления чувствительный к андрогену ген регулируется положительно (т.е. индуцируется) в ответ на обработку андрогеном. В некоторых вариантах осуществления чувствительный к андрогену ген регулируется отрицательно (т.е. подавляется) в ответ на обработку андрогеном. Примеры чувствительных к андрогену генов, без ограничений, включают простатспецифический антиген (ПСА), простатспецифический мембранный антиген (Р8МА), простазин, ген 8паП Ьошо1од 2 (§ЬиО), сериновую трансмембранную протеазу 2 (ТМРК882), семейство шестых трансмембранных эпителиальных антигенов предстательной железы 4 (8ТЕАР4), РК506-связывающий белок 5 (РКВР5), орозомукоидный 1/альфа-1кислый гликопротеин 1 (0КМ1), семейство транспортеров растворенных веществ 35 (§ЬС35Р2/Х0У), инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), ИФР-связывающий белок-3 и -5, связывающий ССААТэнхансер белок-5, удаленный на хромосоме 10 гомолог фосфатазы и тензина (РТЕЩ, РА§Ц N4X3.1, АМ1О02, В1)\К САМК2М, 11РС.1Х ^АРП3, РЬП1, 1Ь-15, 1Ь-18 и ЕКВВ2/НЕК2.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности АК детектируют путем измерения экспрессии одного или более эндогенных генов, которых индуцируют путем обработки андрогеном или агонистом АК. В некоторых вариантах осуществления снижение экспрессии одного или более индуцируемых андрогеном генов после воздействия тестируемого соединения в сравнении с подходящим контролем указывает на то, что тестируемое соединение является эффективным для ингибирования мутантного полипептида АК. Примеры индуцируемых андрогеном генов, без ограничений, включают простатспецифический антиген (ПСА), простазин, ген 8паП Ьошо1од 2 (§ЬиО), сериновую трансмембранную протеазу 2 (ТМРК882), семейство шестых трансмембранных эпителиальных антигенов предстательной железы 4 (8ТЕАР4), РК506-связывающий белок 5 (РКВР5) и орозомукоидный 1/альфа-1-кислый гликопротеин 1 (0КМ1). В некоторых вариантах осуществления экспрессию индуцируемого гена оценивают при наличии агониста АК. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с андрогенным агонистом до или одновременно с тестируемым соединением.
В некоторых вариантах осуществления уровень активности АК детектируют путем измерения экспрессии одного или более эндогенных генов, которых подавляют путем воздействия андрогена или аго- 33 029563
ниста АК. В некоторых вариантах осуществления повышение или недостаточность подавления экспрессии одного или более подавленных андрогеном генов после воздействия тестируемого соединения в сравнении с подходящим контролем указывает на то, что тестируемое соединение является эффективным для ингибирования мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой базальную экспрессию гена до воздействия на клетку тестируемого соединения. Примеры подавленных андрогеном генов, без ограничений, включают простатспецифический мембранный антиген (Р8МА), семейство транспортеров растворенных веществ 35 (8ЬС35Р2^0У), ИФРсвязывающий белок-3 и -5, связывающий ССААТ-энхансер белок-5, удаленный на хромосоме 10 гомолог фосфатазы и тензина (РТЕЦ), 1Ь-15, 1Ь-18 и ЕКВВ2/НЕК2. В некоторых вариантах осуществления экспрессию подавляемого гена оценивают при наличии агониста АК. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с андрогенным агонистом до или одновременно с тестируемым соединением.
Способы измерения экспрессии эндогенных генов хорошо известны в данной области. Примеры способов измерения экспрессии гена, без ограничений, включают способы анализа белков, такие как, например, иммуногистохимия, иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), хроматография, а также способы анализа нуклеиновых кислот, такие как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), количественная ПЦР (кПЦР), ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР), нозерн-блоттинг.
В некоторых вариантах осуществления активность мутантного полипептида АК измеряют с применением анализа, такого как, без ограничений, анализ связывания коактиватора АК (например, иммунопреципитационные анализы, двухгибридные анализы, анализы Ферстеровского (флуоресцентного) резонансного переноса энергии (РКЕТ), например времяразрешенный РКЕТ-анализ связывания коактиватора андрогенного рецептора Ьаи1Ъа8сгееи™), анализ конформационного профилирования АК (см., например, 1о8ерЬ е! а1. (2009 г.) ΡΝΛ8 106 (29):12178-12183), анализ связывания ДНК АК (см., например, КосЬе е! а1. (1992 г.) Мо1. Еийосгшо1. 6(12):2229-35), иммунопреципитация хроматина, анализ взаимодействия Ν/С-концов АК (см., например, Нки е! а1. (2005 г.) Мо1. Еийосгшо1оду 19(2) 350-361 и ОЬай е! а1. (2003 г.) 1. С1ш Еийосгшо1 Ме!аЬ. 88(5):2185-93).
В некоторых вариантах осуществления способ выявления соединений-ингибиторов АК третьего поколения включает выбор потенциального соединения-ингибитора АК третьего поколения с применением компьютеризированного моделирования на основе трехмерной структуры кристалла или раствора предложенного в настоящем документе мутантного полипептида АК. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит аминокислотную замену в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 полипептида АК дикого типа, представленного в 8ЕЦ ГО N0: 1. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК не содержит фенилаланин в аминокислотной позиции 876 в полипептиде. В некоторых вариантах осуществления мутантный полипептид АК содержит лейцин в аминокислотной позиции 876 в полипептиде. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение мутантного полипептида АК в контакт с тестируемым соединением и детекцию взаимодействия тестируемого соединения с мутантным полипептидом АК. В некоторых вариантах осуществления тестируемое соединение, которое взаимодействует с мутантным полипептидом АК, классифицируют как кандидат на соединение-ингибитор АК третьего поколения.
В некоторых вариантах осуществления тестируемое соединение для применения в предложенных способах представляет собой член библиотеки соединений. В некоторых вариантах осуществления создание библиотеки тестируемых соединений выполняют любым подходящим способом для получения химических соединений. Термин "библиотека тестируемых соединений" относится к панели, содержащей множество тестируемых соединений. Пример подхода к синтезу молекулярных библиотек малых органических молекул был описан ранее (Саге11 е! а1. (1994 г.). Аидете. СЬет. 1и!. Ей. Еид1. 33:2059; Саге11 е! а1. (1994 г.) Аидете. СЬет. Ιηΐ. Ей. Еид1. 33:2061). В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем документе тестируемые соединения получают с применением любого из множества подходов для работы с комбинаторными библиотеками, известных в данной области, включая: биологические библиотеки; пространственно адресуемые параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки, требующие деконволюции способы работы с синтетическими библиотеками, способ работы с библиотекой типа "одна гранула - одно соединение" и способы работы с синтетическими библиотеками с применением выбора на основе аффинной хроматографии. Подход с использованием биологической библиотеки ограничен пептидными библиотеками, тогда как другие четыре подхода применимы к библиотекам пептидов, непептидных олигомеров или низкомолекулярных соединений (Ьат, К. 8. (1997 г.) Аийсаисег Игид Эе5. 12:145). В данной области известны и другие примеры способов синтеза молекулярных библиотек, например описанные в публикациях: ЕгЬ е! а1. (1994 г.). Ргос. №й1. Асай. 8сг И8А 91:11422; Ногтее11 е! а1. (1996 г.) 1ттииорЬагтасо1оду 33:68-; и Оа11ор е! а1. (1994 г.); I. Мей. СЬет. 37:1233-. В некоторых вариантах осуществления библиотеки соединений представлены в растворе (например, НоидЬ!еи (1992 г.) ВюйсНшсщех 13:412-421) или на гранулах (Ьат (1991 г.) №йиге 354:82-84), чипах (Ройог (1993 г.) №йиге 364:555-556), бактериях (Ьайиег, патент США № 5,223,409), спорах (Ьайиег И8Р '409), плазмидах (Си11 е! а1. (1992 г.) Ргос №И1 Асай 8ά И8А 89:1865-1869) или на фаге (8сой аий 8тйЬ (1990 г.) 8сгеисе 249:386-390); (Реу1т (1990 г.) 8сгеисе 249:404-406); (Стегг1а е! а1. (1990 г.) Ргос.
- 34 029563
№!1. Асай. δα. 87:6378-6382); (Река (1991 г.) 1. Мо1. Вю1. 222:301-310). В некоторых вариантах осуществления комбинаторные полипептиды получают из библиотеки кДНК. Примеры соединений, для которых можно провести скрининг на активность, включают, без ограничений, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, малые органические молекулы, а также библиотеки экстрактов из натуральных продуктов.
Ингибиторы АК, выявленные способами скрининга
Ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов скрининга, представляют собой модуляторы АК. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК третьего поколения ингибирует или снижает по меньшей мере один тип активности полипептида АК. Примеры типов активности полипептида АК включают, без ограничений, связывание с коактиватором, связывание с ДНК, связывание с лигандом или ядерную транслокацию. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК третьего поколения ингибирует активность полипептида АК приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 или 100% в сравнении с активностью полипептида АК в отсутствие ингибитора. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные предложенными в настоящем документе способами, представляют собой обратные агонисты АК, антагонисты АК, расщепители АК, модуляторы транспорта АК и/или ингибиторы связывания ДНК АК. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой обратные агонисты АК. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой антагонисты АК. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой расщепители АК. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой модуляторы транспорта АК. В некоторых вариантах осуществления соединенияингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой ингибиторы связывания ДНК АК. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК ингибирует по меньшей мере один тип активности полипептида АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления ингибитор АК ингибирует по меньшей мере один тип активности мутантного полипептида АК.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, имеет минимальную просудорожную активность и/или минимальное воздействие на судорожный порог. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, проявляет минимальную модуляцию ГАМК-зависимого хлоридного канала. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, проявляет минимальное связывание с ГАМК-зависимым хлоридным каналом. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, имеет минимальный антагонизм к ГАМК-зависимому хлоридному каналу. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, представляет собой модулятор АК с минимальным взаимодействием с ГАМК-зависимым хлоридным каналом. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, представляет собой модулятор АК с минимальным взаимодействием с ГАМКА-зависимым хлоридным каналом. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, представляет собой модулятор АК с минимальным взаимодействием с ГАМКА-зависимым хлоридным каналом и/или минимальным проникновением через гематоэнцефалический барьер. Анализы ГАМК известны и включают, без ограничений, описанные в публикации Акйок К. Мейа апй Майага] К. Иски "СНагааеп/аИоп о£ 1йе Р1сго!охт δίΚ о£ САВАа Кесер!огк" Сштеп! Рго!осо1к ш Рйагтасо1оду (2000 г.) 1.18.1-1.18.17; авторское право © 2000 1ойп ^УНеу & δοη5, 1пс., которая включена в настоящий документ путем ссылки.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует ядерную транслокацию АК. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует связывание ДНК АК с чувствительным к андрогену элементом. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рекрутинг коактиватора в чувствительном к АК промоторе. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, не показывает активности в качестве агониста в клетках рака предстательной железы с избыточной экспрессией АК.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное
- 35 029563
с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы, экспрессирующих АК дикого типа. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы, экспрессирующих мутантный АК, имеющий мутацию Е876Ь. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы, экспрессирующих АК дикого типа и мутантный АК, имеющий мутацию Р876Ь. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы, экспрессирующих мутантный АК, имеющий мутацию Т877А (например, ксенотрансплантатные опухоли, образованные из клеток Ь-НСаР). В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационно-резистентного рака предстательной железы, экспрессирующих АК дикого типа и мутантный АК, имеющий мутацию Т877А (например, ксенотрансплантатные опухоли, образованные из клеток ЬКСаР). В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, ингибирует рост ксенотрансплантатных моделей кастрационно-чувствительного и кастрационнорезистентного рака предстательной железы, экспрессирующих мутантный АК, имеющий мутацию Т877А, и мутантный АК, имеющий мутацию Р876Ь.
Фармацевтические композиции
В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов скрининга. В некоторых вариантах осуществления предложено применение ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов скрининга, для приготовления лекарственного средства.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор АК третьего поколения, также содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый неактивный ингредиент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор АК третьего поколения, составлена для внутривенной инъекции, подкожной инъекции, перорального введения или местного введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор АК третьего поколения, представляет собой таблетку, драже, капсулу, жидкость, суспензию, гель, коллоид, дисперсию, суспензию, раствор, эмульсию, мазь или лосьон.
Фармацевтические композиции готовят традиционным образом, применяя один или более фармацевтически приемлемых неактивных ингредиентов, которые облегчают подготовку препаратов из активных соединений, которые можно применять фармацевтически. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения. Сводная информация по описанным в настоящем документе фармацевтическим композициям приведена, например, в публикациях Кстшдфп: Ткс ЗАспсс аиб РгасБсс оГ Ркагтасу, №ис1ссп1Н Е6 (ЕакФи, Ра.: Маск РиЫЫипд Сотрапу, 1995 г.); Нооусг, 1оНп Е., КсттдФп'к Ркагтасси11са1 δαспсск, Маск РиЫЫипд Со., ЕаЦоп. Рсптаукаша 1975 г.; ЫЪсгтап, Н.А. апб ЬасНтап, Ь., Е6§., РкагтассиЦса1 Эо^адс Рогтз, Магсс1 Эссксг, №\ν Уогк, N. Υ., 1980 г.; и Ркагтасси11са1 Эо^адс Еогпъ апб Эгид ЭсПусгу §у8йт8, 8сусп1к Е6. (Ырршсок ХУППапъ & ХУПкки 1999 г.), включенных в настоящий документ путем ссылки для настоящего описания.
В настоящем документе предложены фармацевтические композиции на основе ингибитора АК третьего поколения или его фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого неактивного ингредиента. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе ингибитор АК третьего поколения вводят в виде фармацевтических композиций, в которых ингибитор АК третьего поколения смешан с другими активными ингредиентами, как в комбинированной терапии. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции включают другие лекарственные или фармацевтические агенты, носители, адъюванты, консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, улучшители растворимости, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции включают другие терапевтически значимые вещества.
В настоящем документе термин "фармацевтическая композиция" относится к смеси ингибитора АК третьего поколения или его фармацевтически приемлемой соли с другими химическими компонентами (т.е. фармацевтически приемлемыми неактивными ингредиентами), такими как носители, эксципиенты,
- 36 029563
связующие, наполнители, суспендирующие агенты, ароматизаторы, подсластители, облегчающие распад таблетки агенты, диспергирующие агенты, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества, красители, разбавители, солюбилизаторы, увлажняющие агенты, пластификаторы, стабилизаторы, улучшители проницаемости, смачивающие агенты, пеногасящие агенты, антиоксиданты, консерванты или одна или более их комбинаций. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения субъекту, такому как млекопитающее.
Терапевтически эффективное количество может изменяться в широких пределах в зависимости от степени тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, эффективности применяемого соединения и других факторов. Соединения можно применять по отдельности или в комбинации с одним или более терапевтическими агентами в качестве компонентов смесей.
Описанные в настоящем документе фармацевтические составы вводят субъекту через соответствующие пути введения, включая, без ограничений, пероральный, парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный), интраназальный, буккальный, топический, ректальный или трансдермальный пути введения. Описанные в настоящем документе фармацевтические составы включают, без ограничений, жидкие водные дисперсии, самоэмульгирующиеся дисперсии, твердые растворы, липосомные дисперсии, аэрозоли, твердые дозированные формы, порошки, составы с быстрым высвобождением, составы с контролируемым высвобождением, быстроплавкие составы, таблетки, капсулы, драже, составы с задержанным высвобождением, составы с продолжительным высвобождением, составы с импульсным высвобождением, многочастичные составы и составы со смешанным быстрым и контролируемым высвобождением.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит один или более дополнительных терапевтически активных агентов, включая, без ограничений, кортикостероиды, противорвотные агенты, анальгетики, противораковые агенты, противовоспалительные агенты, ингибиторы киназ, ингибиторы Н8Р90 и ингибиторы гистондеацетилазы (НЭЛС).
В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество мутантного полипептида АК, предложенного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе.
Терапевтические способы
В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят для лечения заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения АК-зависимого или АК-опосредованного заболевания или состояния у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли.
В некоторых вариантах осуществления предложены способы, включающие введение соединенияингибитора АК третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, субъекту (например, человеку), имеющему заболевание или состояние, которое является АКопосредованным или АК-зависимым. В некоторых вариантах осуществления предложено применение соединения-ингибитора рецептора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, которое является АК-опосредованным или АК-зависимым. В некоторых вариантах осуществления предложено соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, для лечения заболевания или состояния, которое является АК-опосредованным или АК-зависимым. В некоторых вариантах осуществления субъект (например, человек) в настоящий момент получает один или более дополнительных терапевтически активных агентов, отличных от соединения-ингибитора АК третьего поколения.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение одного или более дополнительных терапевтически активных агентов, отличных от соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов. В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтически активных агентов, отличных от соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, выбраны из: гормонов, агонистов или антагонистов рецепторов гормонов, кортикостероидов, противорвотных агентов, анальгетиков, противораковых агентов, противовоспалительных агентов, ингибиторов киназ, ингибиторов Н8Р90, ингибиторов гистондеацетилазы (НОАС). В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения вводят до, одновременно, после или попеременно с одним или более из дополнительных терапевтически активных агентов, отличных от соединения-ингибитора АК третьего поколения.
В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят агонист или антагонист гонадотропинвысвобождающего гормона (ОиКН) в комбинации с соединением-ингибитором АК третьего поколения,
- 37 029563
предложенным в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят агонист рецептора СпКН, такой как лейпролид, бусерелин или гозерелин, в комбинации с соединениемингибитором АК третьего поколения, предложенным в настоящем документе. Агонисты рецептора СпКН вызывают исходное резкое повышение продукции гормона (т.е. "клиническую вспышку") с последующим ингибированием продукции лютеинизирующего гормона, что, в свою очередь, вызывает подавление тестостерона и дигидротестостерона, от которых зависит продолжение роста клеток рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят агонист или антагонист гонадотропин-высвобождающего гормона (СпКН) в комбинации с соединением-ингибитором АК третьего поколения, предложенным в настоящем документе, для лечения АК-зависимого или АК-опосредованного заболевания или состояния, такого как рак предстательной железы, молочной железы, мочевого пузыря или гепатоцеллюлярный рак. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят агонист или антагонист гонадотропин-высвобождающего гормона (СпКН) в комбинации с соединением-ингибитором АК третьего поколения, предложенным в настоящем документе, для лечения кастрационно-резистентного рака предстательной железы (СКРС). В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят соединение-ингибитор АК третьего поколения, предложенное в настоящем документе, для ослабления или ингибирования исходного резкого повышения продукции гормона, вызванного лечением агонистом рецептора СпКН. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения вводят до, одновременно, после или попеременно с агонистом или антагонистом рецептора СпКН.
В некоторых вариантах осуществления АК-зависимое или АК-опосредованное заболевание или состояние представляет собой доброкачественную гиперплазию предстательной железы, гирсутизм, угревую сыпь, аденомы и неоплазмы предстательной железы, доброкачественные или злокачественные опухолевые клетки, содержащие андрогенный рецептор, сверхволосатость, себорею, эндометриоз, синдром поликистоза яичников, андрогенную плешивость, гипогонадизм, остеопороз, подавление сперматогенеза, либидо, истощение, анорексию, андрогенную поддерживающую терапию при возрастном снижении уровней тестостерона, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак эндометрия, рак матки, рак мочевого пузыря, гепатоцеллюлярный рак, приливы, болезнь Кеннеди, мышечную атрофию и слабость, кожную атрофию, утрату костной ткани, анемию, атеросклероз, сердечно-сосудистое заболевание, утрату энергии, утрату хорошего самочувствия, диабет 2 типа или накопление брюшного жира. В некоторых вариантах осуществления АК-зависимое или АК-опосредованное заболевание или состояние представляет собой АК-зависимый или АК-опосредованный рак, такой как, например, рак предстательной железы, молочной железы, мочевого пузыря или печени (т.е. гепатоцеллюлярный рак).
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой гормонозависимый рак. В некоторых вариантах осуществления гормонозависимый рак представляет собой АК-зависимый рак. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ лечения рака дополнительно включает введение млекопитающему по меньшей мере одного дополнительного противоракового агента.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающее не получало лечения противораковым агентом. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающее не получало лечения химиотерапевтическим соединением.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающему вводили один или более противораковых агентов. Примеры противораковых агентов включают, без ограничений, гормональные терапевтические агенты, включая, без ограничений, антагонисты АК первого и второго поколения (например, бикалутамид, флутамид, гидроксифлутамид, нилутамид, АК№509, энзалутамид (МИУ3100) и КО162) и соединения, которые ингибируют продукцию гормонов (например, андрогена), такие как, например, галетерон (ТОК001), ТАК-700 или абиратерона ацетат, химиотерапевтические соединения, антиметаболиты, противораковые антитела, хирургическую, лучевую и гипертермальную терапию. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающему вводили одно или более химиотерапевтических соединений. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной же- 38 029563
лезы у млекопитающего, причем млекопитающему проводили хирургическое лечение. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающему проводили лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающему проводили гипертермальную терапию.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют для лечения рака предстательной железы у млекопитающего, причем млекопитающему проводили один или более курсов лечения противораковым агентом. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой обратный агонист АК, антагонист АК, расщепитель АК, модулятор транспорта АК, ингибитор связывания ДНК АК или их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой обратный агонист АК.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой антагонист АК.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой расщепитель АК.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой модулятор транспорта АК.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой ингибитор связывания ДНК АК.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе описаны способы лечения рака у млекопитающего, включающие введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения-ингибитора АК третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, или его фармацевтически приемлемой соли, причем соединение представляет собой ингибитор синтеза белка АК.
В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к АКХ-509 рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к энзалутамиду (М0У3100) рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к ΡΌ162 рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к абиратерона ацетату рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к галетерону (Т0К001) рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой резистентный к ТАК-700 рак предстательной железы.
Описанные в настоящем документе фармацевтические составы можно вводить субъекту различными способами множеством путей введения, включая, без ограничений, пероральный, парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный), буккальный, топический или трансдермальный пути введения.
Описанные в настоящем документе фармацевтические составы включают, без ограничений, жидкие
- 39 029563
водные дисперсии, самоэмульгирующиеся дисперсии, твердые растворы, липосомные дисперсии, твердые дозированные формы, порошки, составы с быстрым высвобождением, составы с контролируемым высвобождением, быстроплавкие составы, таблетки, капсулы, драже, составы с отсроченным высвобождением, составы с продолжительным высвобождением, составы с импульсным высвобождением, многочастичные составы и составы со смешанным быстрым и контролируемым высвобождением. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АЕ третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят перорально. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АЕ третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят внутривенно.
В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор АЕ третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят топически. В таких вариантах осуществления соединение-ингибитор АЕ третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, составлено в виде различных композиций для местного введения, таких как растворы, суспензии, лосьоны, гели, пасты, шампуни, скрабы, притирания, карандаши с лекарственными препаратами, бандажи с лекарственными препаратами, бальзамы, кремы или мази. Такие фармацевтические соединения могут содержать солюбилизаторы, стабилизаторы, улучшающие тоничность агенты, буферы и консерванты. В одном аспекте антиандрогенное соединение, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят топически на кожу.
В другом аспекте соединение-ингибитор АЕ третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, применяют в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или состояния, в которых активность АЕ вносит вклад в патологию и/или симптомы заболевания или состояния. В одном аспекте заболевание или состояние представляет собой любое из заболеваний или состояний, указанных в настоящем документе.
В любом из указанных выше аспектов дополнительно имеются варианты осуществления, в которых: (а) эффективное количество соединения-ингибитора АЕ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, вводят млекопитающему системно; и/или (Ь) эффективное количество соединения-ингибитора АЕ третьего поколения вводят млекопитающему перорально; и/или (с) эффективное количество соединения-ингибитора АЕ третьего поколения вводят млекопитающему внутривенно; и/или (ά) эффективное количество соединения-ингибитора АЕ третьего поколения вводят млекопитающему путем инъекции; и/или (е) эффективное количество соединенияингибитора АЕ третьего поколения вводят млекопитающему топически; и/или (£) эффективное количество соединения-ингибитора АЕ третьего поколения вводят млекопитающему несистемно или локально.
В любом из указанных выше аспектов имеются дополнительные варианты осуществления, содержащие однократные введения эффективного количества соединения-ингибитора АЕ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, включая дополнительные варианты осуществления, в которых (ί) соединение-ингибитор АЕ третьего поколения вводят однократно; (ίί) соединение-ингибитор АЕ третьего поколения вводят млекопитающему многократно в течение одного дня; (ίίί) непрерывно; или (ιν) постоянно.
В любом из указанных выше аспектов имеются дополнительные варианты осуществления, содержащие многократные введения эффективного количества соединения-ингибитора АЕ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, включая дополнительные варианты осуществления, в которых (ί) ингибитор АЕ третьего поколения вводят непрерывно или попеременно: в виде одной дозы; (ίί) интервал множества введений составляет каждые 6 часов; (ίίί) соединение-ингибитор АЕ третьего поколения вводят млекопитающему каждые 8 ч; (ιν) соединениеингибитор АЕ третьего поколения вводят млекопитающему каждые 12 ч; (ν) соединение-ингибитор АЕ третьего поколения вводят млекопитающему каждые 24 ч. В дополнительных или альтернативных вариантах осуществления способ включает перерыв в приеме лекарственного средства, когда введение соединения-ингибитора АЕ третьего поколения временно приостанавливают или вводимую дозу соединения временно снижают; по окончании перерыва в приеме лекарственного средства дозирование соединения возобновляют. В некоторых вариантах осуществления продолжительность перерыва в приеме лекарственного средства варьируется от 2 дней до 1 года.
Также предложены способы снижения активации АЕ у млекопитающего, включающие введение млекопитающему соединения-ингибитора АЕ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов. В некоторых вариантах осуществления способ включает снижение активации АЕ в клетках предстательной железы у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления способ включает снижение активации АЕ в клетках, отличных от клеток предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления способ снижения активации АЕ включает снижение связывания андрогенов с андрогенным рецептором. В некоторых вариантах осуществления способ снижения активации АЕ включает снижение концентрации АЕ в клетке.
В некоторых случаях в настоящем документе описано применение соединения-ингибитора АЕ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, в производстве лекарственного средства для лечения заболеваний или состояний, которые являются АЕ- 40 029563
зависимыми или ΑΚ-опосредованными. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления ΑΚзависимое или ΑΚ-опосредованное заболевание или состояние описано в настоящем документе.
В некоторых случаях в настоящем документе описано применение соединения-ингибитора ΑΚ третьего поколения, выявленного с применением предложенных в настоящем документе способов, в лечении или профилактике заболеваний или состояний, которые являются ΑΚ-зависимыми или ΑΚопосредованными. В некоторых вариантах осуществления ΑΚ-зависимое или ΑΚ-опосредованное заболевание или состояние описано в настоящем документе.
В любом из описанных в настоящем документе вариантов осуществления млекопитающее является человеком. В некоторых вариантах осуществления описанное в настоящем документе соединениеингибитор ΑΚ третьего поколения вводят человеку.
В некоторых вариантах осуществления описанное в настоящем документе соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения применяют для снижения, ослабления или устранения активности ΑΚ.
В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы ΑΚ третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, представляют собой селективные модуляторы ΑΚ. В некоторых вариантах осуществления соединения-ингибиторы ΑΚ третьего поколения, выявленные с применением предложенных в настоящем документе способов, имеют высокую специфичность к ΑΚ и имеют желательные показатели тканеселективной фармакологической активности. Желательные показатели тканеселективной фармакологической активности включают, без ограничений, активность антагониста ΑΚ в клетках предстательной железы и отсутствие активности антагониста ΑΚ в клетках, отличных от клеток предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе соединения-ингибиторы ΑΚ третьего поколения представляют собой антиандрогены, которые проявляют пренебрежимо малую активность в качестве агониста ΑΚ или не проявляют ее совсем.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены соединенияингибиторы ΑΚ третьего поколения, выявленные с применением описанных в настоящем документе способов, выбранные из активных метаболитов, таутомеров, фармацевтически приемлемых сольватов, фармацевтически приемлемых солей или пролекарств соединения-ингибитора ΑΚ, выявленного с применением описанных в настоящем документе способов.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую соединенияингибиторы ΑΚ третьего поколения, вводят в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, включая, без ограничений, кортикостероиды, противорвотные агенты, анальгетики, противораковые агенты, противовоспалительные агенты, ингибиторы киназ, ингибиторы Н§Р90 и ингибиторы гистондеацетилазы (НЭЛС). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую соединения-ингибиторы ΑΚ третьего поколения, вводят в комбинации с противораковым агентом, включая, без ограничений, гормональный терапевтический агент, включая, без ограничений, антагонисты ΑΚ первого и второго поколения (например, бикалутамид, флутамид, гидроксифлутамид, нилутамид, ΑΚN-509, энзалутамид (М0У3100) и ΚΌ162), соединение, которое ингибирует продукцию гормонов (например, андрогена), такое как ингибитор СΥΡ17Л, включая, например, галетерон (Ί0Κ001), ΊΑΚ-700 или абиратерона ацетат, химиотерапевтические соединения, антиметаболиты, противораковые антитела, хирургическую, лучевую или гипертермальную терапию. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят в одной и той же композиции. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят как отдельные композиции. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят одновременно, последовательно или попеременно. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят через один и тот же путь введения. В некоторых вариантах осуществления соединение-ингибитор ΑΚ третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят через разные пути введения.
Наборы/готовые изделия
Для применения в описанных в настоящем документе диагностических и терапевтических сферах применения в настоящем документе также описаны наборы и готовые изделия. Такие наборы могут содержать носитель, упаковку или контейнер, который разделен на секции для приема одного или более контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т. п., где каждый из контейнеров содержит один из отдельных элементов для применения в способе, описанном в настоящем документе. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки для тестирования. Контейнеры образуют из любого приемлемого материала, включая, например, стекло или пластик.
В некоторых вариантах осуществления предложенные в настоящем документе наборы предназначены для применения при детекции нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид ΑΚ у субъекта, или для детекции мутантного полипептида ΑΚ у субъекта (т. е. представляют собой диагностический набор). В некоторых вариантах осуществления наборы используют для выбора пациентов для лечения антагонистом ΑΚ третьего поколения, для выявления субъектов, резистентных или потенциаль- 41 029563
но резистентных к антагонисту АК первого или второго поколения, для контроля развития резистентности к терапии антагонистом АК первого или второго поколения или их комбинации. Предложенные в настоящем документе наборы содержат один или более реагентов для детекции нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид АК, для детекции мутантных полипептидов АК, для детекции активности АК в клетках субъекта, или их комбинации. Примеры реагентов, без ограничений, включают буферы, реагенты для ПЦР, антитела, субстраты для ферментативного окрашивания, хромогены или другие материалы, такие как покровные стекла, контейнеры, титрационные микропланшеты и необязательно инструкции для выполнения способов. Специалистам в данной области будут известны множество других возможных контейнеров и планшетов, а также реагентов, которые можно применять для приведения в контакт с различными материалами. Наборы также могут содержать контрольные образцы, такие как, например, нуклеиновые кислоты или белки, такие как, например, мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе, или нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантный полипептид АК, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат один или более наборов олигонуклеотидных праймеров для детекции экспрессии эндогенного андрогенного гена.
В некоторых вариантах осуществления контейнеры могут содержать один или более антагонистов АК первого или второго поколения или соединения-ингибиторы АК третьего поколения, выявленные с применением описанных в настоящем документе способов, необязательно в композиции или в комбинации с другим агентом, как описано в настоящем документе. Контейнеры необязательно имеют стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может представлять собой пакет или флакон с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции). Такие наборы необязательно содержат соединение с идентифицирующим описанием, или этикеткой, или инструкциями по их применению в способах, описанных в настоящем документе.
Набор, как правило, содержит один или более дополнительных контейнеров, каждый с одним или более различными материалами (такими как реагенты, необязательно в концентрированной форме, и/или устройства), желательных с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя для применения соединения, описанного в настоящем документе. Не имеющие ограничительного характера примеры таких материалов, без ограничений, включают буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы; этикетки носителя, упаковки, контейнера, флакона и/или пробирки для тестирования с указанием содержимого и/или инструкций по применению, а также листовки-вставки с инструкциями по применению. Как правило, также приложен набор инструкций.
Этикетка может быть нанесена на или приложена к контейнеру. Этикетку можно наносить на контейнер, причем буквы, цифры или другие символы, образующие этикетку, прикреплены, отлиты или вытравлены на самом контейнере; этикетка может быть приложена к контейнеру, если она присутствует в гнезде или носителе, в которых также находится контейнер, например в качестве листовки-вставки. Этикетку можно применять для указания на то, что содержимое необходимо применять в конкретной терапевтической сфере применения. Этикетка также может содержать указания по применению содержимого, например в способах, описанных в настоящем документе.
Предложены готовые изделия, которые включают упаковочный материал, соединение-ингибитор АК третьего поколения, выявленное с применением предложенных в настоящем документе способов, внутри упаковочного материала и этикетку, которая указывает на то, что соединение, или композиция, или его фармацевтически приемлемая соль, таутомеры, фармацевтически приемлемый Н-оксид. фармацевтически активный метаболит, фармацевтически приемлемое пролекарство или фармацевтически приемлемый сольват применяются для снижения, ослабления или устранения воздействий андрогенных рецепторов, или для лечения, профилактики или облегчения одного или более симптомов заболевания или состояния, во время лечения которого можно получить преимущества от снижения или устранения активности андрогенного рецептора.
