CN108018342A - 检测ar基因突变的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测与前列腺癌有关的AR基因突变的引物和方法。本发明应用RT‑PCR和Sanger测序两项技术，仅使用一对扩增引物和测序引物就可实现位于5号外显子上的主要突变位点W741L/C、8号外显子上的主要突变位点H874Y，F876L和T877A上突变情况的检测，继而能够方便快捷、经济，准确地诊断患者AR基因的突变情况。本发明所述引物和方法，准确、检测高效。

Description

检测AR基因突变的引物和方法
技术领域
本发明属于医学及生物技术领域，一种使用RT-PCR及Sanger测序法检测AR点突变的方法和引物。
技术背景
前列腺癌目前发病率非常高，特别是欧美国家，根据美国国家肿瘤研究所和国家卫生统计中心数据，前列腺癌的发病自1975～2009年以来始终是男性恶性肿瘤发病之首，约160～180/100 000，2001～2005年全美国男性恶性肿瘤的发病率平均562.3/100 000，前列腺癌为158.2/100 000，在所有人群中居第二，仅次于肺和支气管癌，是最严重危害男性健康的疾病。前列腺肿瘤的生长几乎完全依靠雄激素受体(AR)途径，因此对前列腺癌的治疗围绕阻断这条途径为中心来制定。然而在开始阶段应用去势对抗雄激素治疗前列腺癌的治疗非常有效，但肿瘤发展到进展期，对抗雄激素治疗无效，出现骨转移等，众多文献报道前列腺癌的发病进展转移多有AR的突变，在前列腺癌的进展过程中起着重要作用。
人类的AR基因定位于X染色体(Xq11-12)，包含8个外显子和7个内含子，全长90kb，编码918个氨基酸。AR一般由4个结构区域组成，N端(氨基端)转录激活区(NTD)、DNA结合结构区(DBD)、铰链区和配体结合结构区(LBD)，不同的结构区域具有特定的功能。外显子1编码于N-端区域，和5’非转录区，外显子2和3编码于DNA结合结构区(DBD)，外显子4-8编码在铰链区和配体结合区(LBD)。AR基因突变包括基因片段缺失、插入、重复，单个碱基的缺失、插入、点突变等，突变点多发生在LBD，主要为单碱基点突变。目前，AR基因70多个错义突变已经确定，其中H874Y，F876L，T877A和W741L/C四个突变位点会引起耐药性和疾病发展得到公认。
目前用于AR突变检测的方法主要有：Sanger测序法和NGS(Next–generationsequencing technology)测序。Sanger测序法目前是临床应用于检测基因突变极其普遍的一种手段，应用灵活，但其灵敏度不高，且每次测序长度有限，一般一次只能测800bp左右的基因片段。目前AR测序主要以DNA为模板进行PCR扩增，引物测序片段的限制，通常两个热点区域需要分别扩增，增加了成本。NGS测序技术，即高通量测序技术，具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，适用于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查。NGS对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测，成本太高且操作相对于Sanger法更为复杂，对数据分析的要求较高。
发明内容
鉴于目前AR突变位点检测方法的不足，本发明提供了一种以cDNA为模板使用Sanger测序法检测AR点突变的引物，所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
进一步地，所述扩增引物在如下扩增体系中使用：10μl的2×KOD Buffer，0.4μl的KOD酶，4μl的d NTP；10μM引物AR-F和10μM AR-R各0.5ul；3.6μl去离子水；1μl的cDNA模版。
进一步地，所述扩增引物在如下扩增程序下进行：94℃5min；98℃10s，58℃25s，72℃25s，共40个循环；72℃2min。
本发明还提供了检测与T-ALL相关的AR基因点突变的方法，包括以下步骤：
1.提取人全血样本中的RNA，逆转录获得cDNA；
2.利用扩增引物进行PCR扩增步，得到扩增产物；所述PCR扩增条件为：94℃5min；98℃10s，58℃25s，72℃25s，共40个循环；72℃2min。
3.使用酶法纯化PCR产物；
4.利用测序引物进行Sanger测序，得到不同片段长度的测序产物；所述测序反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性15s，50℃退火20s，60℃延伸2min，25个循环。
5.测序产物纯化及上测序仪进行测序；
6.对得到的测序结果进行分析。
所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
进一步地，检测AR基因点突变的位点分别是W741、H874、F876和T877。
进一步地，所述点突变的原始序列分别是：
AR W741野生型：TGG
AR H874野生型：CAT
AR F876野生型：TTC
AR T877野生型：ACT。
