UA121655C2

UA121655C2 - Спосіб лікування аденокарциноми легень

Info

Publication number: UA121655C2
Application number: UAA201611881A
Authority: UA
Inventors: Дена Т. Афтеб; Дэна Т. Афтэб; Пейвень Юй
Original assignee: Екселіксіс, Інк.; Экселиксис, Инк.
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2020-07-10
Also published as: EP3134084B1; EP3134084A1; PL3134084T3; KR102474701B1; EA201692150A1; AU2015249232A1; IL248408B; IL248408A0; MX2016013600A; US20170042880A1; CA2946416C; AU2015249232B2; JP2019189646A; DK3134084T3; ES2874875T3; HUE054557T2; TWI724988B; SG11201608657QA; AR100191A1; EA035223B1

Abstract

Цей винахід належить до лікування раку у пацієнта, зокрема у пацієнта з аденокарциномою легень і, більш конкретно, у пацієнта з недрібноклітинним раком легень, позитивним по злиттю SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1 або FIG-ROS1, за допомогою інгібітору MET, VEGFR2 і ROS1, який являє собою сполуку Формули І Формула I або її фармацевтично прийнятну сіль.

Description

СПОСІБ ЛІКУВАННЯ АДЕНОКАРЦИНОМИ ЛЕГЕНЬ

Перехресне посилання на споріднені заявки

І0О001) Ця заявка РСТ заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США з серійним

Мо 61/984599, яка подана 25 квітня 2014 року, повний зміст якої включено у цей документ за допомогою посилання.

Перелік послідовностей 0002) Ця заявка містить посилання в повному обсязі на перелік послідовностей у вигляді файлу під назвою "ЕХ14-0030-РС 2015 04 20 БЕОШЕМСЕ ГІ5ТІМО 5Т25.4х, створеного 27 квітня 2015 року о 12:54, розміром 26 кБ, і поданого в електронному вигляді разом з нею.

Галузь техніки

І0003| Цей винахід відноситься до виявлення, діагностики та лікування раку, зокрема, аденокарциноми легень, із застосуванням інгібітора рецепторних тирозинкіназ.

Рівень техніки (0004) Рак легень є основною причиною смертності внаслідок раку у всьому світі. Недавні розробки в області таргетної терапії призвели до зміни стандартного методу лікування недрібноклітинного раку легень (НДРЛ). Мок Т5, УМи МІ, Тпопоргазегі 5, Хапода СН, Спи ОТ, Зайо

М, з,ипрамегамопа Р, Нап В, Магоопо В, Іспіпозе У, Мівпімакі М, Опе У, Мапа 9у, СпежазКиїуопд

В, лапд Н, Оийієїй ЕЕГ, УМаїкіп5 СІ, Агтошг АА, РиКкиоКа М. Сеїйіпір ог сагборіаїйп-расійахеї іп риїтопагу адепосагсіпота. М Епа!Ї У Мей. 2009 бер 3; 361(10):947-57. Маєтопао М, Іпоце А,

Кобрауавнпї К, зЗидамага 5, Оігиті 5, Ігоре Н, Сетта А, Нагада М, Мозпігауа Н, Кіпознпіа І, Ешійа

У, ОКіпада 5, Нігапо Н, Мовпітоїі К, Нагада Т, Одига Т, Ападо М, Міуалама Н, ТапакКа Т, Заїйо У,

Надімага К, Моїгйа 5, МиКіжма Т; Мопн-Еаві дарап 5ішау Стоцмир. Сеїййіпір ог спетоїНегару їог поп- втаїІ-се! Ішпоа сапсег м/йй тшавєй ЕСтЕН. М Епді 9 Мей. дип 2010 24; 362(25):2380-8.

Тирозинкіназні інгібітори (ТКІ) рецепторів епідермального фактору росту (ЕСЕР), гефитиніб та ерлотиніб, а також ТКІ кінази анапластичної лімфоми (АЇК), кризотиніб, продемонстрували клінічну активність у пацієнтів з НДРЛ з мутаціями ЕСЕВ або перебудовою генів АЇ К. Кмак ЕЇ,

Вапао У), Сатідде ОК, Зпам АТ, Зоїотоп В, МакКкі КО, би 5Н, Ое?ибре ВУ), даппе РА, Совіа ОВ,

МагеПа-Сагсіа М, Кіт М/Н, Гупсй ТУ, Ріаіаз Р, БІШЬбз Н, Епдеїтап А, Зедниіві ІМ, Тап МУ, Сапані

І, Міпо-Кепидзоп М, М/єї СС, ЗНгтеєме 5М, Ваїаіїп МУ, ЗешШетап У, СНгівієпзеп 92, Наврег БА,

Міїпег К, Заїдіа В, 5Паріго СІ, Сіагк М, Іаїтайе А). Апаріавзіїс ЇмМтрпота Кіпазе іппірйіоп іп поп- зтаї! сеї Ішпуд сапсег. М Епаді У Мед. 2010 Осі 28; 363(18):1693-703. 5пам АТ, Сатідде, Епдеїтап

УА, Боїотоп ВУ, Куак ЕІ, Сіаж МУ, Заїдіа АВ, ЗПпарію, Вапу Му, Тап МУ, Туе Г, УМіпег КО, зіерпепзоп Р, МагеПйа-Сагсіа М, Вегдєїноп К, Іаїтатє А), Ои 5Н. Сіїпіса! асіїмпу ої стігоїпір іп адмапсей поп-5таї! сеїЇ їшпуд сапсег (НДРЛ) Нагброгіпд ВО51 депе геатапдетепі. / Сіїп Опсої. 2012 30 (доп.; реф. 7508). Нещодавно описано, що злиття гена КІР5В (родини кінезинів 58) та онкогена ВЕТ являє собою драйверну мутацію у 1-2 95 пацієнтів з НДРЛ і терапевтичну мішень.

Конпо Т, Іспікамжа Н, Тоюкі У, Мазида К, Нігатою М, Матто Т, ЗаКатоїо Н, Т5шіа К, Рига К,

Зпітада У, ІмаКауа В, Одімага Н, ОїКе Т, Епагі М, 5спейцег АУу, ОКауата Н, Нацдеп А, 5Каца У,

Снпіки 5, Матапака І, Агаї М, Маїапаре 5, 5екКіпе І, Одамжа 5, Нагтіз СС, Твцда Н, Мовніада Т,

МокКоїа у, 5пібайа Т. КІРЄ5В-НЕТ Гивіопв іп Їпд адепосагсіпота. Маї Меа. 2012 Реб 12; 18(3):375- 7. ТаКеиспі К, 5ода М, Тодавні У, 5и2икКі В, ЗакКаїа 5, Наїапо 5, АзаКа В, НатапакКа М, Міпотіуа

Н, Оєпага Н, Гіт Спої У, заюй У, ОКитига 5, МаКадама К, Мапо Н, Іспікамжа У. ВЕТ, ВО51 апа

АЇ К Тив5іопв іп Ішпуд сапсег. Маї Меа. 2012 Реб 12; 18(3):378-81. І Ірзоп 0, СареїПейі М, МеїІепзКу В,

Оно С, РаїКкег А, даго57 М, Ситап 9А, Ваіазибгатапіап 5, Вісот Т, Вгеппап КМУ, Оопапиє А,

Бомлпіпд ЗА, Егатріоп СМ, Сагсіа І, дийп Е, Міїсне!! КС, Мне Е, МУНйе У, міо 7, Регеїх Т,

Меспивнап Н, бБоиззап-сштанп І, Кіт .), Зазакі Н, Кіт НЕ, Рагк 51, Егсап О, Зпеепап СЕ, ВКо55 55, Стопіп МТ, Удаппе РА, 5берпепз5 РУ). Ідепійїсайоп ої пежм АЇК апа КЕТ депе Тиб5іоп5 їот соіогесіа! апа Ішпд сапсег ріорзієз. Маї Мед. 2012 Реб 12; 18(3):382-4. Таким чином, все більш важливою стає ідентифікація ключових драйверних генів в НДРЛ та розробка методів лікування кожного геномного набору пацієнтів.

Суть винаходу 0005) Вказаним винаходом, що відноситься до способу лікування аденокарциноми легень із застосуванням інгібітора активності тирозинкінази, зокрема, активності кінази ВО51, задовольняються вказані та інші потреби. Вказаний спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки або її фармацевтично прийнятної солі, що модулює кіназу ВОБ51 та/або химерний білок ВО51, пацієнту, який потребує в такому лікуванні. В одному з варіантів реалізації аденокарцинома легень являє собою недрібноклітинний рак легень (НДРЛ). Більш конкретно, аденокарцинома легень найчастіше являє собою позитивний по злиттю 5І СЗ4Аг-

КОБІ1 НДРЛ, позитивний до злиття СЮО74-КО51 НДРЛ, позитивний по злиттю ЕІБ-КОБІ1 НДРЛ 60 (наприклад, СЮО74-НОБ1, РІШ-НОБІ, РІС-НОБІ1(), РІС-КОБЗ1(5) і РІС-КОБ1(МІ)3) та НДРЛ, які несуть інші відомі химерні білою КО51. У людей кіназа КО51 кодується геном КОБ5І1 на 6 хромосомі (6422). 0006) В одному аспекті цей винахід відноситься до способу лікування НДРЛ у пацієнта, який потребує в такому лікуванні, що включає введення пацієнту терапевтично ефективної кількості сполуки або її фармацевтично прийнятної солі, яка одночасно модулює КО51 та/або химерний білок КО51.

І0007)| В одному варіанті реалізації вказаного та інших аспектів інгібітор кінази КО51 або інгібітор химерної кінази КО51 являє собою сполуку Формули І:

Н Н зх М М хх

Ка) 2 () о - ко о й і 4, ом

І

83-о ща

І або її фармацевтично прийнятну сіль, де:

В' являє собою галоген;

В2 являє собою галоген;

ВЗ являє собою (С:-Св)алкіл;

В" являє собою (Сі1-Св)алкіл; та

О являє собою СН або М. 0008) В іншому варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку Формули Їа

Н н зх М М ж не)» 2 о о У сна о щі / і, ол "та я нНзас-о М

Формула Іа або її фармацевтично прийнятну сіль, де:

А! являє собою галоген;

Вг являє собою галоген; та

О являє собою СН або М. 0009) В іншому варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1:

М М

С о о Фі

СНз о Е о | Зх - но М сполука 1

ЇО0О10О| або її фармацевтично прийнятну сіль. Сполука 1 відома як М-(4-16,7- біс(метилокси)хінолін-4-іл|оксиуфеніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксамід та під назвою кабозантиніб. 29 листопада 2012 року З-малатну сіль (тобто І -малатну сіль) М-(4-((6,7- диметоксихінолін-4-іл)уокси|феніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксаміду (також відому як кабозантиніб або СОМЕТКІОФ) було схвалено Управлінням по нагляду за якістю харчових продуктів і лікарських засобів США для лікування прогресуючого метастатичного медуллярного раку щитоподібної залози (РЩЗ). У грудні 2013 року Європейський Комітет з лікарських препаратів для людини (СНМР) виніс позитивне рішення за маркетинговою авторизаційною заявкою на реєстрацію (МАА), представленою в Європейське агентство лікарських засобів, або ЕМА, щодо пропонованого показання для використання СОМЕТНКІО, при прогресуючому, нерезектабельному, місцево-плоширеному або метастатичному РЩЗ3. В теперішній час кабозантиніб оцінюють в широкій програмі досліджень, зокрема у безперервних базових клінічних дослідженнях фази З при метастатичному нирково-клітинному раку (НКР) і поширеному гепатоцеллюлярному раку (ГЦР).

І00111| Сполука 1 являє собою ефективний інгібітор С-МЕТ, КЕТ і МЕСЕК2. Макез ЕМ, Снеп У,

Тап У), Матадисні К, Ні М, Ми Р, Оіап Е, Спи Е, Вепігієп Е, Сапсійа В, Оп У, Мои А, І аїга АС,

Епові 5, ее Ї, Гевзсп У, Спои МС, уоїу АН. Сарогапіїпір (ХІ 184), а помеї МЕТ апа мМЕеЕСЕН2 іппірйог, вітинапеоивіу зирргез5евз теїавзіавів, апдіодепевів, апа їштог дгоулЛи. Мо! Сапсег Тег. 2011 Оес; 10(12):2298-308; Вепігівп, Е., 2и20ом, М., Неаїс, М., (ірзоп, А., Зпі, М., Сбооп, Г., Ми, Р.,

Епаві, 5., 7Напа, МУ., Ниапо, 5., 7Нао, І., МузоївКаїа, М., Спи, Е., Вашівїа, В., СапсіПа, В., І атбр,

Р., Удоїу, А. та Макез, М. Іп міїто апа іп мімо асіїміу ої сарогапіїпір (ХІ 184), ап іппірног ої ВЕТ, МЕТ, апа МЕСЕНа, іп а тодеї ої теашіагу Іпугоїд сапсег. Тнугоїд, 2013 (23) 1569-1577. У доклінічних випробуваннях інгібування активності кінази, опосередковане сполукою 1, забезпечувало швидку і стійку регресію судинної системи пухлини, зниження інвазивності і метастазів пухлини, а також збільшення тривалості виживання. беппіпо В., Ізпідито-Сопита Т, МУєї М, Мауїог ВМ,

МУШіатвоп СМ, Внадулапаїп М, Табгиуп 5Р, Мои МУК, Спартап НА, СнНгізіепзєп да, Анаб ОТ,

Мебопаїа ОМ. (2012), "Зурргезвіоп ої Штог іплазіоп апа теїавзіавіз5 Бу сопситепі іппірйіоп ої с-

Меї апа МЕС відпаїйпу іп рапсгєаїйс пешгоепдосгіпе ТШштогв.", Сапсег Оівсомегу, 2(3):270-87 (публікація в електронному вигляді 02/24/2012). 0012 В іншому варіанті реалізації, сполуку Формули І, Іа, сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятну добавку, розчинник або допоміжну речовину.

ЇО013| В одному з варіантів реалізації сполуку Формули І, Їїа або сполуку 1, або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятну добавку, розчинник або допоміжну речовину, для інгібування онкогенних химерних кіназ, що зачіпають тирозинкіназу рецептора-сироти ВОБ51, що

Зо утворюється в результаті хромосомних перебудов, які призводять до конститутивної активації активності кінази ВО51. Вказані химерні кінази ВО51 являють собою мішень для інгібування із застосуванням Формули сполуки І, Іа або сполуки 1, або її фармацевтично прийнятною солі.

Вказані сполуки можуть бути введені у вигляді фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятну добавку, розчинник або допоміжну речовину для лікування аденокарциноми легень, наприклад, недрібноклітинної карциноми легень, що несе одну або більше онкогенних химерних кіназ ВО51. 00141 В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб інгібування активності кінази

ВО51 та/або химерної кінази ВОБ1 в одній або більше клітинних лініях недрібноклітинного раку легень або НДРЛ, який включає введення терапевтично ефективного кількості фармацевтичної композиції, що містить сполуку Формули | або малатну сіль сполуки Формули І, або іншу фармацевтично прийнятну сіль сполуки Формули І, у вказані клітинні лінії недрібноклітинного раку легень або НДРЛ, які несуть кіназу ВОБ51 та/або химерний поліпептид КОБ1. 0015) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб виявлення, діагностики та лікування позитивного по злиттю КО51 НДРЛ, наприклад, позитивного по злиттю 5ІСЗ4А2-

КОБ51 НДРЛ, та інших відомих позитивних по злиттю КО51 НДРЛ, включаючи химерні білки вО51 СО74-8051, РІШС-НОБІ1, РІШ-НОБ51(І, РІС-КОБ1(5) і РІС-КОБ1(МІ), а також інші химерні білки КОБТ, які кодуються у людей геном КО5БІ1 на 6 хромосомі (див.: Вегдеїйоп К, Зпам АТ, Ои

ЗН, Каїауата Р, І ому СМ, Меропаїд МТ, Мавзвіоп РР, 5іжак-Тарр С, Сопла!їє2: А, Рапа В, Маїк

Еу, Вацеп ОМ, Спеп Н, УмМіпег КО, Кмжак ЕЇ, Сіаїк УМ, Сагропе ОР, ді Н, Епдеїтап ЗА, Міпо-

Кепидзоп М, Рао М, Іаїає А. ВОБ51 геатапдетепів деїпе а ипідне тоїесшіаг сіазв ої ІШпд сапсеге. У Сп ОпсоЇ. Маг 2012 10; 30(8):863-70), який включає введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить сполуку Формули І або малатну сіль сполуки Формули І, або іншу фармацевтично прийнятну сіль сполуки Формули І, пацієнту, який потребує в такому лікуванні. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1 або малатну сіль сполуки 1, зокрема, З-малатну сіль сполуки 1. 0016) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб лікування аденокарциноми легень, яка являє собою позитивний по злиттю 5І С34А2-КО51 недрібноклітинний рак легень, у пацієнта, який потребує в такому лікуванні, що включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки 1:

Нн Нн

М М

С о о Фі

СН Ге) Е - нзСс-о М

Сполука 1 або її фармацевтично прийнятну сіль.

І0017)| В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб лікування аденокарциноми легень, яка являє собою позитивний по злиттюСО74-КО51 недрібноклітинний рак легень, у пацієнта, який потребує в такому лікуванні, що включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки 1:

Нн Нн

М М с

СН в) Е - н.Сс-о М

І0018) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб лікування аденокарциноми легень, яка являє собою позитивний по злиттю РІШ-КО51 недрібноклітинний рак легень, у пацієнта, який потребує в такому лікуванні, що включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки 1:

Нн Нн

М М

С о о ІФ

СН Ге) Е - но М

Ї0019| В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб інгібування активності химерної кінази КО51 у клітині НДРЛ, який включає приведення в контакт вказаної клітини з ефективною кількістю сполуки Формули І:

М М з з о 0 | "ов в о соч їй

І в) о 0-4

Со д т3-о М

Ї або її фармацевтично прийнятну сіль, де:

В' являє собою галоген;

В2 являє собою галоген;

ВЗ являє собою (С:-Св)алкіл;

В" являє собою (Сі1-Св)алкіл; та

О являє собою СН або М.

Стислий опис графічних матеріалів

І00201| На фіг. 1 представлена графічна ілюстрація химерних білків КОБІ, які, як відомо, існують у зразках пухлини недрібноклітинної карциноми легень (НДРЛ). Перебудова КОБ51 при

НДРЛ, гліобластомі та холангіокарциномі. СО74(()/5), кластер диференціювання 74, довгі/короткі ізоформи; ЕЕ, езрин; РІС, злитий у гліобластомі; І КІЗ, багаті лейцином повтори та імуноглобуліноподібні домени 3; КО51 ТК, домен тирозинкінази КО51 з партнерами по злиттю; 5004, синдекан-4; 5І СЗ3З4А2(1)/(5), родина транспортеру розчинених речовин 34 (фосфат натрію), 2 член, довгі/короткі ізоформи; 5004, синдекан-4; ТРМ3З, тропоміозин 3.

Номери екзонів ЕЗ32, ЕЗ34, ЕЗ5 або ЕЗб вказують положення розриву КОБ51. Червоний прямокутник означає трансмембранний домен, збережений у КО51.

І00211| На фіг. 2 показано інгібування фосфорилювання злиття ЗІ С34А2-КОБ1 іп мійго в клітинах НСС-78 НДРЛ, в які вводили одноразові зростаючі дози сполуки 1 або 3-(12)-1-(2,6- дихлор-3-фторфеніл)етокси|-5-(1-піперидин-4-ілпіразол-4-іл)піридин-2-аміну (кризотиніб;

ХАЇ КОКІФ).

І0022| На фіг. З представлена амінокислотна послідовність ілюстративного білка КОБ51 людини, вказана в цьому документі як ЗЕО ІЮО МО: 1.

І0023)| На фіг. 4 представлена ілюстративна амінокислотна послідовність домену кінази

КО51 людини, вказана в цьому документі як ХЕО ІЮО МО: 2.

Детальний опис винаходу

Скорочення та визначення (0024) Наступні скорочення та терміни мають у цьому описі вказані значення. до |ЇДублег 11111111 ддо 00 |Дублетдублеїів////СсСсСС мо 77771111 фМультиплету//////////////77777111111111111111111111111111сссСсС мкМо 11110 |Мікромольсі)або мікромолярний.д//-////:/:СсС1С

ММ 11111110 фМілімолярний.їд///////77777777711111111111111111сСсСсС

Ін |Нормальнийабонормальність./:.7/:6/;)////:////:/:/С:(З С

Детальний опис винаходу

Скорочення та визначення (0024) Наступні скорочення та терміни мають у цьому описі вказані значення.

НМ 11111111 |Наномолярний.у///7/7/://СС:(«х/;їСССССССсссссссссссссссССсСсСС

ЯМР о |Спектроскопіяядерногомагнітногорезонансу.7//:///:////С:(///://СУ/ С ко |Квартвет///////////71111111111111111111111111111111 0025) Символ «-» означає одинарний зв'язок, «-» означає подвійний зв'язок. (0026) При зображенні або описанні хімічних структур, якщо однозначно не вказано інше, всі атоми вуглецю вважаються такими, що мають водневі замісники для відповідності валентності, яка дорівнює чотирьом. Наприклад, у структурі в лівій частині схематичного зображення, представленого нижче, присутні дев'ять атомів водню. Ці дев'ять атомів водню зображені в правій структурі. Іноді певний атом у структурі описаний текстовою формулою як той, що має в якості замісників атом або атоми водню (явно вказаний водень), наприклад, -СН2СНа-.

Фахівцям у цій області техніки зрозуміло, що вищевказаний описовий прийом загальноприйнятий в області хімії для забезпечення короткого й простого опису складних в іншому випадку структур. нннНн в с й Вг

Нн Нн

І0027| Якщо група "КК" зображена в кільцевій системі як "плаваюча", як, наприклад, у формулі: зи - й то, якщо не вказано інше, замісник "ЕК" може займати будь-який атом кільцевої системи, маючи на увазі заміщення зображеного, уявного або явно визначеного водню у одного з кільцевих атомів, за умови утворення стійкої структури.

І0028| Якщо група "К" зображена плаваючою в конденсованій кільцевій системі, як, наприклад, в формулах: нН

А. с лк В М «1 ве х

Мах Го в--7

Н або ;, або то, якщо не вказано інше, замісник "КК" може займати будь-який атом конденсованої кільцевої системи, маючи на увазі заміщення зображеного атома водню (наприклад, -МН - в наведеній вище формулі), неявного атома водню (наприклад, як у поданій вище формулі, де атоми водню не показані, але маються на увазі присутніми), або явно певного атома водню (наприклад, якщо в наведеній вище формулі "2" дорівнює -СН-) у одного з кільцевих атомів, за умови утворення стійкої структури. У наведеному прикладі група "К" може перебувати в 5- членному або 6б-членному кільці конденсованої кільцевої системи. Якщо група "К" зображена як існуюча в кільцевій системі, що містить насичені атоми вуглецю, як, наприклад, у формулі: причому в цьому прикладі "у" може бути рівним більшим за один, маючи на увазі, що кожен з них заміщає зображений, уявний або явно певний водень в кільці; то, якщо не вказано інше, за умови стійкості структури, що утворюється, два "К" можуть перебувати в одного атомі вуглецю.

Простим прикладом є випадок, коли К являє собою метилову групу; у вуглецю зображеного кільця ("кільцевого" вуглецю) може існувати гемінальний диметил. В іншому прикладі, два К у одного атома вуглецю, включаючи цей атом вуглецю, можуть утворювати кільце, створюючи, таким чином, спіроциклічну кільцеву ("спіроциклільну" групу) структуру, з кільцем, зображеним, наприклад, у формулі:

НС Й ( !

І0029| "Галоген" або "гало" відноситься до фтору, хлору, брому або йоду. 0030) У цьому контексті білок або поліпептид "КО51" включає білок кінази КО51 ссавця, наприклад, КО5ЗІ1 людини (який кодується геном КОБЗ1), який являє собою рецепторну тирозинкіназу довжиною 2347 амінокислот, схильну до аберантної експресії, що приводить до раку. Опис повнорозмірної кінази КО51 людини (з амінокислотною послідовністю білка КОБ51 людини) представлено в ОпіРгої з номером доступу РО8922. Крім того, існує безліч відомих природних варіантів КО5І1 (див., наприклад, Сгеептап еї аї., Маїшге 446: 153-158, 2007). Відомі нуклеотидні та амінокислотні послідовності повнорозмірної КО5І мишей (див., наприклад,

ОпіРгої з номером доступу О780Х7). За допомогою звичайного експериментування досвідчений біолог може легко визначити відповідні послідовності в гомологах КОБЗІ1 ссавців, що не є людськими. 0031) КОБ51 "дикого типу" означає повнорозмірну кіназу КО51 (тобто для людської КОБ5І1 поліпептид довжиною 2347 амінокислот (5ЕО ІЮ МО:1) або поліпептид довжиною 2320 амінокислот (зріла послідовність) після видалення послідовності сигнального пептиду) у здорової (або нормальною) тканини (наприклад, неракової тканини) нормального індивіда (тобто нормального індивіда, який не страждає від раку). Кіназа КОБ51 (повнорозмірна або усічена) не експресується в нормальній легеневій тканині людини. Однак за допомогою способів, описаних нижче, автори цього винаходу несподівано виявили специфічне інгібування кінази КО5І1 у клітинах раку легень із застосуванням сполук, описаних у цьому документі. Така експресія в атиповій клітині (у цьому випадку раковій клітині), якщо в типовій клітині не спостерігають експресії (наприклад, у нераковій клітині легень), є аберантною. 0032) Кіназа КО51, яка аберантно експресується у формі злиття з іншим білком, наприклад, 5ІС34А2, СО74 або РІС, описана в гліобластомі (див. СНагеві єї аї., Спагеві єї аїЇ., Сепев5

Спготозотев5 Сапсег 37: 58-71, 2003; Спагеві єї аї!., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 100: 916-921, 2003), раку печінки (див. наприклад, публікація РСТ Мо УМУО2010/093928) та раку жовчного протоку (див. Си єї аіІ., Р О5 опе 2011 дап 6;6(1):615640. дої: 10.1371/ЛошгпаІ.ропе.0015640), а также в аденокарциномі НДРЛ (див. Кипів Ю. ЮОамієз 6вї аї. Ідепійуіпд апа Тагоєїїпа ВО51 Сепе / Ривіопв іп Моп-5таї! Сеї| Гипд Сапсег, Сіїп Сапсег Вевз. 2012 Зеріетбег 1; 18(17): 4570-4579). 0033) У цьому контексті термін "злиття КО51" відноситься до частини поліпептиду КО5І1, що містить кіназний домен білка КО51 (або полінуклеотид, який кодує його), конденсованої з цілим або частиною іншого поліпептиду (або полінуклеотиду, який кодує його), де назва другого поліпептиду або полінуклеотиду вказана в назві злиття. (Термін "злиття" означає просто цілий або частину поліпептиду або полінуклеотиду з першого гена, конденсованого з цілим або частиною поліпептиду або полінуклеотиду з другого гена). Наприклад, злиття 5І С34А2-НО51 являє собою злиття між частиною поліпептиду 5І С34А2 (або полінуклеотиду, який кодує його) і частиною поліпептиду КО5І1 (або полінуклеотиду, який кодує його), що містить кіназний домен

КО51. Злиття КО51 часто виникає внаслідок хромосомної транслокації або інверсії. Існує безліч відомих злиттів КО51, які являють собою злиття КОБ51 згідно з цим винаходом, і включають, без обмежень, химерні білки 5 С34А2-КО51, члени яких включають 5ІСЗ34А2-

ВО51(М5), 51 С34А2-0О51(5), 5ІСЗ4А2-КО51(1) (див. публікацію патента США Мо 20100143918), СО74-КОБ1 (див. публікацію патента США Мо 20100221737) та химерні білки РІС-

КОЗ5І1, члени яких включають РІШ-НО51(5), РІС-КОБ1(І) їі РІС-КОЗІ1(ХІ) (див. публікацію РСТ

Мо М/О2010/093928), опис яких включено в цей документ у повному обсязі. Позначення (І), (5), (М5), (МУ) (Х5) або (ХІ) після поліпептиду ВО51 або злиття ВОБ51 відноситься, у цілому, до довгого, короткого, дуже короткого, дуже довгого, надкороткого та наддовгого поліпептиду або полінуклеотиду БОБ, відповідно. 0034) Всі відомі химерні білюи КО5І1 містять повний домен кінази повнорозмірної РО51.