Продукция резистентных к антиандрогенам клеточных линий В настоящем документе предложены способы продукции клеточных линий рака предстательной железы, резистентных к лечению антагонистом АК. В некоторых вариантах осуществления клеточные линии рака предстательной железы резистентны к лечению АК^509. В некоторых вариантах осуществления клеточные линии рака предстательной железы резистентны к лечению энзалутамидом (МЭУ3100). В некоторых вариантах осуществления созданные предложенным способом резистентные клеточные линии экспрессируют более высокий уровень АК в сравнении с родительской клеточной линией, применяемой для создания резистентной клеточной линии. В некоторых вариантах осуществления созданные предложенным способом резистентные клеточные линии экспрессируют приблизительно в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 раз или более количества АК в сравнении с родительской клеточной линией. В некоторых вариантах осуществления резистентные клеточные линии экспрессируют мутантный белок АК.
В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение клеточной линии рака предстательной железы (т.е. родительской клеточной линии) в контакт с антагонистом АК и культивирование клеток в течение заданного периода времени. В некоторых вариантах осуществления способ включает культивирование клеток в повышающихся концентрациях антагониста АК в течение заданного периода
- 42 029563
времени. В некоторых вариантах осуществления концентрация антагониста АК находится в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мкМ, таком как, например, от 1 до приблизительно 10 мкМ. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют при 0,8, 1,5, 3 и 6 мкМ антагониста АК. В некоторых вариантах осуществления концентрацию антагониста АК повышают в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз. В некоторых вариантах осуществления концентрацию антагониста АК повышают в 3 раза. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют в присутствии антагониста АК в течение 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 1 месяца, 1,5 месяцев, 2 месяцев, 2,5 месяцев, 3 месяцев или более. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют и пересевают каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, каждую неделю или реже. В некоторых вариантах осуществления культуральную среду, содержащую антагонист АК, обновляют каждый день, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дня, каждые 6 дней, каждую неделю или реже. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК представляет собой антагонист второго поколения. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК представляет собой АКЫ-509. В некоторых вариантах осуществления антагонист АК представляет собой энзалутамид (МПУ3100).
В некоторых вариантах осуществления клеточная линия рака предстательной железы представляет собой клеточную линию аденокарциномы предстательной железы человека. В некоторых вариантах осуществления клеточная линия рака предстательной железы представляет собой клеточную линию Ь-НСаР. В некоторых вариантах осуществления в клеточной линии рака предстательной железы наблюдается избыточная экспрессия андрогенного рецептора. В некоторых вариантах осуществления клеточная линия рака предстательной железы представляет собой линию ^NСаР/ЛК(с8) или ^NСаР/АК(с8)-^ис.
Примеры
Данные примеры представлены исключительно в целях иллюстрации и не ограничивают объем формулы настоящего изобретения, представленной в настоящем документе.
Пример 1. Создание резистентной к лекарственному средству клеточной линии ίη νίνο
Клеточные линии, резистентные к лечению антиандрогенным соединением АКГС509, создавали ίη νίνο в мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей кастрационно-резистентной аденокарциномы предстательной железы человека В клеточной линии ЬКСаР/ЛК(с8) наблюдается 3-5кратная избыточная экспрессия андрогенного рецептора (АК) в сравнении с родительской клеточной линией Е-КС71Р. имитируя кастрационно-резистентный рак предстательной железы (Сйеп с1 а1. (2004 г.) №Шгс Мебюше 10:33-39).
Ксенотрансплантаты опухолей ^NСаР-АК(с8) выращивали у кастрированных шестинедельных самцов мышей линии 8СГО На1г1е88 0и1Ьгеб (8Н0, Сйаг1е8 К|уег8 ЬаЬога1опе8). 1х106 клеток ^NСаР-ЛКс8 в смеси 50% бессывороточной КРМ1 и 50% Ма1пце1'™ инжектировали подкожно (100 мкл/животное) в правый бок 10 мышам через 3-5 дней после кастрации. Размер опухоли контролировали ежедневно. Когда опухоли достигали среднего объема ~200 мм3 (приблизительно через 60 дней после инъекции), животным начинали лечение только несущей средой (п=1) или 30 мг/кг АКГС509 (п=9) со схемой дозирования раз в день (т.е. перорально в растворе 15% витамина Е-ТРС8 и 65% 0,5% вес/об. карбоксиметилцеллюлозы (СМС) в 20 мМ цитратном буфере (рН 4,0)). Исходно лечение АКГС509 индуцировало регрессию опухоли. Через приблизительно 75 дней дозирования одна опухоль возобновила рост и превысила размер на момент начала лечения. Когда резистентная опухоль достигла ~800 мм3, мышь умерщвляли и извлекали опухоль. Клетки опухоли диспергировали вручную путем гомогенизации шприцом 3 мл. Клетки опухоли культивировали в КРМ1 с добавлением 10% РВ8 и 10 мкМ АКГС509. Данным способом создали одну резистентную клеточную линию.
Пример 2. Создание резистентных к лекарственному средству клеточных линий ίη νίίτο
Клеточные линии, резистентные к лечению анти-АК-соединениями АКГС509 и МОУ3100, создавали ίη νίίτο с применением клеточных линий кастрационно-резистентной аденокарциномы предстательной железы человека ЬКСаР.
ЬКСаР (АТСС), Ь^аР/АК^) (Сто с1 а1. (2006 г.) Сапсег Се11 0:309-19) и Е^аР/АК-Ьис (Тгап с1 а1. 8с1Спсс (2009 г.) 324 (5928) :787-90; Е^^б-Уем е( а1. (2006 г.) Сапсег Ке8. 66:10513-6) поддерживали в КРМ1 1640 с добавлением 10% РВ8 (ΉνΠοικ). Клетки ЬКСаР (АТСС), ^NСаР/АК(с8) или ^NСаР/АК(с8)Ьис культивировали в повышающихся концентрациях либо АКГС509, либо МИУ3100 в течение 6 месяцев. Исходно 50 мл клеток высевали в сосуд для культивирования клеток 225 см2 в концентрации приблизительно 80000 клеток/мл и выращивали в КРМ1 с добавлением 10% РВ8 в присутствии 800 нМ ЛКN-509 или МИУ3100. Среду и лекарственное средство меняли дважды в неделю и клетки по мере необходимости пассивировали в сосуды для культивирования клеток 75 см2. Концентрацию каждого соединения повышали несколько раз от приблизительно 1,5 мкМ до приблизительно 6 мкМ по мере того, как скорость роста обрабатываемых лекарственным средством клеток повышалась до скорости роста необрабатываемых контрольных клеток. Через приблизительно 6 месяцев селекции в присутствии лекарственного средства клетки поддерживали в КРМ1 с добавлением 10% РВ8 и 6 мкМ АКГС509 или МИУ3100. После селекции получали 10 независимых клеточных линий, резистентных к АКГС509 и
- 43 029563
М1)\'3100. Две линии получали из клеток ^NСаΡ (АТСС), проходивших селекцию в присутствии АК№ 509. Четыре клеточные линии получали из клеток ^NСаΡ/ΛК(сз) - две после обработки АК№509 и две после обработки М1)\'3100. Клетки ^NСаΡ/ΛК(сз)-^ис применяли для получения 4 резистентных клеточных линий - две после обработки АК№509 и две после обработки ΜΏν3100.
Пример 3. Анализы на пролиферацию для тестирования на резистентность к лекарственному средству
Для тестирования на резистентность клеточных линий к обработке АК№509 и ΜΏν3100 проводили анализы на пролиферацию клеток.
Анализы на пролиферацию проводили на всех клеточных линиях, резистентных к АК№509 и ΜΏΥ3100, путем высевания 16 мкл/лунку клеток с плотностью 50000 клеток на мл в не содержащей феноловый красный среде ΕΡΜΙ 1640 (с 5% Сδδ) в 384-луночный планшет для культивирования клеток (плоские черные обработанные ТС полистирольные 384-луночные планшеты с прозрачным дном (Сот1пд)) и инкубировали в течение 2 дней при 37°С. Для анализов на активность в качестве агонистов для каждого соединения готовили 11-точечные полулогарифмические разведения в культуральной среде и добавляли к клеткам по 16 мкл каждого разведения. Для АК№509, ΜΏΥ3100 и бикалутамида анализ проводили при конечной концентрации в диапазоне от 3,16х10-5 М до 3,18х10-10 М, тогда как для синтетического андрогена метилтриенолона (К1881) анализ проводили при конечной концентрации в диапазоне от 3,16х10-8 М до 3,18х10-13 М. Для анализа режима антагониста соединения разводили в культуральной среде, также содержащей 200 пМ К1881 (РетктЫтет, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) (конечная [К1881]=100 пМ), и затем добавляли к клеткам (16 мкл). Через 7 дней непосредственно в клеточные культуры добавляли 16 мкл Се11Т11ег-О1о® Ьиштезееп! Се11 У1аЬШ1у Аззау (Рготеда, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и измеряли люминесценцию в относительных люминесцентных единицах (КЪи) в соответствии с инструкциями производителя.
Для анализа режима агонист процентную долю жизнеспособности образцов рассчитывали следующим образом: % жизнеспособности = 100х([КЬи образца-КБИ среды без клеток]/[КЬи обработанных 1881 клеток-КЪи среды без клеток]) (табл. 1А). Для анализа в режиме антагониста процентную долю жизнеспособности образцов рассчитывали следующим образом: % жизнеспособности = 100х([КЪи образца-КЬи день 0]/[ΕΕϋ обработанных К1881 клеток - КЬИ день 0]) (табл. 1В).
Таблица 1А. Анализ на пролиферацию агониста (% жизнеспособности)
Н1881 Бикалутамид МРУЗ100 ΑΗΝ-509
ЪЫСаР 100, 0 + + +
ЪЫСаР/АН(сз) 100, 0 + + +
Класс 1 100, 0 + + + + + +
Класс 2 100, 0 + + + + +
+ = < 30,
++ = > 30
[К1881]=0,1 нМ, [антагонистов]=10 мкМ
Таблица 1В. Анализ на пролиферацию антагониста (% жизнеспособности) К1881 Бикалутамид ΜΏΥ3100 АК№509
ЬЫСаР 100, 0 + + +
ЬЫСаР/АК(сз) 100, 0 + + +
Класс 1 100, 0 + + + + + +
Класс 2 100, 0 + + + + + +
+ = < 30,
++ = > 30
[К1881]=0,1 нМ, [антагонистов]=10 мкМ
В анализах на пролиферацию как АК№509, так и энзалутамид были полными антагонистами пролиферации во всех трех родительских клеточных линиях 1УСаР (табл. 1А, фиг. 1А). Резистентные клеточные линии разделили на два отдельных класса. В отличие от своих родительских клеточных линий, клетки первого класса линий, резистентных к АК№509 и ΜΟΥ3100 (класс 1), пролиферировали в отсутствие добавленных андрогенов. Лиганд-независимый рост клеток не изменялся в присутствии АК№509, \И)\'3100 или бикалутамида. Синтетический андроген К1881 ингибирует пролиферацию в клетках класса 1 при высоких концентрациях. В отношении данной ингибирующей рост активности К1881 антагонистом является как ΜΏν3100, так и А К N-509, что указывает на то, что АК все еще способен связывать
- 44 029563
МЭУ3100 и ΛΚΝ-509 в данных клеточных линиях.
Резистентные клеточные линии класса 1 включали одну клеточную линию, полученную из ксенотрансплантата опухоли ^NСаΡ-АΚ(с5), 2 клеточные линии, полученные из клеток ^NСаΡ/АΚ(с5), проходивших селекцию в присутствии ΛΚΝ-509, 2 клеточные линии, полученные из клеток ^NСаΡ/АΚ(с5), проходивших селекцию в присутствии МЭУ3100, 2 клеточные линии, полученные из клеток Е-Ж'.'аР/АК(с5)-Ьис. проходивших селекцию в присутствии ΛΚΝ-509, и одну клеточную линию, полученную из клеток ΕΝίτιΡ/ΛΚ^ρΡιια проходивших селекцию в присутствии МЭУ3100.
Резистентные к МЭУ3100 и АК^509 клеточные линии второго класса (класс 2) сохраняли зависимость от андрогена в отношении роста, аналогично их родительским клеточным линиям. Однако в отличие от их активности на родительских клеточных линиях АК^509 и МЭУ3100 могут стимулировать пролиферацию в клеточных линиях класса 2. Однако бикалутамид не стимулировал пролиферацию в клеточных линиях класса 2. Резистентные клеточные линии класса 2 включали две клеточные линии, полученные из клеток Б-ЖАР, проходивших селекцию в присутствии АК^509 (^NСаΡ АК^509г1 и Б-ЖАР АК^509г2), и одну клеточную линию, полученную из клеток ^NСаΡ/АΚ(с5)-^ис, проходивших селекцию в присутствии МЭУ3100 (^NСаΡ ΕΝΖγ2).
Частичная активность в качестве агониста не зависела от соединения, использованного для селекции; АК№509 и энзалутамид показали частичную активность в качестве агониста во всех трех клеточных линиях независимо от соединения, применяемого для получения резистентных вариантов. В соответствии с пролиферативной активностью АК№509 или энзалутамид лишь частично выступали в качестве антагонистов андроген-зависимого роста данных резистентных клеточных линий (табл. 1В, фиг. 1В, С).
Пример 4. Анализы транскрипции репортера для тестирования на резистентность к лекарственному средству
Для тестирования на резистентность клеток к обработке АКЖ509, МЭУ3100 и бикалутамидом проводили анализы транскрипции репортера с применением чувствительного элемента АКЕ, функционально связанного с репортерным геном.
Анализы транскрипции репортера проводили для всех резистентных клеточных линий, высевая 100 мкл клеток с плотностью 250000 клеток/мл в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в КРМ1 1640 с добавлением 5% очищенной на активированном угле сыворотки и оставляя их на ночь при 37°С для закрепления.
За исключением клеток ^NСаΡ/АΚ(с5)-^ис, которые содержат встроенный чувствительный к андрогену репортер, клетки временно трансфицировали с применением ЫроГесЬп® (ЫГе ТесЬпо1од1е5) в соответствии с протоколом производителя. Для клеток Б-Ж'.'аР и ^NСаΡ/ΛΚ(с5) проводили тройные трансфекции, применяя 428 нг вектора репортера (рСЬ4 РЬ-люцифераза (промотор пробазина крысы в рСЬ4 (Рготеда, г. Мэдисон, штат Висконсин, США))), 50 нг рКЬ-СМУ (вектор нормализации, Рготеда, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) и 0,7 мкл ЫроГесЬп®. После трансфекции клетки инкубировали в течение 4 ч.
Затем клетки обрабатывали тестируемыми соединениями - АКЖ509, МЭУ3100 и бикалутамидом. Для анализов на активность в качестве агонистов соединения последовательно разводили и добавляли 50 мкл соединения плюс КРМ1 1640 с добавлением 5% очищенного на активированном угле РВЗ к клеткам. Для анализов на активность в качестве антагонистов соединения последовательно разводили и добавляли 50 мкл соединения плюс КРМ1 с добавлением 5% очищенной на активированном угле сыворотки плюс 3 нМ К1881 к клеткам. Через 48 ч инкубации среду удаляли и клетки лизировали в 40 мкл буфера для лизирования (25 мМ Тп5-фосфатный, 2 мМ СОТА, 10% глицерина, 0,5% ТгЪоп Х-100, 2 мМ ЭТТ). Измеряли активность люциферазы светляка непосредственно после добавления 40 мкл люциферазного буфера (20 мМ трицин, 0,1 мМ ЭДТА, 1,07 мМ (МдСо3)4 Мд(ОН)2-5Н2О, 2,67 мМ МдЗО4, 33,3 мМ ЭТТ, 270 мкМ кофермента А, 470 мкМ люциферина, 530 мкМ АТФ). Люциферазу КепШа измеряли после добавления 40 мкл коэлентеразинового буфера (1,1 М №С1, 2,2 мМ №2 ЭДТА, 0,22 М КХРО4 (рН 5,1), 0,44 мг/мл БСА, 1,3 мМ NаN3, 1,43 мкМ коэлентеразина, конечная рН доведена до 5,0).
Два класса резистентных к АК^509 и МЭУ3100 клеточных линий, выявленных в анализах на пролиферацию, также показывали различные свойства в транскрипционных анализах. В анализах временной трансфекции с применением в качестве репортера рСЬ4 РЬ-люциферазы или анализах с применением в качестве репортера встроенной пробазин-люциферазы (т.е. в клетках, полученных из ^NСаΡ/АΚ(с5)-^ис) АКЖ509 и МЭУ3100 оказались эффективными антагонистами в андрогеннезависимых резистентных клетках класса 1, что проявлялось снижением активности люциферазы в сравнении с контролями без обработки (табл. 2). Однако бикалутамид показал повышенную активность в качестве агониста в резистентных клетках класса 1 в сравнении с родительскими клетками. В резистентных клетках класса 2 МЭУ3100 был слабым частичным агонистом в анализе с пробазин-люциферазой в качестве репортера, в то время как бикалутамид и АК^509 не показали активности в качестве агониста.
- 45 029563
Таблица 2А. Анализ транскрипции репортера как агониста (% макс. активности) К1881 Бикалутамид МЭУ3100 АК№509
ЪЫСаР > 90 + + +
ЪЫСаР/АК(сз) > 90 + + +
Класс 1 > 90 + + + +
Класс 2 > 90 + + + +
+ = < 5,
++ = > 5
[К1881]=10 нМ, [антагонистов]=50 мкМ
Таблица 2В. Анализ транскрипции репортера как антагониста (% макс. активности) К1881 Бикалутамид МЭУ3100 АК№509
ЬЫСаР > 90 + + +
ЬЫСаР/АК(сз) > 90 + + +
Класс 1 > 90 + + + + +
Класс 2 > 90 + + + +
+ = < 5,
+ + = > 5
[К1881]=10 нМ, [антагонистов]=50 мкМ
Пример 5. Анализ транскрипции эндогенных генов
Изучали воздействие обработки К1881, МЭУ3100 и бикалутамидом на транскрипцию эндогенного
гена.
Анализ транскрипции эндогенных генов проводили для всех резистентных линий, высевая 0,5 мл клеток с плотностью 500 000 клеток/мл в 24-луночные планшеты в КРМ1, содержащей 5% очищенный на активированном угле РВ8 (с пониженным содержанием гормона) и выращивая клетки в течение 3 дней при 37°С. Затем клетки обрабатывали в течение 24 ч 10 нМ К1881, 30 мкМ МИУ3100 или 30 мкМ бикалутамида.
Выделяли общую РНК с применением набора для выделения общей РНК Аигит™ (ВЮ-КАИ, г. Геркулес, штат Калифорния, США). С РНК (1 мкг) проводили обратную транскрипцию, применяя набор для синтеза кДНК |8сг1р1 (ВЮ-КАИ, г. Геркулес, штат Калифорния, США), для получения кДНК. Затем проводили ПЦР в реальном времени с применением прибора АррНей Вю8у81:ет8 7900НТ и мастер-микса 8УВК Огееп РСК Маз1ег М1х (АррНей Вю8у81:ет8, г. Фостер Сити, штат Калифорния, США). ПЦРреакции проводили в 6 мкл в соответствии с протоколом производителя и протоколом термоциклирования: 95°С в течение 10 мин, затем 40 циклов по 95°С в течение 15 с и 58°С в течение 1 мин. Экспрессию чувствительных к андрогенам генов (ПСА, 8ЬиО, ТМРК882, 8ТЕАР4, РКВР5, ОКМ1, ΝΟν, ΓΆ8Ν, ΝΚΧ3.1, АМЮО2, βΟΝΓ, САМК2М, НРОИ, \СА1’1)3, РБШ) нормировали на экспрессию ОАРИН и выражали относительно обработанных несущей средой родительских клеточных линий. Результаты по относительной экспрессии представлены в табл. 3А. Использованные для ПЦР праймеры приведены в табл. 3В.
Для эндогенных чувствительных к андрогенам генов получали аналогичные показатели селективной активности в качестве агониста для соединений и классов, но в контексте эндогенных генов транскрипционная активность МЭУ3100 проявляется более выраженно (табл. 3). В резистентных клетках класса 1 бикалутамид демонстрирует выраженную транскрипционную активность, а МЭУ3100 является слабым агонистом транскрипции. В отличие от этого, в резистентных клетках класса 2 бикалутамид является слабым агонистом транскрипции, в то время как МЭУ3100 демонстрирует выраженную активность в качестве агониста транскрипции на тестируемых генах.
- 46 029563
Таблица 3А. Активность в транскрипции эндогенных генов (кратность отн. несущей среды)
ПСА зьис ТМРН552 ЗТЕАР4 БКВР5 ОКМ1 Νον
ДМСО 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
ЬБСаР Н1881 ++ +++ ++ ++++ ++ +++ —
Бикалутамид + + + + + - +
МБУЗЮО + + + - + + +
ДМСО 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
ЬБСаР/ Н1881 +++ +++ ++ ++++ ++ ++++ —
АК(сз) Бикалутамид ++ + + ++ + +++ +
МБУЗЮО + + + + + + +
ДМСО 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Класс 1 Н1881 ++ +++ + ++++ +++ ++++ —
Бикалутамид + +++ + +++ ++ ++ +
МБУЗЮО + + + + + + +
Класс 2 ДМСО 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Н1881 +++ +++ ++ ++++ +++ ++++ —
Бикалутамид + + + + + + +
МБУЗЮО +++ +++ ++ +++ ++ +++ -
[К1881]=10 нМ, [антагонистов]=30 мкМ
-- < 0,1, - = 0,1 - 1, + = 1 - 10, ++ = 10 - 50, +++ 50-500, ++++ > 500
Таблица 3В. Последовательность олигонуклеотидов для проведения ПЦР
в реальном времени для транскрипционного анализа
Ген Последовательность прямого праймера Последовательность обратного праймера
АМ1СО2 АСАСАСТ САСАССССАС САТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 20) АТ САССАААСАС АССАС С Т С (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 21)
ΒΌΝΕ АСАСС Т С Τ Т ССАТ САССАССАСАА (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 22) АСССТССАААСССАСТТСАСТАСТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 23)
ΟΑΜΚ2Ν1 САССДАСССССТТСТТАТТСА (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 24) ТСССТТСТСССТСАТАТТТТТСА (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 25)
ЕКВР5 СССАСААССАААСССАААСС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 26) СТТСССССАСАСТСААТСС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 27)
НРСБ АСАССАСССССТТТАТТСТССТТС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 28) ТСССАТ Т САСТС Т САСАССАС Т СТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 29)
ΝΟΑΡΌ3 АС САС Т САС САТ САТ С Т СААСС СА (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 30) ТССТСТТСТТТСССАСАТССТССТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 31)
ΝΟν СССТТАСССТТССАССТТАС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 32) САССАТССТСТССАСТСТСТ (ЗЕО ΙΌ N0: 33)
ОКМ1 СТТССССАТТСССААСТСАСАТСТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 34) ТТТССТСТССТТСТССТССТССТТ (ЗЕО ΙΌ N0: 35)
РЪО1 САСС С Т СС Т АСАСАТ СС Т СА (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 36) Т СТ С ТАС САССАССАС СААС (ЗЕО ΙΌ N0: 37)
ПСА ССТССТСААСААТССАТТСС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 38) САССТССАСАСАСТСААСТТ (ЗЕО ΙΌ N0: 39)
зъис ТТТСТССССТССССАААСАТААСС (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 40) АСАСААССТААТСТСТСССТСССА (ЗЕО ΙΌ N0: 41)
ЗТЕАР4 ССССАССТСТТТСТСТСТССАААТ (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 42) АСААСАСАСАСАССАСАССАСАСА (ЗЕО ΙΌ N0: 43)
- 47 029563
ТМРН332 ТАСТСАААССАСТСТСТСТССССА (ЗЕО ΙΌ N0: 44) АСССТТСАССАСТТСТСАССТСТТ (ЗЕО Ю N0: 45)
ΕΑ3Ν СССТСТССТТСАТСТССТСТС (ЗЕО ΙΌ N0: 46) ТСАТСАААССТССТСТССТСТС (ЗЕО ΙΌ N0: 47)
ΝΚΧ3.1 ТССАСАССААСТ Т САСС С АТ С АСА (ЗЕО ΙΌ N0: 48) АССАСАССТССТТТСССТТАСТСТ (ЗЕО ΙΌ N0: 49)
В отдельном эксперименте анализировали экспрессию следующих генов в клетках ^NСаР, Ь^аР/АК(св), Ь^аР/АК-Ьис, ЬЖаР АК№509г1, ЬЖаР АК№509г2 и Ь^аР/АК-Ьис ΕΝΖγ2: РЬЭ, САМ2КН ΝΟν, ΒΌΝΕ, АМ1СО2, ΕΆδΝ, ТМРК882, ΝΚΧ3.1, ПСА, ЕКВР5, НРСЦ Ν^ΡΌ3, ЗЬИС, 8ТЕАР4 и ОКМ. Клетки культивировали в течение 3 дней в среде с пониженным содержанием гормона и затем обрабатывали несущей средой - 1 нМ К1881 или 30 мкМ соединения. Экспрессию генов нормировали на САРЭН, как описано выше. Полученные результаты представлены в табл. 4А и 4Β.
Таблица 4А. Транскрипция клеток ^NСаР, ^NСаР/ΛК(сδ) и резистентной линии
ЪЫСаР Ъ№ЗаР/АК(с5) ЫГСаР ΑΚΝ-509γ1
Ген Несущая среда ΑΚΝ509 ΕΝΖ Н1881 Несущая среда ΑΚΝ509 ΕΝΖ Н1881 Несущая среда ΑΚΝ509 ΕΝΖ Н1881
АМ1С02 1,00 1,12 1,20 0, 68 1,00 0, 72 1,13 0, 54 1,00 0, 62 0, 99 0,21
ΒϋΝΕ 1,00 1,09 0, 85 0, 40 1,00 0, 85 1,13 0, 48 1,00 0, 90 1,58 0, 31
0ΑΜ2ΚΝ1 1,00 1,17 1,39 0, 13 1,00 0, 80 1,11 0, 05 1,00 0, 37 0, 59 0, 01
ΓΑ5Ν 1,00 1,34 1,24 5, 58 1,00 0, 75 1,19 7,11 1,00 1,04 1,53 3, 12
ЕКВР5 1,00 0, 99 1,04 54,95 1,00 0, 99 1,71 97,01 1,00 2,58 9, 45 53, 45
НРСО 1,00 1,48 1,78 100,43 1,00 1,18 2,01 183,55 1,00 2,36 10,20 61,39
ЫСАРОЗ 1,00 1,16 1,20 104,69 1,00 0, 91 1,22 93, 05 1,00 1,29 3, 12 90, 51
ΝΚΧ3.1 1,00 0, 90 1, 66 30, 06 1,00 1,13 2,51 8,82 1,00 6, 54 11,55 8,11
ЫОУ 1,00 1,73 2,57 0, 15 1,00 1,04 1,27 0, 04 1,00 1,40 1,39 0, 03
0КМ1 1,00 0, 71 1,13 873,10 1,00 0, 84 3, 58 3444,31 1,00 15, 89 205,07 1296,13
РЬ01 1,00 1,09 0, 70 0, 02 1,00 1,04 0, 65 0, 02 1,00 0, 33 0,24 0, 03
ПСА 1,00 0, 66 1, 69 47,84 1,00 1,43 2, 69 19, 16 1,00 32, 67 57, 68 85, 63
зъис 1,00 1,27 2,35 129,79 1,00 1,03 2,06 89, 88 1,00 4, 66 42,52 164,28
ЗТЕАР4 1,00 0,78 1,54 639,15 1,00 0, 90 1,95 1314,23 1,00 3, 03 32,22 1184,45
ТМРН332 1,00 0, 77 1, 68 22,16 1,00 1,06 2,36 17,51 1,00 10,20 23, 75 37,27
ЪЫСаР Ъ№СаР АРЫ-509г2
Ген Несущая среда ΑΚΝ509 ΕΝΖ Н1881 Несущая среда ΑΚΝ509 ΕΝΖ Н1881
АМ1СО2 1,00 1,12 1,20 0, 68 1,00 0, 67 0, 63 0, 55
ΒΌΝΕ 1,00 1,09 0, 85 0,40 1,00 1,04 0,77 0, 47
САМ2КЫ1 1,00 1,17 1,39 0, 13 1,00 0,46 0,38 0, 02
ΕΑ3Ν 1,00 1,34 1,24 5,58 1,00 0, 98 0, 93 4,82
ЕКВР5 1,00 0, 99 1,04 54,95 1,00 8,00 3, 41 48,50
НРСБ 1,00 1,48 1,78 100,43 1,00 1,49 4,56 59, 30
ΝΟΑΡΌ3 1,00 1,16 1,20 104,69 1,00 1,13 1,35 54,95
ΝΚΧ3.1 1,00 0, 90 1, 66 30, 06 1,00 3, 73 6,28 10,20
ΝΟν 1,00 1,73 2,57 0, 15 1,00 1,39 0,71 0, 07
ОРМ1 1,00 0,71 1,13 873,10 1,00 3, 94 23, 75 625,99
ΡΣΌΙ 1,00 1,09 0,70 0, 02 1,00 0, 81 0,29 0, 02
ПСА 1,00 0, 66 1, 69 47,84 1,00 1,91 2,48 7,89
зъис 1,00 1,27 2,35 129,79 1,00 1,31 9,58 77,17
ЗТЕАР4 1,00 0,78 1,54 639,15 1,00 1,45 4, 69 377,41
ТМРН332 1,00 0, 77 1, 68 22,16 1,00 3, 07 4,86 15, 14
- 48 029563
Таблица 4В. Транскрипция в ^NСаΡ/АК-^ис и 1ХСаР/АК-Ьис ΕΝΖγ2
ЬЫСаР/АН-Ьис ЬЫСаР/АН-Ьис ΕΝΖγ2
Ген Несущая среда ΑΗΝ509 ΕΝΖ Н1881 Несущая среда ΑΗΝ509 ΕΝΖ Н1881
ΑΜΙ6Ο2 1,00 1, 13 1,44 0,54 1,00 0, 99 0,78 0,49
ΒΏΝΕ 1,00 1,17 1,08 0, 18 1,00 0,56 0,44 0, 12
ΟΑΜ2ΚΝ1 1,00 1, 13 1,51 0, 11 1,00 0, 65 0,57 0, 11
ΓΑ5Ν 1,00 1,08 1,40 3,48 1,00 1,72 1,20 4,44
ЕКВР5 1,00 1,16 1,46 20, 82 1,00 2,46 3, 03 23,43
ΗΡΟϋ 1,00 1,88 2,51 2,41 1,00 1,22 1, 61 1,39
ΝΟΑΡϋ3 1,00 1, 09 1,33 17,27 1,00 1,38 1,39 31,12
ΝΚΧ3.1 1,00 1,14 1, 68 11,24 1,00 4,82 5,21 10, 13
ΝΟν 1,00 2,55 1,95 0,47 1,00 1,21 1,20 0,27
ΟΚΜ1 1,00 1,27 1,39 7,89 1,00 15, 24 17,88 347,29
РЬО1 1,00 1,45 1,33 0, 15 1,00 0,46 0,74 0,21
ПСА 1,00 0, 60 0,44 2,10 1,00 4,59 3,48 16, 91
зьис 1,00 1, 13 2,73 48,84 1,00 5, 98 12,30 160,90
ЗТЕАР4 1,00 0, 88 1,23 20,25 1,00 1, 66 4,38 79, 89
ТМРН332 1,00 0,74 1,35 3,46 1,00 4,44 4,23 7,73
Пример 6. Анализы на механизмы резистентности
Матрица СОН, создание профиля экспрессии мРНК и анализ последовательностей полученных от пациента опухолей при раке предстательной железы, а также множество животных моделей и моделей т νΐΐΐΌ предполагают множество путей прогрессирования рака до кастрационно-резистентного состояния. Тремя из наиболее часто активируемых путей, выявленных в кастрационно-резистентном раке предстательной железы, являются пути Р13К, Ка£ и АК. В данном примере с помощью вестерн-блоттинга оценивали фосфорилирование Ак! и Егк для оценки состояний активации путей Р13К и Ка£ соответственно.
Для оценки режима резистентности к лекарственному средству в клеточных линиях класса 1 и класса 2 провели анализ "вестерн-блоттинг" для оценки уровней белка АК и состояния активации нескольких клеточных сигнальных путей, о которых известно, что они модулируют активность АК и часто активируются в кастрационно-резистентном раке предстательной железы.
Определяли относительную экспрессию АК, Ак!, фосфорилированного Ак! (5ег473), р44/42 МАРК (Егк1/2), фосфорилированного р44/42 МАРК (Егк1/2) (Тйг202/Туг204), тубулина и актина.