本发明还提供了一种使用一对引物检测AR基因W741L/C、H874Y、F876L和T877A位点的基因突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)提取人全血样本中的RNA，逆转录获得cDNA；
(2)利用扩增引物进行PCR扩增步，得到扩增产物；
(3)使用酶法纯化PCR产物；
(4)利用测序引物进行Sanger测序，得到不同片段长度的测序产物；
(5)对得到的测序结果进行分析；
所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
本发明的有益效果是：在现有的技术中，AR基因突变的检测是基于DNA为模板，要检测相距较远的两个点突变，就需要分别针对这两个位置进行两个PCR扩增，分两段进行测序。而本发明所述的引物和检测方法是基于cDNA为模板，只要进行一个PCR扩增和测序反应，即可同时检测相距较远的两个点突变，节省了成本，增加了检测通量。有助于快速、准确地诊断患者AR突变位点基因的突变情况和突变类型，对于临床上前列腺癌患者用药指导及预后评估有很大的指导意义。
附图说明
图1是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的W741位点测序图。(框选中位置为W741位点)
图2是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的H874位点测序图。(框选中位置为H874位点)
图3是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的F876位点测序图。(框选中位置为F876位点)
图4是使用本发明引物测序方法对一个待检血液样本进行筛查的T877位点测序图。(框选中位置为T877位点)
具体实施方式
实施例1
血液RNA的提取及逆转录：1.5ml离心管中加400μl全血标本和800μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置10min；期间颠倒混匀2-3次；10000rpm离心1min；吸弃上清；加入1mlTRIzol Reagent；用移液枪反复吹打直至裂解液中无细胞团块；每管加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后冰上放置10min。4℃，12000rpm离心10min；吸取上层水相到新管中，然后加入等体积预冷异丙醇，旋涡混匀，冰上静置10min；4℃，12000rpm离心10min；缓慢倒弃上清，在吸水纸上沥干管口残余液体，缓慢加入1ml 75％的DEPC-乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃，12000rpm离心5min；倒弃上清，在吸水纸上沥干管口残余液体，室温干燥5min；加入20-50μl RNA-free水；取6μl RNA加入1μl Primer Mix，再加入4μl RNA-free H2O，65℃变性5min，冰上静置2min，再加入4μl 5×RT buffer，1μl ReverTra Ace(TOYOBO)，最后加入4μlRNA-free H2O。按照如下程序进行逆转录：37℃50min；95℃5min。反应结束后，保存于-20℃待用。
其中，所述10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl 82g，NaHCO3 8.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。
实施例2
PCR扩增：按如下试剂及试剂量配置PCR扩增体系，其中2×KOD Buffer 10μl，KOD酶(1U/μl)0.4μl，dNTP(2mM)4μl；10μM引物AR-F和10μM AR-R各0.5ul；加去离子水3.6μl；最后加cDNA模版1μl。其扩增程序如下：94℃5min；98℃10s，58℃25s，72℃25s，共40个循环；72℃2min。所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
实施例3
PCR产物纯化：酶纯化按如下体系配置：CIP(NEB公司)0.1μl，ExoⅠ(NEB公司)0.5μl，去离子水1.4μl；最后加入9μl PCR产物。其纯化反应程序如下：37℃50min，95℃5min。
实施例4
Sanger测序反应：每反应体系5μl：Bigdye加1μl，3.2P引物加1μl，纯化后的模板加2μl，最后加入1μl ddH2O。盖上管盖低速短暂离心，旋涡混匀，再次低速短暂离心。上PCR仪进行测序反应，反应按如下条件：95℃预变性4min；95℃变性15s，50℃退火20s，60℃延伸2min，25个循环。所述的Sanger测序引物包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
实施例5
测序产物纯化：向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，室温静置30min，充分挥发乙醇；每孔加入10μlHi-Di，封板，放在PCR仪上95℃预变性5min，迅速放入-20℃冰箱内冷却5min；上测序仪测序。