Таким чином, у цьому контексті "поліпептид з активністю кінази КО51" (або "поліпептид, який має активність кінази КО51") означає білок (або поліпептид), який містить повний домен кінази або повнорозмірний білок КО51 та, отже, зберігає активність кінази КО51. Необмежуючі приклади білків з активністю кінази КО51 включають, без обмежень, повнорозмірний білок

КО5І1, химерні білки ЗІ СЗ34А2-КО51, члени яких включають 5І С34А2-НО51(МУ5), 5І СЗ4Аг-

ВО51(5), 5І СЗ4А2-КОЗ1І) (див. публікацію патента США Мо 20100143918), СО74-КОЗБІ (див. публікацію патента США Мо 20100221737) і химерні білки РІ-КО5І1, члени яких включають Б1Іс-

ВО51(5), РІШ-КОБ1(І) і РІС-КОЗІ1(ХІ) (див. публікацію РСТ Мо УУО2010/093928), і будь-які усічені або мутантні форми кінази КО51, які зберігають домен кінази повнорозмірного білка кінази КОБ51. Ілюстративний домен кінази КО51 представлений в ЗЕО ІЮО МО: 2, "поліпептид з активністю кінази БО51" являє собою поліпептид, амінокислотна послідовність якого містить

ЗЕО ІЮО МО: 2, або її частину з активністю кінази.

ІЇ0035| В цьому контексті "поліпептид" (або "амінокислотна послідовність" або "білок") відноситься до полімеру, утвореному в результаті зв'язування в певному порядку, переважно, а- амінокислот, ЮО-, І -амінокислот та їх комбінацій. Зв'язок між одним амінокислотним залишком і наступним залишком називають амідним зв'язком або пептидним зв'язком. Необмежуючі приклади поліпептидів включають послідовності олігопептидів, пептидів, поліпептидів або білків та їх фрагментів або частин, а також природні або синтетичні молекули. Поліпептиди включають також дериватизовані молекули, такі як глікопротеїни та ліпопротеїни, а також низькомолекулярні поліпептиди. "Амінокислотна послідовність" та подібні терміни, такі як "поліпептид" або "білок" не призначені для обмеження вказаної амінокислотної послідовності до повної, нативної амінокислотної послідовності, зв'язаної із згаданої молекулою білка. 0036) У цій області техніки розуміють, що деякі амінокислотні послідовності поліпептиду згідно з цим винаходом можуть бути змінені без істотної зміни структури або функції мутантного білка. Якщо такі відмінності в послідовності є передбаченими, то слід пам'ятати, що існують критичні області білка, які визначають активність (наприклад, кіназний домен КО51). В цілому, можуть бути замінені залишки, які утворюють третинну структуру, за умови використання залишків, які виконують аналогічну функцію. В інших випадках тип залишку може бути абсолютно неважливий, якщо зміна відбувається в некритичній області білка.

І0037| Так, поліпептид з активністю КОБ51 згідно 3 цим винаходом додатково включає варіанти повнорозмірного білка КО5І1 або різні химерні поліпептиди КОБ1, описані в цьому документі, які демонструють істотну активність кінази КО51. Деякі необмежуючі консервативні заміщення включають заміну одного на інше, серед аліфатичних амінокислот Аа, Маї, Геи та Пе; заміну гідроксильних залишків 5ег і ТАг; заміну кислотних залишків А5р і Сім; заміну амідних

Зо залишків Азп Її СіІп; заміну основних залишків Гуз і Аго; і заміну ароматичних залишків Ре і Туг.

Додаткові приклади консервативних замін амінокислот, які відомі фахівцям у цій області техніки, являють собою: ароматичні: фенілаланін, триптофан, тирозин (наприклад, залишок триптофану замінений фенілаланіном); гідрофобні: лейцин, валін, ізолейцин; полярні: глютамін аспарагін; основні: аргінін, лізин гістидин; кислотні: аспарагінова кислота глютамінова кислота; невеликі: аланін, треонін, серин, метіонін, гліцин. Як докладно описано вище, додаткове керівництво, згідно з яким амінокислотні заміни ймовірно будуть фенотипічно мовчазними (тобто малоймовірно будуть чинити істотний несприятливий ефект на функцію), представлено в публікації Вом/іе еї аї., 5сіепсе 247, зирга. (0038) "5 С34А2" може відноситися до натрійзалежного білка-переносника фосфату 2В, який кодується білком гена людини 5ІС34А2 або геном 5І С34А2. Людський білок 5І С34А2 (ізофрома А, яка має номер доступу МСВІ МР 001171469) являє собою білок довжиною 689 амінокислот. 5І СЗ34А2 описано далі в цьому документі. (0039) СО74 також називають гамма-ланцюгом антигену гістосумісності НГ А класу ІІ, також відомий як інваріантний ланцюг, асоційований з антигенами НГА-ОК, або СО74 (кластер диференціювання 74), і являє собою білок, який у людей кодується геном СО74. Ілюстративний людський білок СО74 має номер доступу МСВІ МР 001020329 і номер доступу мРНК

ММ 001025158. СО74 має 160 амінокислот і кодується геном СО74, розташованим в 5 хромосомі (5432). СЮ74 має 9 екзонів. СЮО74 описано далі в цьому документі. 0040) Білок РІС (злитий у гліобластомі) називають також "асоційованим з комплексом

Гольджи РО, який містить суперспіральний мотив" або білком "СОРС", і він кодується геном, розташованим в хромосомі 6 в положенні бд21. Вказаний білок у людини має 462 амінокислоти.

РІС має З ізоформи, що утворюються в результаті альтернативного сплайсингу. Ілюстративний людський білок РІС, згаданий у цьому винаході, має ідентифікатор ОпіРгоїкВ 09НО26-1. 00411) "Химерний білок або ген 5І С34А2-КОБ51" відноситься до соматичних генних злиттів партнерів ЗІ СЗ34А?2 і КО51. У деяких варіантах реалізації химерний білок 5І С34А2-НОБІ1 містить М-кінцевий домен партнера по злиттю, такого як 5І СЗ34А2, і С-кінцевий кіназний домен білка КО51. М-кінцевий домен партнера по злиттю може бути розташований на М-кінці химерного білка, а С-кінцевий кіназний домен білка КО51 може бути розташований на С-кінці химерного білка. Партнер по злиттю може являти собою М-кінцевий домен білка 5І СЗ34А2, 60 розташований на М-кінці химерного білка. В такому випадку химерний білок може бути представлений як білок 5 С34А2-КОБІ1, який містить М-кінцевий домен білка 5ІС34А2 на М- кінці та С-кінцевий кіназний домен білка КО51 на С-кінці В іншому варіанті реалізації представлений химерний ген, що кодує химерний білок, причому ген, що кодує М-кінцевий домен партнера по злиттю, розташований на 5'-кінці, а ген, що кодує С-кінцевий кіназний домен білка КО51, розташований на 3'-кінці. У деяких варіантах реалізації частини білка 5І С34А2 злиті в рамці з частинами білка КО51, що містять функціональний кіназний домен, в результаті аберантної хромосомної транслокації що призводить до хромосомної перебудови КО5І1 з 5І С34А2. У деяких варіантах реалізації химерний білок 5 С34А2-КО51 може містити злиття 5І С34А2 екзон 4-КО5ЗІ1 екзон 32. У деяких варіантах реалізації химерний білок ЗІ С34А2-НОБІ може містити злиття 5І С34А2 екзон 4-КО51 екзон 34. Химерний білок або ген 5І С34А2-НО51, має функціональний кіназний домен КО5БІ, у відповідності з цим винаходом, може містити інші точкові розриви, що зачіпають двох партнерів по транслокації 5ІС34А2 і КОБ51. Ілюстративні химерні білки БІ С34А2-КО51 представлені в каталозі соматичних мутацій при раку СОБМІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/рго|есів/со5Ітіс, повний зміст якої включений у цей документ за допомогою посилання.

І0042| "Химерний білок або ген СО74-КО51" відноситься до соматичних генних злиттів партнерів СО74 і КО51. Ілюстративні химерні біли СО74-КО51 представлені в каталозі соматичних мутацій при раку СОБМІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/рго|есів/со5тіс, повний зміст якої включене в цей документ за допомогою посилання.

І0043| "Химерний білок або ген РІБ-КО51" відноситься до соматичних генних злиттів партнерів РІС і КО51. У деяких варіантах реалізації внутрішньохромосомна гомозиготна делеція 240 тис. основ в 6 хромосомі людини, у положенні бд21, відповідає за утворення локусу

РІ-КОБ51. У деяких варіантах реалізації транскрипт РІБ-КО51 кодується 7 екзонами РІС і 9 екзонами, отриманими з КО51. У деяких варіантах реалізації ген РІБ-КОЗІ кодує білок внутрішьорамочного злиття з конститутивно активним і функціональним кіназним доменом

КО51. Ілюстративні химерні білки РІС-КОБ5І1 представлені в каталозі соматичних мутацій при раку СОБМІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/рго|есів/со5тіс, повний зміст якої включене в цей документ за допомогою посилання. (0044) "Пацієнт", для цілей цього винаходу, включає людей і інших тварин, зокрема ссавців, та інші організми. Отже, представлені способи застосовні як для лікування людей, так і для ветеринарних застосувань. В іншому варіанті реалізації пацієнт являє собою ссавця, а в іншому варіанті реалізації пацієнт являє собою людину.

І0045| "Фармацевтично прийнятна сіль" сполуки означає сіль, яка є фармацевтично прийнятною і яка має необхідну фармакологічну активність вихідної сполуки. Розуміється, що фармацевтично прийнятні солі є нетоксичними. Додаткова інформація про відповідні фармацевтично прийнятні солі представлена в публікації Кетіпдіоп, Рпагтасешіса! 5сіепсев, 17й риб., Маск Рибіїзєпіпд Сотрапу, Еавзіоп, Реппзуїмапіа, 1985, зміст якої включено в цей документ за допомогою посилання, або в публікації 5. М. Вегде, еї аї., "Рпаптасешііса! айв," у.

Рпагт. 5сі., 1977; 66:1-19, і зміст обох публікацій включено в цей документ за допомогою посилання.

І0046| Приклади фармацевтично прийнятних солей приєднання кислот включають солі, утворені з неорганічними кислотами, такими як кислота хлористоводнева, бромистоводородна кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. п.; а також з органічними кислотами, такими як оцтова кислота, трифтороцтова кислота пропіонова кислота, гексанова кислота, циклопентанпропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, молочна кислота, щавлева кислота, малеїнова кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, фумарова кислота, винна кислота, яблучна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, 3-(4-гідроксибензоїл)бензойна кислота, мигдальна кислота, метансульфонова кислота, етансульфонова кислота, 1,2-етандисульфонова кислота, 2-гідроксиетансульфонова кислота, бензолсульфонова кислота, 4-хлоробензолсульфонова кислота, 2- нафталінсульфонова кислота, 4-толуолсульфонова кислота, камфорсульфонова кислота, глюкогептонова кислота, 4,4-метиленбіс-(З-гідрокси-2-єн-1-карбонова кислота), 3- фенілпропіонова кислота, триметилоцтова кислота, тре-бутилоцтова кислота, лаурилсірчана кислота, глюконова кислота, глутамінова кислота, гідроксинафтойна кислота, саліцилова кислота, стеаринова кислота, муконова кислота, п--толуолсульфонова кислота та саліцилова кислота, тощо

І0047| "Проліки" відноситься до сполук, які перетворюються (зазвичай швидко) іп мімо з бо утворенням вихідної сполуки представлених вище формул, наприклад, за допомогою гідролізу в крові. Загальні приклади включають, але не обмежуються ними, складноефірні та амідні форми сполуки, що має активну форму, яка містить групу карбонової кислоти. Приклади фармацевтично прийнятних складних ефірів сполук цього винаходу включають, але не обмежуються ними, алкілові ефіри (наприклад, що містять від близько одного до шести атомів вуглецю), де алкільна група має пряму або розгалужену будова. Прийнятні естери включають також циклоалкільні естери та арилалкільні естери, такі як, але не обмежуючись ним, бензил.

Приклади фармацевтично прийнятних амідів сполук цього винаходу включають, але не обмежуються ними, первинні аміди та вторинні і третинні алкільні аміди (наприклад, що містять від близько одного до шести атомів вуглецю). Аміди та естери сполук цього винаходу можуть бути отримані за стандартними способами. Повний огляд проліків представлений у публікації Т.

Нідисні и М. ЄгейЇа, "Рго-дпав аз Момеї! ОевїЇїмегу Зувієтв," МоЇште 14 А.б.5. Бутрозійт 5егієв, та у Віогемегвіріє Саптієтз іп Огид Оевідп, ейі. Едмжаг В. Воспе, Атегісап Авзосіайоп апа

Рпаптасешіса! Регдатоп Ргезз, 1987, які включені в цей документ за допомогою посилання для усіх цілей. (0048| "КО51" або "білок КО51" являє собою трансмембранну рецепторну тирозинкіназу і додатково описано в цьому документі. (0049) "Терапевтично ефективна кількість" означає кількість сполуки згідно з цим винаходом, яка при введенні пацієнту полегшує симптом захворювання. Терапевтично ефективна кількість включає кількість сполуки, що використовується окремо або в комбінації з іншими активними інгредієнтами, яка є ефективною для модулювання с-Меї і/або МЕСЕК2, або ефективною для лікування або попередження раку. Кількість сполуки у відповідності 3 цим винаходом, яка становить "терапевтично ефективну кількість", змінюється залежно від сполуки, хворобливого стану та його тяжкості, віку пацієнта, що підлягає лікуванню, і т.п. Терапевтично ефективна кількість може бути визначена фахівцем у цій області техніки, із застосуванням його знань і цього опису. 00501 "Лікувати" або "лікування" захворювання, розладу або синдрому в цьому контексті включає (ї) попередження виникнення захворювання, розладу або синдрому у людини, тобто запобігання розвитку клінічних симптомів захворювання, розладу або синдрому у тварини, який може бути підданий чи схильний до захворювання, розладу або синдрому, але ще не відчуває

Зо чи не проявляє симптомів захворювання, розладу або синдрому; (ії) реверсування або уповільнення захворювання, розладу або синдрому, тобто зупинку його розвитку; і (іїї) полегшення захворювання, розладу або синдрому, тобто ініціацію регресії захворювання, розладу або синдрому. Як відомо у цій області техніки, може бути необхідна поправка на системну доставку замість локалізованої доставки, вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать, харчування, час введення, взаємодію ліків і тяжкість стану, і вона може бути встановлена звичайним експериментуванням.

І0051| "Вихід" для кожної реакції, описані в цьому документі, виражений у відсотках від теоретичного виходу.

Варіанти реалізації винаходу 00521 В одному з варіантів реалізації сполука Формули І являє собою сполуку Формули Іа:

Н Н с М М хх

ГО хе)

СУ оо 5 7 сна о 7

І в) о 0-4

Со 4 н-о М

В' являє собою галоген;

В: являє собою галоген; та

О являє собою СН або М. 0053) В іншому варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1:

М М

С о о Фі

СН Ге) Е о | с - нзСс-о М

Сполука 1 або його фармацевтично прийнятну сіль. Як вказано раніше, сполука 1 згадана в цьому документі як М-(4-16,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|оксихфеніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1- дикарбоксамід. УМ/О 2005/030140, включеному в цей документ за допомогою посилання в повному обсязі, описана сполука 1 і описаний спосіб її одержання (МУО 2005/030140, приклад 12, 37, 38 і 48), а також описана терапевтична активність вказаної сполуки для інгібування, регулювання та/або модулювання передачі сигналів кіназ (ММО 2005/030140, Аналізи, таблиця 4, рядок 289). Приклад 48 представлений в параграфі (0353) УМО 2005/030140.

ІЇ0054| В інших варіантах реалізації сполуку Формули !, Іа або сполуку 1, або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, причому фармацевтична композиція додатково містить фармацевтично прийнятний носій, допоміжну речовину або розріджувач. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1.

І0055| Сполука Формули І, Формули Іа і сполука І, описані в цьому документі, включають вказані сполуки, а також їх окремі ізомери і суміші. В кожному випадку сполука Формули включає фармацевтично прийнятні солі, гідрати і/або сольвати вказаних сполук і будь-які окремі ізомери або суміш ізомерів.

І0О56) В інших варіантах реалізації сполука Формули І, Іа або сполука 1 може являти собою (І )-малатну сіль. Малатна сіль сполуки Формули І і сполуки 1 описана в РСТ/О52010/021194 та

ЗМ 61/325095, повний зміст яких включено в цей документ за допомогою посилання.

І0057| В інших варіантах реалізації сполука Формули І являє собою (0)-малатну сіль, яка згадана також як К-малатна сіль. (0058) В інших варіантах реалізації сполука Формули Іа являє собою малатну сіль. 0059) В інших варіантах реалізації сполука Формули Іа являє собою (І)-малатну сіль, яка згадана також як 5-малатна сіль.

І0060)| В інших варіантах реалізації сполука 1 являє собою (0)-малатну сіль, яка згадана також як 5-малатна сіль.

І00О61| В інших варіантах реалізації сполука 1 являє собою малатну сіль.

Зо 0062) В інших варіантах реалізації сполука 1 являє собою (І)-малатну сіль, яка згадана також як 5-малатна сіль. 0063) В іншому варіанті реалізації малатна сіль представлена в кристалічній формі М-1 або у формі М-2 (І )-малатної солі та/або (0)-малатної солі сполуки 1, як описано в заявці на патент

США з серійним Мо 61/325095. Див. УМО 2008/083319, повний зміст якої включено в цей документ за допомогою посилання, де описані властивості кристалічних енантіомерів, включаючи кристалічні форми М-1 і/або М-2 малатної солі сполуки 1. Способи отримання і опису таких форм докладно описані в РСТ/О510/021194, повний зміст якої включено в цей документ за допомогою посилання. (0064) В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу реверсування або інгібування НДРЛ, що включає введення пацієнту, який потребує в такому лікуванні, терапевтично ефективної кількості сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі в будь-якому з варіантів реалізації, описаних у цьому документі. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль. 0065) В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу реверсування або інгібування позитивного по злиттю 5І С34А2-КО51 НДРЛ, що включає введення пацієнту, який потребує в такому лікуванні, терапевтично ефективної кількості сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі в будь-якому з варіантів реалізації описаних у цьому документі. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль. 0066) В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу реверсування або інгібування позитивного по злиттю СО74-КО51 НДРЛ, що включає введення пацієнту, який потребує в такому лікуванні, терапевтично ефективної кількості сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі в будь-якому з варіантів реалізації описаних у цьому документі. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули | являє собою сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль.

І0067| В іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу реверсування або інгібування позитивного по злиттю РІШ-КО51 НДРЛ, що включає введення пацієнту, який потребує в такому лікуванні, терапевтично ефективної кількості сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі в будь-якому з варіантів реалізації описаних у цьому документі. У конкретному варіанті реалізації сполука Формули І являє собою сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль. 0068) В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять до, одночасно або після одного або більше з інших способів лікування. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після одного або більше зі способів лікування. "Лікування" означає будь-який з варіантів лікування, доступних для досвідченого фахівця, включаючи хірургічне втручання, хіміотерапевтичні агенти, гормональні терапії, антитіла, імунотерапії, терапію з радіоактивним йодом та опромінення.

Зокрема, "лікування" означає інший хіміотерапевтичний агент або антитіло. 0069) Так, в іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном.

І0070| В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином доцетакселем. 0071) В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування антитілом НЕК-2. В іншому варіанті реалізації антитіло НЕК-2 являє собою трастузумаб. 00721 В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем.

І0073| В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І, Їїа або сполуку 1, або його фармацевтично прийнятну сіль вводять перорально один раз на добу у вигляді таблетки або капсули. У цих та інших варіантах реалізації сполука Формули | або її фармацевтично

Зо прийнятна сіль являє собою сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль. 0074) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки. 0075) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить до 100 мг сполуки 1. (0076) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 100 мг сполуки 1.

І0077| В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 95 мг сполуки 1. 0078) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 90 мг сполуки 1. 0079) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 85 мг сполуки 1. (0080) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 80 мг сполуки 1.

І0081) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 75 мг сполуки 1. (0082) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 70 мг сполуки 1. 0083) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 65 мг сполуки 1. (0084) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 60 мг сполуки 1. (0085) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 55 мг сполуки 1. (0086) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 50 мг сполуки 1. (0087) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 45 мг сполуки 1. бо 0088) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 40 мг сполуки 1. 0089) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 35 мг сполуки 1. 00901 В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 30 мг сполуки 1.

І0091) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 25 мг сполуки 1. 0092) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 20 мг сполуки 1.

І0093| В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 15 мг сполуки 1. (0094) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 10 мг сполуки 1. 0095) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально один раз на добу у формі вільної основи або її малатної солі у вигляді капсули або таблетки, що містить 5 мг сполуки 1. (0096) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять у формі вільної основи або малатноїї солі перорально один раз на добу у вигляді таблетки, як показано в нижченаведеній таблиці.

І0097)| В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально у формі вільної основи або малатної солі один раз на добу у вигляді таблетки, як показано в нижченаведеній таблиці. (Кроскармелозанатрю. у: Ї1111111601сСсСС (0098) В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять перорально у формі вільної основи або малатної солі один раз на добу у вигляді таблетки, як показано в нижченаведеній таблиці.

Інгредієнт доза) 0099) Будь-які склади таблеток, представлені вище, можуть бути підібрані у відповідності з необхідною дозою сполуки 1 або її фармацевтично прийнятної солі. Таким чином, кількість кожного з інгредієнтів складу можна пропорційно регулювати для отримання таблетованого складу, що містить різні кількості сполуки 1, як це передбачено в попередніх абзацах. В іншому варіанті реалізації склади можуть містити 20, 40, 60 або 80 мг сполуки 1 або її фармацевтично прийнятної солі. 00100) В деяких варіантах реалізації цього винаходу представлений спосіб інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця, що включає введення сполуки

Формули І або її фармацевтично прийнятної солі, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білююм КО51, наприклад, химерним білком 5І С34А2-

ВОБ51, химерним білюм СО74-КО51, химерним білком РБІШ-КО51, химерним білком Р1І-

КО51(3, химерним білком РІШС-КО51(5) і химерним білком РІС-КОБ51(МІ)3, а також іншими химерними білками КОБ51, які містять функціональний С-кінцевий кіназний домен КО51 та кодованими у геном людини КО5І1 в 6 хромосомі (бд22). В одному з варіантів реалізації рак являє собою аденокарциному легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю 5І С34А2-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю СО74-НОБІ1 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю БІС-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю КОБЗ1 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводили у вигляді фармацевтичної композиції що містить сполуку Формули І! або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І! вводять після іншої форми лікування. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабином. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І вводять після лікування кризотинібом. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після

Зо лікування кризотинібом та/або гемцитабіном. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І вводять після лікування карбоплатином. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули | або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку

Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули І або його фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. 00101) В деяких варіантах реалізації цього винаходу представлений спосіб інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця, що включає введення сполуки

Формули Іа або її фармацевтично прийнятної солі, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білююм КО51, наприклад, химерним білком 5І С34А2-

КО51, химерним білюм СО74-КО51, химерним білком РБІБ-КО51, химерним білком РГ1/ІС-

КО51(3, химерним білком РІШС-КО51(5) і химерним білком РІС-КОБ51(МІ)3, а також іншими химерними білками КО51, які містять функціональний С-кінцевий кіназний домен КО51 та кодованими у геном людини КО5І1 в 6 хромосомі (бд22). В одному з варіантів реалізації рак являє собою аденокарциному легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю 5І С34А2-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю СО74-НОБІ1 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю БІС-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю КОБ51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа вводять після іншої форми лікування. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабином. В іншому варіанті реалізації содікеге Формули Іа або її бо фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку

Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном.В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа вводять після лікування кризотинібом.В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа вводять після лікування карбоплатином. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули Іа або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку Формули іа або його фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. 00102) В інших варіантах реалізації цього винаходу представлений спосіб інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця, що включає введення сполуки! або її фармацевтично прийнятної солі, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білююм КОБ51, наприклад, химерним білком 5І/С34А2-8О51, химерним білююм СО74-КО51, химерним білком РІС-КО5ЗІ, химерним білком РІШ-ВНО51І), химерним білком РІШ-КОБ51(5) і химерним білком РІС-КОБ51(М), а також іншими химерними білками КО5І, які містять функціональний С-кінцевий кіназний домен КО5БІ1 та кодованими у геном людини КО51 в 6 хромосомі (бд22). В одному з варіантів реалізації рак являє собою аденокарциному легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю 5ІС34А2-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю СО74-8О51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю БІС-КО51 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації

Зо аденокарцинома легень являє собою позитивний по злиттю КОБЗ1 недрібноклітинний рак легень. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 вводять після іншої форми лікування. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабином. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/"або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабином, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинибом та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем. В іншому варіанті реалізації сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або карбоплатином. 00103) В іншому варіанті реалізації цього винаходу представлений спосіб попередження, лікування, інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця, що включає введення сполуки 1 або її фармацевтично прийнятною солі, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білком КО51, наприклад, химерним білком 5І/С34А2-КО51, химерним білюм СО74-КО51, химерним білком злиття РІШ-НОБІ1, химерним білком ГІС-КОЗ1(І), химерним білком РІС-КО51(5), химерним білком ГІШ-НО5І1 (МІ) або іншими химерними більами КОБЗІ1, при цьому рак раніше лікували із застосуванням 60 терапевтичної схеми введення кризотиніба та/"або карбоплатину, і рак є резистентним до кризотинібу та/або карбоплатину. У деяких варіантах реалізації рак, резистентний до кризотинібу та/(або карбоплатину, несе один або більше химерних білків КО51, вибраних з: химерного білка 5 С34А2-КО51, химерного більа СО74-КО51, химерного білка РІС-ВОБ1, химерного білка РІС-КО51(І), химерного білка РІ-КО51(5) і химерного білка ГІС-НОБІ (МІ), та/або містить мутації в кіназом домені КО51 химерного білка 5І С34А2-КО5І1, химерного білка

СбОр74-Ко51, химерного білка РІШС-КОБІ1, химерного білка РІС-КОЗ1(І)3, химерного білка РІС-