Для проведения анализа "вестерн-блоттинг" клетки выращивали в КРМ1 1640 с добавлением 5% очищенной на активированном угле сыворотки в течение 3 дней. Клетки лизировали в модифицированном буфере для радиоиммунопреципитации (тК1РА; 10 мМ Тпз, 150 мМ №С1, 1% (об./об.) №-40, 0,5% дезоксихолата, 0,1% δϋδ, 5 мМ ЭДТА, рН 7,4), содержащем коктейль На1!™ Рго!еазе апй РИокрИаНаке 1пЫЫ!ог Соск!аП (Тйегто δс^еη!^ίϊс). Общее количество белка в очищенных лизатах определяли методом Лоури (анализа на белок Вюгай ЭС). К лизатам добавляли образец буфера №РАОЕ® Εϋδ δатр1е ВиП'ег и восстанавливающий образец агент δатр1е Кейистд Адеп! и нагревали до 70°С в течение 10 минут. По 20 мкг общего клеточного белка отделяли на 4-12% бистрисакриламидном геле №РАОЕ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, применяя модуль для блоттинга Хсе11 II™ (1пу1!годеп). Мембраны инкубировали в блокирующий буфер В1осктд ВиП'ег (Ы-С0К, г. Линкольн, штат Небраска, США) в течение 30 минут при комнатной температуре с последующими 60-минутными инкубациями с первичными антителами к андрогенному рецептору (Лап1а Сги/ Вю!есйпо1оду, № по кат. δΟ816), Ак! и Рйокрйо-Ак! ^ег473) (Се11 δ^дηа1^ηд, № по кат. 9272 и 4058 соответственно), р44/42 МАРК (Егк1/2) и Рйокрйо-р44/42 МАРК (Егк1/2) (Тйг202/Туг204) (Се11 δ^дηа1^ηд, № по кат. 4695 и 4376δ соответственно) и тубулину или актину ^1дта, № по кат. Т6199 и А4700 соответственно). После инкубации с конъюгированными козьими антителами к 1дО мыши или кролика ГКЭуе® Сощида!ей Ооа! Ап!1 Мойке ог КаЬЫ! 1дО (Ы-С0К) полосы белков количественно оценивали с применением системы ИК-визуализации Ойуккеу® 1п!гагей 1тадтд δуδ!ет.
По результатам вестерн-блоттинга уровни АК в резистентных линиях класса 1 были приблизительно в 2-4 раза выше, чем наблюдавшиеся в клеточной линии ^NСаΡ/АК(сδ) (фиг. 2). Аналогично тому, как приблизительно 3-кратный рост уровней АК является достаточным для поддержания роста клеток ^NСаΡ в условиях кастрации т νι\Ό, дополнительное 2-4-кратное повышение уровней АК может быть достаточным для стимулирования пролиферации в отсутствие андрогенов т νίύΌ. В отличие от этого, уровни АК-резистентных линий класса 2 были аналогичны уровням, наблюдавшимся в родительских
- 49 029563
клеточных линиях. Таким образом, превращение энзалутамида и АКК-509 в частичные агонисты в клеточных линиях класса 2 не было связано с избыточной экспрессией АК. Наблюдались небольшие различия в уровнях общих и фосфорилированных Ак! и Егк без согласованных изменений, наблюдаемых в любом классе резистентных клеточных линий.
Пример 7. Определение последовательности мутантного АК
МБУ3100 и АКХ-509 являются транскрипционными и пролиферативными агонистами в резистентных клеточных линиях класса 2, в то время как бикалутамид остается антагонистом. Экспрессия АК в резистентных клетках класса 2 была аналогична экспрессии в родительской клеточной линии (пример 6). Таким образом, определяли последовательность АК в резистентных клетках класса 2 для установления того, стимулирует ли мутация лиганд-связывающего домена АК повышение функциональной активности.
В качестве матрицы для секвенирования АК применяли кДНК, полученную обратной транскрипцией РНК, выделенной из клеток класса 1 и класса 2 (см. пример 5). Применяя серию олигонуклеотидов, с помощью ПЦР создали перекрывающиеся сегменты, охватывающие лиганд-связывающий домен АК (с. 2013-2757), применяя полимеразу Рйикюп® (Яете Епд1апй Вю1аЬк) и следуя протоколу производителя. Продукты ПЦР очищали на геле для удаления неспецифических полос, а также невстроенных олигонуклеотидов. Очищенные продукты ПЦР секвенировали с применением внутренних олигонуклеотидов.
В трех независимо полученных клеточных линиях была выявлена одна мутация нуклеиновой кислоты внутри лиганд-связывающего домена АК в нуклеотидной позиции 2626. Выявленная во всех линиях мутация с потерей смысла представляла собой замену тимина (Т) на цитозин (С), что превращает фенилаланин (Р) в аминокислотной позиции 876 кодированного полипептида в лейцин (Ь) (8ЕЭ ГО ΝΟ:19). Кроме того, секвенирование индивидуальных субклонированных продуктов ПЦР из клеточной линии ЕХСаР/АК-Еис ЕХ2г2 указывало на то, что во всех клеточных линиях мутация Р876Ь возникала в эндогенном аллеле АК.
Р876 лежит на спирали 11 в области лиганд-связывающего кармана АК, который представляет собой горячую точку мутаций АК при кастрационно-резистентном раке предстательной железы (фиг. 1Ό). Однако в отличие от Т877 и Ь701, которые координируют образование водородной связи с группой 17аОН дигидротестостерона, Р876 участвует в образовании небольшого гидрофобного ядра, образованного остатками в спирали 11 (Р786, Ь880), петлях между спиралями 11 и 12 (Р891) и спирали 3 (Р697, Ь701). Хотя аналогичные остатки и гидрофобные лигандные взаимодействия сохраняются в эстрогеновом и прогестероновом рецепторе, участие Р876 в высокоаффинном связывании или селективности к стероидам не предполагается. В соответствии с относительно малой прогнозируемой ролью Р876 в связывании стероидов о мутации АК-Р876Ь в популяциях с раком предстательной железы или нечувствительностью к андрогенам сообщений не было.
Пример 8. Экспрессия мутантного АК в АК-дефицитных клетках
Чтобы подтвердить, что мутация Р876Ь придает АКХ-509 и МБУ3100 активность в качестве агониста, создали точечную мутацию в контексте полноразмерного АК дикого типа и мутантного рецептора ЕХСаР Т877А. Мутанты с Р876Ь и Р876Ь/Т877А создали в плазмиде рс^NΑ3-ΑК, применяя набор для сайт-направленного мутагенеза ОшскСНапде II §йе-01гес!ей Ми!адепек1к Κι! (Адйеп! ТесНпо1од1ек, г. Санта Клара, штат Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.
Для тестирования транскрипционной активности мутантного АК в ответ на лечение АКХ-509, МБУ3100 и бикалутамидом провели анализы транскрипции репортера с применением чувствительного элемента АКЕ, функционально связанного с репортерным геном.
Анализы транскрипции репортера проводили, высевая 100 мкл клеток НЕРО2 с плотностью 250 000 клеток/мл в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в МЕМ с добавлением 10% очищенной на активированном угле сыворотки и оставляя их на ночь при 37°С для закрепления.
Клетки временно трансфицировали с применением ЫроЕесйп® (ЫЕе ТесНпо1од1ек) в соответствии с протоколом производителя. Проводили тройные трансфекции, применяя 378 нг вектора репортера (4Х АКЕ-люцифераза или рОЬ4 РЬ-люцифераза (промотор пробазина крысы в рОЬ4 (Рготеда, г. Мэдисон, штат Висконсин, США)), 50 нг рсБХА-АК (дикого типа или мутантного), 50 нг рКЬ-СМУ (вектор нормализации) и 0,7 мкл ЫроЕесйп®. После трансфекции клетки инкубировали в течение 4 ч.
После инкубации клетки обрабатывали тестируемыми соединениями - АКХ-509, МБУ3100 и бикалутамидом. Для анализов на активность в качестве агонистов соединения разводили 1:6 и добавляли 50 мкл соединения в МЕМ с добавлением 5% очищенного на активированном угле РВ§ к клеткам до конечной концентрации в диапазоне от 30 мкМ до 0, 64 нМ. Для анализов на активность в качестве антагонистов соединения последовательно разводили с 1 нМ К1881 (для АК дикого типа) или 5 нМ К1881 (для АК Р876Ь).
Через 48 ч инкубации среду удаляли и клетки лизировали в 40 мкл буфера для лизирования (25 мМ Тпк-фосфатный, 2 мМ СБТА, 10% глицерина, 0,5% Тгйоп Х-100, 2 мМ ЭТТ). Измеряли активность люциферазы светляка непосредственно после добавления 40 мкл люциферазного буфера (20 мМ трицин, 0,1 мМ ЭДТА, 1,07 мМ (МдСо3)4 Мд(ОН)2-5Н2О, 2,67 мМ Мд§О4, 33,3 мМ БТТ, 270 мкМ кофермента А, 470
- 50 029563
мкМ люциферина, 530 мкМ АТФ). Люциферазу КепШа измеряли после добавления 40 мкл коэлентеразинового буфера (1,1 М №С1, 2,2 мМ Ν2 ЭДТА, 0,22 М КХРО4 (рН 5,1), 0,44 мг/мл БСА, 1,3 мМ ΝΝ3, 1,43 мкМ коэлентеразина, конечная рН доведена до 5,0).
В анализах временной трансфекции антагонисты АК второго поколения АК№509 и МЭУ3100 индуцировали АК-зависимую транскрипционную активность в контексте мутантного АК Р876Б или Р876Б/Т877А, тогда как бикалутамид вызывал минимальную индукцию (табл. 5). Например, в клетках НерО2 с применением в качестве репортера либо 4ХАКЕ-люциферазы, либо РЬ-люциферазы АК^509 и МЭУ3100, но не бикалутамида, индуцировали АК-зависимую транскрипционную активность в контексте мутантного АК Р876Б или Р876Б/Т877А. Это указывает на то, что механизмом резистентности в клеточных линиях класса 2 является мутация АК Р876Б.
Таблица 5. Транскрипционная активность АК (кратность относительно ДМСО)
К1881 Бикалутамид МБУЗ100 (энзалутамид) ΑΚΝ509
АК дикого типа + + + + + +
АК Г876Ь + + + + + + + +
+ = < 20, ++ = 10-200, +++ > 200
[К1881] = 100 нМ, [антагонистов] =6,3 мкМ
Для подтверждения описанных выше результатов провели' второй эксперимент с 4Х-АКЕлюциферазой в качестве репортера. В данном эксперименте наряду с бикалутамидом, АК№509 и энзалутамидом также сравнивали антиандрогены первого поколения - нилутамид и гидроксифлутамид. Анализы транскрипции репортера АК проводили по существу, как описано выше, с небольшими модификациями. Проводили тройные трансфекции, применяя 50 нг ΡС^NΛ3-ΛΚ или мутанта рС^NЛ3-ЛΚ, 65 нг 4Х АКЕ-люциферазы, 20 нг рКЬ (Рготеда) и 25 нг рСМХ. Для анализов на активность в качестве агонистов соединения последовательно разводили и добавляли 50 мкл соединения плюс КРМ1 1640 с добавлением очищенной на активированном угле сыворотки к клеткам. Для анализов на активность в качестве антагонистов соединения последовательно разводили и добавляли 50 мкл соединения плюс КРМ1 с добавлением очищенной на активированном угле сыворотки плюс метилтриенолон (К1881) к клеткам. Конечная концентрация К1881, применяемая в анализах на активность в качестве антагониста, составляла 1 нМ, за исключением Р876Б, для которого применяли 5 нМ К1881.
Как показано на фиг. 4, в контексте АК дикого типа АК№509 и энзалутамид были полными антагонистами и имели минимальную активность в качестве агониста в анализах андрогенчувствительной транскрипции репортера 4Х-АКЕ. Однако в клетках, экспрессирующих АК-Р876Б или АК Р876Б/Т877А, энзалутамид и АК№509 были частичными агонистами транскрипции (фиг. 4А). И наоборот, антиандрогены первого поколения бикалутамид, нилутамид и гидроксифлутамид проявляли минимальную активность в качестве агониста на мутанте Р876Б (табл. 6, фиг. 4) (Етах = процентная доля от максимального ответа на К1881). Энзалутамид и АК№509 были полными антагонистами на мутантах АК Т877А, Б701Н, IΙ874Υ и У741С, которые либо придавали резистентность к антагонистам АК первого поколения, либо расширяли специфичности к стероидным лигандам у пациентов с кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
Таблица 6
Анализ репортера 4Х АКБ
Соединение Дикий тип, 1С50 (ОМ) Дикий тип, Етах Б876Б 1С50 (□М) Б876Б Етах
ΑΚΝ-509 0,79±0,15 1,3±0,3 0,09±0,06 49,7±11,1
Энзалутамид 1,12±0,17 0,4±0,1 0, 13±0,04 20,2±5,2
Бикалутамид 1,65±0,93 10,0±2,9 3,63±0,04 0,7±0,3
Гидроксифлутамид 0,36±0,04 28,9±5,0 2,60±6,61 0,8±0,2
Нилутамид 1,11±0,17 5,1±2,1 7,59±1,18 0,6±0, 1
Для тестирования на компетентность связывания ДНК мутантами Р876Б создали слитые конструкты УР16-АК. рУР16-АК создали путем субклонирования АК человека с полной длиной в рУР16 (С1оп1есБ). Точечные мутации АК создали в УР16-АК с применением набора для сайт-направленного мутагенеза ОшскСИапде II 8Ие-01гес1ед Ми1адепе§18 КН (АдИен! ТесНпо1од1е§, г. Санта Клара, штат Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.
Анализы транскрипции проводили по существу, как описано выше. Проводили тройные трансфекции, применяя 35 нг рУР16-АК или рУР16-Р876Ь, 70 нг 4Х АКЕ-люциферазы, 20 нг рКР (Рготеда) и 35
- 51 029563
нг рСМХ. Активность репортера 4Х АКЕ-люциферазы контролировали в присутствии повышающихся концентраций соединения в отсутствие или в присутствии 90 пМ К1881 (для УР16-АК дикого типа) или 1 нМ К1881 (для УР16-АК Р876Ь). Активность люцифераз измеряли, как описано выше.
В соответствии с результатами анализа транскрипции репортера в анализе УР16-АК дикого типа, в котором контролировали компетентность связывания ДНК рецептором, энзалутамид и АКА-509 были полными антагонистами (табл. 7, фиг. 4) (Етах = процентная доля от максимального ответа на К1881). Однако в контексте УР16-АК-Р876Ь, АКА-509 и энзалутамид стимулировали связывание ДНК АК. Таким образом, мутация АК Р876 на Ь была достаточной для превращения антиандрогенов 2-го поколения, энзалутамида и АКА-509 в частичные агонисты.
Таблица 7
ΑΗ-ΥΡ16
Соединение Дикий тип, 1С50 (□М) Дикий тип, Етах Е87бЬ 1С50 (ПМ) Е87бЬ Етах
ΑΗΝ-509 0,1б±0,Об 3,98±0,27 0,03±0,02 53,98±1,45
Энзалутамид 0,21±0,07 2,65±О,73 0,05±0,01 34,32±5,38
Бикалутамид 0, 18±0,10 32,77±5,76 2,51±1,11 2,20±1,35
Гидроксифлутамид 0,03±0,01 42,2814,44 0,97±0,27 5,Зб±5,35
Нилутамид 0,13±0,08 33,53±9,75 2,12±0,68 2,90±1,80
Пример 9. Создание стабильной клеточной линии
В данном примере создавали клеточные линии со стабильной экспрессией мутантного АК Р876Ь. Сначала создавали ретровирусы р8КаР876Ь, рЦСХШ-АК и рОСХШ-Р876Ь путем котрансфекции клеток ОР2-293 рУ8У-О (С1оЩесЬ) в соответствии с протоколом производителя.
Клетки РС3 со стабильной экспрессией АК дикого типа или АК-Р876Ь создавали путем трансдукции клеток РС3 ретровирусом либо рЦХШ-АК, либо рОХШ-Р876Р и селекцией в среде КРМ1 1640, содержащей 500 мкг/мл гентамицина.
Клетки РАСаР со стабильной экспрессией АК-Р876Ь создавали путем либо трансфекции клеток РЖ"аР рС^NΑ-Р876^, либо трансдукции клеток Ь-ЖАР ретровирусом 8КаР876Ь. Выделяли индивидуальные клоны ^NСаР/рС^NΑ-Р876^ с последующей селекцией в 400 мкг/мл гентамицина. Проводили селекцию пулов клеток ^NСаР/8КαР876^ в 400 мг/мл гентамицина.
Экспрессию белка АК всех клеточных линий подтверждали с помощью анализа "вестерн-блоттинг" с применением антитела АК N-20 (8ап!:а ίτυζ Вю1:есЬпо1оду).
Пример 10. Анализы равновесного связывания АК
Проводили анализы конкурентного связывания АК дикого типа в сравнении с АК Р876Ь, как описано в публикации С1едд е! а1. (2012 г.) Сапсег КезеагсЬ 72:1494-503, применяя клетки РС3 со стабильной экспрессией АК человека дикого типа или АК-Р876Ь, как описано выше. К! рассчитывали как К1=1С50/(1+([3Н-К1881]/Кб)), [3Н-К1881]=0, 6 нМ.
В анализах равновесного связывания АК АКХ-509 и энзалутамид связывались с мутантом с аффинностью, большей в 30 и 48 раз соответственно (табл. 8, фиг. 5) (Кб для К1881: АК=0,5 нМ; АКР877Ь=0,64 нМ). Таким образом, повышенная активность в качестве агониста в отношении АК связана с повышенной аффинностью связывания как с рецептором дикого типа, так и с рецептором Р876Ь, что указывает на то, что подтверждение агониста обеспечивает повышенную аффинность через сниженную константу диссоциации.
- 52 029563
Таблица 8
Соединение Связывание АЕ, дикий тип, Кд (нМ) Связывание АН, Е876Б, Κι (нМ)
ΑΗΝ-509 18,07±7,46 0,68±0,15
Энзалутамид 26,30+12,77 0,60+0,17
Бикалутамид 26,56±12,51 360,36±283,85
Гидроксифлутамид 14,56+8,25 150,57+55,10
Нилутамид 17,74+5,65 197,42+9,26
Пример 11. Экспрессия генов-мишеней АЕ в и пролиферация стабильных клеточных линий рака предстательной железы с Р876Б
Как показано выше, экспрессия АЕ-Р876Б была достаточной для придания резистентности к энзалутамиду и АНХ-509 в анализах на основе временной экспрессии репортера. В данном примере исследовали воздействия Р876Б на гены-мишени эндогенного АЕ и на пролиферацию в клеточных линиях рака предстательной железы со стабильной экспрессией мутанта. Создавали две линии клеток ^NСаΡ (^NСаΡ/8ЕαР876^ и ^NСаΡ/ρС^NАР876^), как описано в примере 9, для избыточной экспрессии АЕР876Б на уровнях, сравнимых с уровнями модели ^NСаΡ/АЕ(сδ).
Для измерения уровней АЕ в клетках создавали белковые экстракты из клеток ^NСаΡ, ^NСаρ/АЕ(сδ), ^NСаΡ/8ЕαР876^ и ^NСаΡ/ρС^NАР876^, культивированных в среде с пониженным содержанием гормона в течение 3 дней. Уровни белка АЕ анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Уровни АЕ количественно определяли, нормировали на актин и выражали относительно экспрессии АЕ в клетках РХСаР (фиг. 6).
Для анализа эндогенных генов-мишеней клетки ^NСаΡ/АЕ(сδ), Б-УСаР 8ЕаР876Б и ^NСаΡ/ρС^NАР876^ культивировали в течение 3 дней в среде с пониженным содержанием гормона и затем обрабатывали их несущей средой, 1 нМ Е1881 или 1, 3, 10 и 30 мкМ АЕ№-509 или энзалутамида в присутствии или в отсутствие 1 нМ Е1881.
Для анализов на пролиферацию клетки ^NСаΡ/АЕ(сδ), РХСаР 8ЕаР876Б и ^NСаΡ/ρС^NАР876^ культивировали в присутствии среды с пониженным содержанием гормона в течение 2 дней с последующей обработкой лигандом в течение 7 дней, как описано выше. Для анализов на активность в качестве антагонистов добавляли АЕ№-509 или энзалутамид в присутствии 200 пМ Е1881 (конечная концентрация 100 пМ). Пролиферацию количественно определяли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Се11ТИег-С1о, как описано выше.
В клетках ^NСаΡ/АЕ(сδ) АЕ№509 и энзалутамид оказывали небольшое воздействие на индукцию генов-мишеней АЕ или пролиферативную активность (фиг. 7А, табл. 9А). Оба антагониста блокировали индуцируемую Е1881 транскрипцию и пролиферацию до уровней, соответствующих их активности в качестве агонистов при наивысшей концентрации (фиг. 7В, табл. 9В). В отличие от этого, в экспрессирующих Р876Б-АЕ клетках как энзалутамид, так и АЕ№509 продемонстрировали выраженную транскрипционную и пролиферативную активность в качестве агониста (фиг. 7А и 7В, табл. 9С-Р).
Таблица 9А. ^NСаΡ/АЕ(сδ): агонист транскрипции
- Н1881
Энзалутамид ΑΗΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ Н1881 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ
ΑΜΙ6Ο2 1,00 0, 98 0, 68 0, 61 0, 62 0, 66 1,22 1, 14 0, 69 0, 89 0, 65 2,41
ΒΏΝΕ 1,00 0,86 1,04 0, 92 0, 88 0, 95 0, 98 1, 15 0, 93 1,03 1, 03 1, 80
САМ2К1П 1,00 0, 04 0, 80 0,70 0,71 0, 64 0, 64 0, 90 0,76 0, 99 0,78 1,56
ΕΑ3Ν 1,00 4,12 0,47 0,32 0,29 0,31 0,58 0,46 0,40 0,42 0,41 1,30
ЕКВР5 1,00 100,51 0, 91 0, 62 0,75 0, 61 0, 85 0, 99 0,71 0, 91 0,75 1,87
НРСО 1,00 324,60 0,74 0,57 0, 61 0, 63 1,29 0, 81 0,56 0,78 0, 61 1,86
ΝΟΑΡϋ3 1,00 95, 54 0, 66 0,57 0,47 0,56 0,79 0,72 0,74 0,73 0,74 1,34
ΝΚΧ3.1 1,00 12,72 0,71 0,52 0,51 0,86 1, 63 1, 11 0, 68 0,73 0, 85 2,24
ΝΟν 1,00 0, 05 1,12 0, 91 0, 80 1,02 1,01 1,12 1,00 1,11 0, 98 2,07
ΟΚΜ1 1,00 6987,01 0, 92 0, 90 1,06 0,71 2,02 1,37 1,79 1,20 0, 97 1,35
РЬО1 1,00 0, 03 0,77 0, 62 0, 63 0,56 0,56 1,28 0, 66 0, 88 0, 65 1,33
ПСА 1,00 22,14 0,42 0,32 0,38 0,74 1, 60 0,44 0,49 0,58 0, 61 1, 13
зьис 1,00 91,84 0,53 0,55 0,31 0,51 0, 91 0,38 0,42 0,52 0,56 1,36
ЗТЕАР4 1,00 1498,46 0,75 0,73 0,52 1,16 1,28 0, 94 0,77 1,05 0,56 1, 01
ТМРК332 1, 00 35, 42 0,75 0,53 0, 63 0, 89 1,45 0, 99 0, 64 1, 04 0, 62 2,78
- 53 029563
Таблица 9В. ^NСаР/ΑК(сδ): антагонист транскрипции
+ 1 нМ Н1881
Энзалутамид ΑΚΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ Н1881 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ
АМ1СО2 1,00 0, 98 0, 49 0, 19 0, 48 0, 78 0, 92 0, 30 0, 31 0, 52 0, 60 0,76
ΒϋΝΕ 1,00 0,86 0, 61 0,28 0, 63 0, 99 1,12 0, 43 0, 35 0, 67 0, 74 0, 88
САМ2КЫ1 1,00 0, 04 0, 04 0, 06 0,27 0, 50 0, 56 0, 04 0, 06 0, 19 0, 43 0, 42
ΕΑ3Ν 1,00 4,12 1,30 0, 42 0, 71 0,46 0, 59 1,92 1,52 1,08 0, 60 0, 64
ЕКВР5 1,00 100,51 23, 51 5, 64 3, 32 1,41 1,50 33, 14 22,49 12,56 2,74 1,08
НРСО 1,00 324,60 99, 16 16, 30 13, 19 3, 85 4,25 105,97 76,25 32,19 8,36 2,78
ЫСАРОЗ 1,00 95, 54 23, 74 4,35 3, 14 1,29 1,27 43, 93 32,00 15, 57 2,39 0, 96
ΝΚΧ3.1 1,00 12,72 7,70 3, 77 6, 72 4,70 5, 03 8,32 9, 92 12,01 7,22 5, 49
ΝΟν 1,00 0, 05 0, 11 0, 14 0, 61 1,00 0, 92 0, 03 0, 09 0, 31 0,86 0, 82
ОКМ1 1,00 6987,01 3521,95 503,02 257,85 43, 91 22,70 5100,90 2679,73 1031,40 156,90 16, 42
РЬШ 1,00 0, 03 0, 02 0, 02 0, 13 0, 42 0, 54 0, 02 0, 02 0, 04 0, 11 0, 32
ПСА 1,00 22,14 22,76 8,82 11,75 6, 59 5, 65 19, 09 21,75 23, 57 12,90 7,20
зьис 1,00 91,84 50, 08 10,20 10, 56 5,26 5,22 71,33 62,00 50, 70 11,15 5, 49
ЗТЕАР4 1,00 1498,46 585,81 109,37 74,44 13, 61 7,79 1019,98 742,61 256, 89 32,98 6, 86
ТМРН332 1,00 35, 42 19, 88 7,72 10, 51 3, 58 4, 62 19, 07 24,11 23, 38 11,45 5, 94
Таблица 9С ^NСаР/δКαР876^: агонист транскрипции
- Р.1881
Энзалутамид ΑΚΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ К1881 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 3 0 мкМ 0,3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ
АМ1СО2 1,00 0,29 0, 58 0, 32 0, 47 0, 40 0, 31 0,27 0,47 0,23 0, 34 0,27
ΒϋΝΕ 1,00 1,65 1,04 1,30 1,01 0, 99 1,55 0, 79 1,07 0, 75 0, 84 0, 94
САМ2КЫ1 1,00 0,03 0, 52 0,48 0, 38 0,23 0, 37 0, 30 0,24 0, 17 0,21 0,18
ΕΑ3Ν 1,00 3,76 0, 50 0, 64 0, 58 1, 09 1,34 0, 64 1,01 0, 93 1,50 2,77
ГКВР5 1,00 66, 89 1,38 1,14 2,54 9, 61 23, 67 2, 66 5, 95 5,56 13, 02 27,89
НРСО 1,00 182,19 0, 68 0, 96 2,79 18, 98 55,76 4,18 7,90 10, 12 25,79 69,22
ЫСАРОЗ 1,00 31, 69 0, 77 1,01 1,09 3, 56 8,83 1,39 1,58 1, 69 3, 53 9, 35
ΝΚΧ3.1 1,00 10, 80 4,26 5, 54 7,05 11, 94 14,20 7,12 9, 47 7,96 9, 85 12, 67
ΝΟν 1,00 0,06 0, 55 0,28 0, 55 0, 42 0,21 0,27 0,51 0, 31 0,29 0, 17
ОКМ1 1,00 6535,38 2,17 4,85 18,77 242,08 2114,41 44,44 58,96 101,45 459,30 1357,12
РЫЛ 1,00 0,02 0, 67 0,76 0, 60 0, 42 0,41 0, 49 0,44 0, 30 0, 45 0,36
ПСА 1,00 3,43 1,95 2,25 3, 02 4, 05 5, 02 3, 71 3,26 3, 00 5, 07 5,16
зьис 1,00 99,20 1,21 1,55 3,28 16, 87 107,64 5, 56 5, 91 8,15 26, 35 56, 48
ЗТЕАР4 1,00 1706,02 1,13 2,15 9, 98 96, 53 343,81 20,36 27,49 46, 06 187,24 479,64
ТМРК332 1,00 25, 55 3, 11 3, 85 5, 39 9,20 18, 61 6, 36 6,29 5, 84 10, 90 14,20
- 54 029563
Таблица 9Ό ^NСаΡ/8ΚαΡ876^: антагонист транскрипции
+ 1 нМ К1881
Энзалутамид ΑΗΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ Н1881 0,3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 3 0 мкМ 0,3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 3 0 мкМ
ΑΜΙ6Ο2 1,00 0,29 0,23 0,29 0,33 0,39 0,40 0, 17 0,22 0, 14 0, 18 0, 18
ΒϋΝΓ 1,00 1, 65 0,53 0, 64 0, 62 0,51 0,71 0,74 0,76 0,57 0,50 0, 63
САМ2КШ 1,00 0, 03 0, 08 0, 12 0, 19 0,24 0,32 0, 03 0, 03 0, 06 0, 11 0, 17
ΓΑ5Ν 1,00 3,76 1,29 1,22 0, 85 0, 94 1,58 2,23 2,03 1,39 1,30 2, 66
ГКВР5 1,00 66, 89 17,90 14,89 10,21 17,33 40,52 36, 57 39,48 26,46 29, 94 22,71
ΗΡΟϋ 1,00 182,19 49, 66 30, 03 21, 62 34,77 93,52 149,34 134,70 79, 93 70, 80 131,79
ΝΟΑΡϋ3 1,00 31, 69 6, 34 4,28 2,21 3,44 13, 64 19, 83 15, 47 8,71 6, 50 11,82
ΝΚΧ3.1 1,00 10, 80 21, 66 20,78 16, 19 11,84 15,26 12, 63 14,12 11,34 10, 15 13, 64
ΝΟν 1,00 0, 06 0, 12 0,28 0,25 0,33 0,26 0, 05 0, 06 0, 09 0, 11 0, 09
ΟΚΜ1 1,00 6535,38 386,40 216,67 137,73 661,51 3496,87 3335,14 2343,29 1469,18 1608,16 3440,86
РЪШ 1,00 0, 02 0, 04 0, 08 0, 14 0,37 0,48 0, 01 0, 01 0, 02 0, 08 0,20
ПСА 1,00 3,43 5, 84 5, 63 4,47 4,54 4, 64 4,93 4,38 4,59 5,28 4,17
зъис 1,00 99,20 85, 97 64, 63 35, 50 48,80 161,58 85, 97 64, 63 35, 50 48,80 161,58
ЗТЕАР4 1,00 1706,02 259,94 147,25 83,20 275,88 645,04 259,94 147,25 83,20 275,88 645,04
ТМРН332 1,00 25, 55 14,05 13, 81 11,78 12,92 20, 19 14,05 13, 81 11,78 12,92 20, 19
Таблица 9Е ^NСаΡ/ρС^NЛΡ876^: агонист транскрипции
- Е1881
Энзалутамид ΑΕΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ Е1881 0,3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ 0,3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ
АМ1СО2 1,00 0, 92 1,28 0, 82 0, 87 0, 72 0, 91 1,07 0, 86 1,25 0, 60 1,55
ΒΌΝΓ 1,00 1,01 1,54 1, 04 1,11 0, 82 0, 64 1,01 0,76 0, 87 0, 85 1, 16
ΟΑΜ2ΚΝ1 1,00 0, 02 0, 55 0, 96 0,51 0, 37 0,23 0,47 0, 55 0,34 0, 41 0,27
ΓΑ3Ν 1,00 22,20 0, 91 0, 72 0,48 1,27 3, 66 1,16 1,42 1,59 1,79 7, 86
ГКВР5 1,00 145,63 2, 18 2, 91 4,28 10, 54 42,25 7,24 7, 82 9,52 17,39 55,55
НРСР 1,00 854,42 4,70 6, 32 13,26 26, 78 105,81 15,36 19, 27 29,25 47,33 173,82
ΝΟΑΡΌ3 1,00 169,67 1, 95 1, 94 3, 68 9, 41 35,36 5, 83 6, 52 8,28 20, 42 51,13
ΝΚΧ3.1 1,00 9, 67 3,76 3, 71 3,57 4, 69 8,12 6, 07 5, 72 5, 93 7, 05 11, 69
ΝΟν 1,00 0, 08 1,73 1, 62 2,19 0, 88 0,49 1,24 1, 01 0, 82 0,86 0, 72
ОЕМ1 1,00 12816,69 116,91 195,36 659,73 2530,13 4760,77 932,41 1371,33 2307,29 3322,63 5541,08
ΡΣΌΙ 1,00 0,75 1,37 0, 80 0, 69 0,29 0,45 0,78 0, 69 1,01 0, 68 0, 48
ПСА 1,00 12, 17 3, 56 4, 04 5,29 9, 53 11,70 6,74 7, 19 8,25 10, 06 12,99
зъис 1,00 268,77 1, 99 3, 53 4,74 14, 91 55, 93 7,84 8,70 10, 91 21,21 71,08
ЗТЕАР4 1,00 3084,81 10,38 15, 58 46, 50 240,68 520,15 113,39 113,29 173,77 317,80 597,09
ТМРЕ332 1,00 26, 85 4, 98 6, 46 6, 09 8,51 21,78 9,49 8,51 9,70 11,09 23, 01
- 55 029563
Таблица 9Т ΤΝ€αΡ/ρΟΌΝΑΡ876Τ: антагонист транскрипции
+ 1 нМ К1881
Энзалутамид ΑΚΝ-509
Ген Несущая среда 1 нМ К1881 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ 0, 3 мкМ 1 мкМ 3 мкМ 10 мкМ 30 мкМ
АМ1СО2 1,00 0, 92 0, 51 0, 43 0, 39 0, 49 0, 52 0,24 0, 31 0, 43 0, 41 0, 40
ΒΏΝΕ 1,00 1,01 0, 59 0, 71 0, 53 0, 50 0, 41 0,28 0, 41 0, 42 0, 45 0, 34
ΟΑΜ2ΚΝ1 1,00 0, 02 0, 05 0, 16 0, 17 0,21 0, 14 0, 01 0, 02 0, 06 0, 11 0, 06
ΕΑ3Ν 1,00 22,20 5,29 2, 44 1,55 2,08 4,22 3, 89 5, 52 3,22 2,10 3, 98
ЕКВР5 1,00 145,63 53,18 26,29 10, 03 14,22 32,97 45, 69 48,95 38,89 24,82 30,26
НРСО 1,00 854,42 149,44 59, 67 21, 66 35, 90 96, 55 192,05 170,69 107,79 73,28 87,03
ΝΟΑΡϋ3 1,00 169,67 101,65 31,49 14,34 16, 69 42,06 68,41 90, 52 62,27 22,96 44,10
ΝΚΧ3.1 1,00 9, 67 8,53 7, 05 5, 69 5, 54 7, 61 3, 08 5, 95 5, 42 4,81 5,24
ΝΟν 1,00 0, 08 0, 08 0, 17 0, 32 0, 49 0, 39 0, 02 0, 10 0, 12 0,26 0, 18
ΟΚΜ1 1,00 12816,69 4375,20 1581,76 587,00 1377,92 3765,54 4802,10 4943,10 3366,19 2576,38 2470,99
РЬО1 1,00 0, 75 0, 08 0, 12 0, 09 0, 11 0, 12 0, 04 0, 12 0, 05 0, 06 0, 04
ПСА 1,00 12,17 16, 08 12,73 7,92 8,12 14,27 10, 36 14,01 12,21 10,27 13, 14
зъис 1,00 268,77 166,04 86, 01 30,23 36, 56 98,34 112,06 134,56 113,34 69, 55 85, 38
ЗТЕАР4 1,00 3084,81 524,97 156,24 47,11 92,80 214,69 633,57 587,91 376, 66 195,78 232,63
ТМРК332 1,00 26, 85 19, 03 16, 05 8,14 8,92 15, 32 12,13 15, 75 14,19 12,99 12, 67
Пример 12. Взаимодействие Ν- и С-экспрессии генов-мишеней ΑΚ в и пролиферация клеточных линий рака предстательной железы с Т876Ь
Взаимодействие Ν-конца ΑΚ с С-концом ΑΚ важно для обеспечения полной возможности трансактивации ΑΚ. Многие полные и частичные агонисты ΑΚ стимулируют ΑΡ2-зависимое Ν-Свзаимодействие. Проводили двухгибридный анализ взаимодействия Ν-С-концов для оценки взаимодействия Ν- и С-конца ΑΚ в мутанте Т87Ь в присутствии ΑΚΝ-509 и энзалутамида.