将待检样品的测序结果与野生型标准序列进行比对，如果与标准序列一致则为野生型，与标准序列不一致则为突变。
实施例6
检测AR点突变的试剂包括PCR扩增反应的扩增引物和Sanger测序的测序引物。其中所述的扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
检测AR点突变的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、RNA-freeH2O、ReverTra Ace、检测体系PCR反应液、测序反应体系。
其中，所述10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl 82g，NaHCO3 8.4g，EDTA-Na2 3.72g，加ddH2O定容至1000ml。
所述PCR反应液包括2×KOD Buffer 10μl，KOD酶(1U/μl)0.4μl，dNTP(2mM)4μl；10μM引物AR-F和10μM AR-R各0.5ul；加去离子水3.6μl；最后加cDNA模版1μl。其中所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
其扩增程序如下：94℃5min；98℃10s，58℃25s，72℃25s，共40个循环；72℃2min。其中：
所述测序反应体系包括每反应体系每反应体系5μl：Bigdye加1μl，3.2P引物加1μl，纯化后的模板加2μl，最后加入1μl ddH2O。盖上管盖低速短暂离心，旋涡混匀，再次低速短暂离心。所述的测序引物包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
上PCR仪进行测序反应，反应按如下条件：95℃预变性4min；95℃变性15s，50℃退火20s，60℃延伸2min，25个循环。
实施例7
对第一例待检全血样本按实施例1-6所述进行RNA的提取及逆转录，PCR扩增，测序，得到的测序峰图如图1，得到W741位点测序结果序列为：TGG。根据结果判断标准，该样本W741位点未突变。
实施例8
对第二例待检全血样本按实施例1-6所述进行RNA的提取及逆转录，PCR扩增，测序，得到的测序峰图如图2，得到H874位点测序结果序列为：CAT。根据结果判断标准，该样本H874位点未突变。
实施例9
对第三例待检全血样本按实施例1-6所述进行RNA的提取及逆转录，PCR扩增，测序，得到的测序峰图如图3，得到F876位点测序结果序列为：TTC。根据结果判断标准，该样本F876位点未突变。
实施例10
对第四例待检全血样本按实施例1-6所述进行RNA的提取及逆转录，PCR扩增，测序，得到的测序峰图如图4，得到T877位点测序结果序列为：ACT。根据结果判断标准，该样本T877位点未突变。
序列表
<110> 合肥艾迪康临床检验所有限公司
<120> 检测AR基因突变的引物和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcttccgc aacttacacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagaaaggat cttgggcact 20

Claims (5)

1.一种检测AR基因突变的引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述扩增引物在如下扩增体系中使用：10μl的2×KOD Buffer，0.4μl的KOD酶，4μl的d NTP；10μM引物AR-F和10μM AR-R各0.5ul；3.6μl去离子水；1μl的cDNA模版。
3.使用一对引物检测AR基因W741L/C、H874Y、F876L和T877A位点的基因突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)提取人全血样本中的RNA，逆转录获得cDNA；
(2)利用扩增引物进行PCR扩增步，得到扩增产物；
(3)使用酶法纯化PCR产物；
(4)利用测序引物进行Sanger测序，得到不同片段长度的测序产物；
(5)对得到的测序结果进行分析；
所述扩增引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’
所述测序引物的核苷酸序列包括：
AR-F 5’-TGGCTTCCGCAACTTACACG-3’
AR-R 5’-CAGAAAGGATCTTGGGCACT-3’。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增引物在如下扩增程序下进行：94℃5min；98℃10s，58℃25s，72℃25s，共40个循环；72℃2min。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，测序反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性15s，50℃退火20s，60℃延伸2min，25个循环。
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