КО51(5) або химерного білка РІС-КО51(МІ). В одному з варіантів реалізації рак, резистентний до кризотинібу та/або карбоплатину, являє собою рак, що має мутацію в кіназному домені КОБ1 химерного білка СО74-КОБ51. У спорідненому варіанті реалізації рак являє собою кризотиніб- рефрактерну, позитивну по злиттю СО74-КО51 аденокарциному легень, наприклад, кризотиніб- рефрактерний, позитивний по злиттю СО74-КО51 НДРЛ, несе мутацію в кіназному домені

КО51. В іншому варіанті реалізації кризотиніб - та/або карбоплатин-резистентний рак являє собою рак, наприклад, кризотиніб-резистентну аденокарциному легень, наприклад, кризотиніб- резистентний НДРЛ, несе мутацію, обрану з Е19900, 52032, І 2026М, 11951, М2128МУ, К20031І та їх комбінацій, у кіназному домені КО51 химерного білка СЮО74-НОБ1. 00104) В іншому варіанті реалізації цього винаходу представлений спосіб попередження, лікування, інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця, що включає введення сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятною солі, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білком КОБ1, наприклад, химерним білком 5І С34А2-КО51, химерним білююм СО74-КОБ1, химерним білком

РІа-ВО51, химерним білком РІС-КОБ51(І), химерним білком ГІС-КО5З1(5), химерним білком РІС-

КОБ51(МІ) або іншими химерними білками КОБ51, при цьому рак раніше лікували із застосуванням терапевтичної схеми введення кризотиніба та/або карбоплатину, і рак є резистентним до кризотинібу та/або карбоплатину. У деяких варіантах реалізації рак, резистентний до кризотинібу та/або карбоплатину, несе один або більше химерних білків КО51, вибраних з: химерного білка 5І С34А2-КОБ1, химерного білка СЮО74-КО51, химерного білка ГБІС-

КО51, химерного білка РІС-КОБ51(І3, химерного білка РІБ-КОБ51(5) і химерного білка РБІС-

КОБ51(М), та/або містить мутації в кіназом домені КО51 химерного білка 5І С34А2-ВОБ51, химерного білка СО74-КО51, химерного білка РІШ-КО5І1, химерного білка РІШ-ВНО51(І), химерного білка РІС-КОБ51(5) або химерного білка РІБ-КОБ51(МІ)3. В одному з варіантів реалізації рак, резистентний до кризотинібу та/(або карбоплатину, являє собою рак, що має мутацію в кіназному домені КО5І1 химерного білка СО74-КО51. У спорідненому варіанті реалізації рак являє собою кризотиніб-рефрактерну, позитивну по злиттю СО74-НО51 аденокарциному легень, наприклад, кризотиніб-рефрактерний, позитивний по злиттю СО74-

КО51 НДРЛ, несе мутацію в кіназному домені КОЗІ1. В іншому варіанті реалізації кризотиніб - та/або карбоплатин-резистентний рак являє собою рак, наприклад, кризотиніб-резистентну аденокарциному легень, наприклад, кризотиніб-резистентний НДРЛ, несе мутацію, обрану з

Е19900, 52032, І 2026М, 11951, М2128У, К20031 та їх комбінацій, у кіназному домені КО51 химерного білка СО74-КО51. В різних варіантах реалізації описаних вище, спосіб попередження, лікування, інгібування або реверсування прогресу патологічного клітинного росту у ссавця включає введення сполуки Формули І або сполуки Формули Іа, або сполуки 1, або її фармацевтично прийнятною солі, в ілюстративній терапевтично ефективній дозі від близько 0,01 мг/кг до близько 100 мг/кг або від близько 0,1 мг/кг до близько 75 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 50 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 40 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 30 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 20 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 15 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 10 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 5 мг/кг, або від близько 0,1 мг/кг до близько 1 мг/кг пацієнту, який потребує цього, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований химерним білком КОБ51, наприклад, химерним білком 5 С34А2-КОБ51, химерним білком СО74-

КОБ5І1, химерним білком РІШ-КО51, химерним білком РІС-КО51(І), химерним білком Р1І-

КО51(5), химерним білком РІС-КОБ51(МІ) або іншим химерним білком КОБ1; або рак, що несе одну або більше мутацій в химерному білку КОБ51, наприклад, мутації в кіназному домені КО51 химерному білку 5І С34А2-КО51, химерному білку СЮО74-КО51, химерному білку РІБ-В8О51, химерному білку РІС-КОЗ51(І)3, химерному білку РІ-КОБЗ1(5), химерному білку ГІШ-НОБІ (МІ) або в інших химерних білках КО51, включаючи, в деяких варіантах реалізації, рак, який раніше лікували із застосуванням терапевтичної схеми введення кризотинібу та/або карбоплатину, і рак є резистентним до кризотиніуа та/або карбоплатину, наприклад, кризотиніб-резистентний рак, наприклад, кризотиніб-резистентна аденокарцинома легень, наприклад, кризотиніб- резистентний НДРЛ. 60 Введення

00105) Введення сполуки Формули І, Формули Іа або сполуки 1, або її фармацевтично прийнятною солі в чистій формі або відповідної фармацевтичної композиції може бути здійснене будь-яким прийнятним способом введення або засобами, призначеними для подібних цілей. Так, введення може бути, наприклад, здійснено перорально, назально, парентерально (внутрішньовенно, внутрішньом'язово або підшкірно), місцево, трансдермально, внутрішньовагінально, інтравезикально, інтрацистернально або ректально у формі твердих, напівтвердих, ліофілізованих порошків або в рідких лікарських формах, таких як, наприклад, таблетки, супозиторії, пігулки, м'які еластичні і тверді желатинові форми (які можуть бути у вигляді капсул або таблеток), порошки, розчини, суспензії або аерозолі, або т. п., зокрема, у поодиноких лікарських формах, підходять для простого введення точних доз. 00106) Композиції містять стандартний фармацевтичний носій або допоміжну речовину і сполуку Формули | в якості активного агента, а також, крім цього, можуть містити носії та ад'юванти і т.д.

І00107| Ад'юванти включають консервуючі, зволожуючі, суспендуючі, підсолоджучі, смакові, ароматизуючі, емульгуючі добавки та добавки для дозування. Запобігання дії мікроорганізмів може бути забезпечено за допомогою різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти і т.п. Необхідним також може бути включення ізотонічних засобів, наприклад, цукрів, хлориду натрію і т.п. Пролонгована абсорбція ін'єкційної фармацевтичної форми може бути забезпечена застосуванням агентів, що уповільнюють абсорбцію, наприклад, моностеарата алюмінію і желатину. 00108) При необхідності фармацевтична композиція сполуки Формули І також може містити незначні кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні або емульгуючі агенти, рН-буферні агенти, антиоксиданти і т.п., такі як, наприклад, лимонна кислота, сорбітанмонолаурат, триетаноламінолеат, бутильований гідрокситолуол і т.д.

ІЇ00109| Вибір композиції залежить від різних факторів, таких як спосіб введення ліків (наприклад, для перорального введення композиції запроваджують у формі таблеток, пігулок або капсул) і біодоступність лікарської речовини. Нещодавно були розроблені фармацевтичні композиції спеціально для ліків, що демонструють недостатню біодоступність, на підставі того принципу, що біодоступність може бути збільшена за допомогою збільшення площі поверхні,

Зо тобто зменшення розміру частинок. Наприклад, у патенті США Мо 4107288 описана фармацевтична композиція, що містить частинки розміром від 10 до 1000 нм, в якій активний матеріал нанесений на поперечно-зшиту матрицю з макромолекул. У патенті США Мо 5145684 описано одержання фармацевтичної композиції, в якій лікарський речовина нанесена на наночастинки (середній розмір частинок 400 нм) в присутності модифікатора поверхні, а потім дисперговані у рідкому середовищі з отриманням фармацевтичної композиції, яка демонструє помітно високу біодоступність. 00110) Композиції, прийнятні для парентеральної ін'єкції можуть містити фізіологічно прийнятні, стерильні водні або неводні розчини, дисперсії, суспензії або емульсії й стерильні порошки для розведення з отриманням стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій.

Приклади відповідних водних і неводних носіїв, розріджувачів, розчинників або рідких носіїв включають воду, етанол, поліоли (пропіленгліколь, поліетиленгліколь, гліцерин тощо), відповідні їх суміші, рослинні олії (оливкова олія) і органічні естери, придатні для ін'єкцій, такі як етилолеат. Належна плинність може бути забезпечена, наприклад, за допомогою застосування покриття, такого як лецитин, підтримання необхідного розміру часток у разі дисперсій та застосування поверхнево-активних речовин. 00111) Один з конкретних способів введення являє собою пероральний, із застосуванням зручного добового режиму дозування, який може бути підібраний у відповідності зі ступенем тяжкості стану захворювання, що підлягає лікуванню. 00112) Тверді лікарські форми для перорального введення включають капсули, таблетки, порошки і гранули. У таких твердих лікарських формах активна сполука змішана з щонайменше одною інертною стандартною допоміжною речовиною (або носієм), таким як цитрат натрію або фосфат дикальція, або з (а) наповнювачами або сухими розчинниками, такими як, наприклад, крохмаль, лактоза, сахароза, глюкоза, маніт і кремнієва кислота, (б) сполучними агентами, такими як, наприклад, похідні целюлози, крохмаль, альгінати, желатин, полівінілпіролідон, сахароза та гуміарабік, (с) зволожувачами, такими як, наприклад, гліцерин, (4) агентами для поліпшення розпаду таблеток, такими як, наприклад, агар-агар, карбонат кальцію, картопляний або тапіоковий крохмаль, альгінова кислота, натрію кроскармелоза, складні силікати та карбонат натрію, (е) уповільнювачами розчинення, такими як, наприклад, парафін, (ї) прискорювачами абсорбції такими як, наприклад, четвертинні амонієві сполуки, (9) 60 змочувальними агентами, такими як, наприклад, цетиловий спирт і гліцеринмоностеарат,

стеарат магнію і т.п., (п) адсорбентами, такими як, наприклад, каолін та бентоніт, та (ї) змащувальні речовинами, такими як, наприклад, тальк, стеарат кальцію, магнію стеарат, тверді полієтиленгліколі, лаурилсульфат натрію, або їх сумішами. У разі капсул, таблеток та пігулок лікарські форми можуть містити буферні агенти. 00113) Тверді лікарські форми, описані вище, можуть бути отримані з покриттями та оболонками, такими як ентеросолюбільні покриття та інші добре відомі з рівня техніки. Вони можуть містити замутняючі засоби, а також можуть мати такий склад, щоб вивільняти активну сполуку або сполуки в певному відділі кишечника з затримкою. Приклади інкапсулюючих композицій, які можуть бути використані, являють собою полімерні речовини і віск. При необхідності активні сполуки також можуть перебувати в мікроіїнкапсульованій формі з одною або більше з вищевказаних допоміжних речовин. 00114) Рідкі лікарські форми для перорального введення включають фармацевтично прийнятні емульсії, розчини, суспензії, сиропи та еліксири. Такі лікарські форми отримують, наприклад, розчиненням, диспергуванням і т.д. сполуки Формули | або її фармацевтично прийнятною солі і необов'язкових фармацевтичних ад'ювантів у носії, такому, як, наприклад, вода, сольовий розчин, водна декстроза, гліцерин, етанол тощо; солюбілізуючих агентів і емульгаторів, таких як, наприклад, етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, диметилформамід; масел, зокрема, бавовняного масла, арахісового масла, олії проростків кукурудзи, оливкової олії, рицинової олії і кунжутної олії, гліцерину, тетрагідрофурфурилового спирту, поліетиленгліколів та естерів жирних кислот і сорбіту; або сумішей вказаних речовин і т. п., з одержанням розчину або суспензії. 00115) Суспензії, крім активних сполук, що можуть містити суспендуючі агенти, як наприклад, етоксиьовані ізостеарилові спирти, поліоксиетиленсорбіт і складні ефіри сорбіту, мікрокристалічну целюлозу, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант, або суміші таких речовин і т. п. 00116) Композиції для ректального введення являють собою, наприклад, супозиторії, які можуть бути отримані змішуванням сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятною солі, наприклад, з відповідними неподразнюючими допоміжними речовинами або носіями, такими як масло какао, поліетиленгліколь або віск для супозиторіїв, які є твердими за звичайних температур, але рідкими при температурі тіла і, отже, плавляться у відповідній порожнини тіла і вивільняють в ній активний компонент.

ІЇ00117| Лікарські форми для місцевого застосування сполуки Формули | або її фармацевтично прийнятною солі включають мазі, порошки, аерозолі та інгаляційні форми.

Активний компонент змішують в стерильних умовах з фізіологічно прийнятним носієм і будь- якими необхідними консервантами, буферами або витискаючими газами. Офтальмологічні композиції, очні мазі, порошки і розчини також входять в обсяг цього опису. 00118) Гази під тиском можуть бути використані для диспергування сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі у формі аерозолю. Інертні гази, придатні для вказаної мети, являють собою азот, діоксид вуглецю і т.д. 00119) У цілому, в залежності від передбачуваного способу введення фармацевтично активні композиції містять від близько 1 95 до близько 99 95 по масі сполук(-и) Формули І або її фармацевтично прийнятної солі і від 9995 до 195 по масі відповідного фармацевтичної допоміжної речовини. В одному прикладі композиція містить близько 5 95 до близько 75 95 по масі сполук(і-и) Формули І, Формули Іа або сполуки 1, або її фармацевтично прийнятної солі, а решту становлять відповідні фармацевтичні допоміжні речовини. 00120) Існуючі способи отримання таких лікарських форм відомі або зрозумілі фахівцям у цій галузі техніки; див., наприклад, Кетіпдіоп, РПаптасешіса! Зсіеєпсе5, 180е изд., (Маск

Рибріїзпіпд Сотрапу, Істон, штат Пенсільванія, 1990). Композиція, що підлягає введенню в будь- якому випадку містить терапевтично ефективну кількість сполуки Формули |! або її фармацевтично прийнятною солі для лікування стану хвороби у відповідності з ідеєю цього опису. 00121) Сполуки згідно з цим описом або їх фармацевтично прийнятні солі, або сольвати вводять в терапевтично ефективній кількості, яка варіюється в залежності від безлічі факторів, включаючи активність конкретної використовуваної сполуки, метаболічну стабільність і тривалість дії сполуки, вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать, раціон, спосіб та час введення, швидкість екскреції, комбінацію ліків, тяжкість конкретного патологічного стану і реципієнта, що проходить лікування. Сполука Формули І, Формули Іа або сполука 1, або її фармацевтично прийнятна сіль може бути введена пацієнту в дозі від близько 0,1 до 1000 мг на 60 добу. Для нормальної дорослої людини з масою тіла близько 70 кг прикладом дози може служити доза від близько 0,01 до близько 100 мг на кілограм маси тіла на добу. Однак конкретна доза, що використовується може варіювати. Наприклад, доза може залежати від безлічі факторів, включаючи вимоги пацієнта, тяжкість стану, що підлягає лікуванню, і фармакологічну активність сполуки, що використовується. Визначення оптимальних доз для конкретного пацієнта добре відомо фахівцям у цій галузі техніки. (00122) В інших варіантах реалізації сполука Формули І, Формули Іа або сполука 1, або її фармацевтично прийнятна сіль може бути введена пацієнту одночасно з іншими засобами лікування раку. Такі засоби лікування включають інші протиракові хіміотерапевтичні агенти, гормонозамісну терапію, радіаційну терапію або імунотерапію, серед інших. Вибір іншої терапії залежить від безлічі факторів, включаючи метаболічну стабільність і тривалість дії сполуки, вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать, раціон, спосіб та час введення, швидкість екскреції, комбінацію ліків, тяжкість конкретного патологічного стану у реципієнта, що проходить лікування. (00123) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб виявлення, діагностики та лікування захворювання, пов'язаного зі злиттями КОБ5І, таких як позитивний по злиттю

ЗІ С34А2-КО51 НДРЛ, позитивний по злиттю СО74-КО51 НДРЛ і позитивний по злиттю РБІС-

КО51 НДРЛ, крім інших позитивних по злиттю КО51 НДРЛ. У цьому документі більш детально описані способи виявлення та діагностики таких розладів. Лікування вказаних розладів може бути покращено за допомогою введення терапевтично ефективного кількості фармацевтичної композиції, що містить сполуку Формули | або малатну сіль сполуки Формули І, або іншу фармацевтично прийнятну сіль сполуки Формули І, зокрема, в конкретному варіанті реалізації, сполука Формули І, що являє собою сполуку 1 або малатну сіль сполуки 1, пацієнту, у якого ідентифікована або діагностовано захворювання, пов'язане із злиттям КОБ1, таке як позитивний по злиттю 5І/С34А2-КО51 НДРЛ, позитивний по злиттю СО74-КО51 НДРЛ і позитивний по злиттю РІБ-КОБІ1 НДРЛ. (00124) В іншому аспекті сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять пацієнту для попередження або лікування раку легень. У деяких з таких варіантів реалізації вказаний спосіб включає введення пацієнту, який потребує цього, композиції, що містить щонайменше один інгібітор химерного білка КО51, щонайменше один інгібітор химерного гена

Зо КОБ51, що кодує химерний білок, щонайменше один інгібітор гена, що кодує КО51, або їх комбінації в якості активного інгредієнта.

КОЗ5Б1 і партнери по злиттю 5І С34А2, СО74 і БІС 00125) Білок КОБІ1, білок 5І С34А2, білок СО74 і білок РІС, злиття 5І С34А2-КО5І1 або злиття СЮО74-КО51; або злиття РІС-КО5БІ1, або іноді просто звані "химерний білок і нуклеїнові кислоти КОБ51", включаючи способи виявлення, діагностики, набори для виявлення та діагностики, способи скринінгу, способи лікування та попередження, а також різні терапевтичні способи лікування пацієнтів з раком легень, способи вимірювання ефективності лікування та інші фармацевтичні інгредієнти можуть бути використані в комбінації з різними способами лікування, описаними нижче. 00126) Білок КО51 являє собою "сирітську" трансмембранну рецепторну тирозинкіназу.

Білок кінази КОБ51 людини (який кодується геном КОБ1) являє собою рецепторну тирозинкіназу довжиною 2347 амінокислот, яка схильна до аберантної експресії, що приводить до раку. Опис повнорозмірної кінази КО5І1 людини (з амінокислотною послідовністю білка КО5ЗІ1 людини) представлено в ОпіРгої з номером доступу РО8922 (Е. С. - 2.7.10.1). Як показано в таблиці 1, сигнальний пептид, позаклітинні, трансмембранні і кіназні домени КО51 виявлені в наступних амінокислотних залишки в ЗЕО ІЮ МО: 1

І00127| Таблиця 1 Амінокислотні залишки і домени білка КО51 в 5ЕО ІЮО МО: 1 Сигнальний пептид 1-27 Позаклітинний домен 28-1859 Трансмемабранний домен 1860-1882 Кіназний домен 1945-2222

Білок

Таблиця 1

Домен. |Амінокислотнізалиши в ЗЕОЮ МОТЇСС/С/УЗО

00128) Білок КОБІ1І людини може кодуватися людським геном КО51, розташованим в 6 хромосомі людини. С-кінцевий домен білька КО51 може містити амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидом з 319 322, або 342 екзона до останнього екзону (наприклад, 327 З4м екзон) або його фрагментом гена КОБ51. С-кінцевий домен білка КО51 може містити послідовно щонайменше близько 100 амінокислот від стартового положення 312 3272 екзона. Наприклад, С- кінцевий домен білка КОБ51 може містити послідовно від близько 100 до близько 700 амінокислот, послідовно від близько 200 до близько 600 амінокислот або послідовно від близько 250 до близько 500 амінокислот, або послідовно від близько 270 до близько 425 амінокислот, або послідовно від близько 270 до близько 450 амінокислот, або послідовно від близько 475 до близько 625 амінокислот від стартового положення 32го екзона (довга форма) або 349 екзона (коротка форма) в бік С-кінця білка КО5". Передбачуваний точковий розрив білка КО51 відбувається у 1750 або 1852-1853 амінокислоти для химерних білків 5І С3З4А2-

КО5Б1 і химерних білків СО74-КО51, та у 1880-1881 амінокислоти для химерних білків БІс-

ВО51.

І00129| В одному ілюстративному варіанті реалізації людський ген 5І/С34А2, що кодує людський білок 5І С34А2 (МРНК ММ 001177998), локалізован у 4 хромосомі людини (4р15.2) і містить 13 екзонів, та має близько 690 амінокислот у довжину. Білок, який кодується вказаним геном, являє собою рН-чутливий натрійзалежний транспортер фосфату. Дефекти в вказаному гені є причиною альвеолярного мікролітиазу легень. Для цього гена встановлені три транскриптних варіанти, що кодують дві різні ізоформи. Білок 5І С34А2 може бути отриманий з організму ссавця, такого як людина. М-кінцевий домен химерного білка 5І С34А2-КО51 може містити амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидом з першого екзона по 12-й екзон, або з першого екзона по четвертий екзон, або з першого екзона по другий екзон гена 5І С34А2.

Останні екзони, що спостерігаються в структурі гена 5 С34А2 мають передбачувані точкові розриви в положеннях 429 і 2076. М-кінцневий домен химерного білка 5І С34А2-КО51 може містити послідовно щонайменше близько 30-250 амінокислот з 19 положення (тобто щонайменше амінокислотна послідовність з 1ї9по 2502 положення, або її фрагменти) білка

ЗІ С34А2. М-кінцевий домен химерного білка 5 С34А2-КО51 може містити послідовно від близько 30 до 250 амінокислот, послідовно від близько 30 до 225 амінокислот, послідовно від 40 до 200 амінокислот або послідовно від близько 40 до 175 амінокислот з 12 амінокислотного положення білка 5І СЗ4А2. 00130) В одному ілюстративному варіанті реалізації злиття 5ІС34А2-КО51 являє собою хромосомну транслокацію між людськими хромосомами 6 і 4, яка гібридизує 3'єобласть КО5І1 з

Б5-областю 5І С34А2. Химерний білок виявляють і підтверджують за допомогою різних способів, відомих фахівцям у цій галузі техніки або описаних у цьому документі. У деяких варіантах реалізації сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль потім вводять пацієнту, який цього потребує, для запобігання або лікування раку легень. У деяких варіантах реалізації пацієнту, який потребує в цьому, вводять композицію, що містить щонайменше один інгібітор злиття 5І С34А2-КО51, щонайменше один інгібітор химерного гена 5І С34А2-КОБ51, що кодує химерний білок, щонайменше один інгібітор гена, що кодує КО5І, або їх комбінацію, в якості активного інгредієнта.

Ї00131| У химерному білку 5ІС34А2-КО51 злиття або область злиття може бути розташована між різними екзонами гена 51 С34А2 і гена КО51. Фахівцям у цій галузі техніки відомі численні злиття. Приклади таких злиттів включають 27 та/або 4й екзон гена 5І С34А2 та

З2" (довгий, І) та/або 347 екзон (короткий, 5) гена КОБ51, який називають точкою злиття або точковим розривом. Відомі інші злиття або точкові розриви КО51 і 5ІС34А2, і вони представлені в каталозі соматичних мутацій при раку СОБМІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/рго|есів/со5Ітіс/. Термін "область злиття" може ставитися до фрагменту полінуклеотиду (близько 10-30 нуклеотидів) або до фрагменту поліпептиду (близько 5-30 амінокислот) навколо точки злиття.

І00132| Злиття СО74-КО51 являє собою хромосомну транслокацію з участю КО51 між людськими хромосомами 5 і 6, яка гібридизує 3'єобласть КО51 з 5''областю СО74. Химерний білок виявляють і підтверджують за допомогою різних способів, відомих фахівців у цій галузі техніки або описаних у цьому документі. М-кінцевий домен химерного білка СЮО74-КОБ51 може містити амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидом з першого екзона по 12-й екзон, або з першого екзона по четвертий екзон, або з першого екзона по другий екзон гена СО74. М- кінцевий домен химерного білка СЮО74-КО51 може містити послідовно щонайменше близько 30- 250 амінокислот з 1го положення (тобто щонайменше амінокислотна послідовність з 1792 по 2502 положення, або її фрагменти) білка СЮО74. М-кінцевий домен химерного білка СЮО74-КОБ51 може 60 містити послідовно від близько 30 до 250 амінокислот, послідовно від близько 30 до 225 амінокислот, послідовно від 40 до 200 амінокислот або послідовно від близько 40 до210 амінокислот з 1го амінокислотного положення білка СО74. 00133) У химерному білку СО74-КО51 злиття або область злиття може знаходитися між різними екзонами гена СО74 і гена КО51. Фахівцям у цій галузі техніки відомі численні злиття.

Приклади таких злиттів СО74-КО51 включають 6-й екзон гена СО74, злитий з 32-им або 34-им екзоном гена КОБ51, який називають точкою злиття або точковим розривом. Інші злиття або точкові розриви КОБЗІ і СО74 відомі і представлені в каталозі соматичних мутацій при раку

СО5МІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/ргоіесів/со5тіс/.

Термін "область злиття" може відноситися до фрагменту полінуклеотиду (близько 10-30 нуклеотидів) або до фрагменту поліпептиду (близько 5-30 амінокислот) навколо точки злиття. 00134) Химерний білок РІ-КО5І1 утворюється в результаті внутрішньохромосомної делеції в людській хромосомі 6, яка гібридизує 5'-область РІС (також відомого як СОРС) з 3'-областю

КОБ1. Злиття РІС-КО5Б1 ідентифіковані в зразках, отриманих від пацієнтів з холангіокарциномою та раком яєчників, з частотою 8,7 95 і 0,5 95, відповідно. Химерний білок

РІа-КО51 може бути виявлений та підтверджений за допомогою різних способів, відомих фахівців у цій галузі техніки або описаних у цьому документі. М-кінцевий домен химерного білка

РІа-КОБ51 може містити послідовно щонайменше близько 150-500 амінокислот з 19 положення (тобто щонайменше амінокислотна послідовність з 19 по 5002 положення, або її фрагменти) білка РІС. М-кінцевий домен химерного білка РІШ-КО51 може містити послідовно від близько 150 до близько 500 амінокислот, послідовно від близько 200 до близько 450 амінокислот, послідовно від близько 220 до 425 амінокислот або послідовно від близько 220 до близько 420 амінокислот, або їх фрагменти з 1го амінокислотного положення білка РІ. 00135) У химерному білку РІС-КО51 злиття або область злиття може знаходитися між різними екзонами гена РІС і гена КО51. Фахівцям у цій галузі техніки відомі деякі злиття ГБІС-

КО51. Приклади таких злиттів включають 4 або 81 екзон гена РІС, гібридизований з 35-м або 36-м екзоном білка КОБ51, який називають точкою злиття або точковим розривом. Відомі інші злиття або точкові розриви КО51 і РІС, і вони представлені в каталозі соматичних мутацій при раку СОБМІС, в базі даних версії 68, на сторінці сапсег.запдег.ас.ик/сапсегдепоте/ргоіесів/со5тіс/. Термін "область злиття" може відноситися до

Зо фрагменту полінуклеотиду (близько 10-30 нуклеотидів) або до фрагменту поліпептиду (близько 5-30 амінокислот) навколо точки злиття. (00136) Інші партнери злиття КО51 можуть включати ТРМЗ, 5ОС4, Е2К і І КІСЗ, крім злиттів

ЗІ С34А2, СО74 і РІС, докладно описаних у цьому документі. (Див. фіг. 1 в цьому документі і, наприклад, ТаКешспі К, ода М, Тодазпі У, 5и7икі ЕК, ЗакКаїа 5, Наїапо 5, єї аі. ВЕТ, ВО51 апа

АК Ти5іоп5 іп їшпуд сапсег. Маї Меа. 2012, и Кипів 0. Оаміє5, Ап Т. І е, Магіапа РЕ. ТНнеодого,

Магодагеї С. 5КоКап, Оага І. Аієпег, Еатоп М. Вегає, І піді М. Тетассіапо, Майео Іпсагропе,

Маззіто Вопсаїї, Редегісо Сарри22о, ОЮ. МВо55 Сатідде, Магпіейа МагеПйа-Сагсіа и Робеп б.