Создавали ρΜ-ΑΚ1-660, ρνΡ16-ΑΚ507-919 и рУР16-Т876Т507-919 путем субклонирования соответствующих продуктов ПЦР из ρС^NΑ3-ΑΚ и ρС^NΑ3-Γ876^ в рМ и ρνΡ16 (С1оп1есй). Для анализов взаимодействия Ν-С-концов проводили тройные трансфекции, применяя 50 нг ρΜ-ΑΚ1-660, 75 нг ρνΡ16ΑΚ507-919 или ρνΡ16-Τ876Τ507-919, 25 нг [эМНКЫ-Еис и 10 нг ρΚΤ ^гоше^а). Трансфицированные клетки инкубировали в течение 4 ч и затем обрабатывали лигандом. ΑΚΝ-509 и энзалутамид анализировали при 8 мкМ, а Κ1881 - при 1 нМ.
В соответствии с их транскрипционной активностью энзалутамид и ΑΚΝ-509 стимулировали Ν-Свзаимодействие ΑΚ-Τ876Τ, но не ΑΚ дикого типа (фиг. 8). Таким образом, активность ΑΚΝ-509 и энзалутамида в качестве агониста на ΑΚ-Τ876Τ связана с агонист-подобной конформацией ΑΤ-2.
Пример 13. Иммунопреципитационный анализ хроматина ΑΚ
Транскрипционная активация андрогенрегулируемых генов-мишеней ΑΚ требует индуцируемого агонистом связывания ДНК и последующий рекрутинг корегуляторов транскрипции. Для подтверждения результатов по репортеру в νΡ16-ΑΚ, указывающих на то, что ΑΚΝ-509 и энзалутамид стимулируют связывание ДНК ΑΚ-Τ876Τ, был проведен иммунопреципитационный анализ хроматина (СЫТ) 6 геновмишеней ΑΚ из клеток, обработанных Κ1881 и/или каждым антагонистом.
Анализы СЫТ проводили, как описано в публикации ^оδеρЫ е! а1. (2009 г.) ΡΝΑ8 ϋ8Α 106:12178-83. Вкратце, клетки ^NСаΡ/ΑΚ(сδ) и ΕΝίΑΡ 8КаТ876Ь высевали в чашки 150 мм (7х106 клеток в 20 мл) в ΚΡΜΙ 1640 с добавлением 10% С88 в течение 3 дней. Затем клетки обрабатывали 10 мкМ антагониста в присутствии или в отсутствие 1 нМ Κ1881 в течение 4 ч. После обработки лигандом в среду добавляли формальдегид до конечной концентрации 1%, инкубировали в течение 10 мин и гасили глицином (конечная концентрация 125 мМ) в течение 5 мин. Клетки трижды промывали ФСБ, содержащим одноразовый коктейль для ингибирования протеазы и фосфатазы 1Х НаН™ Ρ^оΐеаδе & ΡЫоδрЫаΐаδе 8т§1е-Же ΙηЫЬЕог СосЫаП (1Х ΡΙ, ТЫегто 8с1епййс), гранулировали, лизировали в 1 мл буфера ΚΙΡΑ (50 мМ Τπδ с рН 7,5, 0,15 М ЖС1, 1% ΝΡ-40, 0,5% Ж дезоксихолата, 0,05% 8Ό8, 1 мМ ЭДТА, 1Х ΡΙ) и обрабатывали ультразвуком до получения среднего размера фрагмента ДНК ~500 п.о. Обработанный ультразвуком поперечносшитый хроматин разбавляли в 3,3 мл ΚΙΡΑ и предварительно осветляли 100 мл 50% белковой Α/О агарозной суспензии (8С-2003, 8ап!а С г и/ Вю1есБпо1о§у), содержащей 200 мг на мл обработанной ультразвуком ДНК из молок лосося и 500 мг на мл БСА. Затем один мл предварительно осветленного хроматина иммунопреципитировали 15 мкг анти-ΑΚ (8С-816, 8ап!а Сги/ Вю1есЬпо1о§у) или нормальным Ι§Ο кролика (8С-2027, 8ап!а Сги/ Вю1есЬпо1о§у) в течение 2 ч при 4°С, после чего добавляли 100 мл 50% суспензии белковых Α/О агарозных гранул и инкубировали в течение ночи при 4°С. Гранулы 2 раза промывали последовательно в буфере с низким содержанием соли (50 мМ ΗΕΡΕ8 рН 7,8, 140 мМ ЖС1, 1 мМ ЭДТА, 1% Тгкоп Х-100, 0,1% Ж дезоксихолата, 0,1% 8Ό8), буфере с высоким содержанием соли (то
- 56 029563
же самое, что и буфер с низким содержанием соли, но с 500 мМ №С1), буфере МС1 (20 мМ Τήδ рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 250 мМ МС1, 0,5% \Р-4(), 0,5% \а дезоксихолата) и буфере ТЕ (50 мМ Τήδ рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Все стадии промывки проводили в присутствии 1Х ΡΙ. ДНК-белковые комплексы дважды элюировали в 225 мл буфера для элюирования (50 мМ Τήδ рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1% 8Ό8) при 65°С в течение 15 мин. Элюированные ДНК-белковые комплексы обратно поперечно сшили в присутствии \аС1 в течение ночи при 65°С и дополнительно обработали ЭДТА и протеиназой Κ при 42°С в течение 1 ч. Фрагменты ДНК очищали в 10 мМ Τήδ ρΗ 8,5, применяя набор для очистки для ПЦР ОШриск (СЯадеп), разбавляли и анализировали с помощью ПЦР в реальном времени, применяя Пас] 8УВК Огееп 8ирегш1х χνίΐΐι К0Х (Вю-Каб). Образцы амплифицировали на приборе АВ1 7900ΗΤ. Последовательности олигонуклеотидных праймеров представлены в табл. 8.
Таблица 8. Последовательности олигонуклеотидов для ПЦР в реальном времени СЫР
Ген Последовательность прямого праймера Последовательность обратного праймера
ПСА Е2 АССТ6СТСА6ССТТТ6ТСТСТ6АТ (5Е0 Ю ΝΟ: 50) АСАТССАСССТТССТТАСТСТССТ (ЗЕО Ю ΝΟ: 51)
ПСА Ш АТТСТ6С6ТТ666А6Т6САА66АА (ЗЕО Ю ΝΟ: 52) А66А6АСАТ ССС СА66АТ САААСА (ЗЕО Ю ΝΟ: 53)
ЗТЕАР4 АС ТА66СА66АСАТ Т САСАТ С ССА (ЗЕО Ю N0: 54) АСА6ТАААССТСТССАСАСАТ66С (ЗЕО Ю N0: 55)
ΕΑ3Ν ТАТСАСАСССАССССТТТССТТСА (ЗЕО Ю ΝΟ: 56) ТААС6ТТСССТ6С6С6ТТТАСА6А (ЗЕО Ю ΝΟ: 57)
ТМРН332 ТСССАААТССТ6АССССА (ЗЕО Ю ΝΟ: 58) АССАСАСА6ССССТА66А6А (ЗЕО Ю ΝΟ: 59)
ΝΚΧ3.1 АСАСССТСССССАААТАСААС (ЗЕО Ю ΝΟ: 60) ССТ6ТСТТ66АСАА6С66А6А (ЗЕО Ю ΝΟ: 61)
ОКМ1 666ТСАТТТССАССАССТСАААСА (ЗЕО Ю ΝΟ: 62) ССАСАААССССТТАСАСТАСТСТС (ЗЕО Ю ΝΟ: 63)
В клетках ΙΛ’ΟΡΆΙήοδ) К1881 стимулировал связывание АК с ДНК (фиг. 9). В соответствии с данными по репортеру УР16-АК как АК\-509, так и энзалутамид стимулировали связывание АК с ДНК в клетках 1^01^81/(7.1-/8761.. В присутствии К1881 все антагонисты ингибировали К1881-стимулируемое связывание АК с ДНК до уровней, соответствующих их активности в роли частичных агонистов или антагонистов в обеих клеточных линиях (фиг. 89 в дополнительных материалах).
Пример 14. Воздействия АК Р876Ь ΐη νΐνο
Чтобы определить, придает ли Р876Ь резистентность к энзалутамиду и АКN-509 ΐη νΐνο, клеточные линии ΙΛΌΡ со стабильной экспрессией АК Н876Р вводили путем инъекции (подкожно) кастрированным иммунодефицитным мышам и вырабатывали опухоли.
Все исследования на животных проводили в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию, следуя рекомендациям по надлежащему гуманному использованию животных для исследовательских целей. Эксперименты с ксенотрансплантатами ΐη νΐνο проводили на самцах мышей линии 8СГО I ΡιίιΊο'δδ 0и1Ьгеб (8Η0) ((ΊιαιΌ Εΐνе'1'δ Ι.ίώοιιιΙοπο'δ). У мышей проводили орхиэктомию под изофлорановой анестезией и давали им 7-10 дней для восстановления. Клетки п^аР/АК^) или ^NСаΡ/8КαΡ876^ (как описано выше) суспендировали в 50% КРМ1, 50% Ма1пде1 (ΒΌ Вΐοδсΐеηсеδ) и вводили путем инъекции 3х10б клеток/ксенотрансплантат в объеме 100 мкл. Животных осматривали еженедельно до явного роста опухоли. Через 40-60 дней после инъекции животных случайным образом распределяли по когортам с эквивалентной средней величиной (150-250 мм3) и диапазоном опухолевой нагрузки. Все соединения вводили ежедневно перорально через зонд в дозе 30 мг/кг/день соединения. Для всех исследований с ксенотрансплантатами п^аР/АК^) базовые растворы лекарственных средств АК\-509 и энзалутамида готовили в 18% ПЭГ-400, 1% Τ\υοόίι-80 и 1% повидона и для дозирования их готовили в растворе 15% витамин ЕΤΡΟ8 и 65% 0,5% вес./об. раствора карбоксиметилцеллюлозы в 20 мМ цитратном буфере (рН 4,0). Фармакокинетику АК\-509 и энзалутамида оценивали в конце исследования, как описано ранее (С1едд е1 а1. (2012 г.) Сапсег КезеагсЬ 72:1494-503).
В соответствии с данными ΐη νΐίτο ни АКN-509, ни энзалутамид 30 мг/кг/день не влияли на рост опухолей ^NСаΡ/АК/8КαΡ876^ (фиг. 10). Такое отсутствие активности не было следствием неожиданно низкого воздействия соединения, поскольку количественно определенные на 28 день уровни лекарствен- 57 029563
ного средства в плазме соответствовали результатам предыдущих исследований с ксенотрансплантатами ^NСаΡ/АК (табл. 9). Кроме того, в параллельном эксперименте АК№-509 30 мг/кг/день показал выраженную противоопухолевую активность в модели ^NСаΡ/АК(сδ) в соответствии с предыдущими результатами (фиг. 10).
Таблица 9. Фармакокинетика ксенотрансплантата 1%Са1к8К(.хк876к
Соединение Доза С24 (мкг/мл) Τΐ/2 (час) ППКо-24 (мкг-час/ мл) Стах (мкг/ мл) Тщах (час)
Энзалутами Д 30 мг/кг 9, 14 9, 9 527,3 33,5 1,0
ΑΚΝ-509 30 мг/кг 1,02 7,1 98,9 9,11 1,0
Пример 15. Открытое исследование фазы 1/2 по безопасности, фармакокинетике и подтверждению правильности концепции для АКN-509 у пациентов с прогрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (СКРС) поздних стадий
В данном исследовании выделяли ДНК из образцов плазмы 29 пациентов, участвующих в клиническом исследовании фазы 1/2 для ΛКN-509 для лечения рака предстательной железы. ДНК проанализировали с применением ВЕАМтд ТесЬио1оду на основе эмульсионной ПЦР (Бгеззтаи е! а1. (2003 г.) ΡNΛ8 υ8Λ100:8817-22). Ранее ВЕАМтд успешно применяли для обнаружения различных связанных с опухолями мутаций в активирующих онкогенах, таких как Р1КС3а и К-газ в сί^NΛ, полученных из плазмы человека (ГРеЫ е! а1. (2008 г.) ^Шге Мейюте 14:985-90). Мутацию Р876Б АК выявили у 3 из 29 протестированных образцов пациентов.
Проведенное клиническое исследование представляло собой многоинституциональное исследование фазы 1/2, впервые проведенное с участием людей, с повышением дозы и подтверждением правильности концепции по 9 уровням доз, в котором допущенные к исследованию пациенты с прогрессирующим СКРС поздних стадий получали дозы АК№-509 перорально в амбулаторных условиях, чтобы определить безопасность и фармакокинетику (ФК) и для предварительного подтверждения противоопухолевых воздействий АК№-509.
Пациенты с метастазирующим СКРС были распределены последовательно по уровням доз в когорты по 3-6 пациентов для уровня дозы, применяя стандартный критерий повышения дозы 3x3.
Цель заключалась в определении максимальной переносимой дозы (МТБ) и/или рекомендованной дозы фазы 2 (КР2Б) для АКN-509, которая приводит к дозолимитирующей токсичности (БЬТ) у максимум 30% пациентов. Токсичность ЮкТ по существу определяют как любые судороги степени 1 или выше, любая негематологическая токсичность степени 3-4 (токсичность для ЖКТ должна быть степени 3-4, несмотря на максимальную медикаментозную терапию) и/или гематологическая токсичность степени 4 продолжительностью более 5 дней, определяемые по Общим критериям терминологии для обозначения нежелательных явлений (СТСАЕ) У4.0, которые оценивают как связанные с лечением АК№-509. Схема плана исследования представлена на фиг. 11.
Допущенные к исследованию пациенты, которые подписали документы об информированном согласии, были исходно включены в когорту с повышением дозы, где они перорально получали однократную дозу АКЫ-509 с последующим наблюдением в течение одной недели (неделя ФК). Непрерывное дозирование начиналось в день 1 цикла 1 при условии отсутствия признаков неприемлемой токсичности.
Минимум 3 субъекта с каждым уровнем дозы контролировали на 1)1 /Г вплоть до дня 28 цикла 1. Если у первых 3 пациентов с каждым уровнем дозы не наблюдались БЬТ, последующая группа переходила на следующий уровень дозы. Если 2 или более пациентов испытывали ЮкТ при заданном уровне дозы или наблюдался единичный эпизод судорог любой степени при заданном уровне дозы, повышение дозы прекращалось, и МТБ определяли как предыдущий уровень дозы. Если ЮкТ не наблюдались, КР2Ю определяли на основании общего профиля фармакокинетики и безопасности АК№-509 и оптимальной биологической дозы, определенной на основании доклинических данных, и не обязательно МТБ.
Начальная доза составляла 30 мг/день с повышениями до 60, 90, 120, 180, 240, 300, 390 и 480 мг в день. Предполагалось, что данные уровни доз покрывают предполагаемый фармакологически активный диапазон доз и находятся в пределах безопасной области, указанной по результатам доклинических токсикологических исследований.
После выбора 240 мг в качестве КР2Ю в исследование включали дополнительных допущенных к исследованию пациентов для участия в части фазы 2 исследования, состоящей из 3 одновременных расширенных когорт с МТБ и/или КР2Ю для сбора дополнительной информации по безопасности и получения исходного сигнала о противоопухолевой активности. Такие три расширенные когорты включали:
1) ранее не получавших лечения пациентов с неметастазирующим СКРС (50 пациентов с неметаста- 58 029563
зирующим СКРС, ранее не получавших химиотерапии или лечения абиратероном);
2) ранее не получавших лечения пациентов с метастазирующим СКРС (20 пациентов с метастазирующим СКРС, ранее не получавших химиотерапии или лечения абиратероном); и
3) ранее получавших лечение абиратероном пациентов с метастазирующим СКРС (10-20 пациентов).
Ожидалось, что каждый пациент с метастазирующим СКРС пройдет по меньшей мере 3 цикла (12 недель) непрерывного лечения, а каждый пациент с неметастазирующим СКРС пройдет по меньшей мере 4 цикла (16 недель) непрерывного лечения. Лечение прерывали в любой момент при определенном в протоколе прогрессировании заболевания или неприемлемой токсичности. Оценки опухолей проводили каждые 3 цикла (12 недель) у пациентов с метастазирующим СКРС и каждые 4 цикла (16 недель) у пациентов с неметастазирующим СКРС. Безопасность оценивали с получения первой дозы и до по меньшей мере четырех недель после получения последней дозы, или до устранения симптомов связанной с лекарственным средством токсичности, или до момента, когда токсичность становится необратимой, в зависимости от того, какой период был более продолжительным. Воздействие приема пищи на абсорбцию АКК-509 и воздействие АКК-509 на реполяризацию желудочков оценивали на расширенной фазе исследования фазы 2 в выбранных клинических центрах.
Анализ образцов с применением технологии ВЕАМтд в текущем клиническом исследовании АРМ509 был проведен компанией 1по5бс8 СМВН. Кровь забирали в вакуумные пробирки К2-ЕЭТА и тщательно перемешивали путем нескольких медленных переворотов. Не позднее чем через 30 мин после забора пробирки центрифугировали при 2000хд в течение 15 мин. Плазму декантировали и переносили в пробирки для криохранения. Не позднее чем через 90 мин после декантирования плазму замораживали до -70°С или ниже и хранили до анализа. ДНК очищали из аликвот плазмы 300-500 мкл и экстрагировали так, как описано в публикации ЭюЫ с; а1. (2008 г.) N^1^ тсбютс 14:985-90. Обнаружение мутации проводили в соответствии с технологией ВЕАМтд, как описано в публикации ЭюЫ с; а1. Вкратце, на исходной стадии ПЦР область-мишень (~100 п.о.) амплифицировали с применением генспецифичных праймеров с последовательностями метки и подвергали эмульсионной ПЦР, во время которой использовали покрытые праймерами магнитные гранулы. После эмульсионной ПЦР проводили дискриминацию гранул дикого типа и мутантных гранул путем аллельспецифичной гибридизации с последующей проточной цитометрией. Результаты проточной цитометрии анализировали с применением ЕС5 Ехргсзз (ГОс Шуо ЗоГ^агс, г. Лос-Анджелес, штат Калифорния, США), получив отношение мутантных аллелей к аллелям дикого типа.
Образцы анализировали на наличие АК дикого типа или 3 одноточечных мутантных аллелей, которые могут привести к Е876Б (2988с, с2990а и с2990д (или ;2626с, с2628а и с2928д соответственно, относительно кодирующей нуклеиновую кислоту АК последовательности, представленной в 8НО ГО N0:18). Проанализированные мутации и техническая чувствительность способа ВЕАМтд показаны в табл. 10. Для обнаружения частота должна превышать полное количество геномного эквивалента, применяемого в анализе. Например, если в образце присутствует 1000 геномных эквивалентов и при этом рассчитанная доля мутантных молекул ДНК составляет 0,02% (1 мутантный аллель на 5000 аллелей дикого типа), то образец классифицируется как дикий тип.
Таблица 10. Замены нуклеотидов АК, контролируемые с помощью анализа ВЕАМтд
Позиция нуклеотида Замена нуклеотида Позиция аминокислоты Замена аминокислоты
с.2626 Ос 876 Г>Ъ
с.2628 с>а 876 г>ъ
с.2628 с>д 876 г>ъ
Результаты
У подмножества пациентов по всем группам доз наблюдали ответ ПСА, причем у 14/30 пациентов наблюдали >50% снижение ПСА на неделе 12 в сравнении с базовым уровнем. Ответ ПСА у 29 прошедших скрининг пациентов показан на фиг. 12. Анализировали образцы плазмы до лечения и во время лечения. Время анализа ВЕАМтд указано концом кривой ответа ПСА. Восемнадцать из 29 пациентов имели ПСА выше базового уровня во время анализа, что указывает либо на собственную, либо на приобретенную резистентность к АКМ-509.
Для контроля 3 нуклеотидных изменений, которые могут кодировать аминокислотную замену Е876Б, создали три зонда. Эксперименты по смешиванию разбавлением с мутантной последовательностью и ДНК дикого типа показали техническую чувствительность 0,02% (потенциал обнаружения 1 мутантной последовательности среди 5000 последовательностей дикого типа). При исходном скрининге образцов плазмы 29 пациентов, получавших лечение АКМ-509, признаки мутации были обнаружены у 3 пациентов (табл. 11 и 12). На момент анализа ВЕАМтд пациенты 7 и 10 имели уровни ПСА выше базового уровня, а у пациента 13 наблюдался подъем ПСА над низшей точкой во время лечения (фиг. 13). У всех 3 пациентов была обнаружена нуклеотидная замена с2628а. У одного из данных 3 пациентов (паци- 59 029563
ент 10) также был обнаружен мутант 1:2626с, что указывает на поликлональное заболевание. Кодирующие Р876Ь мутации не были обнаружены ни в одном из образцов, взятых до лечения (0/29), что указывает на то, что если они и присутствовали до лечения АК№509, то были ниже предела обнаружения, или что мутации возникли йе ηονο во время лечения АК№509. В любом сценарии данные подтверждают гипотезу о том, что селективное выращивание несущих мутантный аллель повреждений до уровней, достаточных для обнаружения в цоДНК, зависит от хронического воздействия АКЫ-509 и связано с ростом ПСА. Для дополнительного установления связи Р876Ь с прогрессированием заболевания мы проанализировали образцы плазмы, взятые в дополнительные временные точки у 3 пациентов, классифицированных как положительные при исходном скрининге (табл. 12). У пациента 10 мутация не была обнаружена в одной дополнительно проанализированной временной точке (цикл 4; ПСА 102% от Т0). У пациента 13 мутация не была обнаружена в цикле 4 (ПСА 16,2% от базового уровня) или в цикле 12 (пациент классифицирован как положительный в цикле 11). В цикле 11 мутантная последовательность была на пределе обнаружения и, по оценкам, возникла в результате амплификации единственной мутантной молекулы. Хотя ПСА у пациента 13 медленно рос от низшей точки во время лечения в циклах 11 и 12, в обеих временных точках ПСА все равно был на >60% ниже уровня на начало исследования, и, таким образом, явной резистентности еще не возникло. Выявление мутантной последовательности на пределе обнаружения, вероятно, отражает наличие относительно редкого мутантного клона, который обладает потенциалом к размножению в условиях непрерывного селективного давления и в конце концов приводит к прогрессированию заболевания.
Принимая во внимание относительно большую продолжительность лечения пациента 7, проанализировали образцы плазмы в дополнительные временные точки во время явного снижения ПСА (> 90% снижение от базового уровня; циклы 4, 8 и 10) и при исходном росте ПСА от его низшей точки (циклы 15 и 19) (фиг. 13). Интересно отметить, что в 3 образцах из цикла лечения 4, 8 и 10 мутации обнаружены не были, тогда как в 2 образцах, проанализированных при исходном росте ПСА (циклы 15 и 19), была обнаружена мутация с2628а. Эти клинические данные согласуются с доклиническими данными, указывающими на достаточность аминокислотной замены Р876Ь для придания резистентности к АК№509.
Таблица 11. Результаты ВЕАМзпд для положительных по Р876Р пациентов
Пациент Цикл лечения* ПСА [Процентная доля от значения в день 0] Классификация генотипа Частота мутанта [мутантные гранулы/гранулы дикого типа хЮО]
с2990а с2990д 52988с
7 0 100 Дикий тип - - -
7 4 1,4 Дикий тип - - -
7 8 3,3 Дикий тип - - -
7 10 5,6 Дикий тип - - -
7 15 41,2 Мутант 0,162 - -
7 19 97,2 Мутант 5, 005 - -
7 22 281,0 Мутант 1,002 - -
10 0 100 Дикий тип - - -
10 4 102 Дикий тип - - -
10 7 245 Мутант 0, 051 - 0, 12
13 0 100 Дикий тип - - -
13 4 16,2 Дикий тип - - -
13 11 31,7 Мутант 0, 065 - -
13 12 39, 5 Дикий тип - - -
продолжительность цикла лечения составляла 4 недели; цикл 0 соответствует временной точке до лечения.
- 60 029563
Таблица 12. Первичный анализ ВЕАМтд по Γ876Ι, для пациентов из АК№509-001
Ответ ПСА на Анализ ВЕАМДпд ПСА на момент проведения анализа ВЕАМДпд Классификация Классификация
Пациент неделе 12 Цикл лечения* [Процентная доля от базового уровня] генотипа на базовом уровне* генотипа в процессе лечения
1 30,49 19 195, 4 Дикий тип Дикий тип
2 -61, 8 10 337,08 Дикий тип Дикий тип
Л 00 "7 /1 1 оо ПтгтлтгтЧ ПтгтлтгтЧ
{ !
4 12,4 5 134 Дикий тип Дикий тип
5 -70,65 8 16 Дикий тип Дикий тип
6 -90,02 10 84, 6 Дикий тип Дикий тип
7 -98, 6 22 281 Дикий тип Мутант
8 -62,2 16 10,2 Дикий тип Дикий тип
9 26, 38 7 185 Дикий тип Дикий тип
10 2,33 7 245 Дикий тип Мутант
11 -49,76 8 143,88 Дикий тип Дикий тип
12 -56,65 7 99, 47 Дикий тип Дикий тип
13 -83,79 11 31,7 Дикий тип Мутант
14 -43,21 11 150,5 Дикий тип Дикий тип
15 164,14 3 220 Дикий тип Дикий тип
16 89, 09 4 189 Дикий тип Дикий тип
17 -45,86 4 54,14 Дикий тип Дикий тип
18 -95,65 6 7,34 Дикий тип Дикий тип
19 -71,19 11 196,86 Дикий тип Дикий тип
20 -30,88 21 89, 3 Дикий тип Дикий тип
21 -74,43 10 46, 91 Дикий тип Дикий тип
22 -82,7 25 0, 19 Дикий тип Дикий тип
23 97,78 8 222,46 Дикий тип Дикий тип
24 -74,86 25 4,89 Дикий тип Дикий тип
25 -30,07 12 161 Дикий тип Дикий тип
26 96,51 5 214,85 Дикий тип Дикий тип
27 -0,89 13 20, 69 Дикий тип Дикий тип
28 -33,59 10 126 Дикий тип Дикий тип
29 -58,44 13 105 Дикий тип Дикий тип
Пример 16. Способ создания клеточных линий для скрининга лекарственных средств
Для выявления соединений, которые сохраняют активность в качестве антагониста АК в контексте мутации Γ876Ι, андрогенного рецептора, можно использовать ряд анализов ιη νΐίΓο и ιη νίνο, как описано выше.
В условиях ιη νΐίΓο для выявления соединений, не имеющих активности в качестве агониста и проявляющих полный антагонизм к транскрипционной активности как АК дикого типа, так и мутантного АК Γ876Ρ, применяется анализ транскрипции после временной трансфекции, аналогичный описанному в примере 8. Для такого скрининга используют клетки НЕРС2 или любую эукариотическую клетку, в ко- 61 029563
торой можно контролировать транскрипционную активность АК.
В качестве альтернативы временной трансфекции в ряд клеточных линий стабильно встраивают транскрипционный репортер и АК Р876Ь, которые могут применяться для скрининга соединений. Стабильное встраивание мутантного АК Р876Ь в клеточную линию андрогенчувствительного рака предстательной железы, такую как ^NСаΡ, ЬаРС4 или УСаР, путем встраивания с применением плазмиды (т.е. рС^NА3.1) или вирусов позволяет проводить скрининг и оценку соединений в условиях анализа транскрипции, пролиферации и использования ксенотрансплантатов. Вкратце, АК Р876Ь клонируют в ретровирусный вектор экспрессии, такой как рфСХ1Р (С1оп!есЬ, г. Маунтин-Вью, штат Калифорния, США). Затем полученную плазмиду применяют для создания вирусных матричных растворов с высоким титром для применения при создании клеточных линий со стабильной трансдукцией в соответствии с протоколом производителя. Полученные клеточные линии применяют для анализов транскрипции после временной трансфекции, как описано в примере 4, анализов транскрипции эндогенных генов, как описано в примере 5, анализов на пролиферацию, как описано в примере 3, или исследований с ксенотрансплантатами, как описано в примере 1.
Альтернативно клетки дополнительно модифицируют путем стабильного встраивания АКчувствительного репортера, такого как Слцпа1 ЬепЬ АК Керойег (ф1адеп, г. Валенсия, штат Калифорния, США), что позволяет проводить скрининг соединений на основе репортера, не требуя временной трансфекции.
Описанные в настоящем документе примеры и варианты осуществления приведены только с целью иллюстрации, и различные модификации или изменения, которые могут предложить специалисты в данной области, считаются входящими в сущность и сферу действия настоящей заявки и в объем приложенной формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Агадоп Рйагта.сеиЕ1са1з, 1пс.
Лозерй, Латез БауШ Надег, Ле££геу Н.
5епз1пЕа££аг, Лойп Ьее Ьи, МЫп
|21ап, Ляпд ЗтАДЬ, Ы1сйо1аз Ό.