Роебеїеї, Ідепійуїпу апа Тагдеїпуд ВО51 Сепе Ривіопв іп Моп-5таї! СеїЇ па Сапсег, (2012), Сіїп

Сапсег Вев. Зеріетьег 2012 1; 18(17): 4570-4579, зміст вказаних описів, щодо химерних білків

КОЗ5І1, включено у цей документ у повному обсязі.

І00137| В одному з варіантів реалізації химерний білок КО5Б1 згідно з цим винаходом містить

С-кінцевий домен людського білка КО51 (наприклад, людського КО51, представленого в ЗЕО

ІО МО. 1), що забезпечує функціональний кіназний домен, який складається по суті з близько 50-300 амінокислот, розташованих послідовно, починаючи з амінокислоти, що відповідає стартовому положенню 322 екзона білка КОБТ, і в бік С - кінця білка КОБ5І1.

Ї00138| У цьому контексті номер екзона відповідає номеру екзона, присвоєному

Національним центром біотехнологічної інформації (МСВІ), очолюваним Національним інститутом охорони здоров'я, Бетесда, штат Меріленд, США. У деяких ілюстративних варіантах реалізації химерний білок 5 С34А2-КО51 може мати будь-яку амінокислотну послідовність, визначену таким центром МСВІ. Нуклеотидні послідовності молекул ДНК і амінокислотні послідовності білків, що кодуються молекулами ДНК, можуть бути визначені за допомогою автоматичного секвенатора ДНК або автоматичного секвенатора пептидів. (Нуклеотидні або амінокислотні) послідовності, визначені такими автоматичними засобами секвенування, можуть містити приватну похибку порівняно з реальними послідовностями. В цілому, послідовності, визначені автоматичним секвенуванням, можуть мати ідентичність послідовностей щонайменше близько 90 95, щонайменше 20 близько 95 95, щонайменше близько 99 95 або щонайменше близько 99,9 95 порівняно з реальними послідовностями. Отже, химерний білок, химерний ген або химерна область може мати амінокислотну послідовність або нуклеотидну послідовність, що має ідентичність щонайменше близько 90 956, щонайменше близько 95 95, 60 щонайменше близько 99 95 або щонайменше близько 99,9 95 у порівнянні з послідовностями,

ідентифікованими центром МУВІ.

І00139| Для спрощення наступний опис відноситься до химерного білка КОБІ1 5І С34А2-

КО51, але він також може відноситися до інших химерних білків КО51, описаних у цьому документі. Ілюстративний химерний білок 5І С34А2-КОБ51 у деяких варіантах реалізації може складатися з 80-200 М-кінцевих амінокислотних залишків білка 5І С34А2 і щонайменше 300 С- кінцевих залишків КОЗІ1, переважно 300-500 С-кінцевих амінокислотних залишків. Химерний ген має домен протеїнтирозинкінази разом з гелікальними доменами. Не обмежуючись будь-якої теорії, вважають, що третинна конформація химерного білка 5 С34А2-КОБ51 включає гомо- димеризацію, яка активує онкогенний домен протеїнтирозинкінази за допомогою автофосфорилювання. У підсумку, химерний ген 5 С34А2-КО5І1 може бути в значній мірі експресован, а потім димерізован після трансляції, обумовленої 5І С34А2. Потім димерізований протеїнтирозинкіназний домен КОБЗІ1 може бути патологічно стимульований, що полегшує стимуляцію онкогенного каскаду, наприклад, як у випадку раку легень НДРЛ, пов'язаного зі злиттям КОБ1. 00140) Після виявлення злиття воно стає відомим як химерний ген 5І/С34А2-КОБ51, що кодує химерний білок 5ІС34А2-КО51. У цьому документі описан спосіб забезпечення інформації для діагностики раку легень, що включає стадію виявлення злиття у випробуваному зразку, отриманому від суб'єкта. При діагностиці проводять порівняння химерного гена, що кодує химерний білок; і надекспресію КОБ1 в порівнянні зі стандартним зразком, отриманим від особи, яка не страждає на рак, де при виборі і виявленні у випробуваному зразку щонайменше одного елемента суб'єкта ідентифікують як того, щоналежить до однієї або усіх наступних груп: пацієнт, який страждає на рак; пацієнт, який страждає на рак легень; пацієнт, який страждає раком легень НДРЛ; пацієнт, який страждає НДРЛ, пов'язаним зі злиттям КО51; та/або пацієнт, який страждає НДРЛ, пов'язаним зі злиттям 5І С34А2-НО51. 00141) Делеція, інверсія або транслокація у 6 хромосомі може бути виявлена за допомогою полінуклеотиду (зонда), здатного до гібридизації (комплементарного зв'язування) з областю делеції, інверсії або транслокації в 6 хромосомі людини, і/або праймерної пари, здатної до виявлення делеції, інверсії або транслокації у б хромосомі людини, наприклад, здатної утворювати полінуклеотидний фрагмент, що має 100-200 послідовних нуклеотидів, які містять

Зо область інверсії в 6 хромосомі людини. Химерний білок, химерний ген і химерна область описаіїо в цьому документі. В ілюстративному варіанті реалізації химерний білок також може бути виявлений за допомогою виявлення наявності химерного білка або химерного гена, або

МРНАК, відповідної химерному гену, наприклад, за допомогою КОБ51-специфічних або специфічних по злиттю КОБ51 антитіл, відомих у цій області техніки і описаних у цьому документі. 00142) Наявність химерного білка може бути виявлена за допомогою загального аналізу, в якому вимірюють взаємодію між химерним білком і матеріалом (наприклад, антитілом або аптамером), який специфічно зв'язується химерним білком. Загальний аналіз може являти собою імунохроматографію, імуногістохімічне фарбування, твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА), радіоїмунологічний аналіз (КІА), імуноферментний аналіз (ІФА), флуоресцентний імунологічний аналіз (РІА), люмінесцентний імунологічний аналіз (ГІА), вестерн-блоттінг, сортування флуоресцентно-активованих клітин (ГАС) і т. п. 00143) Крім того, наявність химерного гена або мРНК може бути виявлена за допомогою загального аналізу, такого як ПЛР, РІЗН (флуоресцентна гібридизація іп 5йц) і т.п., за допомогою полінуклеотиду, здатного до гібридизації (комплементарного зв'язування) з химерним геном або

МРАК. РІБН більш докладно описана нижче. Химерний ген може бути виявлений і/або підтверджений за допомогою методів інтеграції загального транскриптомного (РНК) та/або загального геномного секвенування ДНК за допомогою технологій масового паралельного секвенування. Полінуклеотид, здатний до гібридизації з химерним геном або мРНК, може являти собою міРНК, олігонуклеотид, зонд ДНК або праймер ДНК, який може виявляти химерний ген або мРНК шляхом безпосередньої гібридизації зі злитим або усіченим геном або транскриптом у зразку, що випробовується. 00144) У додаткових варіантах реалізації в способах згідно цього винаходу використовують флуоресцентну гібридизацію іп 5йи (РІЗН) (як описано в Мепта еї аК. Нитап Спготозотев: А

Мапиаї ОЇ Вавзіс Тесппідие5, Регдатоп Ргез5, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1988)). Аналіз РІЗН може бути здійснен за допомогою одного або більше наборів зондів, нижче представлені варіанти реалізації: (1) перший набір зонда, який являє собою перший набір зонда, націлений на хромосомний сайт, який містить ген ВО51 (перший хромосомний сайт); він складається з зонда ТА, міченого першою флуоресцентною речовиною, і зонда 1В, міченого другою бо флуоресцентною речовиною; зонд ТА є комплементарним першої області, яка являє собою 5'-

область у вищезгаданому першому хромосомному сайті, зонд 18 є комплементарним другій області, яка знаходиться на відстані від вищезгаданої першої області і являє собою 3'-область у вищезгаданому першому хромосомному сайті, і точковий розрив у гені ВО51, якщо химерний ген 5 С34А2-8О51 утворений в результаті транслокації між генами 5ІС34А2 і ВО51, розташований на 3'-кінці вищевказаної першої області, між вищевказаними першою і другою областями, або на 5'-кінці вищевказаної другої області; (2) другий набір зонда, який являє собою другий набір зонда, націлений на хромосомний сайт, який містить ген 5І СЗ4Аг (другий хромосомний сайт); він складається з зонда 2А, міченого першою флуоресцентною речовиною, і зонда 2В, міченого другою флуоресцентною речовиною; зонд 2А є комплементарним першої області, яка являє собою 5'-область у вищевказаному другому хромосомному сайті, зонд 2В є комлементарним другій області, яка знаходиться на відстані від вищевказаної першої області і являє собою 3'-область у вищевказаному другому хромосомному сайті, і точковий розрив у гені

ЗІ С34А2, якщо химерний ген 5І С34А2-КО51 утворений в результаті транслокації між генами 5ІС34А2 і КО51, розташований на 3'-кінці вищевказаної першої області, між вищевказаної першою і другою областями або на 5'-кінці вищевказаної другий області; (3) третій набір зонда, що складається з вищевказаного зонда 2А і вищевказаного зонда 18В; і (4) четвертий набір зонда, що складається з зонда 4А, який є комплементарним хромосомному сайту, містить ген

КОЗ5Б1 (третій хромосомний сайт), і зонда 4В, який є комплементарним хромосомному сайту, що містить ген 5І С34А2 (четвертий хромосомний сайт).

І00145| Довжина вищевказаного першого хромосомного сайту може становити 0,5-2,0 мегабаз. Довжина вищевказаного другого хромосомного сайту може становити 0,5-2,0 мегабаз.

Довжина вищевказаного третього хромосомного сайту може становити 0,5-2,0 мегабаз.

Довжина вищевказаного четвертого хромосомного сайту може становити 0,5-2,0 мегабаз. 00146) У деяких варіантах реалізації аналіз РІЗН може корелювати з іншими фізичними технологіями хромосомного картування і даними генетичної карти. Технологія РІЗН загальновідома (див., наприклад, патент США Мо 5756696; 5447841; 5776688; і 5663319).

Приклади даних генетичної карти представлені в публікації Сепоте Іб55йе ої 5сіепсе, 1994 (265: 19817). Кореляція між локалізацією гена, що кодує білок КО51 та/або, у разі химерних поліпептидів КО51, гена, що кодує партнера по злиттю химерного білка КОБ51 (наприклад, гена

Зо РІб, гена 51С34А2 або гена СО74), і фізичною хромосомної картою і конкретним захворюванням або схильністю до конкретного захворювання може полегшувати визначення меж області ДНК, пов'язаної з конкретним генетичним захворюванням. Нуклеотидні послідовності відповідно до цього винаходу можуть бути використані для виявлення різниці в генних послідовностей між нормальними індивідуумами, індивідуумами-носіями або ураженими індивідуумами.

І00147| Іп 5йи гібридизація хромосомних препаратів і технології фізичного картування, такі як аналіз груп зчеплення за допомогою встановлених хромосомних маркерів, можуть бути використані для розширення генетичних карт. Найчастіше розташування гена в хромосомі іншого ссавця вигляду, такого як миші, може виявляти асоційовані маркери навіть якщо номер або плече конкретної людської хромосоми невідомі. Нові послідовності можуть бути віднесені до хромосомних плеч або їх частин за допомогою фізичного картування. Це забезпечує цінну інформацію для дослідників, які виробляють пошук генів захворювань за допомогою позиційного клонування або інших технологій відкриття генів. Після грубої локалізації захворювання або синдрому за генетичним зв'язком з певною геномною областю, наприклад, від АТ до 11422-23 (Сайці еї аї., Майте 336: 577-580 (1988)), будь-які послідовності, картовані на вказаній області, можуть являти собою асоційовані або регуляторні гени для додаткового дослідження. Нуклеотидні послідовності, що кодують злиття КОБ5І1 відповідно до цього винаходу, або їх частини, також можуть бути використані для виявлення відмінностей у хромосомнії локалізації внаслідок транслокації, інверсії і т.д., між нормальними індивідуумами, індивідуумами-носіями або ураженими індивідуумами.

ІЇ00148| Слід розуміти, що всі способи (наприклад, ПЛР та РІ5Н), які виявляють полінуклеотиди, що кодують поліпептид з активністю кінази КО51 (наприклад, повнорозмірний

КО51 або химерні полінуклеотиди КОБ1, такі як 5 С34А2-8О51, або СО74-КОБ1, або РІС-

КО51(5)), можуть бути об'єднані з іншими способами, які виявляють поліпептиди з активністю кінази КО51 або полінуклеотиди, що кодують поліпептид з активністю кінази КО51. Наприклад, виявлення химерного білка РІШ-КОБ1 у генетичному матеріалі біологічного зразка (наприклад,

РІШ-КО51 циркулюючій в крові пухлинної клітини) може бути продовжено аналізом вестерн- блот або імуногістохімічним (ІНС) аналізом білків зразка для визначення того, чи дійсно полінуклеотид РІШ-КО51 експресується в біологічному зразку як химерний білок РІБ-ВО51. 60 Вказані аналізи вестерн-блот або ІНС можуть бути здійснені із застосуванням антитіла, яке специфічно зв'язується з поліпептидом, що кодується виявленим полінуклеотидом РІБ-БОБІ1, або вказані аналізи можуть бути здійснені із застосуванням антитіл, які специфічно зв'язуються з повнорозмірним РІС (наприклад, зв'язуються з М-кінцем білка) або з повнорозмірним КО51 (наприклад, зв'язуються з епітопом у кіназному домені КО51). Такі аналізи відомі в цій області техніки (див., наприклад, патент США Мо 7468252).

ІЇ00149| В іншому прикладі технологія СІЗН компанії ЮБако забезпечує можливість хроматогенної іп 5йи гібридизації з імуногістохімією на одному тканинному зрізі. Див. ЄПіої еї аї.,

Вг У Віотеєа 5сі 2008; 65(4): 167-171, 2008, де представлено порівняння СІЗН і РІЗН. 00150) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб діагностики пацієнта з раком легень або з підозрою на рак легень, обумовлений кіназою КО5З1. Вказаний спосіб включає приведення в контакт біологічного зразка вказаного раку легень або передбачуваного раку легень (причому біологічний зразок містить щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти) з зондом, який гібридизується в жорстких умовах з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з активністю кінази КО51, такий як повнорозмірний полінуклеотид КО51 або химерний полінуклеотид КО51 (наприклад, химерний полінуклеотид БІС-КО51, химерний полінуклеотид 51 С34А2-КО5І1 або химерний полінуклеотид СО74-КО51), при цьому гібридизація вказаного зонда із щонайменше однією молекулою нуклеїнової кислоти в вказаному біологічному зразку забезпечує ідентифікацію вказаного пацієнта як того, що має рак легень або підозрюваний рак легень, обумовлений кіназою КОБ1. 00151) В іншому аспекті цього винаходу представлений спосіб діагностики пацієнта який страждає на рак легень або імовірно страждає на рак легень, обумовлений кіназою КО51.

Вказаний спосіб включає приведення в контакт біологічного зразка вказаного раку легень або передбачуваного раку легень (причому вказаний біологічний зразок містить щонайменше один поліпептид) з реагентом, який специфічно зв'язується з поліпептидом з активністю кінази КО51 (наприклад, химерний поліпептид РІШ-КОБ51, химерний поліпептид 5ІС34А2-КО51 або СО74-

КО51), при цьому специфічне зв'язування вказаного реагенту з щонайменше одним химерним поліпептидом у вказаному біологічному зразку забезпечує ідентифікацію вказаного пацієнта як того, який має рак легень або підозрюваний рак легень, обумовлений кіназою КОБ1. 00152) У різних варіантах реалізації ідентифікація раку легень або передбачуваного раку

Зо легень, обумовленого кіназою КО5Б1, забезпечує визначення того, що пацієнт, який має рак легень або підозрюваний рак легень, ймовірно відповідає на КО51-інгібуючий терапевтичний засіб.

Ї00153)| Набір для виявлення транслокацій між генами 5І С34А2 і КОЗІ може містити один або більше наборів зондів. (1) Перший набір зондів містить зонд ТА, мічений першою флуоресцентною сполукою, і зонд 18, мічений другою флуоресцентною сполукою; зонд ТА є комплементарним першії області, яка являє собою 5'-область у вищевказаному першому хромосомному сайті, зонд 18 є комплементарним другій області, яка знаходиться на деякій відстані від вищевказаної першої області і являє собою 3'-область у вищевказаному першому хромосомному сайті, і точковий розрив в гені КО51, якщо химерний ген 51 С34А2-8О51 утворений в результаті транслокації між генами 5І.С32А2 і КО51, розташований в 3'-хвості вищевказаної першої області, між вищевказаною першою і другою областями, або в 5'-хвості вищевказаної другої області; (2) другий набір зондів, який являє собою другий набір зондів, націлений на хромосомний сайт, який містить ген 5С32А2 (другий хромосомний сайт); складається з зонда 2А, міченого першою флуоресцентною сполукою, і зонда 2В, міченого другою флуоресцентною сполукою; зонд 2А є комплементарним першій області, яка являє собою 5'-область у вищевказаному другому хромосомному сайті, зонд 28 є комплементарним другій області, яка знаходиться на деякій відстані від вищевказаної першої області і являє собою 3'-область у вищевказаному другому хромосомному сайті, і точковий розрив в гені

ЗІ С32А2, якщо химерний ген 5І С34А2-КО51 утворений в результаті транслокації між генами 5І/С32А2 і КО5І1, розташований в 3'-хвості вищевказаної першої області, між вищезгаданою першою і другою областями, або в 5'-хвості вищевказаної другої області; (3) третій набір зондів, що складається з вищевказаного зонда 2А і вищевказаного зонда 18; і четвертий набір зондів, що складається з зонда 4А, який є комплементарним хромосомному сайту, що містить ген

КОЗ5Б1 (третій хромосомний сайт), і зонда 4В, який є комплементарним хромосомному сайту, що містить ген 5І С32А2 (четвертий хромосомний сайт). (00154) Набір, придатний для ідентифікації пацієнтів, схильних до транслокації 5І СЗ4Аг-

КО51, містить один або більше елементів, вибраних з групи, що містить пояснення щодо застосування зондів, контрастного барвника ДНК, буфера для застосування при гібридизації, инкапсулюючого агента і контрольного слайда. Набір забезпечує можливість зручної та бо ефективної реалізації способу згідно з цим винаходом. Набір може містити, в якості необхідних елементів (незамінних інгредієнтів), вищевказаний перший набір зондів, другий набір зондів, третій набір зондів або четвертий набір зондів. У набір також можуть бути включені два або більше типів наборів зондів. Наприклад, набір може містити перший набір зондів і третій набір зондів. Оскільки докладний опис кожного набору зондів описано вище, їх повторне опис не наводиться.

І00155| Виявлення наявності або відсутності химерного полінуклеотида 5ІСЗ34А2-НОБІ1 може бути здійснено безпосередньо з застосуванням геномної ДНК, яка кодує вищевказаний химерний поліпептид, або транскрипту з вказаної геномної ДНК, а також може бути здійснено опосередковано із застосуванням продукту трансляції із вказаного транскрипту (вищевказаного химерного поліпептиду).

І00156| Оскільки геномна ДНК, яка кодує химерний поліпептид, утворена в результаті інверсії між областю розміром 117,61-117,75 мегабаз 6 хромосоми, (бд22), то явище згідно з цим винаходом може бути виявлено як "виявлення наявності або відсутності химерного полінуклеотиду 5І С34А2-КО51". При виявленні такої інверсії, наприклад, може бути виявлено розщеплення між 5'-боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції від кодуючої області кіназного домену гена КО51, 3'-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена КОБ51, або може бути виявлено розщеплення між областю, яка кодує частини або повні спіральні домени і 5'-боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена 5І С32А2, 3'-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції від вказаної кодуючої області спіральних доменів гена 5І СЗ4А2.

І00157| Технології, відомі досвідченим фахівцям, можуть бути використані для "виявлення наявності або відсутності химерного полінуклеотиду 5ІС34А2-КО51" відповідно до цього винаходу. Якщо об'єктом є "геномна ДНК, яка кодує вищезгаданий химерний поліпептид", тоді може бути використана, наприклад, іп 5йи гібридизація (ІЗН) із застосуванням флуоресценції або подібне, геномна ПЛР, пряме секвенування, Саузерн-блоттінг або мікроматричний аналіз генома. Якщо об'єктом є "транскрипт з вищезгаданої геномної ДНК", то може бути використана, наприклад, ЗТ-ПЛР, пряме секвенування, нозерн-блоттінг, дот-блоттінг або мікроматричний аналіз кДНК. 00158) Набір згідно з цим винаходом також може містити інші елементи. Приклади вказаних

Зо інших елементів являють собою технічні умови щодо застосування зондів, контрастний барвник

ДНК, таких як ОАРІ, буфер для гібридизації, промивний буфер, розчинники, заливочне середовище, контрольні слайди, реакційні посудини та інше обладнання. Також можуть бути включені специфікації для діагностичних цілей. Крім того, можуть бути включені також специфікації тощо, які вказують способи налаштування виявлення (позитивної ідентифікації) транслокації 5ІС34А2-КОБІУ зразках хромосом, отриманих від онкологічних пацієнтів, у вказаних пацієнтів із застосуванням інгібітора кінази КО51. Крім того, може бути включений також план визначення курсу лікування і пояснення вказаного плану. 00159) Передбачені відносно довгі зонди (від приблизно 200 кілобаз (зонд 1А) до приблизно 1370 кілобаз (зонд 48). Таким чином, комплементация між зондами і цільовими послідовностями необов'язково повинна бути строго обмежуючою, до тієї міри, в якій досягається специфічна гібридизація, передбачувана у цьому винаході. Приклад подібність між цільовими послідовностями становить щонайменше 90 956, переважно щонайменше 95 95, і більш переважно щонайменше 98 95. 00160) У разі застосування першого набору зондів і другого набору зондів, у хромосомних зразках, в яких має місце транслокація між геном 51 СЗ4А2 і геном КО5БІ, поділяють і виявляють окремо два флуоресцентних сигнали; в хромосомних зразках, в яких не відбувається транслокація, два флуоресцентних сигнали зазвичай спостерігають як такі, що відбуваються один за іншим, або спостерігають сигнал (жовтий), який являє собою комбінацію двох флуоресцентних сигналів. Таким чином, наявність або відсутність транслокації між геном 5І СЗ34А2 і геном КО5ЗІ1 відображено в характері флуоресцентного сигналу. Отже, транслокація між геном 5ІС34А2 і геном КО5І1 може бути визначена за характером флуоресцентного сигналу.

І00161)| Рішення щодо вищевказаного явища переважно і зазвичай приймають на підставі порівняння результату з контролем (контрольним зразком). У цьому контексті контроль являє собою хромосомний зразок, отриманий від пацієнта з недрібноклітинним раком легень, або хромосомний зразок, отриманий від пацієнта, який демонструє передпухлинний стан. Крім того, в якості контролю можуть бути використані хромосомні зразки, отримані від пацієнта з передпухлинним станом, хромосомні зразки, отримані від пацієнтів, що не мають раку, або хромосомні зразки, взяті у нормальних здорових суб'єктів. В якості контролю також можуть бути бо використані хромосомні зразки, отримані з клітин штамів.

(00162) Якщо химерний ген являє собою химерний ген 5 С34А2-КО51, що кодує химерний білок 5 С34А2-КО51, то химерний ген 5 С34А2-КО51 (або будь-який інший химерний ген

КО51, наприклад, СЮО74-КОБ1 і РІС-КОБІ1) може бути виявлений за допомогою полінуклеотиду (зонда), здатного до гібридизації (комплементарного зв'язування) з химерною областю та/або праймерною парою, здатною до утворення фрагмента полінуклеотиду, який має 100-200 послідовних нуклеотидів, що містить химерну область. Крім того, в одному ілюстративному варіанті реалізації химерний білок 5І С34А2-КОБ51 може бути виявлений за допомогою антитіла або аптамеру який специфічно зв'язується з химерною областю химерного білка 5І С34А2-

ВО51. 00163) Крім того, виявлення може бути здійснено за допомогою аналізу злиття, який являє собою комбінацію методу хромогенной іп 5йи гібридизації (СІЗН) і методу іп 5йи гібридизації зі сріблом (5І5Н). "Точка злиття" у тексті цього опису ставиться до точки, в якій частина, утворена з відповідних генів 5І СЗ34А2, гібридизована з частиною, утвореною з гена КО51. (00164) Термін "здатна до гібридизації з химерною областю (або областю інверсії)» може відноситися до наявності комплементарної послідовності або послідовності, що має ідентичність послідовностей щонайменше 90 95 з послідовністю химерної області (або області інверсії). В іншому варіанті реалізації представлена композиція для діагностики раку, що містить один або більше елементів, вибраних з групи, що складається з полінуклеотиду, здатного до гібридизації з химерною областю, праймерної пари, здатної до утворення полінуклеотидного фрагмента, що містить 100-200 послідовних нуклеотидів, які містять химерну область. Також полінуклеотид, здатний до гібридизації з областю інверсії в 6 хромосомі людини, праймерна пара, здатна до утворення полінуклеотидного фрагмента, що містить 100-200 послідовних нуклеотидів, які містять область інверсії 6 хромосоми людини, і антитіло або аптамер, які зв'язується з химерною областю. В іншому варіанті реалізації представлено застосування химерного білка та/або химерного гена для діагностики раку. Пацієнт може являти собою будь- якого ссавця, наприклад, примата, такого як людина або мавпа, гризуна, такого як миша або пацюк, зокрема, людини. Випробуваний зразок, що підходить для застосування в будь-яких згаданих аналізах, може являти собою клітину (наприклад, клітину легень); тканину (наприклад, легеневу тканину; рідину організму (наприклад, кров); циркулюючу пухлинну ДНК, циркулюючі

Зо пухлинні клітини. Зразки можуть бути зібрані будь-яким способом, відомим фахівцям у цій області техніки, включаючи отримання в результаті хірургічної біопсії пухлини, кор-біопсії пухлини, тонкоголкової аспірації пухлини, плеврального ексудату та інших відомих способів виділення клітин і тканин з організму пацієнта. Наприклад, на циркулюючих пухлинних клітинах може бути проведений аналіз РІЗН (описаний в цьому документі).

І00165| Пацієнт може проходити лікування або мати заплановане лікування інгібітором кінази. Випробуваний зразок може містити клітину, отриману з ракової клітини людини або її екстракту. (00166) В іншому варіанті реалізації представлений химерний ген, що кодує химерний білок, причому ген, що кодує М-кінцевий домен партнера по злиттю, розташований на 5'-кінці, а ген, що кодує С-кінцевий домен білка КО51, розташований на 3'-кінці. В одному ілюстративному варіанті реалізації, якщо химерний білок являє собою білок 5І С34А2-КОБІ1, химерний ген може бути представлений як ген 5І С34А2-КО5І1, причому ген, що кодує М-кінцевий домен 5І С34А2, розташований на 5'-кінці, а ген, що кодує С-кінцевий домен білка КО51, розташований на 3'- кінці.

І00167| В іншому варіанті реалізації представлений експресійний вектор, що містить химерний ген і необов'язково транскрипційні елементи (наприклад, промотор і т.п.), функціонально зв'язані з химерним геном. В іншому варіанті реалізації представлена клітина- трансформант, трансформована експресійним вектором. 00168) Біологічні зразки, отримані під час лікування або діагностики (біопсійні зразки і т.д.) найчастіше фіксують у формаліні, і в цьому випадку застосування іп 5йи гібридизації є переважним, оскільки геном ДНК, який є об'єктом виявлення, стабільний при фіксації у формаліні і оскільки чутливість виявлення є високою. 00169) При іп 5йи гібридизації геномна ДНК, яка кодує химерний поліпептид 51 С34А2-

КО51в біологічному зразку, може бути виявлена гібридизацією полінуклеотиду за пунктом (а) або (Б), описаного нижче, який має ланцюг довжиною щонайменше 15 нуклеотидних основ: (а) полінуклеотид, який являє собою щонайменше один зонд, обраний із групи, що складається з зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок 5І СЗ4А2, і зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок КО51 (Б) полінуклеотид, який являє собою зонд, який сгібридизується 3 сайтом злиття бо полінуклеотиду, що кодує білок ЗІ СЗ4А2, і полінуклеотиду, що кодує білок КОЗІ1.

001701 При іп 5йи гібридизації геномна ДНК, яка кодує химерний поліпептид СЮО74-КОБ1 в біологічному зразку може бути виявлена гібридизацією полінуклеотиду за пунктом (а) або (б), описаного нижче, який має ланцюг довжиною щонайменше 15 основ: (а) полінуклеотид, який являє собою щонайменше один зонд, обраний із групи, що складається з зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок СО74, і зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок КО51 (Б) полінуклеотид, який являє собою зонд, який сгібридизується 3 сайтом злиття полінуклеотиду, що кодує білок СО74, і полінуклеотиду, що кодує білок КО51. 001711) При іп 5йи гібридизації геномна ДНК, яка кодує химерний поліпептид РІС-КОБІ1 в біологічному зразку може бути виявлена гібридизацією полінуклеотиду за пунктом (а) або (б), описаного нижче, який має ланцюг довжиною щонайменше 15 основ: (а) полінуклеотид, який являє собою щонайменше один зонд, обраний із групи, що складається з зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок РІС, і зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок КО51 (Б) полінуклеотид, який являє собою зонд, який сгібридизується 3 сайтом злиття полінуклеотиду, що кодує білок РІС, і полінуклеотиду, що кодує білок КО51.

І00172| Однак послідовність ДНК гена може мутувати в природних умовах (тобто не штучним чином). Відповідно, такі природні варіанти також можуть бути об'єктом цього винаходу (аналогічним чином тут і далі). 00173) Полінуклеотид, вказаний в пункті (а) цього винаходу, може бути будь-яким, за умови, що він може виявляти наявність геномної ДНК, яка кодує вищезгаданий химерний білок КОБ51 в біологічному зразку, за допомогою гібридизації з полінуклеотидом, який кодує партнера по зв'язуванню КОБ1, тобто білок 5ІС34А2, СО74 або РІС, або з полінуклеотидом, який кодує білок КОБ1, які є цільовими послідовностями основ вказаного полінуклеотиду. Переважно, він являє собою полінуклеотид, вказаний нижче в пунктах (а1)-(а4). 00174) (а1) Комбінація полінуклеотиду, який гібридизується з областю, що кодує частини або повний спіральнмй домен екзонів 1-2 і 5''боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена 5ІС34А2 (тут і далі згаданого також як "5' 5І С34А2 зонд 1"), і полінуклеотиду, який гібридизується з областю, що кодує кіназний домен та

Зо 3-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена

КОБ1 (тут і далі згаданого також як "3 КОБ51 зонд 17").

І00175| (а2) Комбінація полінуклеотиду, який гібридизується з 5-боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції від вказаної кодуючої області кіназного домену гена

КОЗ5Б1 (тут і далі згаданого також як "5" КОБІ1 зонд 1"), і полінуклеотиду, який гібридизується з областю, що кодує кіназний домен та 3'-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції вказаної кодуючої області гена КОБІ (тут і далі згаданого також як "3' КО51 зонд 17").

ІЇ00176| (а3) Комбінація полінуклеотиду, який гібридизується з областю, яка кодує фібронектин ІІІ типу 9 і 5'-боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції вказаної від вказаної області гена КО5Б1 (тут і далі згаданого також як "5" КО51 зонд 2"), і полінуклеотиду, який гібридизується зобластю, яка кодує трансмембранний домен та 3'-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена КОБ51 (тут і далі згаданого також як "3 КО51 зонд 2").

І00177| (а4) Комбінація полінуклеотиду, який гібридизується з областю, що кодує частини або повний спіральнмій домен і 5'-боковою областю, розташованою проти ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена 5І С34А2 (тут і далі згаданого також як "5' 5І С34А2 зонд 17"), і полінуклеотиду, який гібридизується з областю, що кодує суперспіральний домен та 3'-боковою областю, розташованою по ходу транскрипції від вказаної кодуючої області гена 51 С34А2 (тут і далі згаданого також як "3 5І СЗ34А2 зонд 17").

І00178| Область (цільова послідовність основ), з якої гібридизується полінуклеотид за пунктом (а1ї), що використовується в іп 5йш гібридизації, переважно являє собою область в межах 1000000 основ від сайту злиття гена 5І СЗ34А?2 і гена КО51, що обумовлено міркуваннями специфічності до цільової послідовності основ і чутливості виявлення, а область, з якої гібридизується полінуклеотиди по пунктах (а2)-(а4), що використовуються в іп 5іш гібридизації, переважно являють собою область в межах 1000000 основ від точкового розриву в гені 5І С34А2 або гені КОБІ, з тих же причин.

І00179| Полінуклеотид, вказаний вище в пункті (а) або (Б), що використовується в іп 5йи гібридизації, переважно являє собою колекцію, складену з безлічі типів поліпептидів, яка може охоплювати всі вищезгадані цільові послідовності основ, що обумовлено міркуваннями специфічності до цільової послідовності основ і чутливості виявлення. У цьому випадку довжина бо полінуклеотидів, які утворюють колекцію, становить щонайменше 15 основ і переважно від 100 до 1000 основ.

І00180| Полінуклеотид, вказаний вище в пунктах (а) або (Б), що використовується в іп 5іш гібридизації переважно є міченим флуоресцентним барвником або подібним чином для виявлення. Приклади таких флуоресцентних барвників включають ОЕАС, РІТС, бо, ТехкКеа і

Су5, але не обмежуються ними. Крім флуоресцентного барвника, вищезгаданий полінуклеотид може також бути міченим барвником (хромогеном), таким як САВ, або сріблом і подібним чином, заснованим на ферментативному осадженні металу. 001811) При іп вйи гібридизації, при використанні 5' 5І С34А2 зонда 1 і 3 КОБ1 зонда 1, або при використанні 5' КОБ1 зонда 1 і 3" КО51 зонда 1, або при використанні 5' КОБ51 зонда 2 і 3"

КО51 зонда 2, або при використанні 5' 5І С34А2 зонда 1 і 3' 5І С34А2 зонда 1, бажано, щоб вказані зонди були міченими взаємнопротилежними барвниками. При проведенні іп 5йй гібридизації з застосуванням комбінації зондів, мічених описаним чином різними барвниками, якщо сигнал, створюваний міткою 5' 5І С34А2 зонда 1 (наприклад, флуоресцентний), і сигнал, створюваний міткою 3 КОБ51 зонда 1, перекриваються, може бути встановлено, що виявлена геномна ДНК, що кодує химерний поліпептид 5ІС34А2-КО51. З іншого боку, якщо сигнал, створений міткою 5 КОБ5ІЇ зонда 1, і сигнал, створений міткою 3 КО51 зонда 1, розщеплюються, або сигнал, створений міткою 5' КО51 зонда 2, і сигнал, створений міткою 3'

КО51 зонда 2, розщеплюються, або сигнал, створений міткою 5' 5І С34А2 зонда 1, і сигнал, створений міткою 3' 5І С34А2 зонда 1, розщеплюються, може бути встановлено, що виявлена геномна ДНК, що кодує химерний поліпептид 5 С34А2-8О51.

І00182| Мічення полінуклеотиду може бути здійснено за допомогою відомої технології.

Наприклад, основа підкладки, мічене флуоресцентним барвником або подібним чином за допомогою нік-трансляції або випадкового праймування, може бути впроваджено в полінуклеотид з отриманням міченого полінуклеотиду При іп 5йи гібридизації умови, що використовуються для гібридизації полінуклеотиду, вказаного вище у пункті (а) чи (Б), і вищезгаданого біологічного зразка, можуть змінюватись в залежності від різних факторів, таких як довжина релевантного полінуклеотиду, однак одним із прикладів жорстких умов гібридизації є 0,2 х55С, 65 "С, а прикладом нежорстких умов гібридизації є 2,0 х55С, 50 "С. Слід зазначити, що умови гібридизації з таким самим ступенем суворості, як вищевказані умови, можуть бути

Зо досягнуті фахівцями в цій області техніки за допомогою відповідного вибору різних умов, таких як концентрація солі (ступінь розведення 555) і температура, а також концентрація поверхнево- активної речовини (МР-40 і т. д.), концентрація формаміду і рН. Наприклад, для загальних умов гібридизації для проведення скринінгу, забезпечують полінуклеотидні композиції, здатні до гібридизації в помірних-дуже жорстких умовах з полінуклеотидною послідовністю, наведеною в цьому документі, або її частиною, або її комплементарною послідовністю. Технології гібридизації є загальновідомимі в галузі молекулярної біології. Для ілюстративних цілей, відповідні помірно жорсткі умови для випробування гібридизації полінуклеотиду згідно з цим винаходу з іншими полінуклеотидами включають попереднє промивання в розчині 5Х 552, 0,596 505, 1,0 мМ ЕДТК (рн 8,0); гібридизацію при 50 70-60, 5Х 5552, протягом ночі; з подальшим дворазовим промиванням при 65 "С протягом 20 хвилин кожним з розчинів 2Х, 0,5

Х, 0,2 Х 5550, що містять 0,1 95 505. Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що жорсткість гібридизації можна легко регулювати, наприклад, зміною змісту солі в розчині гібридизації та/або температури, при якій проводять гібридизацію. Наприклад, в іншому варіанті реалізації відповідні жорсткі умови гібридизації включають умови, описані вище, за винятком підвищення температури гібридизації, наприклад, до 60-65 "С або 65-70 "С.

ІЇ00183| Приклади способів виявлення геномної ДНК, яка кодує химерний поліпептид

ЗІ С34А2-КО51, із застосуванням полінуклеотиду, вказаного вище у пункті (а) або (б), відмінні від вищевказаних способів іп 5йи гібридизації, являють собою Саузерн-блоттінг, нозерн-блоттінг і дот-блоттінг. У вказаних способах вищезгаданий химерний ген виявляють за допомогою гібридизації в помірних-дуже жорстких умовах поліпептиду, вказаного вище у пункті (а) або (Б), з мембраною, на якій транскрибован екстракт нуклеїнової кислоти, отриманий з вищевказаного біологічного зразка. При використанні полінуклеотида (а) може бути встановлено, що виявлена геномна ДНК, яка кодує химерний поліпептид 5І/СЗ4А2-КО51, якщо поліпептид, який гібридизується з полінуклеотидом, який кодує білок 5І С34А2, і поліпептид, який гібридизується з полінуклеотидом, який кодує білок КО51, розпізнають одну і ту ж смугу, що проявилася на мембрані.

І00184| Мікроматричний аналіз генома і мікроматричний аналіз ДНК являють собою додаткові способи виявлення геномної ДНК, яка кодує химерний поліпептид 5І С34А2-КОБІ, із застосуванням описаного вище полінуклеотиду за пунктом (Б). У вказаних способах матрицю бо полінуклеотидів з пунктом (Б) фіксують на підкладці, і релевантну геномну ДНК виявляють приведенням в контакт біологічного зразка з полінуклеотидами в матриці. При ПЛР або секвенуванні полінуклеотиди за пунктом (с), описаного нижче, можуть бути використані для специфічної ампліфікації частини або повного химерного полінуклеотиду 5ІС34А2-КОБІ1, із застосуванням ДНК (геномної ДНК, кКДНК) або РНК, отриманої з біологічного зразка у вигляді матриці. (с) Полінуклеотид, який являє собою пару праймерів, призначених для утворення скндвічевої структури з сайту злиття полінуклеотиду, що кодує білок 5І СЗ4А2, і полінуклеотиду, що кодує білок КО51. "Полінуклеотид, який являє собою пару праймерів" являє собою набір праймерів, з яких один праймер гібридизується з полінуклеотидом, що кодує білок 5І С34А2, а інший праймер гібридизується з полінуклеотидом, що кодує білок КОБ5І1, у послідовності основ, такий як вищезгаданий химерний полінуклеотид, який служить мішенню. Довжина вказаних полінуклеотидів зазвичай становить від 15 до 100 основ і переважно від 17 до 30 основ. 00185) З точки зору точності і чутливості виявлення методом ПЛР, полінуклеотид, вказаний в пункті (с) відповідно до цього винаходу, переважно являє собою послідовність, комплементарну послідовності основ вищевказаного химерного полінуклеотиду в межах 5000 основ від сайту злиття полінуклеотиду, що кодує білок 5І СЗ4А2, і полінуклеотиду, що кодує білок КО51. (00186) "Полінуклеотид, який являє собою пару праймерів" може бути відповідним чином спроектований за допомогою відомих технологій, заснованих на послідовності основ химерного полінуклеотиду 5 С34А2-КО51, який слугує мішенню. Переважні приклади "полінуклеотиду, який являє собою пару праймерів", являють собою набори праймерів, що складається з одного праймера, вибраного з групи, що складається з 5ІС34А2-НО51-Е1, 51 СЗ4Аг-іпі15-Е1,

ЗІ СЗ4Аг-іпі15-Е2, 5І С34А2-ех16-Е1, 5І СЗ4А2-ех23-Е1, 5І СЗ4А2-ех24-Е1, 5І СЗ4А2-Р-огі2438 і

ЗІ СЗ4Аг-іпі15-Е3.5, і одного праймера, вибраного з групи, що складається з 5І СЗ34А2-НО51-

ВТ, ВО51-іп11-А3, ВО51-іпі7-Н1, ВО51-іпі11-80.5, ВО51-іпі11-А1, ВО51-іпі7-К2 ії КО51-8- ог2364. Більш переважно, він являє собою 5І С34А2-2КО51-Е1 і 5І С34А2-НО51-81, 51 СЗ4А2- іп 5-Е1 ї 5І С34А2-НОБ1-81, 5І СЗ4А2-іп 5-22 ії КО51-іпи 1-83, 5І С34А2-ех16-Е1 і 5І С34А2-

ВО51-В81, 5І СЗ34А2-ех23-Е1 і 5І С34А2-8О51-К1, або праймер 51 С34А2-ех24-Е1 і праймер

ВО51-іп1і7-В1. 00187) У деяких варіантах реалізації цього винаходу представлені способи: ідентифікації, оцінки або виявлення злиття 5І С34А2-КОБ5І1; способи ідентифікації, визначення, оцінки та/або лікування суб'єкта, який страждає від раку, наприклад, раку, який має злиття 5І С34А2-НО51,

СОр74-КкоО51 або РІС-КО51; виділення молекул нуклеїнових кислот 5І С34А2-8О051, СО74-8О051 або РІС-КОБ5Б1, конструктів нуклеїнових кислот, клітин-хазяїв, що містять вказані молекули нуклеїнових кислот; очищених поліпептидів 5 С34А2-НО51, СО74-КО51 або РІС-КОБІ1 і зв'язуючих агентів; реагентів виявлення (наприклад, зондів, праймерів, антитіл, наборів, здатних, наприклад, до специфічного виявлення нуклеїнових кислот або білків 5 С34А2-8О51,

СО74-КО51 або РІС-КОБ1); аналізів скринінгу для ідентифікації молекул, які взаємодіють, наприклад, інгібують злиття 5'5І С34А2-3'В051, 5С074-3КО51 або 5'ЄІС-3'КО51, наприклад, нових інгібіторів кінази; а також аналізи та набори для визначення, ідентифікації, оцінки та/або лікування суб'єкта, який страждає від раку, наприклад, раку, який має одне або більше злиттів

ЗІ С34А2-8О051, СО74-КОБІ1 або РІС-КОБ1. Композиції і способи, які описані в цьому документі, можуть бути використані, наприклад, для ідентифікації нових інгібіторів 5 С34А2-НОБІ, СО074-

КО51 або РІС-КОБ1; для визначення, ідентифікації або вибору суб'єкта, наприклад, пацієнта, що страждає від раку; і для лікування або попередження раку.

ІЇ00188| Молекули нуклеїнових кислот 5І С34А2-НО51, СО074-КО51 і РІС-КОБІ1. В одному аспекті цей винахід відноситься до молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, виділеної або очищеної), яка містить фрагмент гена 5І С34А2, або СО74, або РІС і фрагмент протоонкогена

КО51. В одному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить злиття, наприклад, внутрішньорамочне злиття щонайменше одного екзона 5І С34А2, СО74 або РІС і екзона ВО5І1

БО (наприклад, одного або більше екзонів, які кодують домен тирозинкінази КО51 або його фрагмент).

І00189| В ілюстративному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти 5'5ІС34А2-

З'КО51 містить достатню послідовність 5 СЗ34А2 і достатню послідовність КО51, так що кодоване злиття 5'5ІС34А2-3'КМО51 має конститутивну активність кінази, наприклад, має підвищену активність, наприклад, активність кінази, порівняно з КО51 дикого типу, наприклад, у клітині раку, згаданого в цьому документі. В одному з варіантів реалізації злиття, кодоване 55І СЗ4А2-3'КО51 містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 або 11 екзонів з 5І СЗ4А2 і щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9,10, 11, 12 або 13 екзонів КО51. В одному з варіантів реалізації кодований химерний поліпептид 5'5ІС34А2-32О51 містить спіральний домен або його бо функціональний фрагмент і домен тирозинкінази КО51 або його функціональний фрагмент.

00190) В ілюстративному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти 5'ЄЮ74-3'ВО51 містить достатню послідовність СО74 і достатню послідовність КО51, так що кодоване злиття 5074-3051 має конститутивну активність кінази, наприклад, має підвищену активність, наприклад, активність кінази, порівняно з КО5І1 дикого типу, наприклад, у клітині раку, згаданого в цьому документі. В одному з варіантів реалізації кодоване злиття 5'Є074-3'КО51 містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6 екзонів з СЮО74 і щонайменше 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 9,10, 11, 12 або 13 екзонів КО51. В одному з варіантів реалізації кодований химерний поліпептид 52074-3'ВО51 містить спіральний; сигнально-якірний домен для ІІ типу мембранного білка або його функціональний фрагмент, і домен тирозинкінази КОБ51 або його функціональний фрагмент. 00191) В ілюстративному варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти 5'ЄЇ6-3'О51 містить достатню послідовність КО51 і достатню послідовність БІС, так що кодоване злиття

Б'РІЯ-3'КО51 має конститутивну активність кінази, наприклад, має підвищену активність, наприклад, активність кінази, порівняно з КО5І1 дикого типу, наприклад, у клітині раку, згаданого в цьому документі. В одному з варіантів реалізації кодоване злиття 5'ЄЇЗ-3'КО51 містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 екзонів з РІС і щонайменше 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 9,10, 11, 12 або 13 екзонів КО51. В одному з варіантів реалізації кодований химерний поліпептид 5'ЄЇ-3'ВО51 містить суперспіральний домен або його функціональний фрагмент і домен тирозинкінази КОБ1 або його функціональний фрагмент.

І00192) В одному з варіантів реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти 5І СЗ4А2-

КОЗ51 містить нуклеотидну послідовність, яка має внутрішньорамочне злиття екзона 2 і/або 4 5ІС34А2 з екзоном 32 та/або 34, талабо 35 КО51. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка містить точковий розрив.

Наприклад, злиття 5ІС34А2-КО51 може містити внутрішньорамочне злиття щонайменше екзона 4 5І С34А2 або його фрагмента (наприклад, екзонів 1-4 5І С34А2 або його фрагмента) з щонайменше екзоном 32 та/або 34 КО51 або його фрагментом (наприклад, екзони 30-43 ВО51 або його фрагменти). В деяких варіантах реалізації злиття 5ІС34А2-КО51 знаходиться в конфігурації від 5-5І С34А2 до 3-КО51. В одному з варіантів реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність екзонів 1-4 гена 5 С34А2 або його фрагмента. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність

Зо екзонів 30-43, наприклад, 32 та/або 34, та/л?або 35 гена КО51 або його фрагмента, або послідовність, по суті ідентичну їй. 00193) В одному з варіантів реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти СО74-ВО51 містить нуклеотидну послідовність, яка має внутрішньорамочне злиття екзонів 1-6 СО74 з екзоном 32 та/або 34 КОБ1. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка містить точковий розрив. Наприклад, злиття СЮО74-КОБІ1 може містити внутрішньорамочне злиття щонайменше екзона 6 СО74 або його фрагмента (наприклад, екзонів 1-6 СО74 або його фрагмента) з щонайменше екзоном 32 та/або 34, та/або 35 РО51 або його фрагментом (наприклад, екзони 30-43 КО51 або його фрагменти). У деяких варіантах реалізації злиття СО74-КОБІ1 знаходиться в конфігурації від 5'-СО74 до 3-КО51. В одному з варіантів реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність екзонів 1-6 гена СО74 або його фрагмента. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність екзонів 30-43, наприклад, 32 та/або 34, та/або 35 гена КО51 або його фрагмента, або послідовність, по суті ідентичну їй. 00194) В одному з варіантів реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти РІБ-НОБІ містить нуклеотидну послідовність, яка має внутрішньорамочне злиття екзонів 1-8, наприклад, 1-4 або 1-8 РІС з екзоном 32 та/або 34, та/або 35 КОБ1. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка містить точковий розрив.

Наприклад, злиття РІБ-КО5І1 може містити внутрішньорамочне злиття щонайменше екзона 4 та/лабо екзона 8 РІС або його фрагмента (наприклад, екзонів 1-4 або 1-8 РІС або його фрагмента) з щонайменше екзоном 32 та/або 34, тал"або 35 КО5ЗІ або його фрагмента (наприклад, екзони 30-43 КО51 або його фрагменти). У деяких варіантах реалізації злиття ГБІс-

КОБ51 знаходиться в конфігурації від 5-СО074 до 3-КО51. В одному з варіантів реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність екзонів 1-6 гена СЮО74 або його фрагмента. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність екзонів 30-43, наприклад, 32 та/або 34, та/або 35 гена КОБ51 або його фрагмента, або послідовність, по суті ідентичну їй. 00195) В інших варіантах реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти ЗІ С34А2-НОБІ містить нуклеотидну послідовність, що кодує химерний поліпептид 5. С34А2-КОБІ, який містить фрагмент гена 5ІС34А2 і фрагмент протоонкогена КО51. В одному з варіантів реалізації 60 нуклеотидна послідовність кодує химерний поліпептид 5І С34А2-КОБІ, який містить спіральний

Зо домен або його функціональний фрагмент і домен тирозинкінази КОБ51 або його функціональний фрагмент. 00196) В іншому варіанті реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти СО74-НОБІ1 містить злиття СО74-КОБ51, яке містить зчленування злиття між транскриптом КО51 і транскриптом СО74. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить злиття, наприклад, внутрішньорамочне злиття, щонайменше екзона 32, або 34 або 35 КОБ51 або його фрагмента (наприклад, екзони 30-43 КО51 або його фрагменти) і щонайменше екзона 1 або його фрагмента (наприклад, екзони 1-6 СО74 або його фрагменти). У деяких варіантах реалізації злиття СЮО74-КОБ1 знаходиться в конфігурації від 5-СО74 до 3-КОБ5Б1. В одному з варіантів реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотиди, відповідні екзонам 30-43 гена КОБ51, наприклад, екзонам 32, 34 або 35 або його фрагменту, або послідовність, по суті ідентичну їм.

І00197| В іншому варіанті реалізації молекула химерної нуклеїнової кислоти РІБ-НОБІ1 містить злиття БГІС-КОБ5І, яке містить зчленування злиття між транскриптом КО5І1 і транскриптом РІС. В іншому варіанті реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить злиття, наприклад, внутрішньорамочне злиття, щонайменше екзона 32, або 34 або 35 КОБ51 або його фрагмента (наприклад, екзони 30-43 КОБ1 або його фрагмента) і щонайменше екзона 4 або 8, або його фрагмента (наприклад, екзони 1-8 Біб або його фрагмента). У деяких варіантах реалізації злиття РІС-КОБ5І знаходиться в конфігурації від 5-БІбЗ до 3-КО51. В одному з варіантів реалізації молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотиди, відповідні екзонам 30-43 гена КОБ51, наприклад, екзонам 32, 34 або 35 або його фрагменту, або послідовність, по суті ідентичну їм.

І00198| У спорідненому аспекті даний винахід відноситься до конструктів нуклеїнової кислоти, які містять молекули химерних нуклеїнових кислот ЗІ С34А2-НО51, СО074-КО51 і РІС-

КО5БІ1, описані в цьому документі. У деяких варіантах реалізації молекули нуклеїнових кислот функціонально зв'язані з нативною або гетерологичною регуляторною послідовністю. Включені також вектори і клітини-хазяї, які містять молекули нуклеїнової кислоти 5І СЗ34А2-КОБІ1, описані в цьому документі, наприклад, вектори і клітини-хазяї, придатні для отримання молекул нуклеїнових кислот і поліпептидів, описаних у цьому документі.

Зо ІЇ00199| В іншому аспекті цей винахід відноситься до молекул нуклеїнових кислот, які знижують або інгібують експресію нуклеїнової кислоти, що кодує злиття 5І С34А2-КОБ1, як описано в цьому документі. Приклади таких молекул нуклеїнових кислот включають, наприклад, антисмислові молекули, рібозіми, РНКІ, потрійні спіральні молекули, які гібридизуються з нуклеїновою кислотою, що кодує ЗІ СЗ34А2-НО51, СО74-КОБІ1 і РІС-КО5І1 або транскрипційну регуляторну область 5ІС34А2-НО51, СО074-КО51 і РІС-КО5Б1, і блокують або знижують експресію МРНК 5І С34А2-НОБІ1, СО74-КОБЗІ1 або РІС-ВОБ1.