<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ, НАПРАВЛЕННОЙ НА АНДРОГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР
<130> 38937-725.601
<150> 61/676,842
<151> 2012-07-27
<150> 61/783,763
<151> 2013-03-14
<150> 61/829,123
<151> 2013-05-30
<160> 63
<170> РаЬепНп, версия 3.5
<210> 1
<211> 919
<212> РКТ
<213> Ното заряепз
<400> 1
МеЕ О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго Зег
1 5 10 15
- 62 029563
Ьуз ТЬг Туг Агд С1у 20 А1а РЬе Θ1η Азп 25 Ьеи РЬе Θΐη Зег να1 30 Агд Θΐυ
ναΐ Не Θΐη Азп Рго С1у Рго Агд Н1з Рго О1и Λΐα Λΐα Зег Λΐα Λΐα
35 40 45
Рго Рго С1у А1а Зег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Θΐη Θΐη Θΐη Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η
50 55 60
Θΐη Θΐη Θΐη Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η Θΐη Θΐη Θ1η Θ1η Θ1η Θΐυ ТЬг
65 70 75 80
Зег Рго Агд Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η Θ1η О1у Θΐυ Азр Θΐν Зег Рго Θ1η
85 90 95
А1а Ηΐ3 Агд Агд С1у Рго ТЬг С1у Туг Ьеи να1 Ьеи Азр Θΐυ Θΐυ Θ1η
100 105 110
Θΐη Рго Зег Θ1η Рго Θ1η Зег А1а Ьеи О1и Суз Н1з Рго Θΐυ Агд Θΐν
115 120 125
Суз ναΐ Рго С1и Рго С1у А1а А1а ναΐ Λΐα Λΐα Зег Ьуз Θΐν Ьеи Рго
130 135 140
Θΐπ Θΐη Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр С1и Азр Азр Зег Λΐα Λΐα Рго Зег
145 150 155 160
ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи С1у Рго ТЬг РЬе Рго Θΐγ Ьеи Зег Зег Суз Зег
165 170 175
А1а Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег С1и Λΐα Зег ТЬг МеЬ Θ1η Ьеи Ьеи
180 185 190
Θΐη Θΐη Θΐη Θ1η Θ1η С1и А1а ναΐ Зег О1и Θΐγ Зег Зег Зег Θΐν Агд
195 200 205
А1а Агд С1и А1а Зег С1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп Туг Ьеи
210 215 220
Θ^ с1у ТЬг Зег ТЬг 11е Зег Азр Азп Λΐα Ьуз Θΐυ Ьеи Суз Ьуз Λΐα
225 230 235 240
ναΐ Зег ναΐ Зег МеЬ С1у Ьеи С1у να1 О1и Λΐα Ьеи Θΐυ Н1з Ьеи Зег
245 250 255
Рго с1у С1и Θ1η Ьеи Агд С1у Азр Суз МеЬ Туг Λΐα Рго Ьеи Ьеи Θΐν
260 265 270
- 63 029563
ναι Рго Рго 275 А1а Уа1 Агд Рго ТЬг 280 Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а 285 О1и Суз
Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и Азр ТЬг
290 295 300
А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи О1и О1у
305 310 315 320
О1и Зег Ьеи О1у Суз Зег О1у Зег А1а А1а А1а О1у Зег Зег О1у ТЬг
325 330 335
Ьеи О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи Азр
340 345 350
О1и А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а
355 360 365
Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд
370 375 380
11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а А1а
385 390 395 400
А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у А1а О1у
405 410 415
А1а А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег Зег Зег
420 425 430
Тгр Ηΐ3 ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз
435 440 445
О1у О1у О1у С1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у
450 455 460
О1у О1у О1у С1у О1у О1у О1у О1у О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг
465 470 475 480
О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у Ьеи А1а О1у О1п О1и Зег Азр РЬе
485 490 495
ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у МеЬ Уа1 Зег Агд Уа1 Рго
500 505 510
Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ Азр
515 520 525
- 64 029563
Зег Туг 530 Зег О1у Рго Туг О1у Азр МеЕ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр
535 540
Ηΐ3 Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи
545 550 555 560
11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз
565 570 575
О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз
580 585 590
Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд
595 600 605
Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЕ
610 615 620
ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п
625 630 635 640
О1и О1и О1у О1и А1а Зег Зег ТЬг ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг ТЬг
645 650 655
О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег Н1з 11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е
660 665 670
РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у
675 680 685
Ηΐ3 Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи
690 695 700
Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз
705 710 715 720
А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЕ А1а Уа1
725 730 735
11е С1п Туг Зег Тгр МеЕ О1у Ьеи МеЕ Уа1 РЬе А1а МеЕ О1у Тгр Агд
740 745 750
Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЕ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи
755 760 765
Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЕ Нгз Ьуз Зег Агд МеЕ Туг Зег О1п Суз
- 65 029563
770 775 780
ναι 785 Агд МеЬ Агд Н1з Ьеи 790 Зег О1п О1и РЬе О1у 795 Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг 800
Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е
805 810 815
Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЬ
820 825 830
Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп
835 840 845
Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр
850 855 860
Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи
865 870 875 880
Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеЬ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а
885 890 895
О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз
900 905 910
Рго 11е Туг РЬе Нтз ТЬг О1п
915
<210> 2
<211> 920
<212> РКТ
<213> Ното заргепз
<400> 2
МеЬ О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго Зег
1 5 10 15
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
ναι 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Зег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
50 55 60
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
- 66 029563
65 70 75 80
О1и ТЬг Зег Рго Агд О1п 85 О1п О1п О1п О1п 90 О1п О1у О1и Азр О1у 95 Зег
Рго О1п А1а Ηΐ3 Агд Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и
100 105 110
О1и О1п О1п Рго Зег О1п Рго О1п Зег А1а Ьеи О1и Суз Н1з Рго О1и
115 120 125
Агд С1у Суз Уа1 Рго О1и Рго О1у А1а А1а Уа1 А1а А1а Зег Ьуз О1у
130 135 140
Ьеи Рго О1п О1п Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а А1а
145 150 155 160
Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег
165 170 175
Суз Зег А1а Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а Зег ТЬг МеЕ О1п
180 185 190
Ьеи Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег
195 200 205
С1у Агд А1а Агд О1и А1а Зег О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп
210 215 220
Туг Ьеи С1у С1у ТЬг Зег ТЬг 11е Зег Азр Азп А1а Ьуз О1и Ьеи Суз
225 230 235 240
Ьуз А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з
245 250 255
Ьеи Зег Рго С1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Ьеи
260 265 270
Ьеи С1у Уа1 Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а
275 280 285
О1и Суз Ьуз С1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и
290 295 300
Азр ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи
305 310 315 320
- 67 029563
О1и О1у О1и Зег Ьеи 325 О1у Суз Зег О1у Зег А1а А1а А1а О1у Зег Зег
330 335
О1у ТЬг Ьеи О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а
340 345 350
Ьеи Азр О1и А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго
355 360 365
Ьеи А1а Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з
370 375 380
А1а Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а
385 390 395 400
А1а А1а А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у
405 410 415
А1а О1у А1а А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег
420 425 430
Зег Зег Тгр Ηΐ3 ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у
435 440 445
Рго Суз О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у
450 455 460
О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго
465 470 475 480
Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у Ьеи А1а О1у О1п О1и Зег Азр
485 490 495
РЬе ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у Мек Уа1 Зег Агд Уа1
500 505 510
Рго Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз Зег О1и Мек О1у Рго Тгр Мек
515 520 525
Азр Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр Мек Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд
530 535 540
Азр Ηΐ3 Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз
545 550 555 560
Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг
565 570 575
- 68 029563
Суз О1у Зег Суз 580 Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз 585 Агд А1а А1а О1и О1у 590 Ьуз О1п
Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд
595 600 605
Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у
610 615 620
МеЬ ТЬг Ьеи С1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи
625 630 635 640
О1п О1и О1и С1у О1и А1а Зег Зег ТЬг ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг
645 650 655
ТЬг О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег Н1з 11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго
660 665 670
11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а
675 680 685
О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег
690 695 700
Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а
705 710 715 720
Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЬ А1а
725 730 735
ναι 11е О1п Туг Зег Тгр МеЬ О1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр
740 745 750
Агд Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр
755 760 765
Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЬ Н1з Ьуз Зег Агд МеЬ Туг Зег О1п
770 775 780
Суз Уа1 Агд МеЬ Агд Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е
785 790 795 800
ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е
805 810 815
11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд
820 825 830
- 69 029563
МеЬ Азп Туг 835 11е Ьуз О1и Ьеи Азр 840 Агд 11е 11е А1а Суз 845 Ьуз Агд Ьуз
Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи
850 855 860
Азр Зег Уа1 С1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Нтз С1п РЬе ТЬг РЬе Азр
865 870 875 880
Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Нтз МеЬ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ
885 890 895
А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 С1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1
900 905 910
Ьуз Рго 11е Туг РЬе Нтз ТЬг С1п
915 920
<210> 3
<211> 369
<212> РКТ
<213> Ното зартепз
<400> 3
Туг Туг РЬе Рго Рго С1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а
1 5 10 15
Зег О1у Суз Нтз Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе
20 25 30
РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз С1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд
35 40 45
Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз
50 55 60
Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз
65 70 75 80
Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег
85 90 95
Зег ТЬг ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг ТЬг С1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег
100 105 110
Нтз 11е О1и О1у Туг О1и Суз С1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и
115 120 125
- 70 029563
А1а 11е 130 О1и Рго О1у Уа1 Уа1 135 Суз А1а О1у Нтз Азр 140 Азп Азп О1п Рго
Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд
145 150 155 160
О1п Ьеи Уа1 Нтз Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд
165 170 175
Азп Ьеи Нтз Уа1 Азр Азр О1п МеЕ А1а Уа1 11е О1п Туг Зег Тгр МеЕ
180 185 190
О1у Ьеи МеЕ Уа1 РЬе А1а МеЕ О1у Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп
195 200 205
Зег Агд МеЕ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд
210 215 220
МеЕ Нтз Ьуз Зег Агд МеЕ Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд МеЕ Агд Нтз Ьеи
225 230 235 240
Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз
245 250 255
МеЕ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз
260 265 270
Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЕ Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи
275 280 285
Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд
290 295 300
Агд РЬе Туг С1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а
305 310 315 320
Агд О1и Ьеи Нтз О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Нтз МеЕ
325 330 335
ναι Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п
340 345 350
ναι Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе Нтз ТЬг
355 360 365
О1п
- 71 029563
<210> 4
<211> 230
<212> РКТ
<213> Ното зар1епз
<400> 4
Азр Азп Азп 1 О1п Рго 5 Азр Бег РНе А1а А1а 10 Ьеи Ьеи Бег Бег Ьеи 15 Азп
О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а
20 25 30
Ьеи Рго О1у РНе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЕ А1а Уа1 11е
35 40 45
О1п Туг Бег Тгр МеЕ О1у Ьеи МеЕ Уа1 РНе А1а МеЕ О1у Тгр Агд Бег
50 55 60
РНе ТНг Азп Уа1 Азп Бег Агд МеЕ Ьеи Туг РНе А1а Рго Азр Ьеи Уа1
65 70 75 80
РНе Азп О1и Туг Агд МеЕ Н1з Ьуз Бег Агд МеЕ Туг Бег О1п Суз Уа1
85 90 95
Агд МеЕ Агд Н1з Ьеи Бег О1п О1и РНе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТНг Рго
100 105 110
С1п О1и РНе Ьеи Суз МеЕ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РНе Бег 11е 11е Рго
115 120 125
Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РНе РНе Азр О1и Ьеи Агд МеЕ Азп
130 135 140
Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго
145 150 155 160
ТНг Бег Суз Бег Агд Агд РНе Туг О1п Ьеи ТНг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Бег
165 170 175
Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РНе ТНг РНе Азр Ьеи Ьеи
180 185 190
11е Ьуз Бег Н1з МеЕ Уа1 Бег Уа1 Азр РНе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и
195 200 205
11е 11е Бег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Бег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго
- 72 029563
210 215 220
11е Туг РЬе Н1з ТЬг О1п 225 230
<210> 5
<211> 919
<212> РКТ
<213> Ното зар1епз
<400> 5
МеЕ 1 О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Бег
5 10
Ьуз ТЬг Туг Агд С1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Бег Уа1 Агд О1и
20 25 30
ναι 11е О1п Азп Рго С1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Бег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго С1у А1а Бег Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
50 55 60
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и ТЬг
65 70 75 80
Бег Рго Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1у О1и Азр О1у Бег Рго О1п
85 90 95
А1а Н1з Агд Агд С1у Рго ТЬг С1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и О1и О1п
100 105 110
О1п Рго Бег О1п Рго О1п Бег А1а Ьеи О1и Суз Н1з Рго О1и Агд О1у
115 120 125
Суз Уа1 Рго О1и Рго С1у А1а А1а Уа1 А1а А1а Бег Ьуз О1у Ьеи Рго
130 135 140
О1п О1п Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Бег А1а А1а Рго Бег
145 150 155 160
ТЬг Ьеи Бег Ьеи Ьеи С1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Бег Бег Суз Бег
165 170 175
А1а Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Бег О1и А1а Бег ТЬг МеЕ О1п Ьеи Ьеи
180 185 190
О1п О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1 Бег О1и О1у Бег Бег Бег О1у Агд
- 73 029563
195 200 205
А1а Агд О1и А1а Бег О1у А1а Рго ТЬг Бег Бег Ьуз Азр Азп Туг Ьеи
210 215 220
О1у О1у ТЬг Бег ТЬг 11е Бег Азр Азп А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а
225 230 235 240
ναι Бег Уа1 Бег МеЬ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Бег
245 250 255
Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЬ Туг А1а Рго Ьеи Ьеи О1у
260 265 270
ναι Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и Суз
275 280 285
Ьуз О1у Бег Ьеи Ьеи Азр Азр Бег А1а О1у Ьуз Бег ТЬг О1и Азр ТЬг
290 295 300
А1а О1и Туг Бег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи О1и О1у
305 310 315 320
О1и Бег Ьеи О1у Суз Бег О1у Бег А1а А1а А1а О1у Бег Бег О1у ТЬг
325 330 335
Ьеи О1и Ьеи Рго Бег ТЬг Ьеи Бег Ьеи Туг Ьуз Бег О1у А1а Ьеи Азр
340 345 350
О1и А1а А1а А1а Туг О1п Бег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а
355 360 365
Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд
370 375 380
11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Бег А1а Тгр А1а А1а А1а
385 390 395 400
А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Бег Ьеи Н1з О1у А1а О1у
405 410 415
А1а А1а О1у Рго О1у Бег О1у Бег Рго Бег А1а А1а А1а Бег Бег Бег
420 425 430
Тгр Ηΐ3 ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз
435 440 445
- 74 029563
Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θ^ Θ^ Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θ^ 460 Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν
450 455
Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐν Θΐυ Λΐα Θΐν Λΐα ναΐ Λΐα Рго Туг
465 470 475 480
Θ^ Туг ТЬг Агд Рго Рго Θΐη Θΐν Ьеи Λΐα Θΐν Θΐη Θΐυ Зег Азр РЬе
485 490 495
ТЬг Λΐα Рго Азр ναΐ Тгр Туг Рго Θΐν Θΐν МеЬ ναΐ Зег Агд ναΐ Рго
500 505 510
Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз ναΐ Ьуз Зег Θΐυ МеЬ Θΐν Рго Тгр МеЬ Азр
515 520 525
Зег Туг Зег Θΐν Рго Туг Θΐν Азр МеЬ Агд Ьеи Θΐυ ТЬг Λΐα Агд Азр
530 535 540
Нгз ναΐ Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго Θΐη Ьуз ТЬг Суз Ьеи
545 550 555 560
11е Суз Θΐν Азр Θΐυ Λΐα Зег Θΐν Суз Нгз Туг Θΐν Λΐα Ьеи ТЬг Суз
565 570 575
Θ^ Зег Суз Ьуз ναΐ РЬе РЬе Ьуз Агд Λΐα Λΐα Θΐυ Θΐν Ьуз Θΐη Ьуз
580 585 590
Туг Ьеи Суз Λΐα Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд
595 600 605
Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг Θΐυ Λΐα Θΐν МеЬ
610 615 620
ТЬг Ьеи Θΐν Λΐα Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Θΐν Азп Ьеи Ьуз Ьеи Θΐη
625 630 635 640
Θΐυ Θΐυ Θΐν Θΐυ Λΐα Зег Зег ТЬг ТЬг Зег Рго ТЬг Θΐυ Θΐυ ТЬг ТЬг
645 650 655
Θ1η Ьуз Ьеи ТЬг ναΐ Зег Нгз 11е Θΐυ Θΐν Туг Θΐυ Суз Θΐη Рго 11е
660 665 670
РЬе Ьеи Азп ναΐ Ьеи Θΐυ Λΐα 11е Θΐυ Рго Θΐν ναΐ ναΐ Суз Λΐα Θΐν
675 680 685
Нгз Азр Азп Азп Θΐη Рго Азр Зег РЬе Λΐα Λΐα Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи
690 695 700
- 75 029563
Азп О1и 705 Ьеи О1у О1и Агд 710 С1п Ьеи Уа1 Нтз Уа1 715 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз 720
А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Нтз Уа1 Азр Азр О1п МеЬ А1а Уа1
725 730 735
11е О1п Туг Зег Тгр МеЬ С1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр Агд
740 745 750
Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи
755 760 765
Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЬ Нтз Ьуз Зег Агд МеЬ Туг Зег С1п Суз
770 775 780
ναι Агд МеЬ Агд Н1з Ьеи Зег С1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи С1п 11е ТЬг
785 790 795 800
Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е
805 810 815
Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп С1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЬ
820 825 830
Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп
835 840 845
Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг С1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр
850 855 860
Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Нтз О1п Ьеи ТЬг РЬе Азр Ьеи
865 870 875 880
Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеЬ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а
885 890 895
О1и 11е 11е Зег Уа1 С1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз
900 905 910
Рго 11е Туг РЬе Нтз ТЬг С1п
915
<210> 6
<211> 902
<212> РКТ
<213> КаЬЬиз по^νедίсиз
<400> 6
- 76 029563
Меб 1 О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
5 10
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
А1а 11е О1п Азп Рго С1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег 11е А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Суз Ьеи О1п О1п Агд О1п О1и ТЬг Зег Рго Агд Агд
50 55 60
Агд Агд Агд О1п О1п Н1з Рго О1и Азр О1у Зег Рго О1п А1а Н1з 11е
65 70 75 80
Агд О1у ТЬг ТЬг С1у Туг Ьеи А1а Ьеи О1и О1и О1и О1п О1п Рго Зег
85 90 95
О1п О1п О1п Зег А1а Зег О1и С1у Н1з Рго О1и Зег О1у Суз Ьеи Рго
100 105 110
О1и Рго О1у А1а А1а ТЬг А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи Рго О1п О1п Рго
115 120 125
Рго А1а Рго Рго Азр О1п Азр Азр Зег А1а А1а Рго Зег ТЬг Ьеи Зег
130 135 140
Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго С1у Ьеи Зег Зег Суз Зег А1а Азр 11е
145 150 155 160
Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а С1у ТЬг Меб О1п Ьеи Ьеи О1п О1п О1п
165 170 175
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
180 185 190
О1п О1п О1п О1и Уа1 11е Зег О1и О1у Зег Зег Зег Уа1 Агд А1а Агд
195 200 205
О1и А1а ТЬг О1у А1а Рго Зег Зег Зег Ьуз Азр Зег Туг Ьеи О1у О1у
210 215 220
Азп Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Зег
225 230 235 240
Уа1 Зег Меб О1у Ьеи С1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Нтз Ьеи Зег Рго О1у
245 250 255
- 77 029563
О1и Οίη Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг 265 А1а Зег Ьеи Ьеи О1у 270 О1у Рго
260
Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и Суз Ьуз О1у
275 280 285
Ьеи Зег Ьеи Азр О1и О1у Рго О1у Ьуз О1у ТЬг О1и О1и ТЬг А1а О1и
290 295 300
Туг Зег Зег РЬе Ьуз О1у О1у Туг А1а Ьуз О1у Ьеи О1и О1у О1и Зег
305 310 315 320
Ьеи О1у Суз Зег О1у Зег Зег О1и А1а О1у Зег Зег О1у ТЬг Ьеи О1и
325 330 335
11е Рго Зег Зег Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Уа1 Азр О1и А1а
340 345 350
А1а А1а Туг Ο1η Азп Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а Ьеи Зег
355 360 365
О1у Рго Рго Ηΐ3 Рго Рго Рго Рго ТЬг Н1з Рго Н1з А1а Агд 11е Ьуз
370 375 380
Ьеи О1и Азп Рго Зег Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а А1а А1а А1а
385 390 395 400
Ο1η Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у О1у Зег Уа1 А1а
405 410 415
О1у Рго Зег ТЬг О1у Зег Рго Рго А1а ТЬг А1а Зег Зег Зег Тгр Н1з
420 425 430
ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у Ο1η Ьеи Туг О1у Рго О1у О1у О1у
435 440 445
О1у О1у Зег Зег Зег Рго Зег Азр А1а О1у Рго Уа1 А1а Рго Туг О1у
450 455 460
Туг ТЬг Агд Рго Рго Ο1η О1у Ьеи А1а Зег Ο1η О1и О1у Азр РЬе Зег
465 470 475 480
А1а Зег О1и Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у Уа1 Уа1 Азп Агд Уа1 Рго Туг
485 490 495
Рго Зег Рго Зег Суз Уа1 Ьуз Зег О1и МеЕ О1у Рго Тгр МеЕ О1и Азп
- 78 029563
500 505 510
Туг Зег С1у Рго Туг О1у Азр МеЬ Агд Ьеи Азр Зег ТЬг Агд Азр Н1з
515 520 525
ναι Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго С1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е
530 535 540
Суз С1у Азр О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у
545 550 555 560
Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз С1п Ьуз Туг
565 570 575
Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз
580 585 590
Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг
595 600 605
Ьеи С1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и
610 615 620
О1и С1у С1и Азп Зег Зег А1а О1у Зег Рго ТЬг О1и Азр Рго Зег О1п
625 630 635 640
Ьуз МеЬ ТЬг Уа1 Зег Н1з 11е О1и О1у Туг О1и Суз С1п Рго 11е РЬе
645 650 655
Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з
660 665 670
Азр Азп Азп С1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп
675 680 685
О1и Ьеи С1у О1и Агд С1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а
690 695 700
Ьеи Рго С1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр С1п МеЬ А1а Уа1 11е
705 710 715 720
С1п Туг Зег Тгр МеЬ О1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр Агд Зег
725 730 735
РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1
740 745 750
- 79 029563
РЬе Азп О1и 755 Туг Агд МеЕ Н1з Ьуз 760 Зег Агд МеЕ Туг Зег 765 О1п Суз Уа1
Агд МеЕ Агд Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго
770 775 780
О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЕ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго
785 790 795 800
Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЕ Азп
805 810 815
Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго
820 825 830
ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег
835 840 845
Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи
850 855 860
11е Ьуз Зег Н1з МеЕ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и
865 870 875 880
11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго
885 890 895
11е Туг РЬе Нгз ТЬг О1п
900
<210> 7
<211> 899
<212> РКТ
<213> Миз тизси1из
<400> 7
МеЕ 1 О1и Уа1 О1п Ьеи 5 О1у Ьеи О1у Агд Уа1 10 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
Ьуз ТЬг Туг Агд 20 О1у А1а РЬе О1п Азп 25 Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 30 Агд О1и
А1а 11е О1п 35 Азп Рго О1у Рго Агд 40 Н1з Рго О1и А1а А1а 45 Азп 11е А1а
Рго Рго 50 О1у А1а Суз Ьеи О1п 55 О1п Агд О1п О1и ТЬг 60 Зег Рго Агд Агд
- 80 029563
Агд Агд Агд Ο1η Ο1η Нтз ТЬг О1и Азр О1у Зег 75 Рго Ο1η А1а Н1з 11е 80
65 70
Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи А1а Ьеи О1и О1и О1и Ο1η Ο1η Рго Зег
85 90 95
Οίη Ο1η Ο1η А1а А1а Зег О1и О1у Н1з Рго О1и Зег Зег Суз Ьеи Рго
100 105 110
О1и Рго О1у А1а А1а ТЬг А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи Рго Ο1η Ο1η Рго
115 120 125
Рго А1а Рго Рго Азр Ο1η Азр Азр Зег А1а А1а Рго Зег ТЬг Ьеи Зег
130 135 140
Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз Зег А1а Азр 11е
145 150 155 160
Ьуз Азр 11е Ьеи Азп О1и А1а О1у ТЬг МеЬ Ο1η Ьеи Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η
165 170 175
Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Н1з Ο1η Ο1η Ο1η Н1з Ο1η Ο1η Н1з Ο1η Ο1η Ο1η
180 185 190
Ο1η О1и Уа1 11е Зег О1и О1у Зег Зег А1а Агд А1а Агд О1и А1а ТЬг
195 200 205
О1у А1а Рго Зег Зег Зег Ьуз Азр Зег Туг Ьеи О1у О1у Азп Зег ТЬг
210 215 220
11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЬ
225 230 235 240
О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег Рго О1у О1и Ο1η Ьеи
245 250 255
Агд О1у Азр Суз МеЬ Туг А1а Зег Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Рго А1а Уа1
260 265 270
Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи Рго О1и Суз Ьуз О1у Ьеи Рго Ьеи
275 280 285
Азр О1и О1у Рго О1у Ьуз Зег ТЬг О1и О1и ТЬг А1а О1и Туг Зег Зег
290 295 300
РЬе Ьуз О1у О1у Туг А1а Ьуз О1у Ьеи О1и О1у О1и Зег Ьеи О1у Суз
305 310 315 320
- 81 029563
Зег О1у Зег Зег О1и А1а 325 О1у Зег Зег О1у ТЬг 330 Ьеи О1и 11е Рго 335 Зег
Зег Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи Азр О1и А1а А1а А1а Туг
340 345 350
О1п Азп Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а Ьеи Зег О1у Рго Рго
355 360 365
Ηΐ3 Рго Рго Рго Рго ТЬг Н1з Рго Н1з А1а Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп
370 375 380
Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а А1а А1а А1а С1п Суз Агд
385 390 395 400
Туг О1у Азр Ьеи О1у Зег Ьеи Н1з О1у О1у Зег Уа1 А1а О1у Рго Зег
405 410 415
ТЬг О1у Зег Рго Рго А1а ТЬг ТЬг Зег Зег Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе
420 425 430
ТЬг А1а О1и О1и О1у С1п Ьеи Туг О1у Рго О1у О1у О1у О1у О1у Зег
435 440 445
Зег Зег Рго Зег Азр А1а О1у Рго Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд
450 455 460
Рго Рго С1п О1у Ьеи ТЬг Зег С1п О1и Зег Азр Туг Зег А1а Зег О1и
465 470 475 480
Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у Уа1 Уа1 Азп Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго
485 490 495
Азп Суз Уа1 Ьуз Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ О1и Азп Туг Зег О1у
500 505 510
Рго Туг О1у Азр МеЬ Агд Ьеи Азр Зег ТЬг Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго
515 520 525
11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго С1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр
530 535 540
О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз
545 550 555 560
Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз С1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а
565 570 575
- 82 029563
Зег Агд Азп Азр 580 Суз ТЬг 11е Азр Ьуз 585 РЬе Агд Агд Ьуз Азп 590 Суз Рго
Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у А1а
595 600 605
Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и
610 615 620
Азп Зег Азп А1а О1у Зег Рго ТЬг О1и Азр Рго Зег О1п Ьуз МеЬ ТЬг
625 630 635 640
Уа1 Зег Н1з 11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1
645 650 655
Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп Азп
660 665 670
О1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у
675 680 685
О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у
690 695 700
РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЬ А1а Уа1 11е О1п Туг Зег
705 710 715 720
Тгр МеЬ О1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп
725 730 735
Уа1 Азп Зег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и
740 745 750
Туг Агд МеЬ Н1з Ьуз Зег Агд МеЬ Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд МеЬ Агд
755 760 765
Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе
770 775 780
Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у
785 790 795 800
Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЬ Азп Туг 11е Ьуз
805 810 815
О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз
- 83 029563
820 825 830
Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго
835 840 845
11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег
850 855 860
Н1з МеЬ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а О1и 11е 11е Зег
865 870 875 880
Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе
885 890 895
Нгз ТЬг О1п
<210> 8
<211> 907
<212> РКТ
<213> ι Сапгз ЕашШагтз
<400> 8
МеЬ О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго Зег
1 5 10 15
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
Уа1 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а Уа1 Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Н1з Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
50 55 60
О1и ТЬг Зег Рго Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1у Азр Азр О1у
65 70 75 80
Зег Рго О1п А1а О1п Зег Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи А1а Ьеи Азр
85 90 95
О1и О1и О1п О1п Рго Зег О1п О1п Агд Зег А1а Зег Ьуз О1у Н1з Рго
100 105 110
О1и Зег А1а Суз Уа1 Рго О1и Рго О1у Уа1 ТЬг Зег А1а ТЬг О1у Ьуз
115 120 125
О1у Ьеи О1п О1п О1п О1п Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азп Азр Зег А1а
- 84 029563
130 135 140
А1а 145 Рго Зег ТЬг Ьеи Зег 150 Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг 155 РЬе Рго О1у Ьеи Зег 160
Зег Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а О1у ТЬг МеЕ
165 170 175
О1п Ьеи Ьеи О1п О1п О1п Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
180 185 190
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и Уа1 Уа1 Зег О1и О1у
195 200 205
Зег Зег Зег О1у Агд А1а Агд О1и А1а А1а О1у А1а Зег ТЬг Зег Зег
210 215 220
Ьуз Азр Зег Туг Ьеи О1у О1у Зег Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз
225 230 235 240
О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а