І00200| Цей винахід відноситься також до молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, до фрагмента нуклеїнової кислоти, придатному в якості зонда, праймера, затравки або бібліотечного елемента, який містить, фланкує, гібридизується з і підходить для ідентифікації або іншим чином заснований на злиттях КОБ1, описаних у цьому документі. У деяких варіантах реалізації зонд, праймер або затравкова молекула являє собою олігонуклеотид, що забезпечує можливість захоплення, виявлення або виділення молекули химерної нуклеїнової кислоти

ВОЗ5І, описаної в цьому документі. Олігонуклеотид може містити нуклеотидну послідовність, по суті комплементарну фрагменту молекул химерних нуклеїнових кислот КО51, описаних у цьому документі. Ідентичність послідовностей між фрагментом нуклеїнової кислоти, наприклад, олігонуклеотидом, і цільової послідовністю злиття КО51 не обов'язково повинна бути точною, за умови, що вказані послідовності досить комплементарні для забезпечення можливості захоплення, виявлення або виділення цільової послідовності. В одному з варіантів реалізації фрагмент нуклеїнової кислоти являє собою зонд або праймер, який містить олігонуклеотид довжиною від близько 5 до 25, наприклад, від 10 до 20 або від 10 до 15 нуклеотидів. В інших варіантах реалізації фрагмент нуклеїнової кислоти являє собою затравку, яка містить олігонуклеотид довжиною від близько 100 до 300 нуклеотидів, від 130 до 230 нуклеотидів, від 150 до 200 нуклеотидів, від 200 до 350, від 350 до 950, від 300 до 600, від 500 до 1000, від 750 до 2000 нуклеотидів, і не обов'язково містить химерні нуклеїнові кислоти РО51.

ІЇ00201| В одному з варіантів реалізації фрагмент нуклеїнової кислоти може бути використаний для ідентифікації або захоплення, наприклад, за допомогою гібридизації, злиття

ЗІ С34А2-КО51 або злиття СО74-КО5І1, або злиття РІС-КО5ЗІ1. В ілюстративному прикладі фрагмент нуклеїнової кислоти може являти собою зонд, праймер для застосування при ідентифікації або захопленні, наприклад, за допомогою гібридизації в помірних-дуже жорстких 60 умовах, злиття 5ІС34А2-КО51 або злиття СО74-КОБ51, або злиття БІС-КО5Б1, описаного в цьому документі. В одному з варіантів реалізації фрагмент нуклеїнової кислоти може бути використаний для ідентифікації або захоплення точкового розриву 5І С34А2-КО51 або СО74-

КОБ51, або РІС-КО51. В одному ілюстративному варіанті реалізації фрагмент нуклеїнової килсоти гібридизується з нуклеотидною послідовністю в межах хромосомної перебудови, яка призводить до внутрішньорамочного злиття екзона 4 або 13 5І СЗ4А2 з екзоном 32, 34 або 35

КО51 (наприклад, послідовність у межах транслокації на 6 хромосомі).

І00202| Зонди або праймери, описані в цьому документі, можуть бути використані, наприклад, для РІЗН виявлення або ПЛР-ампліфікації, або для підтвердження за допомогою

ЗТ-ПЛР перебудов КО5Б1 та ідентифікації партнерів по зв'язуванню. В одному ілюстративному варіанті реалізації в якому виявлення засноване на ПЛР, ампліфікація зчленувань злиття

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КОБ5БІ1 може бути здійснена за допомогою праймера або пари праймерів, наприклад, для ампліфікації послідовності, яка фланкує зчленування злиття 5І С34А2-КО51 або СО74-КОБ1, або РІС-КОБІ, описані в цьому документі, наприклад, мутації або зчленування хромосомної перебудови, описаної в цьому документі. В одному з варіантів реалізації пара виділених олігонуклеотидних праймерів може ампліфікувати область, що містить або розташована поруч з положенням злиття 5І С34А2-КОБ51. Наприклад, прямі праймери можуть бути призначені для гібридизації з нуклеотидною послідовністю в межах геномної або мРНК послідовності 5ЇС34А2, СО74 або РІС. В різних варіантах реалізації праймери до КО51, 5І С34А2 і РІС (різні види, включаючи людину) є у продажу у компанії

Оіадеп (кат. Мо ОРО018545, ОРО0449078 і ОБ00278992 Оіадеп, Гейтерсберг, штат Меріленд,

США). В інших варіантах реалізації підтвердження наявності химерних полінуклеотидів КО51 може бути проведено на зразках пухлини пацієнта із застосуванням панелі праймерів ПЛР, що містить прямі праймери екзона 4 51 С34А?2 і екзона 6 СО74, спарені зі зворотними праймерами екзона 32 і екзона 34 КО51. РНК зразка з пухлини може бути витягнута з тканини ЕЕРЕ за способом Адепсоигі Еогтариге (Адепсошгі Віозсіепсе5, Беверлі, штат Массачусетс, США) і зворотньотранскрибирована за допомогою набору для синтезу кКДНК 5Зирегзогірі ІЇЇ, наявного в продажу у компанії Іпмігодеп, Карлобад, Каліфорнія, США. Для визначення точкових розривів

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КОБ51 можуть бути використані наступні праймери: 5І С34А2 екзон 4, пряма послідовність ТСОСАТТТСТСТАСТТТТТСОТО (5ЕО ІОЮО МО:3); СО74 екзон 6, зворотна

Зо послідовність СТОСТОТТТОАААТОАОоСАсОо (5БО ІЮ МО:4); КОБ5І1 екзон 32, зворотна послідовність сОААТОССТОСТТТАТТТОос (5БО ІО МО:5); і КОБ5І екзон 34, зворотна послідовність ТОДААСТТОТТТСТОСТАТССАА (ЗЕО ІЮ МО:6). ПЛР-ампліфікації можуть бути здійснені в будь-якому термоциклері ПЛР, наприклад, Еррепаогі Мабвіегсусієг Сгадієпі (Еррепаогї, Гамбург, Німеччина), із застосуванням Тад-полімерази Ріаїйпит (Іпмйгодеп) у стандартних умовах з 40 нг КДНК. кКДНК прослідковували за допомогою набору ВідОуе 3.0 Кі (Сіте Тесппоіодіє5, Карлобад, Каліфорнія). 00203 Фрагмент нуклеїнової кислоти може бути видимий чином позначений, наприклад, радіоактивною міткою, флуоресцентною міткою, біолюмінесцентною міткою, хемолюмінесцентною міткою, ферментною міткою, міткою, яка зв'язує пари або може містити афінну мітку; або міткою, або ідентифікатором (наприклад, адаптором, штрихкодом або іншим ідентифікатором послідовності). (00204) В іншому ілюстративному варіанті реалізації спосіб визначення наявності злиття

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КОБ1, або РІС-КО5І1 включає: безпосереднє одержання інформації про наявність молекули химерної нуклеїнової кислоти або поліпептиду 5ІС34А2-КО51 або

СбО74-КО51, або РІС-КО5І1 в зразку, отриманому від суб'єкта. Зразок може являти собою зразок, що складається з рідини, клітин, тканин, наприклад, пухлинної тканини, він може містити зразок нуклеїнової кислоти, зразок білка, біопсію пухлини або циркулюючу пухлинну клітину або нуклеїнову кислоту, він може бути вибраний з раку легень, включаючи НДРЛ, СІ С, СС або їх комбінацію, і аденокарценому або меланому. 00205) Спосіб виявлення злиття 5І С34А2-КОЗІ1 або СО74-КОБІ1, або РІС-КОЗБІ1 в молекулі нуклеїнової кислоти за допомогою будь-якого з наступних способів: аналіз гібридизації нуклеїнової кислоти, аналізи на основі ампліфікації, аналіз ПЛР-ПДРФ, ЗТ-ПЛР, секвенування, скринінговий аналіз, РІЗН, спектральне каріотипування або МРЇІЗН, порівняльна геномна гібридизація), іп 5йи гібридизація, БОР, ВЕРХ або мас-спектрометричні генотипування.

І00206| Описаний спосіб виявлення химерного поліпептиду або білка ЗІ С34А2-КОБ51 або

СО74-КО51, або РІС-КО51, що включає приведення в контакт зразка білка з реагентом, який специфічно зв'язується з химерним поліпептидом 5ІС34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-

КО51; і виявлення утворення комплексу химерного поліпептиду 5 С34А2-КО51 або СО74-

КО51, або РІС-КО51 вказаного реагенту. Способи виявлення поліпептиду включають 60 застосування реагенту, міченого виявленою групою, для полегшення виявлення зв'язаного і незв'язаного реагенту, причому реагент являє собою молекулу антитіла, при цьому рівень або активність злиття 5ІС34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51 підвищена, де злиття

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО5І виявляють до початку, під час або після лікування суб'єкта, при цьому злиття 5І С34А2-КО51 або СО74-КОБІ1, або РІС-КОБ51 виявляють під час діагностики раку, при цьому злиття 5ІС34А2-КО5І1 або СО74-КОБІ1, або РІС-НОБІ1 виявляють у певному інтервалі, наприклад, у першій точці часу і щонайменше в одній подальшої точці часу.

І00207| Включені також реакції на лікування, зокрема в яких використано сприйнятливий до виявлення наявності злиття 5І С34А2-КО051 або СО74-КОБ1, або РІС-БО51 один або більше з наступних елементів: (1) поділ групи пацієнтів; (2) ідентифікація або вибір суб'єкта який ймовірно або малоймовірно відповідає на лікування; (3) вибір варіанта лікування; та/або (4) прогнозування часової динаміки захворювання у суб'єкта. (00208) Виділена або очищена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злиття 5І С34А2-

КОБ51 або СО74-КОБ51, або РІС-КОБ51 або його фрагмент, що містить точковий розрив, може бути використаний з метою підтвердження і прямого специфічного лікування позитивного по злиттю КОБ51 раку НДРЛ і аденокарциноми легень із застосуванням сполук згідно 3 цим винаходом. Інші конструкти можуть бути використані для прямого специфічного лікування раку, позитивного по злиттю КОБ51, наприклад, НДРЛ з перебудованим КО5БІ1, включаючи: виділену або очищену молекулу химерної нуклеїнової кислоти 5 С34А2-КО51 або СО74-КОБІ1, або РІС-

КО51, функціонально зв'язану з нативною або гетерологичною регуляторної послідовністю.

Виділений або очищений вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує злиття

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51, або його точковий фрагмент, що містить точковий розрив. Клітину-хазяїна, що містить вектор. Молекулу нуклеїнової кислоти, яка специфічно знижує або інгібує експресію молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злиття

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51, яка може бути обрана з антисмислової молекули, рібозима, міРНК або потрійної спіральної молекули. Виділений або очищений химерний поліпептид 5. С34А2-КО51 або СО74-КОБ1, або РІС-КОБ1, або його фрагмент, що містить точковий розрив. Виділений або очищений химерний поліпептид 5І/С34А2-КОБ51 або

СО74-КО51, або РІС-КОБ1, який має активність кінази КОБ1 та/або активність дімерізації або

Зо мультимерізації. Виділену або очищену молекулу антитіла, що специфічно зв'язується з химерним поліпептидом 5ІС34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51. Молекулу антитіла, причому вказана молекула антитіла являє собою молекулу моноспецифічного антитіла до химерного поліпептиду 5І С34А2-КО51 або СЮО74-КОБІ1, або РІС-НОБ1.

І00209| Приклади способу виявлення продукту трансляції химерного полінуклеотиду

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КОБ5І1 згідно з цим винаходом являють собою імунофарбування, вестерн-блоттінг, твердофазний імуноферментний аналіз, проточну цитометрию, імунопреципітацію та матричний аналіз антитіл. У вказаних способах використовують антитіло, яке зв'язується з химерним поліпептидом 5ІС34А2-КО51 або СО74-

КОБ51, або РІШС-8О51. Приклади такого антитіла являють собою антитіло, специфічне до поліпептиду, який містить сайт злиття білка 5І С34А2 або СО74, або РІС і білок РО51 (тут і далі також згадується як специфічне до сайту злиття антитіло"), антитіло, яке зв'язується з поліпептидом, що складається з області С-кінцевій частині від вищезгаданого сайту злиття білка

КОБ51 (тут і далі також зветься "КО51-С кінцеве антитіло") і антитіло, яке зв'язується з поліпептидом, що складається з області на М-кінцевій частині від вищезгаданого сайту злиття білка 5І С34А2 або СО74, або РІС (тут і далі також згадується як 5І С34А2 або СО74, або БІС-М кінцеве антитіло"). У цьому контексті "специфічне до сайту злиття антитіло" означає антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить вищевказаний сайт злиття, але не зв'язується ні з білком 5І С34А2 або СО74, або РІС дикого типу (нормального типу), ні з білком

КО5Б1 дикого типу (нормального типу).

І00210| Химерний поліпептид 5І С34А2-КО51 або СО74-КОБІ1, або РІС-КО51 може бути виявлений за допомогою вищезгаданого специфічного до сайту злиття антитіла або комбінації вищевказаного КО51-С термінального антитіла і 5І С34А2 або СО74, або РІС-М термінального антитіла. Однак оскільки в нормальних клітинах легень, наприклад, практично не виявляють експресію білка КОБ51, то наявність химерного поліпептиду 5 С34А2-КО51 або СО74-НОБ51, або РІС-КО5І1 в тканині аденокарциноми легень може бути виявлено навіть при використанні тільки КО51-С термінального антитіла при иммунофарбуванні. 00211) У різних варіантах реалізації застосування імуногістохімічного фарбування (ІНС) та вестерн-блот для ідентифікації химерних поліпептидів КОБ5І1 згідно з цим винаходом може бути здійснено із застосуванням фосфоро-КОБІ1, антитіл КО51, наявних у продажу у компанії СеїЇ бо зЗідпаїпу Тесппоїоду (Денверс, штат Массачусетс, США). В одному з варіантів реалізації ідентифікація позитивних по злиттю КО5І1 ракових клітин, наприклад, клітин раку легень НДРЛ з перебудовою КОБІ, може бути здійснена за допомогою кролячого анти-КО51 моноклонального антитіла 0406, кат. Мо 3287 (СеїІ Бідпаїїпуд ТесппоЇоду, Денверс, штат Массачусетс, США). (00212) В деяких варіантах реалізації "антитіло, яке зв'язується з химерним поліпептидом

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КОБІ1, або РІС-КО51", може бути отримано фахівцем у цій області техніки, що вибрали відповідний відомий спосіб. Приклад таких відомих способів являє собою спосіб, в якому імунну тварину інокулюють вищевказаним поліпептидом, що складається з С- кінцевої частині білка КО51, химерним поліпептидом 5. С34А2-КОБ51 або СО74-ВО51, або РІС-

КО51, вищезгаданий пептид складається з М-кінцевої частині білка 5І С34А2 або СО74, або РІС і т.д., активуючи тим самим імунну систему тварини, а потім виділяють сироватку (поліклональне антитіло) крові тварини, і використовують способи отримання моноклональних антитіл, такі як метод гібридоми, метод рекомбінантної ДНК і метод фагового дисплею. При використанні антитіла, з яким зв'язується мічена сполука, цільовий білок може бути безпосередньо виявлений за допомогою виявлення вказаної мітки. Мічена сполука не має певного обмеження, за умови, що вона може зв'язуватися з антитілом і може бути виявлена.

Приклади включають пероксидазу, В-ЮО-галактозидазу, мікропероксидазу, пероксидазу хрону (НЕР), флуоресцеїну ізотіоціанат (РІТС), родаміну ізотіоціанат (КІТС), лужну фосфатазу, біотин і радіоактивні сполуки. Крім того, крім способів, які забезпечують пряме виявлення цільового білка з застосуванням антитіла, з яким зв'язується мічена сполука, можуть бути використані також способи, які забезпечують непряме виявлення цільового білка із застосуванням білка б, білка А або вторинного антитіла, з яким зв'язується мічене антитіло.

І00213| При виявленні химерного полінуклеотиду або поліпептиду 5 С34А2-КО51 або

СО74-КО51, або РІС-КО51 у зразку, виділеній з організму суб'єкта вищезгаданими способами, вважають, що ефективність лікування раку із застосуванням інгібіторів тирозинкінази КОБ1, такого як сполука Формули І, Іа або сполука 1, або її фармацевтично прийнятної солі, буде найвищим у такого пацієнта, тоді як при відсутності виявлення наявності химерного полінуклеотиду 5. С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51 вважають, що ефективність лікування раку інгібітором тирозинкінази КО5І1 буде низькою у вказаного пацієнта. (00214) Як описано вище, будь-який з полінуклеотидів, вказаних нижче у пунктах (а)-(с), що

Зо має довжину ланцюга щонайменше 15 основ, може бути переважно використаний для виявлення наявності або відсутності химерного полінуклеотиду 5ІС34А2-КО51 або СО74-

КОЗ51, або РІБ-НОБІ; (а) полінуклеотид, який являє собою щонайменше один зонд, обраний із групи, що складається з зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок 5І С34А2 або сО74, або РІС і зондів, які гібридизуються з полінуклеотидом, який кодує білок КО51 (Б) полінуклеотид, який являє собою зонд, що сгибридизується з сайтом злиття полінуклеотиду, який кодує білок 5І С34А2 або СО74, або РІС, і полінуклеотиду, що кодує білок

ВО51; (с) полінуклеотид, який являє собою пару праймерів, призначених для утворення сендвічевої структури з сайту злиття полінуклеотиду, що кодує білок 5І С34А2 або СО74, або

РІС, і полінуклеотиду, що кодує білок КО5І1;

І00215| Вказані полінуклеотиди мають послідовність основ, комплементарну певній послідовності днк гена-мішені. У цьому контексті "комплементарний" може означати не повністю комплементарний, за умови, що він гібридизується, наприклад, у помірних-дуже жорстких умовах. Наприклад, вказані поліпептиди мають 80 95 або більше, переважно 90 95 або більше, більш переважно 9595 або більше, і найбільш переважно 10095 гомології з певною послідовністю основ. 00216) У полінуклеотидах (а)-(с), у частини або повної ДНК або РНК нуклеотиди можуть бути заміщені штучними нуклеїновими кислотами, такими як ПНК (поліамідна нуклеїнова кислота, пептидна нуклеїнова кислота), ЗНК (торгова марка, замкнута нуклеїнова кислота, місткова нуклеїнова кислота), ЕНК (торгова марка, 2-0, 4-б-етилен-місткові нуклеїнові кислоти), ГНК (гліцериннуклеїнова кислота) і ТНК (треозонуклеїнова кислота).

І00217| Крім того, як описано вище, антитіло, яке зв'язується з химерним поліпептидом

ЗІ С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51, переважно використовують при виявленні продукту трансляції химерного полінуклеотиду ЗІ С34А2-КОЗІ1 або СЮО74-КОБ1, або РІС-ВО51.

Відповідно, у цьому винаході представлено лікарський засоб для визначення ефективності лікування раку інгібітором тирозинкінази КОБ51, що містять вказане антитіло. (00218) Спосіб виявлення химерного гена згідно з цим винаходом включає стадію виявлення наявності полінуклеотидів згідно з цим описом у зразку, отриманому від випробуваного суб'єкта. бо В якості зразка, отриманого від випробуваного суб'єкта, використовують речовини, отримані від випробуваного суб'єкта (зразки, виділені з живого організму), зокрема, збирають будь-які типи рідини організму (переважно кров) альвеолярні і бронхіальні змиви, зразки, які піддавали біопсії та зразки флегми. Переважно використовують біопсійний зразок або зразок флегми з ураженої області легень випробуваного суб'єкта. Із зразка може бути виділена використана геномна ДНК.

Крім того, можуть бути використані її транскрипти (продукти, одержані в результаті транскрипції і трансляції геному; наприклад, мРНК, кДНК і білки). Зокрема, бажано отримувати і використовувати мРНК або кДНнК.

І00219| Геномна ДНК може бути виділена відомими методами, і виділення може бути легко здійснено за допомогою наявного в продажу набори для виділення ДНК. (00220) Стадія виявлення може бути здійснена у відповідності з відомими методами аналізу гена (наприклад, відомими методами, які зазвичай використовують у якості методів виявлення генів, такими як ПЛР, ЛЛР (лігазна ланцюгова реакція), ОА (ампліфікація з заміщенням ланцюгів), МАЗВА (ампліфікація на основі послідовності нуклеїнової кислоти), ІСАМ (ізотермічна ампліфікація нуклеїнової кислоти, яка ініціюється химерним праймером), метод ГАМР (пітльова ізотермічна ампліфікація), метод ТМА (система транскрипційно опосередкованої ампліфікації

Сеп-Ргобе), метод іп 5йи гібридизації і мікроматричні аналізи. Наприклад, використовують технологію гібридизації, в якій в якості зонда використовують нуклеїнову кислоту, гібридизовану з полінуклеотидом, що підлягають виявленню, використовують технологію генної ампліфікації, в якій в якості праймера використовують ДНК, гібридизовану з полінуклеотидом, що підлягають виявленню, або такі способи. (00221) Зокрема, виявлення проводять із застосуванням нуклеїнових кислот, отриманих зі зразка, отриманого від випробуваного суб'єкта, наприклад, мРНК і т. п. Кількість мРНК вимірюють методом реакції генної ампліфікації з використанням праймерів, призначених для специфічної ампліфікації послідовності полінуклеотиду, що підлягає виявленню. Праймери, використані в способі виявлення згідно з цим винаходом, або праймери, включені в набір для виявлення, не мають певного обмеження, за умови, що вказані праймери можуть специфічно ампліфікувати послідовність полінуклеотиду, що підлягає виявленню, і сконструйовані на основі послідовності основ полінуклеотиду, що підлягає виявленню. Праймери, які використовуються в методі моніторингу ампліфікації ПЛР, можуть бути спроектовані за допомогою програмного

Зо забезпечення для конструювання праймерів (наприклад, Ргітег Ехрге55 виробництва компанії

РЕ Віозувзіет»5) і т. п. Крім того, оскільки чим більше розмір продукту ПЛР, тим сильніше погіршується ефективність ампліфікації, необхідно конструювати смисловий праймер і антисмисловий праймер так, щоб розмір продуктів ампліфікації, одержаних при ампліфікації

МРНК або кДНК, був менше 1 килобаз або менше. (00222| Більш конкретно, смисловий праймер (5'-праймер) конструюють з частини, що кодує

ЗІ С34А2, а антисмисловий праймер (3'-'праймер) конструюють з частини, що кодує КО5Б1.

Переважно використовувати праймер, що входить в набір для виявлення згідно з цим винаходом, і більш бажано використовувати найбільш прийнятний праймер, що входить в набір для виявлення. У методі моніторингу ампліфікації ПЛР може бути сконструйована мультиплексна ПЛР для виявлення всіх химерних полінуклеотидів в одній реакційної рідини за допомогою змішування вищевказаних смислових праймерів, які відповідають відповідним генам. За допомогою методу, придатного для кожної технології ампліфікації може бути підтверджений факт наявності або відсутності ампліфікації гена-мішені (всього гена або його певної частини). Наприклад, в методі ПЛР продукти ПЛР аналізують електрофорезом в агарозному гелі і піддають фарбуванню бромідом етидію, тощо, що забезпечує можливість підтвердження отримання чи не отримання ампліфікованих фрагментів, що мають необхідний розмір. Отримання ампліфікованих фрагментів, що мають необхідний розмір, вказує на те, що полінуклеотид, що підлягає виявленню, присутній в зразку, отриманому від випробуваного суб'єкта. Таким чином, може бути виявлено наявність полінуклеотиду, що підлягає виявленню. 00223) Спосіб виявлення химерного гена згідно з цим винаходом переважно включає стадію виявлення наявності певного полінуклеотиду в зразку, отриманому від випробуваного суб'єкта, за допомогою реакції ампліфікації гена, і стадію виявлення отримання чи не отримання ампліфікованих фрагментів, що мають необхідний розмір. (00224) Виявлення із застосуванням технології гібридизації проводять із застосуванням, наприклад, нозерн-гібридизації, методу дот-блот, методу мікроматриць ДНК і методу захисту

РНК. В якості зондів, використованих для гібридизації, може бути використаний зонд, який містить послідовності, що складаються з 16 основ, відповідно, проти ходу і по ходу транскрипції від точки злиття як центру молекули нуклеїнової кислоти, яка складається з щонайменше 32 послідовних основ, які гібридизуються з полінуклеотидом, що підлягають виявленню, або з його 60 комплементарною спіраллю у помірних-дуже жорстких умовах (переважно в дуже жорстких умовах), або містить їх комплементарні спіралі. (00225) Також може бути використана технологія ампліфікації гена, така як ЗТ-ПЛР. У методі

ЗТ-ПЛР метод моніторингу ампліфікації ПЛР (ПЛР в реальному часі) здійснюють під час процесу ампліфікації гена, тому наявність полінуклеотиду, що підлягає виявленню, може бути проаналізовано кількісно. Можуть бути використані методи моніторингу ампліфікації ПЛР. ПЛР у реальному часі являє собою відомий метод, і він може бути легко реалізований із застосуванням наявних у продажу і наборів інструментів для вказаного методу.

І00226| Спосіб виявлення химерного білка згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу включає стадію виявлення наявності певного поліпептиду в зразку, отриманому від випробуваного суб'єкта, тобто поліпептиду, кодованого полінуклеотидом, що підлягає виявленню (тут і далі званого поліпептидом, що підлягає виявленню). Така стадія виявлення може бути здійснена методом імунологічного аналізу або методом аналізу ферментної активності, який проводять за допомогою отримання солюбілізованої рідини, отриманої зі зразка, отриманого у випробуваного суб'єкта (наприклад, ракової тканин або клітин, отриманих від випробуваного суб'єкта), і змішування поліпептиду, що підлягає виявленню, що міститься у вказаній рідини, з антитілом анти-5І С34А2 або анти-СО74, або анти-РІ|С і антитілом анти-КО51.

Переважно, можуть бути використані технології із застосуванням моноклонального антитіла або поліклонального антитіла, специфічного до поліпептиду, що підлягає виявленню, такі як метод ферментативного імуноанализа, імуноферментний сендвічевий метод подвійних антитіл, метод флуоресцентного імуноанализа, радіоїмунологічний метод і метод вестерн-блот.

І(00227| При виявленні полінуклеотиду, що підлягає виявленню, або поліпептидів, що підлягає виявленню, способом виявлення згідно з цим винаходом у зразку, отриманому від випробуваного суб'єкта, випробуваний суб'єкт являє собою суб'єкт (пацієнта), що має рак, позитивний до вказаного нуклеотиду, і підлягає лікуванню із застосуванням інгібіторів КОБ51. (00228) Набір для виявлення згідно з цим винаходом містить щонайменше смисловий і антисмисловий праймери, які сконструйовані для специфічної ампліфікації полінуклеотиду, що підлягає виявленню, у способі виявлення відповідно до цього винаходу. Набір смислового і антисмислового праймера являє собою набір полінуклеотидів, діючих як праймери для ампліфікації полінуклеотиду, що підлягає виявленню.

Зо 00229) В одному з варіантів реалізації набір праймерів відповідно до цього винаходу для виявлення химерного гена містить (1) набір праймерів, який містить смисловий праймер, сконструйований з частини, що кодує 5І С34А2 або СО74, або РІС, і антисмисловий праймер, сконструйований з частини, що кодує КО51, і призначений для виявлення химерного гена 5ІС34А2 або СО74, або РІС і гена КО51, причому антисмисловий праймер складається з молекули нуклеїнової кислоти (переважно молекули нуклеїнової кислоти, що складається з щонайменше 16 основ), яка гібридизується з "полінуклеотидом, що підлягають виявленню" у помірних-дуже жорстких умовах (переважно в дуже жорстких умовах), а смисловий праймер складається з молекули нуклеїнової кислоти (переважно молекули нуклеїнової кислоти, яка складається з щонайменше 16 основ), яка гібридизуюється з комплементарною спіраллю "полінуклеотиду, що підлягає виявленню" в жорстких умовах (переважно в дуже жорстких умовах). 00230) Такі набори праймерів (2) і (3) включені в набір праймерів як більш конкретні варіанти набору праймерів (1). (00231) (2) Набір праймерів зі смислового праймера, який складається з олігонуклеотиду, що складається з щонайменше будь-яких 16 послідовних основ. (002321) (3) Набір праймерів зі смислового праймера, який складається з олігонуклеотиду, що складається з щонайменше будь-яких 16 послідовних основ. 00233) У вказаних наборах праймерів (1)-(3) інтервал між положеннями, в яких вибирають смисловий праймер і антисмисловий праймер, переважно становить 1 кілобаз або менше, або розмір продукту ампліфікації, ампліфікованого смисловим праймером і антисмисловим праймером, переважно становить 1 кілобаз або менше.

І00234| Крім того, праймер має довжину спіралі, що складає, в цілому, з 15-40 основ, переважно складається з 16-24 овнов, більш переважно складається з 18-24 овнов і особливо переважно складається з 20-24 овнов.

І00235| Набір праймерів може бути використаний для ампліфікації та виявлення полінуклеотиду, що підлягає виявленню. Крім того, незважаючи на відсутність конкретного обмеження, відповідні праймери, включені в набір праймерів згідно з цим винаходом, можуть бути отримані, наприклад, хімічним синтезом. (00236) Ілюстративні праймери КОБ51, 5І С34А2 або СО74, здатні до виявлення химерних 60 полінуклеотидів КОБ51, представлені в таблиці 2.

Таблиця 2

Ілюстративний набір праймерів для ідентифікації різних химерних білків ВО51 у відповідності з цим винаходом.

І00237| Спосіб відбору протиракового лікарського засобу включає: приведення в контакт досліджуваної сполуки з клітиною, яка експресує химерний білок; і вимірювання рівня експресії химерного білка в клітині, і якщо рівень експресії химерного білка в клітині, обробленої досліджуваною сполукою, знижений у порівнянні з рівнем до обробки досліджуваних сполук або рівнем у необробленій клітині, досліджувану сполуку визначають як потенційну сполуку для протиракового лікарського засобу. (00238) Спосіб відбору протиракового лікарського засобу може додатково включати стадію вимірювання рівня експресії химерного білка в клітині до обробки досліджуваною сполукою. В цьому випадку досліджувана сполука може бути визначена як потенційна сполука для протиракового лікарського засобу, якщо рівень експресії химерного білка після обробки досліджуваною сполукою є зниженим у порівнянні з рівнем до обробки досліджуваною сполукою в тій самій клітині. В альтернативному варіанті спосіб відбору протиракового лікарського засобу може включати отримання клітин, що експресують химерний білок, і приведення в контакт досліджуваної сполуки з частиною отриманих клітин. В цьому випадку досліджувана сполука може бути визначена як потенційна сполука для протиракового лікарського заосбу, якщо рівень експресії химерного білка в клітині, приведеною в контакт з досліджуваною сполукою є зниженим порівняно з рівнем у клітинах, які не були приведені в контакт з досліджуваною сполукою. 002391 Клітина, яка використовується у відбірковому способі, може являти собою клітину, отриману з ракової клітини, де експресується та/або активується химерний ген або химерний білок, екстракт вказаної клітини або культуру вказаної клітини. Ракова клітина може являти собою клітку солідного раку, зокрема, раку легень, наприклад, недрібноклітинного раку легень, такого як аденокарцинома легень, як описано вище.

І00240| В іншому варіанті реалізації представлений спосіб відбору протиракового лікарського засобу проти раку легень, що включає: обробку клітини, яка експресує химерний білок, досліджуваною сполукою; вимірювання рівня експресії химерного білка в клітині, і якщо рівень експресії химерного білка в клітині, обробленої досліджуваною сполукою, є зниженим у

Зо порівнянні з рівнем до обробки досліджуваною сполукою або з рівнем необробленої клітини, то досліджувану сполуку визначають як потенційну сполуку для протиракового лікарського засобу проти раку легень. (00241) Химерні білки КО5І1 (тобто 5І С34А2-НОБІ, СО74-КОБІ і РІС-КОБІ1) можуть бути використані в якості маркера для діагностики раку легень або для лікування або попередження, або лікування раку легень. Лікування або попередження раку легень включає стадію введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості щонайменше одного інгібітора проти химерного білка, щонайменше одного інгібітора проти химерного гена, що кодує химерний білок, щонайменше одного інгібітора проти гена, що кодує КОБ5БІ1, або їх комбінації.

Інгібітор може являти собою сполуку Формули І, їа або сполуку 1, або її фармацевтично прийнятну сіль. (00242) В іншому варіанті реалізації представлений спосіб попередження та/або лікування раку, що включає введення пацієнту, який потребує цього, фармацевтично (терапевтично)

ефективної кількості щонайменше одного інгібітора проти химерного білка, щонайменше одного інгібітора проти химерного гена, що кодує химерний білок, щонайменше одного інгібітора проти гена, що кодує КОБІ, або їх комбінації, кожний з яких може являти собою солуку Формули 1 та інші конкретні сполуки, описані в цьому документі. Вказаний спосіб може додатково включати стадію ідентифікації пацієнта, що потребує у попередженні та/або лікуванні раку, до стадії введення такого лікування. Лікування або попередження раку легень включає стадію введення пацієнту, який потребує цього, терапевтично ефективного кількості щонайменше одного інгібітора проти химерного білка, щонайменше одного інгібітора проти химерного гена, що кодує химерний білок, щонайменше одного інгібітора проти гена, що кодує КО5БІ, або їх комбінації. В іншому варіанті реалізації представлено застосування інгібітора проти химерного білка, інгібітора проти химерного гена, що кодує химерний білок, інгібітора проти гена, що кодує РО51, або їх комбінації для попередження та/або лікування раку. Інгібітор може являти собою сполуку

Формули І, Іа або сполуку 1, або її фармацевтично прийнятну сіль. (00243) У цьому винаході рак може являти собою рак легень, зокрема, дрібноклітинний рак легень (ДРЛ) або недрібноклітинний рак легень (НДРЛ), такий як аденокарцинома легень, плоскоклітинна карцинома легень або крупноклеточная карцинома легень. (00244) Композиція, в якій інгібітор проти химерного білка КО5І1 являє собою щонайменше один елемент, вибраний із групи, що складається з аптамеру, який специфічно зв'язується з химерним білком антитіла, специфічно зв'язується з химерним білком, і інгібітора проти химерного гена або гена, що кодує КОБ51, являє собою щонайменше одну, вибрану з групи, яка складається з міРНК, кшРНК, мікроРНК і аптамеру, які здатні специфічно зв'язуватися з химерним геном або геном, який кодує КО51. (00245) Будь-який інгібітор кінази КО51, який інгібує експресію КО51 та/або активність кінази КО5І1 (наприклад, транскрипцію, трансляцію або стабільність), може бути використаний окремо або в комбінації зі сполукою Формули І, їа або сполукою 1, або її фармацевтично прийнятною сіллю. (00246) Такий інгібуючий агент може бути КО51-специфічним або може бути неспецифічним (наприклад, неспецифічні інгібітори кінази, багатоцільові інгібітори). Розроблено кілька інгібіторів кінази КО51, і в цей час проводиться вивчення їх клінічного застосування. Від

Зо активності кінази КО51 залежать наступні кінази, такі як фосфатидилінозитол-3-кінази (РІЗК) і позаклітинні сигнальні кінази 1/2 (ЕКК) (//хіеа УН еїа!. У Віої Спет 2011), и 5ТАТЗ (Нмапа УН єї аІ. Мої Епдостіпої 2003; 17: 1155-1166). Ліки, що інгібують такі низхідні каскади передачі сигналів, також можуть бути використані в якості альтернативи ингибитору кінази ВО51 або в якості ад'юванта, окремо або в комбінації зі сполуками Формули 1.

І00247| В одному з варіантів суб'єктів, розглядаються як тих, що мають 5І С34А2-8О51 або транслокації СЮО74-РІС, або делецію РІШ-ВО51, також розглядають як тих, що мають мутацію

ВО51 сайту за сайтом транслокації. Приклад мутації ВО51 являє собою активує мутацію, яка забезпечує конститутивну активність кінази. Активуюча мутація ВО51 являє собою випадкову мутацію, яка викликає підвищення активації порівняно з мутацією дикого типу. Наприклад, активуюча мутація КО51 може призводити до постійної активації КО51. Може існувати навіть варіант вторинної активуючої мутації КО51, пов'язаної із застосуванням або обумовленої застосуванням інгібітора КО51. Мутації, які призводять до підвищення сигнальної активності

КО51, виникають, наприклад, внаслідок точкової мутації кіназного домену, делеції, вставки, дуплікації або інверсії, або комбінації двох або більше з них, що призводить до збільшення сигналу КОБ51. Стосовно суб'єктів, визначених як ті, що мають транслокації або делецию злиття

КО5Б1, як описано в цьому документі, і мутацію КО5І1, також може бути прийнято рішення про їх лікуванні інгібітором кінази КО51. Крім того, їх лікування/терапія може бути проведена на підставі такого рішення.

І(00248| Як описано вище, ефективність лікування раку інгібітором тирозинкінази КО51 вважається високою у пацієнта, у якого способом згідно з цим винаходом виявлений химерний полінуклеотид 5І/С34А2-КО51 або СО74-КО51, або РІС-КО51. З цієї причини лікування раку може бути ефективно здійснено шляхом введення інгібіторів тирозинкінази КО5І1, селективної щодо тих онкологічних пацієнтів, які мають химерний ген 5І С34А2-КО51 або СО74-КОБ1, або

РІа-КОБ1 і ген КО51. Відповідно, у цьому винаході представлений спосіб лікування раку, який включає стадію введення інгібітору тирозинкінази КО51, який являє собою сполуку Формули Ї,

Іа або сполуку 1, або її фармацевтично прийнятну сіль, пацієнту, у якого встановлена висока ефективність лікування раку таким інгібітором тирозинкінази КОБ51 за допомогою вищевказаного способу діагностики, описаного в цьому документі.

І00249| У тексті цього винаходу "зразок" являє собою не тільки біологічний зразок бо (наприклад, клітини, тканину, орган, рідину (кров, лімфатичну рідину тощо), травний сік, слину,

змив альвеолярного/бронхіального лаважу, сечу, кал), але і включає екстракти нуклеїнових кислот (екстракт геномної ДНК, екстракт мРНК або препарат кКДНК, або препарат кРНК, отриманий з екстракту мРНК), або екстракти білків, отримані із вказаних біологічних зразків.

Вказаний зразок також може бути схильний до фіксації у формаліні, фіксації в спирті, заморожування або заливці в парафін. 002501 Крім того, геномна ДНК, мРНК, кДНК або білок можуть бути отримані фахівцем у цій галузі техніки після вибору відповідної технології з урахуванням типу, стану і т. д. зразка. 00251) Крім вищевказаних речовин (полінуклеотидів, антитіл) у якості активних інгредієнтів, лікарский засіб відповідно до цього винаходу може містити інші фармацевтично прийнятні інгредієнти. Приклади таких інгредієнтів включають буферні агенти, емульгатори, суспендуючі агенти, стабілізатори, консерванти, фізіологічний сольовий розчин і т. д. У якості буферних агентів можуть бути використані фосфати, цитрати, ацетати і т.д. В якості емульгаторів може бути використаний гуміарабік, альгінат натрію, трагакант і т.д. В якості суспендуючих агентів може бути використаний гліцерилмоностеарат, моностеарат алюмінію, метилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, гідроксиметилцеллюлоза, лаурилсульфат натрію і т. д. В якості стабілізаторів може бути використаний пропіленгліколь, діетилсульфіт, аскорбінова кислота і т.д. В якості консервантів може бути використаний азид натрію, хлорид бензалконію, пара- оксібензойна кислота, хлорбутанолі т. д. (002521 Крім того, крім препарату, який містить полінуклеотиди і антитіла, препарати, такі як субстрат, позитивний контроль (наприклад, химерні полінуклеотиди 5ІС34А2-НО5І1, С074-

КО5І1 або РІС-КО5БІ1, химерні поліпептиди 5І С34А2-НОБІ, СО074-КО51 або РІС-КО5БІ1, або клітини, що мають їх, і т. д-) та негативний контроль, необхідні для виявлення мітки, яка прикріплена до полінуклеотидів і антитіл, а також контрастний забарвлюючий реагент (АРІ їі т.д.), який використовується при іп 5йи гібридизації або т. п., молекула, необхідна для виявлення антитіла (наприклад, вторинне антитіло, білок С, білок А) і буферний розчин, який використовується для розведення або промивання антитіла, можуть бути об'єднані у вигляді набору для застосування в способі відповідно до цього винаходу. Вказаний набір може містити інструкції щодо застосування набору. У цьому винаході представлений також вищезгаданий набір для застосування в способі відповідно до цього винаходу.

Зо 00253) Способи виявлення, описані в цьому документі, особливо підходять при виявленні химерного білка, який складається по суті з М-кінцевого домену партнера по злиттю і С- кінцевого домену білка КО51, що кодує кіназний домен. Химерний білок може являти собою химерний білок ЗІ С34А2-8О51, що складається по суті з М-кінцевого домену білка 5І СЗ34А2 або його фрагмента і С-кінцевого домену білка КОБ51, що кодує кіназний домен. Химерний білок може являти собою химерний білок СЮО74-КО51, що складається по суті з М-кінцевого домену білка СО74 або його фрагмента і С-кінцевого домену білка КО51, що кодує кіназний домен.

Химерний білок може являти собою химерний білок РІБ-КО51, що складається по суті з М- кінцевого домену білка БІС або його фрагмента і С-кінцевого домену білка КО51, що кодує кіназний домен. Вказаний спосіб може бути використаний для діагностики раку легень, зокрема, недрібноклітинного раку легень, і включає: виявлення щонайменше однієї хромосомної перебудови з участю КО5Б1, включаючи інверсії, транслокації або делецію в б хромосомі; химерного білка, причому білок є гібридизованим з іншим білком; химерного гена, який кодує химерний білок; і надекспресії КО51 порівняно зі стандартним зразком, отриманим від індивідуума, що не має раку. При виявленні у випробуваному зразку однією з хромосомних перебудов, описаних вище, вибраних з описаної вище групи, індивідум підлягає лікування інгібітором КОБІ, таким як сполука Формули І, їа або сполука 1, або її фармацевтично прийнятна сіль.

Отримання Сполуки 1 (00254) Отримання М-(4-Щ6,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|оксиу)феніл)-М'-(4- фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксаміду і його (І)-малатної солі.

ІЇ00255| Спосіб синтезу, використаний для отримання М-(4-І(6,7-біс(метилокси)хінолін-4- іл|оксиуфеніл)-М'-(4-фторфеніл)уциклопропан-1,-дикарбоксаміду і його (І)-малатної солі, представлений на Схемі 1:

Схема 1 що: МО он с З ХУ -д й 7-в м -яЯ ж -е м

ЗАеЛутідів 7

Мне о новак о. 1 кю ню.ТФ г по т пон "ру но "г ПЛ Яйтлеєна кислота

Шк чн о п Е Ацетон І мус о

Оксамюіхлорид н н

Те Но Но

ПЕОСЬ ЕМ Їх С ко С -- 8 те о а С З а Е будут шиї То М сСпсалУка Й тФ т "

Отримання 4-хлор-6,7-диметоксихіноліну

І00256| У реактор послідовно завантажували 6б,7-диметоксихінолін-4--ол (10,0 кг) і ацетонітрил (64,0 л)у. Отриману суміш нагрівали до близько 65 "С і додавали оксихлорид фосфору (РОСІЗ, 50,0 кг). Після додавання РОСІЗ температуру реакційної суміші підвищували до 80 "С. Реакцію вважали завершеною (близько 9,0 годин), коли залишилося менше 2 відсотків початкової речовини (вбудований аналіз високоефективної рідинної хроматографії ІВЕРХІ).

Реакційну суміш охолоджували до близько 10 "С, а потім гасили в холодному розчині дихлорметану (ДХМ, 238,0 кг) 30 96 МНАОН (135,0 кг) і льоду (440,0 кг). Отриману суміш нагрівали до близько 14 "С і розділяли фази. Органічну фазу промивали водою (40,0 кг) і концентрували вакуумною перегонкою для видалення розчинника (близько 190,0 кг). До суміші додавали метил-трет-бутиловий ефір (МТБЕ, 50,0 кг) і суміш охолоджували до близько 10 "С, і за цей час продукт кристалізувався. Тверду речовину виділяли центрифугуванням, промивали н-гептаном (20,0 кг) і сушили при близько 40 "С з отриманням вказаної в заголовку сполуки (8,0

КГ).

Отримання 6,7-диметил-4-(4-нітрофенокси)хіноліну

І(00257| У реактор послідовно завантажували 4-хлор-б,/-диметоксихінолін (8,0 кг), 4- нітрофенол (7,0 кг), 4-диметиламінопіридин (0,9 кг) і 2,6-лутидин (40,0 кг). Вміст реактора нагрівали до близько 147 "С. По завершенні реакції (залишилося менше 5 відсотків вихідної речовини, за результатами визначення за допомогою вбудованого ВЕРХ аналізу, близько 20 годин) вміст реактора залишили остигати до близько 25 "С. Додавали метанол (26,0 кг), потім карбонат калію (3,0 кг), розчинений у воді (50,0 кг). Вміст реактора перемішували протягом близько 2 годин. Отриманий твердий осад фільтрували, промивали водою (67,0 кг) і сушили при 7С протягом близько 12 годин з отриманням вказаної в заголовку сполуки (4,0 кг). 25 Отримання 4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніламіну (00258) Розчин, що містить форміат калію (5,0 кг), мурашину кислоту (3,0 кг) і воду (16,0 кг), додавали до суміші 6б,7-диметокси-4-(4-нітрофенокси)хіноліну (4,0 кг), 10-відсоткового паладію на вуглеці (вміст вологи 50 відсотків, 0,4 кг) у тетрагідрофурані (ТГФ, 40,0 кг), яку нагрівали до близько 60 "С. Додавання проводили так, щоб температура реакційної суміші залишалася на

Зо рівні близько 60 "С. По завершенні реакції, за результатами визначення за допомогою вбудованого ВЕРХ аналізу (залишилося менше 2 відсотків вихідної речовини, зазвичай 15 годин), вміст реактора відфільтрували. Фільтрат концентрували вакуумною перегонкою при

З35"С до половини початкового об'єму, в результаті чого продукт випав в осад. Продукт виділяли фільтрацією, промивали водою (12,0 кг) і сушили під вакуумом при близько 50 "С з отриманням вказаної в заголовку сполуки (3,0 кг; площа під кривою (АОС) 97 відсотків).

Отримання 1-(4-фторфенілкарбамоїл)циклопропанкарбонової кислоти (002591) Триетиламін (8,0 кг) додавали до охолодженого (близько 4 "С) розчину циклопропан- 1,1-дикарбонової кислоти (є у продажу) (21, 10,0 кг) в ТГФ (63,0 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 10 "С. Розчин перемішували протягом близько 30 хвилин,

а потім додавали тіонилхлорид (9,0 кг), підтримуючи температуру суміші нижче 10 70. По завершенні додавання додавали розчин 4-фтораніліну (9,0 кг) в ТГФ (25,0 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 10 "С. Суміш перемішували протягом близько 4 годин, а потім розбавляли ізопропілацетатом (87,0 кг). Розчин послідовно промивали водним розчином гідроксиду натрію (2,0 кг, розчиненого в 50,0 л води), водою (40,0 л) водним розчином хлориду натрію (10,0 кг, розчиненого в 40,0 л води). Органічний розчин концентрували вакуумною перегонкою, потім додавали гептан, в результаті чого в осад випала тверда речовина. Тверду речовина виділяли центрифугуванням, а потім сушили при близько 35 "С під вакуумом з отриманням вказаної в заголовку сполуки (10,0 кг).

Отримання 1-(4-фторфенілкарбамоїл)уциклопропанкарбонілхлориду (00260) Оксалілхлорид (1,0 Кг) додавали до розчину 1-(4- фторфенілкарбамоїл)уциклопропанкарбонової кислоти (2,0 кг) в суміші ТГФ (11 кг) і М, М- диметилформамід (ДМФА; 0,02 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 30 "С. Отриманий розчин використовували на наступній стадії без додаткової обробки.

Отримання /-М-(4-Ц6,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|окси)феніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан- 1,1-дикарбоксаміду (002611 Розчин З попередньої стадії, що містить 1-(4- фторфенилкарбамоїл)циклопропанкарбонілхлорид, додавали до суміші 4-(6,7- диметоксихінолін-4-ілокси)феніламіну (3,0 кг) і карбонату калію (4,0 кг) в ТГФ (27,0 кг) і воді (13,0 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 30 "С. По завершенні реакції (зазвичай 10 хвилин) додавали воду (74,0 кг). Суміш перемішували при 15-30 "С протягом близько 10 годин, в результаті чого продукт випав в осад. Продукт виділяли фільтрацією, промивали попередньо отриманим розчином ТГФ (11,0 кг) і води (24,0 кг) і сушили при близько 65"С під вакуумом протягом близько 12 годин з отриманням вказаної в заголовку сполуки (вільний підстава, 5,0 кг). ІН ЯМР (400 МГц, а6-ДМСО): б 10,2 (з, 1Н), 10,05 (з, 1Н), 8,4 (з, 1Н), 7,8 (м, 2Н), 7,65 (м, 2Н), 7,5 (з, 1Н), 7,35 (з, 1Н), 7,25 (м, 2Н), 7,15 (м, 2Н), 6,4 (з, 1Н), 4,0 (д, 6Н), 1,5 (з, 4Н). РХ/МС: МАН-502.

Отримання /-М-(4-Ц6,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|окси)феніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан- 1,1-дикарбоксаміду, (І)-малатної солі

І00262| Розчин І-яблучної кислоти (2,0 кг) у воді (2,0 кг) додавали до розчину (|4-(6,7- диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|іамід-(4-фторфеніл)аміду циклопропан-1,1-дикарбонової кислоти, вільної основи (15, 5,0 кг) в етанолі, підтримуючи температуру суміші близько 25 76.

Потім додавали вуглець (0,5 кг) і кремній-тіол (0,1 кг), і отриману суміш нагрівали до близько 78"С, при якій додавали воду (6,0 кг). Потім реакційну суміш фільтрували з подальшим додаванням ізопропанолу (38,0 кг) залишали остигати до близько 25 "С. Продукт виділяли фільтрацією і промивали ізопропанолом (20,0 кг), і сушили при близько 65 "С з отриманням вказаної в заголовку сполуки (5,0 кг).

Альтернативне отримання М-(4-Ц6,7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|оксиу)феніл)-М'-(4- фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксаміду і його (І)-малатної солі. (00263) Альтернативний спосіб синтезу, який може бути використаний для отримання М-(4-

І6, 7-біс(метилокси)хінолін-4-іл|Іоксиуфеніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксаміду |і його (І)-малатної солі, наведений на Схемі 2, як описано в РСТ/О52012/024591, повний зміст якої включено в цей документ за допомогою посилання.

Схема 2

Ка! ря Е вет - т я з от пк пою я одивутя о ню ГО «роми МА М збо трет-нентовси натрію, ПМА ; юю,

Рон оте во о НЕО, БМ о т ве чо дтчюм тре а Е бр Гусалілхлюрівд Т 2 о я и 7 ж

Ех вх шику пФ " р и : й В У В -

Же -- ДМА го шУ З ек у ї ж Її. цоМ те пли Об итк

ОКУ таб лет пох ц 7 йлеявлучна кнелота. дл М кдд МЕК ге МО

Но дв нео зд ин

Отримання 4-хлор-6,7-диметоксихіноліну

І00264| У реактор послідовно завантажували 6б,7-диметоксихінолін-4-ол (47,0 кг) і ацетонітрил (318,8 кг). Отриману суміш нагрівали до близько 60 "С і додавали оксихлорид фосфору (РОСІЗ, 130,6 кг). Після додавання РОСІЗтемпературу реакційної суміші підвищували до близько 77 "С. Реакцію вважали завершеною (близько 13 годин), коли залишилося менше

З 965 вихідної речовини (вбудований аналіз високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ|І).

Реакційну суміш охолоджували до близько 2-7 "С, а потім гасили в холодному розчині дихлорметану (ДХМ, 482,8 кг), 26-відсоткового МНАОН (251,3 кг) і води (900 л). Отриману суміш нагрівали до близько 20-25 "С і поділяли фази. Органічну фазу фільтрували через шар АМУ/

Нуйо Бире!-Се! МЕ (целіт; 5,4 кг) і осад промивали на фільтрі ДХМ (118,9 кг). Об'єднану органічну фазу промивали насиченим сольовим розчином (282,9 кг) і змішували з водою (120 л).

Фази поділяли і концентрували органічну фазу вакуумною перегонкою для видалення розчинника (залишковий об'єм близько 95 л). ДХМ (686,5 кг) завантажували в реактор, що містить органічну фазу, і концентрували вакуумною перегонкою для видалення розчинника (залишковий об'єм близько 90 л). Потім завантажували метил-трет-бутиловий ефір (МТБЕ, 226,0 кг) і доводили температуру суміші до значення від -20 до -25 "С і витримували протягом 2, 5 годин з отриманням твердого осаду, який потім відфільтровували і промивали н-гептаном (92,0 кг) і сушили на фільтрі при близько 25 "С в атмосфері азоту з отриманням вказаної в заголовку сполуки. (35,6 кг).

Отримання 4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніламіну

І00265| 4-Амінофенол (24,4 кг), розчинений в М, М-диметилацетаміді (ОМА, 184,3 кг), завантажували в реактор, що містить 4-хлор-6,7-диметоксихінолін (35,3 кг), трет-бутоксид натрію (21,4 кг) ії ОМА (167,2 кг) при 20-25 "С. Потім суміш нагрівали до 100-105 "С протягом близько 13 годин. По завершенні реакції, за результатами визначення за допомогою вбудованого ВЕРХ аналізу (залишилося менше 2 відсотків вихідної речовини), вміст реактора охолоджували при 15-20 С і завантажували воду (попередньо охолоджену, 2-7 "С, 587 л) з такою швидкістю, щоб підтримувати температуру 15-30 С. Отриманий твердий осад фільтрували, промивали сумішшю води (47 л) і ОМА (89,1 кг) і, нарешті, водою (214 л). Потім

Зо осад на фільтрі сушили при близько 25"С на фільтрі з отриманням неочищеного 4-(6,7- диметоксиетинолін-4-ілокси)феніламіну (59,4 кг вологого, 41,6 кг сухого, розрахунок на основі втрат при висушуванні). Неочищений 4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніламін кип'ятили зі зворотним холодильником (близько 75 С) в суміші тетрагідрофурану (ТГФ, 211,4 кг) і ОМА (108,8 кг) протягом близько 1 години, а потім охолоджували до 0-5 "С і витримували протягом близько 1 години, після чого відфільтровували тверду речовину, промивали ТГФ (147,6 кг) і сушили на фільтрі під вакуумом при близько 25 "С з отриманням 4-(6,7-диметоксихінолін-4- ілокси)феніламіну (34,0 кг).