245 250 255
Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг
260 265 270
А1а Рго Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго Суз А1а Рго Ьеи
275 280 285
А1а О1и Суз Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр О1у Рго О1у Ьуз О1у ТЬг
290 295 300
О1и О1и ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз А1а О1у Туг А1а Ьуз О1у
305 310 315 320
Ьеи Азр О1у Азр Зег Ьеи О1у Суз Зег Зег Зег Зег О1и А1а О1у О1у
325 330 335
Зег О1у ТЬг Ьеи О1и МеЕ Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у
340 345 350
А1а Ьеи Азр О1и А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе
355 360 365
Рго Ьеи Зег Ьеи О1у О1у Рго Рго Рго Нгз Рго Рго Рго Рго Нгз Рго
370 375 380
- 85 029563
Н1з 385 ТЬг Агд 11е Ьуз Ьеи 390 О1и Азп Рго Ьеи Азр 395 Туг О1у Зег А1а Тгр 400
А1а А1а А1а А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з
405 410 415
О1у А1а О1у А1а А1а О1у Рго Зег Зег О1у Зег Рго Зег А1а ТЬг ТЬг
420 425 430
Зег Зег Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг
435 440 445
О1у Рго Суз О1у О1у Зег О1у О1у О1у Зег А1а О1у Азр О1у О1у Зег
450 455 460
Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у Ьеи А1а О1у О1п
465 470 475 480
О1и О1у Азр РЬе Рго Рго Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у Уа1 Уа1
485 490 495
Зег Агд Уа1 Рго РЬе Рго Зег Рго Зег Суз Уа1 Ьуз Зег О1и МеЬ О1у
500 505 510
Зег Тгр МеЬ О1и Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр МеЬ Агд Ьеи О1и
515 520 525
ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п
530 535 540
Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1у
545 550 555 560
А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и
565 570 575
О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр
580 585 590
Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг
595 600 605
О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп
610 615 620
Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег Азп Уа1 ТЬг Зег Рго ТЬг
625 630 635 640
- 86 029563
О1и О1и Рго ТЬг О1п 645 Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег 650 Н1з 11е О1и О1у Туг 655 О1и
Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1
660 665 670
να1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи
675 680 685
Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1
690 695 700
Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр
705 710 715 720
О1п МеЕ А1а Уа1 11е О1п Туг Зег Тгр МеЕ О1у Ьеи МеЕ Уа1 РЬе А1а
725 730 735
МеЕ О1у Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЕ Ьеи Туг РЬе
740 745 750
А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЕ Н1з Ьуз Зег Агд МеЕ
755 760 765
Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд МеЕ Агд Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр
770 775 780
Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЕ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи
785 790 795 800
РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр
805 810 815
О1и Ьеи Агд МеЕ Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз
820 825 830
Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг
835 840 845
Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе
850 855 860
ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеЕ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго
865 870 875 880
О1и МеЕ МеЕ А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег
885 890 895
- 87 029563
О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе НЬз ТЬг О1п 900 905
<210> 9
<211> 912
<212> РКТ
<213> СгосиЬа сгосиЬа
<400> 9
МеЬ 1 О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
5 10
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
Уа1 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд НЬз Рго О1и А1а ТЬг Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Агд Ьеи О1п О1п О1п НЬз О1п НЬз О1п О1п О1п НЬз
50 55 60
О1п НЬз О1и ТЬг Зег Рго Агд Агд О1п О1п О1п О1п О1п Рго О1и Азр
65 70 75 80
О1у Зег Рго О1п Агд Рго Зег Агд О1у Рго ТЬг Зег Туг Ьеи А1а Ьеи
85 90 95
Азр О1и О1и О1п О1п Рго Зег О1п НЬз О1п Зег А1а Ьуз О1у НЬз Рго
100 105 110
О1и Зег О1у Суз Уа1 Рго О1и Рго Уа1 А1а МеЬ Зег Агд ТЬг О1у Ьуз
115 120 125
О1у Ьеи О1и О1п О1п О1п Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а
130 135 140
А1а Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег
145 150 155 160
Зег Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а О1у ТЬг МеЬ
165 170 175
О1п Ьеи Ьеи О1п Агд О1п Агд О1п Агд О1п О1п О1п Агд О1п О1п О1п
180 185 190
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и
195 200 205
- 88 029563
Уа1 Уа1 210 Бег О1и О1у О1у Бег 215 Бег О1у Агд А1а Агд О1и А1а А1а О1у 220
А1а Рго ТНг Бег Бег Ьуз Азр Бег Туг Ьеи О1у О1у Бег Бег ТНг 11е
225 230 235 240
Бег Азр Бег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Бег Уа1 Бег МеЕ О1у
245 250 255
Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Бег Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд
260 265 270
О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Рго Рго Уа1 Суз
275 280 285
Рго Суз А1а Рго Ьеи ТНг О1и Суз Ьуз О1у Бег Уа1 Ьеи Азр Азр О1у
290 295 300
Рго Бег Ьуз О1у ТНг О1и О1и ТНг А1а О1и Туг Бег Рго РНе Ьуз ТНг
305 310 315 320
О1у Туг А1а Ьуз О1у Ьеи Азр О1у Азр Бег Ьеи О1у Суз Бег О1у Бег
325 330 335
Бег О1п А1а О1у О1у Бег О1у ТНг Ьеи О1и 11е Рго Бег ТНг Ьеи Бег
340 345 350
Ьеи Туг Ьуз Бег О1у ТНг Ьеи Азр О1и А1а А1а А1а Туг О1п Бег Агд
355 360 365
Азр Туг Туг Азп РНе О1п Ьеи Бег Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго
370 375 380
Рго Бег Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр
385 390 395 400
Туг О1у Бег А1а Тгр А1а А1а А1а А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр
405 410 415
Ьеи А1а Бег Ьеи Н1з О1у О1у О1у А1а А1а О1у Рго О1у Бег О1у Бег
420 425 430
Рго Бег А1а ТНг А1а Бег Бег Бег Тгр Н1з ТНг Ьеи РНе ТНг А1а О1и
435 440 445
О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз О1у О1у Бег О1у О1у О1у О1у ТНг
- 89 029563
450 455 460
О1у 465 О1и Зег Уа1 Зег Уа1 470 ТЬг Рго Туг О1у Туг 475 ТЬг Агд Рго О1п О1п 480
О1у Ьеи ТЬг О1у О1п О1и О1у Азр РЬе Рго Рго Рго Азр Уа1 Тгр Туг
485 490 495
Рго О1у О1у Уа1 Уа1 Зег Агд Мек Рго Туг Рго Зег А1а Зег Суз Уа1
500 505 510
Ьуз Зег О1и Мек О1у Рго Тгр Мек О1и Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у
515 520 525
Азр Мек Агд Ьеи О1и ТЬг ТЬг Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг
530 535 540
Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег
545 550 555 560
О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе
565 570 575
Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп
580 585 590
Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Рго Суз Агд
595 600 605
Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у Мек ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Агд Ьеи
610 615 620
Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег Зег
625 630 635 640
ТЬг ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг ТЬг О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег Н1з
645 650 655
11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а
660 665 670
11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр
675 680 685
Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п
690 695 700
- 90 029563
Ьеи 705 ναΐ Н1з ναΐ ναΐ Ьуз 710 Тгр Λΐα Ьуз Λΐα Ьеи 715 Рго Θΐν РЬе Агд Азп 720
Ьеи Н1з ναΐ Азр Азр Θΐη МеТ Λΐα ναΐ 11е Θΐη Туг Зег Тгр МеТ Θΐν
725 730 735
Ьеи МеТ ναΐ РЬе Λΐα МеТ Θΐν Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп ναΐ Азп Зег
740 745 750
Агд МеТ Ьеи Туг РЬе Λΐα Рго Азр Ьеи ναΐ РЬе Азп Θΐυ Туг Агд МеТ
755 760 765
Н1з Ьуз Зег Агд МеТ Туг Зег Θΐη Суз ναΐ Агд МеТ Агд Н1з Ьеи Зег
770 775 780
Θΐη Θΐυ РЬе Θΐν Тгр Ьеи Θΐη 11е ТЬг Рго Θΐη Θΐυ РЬе Ьеи Суз МеТ
785 790 795 800
Ьуз Λΐα Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго ναΐ Азр Θΐν Ьеи Ьуз Азп
805 810 815
Θΐη Ьуз РЬе РЬе Азр Θΐυ Ьеи Агд МеТ Азп Туг 11е Ьуз Азр Ьеи Азр
820 825 830
Агд 11е 11е Λΐα Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд
835 840 845
РЬе Туг Θΐη Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег ναΐ Θΐη Рго 11е Λΐα Агд
850 855 860
Θΐυ Ьеи Н1з Θΐη РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеТ ναΐ
865 870 875 880
Зег ναΐ Азр РЬе Рго Θΐυ МеТ МеТ Λΐα Θΐυ 11е 11е Зег ναΐ Θΐη ναΐ
885 890 895
Рго Ьуз 11е Ьеи Зег Θΐν Ьуз ναΐ Ьуз Рго 11е Туг РЬе Н1з ТЬг Θΐη
900 905 910
<210> 10
<211> 884
<212> РКТ
<213> Еи1етиг Ти1чиз
<400> 10
МеТ Θ1ώ. ναΐ Θΐη Ьеи Θΐν Ьеи Θΐν Агд ναΐ Туг Рго Агд Рго Рго Зег 1 5 10 15
- 91 029563
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у 20 А1а РЬе Ο1η Азп 25 Ьеи РЬе Ο1η Зег Уа1 30 Агд О1и
Уа1 11е Ο1η Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Агд Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η О1и ТЬг Зег Рго Рго Ο1η
50 55 60
Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η О1у О1и Азр О1у Зег Рго Ο1η А1а Ο1η Зег
65 70 75 80
Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи А1а Ьеи Азр О1и О1и Ο1η Ο1η Рго Зег
85 90 95
Ο1η Ο1η Ο1η Зег А1а Ьеи О1и Суз Н1з Рго О1и Зег О1у Суз Уа1 Рго
100 105 110
О1и Рго О1у А1а А1а А1а А1а А1а Зег Ьуз О1у Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η Рго
115 120 125
Рго А1а Рго Зег Азр О1и Азр Азр Зег А1а Уа1 Рго Зег ТЬг Ьеи Зег
130 135 140
Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз Зег А1а Азр Ьеи
145 150 155 160
Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а О1у ТЬг МеЕ Ο1η Ьеи Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η
165 170 175
Ο1η Ο1η О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег О1у Агд А1а Агд О1и
180 185 190
А1а А1а О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Зег Туг Ьеи О1у О1у ТЬг
195 200 205
Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Зег Уа1
210 215 220
Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и ТЬг Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег Рго О1у О1и
225 230 235 240
Ο1η Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Рго
245 250 255
А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и Суз Ьуз О1у Зег
260 265 270
- 92 029563
Ьеи Ьеи Азр 275 Азр Зег А1а Азр Ьуз 280 О1у ТЬг О1и О1и Рго А1а О1и Туг 285
ТЬг Рго РЬе Ьуз О1у Зег Туг ТЬг О1п О1у Ьеи О1и О1у О1и Зег Ьеи
290 295 300
О1у Суз Зег О1у Зег Зег О1и А1а О1у Зег Зег О1у ТЬг Ьеи О1и Ьеи
305 310 315 320
Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи О1и О1и А1а А1а
325 330 335
Зег Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а Ьеи А1а О1у
340 345 350
Рго Рго Рго Рго Рго Ьеи Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд 11е Ьуз Ьеи
355 360 365
О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег Зег Тгр А1а А1а А1а А1а А1а О1п
370 375 380
Суз Агд РЬе О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у О1у О1у А1а ТЬг О1у
385 390 395 400
Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а А1а Зег Зег Тгр Н1з ТЬг
405 410 415
Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз О1у О1у О1у
420 425 430
О1у О1у О1у ТЬг Зег О1и А1а О1у А1а Уа1 ТЬг Рго Туг О1у Туг Зег
435 440 445
Агд Рго Рго О1п О1у Ьеи А1а О1у О1п О1и О1у Азр РЬе Рго А1а Рго
450 455 460
Азр Уа1 Тгр Туг Рго Зег О1у Уа1 Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег
465 470 475 480
Рго Зег Суз Уа1 Ьуз Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ О1и Зег Туг Зег
485 490 495
О1у Рго Туг О1у Азр Уа1 Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи
500 505 510
Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у
515 520 525
- 93 029563
Азр О1и 530 А1а Бег О1у Суз Н1з 535 Туг О1у А1а Ьеи ТЬг 540 Суз О1у Бег Суз
Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз
545 550 555 560
А1а Бег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз
565 570 575
Рго Бег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у
580 585 590
А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у
595 600 605
О1и А1а Бег Бег А1а ТЬг Бег Рго ТЬг О1и О1и Бег Бег О1п Ьуз Ьеи
610 615 620
ТЬг Уа1 Бег Н1з 11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп
625 630 635 640
Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп
645 650 655
Азп О1п Рго Азр Бег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Бег Бег Ьеи Азп О1и Ьеи
660 665 670
О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго
675 680 685
О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЬ А1а Уа1 11е О1п Туг
690 695 700
Бег Тгр МеЬ О1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр Агд Бег РЬе ТЬг
705 710 715 720
Азп Уа1 Азп Бег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп
725 730 735
О1и Туг Агд МеЬ Н1з Ьуз Бег Агд МеЬ Туг Бег О1п Суз Уа1 Агд МеЬ
740 745 750
Агд Н1з Ьеи Бег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и
755 760 765
РЬе Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Бег 11е 11е Рго Уа1 Азр
- 94 029563
770 775 780
О1у 785 Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз 790 РЬе РЬе Азр О1и Ьеи 795 Агд МеЕ Азп Туг 11е 800
Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Бег
805 810 815
Суз Бег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Бег Уа1 О1п
820 825 830
Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз
835 840 845
Бег Н1з МеЕ Уа1 Бег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и 11е 11е
850 855 860
Бег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Бег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг
865 870 875 880
РЬе Нгз ТЬг О1п
<210> 11
<211> 777
<212> РКТ
<213> ЬгЕЬоЬаЕез саЕезЬегапа
<400> 11
МеЕ О1и Уа1 Н1з 11е О1у Ьеи О1у О1у Уа1 Туг Ьуз О1п Рго Рго О1у
1 5 10 15
Ьуз МеЕ 11е Агд О1у А1а РЬе О1и Азп Ьеи РЬе Ьеи Бег Уа1 Агд О1и
20 25 30
А1а Ьеи О1п О1у О1и Агд Агд Бег А1а А1а Бег Ьеи Азр ТЬг Бег Бег
35 40 45
Рго 11е Бег А1а Суз Уа1 Н1з Рго Н1з Рго ТЬг Тгр Азп О1и Рго Бег
50 55 60
ТЬг Тгр ТЬг О1и Уа1 Агд О1у ТЬг Рго Тгр Агд О1и Рго О1п О1у А1а
65 70 75 80
О1п Рго Азр Рго Рго Рго Суз Бег Рго Агд Бег О1п А1а Рго О1п РЬе
85 90 95
ТЬг Ьеи Бег Бег Суз ТЬг ТЬг О1и Ьеи Ьуз О1и 11е Ьеи О1у О1и О1п
- 95 029563
100 105 110
О1у О1у МеЬ Рго О1и О1и О1у Азп Зег О1и Зег А1а Зег Ьуз О1и О1у
115 120 125
Туг Рго О1и Зег 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и 11е Суз Ьуз А1а Уа1
130 135 140
Зег Уа1 Зег Ьеи О1у Ьеи Зег МеЬ О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег А1а
145 150 155 160
А1а О1у О1и Тгр О1п Агд О1у Азр Суз МеЬ РЬе А1а О1у Рго Рго Н1з
165 170 175
Н1з ТЬг МеЬ О1у А1а О1п ТЬг Суз О1п Уа1 А1а О1и О1и Азр Ьуз Зег
180 185 190
Азр ТЬг Зег РЬе Зег О1п Туг Агд О1и О1у А1а РЬе Агд Агд А1а О1у
195 200 205
О1п Зег ТЬг Туг Зег А1а О1у Ьуз А1а Рго О1и Азр О1у Зег Зег Ьеи
210 215 220
Рго ТЬг О1и Азр Ьуз О1и О1п Рго Суз ТЬг Азр МеЬ А1а Ьеи Зег О1и
225 230 235 240
Рго О1у Зег Ьеи Агд Зег Агд О1у МеЬ О1и Уа1 МеЬ Рго Зег Ьеи ТЬг
245 250 255
Ьеи Туг Ьуз Рго ТЬг А1а РЬе МеЬ О1и Азр А1а Зег А1а Туг Рго О1у
260 265 270
Агд Азр Туг Туг Зег РЬе О1п МеЬ А1а Ьеи А1а Рго Н1з О1у Агд 11е
275 280 285
Ьуз Уа1 О1и Зег Рго 11е О1и РЬе А1а О1у Зег А1а Тгр О1у О1у Рго
290 295 300
Зег Агд Туг Зег О1и РЬе Рго О1у РЬе Зег Н1з Суз О1у Рго Зег А1а
305 310 315 320
Азп Тгр Н1з Зег Ьеи РЬе О1и О1и О1у О1п А1а ТЬг А1а Зег Туг ТЬг
325 330 335
Азр Зег Зег Ьеи Туг Зег Туг Рго Агд Зег Нгз Уа1 Рго А1а О1у Рго
340 345 350
- 96 029563
Азр О1у О1и 355 РЬе Зег А1а О1и А1а 360 Тгр Туг Рго А1а ТЬг 365 А1а МеЕ Ьеи
О1у Агд Уа1 Н1з МеЕ А1а Уа1 Рго МеЕ Агд Рго Агд МеЕ ТЬг Н1з О1у
370 375 380
Тгр ТЬг А1а ТЬг Ьеи О1у 11е Агд Агд Агд Ьеи О1у Тгр ТЬг О1у Уа1
385 390 395 400
О1и Зег ТЬг РЬе Туг Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз Рго
405 410 415
Суз Ьеи Зег Суз О1и Азр О1и А1а Зег О1у Суз Н1з Туг О1и А1а Ьеи
420 425 430
ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Азп
435 440 445
О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе
450 455 460
Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а
465 470 475 480
О1у МеЕ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз
485 490 495
А1а О1п О1и О1и Ьеи О1и О1у Зег Рго О1у О1п Зег О1и О1у Агд О1и
500 505 510
МеЕ Рго Рго Азп МеЕ Зег 11е Рго О1п Ьеи О1и О1у Туг Зег Суз О1п
515 520 525
Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго МеЕ Уа1 Уа1 Суз
530 535 540
Зег О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег РЬе А1а Ьеи Ьеи Ьеи Зег
545 550 555 560
Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр
565 570 575
А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азп Азр О1п МеЕ
580 585 590
ТЬг Уа1 11е О1п Туг Зег Тгр МеЕ О1у Ьеи МеЕ 11е РЬе А1а МеЕ О1у
595 600 605
- 97 029563
Тгр Агд 610 Зег РЬе Ьуз Азп Уа1 615 Азп Зег Агд Меб Ьеи 620 Туг РЬе А1а Рго
Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд Меб Н1з Ьуз Зег Агд Меб Туг Зег
625 630 635 640
О1п Суз Уа1 Агд Меб Агд Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п
645 650 655
Уа1 ТЬг Рго О1и О1и РЬе Ьеи Суз Азр О1и О1у Рго Зег А1а Ьеи Зег
660 665 670
11е 11е Рго Уа1 О1и О1у Ьеи Ьуз Азр О1п Ьуз Суз РЬе Азр О1и Ьеи
675 680 685
Агд Меб Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд Уа1 11е Зег Суз Ьуз Агд
690 695 700
Азп Азп Рго А1а Зег Зег Зег Рго Агд РЬе РЬе Азп Ьеи Рго Ьуз Ьеи
705 710 715 720
Ьеи О1у Зег Уа1 О1п Рго 11е Азр Уа1 Азп Ьеи Уа1 О1п РЬе ТЬг РЬе
725 730 735
О1у Ьеи РЬе О1у Ьуз А1а О1п Меб Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и Меб
740 745 750
Меб Зег О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Агд
755 760 765
Уа1 Ьуз Рго Ьеи Туг РЬе Нтз Зег Зег
770 775
<210> 12
<211> 895
<212> РКТ
<213> Масаса ЬазстсиТагтз
<400> 12
Меб 1 О1и Уа1 О1п Ьеи 5 О1у Ьеи О1у Агд Уа1 10 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
Ьуз ТЬг Туг Агд 20 О1у А1а РЬе О1п Азп 25 Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 30 Агд О1и
Уа1 11е О1п 35 Азп Рго О1у Рго Агд 40 Нтз Рго О1и А1а А1а 45 Зег А1а А1а
- 98 029563
Рго Рго 50 О1у А1а Зег Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и ТЬг
55 60
Зег Рго Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1у О1и Азр О1у Зег Рго
65 70 75 80
О1п А1а Н1з Агд Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и О1и
85 90 95
О1п О1п Рго Зег О1п Рго О1п Зег А1а Рго О1и Суз Н1з Рго О1и Агд
100 105 110
О1у Суз Уа1 Рго О1и Рго О1у А1а А1а Уа1 А1а А1а О1у Ьуз О1у Ьеи
115 120 125
Рго О1п О1п Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а А1а Рго
130 135 140
Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз
145 150 155 160
Зег ТЬг Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а Зег ТЬг МеЕ О1п Ьеи
165 170 175
Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег О1у
180 185 190
Агд А1а Агд О1и А1а Зег О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп Туг
195 200 205
Ьеи О1у О1у ТЬг Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз
210 215 220
А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи
225 230 235 240
Зег Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Уа1 Ьеи
245 250 255
О1у Уа1 Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и
260 265 270
Суз Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и Азр
275 280 285
ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи О1и
290 295 300
- 99 029563
О1у 305 О1и Зег Ьеи О1у Суз 310 Зег О1у Зег А1а А1а А1а 315 О1у Зег Зег О1у 320
ТЬг Ьеи О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи
325 330 335
Азр О1и А1а А1а А1а Туг Ο1η Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи
340 345 350
А1а Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а
355 360 365
Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а
370 375 380
А1а А1а А1а Ο1η Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у А1а
385 390 395 400
О1у А1а А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег Зег
405 410 415
Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у Ο1η Ьеи Туг О1у Рго
420 425 430
Суз О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у А1а О1у
435 440 445
О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго Ο1η О1у
450 455 460
Ьеи А1а О1у Ο1η О1и О1у Азр РЬе ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго
465 470 475 480
О1у О1у МеЬ Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз
485 490 495
Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ Азр Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр
500 505 510
МеЬ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг
515 520 525
РЬе Рго Рго Ο1η Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у
530 535 540
Суз Нгз Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз
- 100
029563
545 550 555 560
Агд Λΐα Λΐα Θΐυ Θΐν 565 Ьуз Θΐη Ьуз Туг Ьеи 570 Суз Аΐа Зег Агд Азп 575 Азр
Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи
580 585 590
Агд Ьуз Суз Туг Θΐυ Аΐа Θΐу МеТ ТЬг Ьеи Θΐу Аΐа Агд Ьуз Ьеи Ьуз
595 600 605
Ьуз Ьеи Θΐν Азп Ьеи Ьуз Ьеи Θΐη Θΐυ Θΐυ Θΐу Θΐυ Аΐа Зег Зег ТЬг
610 615 620
ТЬг Зег Рго ТЬг Θΐυ Θΐυ ТЬг Аΐа Θΐη Ьуз Ьеи ТЬг ναΐ Зег Н1з 11е
625 630 635 640
Θΐυ Θΐν Туг Θΐυ Суз Θΐη Рго 11е РЬе Ьеи Азп ναΐ Ьеи Θΐυ Аΐа 11е
645 650 655
Θΐυ Рго Θΐν ναΐ ναΐ Суз Аΐа Θΐу Н1з Азр Азп Азп Θΐη Рго Азр Зег
660 665 670
РЬе Λΐα Λΐα Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп Θΐυ Ьеи Θΐу Θΐυ Агд Θΐη Ьеи
675 680 685
ναΐ Н1з ναΐ ναΐ Ьуз Тгр Аΐа Ьуз Аΐа Ьеи Рго Θΐу РЬе Агд Азп Ьеи
690 695 700
Н1з ναΐ Азр Азр Θΐη МеТ Аΐа ναΐ 11е Θΐη Туг Зег Тгр МеТ Θΐу Ьеи
705 710 715 720
МеТ ναΐ РЬе Λΐα МеТ Θΐу Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп ναΐ Азп Зег Агд
725 730 735
МеТ Ьеи Туг РЬе Аΐа Рго Азр Ьеи ναΐ РЬе Азп Θΐυ Туг Агд МеТ Н1з
740 745 750
Ьуз Зег Агд МеТ Туг Зег Θΐη Суз ναΐ Агд МеТ Агд Н1з Ьеи Зег Θΐη
755 760 765
Θΐυ РЬе Θΐν Тгр Ьеи Θΐη 11е ТЬг Рго Θΐη Θΐυ РЬе Ьеи Суз МеТ Ьуз
770 775 780
Λΐα Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго ναΐ Азр Θΐу Ьеи Ьуз Азп Θΐη
785 790 795 800
- 101
029563
Ьуз РЬе РЬе Азр О1и 805 Ьеи Агд МеЬ Азп Туг 810 11е Ьуз О1и Ьеи Азр 815 Агд
11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе
820 825 830
Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и
835 840 845
Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеЬ Уа1 Зег
850 855 860
Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго
865 870 875 880
Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе Нгз ТЬг О1п
885 890 895
<210> 13
<211> 895
<212> РКТ
<213> Масаса ти1аЬЬа
<400> 13
МеЬ 1 О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
5 10
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
Уа1 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Зег Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и ТЬг
50 55 60
Зег Рго Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1у О1и Азр О1у Зег Рго
65 70 75 80
О1п А1а Н1з Агд Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и О1и
85 90 95
О1п О1п Рго Зег О1п Рго О1п Зег А1а Рго О1и Суз Н1з Рго О1и Агд
100 105 110
О1у Суз Уа1 Рго О1и Рго О1у А1а А1а Уа1 А1а А1а О1у Ьуз О1у Ьеи
115 120 125
- 102
029563
Рго О1п 130 О1п Ьеи Рго А1а Рго 135 Рго Азр О1и Азр Азр 140 Зег А1а А1а Рго
Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз
145 150 155 160
Зег А1а Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а Зег ТЬг МеЬ О1п Ьеи
165 170 175
Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег О1у
180 185 190
Агд А1а Агд О1и А1а Зег О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп Туг
195 200 205
Ьеи О1и О1у ТЬг Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз
210 215 220
А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЬ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи
225 230 235 240
Зег Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЬ Туг А1а Рго Уа1 Ьеи
245 250 255
О1у Уа1 Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и
260 265 270
Суз Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и Азр
275 280 285
ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи О1и
290 295 300
О1у О1и Зег Ьеи О1у Суз Зег О1у Зег А1а А1а А1а О1у Зег Зег О1у
305 310 315 320
ТЬг Ьеи О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи
325 330 335
Азр О1и А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи
340 345 350
А1а Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а
355 360 365
Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а
370 375 380
- 103
029563
А1а 385 А1а А1а О1п Суз Агд 390 Туг О1у Азр Ьеи А1а 395 Зег Ьеи Н1з О1у А1а 400
О1у А1а А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег Зег
405 410 415
Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго
420 425 430
Суз О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у А1а О1у
435 440 445
О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у
450 455 460
Ьеи А1а О1у О1п О1и О1у Азр РЬе ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго
465 470 475 480
О1у О1у МеЬ Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз
485 490 495
Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ Азр Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр
500 505 510
МеЬ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг
515 520 525
РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у
530 535 540
Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз
545 550 555 560
Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр
565 570 575
Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи
580 585 590
Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз
595 600 605
Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег Зег ТЬг
610 615 620
ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг А1а О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег Нгз 11е
625 630 635 640
- 104
029563
О1и О1у Туг О1и Суз 645 О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп 650 Уа1 Ьеи О1и А1а 655 11е
О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Нгз Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег
660 665 670
РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи
675 680 685
Уа1 Нгз Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи
690 695 700
Нгз Уа1 Азр Азр О1п МеЕ А1а Уа1 11е О1п Туг Зег Тгр МеЕ О1у Ьеи
705 710 715 720
МеЕ Уа1 РЬе А1а МеЕ О1у Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд
725 730 735
МеЕ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЕ Нгз
740 745 750
Ьуз Зег Агд МеЕ Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд МеЕ Агд Нгз Ьеи Зег О1п
755 760 765
О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЕ Ьуз
770 775 780
А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п
785 790 795 800
Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЕ Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд
805 810 815
11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе
820 825 830
Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и
835 840 845
Ьеи Нгз О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Нгз МеЕ Уа1 Зег
850 855 860
Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго
865 870 875 880
Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе Нгз ТЬг О1п
- 105
029563
885 890 895
<210> 14
<211> 911
<212> РКТ
<213> Рап Егод1ой.уЕе
<400> 14
МеЕ 1 О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго 15 Зег
5 10
Ьуз ТЬг Туг Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
Уа1 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Зег Ьеи Ьеи Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п
50 55 60
О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и ТЬг
65 70 75 80
Зег Рго Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1у О1и Азр О1у Зег Рго О1п А1а
85 90 95
Н1з Агд Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и О1и О1п О1п
100 105 110
Рго Зег О1п Рго О1п Зег А1а Рго О1и Суз Н1з Рго О1и Агд О1у Суз
115 120 125
Уа1 Рго О1и Рго О1у А1а А1а Уа1 А1а А1а Зег Ьуз О1у Ьеи Рго О1п
130 135 140
О1п Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а А1а Рго Зег ТЬг
145 150 155 160
Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз Зег А1а
165 170 175
Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а Зег ТЬг МеЕ О1п Ьеи Ьеи О1п
180 185 190
О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег О1у Агд А1а
195 200 205
Агд О1и А1а Зег О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп Туг Ьеи О1у
- 106
029563
210 215 220
О1у ТЬг 225 Зег ТЬг 11е Зег Азр 230 Зег А1а Ьуз О1и 235 Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 240
Зег Уа1 Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег Рго
245 250 255
О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Ьеи Ьеи О1у Уа1
260 265 270
Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и Суз Ьуз
275 280 285
О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и Азр ТЬг А1а
290 295 300
О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз О1у О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи О1и О1у О1и
305 310 315 320
Зег Ьеи О1у Суз Зег О1у Зег А1а А1а А1а О1у Зег Зег О1у ТЬг Ьеи
325 330 335
О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи Азр О1и
340 345 350
А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а Ьеи
355 360 365
А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд 11е
370 375 380
Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а А1а А1а
385 390 395 400
А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у А1а О1у А1а
405 410 415
А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег Зег Зег Тгр
420 425 430
Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз О1у
435 440 445
О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у
450 455 460
- 107
029563
О1и А1а О1у 465 А1а Уа1 А1а 470 Рго Туг О1у Туг ТЬг 475 Агд Рго Рго О1п О1у 480
Ьеи А1а О1у О1п О1и О1у Азр РЬе ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго
485 490 495
О1у О1у МеЬ Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз
500 505 510
Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ Азр Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр
515 520 525
МеЬ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр НЬз Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг
530 535 540
РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у
545 550 555 560
Суз НЬз Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз
565 570 575
Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп Азр
580 585 590
Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд Ьеи
595 600 605
Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз
610 615 620
Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег Зег ТЬг
625 630 635 640
ТЬг Зег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг ТЬг О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Зег НЬз 11е
645 650 655
О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е
660 665 670
О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у НЬз Азр Азп Азп О1п Рго Азр Зег
675 680 685
РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи
690 695 700
Уа1 НЬз Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи
705 710 715 720
- 108
029563
Н1з Уа1 Азр Азр О1п 725 МеЕ А1а Уа1 11е О1п 730 Туг Бег Тгр МеЕ О1у 735 Ьеи
МеЕ Уа1 РНе А1а МеЕ О1у Тгр Агд Бег РНе ТНг Азп Уа1 Азп Бег Агд
740 745 750
МеЕ Ьеи Туг РНе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РНе Азп О1и Туг Агд МеЕ Н1з
755 760 765
Ьуз Бег Агд МеЕ Туг Бег О1п Суз Уа1 Агд МеЕ Агд Н1з Ьеи Бег О1п
770 775 780
О1и РНе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТНг Рго О1п О1и РНе Ьеи Суз МеЕ Ьуз
785 790 795 800
А1а Ьеи Ьеи Ьеи РНе Бег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п
805 810 815
Ьуз РНе РНе Азр О1и Ьеи Агд МеЕ Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд
820 825 830
11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТНг Бег Суз Бег Агд Агд РНе
835 840 845
Туг О1п Ьеи ТНг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Бег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и
850 855 860
Ьеи Н1з О1п РНе ТНг РНе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Бег Н1з МеЕ Уа1 Бег
865 870 875 880
Уа1 Азр РНе Рго О1и МеЕ МеЕ А1а О1и 11е 11е Бег Уа1 О1п Уа1 Рго
885 890 895
Ьуз 11е Ьеи Бег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РНе Н1з ТНг О1п
900 905 910
<210> 15
<211> 895
<212> РКТ
<213> Рарто НатаИгуаз
<400> 15
МеЕ О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго Бег
1 5 10 15
Ьуз ТНг Туг Агд О1у А1а РНе О1п Азп Ьеи РНе О1п Бег Уа1 Агд О1и
20 25 30
- 109
029563
Уа1 11е Ο1η 35 Азп Рго О1у Рго Агд 40 Н1з Рго О1и А1а А1а 45 Зег А1а А1а
Рго Рго О1у А1а Зег Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η О1и
50 55 60
ТЬг Зег Рго Агд Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η О1у О1и Азр О1у Зег Рго
65 70 75 80
Ο1η А1а Н1з Агд Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр О1и О1и
85 90 95
Ο1η Ο1η Рго Зег Ο1η Рго Ο1η Зег А1а Рго О1и Суз Н1з Рго О1и Агд
100 105 110
О1у Суз Уа1 Рго О1и Рго О1у А1а А1а Уа1 А1а А1а О1у Ьуз О1у Ьеи
115 120 125
Рго Ο1η Ο1η Ьеи Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а А1а Рго
130 135 140
Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег Зег Суз
145 150 155 160
Зег А1а Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а Зег ТЬг МеЕ Ο1η Ьеи
165 170 175
Ьеи Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η Ο1η О1и А1а Уа1 Зег О1и О1у Зег Зег Зег О1у
180 185 190
Агд А1а Агд О1и А1а Зег О1у А1а Рго ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Азп Туг
195 200 205
Ьеи О1у О1у ТЬг Зег ТЬг 11е Зег Азр Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз
210 215 220
А1а Уа1 Зег Уа1 Зег МеЕ О1у Ьеи О1у Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи
225 230 235 240
Зег Рго О1у О1и Ο1η Ьеи Агд О1у Азр Суз МеЕ Туг А1а Рго Уа1 Ьеи
245 250 255
О1у Уа1 Рго Рго А1а Уа1 Агд Рго ТЬг Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и
260 265 270
Суз Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Зег А1а О1у Ьуз Зег ТЬг О1и Азр
275 280 285
- 110
029563
ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе 295 Ьуз О1у О1у Туг ТЬг 300 Ьуз О1у Ьеи О1и
290
О1у О1и Зег Ьеи О1у Суз Зег О1у Зег А1а А1а А1а О1у Зег Зег О1у
305 310 315 320
ТЬг Ьеи О1и Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи
325 330 335
Азр О1и А1а А1а А1а Туг О1п Зег Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи
340 345 350
А1а Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Н1з А1а
355 360 365
Агд 11е Ьуз Ьеи О1и Азп Рго Ьеи Азр Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а
370 375 380
А1а А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у О1и Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у А1а
385 390 395 400
О1у А1а А1а О1у Рго О1у Зег О1у Зег Рго Зег А1а А1а А1а Зег Зег
405 410 415
Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Рго
420 425 430
Суз О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у А1а О1у
435 440 445
О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у
450 455 460
Ьеи А1а О1у О1п О1и О1у Азр РЬе ТЬг А1а Рго Азр Уа1 Тгр Туг Рго
465 470 475 480
О1у О1у МеЬ Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго ТЬг Суз Уа1 Ьуз
485 490 495
Зег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ Азр Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у Азр
500 505 510
МеЬ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг
515 520 525
РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег О1у
- 111
029563
530 535 540
Суз 545 Н1з Туг О1у А1а Ьеи 550 ТЬг Суз О1у Бег Суз 555 Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз 560
Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Бег Агд Азп Азр
565 570 575
Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Бег Суз Агд Ьеи
580 585 590
Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЕ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз
595 600 605
Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Бег Бег ТЬг
610 615 620
ТЬг Бег Рго ТЬг О1и О1и ТЬг А1а О1п Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Бег Н1з 11е
625 630 635 640
О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е
645 650 655
О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр Бег
660 665 670
РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Бег Бег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи
675 680 685
Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи
690 695 700
Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЕ А1а Уа1 11е О1п Туг Бег Тгр МеЕ О1у Ьеи
705 710 715 720
МеЕ Уа1 РЬе А1а МеЕ О1у Тгр Агд Бег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Бег Агд
725 730 735
МеЕ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд МеЕ Н1з
740 745 750
Ьуз Бег Агд МеЕ Туг Бег О1п Суз Уа1 Агд МеЕ Агд Н1з Ьеи Бег О1п
755 760 765
О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз МеЕ Ьуз
770 775 780
- 112
029563
А1а 785 Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 790 11е 11е Рго Уа1 Азр 795 О1у Ьеи Ьуз Азп О1п 800
Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЬ Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд
805 810 815
11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд РЬе
820 825 830
Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд О1и
835 840 845
Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з МеЬ Уа1 Зег
850 855 860
Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго
865 870 875 880
Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е Туг РЬе Н1з ТЬг О1п
885 890 895
<210> 16
<211> 896
<212> РКТ
<213> Зиз зсгоЬа
<400> 16
МеЬ О1и Уа1 О1п Ьеи О1у Ьеи О1у Агд Уа1 Туг Рго Агд Рго Рго Зег
1 5 10 15
Ьуз ТЬг РЬе Агд О1у А1а РЬе О1п Азп Ьеи РЬе О1п Зег Уа1 Агд О1и
20 25 30
Уа1 11е О1п Азп Рго О1у Рго Агд Н1з Рго О1и А1а А1а Зег А1а А1а
35 40 45
Рго Рго О1у А1а Агд Ьеи О1п О1п О1п О1п Ьеи О1п О1п О1п О1и ТЬг
50 55 60
Зег Рго Агд Агд О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п Рго Зег О1и Азр О1у
65 70 75 80
Зег Рго О1п Уа1 О1п Зег Агд О1у Рго ТЬг О1у Туг Ьеи А1а Ьеи Азр
85 90 95
О1и Ьуз О1п О1п Рго Зег О1п О1п О1п Зег А1а Рго О1и Суз Н1з Рго
100 105 110
- 113
029563
О1и Зег О1у Суз 115 ТЬг Рго О1и Рго 120 О1у А1а А1а Зег А1а 125 А1а Зег Ьуз
О1у Ьеи О1п О1п О1п Рго Рго А1а Рго Рго Азр О1и Азр Азр Зег А1а
130 135 140
А1а Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Ьеи О1у Рго ТЬг РЬе Рго О1у Ьеи Зег
145 150 155 160
Зег Суз Зег ТЬг Азр Ьеи Ьуз Азр 11е Ьеи Зег О1и А1а О1у ТЬг Мек
165 170 175
О1п Ьеи Ьеи О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1п О1и А1а Уа1
180 185 190
Зег О1и О1у Азп Зег Зег О1у Агд А1а Агд О1и А1а ТЬг О1у А1а Рго
195 200 205
11е Зег Зег Ьуз Азр Зег Туг Ьеи О1у О1у Зег Зег ТЬг 11е Зег Азр
210 215 220
Зег А1а Ьуз О1и Ьеи Суз Ьуз А1а Уа1 Зег Уа1 Зег Мек О1у Ьеи О1у
225 230 235 240
Уа1 О1и А1а Ьеи О1и Н1з Ьеи Зег Рго О1у О1и О1п Ьеи Агд О1у Азр
245 250 255
Суз Мек Туг А1а Рго Ьеи Ьеи ТЬг О1у Рго Рго Зег Уа1 Агд Рго ТЬг
260 265 270
Рго Суз А1а Рго Ьеи А1а О1и Суз Ьуз О1у Зег Ьеи Ьеи Азр Азр О1у
275 280 285
Рго О1у Ьуз Зег Азп О1и О1и ТЬг А1а О1и Туг Зег Рго РЬе Ьуз А1а
290 295 300
О1у Туг ТЬг Ьуз О1у Ьеи Азр Зег О1и Зег Ьеи О1у Суз Зег Зег О1у
305 310 315 320
О1у О1и А1а О1у О1у Зег О1у ТЬг Ьеи О1и Ьеи Рго Зег А1а Ьеи Зег
325 330 335
Ьеи Туг Ьуз Зег О1у А1а Ьеи Азр Азр Уа1 А1а А1а Туг Рго Зег Агд
340 345 350
Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи А1а Ьеи А1а О1у Рго Рго Рго Рго Рго
355 360 365
- 114
029563
Рго Рго 370 Рго Н1з Рго Н1з А1а Агд 375 11е Ьуз Ьеи О1и 380 Азп Рго Ьеи Азр
Туг О1у Зег А1а Тгр А1а А1а А1а А1а А1а О1п Суз Агд Туг О1у Азр
385 390 395 400
Ьеи А1а Зег Ьеи Н1з О1у О1у О1у А1а Рго О1у Рго О1у Зег О1у Зег
405 410 415
Рго Зег А1а ТЬг Зег Зег Зег Зег Тгр Н1з ТЬг Ьеи РЬе ТЬг А1а О1и
420 425 430
О1и Зег О1п Ьеи Туг О1у Рго Суз О1у О1у О1у О1у О1у О1у Зег А1а
435 440 445
О1у О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг ТЬг Агд Рго Рго О1п
450 455 460
О1у Ьеи А1а О1у О1п О1и О1у Азр Ьеи А1а 11е Рго Азр 11е Тгр Туг
465 470 475 480
Рго О1у О1у Уа1 Уа1 Зег Агд Уа1 Рго Туг Рго Зег Рго Зег Суз Уа1
485 490 495
Ьуз Зег О1и МеЕ О1у Рго Тгр МеЕ О1и Зег Туг Зег О1у Рго Туг О1у
500 505 510
Азр МеЕ Агд Ьеи О1и Рго ТЬг Агд Азр Н1з Уа1 Ьеи Рго 11е Азр Туг
515 520 525
Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз О1у Азр О1и А1а Зег
530 535 540
О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Зег Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе
545 550 555 560
Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи Суз А1а Зег Агд Азп
565 570 575
Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп Суз Рго Зег Суз Агд
580 585 590
Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЕ ТЬг Ьеи О1у А1а Агд Ьуз Ьеи
595 600 605
Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и О1у О1и А1а Зег Зег
610 615 620
- 115
029563
А1а 625 ТЬг Зег Рго ТЬг О1и 630 О1и Рго А1а О1п Ьуз 635 Ьеи ТЬг Уа1 Зег Н1з 640
11е О1и О1у Туг О1и Суз О1п Рго 11е РЬе Ьеи Азп Уа1 Ьеи О1и А1а
645 650 655
11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр Азп Азп О1п Рго Азр
660 665 670
Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и Ьеи О1у О1и Агд О1п
675 680 685
Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи Рго О1у РЬе Агд Азп
690 695 700
Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п Меб А1а Уа1 11е О1п Туг Зег Тгр Меб О1у
705 710 715 720
Ьеи Меб Уа1 РЬе А1а Меб О1у Тгр Агд Зег РЬе ТЬг Азп Уа1 Азп Зег
725 730 735
Агд Меб Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе Азп О1и Туг Агд Меб
740 745 750
Н1з Ьуз Зег Агд Меб Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд Меб Агд Н1з Ьеи Зег
755 760 765
О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п О1и РЬе Ьеи Суз Меб
770 775 780
Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1 Азр О1у Ьеи Ьуз Азп
785 790 795 800
О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд Меб Азп Туг 11е Ьуз О1и Ьеи Азр
805 810 815
Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг Зег Суз Зег Агд Агд
820 825 830
РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 О1п Рго 11е А1а Агд
835 840 845
О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е Ьуз Зег Н1з Меб Уа1
850 855 860
Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и Меб Меб А1а О1и 11е 11е Зег Уа1 О1п Уа1
- 116
029563
865 870 875 880
Рго Ьуз 11е Ьеи Зег Θΐу Ьуз ναΐ Ьуз Рго 11е Туг РЬе Н1з ТЬг Θΐη 885 890 895
<210> 17
<211> 709
<212> РКТ
<213> 0^усТоΐадиз сип1си1из
<400> 17
Н1з 1 Н1з Θΐη Θΐη Θΐη Θΐη Азр Аΐа 5 Аΐа ТЬг 10 Θΐυ Θΐу Зег Зег Зег 15 Θΐу
Агд Аΐа Агд Агд Рго Зег Θΐу Аΐа Зег ТЬг Зег Зег Ьуз Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи Θΐу Зег ТЬг Зег ναΐ 11е Зег Азр Зег Аΐа Ьуз Θΐυ Ьеи Суз Ьуз
35 40 45
Аΐа ναΐ Зег ναΐ Зег Ьеи Θΐу Ьеи Θΐу ναΐ Θΐυ Аΐа Ьеи Θΐυ Н1з Ьеи
50 55 60
Зег Зег Θΐу Θΐυ Θΐη Ьеи Агд Θΐу Азр Суз МеТ Туг Аΐа Рго Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Θΐу Θΐу Рго Рго ναΐ ναΐ Агд Рго ТЬг Рго Суз Ьеи Рго Ьеи ναΐ Θΐυ
85 90 95
Суз Ьуз Θΐу Зег Ьеи Ьеи Азр Азр Θΐу Рго Θΐу Ьуз Θΐу ТЬг Θΐυ Θΐυ
100 105 110
ТЬг Аΐа Θΐυ Туг ТЬг Рго РЬе Ьуз Θΐу Θΐу Туг Азп Ьуз Θΐу Ьеи Θΐυ
115 120 125
Аΐа Θΐυ Зег Ьеи Θΐу Суз Зег Θΐу Зег Θΐу Θΐυ Аΐа Θΐу Зег Зег Θΐу
130 135 140
ТЬг Ьеи Θΐυ Ьеи Рго Зег ТЬг Ьеи Зег Ьеи Туг Ьуз Зег Θΐу ТЬг Ьеи
145 150 155 160
Азр Θΐυ Аΐа Аΐа Аΐа Туг Θΐη ТЬг Агд Азр Туг Туг Азп РЬе Рго Ьеи
165 170 175
Аΐа Ьеи Аΐа Θΐу Θΐη Рго Рго Рго Рго Н1з Рго Агд Агд 11е Ьуз Ьеи
180 185 190
Θΐυ Азп Рго Ьеи Азр Туг Θΐу Зег Аΐа Тгр Аΐа Аΐа Аΐа Аΐа Аΐа Θΐη
- 117
029563
195 200 205
Суз Агд Туг О1у Азр Ьеи А1а Бег Ьеи Н1з О1у О1у О1у А1а А1а О1у
210 215 220
Рго О1у Бег О1у Бег Рго Бег ТЬг А1а А1а Бег Бег Бег Тгр Н1з ТЬг
225 230 235 240
Ьеи РЬе ТЬг ТЬг О1и О1и О1у О1п Ьеи Туг О1у Ьеи Суз О1у О1у О1у
245 250 255
О1у О1у Бег О1у Рго О1у О1и А1а О1у А1а Уа1 А1а Рго Туг О1у Туг
260 265 270
ТЬг Агд Рго Рго О1п О1у Ьеи ТЬг О1у О1п О1и О1у Азр РЬе Рго А1а
275 280 285
Рго О1и Уа1 Тгр Туг Рго О1у О1у Уа1 Уа1 Бег Агд Уа1 Рго Туг Рго
290 295 300
Азп Рго Бег Суз Уа1 Ьуз Бег О1и МеЬ О1у Рго Тгр МеЬ О1и Бег Туг
305 310 315 320
Бег О1у Рго Туг О1у Азр МеЬ Агд Ьеи О1и ТЬг А1а Агд Азр Н1з Уа1
325 330 335
Ьеи Рго 11е Азр Туг Туг РЬе Рго Рго О1п Ьуз ТЬг Суз Ьеи 11е Суз
340 345 350
О1у Азр О1и А1а Бег О1у Суз Н1з Туг О1у А1а Ьеи ТЬг Суз О1у Бег
355 360 365
Суз Ьуз Уа1 РЬе РЬе Ьуз Агд А1а А1а О1и О1у Ьуз О1п Ьуз Туг Ьеи
370 375 380
Суз А1а Бег Агд Азп Азр Суз ТЬг 11е Азр Ьуз РЬе Агд Агд Ьуз Азп
385 390 395 400
Суз Рго Бег Суз Агд Ьеи Агд Ьуз Суз Туг О1и А1а О1у МеЬ ТЬг Ьеи
405 410 415
О1у А1а Агд Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи О1у Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1п О1и О1и
420 425 430
О1у О1и Бег Бег Бег А1а Бег Бег Рго ТЬг О1и Азр ТЬг ТЬг О1п Ьуз
435 440 445
- 118
029563
Ьеи ТЬг 450 Уа1 Зег Н1з 11е О1и 455 О1у Туг О1и Суз О1п 460 Рго 11е РЬе Ьеи
Азп Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Рго О1у Уа1 Уа1 Суз А1а О1у Н1з Азр
465 470 475 480
Азп Азп О1п Рго Азр Зег РЬе А1а А1а Ьеи Ьеи Зег Зег Ьеи Азп О1и
485 490 495
Ьеи О1у О1и Агд О1п Ьеи Уа1 Н1з Уа1 Уа1 Ьуз Тгр А1а Ьуз А1а Ьеи
500 505 510
Рго О1у РЬе Агд Азп Ьеи Н1з Уа1 Азр Азр О1п МеЬ А1а Уа1 11е О1п
515 520 525
Туг Зег Тгр МеЬ О1у Ьеи МеЬ Уа1 РЬе А1а МеЬ О1у Тгр Агд Зег РЬе
530 535 540
ТЬг Азп Уа1 Азп Зег Агд МеЬ Ьеи Туг РЬе А1а Рго Азр Ьеи Уа1 РЬе
545 550 555 560
Азп О1и Туг Агд МеЬ Н1з Ьуз Зег Агд МеЬ Туг Зег О1п Суз Уа1 Агд
565 570 575
МеЬ Агд Н1з Ьеи Зег О1п О1и РЬе О1у Тгр Ьеи О1п 11е ТЬг Рго О1п
580 585 590
О1и РЬе Ьеи Суз МеЬ Ьуз А1а Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Зег 11е 11е Рго Уа1
595 600 605
Азр О1у Ьеи Ьуз Азп О1п Ьуз РЬе РЬе Азр О1и Ьеи Агд МеЬ Азп Туг
610 615 620
11е Ьуз О1и Ьеи Азр Агд 11е 11е А1а Суз Ьуз Агд Ьуз Азп Рго ТЬг
625 630 635 640
Зег Суз Зег Агд Агд РЬе Туг О1п Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1
645 650 655
О1п Рго 11е А1а Агд О1и Ьеи Н1з О1п РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Ьеи 11е
660 665 670
Ьуз Зег Н1з МеЬ Уа1 Зег Уа1 Азр РЬе Рго О1и МеЬ МеЬ А1а О1и 11е
675 680 685
11е Зег Уа1 О1п Уа1 Рго Ьуз 11е Ьеи Зег О1у Ьуз Уа1 Ьуз Рго 11е
690 695 700
- 119
029563
Туг РЬе Н1з ТЬг О1п 705
<210> 18 <211> 2760 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 18 аЕддаадЕдс адЕЕадддсЕ дддаадддЕс ЕасссЕсддс сдссдЕссаа дассЕассда 60
ддадсЕЕЕсс адааЕсЕдЕЕ ссададсдЕд сдсдаадЕда Ессадаассс дддссссадд 120
сасссададд ссдсдадсдс адсассЕссс ддсдссадЕЕ ЕдсЕдсЕдсЕ дсадсадсад 180
садсадсадс адсадсадса дсадсадсад садсадсадс адсадсадса дсадсадсаа 240
дадасЕадсс ссаддсадса дсадсадсад садддЕдадд аЕддЕЕсЕсс ссаадсссаЕ 300
сдЕададдсс ссасаддсЕа ссЕддЕссЕд даЕдаддаас адсаассЕЕс асадссдсад 360
ЕсддсссЕдд адЕдссассс сдадададдЕ ЕдсдЕсссад адссЕддадс сдссдЕддсс 420
дссадсаадд ддсЕдссдса дсадсЕдсса дсассЕссдд асдаддаЕда сЕсадсЕдсс 480
ссаЕссасдЕ ЕдЕсссЕдсЕ дддссссасЕ ЕЕссссддсЕ ЕаадсадсЕд сЕссдсЕдас 540
сЕЕааадаса ЕссЕдадсда ддссадсасс аЕдсаасЕсс ЕЕсадсааса дсадсаддаа 600
дсадЕаЕссд ааддсадсад садсдддада дсдадддадд ссЕсдддддс ЕсссасЕЕсс 660
Ессааддаса аЕЕасЕЕадд дддсасЕЕсд ассаЕЕЕсЕд асаасдссаа ддадЕЕдЕдЕ 720
ааддсадЕдЕ сддЕдЕссаЕ дддссЕдддЕ дЕддаддсдЕ ЕддадсаЕсЕ дадЕссаддд 780
даасадсЕЕс ддддддаЕЕд саЕдЕасдсс ссасЕЕЕЕдд дадЕЕссасс сдсЕдЕдсдЕ 840
сссасЕссЕЕ дЕдссссаЕЕ ддссдааЕдс аааддЕЕсЕс ЕдсЕадасда садсдсаддс 900
аададсасЕд аадаЕасЕдс ЕдадЕаЕЕсс ссЕЕЕсаадд даддЕЕасас сааадддсЕа 960
дааддсдада дссЕаддсЕд сЕсЕддсадс дсЕдсадсад ддадсЕссдд дасасЕЕдаа 1020
сЕдссдЕсЕа сссЕдЕсЕсЕ сЕасаадЕсс ддадсасЕдд асдаддсадс ЕдсдЕассад 1080
адЕсдсдасЕ асЕасаасЕЕ ЕссасЕддсЕ сЕддссддас сдссдссссс ЕссдссдссЕ 1140
ссссаЕсссс асдсЕсдсаЕ саадсЕддад аасссдсЕдд асЕасддсад сдссЕдддсд 1200
дсЕдсддсдд сдсадЕдссд сЕаЕддддас сЕддсдадсс ЕдсаЕддсдс дддЕдсадсд 1260
ддасссддЕЕ сЕдддЕсасс сЕсадссдсс дсЕЕссЕсаЕ ссЕддсасас ЕсЕсЕЕсаса 1320
дссдаадаад дссадЕЕдЕа ЕддассдЕдЕ ддЕддЕддЕд ддддЕддЕдд сддсддсддс 1380
ддсддсддсд дсддсддсдд сддсддсддс ддсддсддсд аддсдддадс ЕдЕадссссс 1440
ЕасддсЕаса сЕсддссссс ЕсаддддсЕд дсдддссадд ааадсдасЕЕ сассдсассЕ 1500
даЕдЕдЕддЕ асссЕддсдд саЕддЕдадс ададЕдсссЕ аЕсссадЕсс сасЕЕдЕдЕс 1560
- 120 029563
аааадсдааа ЬдддссссЬд даЬддаЬадс ЬасЬссддас сЬЬасдддда саЬдсдЬЬЬд 1620
дадасЬдсса дддассаЬдЬ ЬЬЬдсссаЬЬ дасЬаЬЬасЬ ЬЬссасссса даадассЬдс 1680
сЬдаЬсЬдЬд дадаЬдаадс ЬЬсЬдддЬдЬ сасЬаЬддад сЬсЬсасаЬд ЬддаадсЬдс 1740
ааддЬсЬЬсЬ Ьсаааададс сдсЬдааддд ааасадаадЬ ассЬдЬдсдс садсадаааЬ 1800
даЬЬдсасЬа ЬЬдаЬаааЬЬ ссдааддааа ааЬЬдЬссаЬ сЬЬдЬсдЬсЬ ЬсддаааЬдЬ 1860
ЬаЬдаадсад ддаЬдасЬсЬ дддадсссдд аадсЬдаада аасЬЬддЬаа ЬсЬдааасЬа 1920
саддаддаад дададдсЬЬс садсассасс адссссасЬд аддадасаас ссадаадсЬд 1980
асадЬдЬсас асаЬЬдаадд сЬаЬдааЬдЬ садсссаЬсЬ ЬЬсЬдааЬдЬ ссЬддаадсс 2040
аЬЬдадссад дЬдЬадЬдЬд ЬдсЬддасас дасаасаасс адсссдасЬс сЬЬЬдсадсс 2100
ЬЬдсЬсЬсЬа дссЬсааЬда асЬдддадад адасадсЬЬд ЬасасдЬддЬ саадЬдддсс 2160
ааддссЬЬдс сЬддсЬЬссд саасЬЬасас дЬддасдасс адаЬддсЬдЬ саЬЬсадЬас 2220
ЬссЬддаЬдд ддсЬсаЬддЬ дЬЬЬдссаЬд ддсЬддсдаЬ ссЬЬсассаа ЬдЬсаасЬсс 2280
аддаЬдсЬсЬ асЬЬсдсссс ЬдаЬсЬддЬЬ ЬЬсааЬдадЬ ассдсаЬдса саадЬсссдд 2340
аЬдЬасадсс адЬдЬдЬссд ааЬдаддсас сЬсЬсЬсаад адЬЬЬддаЬд дсЬссаааЬс 2400
ассссссадд ааЬЬссЬдЬд саЬдааадса сЬдсЬасЬсЬ ЬсадсаЬЬаЬ ЬссадЬддаЬ 2460
дддсЬдаааа аЬсаааааЬЬ сЬЬЬдаЬдаа сЬЬсдааЬда асЬасаЬсаа ддаасЬсдаЬ 2520
сдЬаЬсаЬЬд саЬдсаааад ааааааЬссс асаЬссЬдсЬ саадасдсЬЬ сЬассадсЬс 2580
ассаадсЬсс ЬддасЬссдЬ дсадссЬаЬЬ дсдадададс ЬдсаЬсадЬЬ сасЬЬЬЬдас 2640
сЬдсЬааЬса адЬсасасаЬ ддЬдадсдЬд дасЬЬЬссдд аааЬдаЬддс ададаЬсаЬс 2700
ЬсЬдЬдсаад ЬдсссаадаЬ ссЬЬЬсЬддд ааадЬсаадс ссаЬсЬаЬЬЬ ссасасссад 2760
<210> 19
<211> 2760
<212> ДНК
<213> Ното зар1епз
<400> 19
аЬддаадЬдс адЬЬадддсЬ дддаадддЬс ЬасссЬсддс сдссдЬссаа дассЬассда 60
ддадсЬЬЬсс адааЬсЬдЬЬ ссададсдЬд сдсдаадЬда Ьссадаассс дддссссадд 120
сасссададд ссдсдадсдс адсассЬссс ддсдссадЬЬ ЬдсЬдсЬдсЬ дсадсадсад 180
садсадсадс адсадсадса дсадсадсад садсадсадс адсадсадса дсадсадсаа 240
дадасЬадсс ссаддсадса дсадсадсад садддЬдадд аЬддЬЬсЬсс ссаадсссаЬ 300
сдЬададдсс ссасаддсЬа ссЬддЬссЬд даЬдаддаас адсаассЬЬс асадссдсад 360
ЬсддсссЬдд адЬдссассс сдадададдЬ ЬдсдЬсссад адссЬддадс сдссдЬддсс 420
дссадсаадд ддсЬдссдса дсадсЬдсса дсассЬссдд асдаддаЬда сЬсадсЬдсс 480
- 121 029563
ссаЬссасдЬ ЬдЬсссЬдсЬ дддссссасЬ ЬЬссссддсЬ ЬаадсадсЬд сЬссдсЬдас 540
сЬЬааадаса ЬссЬдадсда ддссадсасс аЬдсаасЬсс ЬЬсадсааса дсадсаддаа 600
дсадЬаЬссд ааддсадсад садсдддада дсдадддадд ссЬсдддддс ЬсссасЬЬсс 660
Ьссааддаса аЬЬасЬЬадд дддсасЬЬсд ассаЬЬЬсЬд асаасдссаа ддадЬЬдЬдЬ 720
ааддсадЬдЬ сддЬдЬссаЬ дддссЬдддЬ дЬддаддсдЬ ЕддадсаЬсЬ дадЬссаддд 780
даасадсЬЬс ддддддаЬЬд саЬдЬасдсс ссасЬЬЬЬдд дадЬЬссасс сдсЬдЬдсдЬ 840
сссасЬссЬЬ дЬдссссаЬЬ ддссдааЬдс аааддЬЬсЬс ЬдсЬадасда садсдсаддс 900
аададсасЬд аадаЬасЬдс ЬдадЬаЬЬсс ссЬЬЬсаадд даддЬЬасас сааадддсЬа 960
дааддсдада дссЬаддсЬд сЬсЬддсадс дсЬдсадсад ддадсЬссдд дасасЬЬдаа 1020
сЬдссдЬсЬа сссЬдЬсЬсЬ сЬасаадЬсс ддадсасЬдд асдаддсадс ЬдсдЬассад 1080
адЬсдсдасЬ асЬасаасЬЬ ЬссасЬддсЬ сЬддссддас сдссдссссс ЬссдссдссЬ 1140
ссссаЬсссс асдсЬсдсаЬ саадсЬддад аасссдсЬдд асЬасддсад сдссЬдддсд 1200
дсЬдсддсдд сдсадЬдссд сЬаЬддддас сЬддсдадсс ЬдсаЬддсдс дддЬдсадсд 1260
ддасссддЬЬ сЬдддЬсасс сЬсадссдсс дсЬЬссЬсаЬ ссЬддсасас ЬсЬсЬЬсаса 1320
дссдаадаад дссадЬЬдЬа ЬддассдЬдЬ ддЬддЬддЬд дддд+ддЬдд сддсддсддс 1380
ддсддсддсд дсддсддсдд сддсддсддс ддсддсддсд аддсдддадс ЬдЬадссссс 1440
ЬасддсЬаса сЬсддссссс ЬсаддддсЬд дсдддссадд ааадсдасЬЬ сассдсассЬ 1500
даЬдЬдЬддЬ асссЬддсдд саЬддЬдадс ададЬдсссЬ аЬсссадЬсс сасЬЬдЬдЬс 1560
аааадсдааа ЬдддссссЬд даЬддаЬадс ЬасЬссддас сЬЬасдддда саЬдсдЬЬЬд 1620
дадасЬдсса дддассаЬдЬ ЬЬЬдсссаЬЬ дасЬаЬЬасЬ ЬЬссасссса даадассЬдс 1680
сЬдаЬсЬдЬд дадаЬдаадс ЬЬсЬдддЬдЬ сасЬаЬддад сЬсЬсасаЬд ЬддаадсЬдс 1740
ааддЬсЬЬсЬ Ьсаааададс сдсЬдааддд ааасадаадЬ ассЬдЬдсдс садсадаааЬ 1800
даЬЬдсасЬа ЬЬдаЬаааЬЬ ссдааддааа ааЬЬдЬссаЬ сЬЬдЬсдЬсЬ ЬсддаааЬдЬ 1860
ЬаЬдаадсад ддаЬдасЬсЬ дддадсссдд аадсЬдаада аасЬЬддЬаа ЬсЬдааасЬа 1920
саддаддаад дададдсЬЬс садсассасс адссссасЬд аддадасаас ссадаадсЬд 1980
асадЬдЬсас асаЬЬдаадд сЬаЬдааЬдЬ садсссаЬсЬ ЬЬсЬдааЬдЬ ссЬддаадсс 2040
аЬЬдадссад дЬдЬадЬдЬд ЬдсЬддасас дасаасаасс адсссдасЬс сЬЬЬдсадсс 2100
ЬЬдсЬсЬсЬа дссЬсааЬда асЬдддадад адасадсЬЬд ЬасасдЬддЬ саадЬдддсс 2160
ааддссЬЬдс сЬддсЬЬссд саасЬЬасас дЬддасдасс адаЬддсЬдЬ саЬЬсадЬас 2220
ЬссЬддаЬдд ддсЬсаЬддЬ дЬЬЬдссаЬд ддсЬддсдаЬ ссЬЬсассаа ЬдЬсаасЬсс 2280
аддаЬдсЬсЬ асЬЬсдсссс ЬдаЬсЬддЬЬ ЬЬсааЬдадЬ ассдсаЬдса саадЬсссдд 2340
аЬдЬасадсс адЬдЬдЬссд ааЬдаддсас сЬсЬсЬсаад адЬЬЬддаЬд дсЬссаааЬс 2400
- 122 029563
ассссссадд ааЕЕссЕдЕд саЕдааадса сЕдсЕасЕсЕ ЕсадсаЕЕаЕ ЕссадЕддаЕ 2460
дддсЕдаааа аЕсаааааЕЕ сЕЕЕдаЕдаа сЕЕсдааЕда асЕасаЕсаа ддаасЕсдаЕ 2520
сдЕаЕсаЕЕд саЕдсаааад ааааааЕссс асаЕссЕдсЕ саадасдсЕЕ сЕассадсЕс 2580
ассаадсЕсс ЕддасЕссдЕ дсадссЕаЕЕ дсдадададс ЕдсаЕсадсЕ сасЕЕЕЕдас 2640
сЕдсЕааЕса адЕсасасаЕ ддЕдадсдЕд дасЕЕЕссдд аааЕдаЕддс ададаЕсаЕс 2700
ЕсЕдЕдсаад ЕдсссаадаЕ ссЕЕЕсЕддд ааадЕсаадс ссаЕсЕаЕЕЕ ссасасссад 2760
<210> 20
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 20
ададасЕсад аддсдассаЕ 20
<210> 21
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 21
аЕсадсааас асадсадсЕс 20
<210> 22
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 22
ададсЕдЕЕд даЕдаддасс адаа 24
<210> 23
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 23
аддсЕссааа ддсасЕЕдас ЕасЕ 24
<210> 24
- 123 029563
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 24
дассаадсдд дТТдТТаТТд α 21
<210> 25
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 25
ТдссТТдТсд дТсаТаТТТТ Τοα 23
<210> 26
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 26
сддадаасса аасддааадд 20
<210> 27
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 27
сТТсдсссас адТдааТдс 19
<210> 28
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 28
асадсадссд дТТТаТТдТд сТТс 24
<210> 29
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 124 029563
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 29
ЕддсаЕЕсад ЕсЕсасасса сЕдЕ 24
<210> 30
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 30
ассасЕсасс аЕсаЕсЕсаа ддса 24
<210> 31
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 31
ЕдсЕсЕЕсЕЕ ЕдссадаЕсс ЕсдЕ 24
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 32
дссЕЕасссЕ ЕдсадсЕЕас 20
<210> 33
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 33
дадсаЕдсЕд ЕссасЕсЕдЕ 20
<210> 34
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
- 125 029563
<400> 34
сЬЬдсдсаЬЬ сссаадЬсад аЬдЬ 24
<210> 35
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 35
ЬЬЬссЬсЬсс ЬЬсЬсдЬдсЬ дсЬЬ 24
<210> 36
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 36
дадссЬдсЬа садаЬддЬса 20
<210> 37
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 37
ЬдЬсЬассад саддасдаад 20
<210> 38
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 38
ссЬссЬдаад ааЬсдаЬЬсс 20
<210> 39
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 39
даддЬссаса сасЬдаадЬЬ 20
- 126 029563
<210> 40
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 40
ЬЬЬсЬдддсЬ ддссааасаЬ аадс 24
<210> 41
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 41
асасааддЬа аЬдЬдЬдддЬ седа 24
<210> 42
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 42
сддсаддЬдЬ ЬЬдЬдЬдЬдд аааЬ 24
<210> 43
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 43
адаадасаса садсасадса даса 24
<210> 44
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 44
ЬадЬдааасс адЬдЬдЬсЬд ссса 24
<210> 45
- 127 029563
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 45
адсдЕЕсадс асЕЕсЕдадд ЕсЕЕ 24
<210> 46
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 46
сдсЕсЕддЕЕ саЕсЕдсЕсЕ д 21
<210> 47
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 47
ЕсаЕсааадд ЕдсЕсЕсдЕс Ед 22
<210> 48
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 48
Еддададдаа дЕЕсадссаЕ сада 24
<210> 49
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 49
аддададсЕд сЕЕЕсдсЕЕа дЕсЕ 24
<210> 50
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 128 029563
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 50
асс£дс£сад сс£££д£с£с £да£ 24
<210> 51
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 51
адаЬссаддс ££дс££ас£д £сс£ 24
<210> 52
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 52
а££с£ддд££ дддадЬдсаа ддаа 24
<210> 53
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 53
аддадасаЬд сссаддаЬда ааса 24
<210> 54
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 54
асЬаддсадд аса££даса£ ссса 24
<210> 55
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
- 129 029563
<400> 55
асадЕааасс ЕсЕссасаса Еддс 24
<210> 56
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 56
ЕаЕдасассс адддсЕЕЕсд ЕЕса 24
<210> 57
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 57
ЕаасдЕЕссс ЕдсдсдЕЕЕа сада 24
<210> 58
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 58
ЕсссаааЕсс Едасссса 18
<210> 59
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 59
ассасасадс сссЕаддада 20
<210> 60
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 60
асадддЕддс ссаааЕадаа с 21
- 130 029563
<210> 61
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 61
ссЕдЕсЕЕдд асаадсддад а 21
<210> 62
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 62
дддЕсаЕЕЕс сассассЕса ааса 24
<210> 63
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность праймера
<400> 63
ддадаааддс сЕЕасадЕад ЕсЕс 24

Claims (114)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения чувствительности субъекта к терапии антагонистом андрогенного рецептора (АК) первого или второго поколения, включающий:
    (a) тестирование образца, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта на наличие модификации аминокислоты, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Еф ГО N0:1; и
    (b) выявление субъекта, резистентного к терапии антагонистом АК первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации.
  2. 2. Способ прогнозирования чувствительности субъекта к терапии антагонистом андрогенного рецептора (АК) первого или второго поколения, включающий:
    (a) тестирование образца, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта на наличие модификации аминокислоты, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Еф ГО N0:1; и
    (b) выявление субъекта, потенциально резистентного к терапии антагонистом АК первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации.
  3. 3. Способ по п.1, в котором субъекту вводили антагонист АК первого или второго поколения для лечения рака.
  4. 4. Способ по п.3, в котором рак представляет собой рак предстательной железы.
  5. 5. Способ оптимизации терапии субъекта, получающего антагонист АК первого или второго поколения для лечения рака, включающий:
    (а) тестирование образца, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8Еф ГО N0:1; и
    - 131 029563
    (Ь) прекращение лечения антагонистом ЛК первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации или продолжение лечения антагонистом АК первого или второго поколения при отсутствии у субъекта модификации.
  6. 6. Способ выбора субъекта для терапии антагонистом АК третьего поколения, включающий:
    (a) тестирование образца, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК по аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §ЕЦ ГО N0:1; и
    (b) характеризацию субъекта как кандидата на терапию антагонистом АК третьего поколения при наличии у субъекта модификации.
  7. 7. Способ по п.3 или 4, дополнительно включающий прекращение лечения антагонистом АК первого или второго поколения при наличии у субъекта модификации или продолжение лечения антагонистом АК первого или второго поколения при отсутствии у субъекта модификации.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, дополнительно включающий введение антагониста АК третьего поколения, который ингибирует модифицированный рецептор при наличии у субъекта модификации.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, в котором модификация содержит замену или делецию аминокислоты в аминокислотной позиции 876 в полипептиде АК.
  10. 10. Способ по п.9, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  11. 11. Способ по п.9, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина, в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  12. 12. Способ по п.10, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на лейцин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-9, в котором модификация содержит делецию нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную позицию 876 полипептида АК.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный полипептид АК, имеет:
    (ί) мутацию тимина (1) на цитозин (с) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2626 в последовательности нуклеотидов, представленной в §ЕЦ ГО N0:18;
    (ίί) мутацию цитозина (с) на аденин (а) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2628 в последовательности нуклеотидов, представленной в §ЕЦ ГО N0:18; или (и) мутацию цитозина (с) на гуанин (д) в позиции нуклеиновой кислоты, соответствующей позиции нуклеиновой кислоты 2628 в последовательности нуклеотидов, представленной в §ЕЦ ГО N0:18.
  15. 15. Способ по п.14, в котором нуклеиновая кислота кодирует лейцин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  16. 16. Способ по любому из пп.1-15, в котором нуклеиновая кислота представляет собой РНК или
    ДНК.
  17. 17. Способ по п.15, в котором ДНК представляет собой геномную ДНК.
  18. 18. Способ по любому из пп.1-15, дополнительно включающий выделение мРНК из образца РНК.
  19. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором тестирование включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную позицию 876 полипептида АК.
  20. 20. Способ по п.19, в котором амплификацию проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
  21. 21. Способ по п.20, в котором ПЦР-амплификация включает применение пары олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область, кодирующую аминокислотную позицию 876 полипептида АК.
  22. 22. Способ по любому из пп.1-21, включающий секвенирование амплифицированной нуклеиновой кислоты.
  23. 23. Способ по любому из пп.1-22, в котором тестирование включает приведение нуклеиновой кислоты в контакт со специфичным к последовательности нуклеиновой кислоты зондом, причем специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд:
    (a) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный рецептор, который модифицирован в аминокислотной позиции 876;
    (b) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей рецептор дикого типа, имеющий фенилаланин в аминокислотной позиции 876.
  24. 24. Способ по любому из пп.1-23, в котором образец представляет собой образец клеток опухоли субъекта.
  25. 25. Способ по любому из пп.1-23, в котором образец представляет собой образец биопсии опухоли, образец крови, образец сыворотки, образец лимфы или образец аспирата костного мозга.
  26. 26. Способ по п.24 или 25, в котором образец содержит циркулирующие опухолевые клетки (СТС)
    - 132 029563
    или клетки диссеминированной опухоли (ЭТС).
  27. 27. Способ по любому из пп.1-26, в котором антагонист АК первого или второго поколения ингибирует полипептид АК дикого типа за счет конкурентного антагонизма.
  28. 28. Способ по любому из пп.1-27, в котором антагониста АК второго поколения выбирают среди АК№509, энзалутамида (МОУ3100) и КЭ162.
  29. 29. Способ по любому из пп.1-28, в котором субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное среди рака, воспалительного расстройства или пролиферативного расстройства.
  30. 30. Способ по п.29, в котором у субъекта имеется рак.
  31. 31. Способ по п.30, в котором рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря или гепатоцеллюлярный рак.
  32. 32. Способ по п.31, в котором рак представляет собой рак предстательной железы.
  33. 33. Способ по п.32, в котором у субъекта имеется кастрационно-резистентный рак предстательной железы.
  34. 34. Способ по любому из пп.1-33, в котором у субъекта имеется солидная опухоль.
  35. 35. Способ по любому из пп.1-34, в котором субъект получает лечение антагонистом АК первого или второго поколения перед получением образца.
  36. 36. Способ по п.35, в котором образец представляет собой образец, полученный через 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 14 месяцев, 16 месяцев, 18 месяцев, 20 месяцев, 22 месяца или 24 месяца после первого введения антагониста АК первого или второго поколения.
  37. 37. Способ по п.35 или 36, в котором образец получают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз в течение курса лечения антагонистом АК первого или второго поколения.
  38. 38. Способ по любому из пп.1-37, в котором субъект чувствителен к лечению антагонистом АК первого или второго поколения при его первом введении.
  39. 39. Способ скрининга соединений, которые выступают в роли антагониста к модифицированному АК, включающий:
    (a) экспрессию модифицированного АК в клетке, причем модифицированный АК модифицирован в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО ΝΟ: 1;
    (b) приведение клетки в контакт с тестируемым соединением, подвергаемым скринингу; и
    (c) детекцию уровня активности АК в клетке, причем снижение активности относительно активности 8ЕО ГО ΝΟ:1 указывает на то, что соединение выступает в роли антагониста к модифицированному рецептору АК.
  40. 40. Способ по п.39, в котором тестируемое соединение показывает активность полного антагониста к модифицированному рецептору АК.
  41. 41. Способ по п.39 или 40, в котором тестируемое соединение не показывает активность в качестве агониста к модифицированному рецептору АК.
  42. 42. Способ по любому из пп.39-41, в котором модификация представляет собой замену или делецию аминокислоты в позиции 876 полипептида АК.
  43. 43. Способ по п.40, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди лейцина, изолейцина, валина, аланина, глицина, метионина, серина, треонина, цистеина, триптофана, лизина, аргинина, гистидина, пролина, тирозина, аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  44. 44. Способ по п.43, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на аминокислоту, выбранную среди глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина, в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  45. 45. Способ по п.44, в котором модификация представляет собой замену фенилаланина на лейцин в аминокислотной позиции 876 полипептида АК.
  46. 46. Способ по любому из пп.39-45, в котором клетка лишена экспрессии АК дикого типа, экспрессирует низкий уровень АК дикого типа или экспрессирует модифицированный рецептор АК.
  47. 47. Способ по любому из пп.39-46, в котором клетка выбрана среди НеЬа, СУ1, ТО87, НерС2, НЕК293, Όυ145, РС3, Т8У-РК1, Ь^аР, СУК, УСаР и ЬАРС4.
  48. 48. Способ по любому из пп.39-47, в котором клетка содержит репортерный ген, функционально связанный с чувствительным к андрогену промотором.
  49. 49. Способ по п.48, в котором активность определяют, анализируя экспрессию репортерного гена.
  50. 50. Способ по п.48 или 49, в котором промотор содержит чувствительный к андрогену элемент.
  51. 51. Способ по п.50, в котором чувствительный к андрогену элемент представляет собой 4хАКЕ или элемент пробазин.
  52. 52. Способ по любому из пп.39-51, в котором промотор представляет собой пробазин, простатспецифический антиген, ММТУЪТК, РА8^ 8ТЕАР4, ТМРК882, ΟΚМ1 или промотор ΝΚΧ3.1.
  53. 53. Способ по любому из пп.39-52, в котором репортерный ген кодирует белок, выбранный среди люциферазы, флуоресцентного белка, биолюминесцентного белка или фермента.
    - 133 029563
  54. 54. Выделенный полипептид АК или его вариант, имеющий активность АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §Е0 ГО N0: 1, причем модификация придает резистентность к антагонисту АК на модифицированном полипептиде АК или варианте.
  55. 55. Выделенный полипептид АК по п.54, в котором модификация содержит замену аминокислоты в позиции 876 в сравнении с АК дикого типа, представленным в §Е0 ГО N0: 1.
  56. 56. Выделенный полипептид АК по п.54 или 55, в котором замена представляет собой Р876Ь.
  57. 57. Выделенный полипептид АК по п.56, имеющий последовательность аминокислот, представленную в §Е0 ГО N0: 5.
  58. 58. Выделенный полипептид АК по п.54, в котором модификация содержит делецию аминокислотной позиции 876.
  59. 59. Выделенный полипептид АК по любому из пп.54-58, в котором полипептид содержит замену аминокислоты в позиции 876 в сравнении с АК дикого типа, представленным в §Е0 ГО N0: 1, и одну или более дополнительных аминокислотных замен.
  60. 60. Выделенный полипептид АК по п.59, в котором замена аминокислоты в позиции 876 представляет собой Р876Ь.
  61. 61. Выделенный полипептид АК по любому из пп.59-60, в котором одну или более дополнительных аминокислотных замен выбирают среди одной или более аминокислотных замен, связанных с кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
  62. 62. Выделенный полипептид АК по любому из пп.59-61, в котором одну или более дополнительных аминокислотных замен выбирают среди Т877А, А741С, А741Ь, А741К, Ь701Н или Η874Υ.
  63. 63. Выделенный полипептид АК по любому из пп.54-62, в котором полипептид содержит последовательность аминокислот, представленную в §Е0 ГО N0: 5, или вариант, который имеет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в §Е0 ГО N0: 5, причем аминокислота в позиции 876 не является фенилаланином.
  64. 64. Выделенный полипептид АК по любому из пп.54-63, который представляет собой рекомбинантный белок.
  65. 65. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный полипептид АК по любому из пп.54-63.
  66. 66. Выделенная нуклеиновая кислота по п.65, причем нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК или РНК.
  67. 67. Выделенная нуклеиновая кислота по п.65, причем нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.
  68. 68. Выделенная нуклеиновая кислота по п.65 или 66, причем нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновых кислот, представленную в §Е0 ГО N0: 19, или вариант, который имеет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентичность последовательности с последовательностью нуклеиновых кислот, представленной в §Е0 ГО N0: 19, причем кодон нуклеиновой кислоты, кодирующий аминокислоту в позиции 876, не кодирует фенилаланин.
  69. 69. Выделенная нуклеиновая кислота по п.68, в которой нуклеиновая кислота кодирует лейцин в позиции 876 полипептида АК.
  70. 70. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.65-69.
  71. 71. Вектор по п.70, представляющий собой вирусный или плазмидный вектор.
  72. 72. Вектор по п.70 или 71, в котором нуклеиновая кислота функционально связана с промотором.
  73. 73. Вектор по п.72, в котором промотор представляет собой конститутивный или индуцируемый промотор.
  74. 74. Клетка-хозяин, содержащая вектор по любому из пп.70-73.
  75. 75. Клетка-хозяин по п.74, представляющая собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку.
  76. 76. Клетка-хозяин по п.75, представляющая собой клетку млекопитающих, бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого, растительную клетку или клетку амфибии.
  77. 77. Мутантный полипептид АК, экспрессируемый клеткой-хозяином по любому из пп.74-76.
  78. 78. Антагонист АК третьего поколения, выявленный способами по любому из пп.39-53.
  79. 79. Фармацевтическая композиция, содержащая антагонист АК третьего поколения, выявленный способами по любому из пп.39-53, и фармацевтически приемлемый эксципиент.
  80. 80. Способ лечения субъекта, страдающего раком, включающий введение требующему лечения субъекту, страдающему раком, терапевтически эффективного количества антагонист АК третьего поколения по п.78 или фармацевтической композиции по п.79, причем композиция содержит подходящий фармацевтический носитель, где субъект имеет рак.
  81. 81. Способ по п.80, в котором рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря или гепатоцеллюлярный рак.
    - 134 029563
  82. 82. Способ по п.81, в котором рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы.
  83. 83. Способ по любому из пп.80-82, в котором у субъекта экспрессируется мутантный АК.
  84. 84. Способ по п.83, в котором мутантный АК содержит замену или делецию аминокислоты в аминокислотной позиции 876 в полипептиде АК.
  85. 85. Способ по п.84, в котором замена представляет собой Р876Ь.
  86. 86. Способ по любому из пп.80-85, в котором антагонист АК третьего поколения вводят с дополнительным терапевтическим агентом.
  87. 87. Способ по п.86, в котором антагонист АК третьего поколения и дополнительный терапевтический агент вводят последовательно, одновременно или попеременно.
  88. 88. Способ по п.86 или 87, в котором дополнительный терапевтический агент выбирают среди гормонов, агонистов или антагонистов рецепторов гормонов, кортикостероидов, противорвотных агентов, анальгетиков, противораковых агентов, противовоспалительных агентов, ингибиторов киназ, ингибиторов Н8Р90 и ингибиторов гистондеацетилазы (НОАС).
  89. 89. Способ по п.86 или 87, в котором дополнительный терапевтический агент представляет собой агонист или антагонист гонадотропин-высвобождающего гормона (СпКН).
  90. 90. Способ по п.89, в котором агонист СпКН представляет собой лейпролид, бусерелин или гозерелин.
  91. 91. Микрочип, содержащий модифицированный полипептид АК по любому из пп.54-63 или нуклеиновую кислоту по любому из пп.64-68.
  92. 92. Микрочип по п.91, в котором модифицированный полипептид АК содержит аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь, или нуклеиновая кислота кодирует модифицированный полипептид АК, имеющий аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь.
  93. 93. Набор, содержащий носитель или упаковку, которая разделена на отсеки для вмещения одного или более контейнеров, где каждый контейнер содержит:
    (a) один или более реагентов для обнаружения нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный полипептид АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876, или модифицированный полипептид АК, содержащий модификацию в аминокислотной позиции 876;
    (b) один или более выбранных из буфера ПЦР реагента, антитела, субстрата для ферментативного окрашивания, хромогена, образца контроля белка;
    (c) необязательную этикетку, указывающую на список компонентов, и/или инструкции по использованию, и/или вкладыш в упаковку с инструкциями по использованию.
  94. 94. Набор по п.93, в котором модифицированный полипептид АК содержит аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь.
  95. 95. Набор по п.93 или 94, содержащий пару олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоту 876 полипептида АК.
  96. 96. Набор по п.93 или 94, содержащий олигонуклеотидный праймер, который:
    (a) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный АК, который модифицирован в аминокислотной позиции 876; и
    (b) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей АК дикого типа, имеющий фенилаланин в аминокислотной позиции 876.
  97. 97. Набор по п.93 или 94, содержащий микрочип, который содержит:
    (a) модифицированный полипептид АК, имеющий модификацию, которая представляет собой Р8768, или его часть, содержащую модификацию, которая представляет собой Р8768; или
    (b) нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид АК, имеющий модификацию, которая представляет собой Р8768, или его часть, содержащую модификацию, которая представляет собой Р8768.
  98. 98. Система детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащая:
    (a) образец, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта; и
    (b) микроматрицу, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид АК или его часть, который модифицирован в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО N0: 1.
  99. 99. Система по п.98, в которой микроматрица содержится на микрочипе.
  100. 100. Система детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащая:
    (a) образец, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта; и
    (b) специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд, причем специфичный к последовательности нуклеиновой кислоты зонд:
    (ί) связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный АК, который модифицирован в аминокислотной позиции 876; и
    (ίί) не связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей АК дикого типа, имеющий фенилаланин в
    - 135 029563
    аминокислотной позиции 876.
  101. 101. Система детекции модифицированного АК, который является резистентным к ингибированию антагонистом АК первого или второго поколения у субъекта, содержащая:
    (a) образец, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта; и
    (b) пару олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоту 876 полипептида АК.
  102. 102. Выделенное антитело, которое связывается с модифицированным полипептидом АК по любому из пп.53-62, причем антитело не связывается или связывается с меньшей аффинностью с полипептидом АК дикого типа, имеющим последовательность аминокислот, представленную в §ЕЦ ГО NΟ: 1.
  103. 103. Антитело по п.102, в котором модифицированный полипептид АК содержит аминокислотную замену, которая представляет собой Р876Ь.
  104. 104. Способ поддерживающей терапии у пациента, имеющего рак, включающий:
    (a) применение к пациенту схемы поддерживающей терапии, включающей введение терапевтически эффективной дозы антагониста АК первого или второго поколения; и
    (b) контроль пациента через заданные интервалы времени в течение курса схемы поддерживающей терапии, чтобы определить, имеется ли у субъекта мутация в эндогенном гене, кодирующем АК, которая приводит к модификации в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §ЕЦ ГО NΟ:1.
  105. 105. Способ по п.104, в котором контроль включает тестирование образца, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид АК, от субъекта, чтобы определить, модифицирован ли кодированный полипептид АК в аминокислотной позиции, соответствующей аминокислотной позиции 876 аминокислотной последовательности, представленной в §ЕЦ ГО NΟ: 1.
  106. 106. Способ по п.104 или 105, дополнительно включающий прекращение схемы поддерживающей терапии при наличии у субъекта модификации или продолжение схемы поддерживающей терапии при отсутствии у субъекта модификации.
  107. 107. Способ по п.104 или 105, дополнительно включающий введение антагониста АК третьего поколения, который ингибирует модифицированный АК при наличии у субъекта модификации.
  108. 108. Способ по любому из пп.104-107, в котором модификация в полипептиде АК представляет собой Р876Ь.
  109. 109. Способ по любому из пп.104-108, в котором антагонист АК первого или второго поколения ингибирует полипептид АК дикого типа за счет конкурентного антагонизма.
  110. 110. Способ по любому из пп.104-109, в котором антагониста АК второго поколения выбирают среди АК^509, энзалутамида (М^V3100) и КО 162.
  111. 111. Способ по любому из пп.104-110, в котором рак представляет собой рак предстательной железы, рак молочной железы, рак мочевого пузыря или гепатоцеллюлярный рак.
  112. 112. Способ по п.111, в котором рак представляет собой рак предстательной железы.
  113. 113. Способ по п.112, в котором рак представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы.
  114. 114. Способ по любому из пп.104-113, в котором заданный интервал времени представляет собой каждую неделю, каждый месяц, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца, каждые 4 месяца, каждые 5 месяцев, каждые 6 месяцев, каждые 7 месяцев, каждые 8 месяцев, каждые 9 месяцев, каждые 10 месяцев, каждые 11 месяцев или каждый год.
    - 136 029563
    - 137 029563
    Р1881
    ΑΡΝ-509
    ·+· Энзалутамид — Время - О
    <·> Р1881 ΑΡΝ-509
    -А- Энзалутамид — Время - О
EA201590290A 2012-07-27 2013-07-26 Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор EA029563B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261676842P 2012-07-27 2012-07-27
US201361783763P 2013-03-14 2013-03-14
US201361829123P 2013-05-30 2013-05-30
PCT/US2013/052395 WO2014018926A1 (en) 2012-07-27 2013-07-26 Methods and compositions for determining resistance to androgen receptor therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590290A1 EA201590290A1 (ru) 2015-06-30
EA029563B1 true EA029563B1 (ru) 2018-04-30

Family

ID=48948536

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590290A EA029563B1 (ru) 2012-07-27 2013-07-26 Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор
EA201792520A EA035535B1 (ru) 2012-07-27 2013-07-26 Слитый белок и устройство для лечения заболеваний или состояний, связанных с андрогенными рецепторами

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792520A EA035535B1 (ru) 2012-07-27 2013-07-26 Слитый белок и устройство для лечения заболеваний или состояний, связанных с андрогенными рецепторами

Country Status (34)

Country Link
US (2) US9617602B2 (ru)
EP (2) EP3653733A1 (ru)
JP (3) JP6297556B2 (ru)
KR (2) KR102210183B1 (ru)
CN (3) CN104685072A (ru)
AU (3) AU2013295543B2 (ru)
BR (2) BR112015001801A2 (ru)
CA (1) CA2879926A1 (ru)
CL (1) CL2015000194A1 (ru)
CO (1) CO7280477A2 (ru)
CR (1) CR20150022A (ru)
CY (1) CY1122651T1 (ru)
DK (1) DK2877599T3 (ru)
EA (2) EA029563B1 (ru)
EC (1) ECSP15007420A (ru)
ES (1) ES2764381T3 (ru)
GT (1) GT201500019A (ru)
HK (1) HK1211060A1 (ru)
HR (1) HRP20192342T1 (ru)
HU (1) HUE047781T2 (ru)
IL (2) IL236844B (ru)
LT (1) LT2877599T (ru)
MX (2) MX370507B (ru)
NI (1) NI201500004A (ru)
NZ (4) NZ744288A (ru)
PE (3) PE20190845A1 (ru)
PH (2) PH12015500175A1 (ru)
PL (1) PL2877599T3 (ru)
PT (1) PT2877599T (ru)
RS (1) RS59812B1 (ru)
SG (2) SG11201500184TA (ru)
SI (1) SI2877599T1 (ru)
UA (1) UA118178C2 (ru)
WO (1) WO2014018926A1 (ru)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2721506C (en) 2008-04-16 2019-09-17 Jun Luo Compositions and methods for treating or preventing prostate cancer and for detecting androgen receptor variants
AU2012353660A1 (en) 2011-12-16 2014-06-12 Olema Pharmaceuticals, Inc. Novel benzopyran compounds, compositions and uses thereof
EP2839028B1 (en) 2012-04-20 2016-12-28 Cepheid Methods of detecting bladder cancer
EP2912194B1 (en) * 2012-10-26 2019-05-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
ES2798899T3 (es) * 2013-02-25 2020-12-14 Novartis Ag Mutación novedosa del receptor de andrógenos
ES2715874T3 (es) 2013-03-06 2019-06-06 Cepheid Métodos de detección del cáncer de la vejiga
EP4066841A1 (en) 2013-03-14 2022-10-05 University of Maryland, Baltimore Androgen receptor down-regulating agents and uses thereof
SG11201600525XA (en) 2013-08-12 2016-02-26 Tokai Pharmaceuticals Inc Biomarkers for treatment of neoplastic disorders using androgen-targeted therapies
EP3456700A1 (en) 2013-10-18 2019-03-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Labeled inhibitors of prostate specific membrane antigen (psma), their use as imaging agents and pharmaceutical agents for the treatment of prostate cancer
KR20200015830A (ko) * 2014-02-05 2020-02-12 레크 파마슈티칼스 디.디. 안드로겐 수용체 길항제의 고체 제약 조성물
US10774387B2 (en) 2014-05-19 2020-09-15 The Johns Hopkins University Methods for identifying androgen receptor splice variants in subjects having castration resistant prostate cancer
WO2016033114A1 (en) * 2014-08-25 2016-03-03 The Johns Hopkins University Methods and compositions related to prostate cancer therapeutics
US11369319B2 (en) 2016-03-29 2022-06-28 Roche Diabetes Care, Inc. Method of operating a receiver for receiving analyte data, receiver and computer program product
US11702702B2 (en) * 2016-04-15 2023-07-18 Predicine, Inc. Systems and methods for detecting genetic alterations
CN106405085B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106290919B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106198985B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106526185B (zh) * 2016-10-28 2018-03-30 拜尔康(天津)医药科技有限公司 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及检测方法
ES2884064T3 (es) * 2016-12-16 2021-12-10 Kangpu Biopharmaceuticals Ltd Composición combinada que comprende un compuesto benzoheterocíclico y un modulador de la vía de los receptores androgénicos y usos de la misma
SG11202003122XA (en) * 2017-10-19 2020-05-28 Univ Yale Inhibition of androgen receptor by extracts of medicinal herbs and compositions thereof
CN108018342A (zh) * 2017-12-04 2018-05-11 合肥艾迪康临床检验所有限公司 检测ar基因突变的引物和方法
JP6993683B2 (ja) 2017-12-15 2022-01-13 東都興業株式会社 ビニールハウスにおけるシート押え紐の止め具
CN109115742A (zh) * 2018-09-05 2019-01-01 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种抗雄激素效应的检测方法
CN109321569B (zh) * 2018-10-29 2022-04-12 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一种引物探针组合物及其应用
KR102473989B1 (ko) 2018-11-28 2022-12-07 (주)바이오니아 안드로젠 수용체 특이적 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 및 이를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물
JP2022549222A (ja) * 2019-09-23 2022-11-24 アキュター バイオテクノロジー インコーポレイテッド アンドロゲン受容体分解活性を有する新規尿素およびその使用
GB201914296D0 (en) * 2019-10-03 2019-11-20 Univ Oxford Innovation Ltd Treatment
WO2021110731A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Bayer Aktiengesellschaft Method for determining the response of prostate cancer patients to treatment with androgen receptor antagonists based on gene expression changes or super-enhancer protein-binding profiles
CN113533730B (zh) * 2021-07-23 2022-09-06 南方医科大学深圳医院 一种血浆外泌体标志物组合及其应用
WO2024001989A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. Compositions and methods for modulating molecules
CN117860773B (zh) * 2023-11-28 2024-07-16 四川大学华西医院 促进ar基因甲基化的药物及其在预防或治疗雄性激素脱发中的用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066599A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Schering Ag Crystal
EP2065474A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-03 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH A method to assess prognosis and to predict therapeutic response to endocrine treatment
US20100068802A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-18 University Of Maryland, Baltimore Novel human androgen receptor alternative splice variants as biomarkers and therapeutic targets

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU690131B2 (en) 1993-07-26 1998-04-23 Variagenics, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes as a basis for cancer therapeutic agents
US6200754B1 (en) 1998-03-19 2001-03-13 Variagenics, Inc. Inhibitors of alternative alleles of genes encoding products that mediate cell response to environmental changes
US6960474B2 (en) * 2000-06-28 2005-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Method for the treatment of a condition remediable by administration of a selective androgen receptor modulator
NZ550102A (en) * 2004-02-24 2010-10-29 Univ California Methods and materials for assessing prostate cancer therapies and compounds (thiohydantoine derivatives)
MX2010005703A (es) * 2007-11-26 2010-06-11 Enzon Pharmaceuticals Inc Antagonistas de acido nucleico entrelazado que eligen como objetivo al receptor de androgeno.
JP5631382B2 (ja) * 2009-04-03 2014-11-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 複合材料の製造方法
GEP20146138B (en) * 2009-10-23 2014-08-11 Panacela Labs Inc Method for treating androgen receptor positive cancers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066599A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Schering Ag Crystal
EP2065474A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-03 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH A method to assess prognosis and to predict therapeutic response to endocrine treatment
US20100068802A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-18 University Of Maryland, Baltimore Novel human androgen receptor alternative splice variants as biomarkers and therapeutic targets

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALBAS MINNA D; EVANS MICHAEL J; HOSFIELD DAVID J; WONGVIPAT JOHN; ARORA VIVEK K; WATSON PHILIP A; CHEN YU; GREENE GEOFFREY L; SHE: "Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.", ELIFE, ELIFE SCIENCES PUBLICATIONS LTD., GB, vol. 2, GB, pages e00499/1 - 21, XP009173001, ISSN: 2050-084X, DOI: 10.7554/eLife.00499 *
C. E. BOHL, WU Z., MILLER D. D., BELL C. E., DALTON J. T.: "Crystal Structure of the T877A Human Androgen Receptor Ligand-binding Domain Complexed to Cyproterone Acetate Provides Insight for Ligand-induced Conformational Changes and Structure-based Drug Design", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 282, no. 18, pages 13648 - 13655, XP055080870, ISSN: 00219258, DOI: 10.1074/jbc.M611711200 *
HAAPALA K, ET AL: "Androgen receptor alterations in prostate cancer relapsed during a combined androgen blockade by orchiectomy and bicalutamide.", LABORATORY INVESTIGATION, NATURE PUBLISHING GROUP, THE UNITED STATES AND CANADIAN ACADEMY OF PATHOLOGY, INC., vol. 81, no. 12, 1 December 2001 (2001-12-01), The United States and Canadian Academy of Pathology, Inc., pages 1647 - 1651, XP002382327, ISSN: 0023-6837 *
J. D. JOSEPH, LU N., QIAN J., SENSINTAFFAR J., SHAO G., BRIGHAM D., MOON M., MANEVAL E. C., CHEN I., DARIMONT B., HAGER J. H.: "A Clinically Relevant Androgen Receptor Mutation Confers Resistance to Second-Generation Antiandrogens Enzalutamide and ARN-509", CANCER DISCOVERY, vol. 3, no. 9, 1 September 2013 (2013-09-01), pages 1020 - 1029, XP055080859, ISSN: 21598274, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-13-0226 *
M. KORPAL, KORN J. M., GAO X., RAKIEC D. P., RUDDY D. A., DOSHI S., YUAN J., KOVATS S. G., KIM S., COOKE V. G., MONAHAN J. E., STE: "An F876L Mutation in Androgen Receptor Confers Genetic and Phenotypic Resistance to MDV3100 (Enzalutamide)", CANCER DISCOVERY, vol. 3, no. 9, 1 September 2013 (2013-09-01), pages 1030 - 1043, XP055080863, ISSN: 21598274, DOI: 10.1158/2159-8290.CD-13-0142 *
TAKAYOSHI, D. ; NOBORU, K. ; ATSUSHI, O. ; HISAKAZU, F. ; TERUO, I. ; TOMOHIKO, K.: "Establishment and characterization of monoclonal antibody against androgen receptor", JOURNAL OF STEROID BIOCHEMISTRY., PERGAMON PRESS PLC., GB, vol. 33, no. 5, 1 November 1989 (1989-11-01), GB, pages 845 - 851, XP025204824, ISSN: 0022-4731, DOI: 10.1016/0022-4731(89)90231-8 *
XING HUO, LI JIAZHONG, GRAMATICA PAOLA: "Quantitative structure–activity relationship analysis of a novel series of chemicals antagonizing WT and MT AR", CHEMOMETRICS AND INTELLIGENT LABORATORY SYSTEMS, vol. 107, no. 2, 1 July 2011 (2011-07-01), pages 283 - 289, XP055081203, ISSN: 01697439, DOI: 10.1016/j.chemolab.2011.04.013 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150072399A (ko) 2015-06-29
AU2017203385A1 (en) 2017-06-08
SG11201500184TA (en) 2015-04-29
HRP20192342T1 (hr) 2020-04-03
PE20190845A1 (es) 2019-06-17
GT201500019A (es) 2017-07-24
JP6297556B2 (ja) 2018-03-20
CN108048567A (zh) 2018-05-18
PH12015500175B1 (en) 2015-03-16
JP2020072655A (ja) 2020-05-14
PE20150644A1 (es) 2015-05-11
US20150252426A1 (en) 2015-09-10
AU2019201726B2 (en) 2021-04-01
IL236844B (en) 2019-09-26
MX2019015148A (es) 2020-02-19
NZ744288A (en) 2020-04-24
MX2015001209A (es) 2015-09-23
CO7280477A2 (es) 2015-05-29
NI201500004A (es) 2015-10-05
JP6592545B2 (ja) 2019-10-16
CN104685072A (zh) 2015-06-03
AU2013295543A1 (en) 2015-02-05
JP2015531590A (ja) 2015-11-05
US9617602B2 (en) 2017-04-11
AU2013295543B2 (en) 2019-03-14
EA035535B1 (ru) 2020-07-01
NZ740700A (en) 2019-07-26
ES2764381T3 (es) 2020-06-03
MX370507B (es) 2019-12-16
PH12015500175A1 (en) 2015-03-16
JP2018113968A (ja) 2018-07-26
PT2877599T (pt) 2020-01-24
PL2877599T3 (pl) 2020-05-18
UA118178C2 (uk) 2018-12-10
KR102210183B1 (ko) 2021-01-29
NZ704487A (en) 2018-05-25
HUE047781T2 (hu) 2020-05-28
US20170196840A1 (en) 2017-07-13
PH12018502500A1 (en) 2020-09-14
SI2877599T1 (sl) 2020-03-31
SG10201703254VA (en) 2017-06-29
CY1122651T1 (el) 2021-03-12
HK1211060A1 (en) 2016-05-13
DK2877599T3 (da) 2020-01-20
EP2877599B1 (en) 2019-10-23
BR112015001801A2 (pt) 2017-11-07
RS59812B1 (sr) 2020-02-28
CR20150022A (es) 2015-04-30
WO2014018926A8 (en) 2014-04-10
PE20190574A1 (es) 2019-04-22
CL2015000194A1 (es) 2015-04-24
KR20210012064A (ko) 2021-02-02
BR122017017921A2 (pt) 2019-09-10
WO2014018926A1 (en) 2014-01-30
CA2879926A1 (en) 2014-01-30
NZ742581A (en) 2020-02-28
AU2019201726A1 (en) 2019-04-04
IL265610B (en) 2021-03-25
EA201590290A1 (ru) 2015-06-30
IL236844A0 (en) 2015-03-31
LT2877599T (lt) 2020-01-27
ECSP15007420A (es) 2016-01-29
CN110845626A (zh) 2020-02-28
AU2017203385B2 (en) 2018-12-20
EA201792520A3 (ru) 2018-08-31
EP2877599A1 (en) 2015-06-03
EP3653733A1 (en) 2020-05-20
IL265610A (en) 2019-05-30
EA201792520A2 (ru) 2018-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029563B1 (ru) Способы и композиции для определения резистентности к терапии, направленной на андрогенный рецептор
Cao et al. Genome-wide identification of PAX3-FKHR binding sites in rhabdomyosarcoma reveals candidate target genes important for development and cancer
US20110311555A1 (en) Tc11 as a Transcriptional Regulator
UA121655C2 (uk) Спосіб лікування аденокарциноми легень
Ghiassi‐Nejad et al. Reduced hepatic stellate cell expression of kruppel‐like factor 6 tumor suppressor isoforms amplifies fibrosis during acute and chronic rodent liver injury
JP2015109806A (ja) 新規ｒｅｔ融合体の検出法
Todorova et al. Micro-RNA-204 participates in TMPRSS2/ERG regulation and androgen receptor reprogramming in prostate cancer
Zheng et al. Clonal deletion of simian virus 40 large T antigen-specific T cells in the transgenic adenocarcinoma of mouse prostate mice: an important role for clonal deletion in shaping the repertoire of T cells specific for antigens overexpressed in solid tumors
WO2019143880A1 (en) Biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response
Debrus et al. The zinc finger-only protein Zfp260 is a novel cardiac regulator and a nuclear effector of α1-adrenergic signaling
Trépos‐Pouplard et al. Proteome analysis and genome‐wide regulatory motif prediction identify novel potentially sex‐hormone regulated proteins in rat efferent ducts
US7037652B2 (en) Expression analysis of KIAA nucleic acids and polypeptides useful in the diagnosis and treatment of prostate cancer
Porter The dynamic role of the androgen receptor (AR) and ABL interactor-1 (ABI1) axis in prostate cancer
Ahn Role of receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2 in treatment-resistant prostate cancer
Jain Development of transcriptional amplification systems to target and characterize cancer cells based on gene expression altered during prostate cancer development and treatment
Yerokun et al. Molecular Profile of Human Serine Palmitoyltransferase-1 Proximate of Chromosome 9 Disease Susceptibility Gene Cluster in Inflammatory Cancer Cell Lines
Balbas Mutation Based Resistance to Antiandrogens in Prostate Cancer
Watkins A new pathway in the induction of breast cancer