Альтернативне отримання 4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)уфениламина

(00266) 4-Хлор-6,7-диметоксихінолін (34,8 кг) ії 4-амінофенол (30,8 кг), і трет-пентоксид натрію (1,8 еквівалента, 88,7 кг, 35 мас. відсотків у ТГФ) завантажували в реактор, потім додавали М, М-диметилацетамід (ОМА, 293,3 кг). Потім отриману суміш нагрівали до 105-115" протягом близько 9 годин. По завершенні реакції, за результатами визначення за допомогою вбудованого ВЕРХ аналізу (залишилося менше 2 відсотків вихідної речовини), вміст реактора охолоджували при 15-25"С і додавали воду (315 кг) протягом двох годин, підтримуючи температуру 20-30 "С. Потім реакційну суміш перемішували протягом ще однієї години при 20- 25 7б. Неочищений продукт збирали фільтрацією і промивали сумішшю 88 кг води і 82,1 кг ОМА, потім 175 кг води. Продукт сушили на фільтрі-вологовідокремлювателі протягом 53 годин.

Аналіз втрат при висушуванні показав менше 1 відсотка мас./мас. (00267) В альтернативному способі використовували 1,6 еквівалента трет-пентоксиду натрію і підвищували температуру реакції до 110-120 С. Крім того, температуру охолодження підвищували до 35-40 "С, і вихідну температуру додавання води доводили до 35-40 "С, з подальшим нагріванням до 45 "С.

Отримання 1-(4-фторфенілкарбамоїл)циклопропанкарбонової кислоти

І00268| Триетиламін (19,5 кг) додавали до охолодженого (близько 5"С) розчину циклопропан-1,1-дикарбоновоїкислоти (24,7 кг) в ТГФ (89,6 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 5 "С. Розчин перемішували протягом близько 1,3 години, а потім додавали тіонілхлорид (23,1 кг), підтримуючи температуру суміші нижче 10 С. По завершенні додавання розчин перемішували протягом близько 4 годин, підтримуючи температуру нижче 10 "С. Потім додавали розчин 4-фтораніліну (18,0 кг) у ТГФ (33,1 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 10 "С. Суміш перемішували протягом близько 10 годин, після чого вважали реакцію завершеною. Потім реакційну суміш розбавляли ізопропілацетатом (218,1 кг). Отриманий розчин послідовно промивали водним розчином гідроксиду натрію (10,4 кг, 50 відсотків, розчинені в 119 л води), додатково розведеним водою (415 л), потім водою (100 л) і, нарешті, водним розчином хлориду натрію (20,0 кг, розчинені у 100 л води). Органічний розчин концентрували вакуумною перегонкою (залишковий об'єм 100 л) нижче 40 "С, потім додавали н-гептан (171, 4 кг), в результаті чого в осад випала тверда речовина. Тверду речовину виділяли фільтрацією і промивали н-гептаном (102,4 кг) з

Зо отриманням вологої, неочищеної 1-(4-фторфенілкарбамоїл)уциклопропанкарбонової кислоти (29,0 кг). Неочищену 1-(4-фторфенілкарбамоїлуциклопропанкарбонову кислоту розчиняли в метанолі (139,7 кг) при близько 25 "С, потім додавали воду (320 л) з отриманням суспензії, яку виділяли фільтрацією, послідовно промивали водою (20 л) і н-гептаном (103,1 кг), а потім сушили на фільтрі при близько 25 "С в атмосфері азоту з отриманням вказаної в заголовку сполуки (25,4 кг).

Отримання 1-(4-фторфенілкарбамоїл)уциклопропанкарбонілхлориду (00269) Оксалілхлорид (12,6 Кг) додавали до розчину 1-(4- фторфенілкарбамоїл)циклопропанкарбонової кислоти (22,8 кг) в суміші ТГФ (96,1 кг) і М, М- диметилформаміду (ДМФА; 0,23 кг) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 25 "С. Отриманий розчин використовували на наступній стадії без додаткової обробки.

Альтернативне отримання 1-(4-фторфенілкарбамоїлуциклопропанкарбонілхлориду (00270) У реактор завантажували 1-(4-фторфенілкарбамоїл)циклопропанкарбонову кислоту (35 кг), 344 р ДМФА і 175 кг ТГФ. Реакційну суміш доводили до 12-17 "С, а потім до реакційної суміші додавали 19,9 кг оксалілхлориду протягом 1 години. Реакційну суміш залишали перемішуватися при 12-17 "С на 3-8 годин. Одержаний розчин використовували на наступній стадії без додаткової обробки.

Отримання (|4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|Іамід-(4-фторфеніл)аміду циклопропан- 1,1-дикарбонової кислоти (002711 Розчин З попередньої стадії, що містить 1-(4- фторфенілкарбамоїлуциклопропанкарбонілхлорид, додавали до суміші сполуки 4-(6,7- диметоксихінолін-4-ілокси)феніламину (23,5 кг) і карбонату калію (31,9 кг) у ТГФ (245,7 кг) і воді (116 л) з такою швидкістю, щоб температура суміші не перевищувала 30 "С. По завершенні реакції (близько 20 хвилин) додавали воду (653 л). Суміш перемішували при 20-25 "С протягом близько 10 годин, в результаті чого продукт випав в осад. Продукт виділяли фільтрацією, промивали попередньо отриманим розчином ТГФ (68,6 кг) і води (256 кг) і сушили спочатку на фільтрі в атмосфері азоту при близько 25 "С, а потім при близько 45 "С під вакуумом з отриманням вказаної в заголовку сполуки (41,0 кг, 38,1 кг, розрахунок на підставі втрат при висушуванні). бо Альтернативне отримання (|4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніліамід-(4-фторфеніл)аміду циклопропан-1,1-дикарбонової кислоти

І00272| У реактор завантажували 4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніламін (35,7 кг, 1 еквівалент), потім 412,9 кг ТГФ. До реакційної суміші додавали розчин 48,3 К2СОЗ 169 кг води.

Розчин хлорангідридів кислоти, описаний вище в альтернативному способі отримання 1-(4- фторфенілкарбамоїл)циклопропанкарбонілахлориду, переносили в реактор, що містить 4-(6,7- диметоксихінолін-4-ілокси)феніламін, підтримуючи температуру 20-30 "С протягом не менше двох годин. Реакційну суміш перемішували при 20-25 "С протягом не менше трьох годин. Потім температуру реакційної суміші доводили до 30-25 "С і перемішували суміш. Перемішування припиняли і залишали розділятися фази суміші. Нижню водну фазу видаляли і відкидали. До решти верхній органічній фазі додавали 804 кг води. Реакційну суміш залишали перемішуватися при 15-25 "С протягом не менше 16 годин.

І00273| Продукт випадав в осад. Продукт відфільтровували і промивали сумішшю 179 кг води і 157,9 кг ТГФ двома порціями. Неочищений продукт сушили під вакуумом протягом щонайменше двох годин. Потім висушений продукт розчиняли в 285,1 кг ТГФ. Отриману суспензію переносили в реакційний посудину і перемішували до отримання перетворення суспензії в прозорий (розчинений) розчин, який нагрівали до 30-35 "С протягом близько 30 хвилин. Потім до розчину додавали 456 кг води, а також 20 кг етанолу БОАС-1 (етанол, денатурований метанолом протягом двох годин). Суміш перемішували при 15-25 "С протягом щонайменше 16 годин. Продукт відфільтровували і промивали сумішшю 143 кг води і 126,7 ТГФ двома порціями. Продукт сушили при максимальній температурі 40 "с.

І00274| В альтернативному способі температуру реакції при утворенні хлорангідридів кислоти доводили до 10-15"7С. Температуру перекристалізації міняли з 15-25 С на 45-5070 протягом 1 години, а потім охолоджували до 15-25 "С протягом 2 годин.

Отримання (|4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|Іамід-(4-фторфеніл)аміду циклопропан- 1,1-дикарбонової кислоти, солі малатної 00275) 14-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|амід-(4-фторфеніл)амід циклопропан-1,1- дикарбонової кислоти (1-5; 13,3 кг), | -яблучну кислоту (4,96 кг), метилетилкетон (МЕК; 188,6 кг) і воду (37,3 кг) завантажували в реактор і суміш нагрівали до кипіння зі зворотним холодильником (близько 74 "С) протягом близько 2 годин. Температуру реактора знижували до

Зо 50-5570 ії відфільтровували вміст реактора. Вказані послідовні стадії, описані вище, повторювали ще два рази, виходячи з таких саме кількостей вихідної речовини (13,3 кг), /- яблучної кислоти (4,96 кг), МЕК (198,6 кг) і води (37,2 кг). Об'єднаний фільтрат азеотропно сушили при атмосферному тиску, використовуючи МЕК (1133,2 кг) (залишковий об'єм близько 711 л; КЕ « 0,5 95 мас./мас.) при близько 74 "С. Температуру вмісту реактора знижували до 20- 25"Сб і витримували протягом близько 4 годин з отриманням твердого осаду, який відфільтровували, промивали МЕК (448 кг) і сушили під вакуумом при 50 "С з отриманням вказаної в заголовку сполуки (45,5 кг).

Альтернативне отримання (|4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніліамід-(4-фторфеніл)аміду циклопропан-1,1-дикарбонової кислоти, (І) солі малатної 00276) (|4-(6,7-диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|амід-(4-фторфеніл)амід циклопропан-1,1- дикарбонової кислоти (47,9 кг), І -яблучну кислоту (17,2), 658,2 кг метилетилкетону та 129,1 кг води (37,3 кг) завантажували в реактор і суміш нагрівали до 50-55 7С протягом 1-3 годин, а потім при 55-60 "С протягом ще 4-5 годин. Суміш висвітляли фільтрацією через картридж 1 мкм.

Температуру реактора доводили до 20-25 20-25 "С і переганяли під вакуумом з тиском вакууму 150-200 мм рт.ст. з максимальною температурою рубашки 5573 до обсягу 558-731 л.

І00277| Вакуумну перегонку проводили ще два рази з завантаженням 380 кг і 380,2 кг метилетилкетону, відповідно. Після третьої дистиляції обсяг партії довели до 18 об./мас. І4-(6,7- диметоксихінолін-4-ілокси)феніл|амід-(4-фторфеніл)-аміду циклопропан-1,1-дикарбонової кислоти, завантаживши 159,9 кг метилетилкюетону з отриманням загального обсягу 880 л.

Проводили додаткову вакуумну дистиляцію, додавши 245,7 метилетилкетону. Реакційну суміш залишали при помірному перемішуванні при 20-257С на щонайменше 24 години. Продукт відфільтровували і промивали 415,1 кг метилетилкетону трьома порціями. Продукт сушили під вакуумом з температурою рубашки, встановленої на 45 "С. (00278) В альтернативному способі порядок додавання змінювали, тому що розчин 17,7 кг 1 - яблучної кислоти, розчиненої в 129,9 кг води, додавали до (|4-(6б,7-диметоксихінолін-4- ілокси)феніл|амід-(4-фторфеніл)-аміду циклопропан-1,1-дикарбонової кислоти (48,7 кг) у метилетилкетоні (673,3 кг).

Біологічний приклад

Зростання клітин НСС-78 і МСІ-Н2228 бо І00279| Клітини НОС-78 і МСІ-Н2228 купували у компаній О5МА і АТСС, відповідно, у вигляді замороженого біологічного зразка, відтавали в колбі Т-75 (Мипс) і вирощували до 80-90 95 злиття для злиплих клітин або до досягнення щільності 1-2 х 106 клітин/мл клітинної суспензії. (00280) МОСІ-Н2228, клітинну лінію аденокарциноми легень НДРЛ людини (АТСС, СКІ 5935), яка несе активуючи злиття ЕМІ 4-АЇ К, висівали з щільністю 3,5 х 104 клітин/лунку і 2,5 х 104 клітин/лунку на 48 годині і 72 годині, відповідно, в 0,1 мл КРМІ 1640 (АТСС 30-2001), 10 96 ФБС, 1 9о пеніциліну-стрептоміцину на чорні 96-лункові планшети (Совіаг, 3904). (00281) НОС-78, клітинну лінію аденокарциноми легень НДРЛ людини (05М7, АСС 563), яка несе активуючи злиття 5І/С34А2-КО51 і фосфор-Меї, висівали з щільністю 2,5 х 104 клітин/лунку і 2 х 104 клітин/лунку на 48 годин і 72 години, відповідно, в 0,1 мл КРМІ 1640 (АТОоС 30-2001), 10 95 ФБС (інактивована нагріванням, СеїІдго), 1 9о пеніциліну-стрептоміцину на чорні 9б-лункові планшети (Созіаг, 3904).

І00282| Клітини вирощували при 37 "С у зволоженій атмосфері з 595 02 протягом 16 годин. ДМСО або серійні розведення сполуки 1 у свіжому середовищі, що не містить сироватки, або в середовищі, що містить сироватку, додавали до клітин і інкубували протягом 48 годин або 72 годин при 37 "С у зволоженій атмосфері з 5 965 002 з подальшим додаванням розчину дял мічення 5'-бром-2'-дезоксіурідина (Вга)) (Коспе) на 2-4 години. Клітинні суспензії переносили на фільтрувальні планшети (Согпіпд, 3504), а потім проводили аналіз. Клітини аналізували на проліферацію, контролюючи впровадження ВгаО. Реагенти набору для твердофазного імуноферментного аналізу клітинної проліферації, Ва (хемілюмінесценція) (Коспе

Віозсіепсе5, 11 669 915 001), використовували за інструкціями виробника. Після впровадження мітки ВгаО клітини фіксували розчином ЕРіхОепаї. Додавали кон'югат анти-ВгаО пероксидази (РОБ) і промивали планшети їх РВ5. Додавали розчин субстрату і вимірювали люмінесценцію на планшет-рідері Місіог ММайас М (Регкіп ЕІтег). Процентне інгібування проліферації розраховували порівнянням проліферації клітин, оброблених сполукою 1, із зразками, обробленими ДМСО. Значення процентного інгібування при 5-8 концентраціях сполуки. 1 використовували для розрахунку значень ІС50.

Біологічний приклад

Інгібування фосфорилювання КОБ51 00283) Клітини НОСС-78, клітинну лінію аденокарциноми легень НДРЛ людини (05М2, АСС

Зо 563), яка несе активуючи злиття 5 С34А2-КО51 і фосфор-Меї, висівали з щільністю З х 105 клітин/лунку на 96-лункові планшети (Мипсіоп, 152795) в КРМІ 1640 (АТСС, 30-2001), що містить 10 95 ФБС (інактивована нагріванням, СеїЇдго) і 1 96 пеніциліну-стрептоміцину (СеїЇдго). ДМСО або серійні розведення сполуки 1 у свіжому середовищі з 10 95 ФБС кінцевої концентрації 0,3 95

ДМСО (носія) додавали до клітин і інкубували протягом З годин. Після обробки клітини збирали і промивали холодним РВЗ і відразу лізирували 0,15 мл холодного лізисного буфера (50 мМ Ттгі5

НС, рН 8,0, 150 мМ Масі, 1 95 МР 40, 0,1 95 505, 0,5 95 дезоксихолату натрію, 1 мМ ЕДТК, 50 мМ Мак, 1 мМ пірофосфату натрію, 1 мМ Мазмо4, 2 мМ РМ5БЕ, 10 мкг/мл апротиніну, 5 мкг/мл лейпептину і 5 мкг/мл пепстатину А). Лізати збирали і вимірювали концентрації білка за методом

ВСА (Рієгсе). Лізати збирали і вимірювали концентрації білка за методом ВСА (Ріегсе). Лізати змішували з буфером для зразків МиРаде ГО5 (Іпийгодеп МРООО07) і відновлючим агентом (Іпийгодеп МоМРООО4), потім нагрівали при 70 С протягом 10 хвилин. 20 мкг білка завантажували на гель МиРаде 1095 Віб Тгі5 (Іпмігодеп, МРОЗ302). Білки переносили на нітроцелюлозні мембрани (Іпмігодеп, ЇС2001), блокували протягом 1 години в блокувальному буфері Одуззеу (Гі-Сог, 927 40000) та інкубували при 4 "С протягом ночі з анти-КО51 мишачим моноклональним антитілом (1:1000) (Се! Зідпайпуд Тесппоіоду, 3266) і анти-фосфоро-ВО51 (2274) кролячим антитілом (1:1000) (Се! вЗідпайпуд Тесппоїоду, 3077), розведеним у блокувальному буфері Одуззеу, що містить 0,1 96 Тмееп 20. Мембрани чотири рази по 10 хвилин промивали буфером ТВ5 Т (50 мМ Ттгі5 НС, рН 7,2; 150 мМ Масі; 0,1 95 Туееп 20) і проводили блоттінг з вторинними антитілами, козячим анти-мишачим ІКОСуеб80 (Іі-Сог, 926 32220) та козячим анти-кролячим ІКОуе8о0 (1і-Сог, 926 32211), у блокувальному буфері

Одузбеу, що містить 0,195 Тмееп 20 і 0,0195 505, протягом 60 хвилин при кімнатній температурі. Мембрани промивали чотири рази по 10 хвилин буфером ТВ5-Т і двічі промивали

РВ5. Мембрани сканували за допомогою сканера Одуззеу (1і-Сог) і кількісно визначали інтенсивність сигналу кожної смуги за допомогою ІтадеОмцапі (Моїіесшаг Оемісе5). Значення

ІС5О розраховували на підставі сигналу, отриманого в обробленому сполукою зразку, у порівнянні з сигналом в контрольному зразку з носієм (ДМСО). (00284) Інгібування активності кінази, опосередкованої 5І С34А2-КОБІ1, в клітинах НСС-78

НДРЛ, в які вводили одноразові зростаючі дози сполуки 1 або 3-(1Н8)-1-(2,6-дихлор-3- фторфеніл)етокси|-5-(1-піперидин-4-ілпіразол-4-іл)упіридин-2-аміну (кризотиніб; ХАЇКОРІФ), бо показано на фіг. 1. На фіг. наочно показана потужна інгібуюча активність сполуки 1 проти химерної кінази КО51, яка ефективніше порівняльного контрольного зразка, 3-(1НА)-1-(2,6- дихлор-3-фторфеніл)етокси|-5-(1-піперидин-4-ілпіразол-4-іл)упіридин-2-аміну (кризотиніб) у концентраціях, випробуваних іп міїго.

Біологічний приклад

ВО51-залежна проліферація клітин НСС-78 НДРЛ (00285) Значення ІС5О розраховували для сполуки 1 та порівняльного контрольного зразка, 3-(118)-1-(2,6-дихлор-3-фторфеніл)етокси|-5-(1-піперидин-4-ілпіразол-4-іл)піридин-2-аміну (кризотиніб) після інкубації активних агентів з клітинами НСС-78 НДРЛ протягом 48 або 72 годин в різних концентраціях. Кількісну оцінку проліферації клітин НСС-78 НДРЛ проводили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ВгаО (хемілюмінесценція, Коспе

Віозсіепсе5, Саї. Мо 11 669 915 001) згідно з рекомендаціями виробника. Визначення значень

ІСБО (А-Е) (концентрація при 50 95 інгібуванні) проводили так, як описано вище, і визначали шляхом обчислень за допомогою програмного забезпечення СгарпРаай Ргізт. (00286) Таблиця 3. КО51-залежна проліферація клітин НСС-78 НДРЛ у присутності сполуки 1 згідно з цим винаходом і 3-М1Н)-1-(2,6-дихлор-3-фторфеніл)етокси|-5-(1-піперидин-4- ілпіразол-4-іл)піридин-2-аміну (кризотиніб). ян

Злиття ЕМІ 4-АЇ К . ТРБОЗ 03317

Інформація про генотип СОКМ2А МІ "157 деї, ?їв: ВВІ Злиття 5І 534А2-8О51

Е20415710

Проліферація |Проліферація |Проліферація |Проліферація

Назва сполуки 48 годин 72 години 48 годин 72 години

ІСво (НМ) ІСво (НМ) ІСво (НМ) ІСво (НМ)

Сполука! 77777771 10 ФЕТА ЇА 3-(18)-1-(2,6-дихлор-3- фторфеніл)етокси|-5-(1- с с А піперидин-4-ілпіразол-4- іл)піридин-2-амін (кризотиніб)

Представлені дані ІСво: Е-5000 - 10000 нм; 0-1000-5000 нм; С-500-1000 нм; В-100-500 нм;

А-10-100 нМ.

Інші варіанти реалізації винаходу

І00287| Вищевикладений опис було докладно викладено за допомогою ілюстрації та приклади з метою ясності і розуміння. Цей винахід було описано з посиланням на різні конкретні і кращі варіанти реалізації та способи. Однак слід розуміти, що можуть бути зроблені численні зміни і модифікації без відступу від суті та обсягу винаходу. Фахівцю в цій області техніки зрозуміло, що в межах обсягу наведеної формули винаходу можуть бути зроблені зміни і модифікації. Тому слід розуміти, що наведене вище опис призначено для ілюстрації, але не обмеження. (00288) Отже, обсяг цього винаходу слід визначати не на підставі наведеного вище опису, а

Зо замість цього його слід визначати на підставі наступної наведеної формули винаходу разом з усіма еквівалентами, до яких така формула винаходу має відношення.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» Ехеїїхів Іпс.

Апаб, Сапа Т

Уи, Реіже п «120» Спосіб лікування аденокарциноми легень «130». 224990/ЕХ14-003С-РС/370960 «1502 5 61/984599 «151» 2014-04-25 «160» 15 «170» Раїепіп версії 3.5 «210251 «2112» 2347 «2122» ПРТ «213» Ното з5аріеп5 «220» «221» МІбС РЕАТИВЕ «222» (1).2347) «223» Білок КО51 людини, номер доступу ОпіРгої РОВО22 «40025 1

Ме іух Азп Пе Туг Суз Гец Ме Рго Туз Мей Ма! Ап Ріе Аа Тит 1 5 10 15

Ге ом Су Гей Тгр Пе 5ег Ма! Ма! Сп Су Тиг Ма! (ец Ап 5ег зо

СузІец (ух ех Су Ма! Ти Ап Ген бу СіІп СІп Ген Ар Гей Су

Тк Рго Ніх Азп Ге бег Сім Рго Сух Пе Сп СІУ Сух Ні Рне Тгр бо

Абп 5ег Маї Ар біп Гуз Аби Сух Ага Гец (ух Су АгеЕ Ом 5ег Суб 65 70 75 80

Сім ма! Сім Сух бег бег Аа Су су Аа Туг Сім СІ сю МаЇ сец 85 90 95

Сім доп Аа А5р Ме Рго Те Аа Рго Рне Діа 5ег бек Пе Сіу 5ег 100 105 110

Ні Ахп Меї Тіг ги Аге Тгр Гуз 5ег АІа Аоп Ріе 5ег Су Маї (ух 115 120 125

Туг Пе Пе Сп Тгр ух Туг Аа біл СГец Гец Оу 5ег Тгтр ТАг Туг 130 135 140

ТНг Гу ТЬг Ма! 5ег Аг Рго 5ег Туг Ма! Ма! (ух Рко Геи Ні Рго 145 150 155 160

Ре Тит Сім Тук Пе Ріє Аге Маї Ма! Тер Пе Рне ТЕг Ага біп беи 1655 175 175 біп Гец Туг бег Рго Рго 5ег Рго 5ег Туг Аге Тиг Ні Рго Ні су 180 185 190

Уа! Рго Сі Тиг Аа Рго Гец Пе Агр Ахп Пе Сім 5ег бег 5ег Рго 195 200 205

Авр Тиг Ма! сі Ма! зег Тир А5р Рго Рго бій Рпе Рго бу біх Рго 210 215 220

Пе Ге Су Туг Ап Ге Аге Ееи Пе бек Гуз Асп Сп Ту Гей Ар

225 230 235 240

Аа СІу Тиг Сп Аге ТНг бег Ре Сп Ре Туг 5ет Тг Гец Рго А5п 245 250 255

Тит Пе Туг Ага Ре 5ег Ме Аз Аа Ма! Ахп Си Маї СУ Си бу 260 265 270

Рго Сім Аа бі 5ег 5ег Пе Тиг Тих бег 5ег 5ег Аа Маї сій б/Іп 275 280 285

Сію Са біп Тгр Ге Ріє Геи 5ег Агр (ух Таг зег Гец Аге Гуз Агр 290 295 з00 5егієц ух Ні Гей Маї Азр бю Ага Ні Су (ем Ася ем Азр Аа 305 310 315 320

Пе Туг Ні5 Асп Ме Тик бу Ге 5ег Маї Ар Маї! Ніз сіп біл Пе 325 ззо 335

Уаї Тугс Ре 5ег бім Сіу Тег МКеи Ме Тгр Аа Гух Гух Аа Аа А5п з40 з45 350

Меї б5ег Азр Уаї бег Азр Гей Аге Пе Рпе Туг Агя ОМ 5ег ОМ Геи 355 360 3655

Це 5ег 5ег Ме 5ег Ме Ар Тгр Геи Туг бр Аге Меї Туг Рне Пе 370 375 з80

Меї Азр Сію Ге Ма! Су Ма! Сух Ар Ге Сім Азп Суз 5ег Ап Пе 385 390 395 400

Січ Сім Пе Тнг Рго Рго 5ег Пе 5ег Аа Рго біп ух Ме маї Аа 405 410 415

Азр бег Тук Ап Оу Туг Ма! Ре ТугГец еи Агр Авзр су Не Туг 420 425 430

Агв Аа Ар Гей Рго Ма! Рго бег Су Аге Су Аа См Аа Маї Аге 435 440 445

Ме Маї сію 5ег Су Тпг Ге (ух Азр Рпе Аа Ме (ух Рго СїІп Аа 450 455 460

Гуз Аге Пе Пе Туг Рне Азл Ар Тнг Аа сл Ма! Рне Меї 5ег Тиг 465 470 475 480

Ріє Геи Азр бу бег Аа 5ег Ні5 Гец Пе Тед Рго Аге Пе Рго Ре 485 490 495

Аа Ар Маї (ух 5ег Ре Аа Су Си Ап Ал Авр Ріє Ге Маї Тиг 500 505 510

Ар біу Гу Ма! Пе Ре сій сіпа Ар Аа Гей 5ег Ре Ап Сів Ре 515 520 525

Пе Маї Сіу Сує Дер (еи 5ег Нів Пе Си Си Рпе сбіу Рпе біму Азп 530 535 540

Гец Ма! Не Ре Оу 5ег 5ег 5ег Сп Ге Ні Рко Гей Рго бу Аге 5а5 550 555 560

Рго Сп си Се 5ег Ма! Гец Рне Су бег Ні Сп Аа Ге Ма! сп 565 570 575

Тр Цух Рго Рго Аа Ге Аа Ме Су Аа Азп Ма! Пе Ге Пе 5ег 580 585 590

Азр Пе Ме СІш Гей Ре бій /еми сім Рго 5ег Аа Тир Сп Ап Тер 595 500 605

Тег Туг біц Ма! Су Маї зег Таг біп Ар Рго Рго си Маї ТА Ні 610 615 620

Пе Рне Гей Азп Пе 5ег Сі Ті Меї Гецм Ап Ма! Рго б Гец Сп 625 630 635 640 бег Аа Меї (ух Тує Гуз МУаі бег Уа! Аге Аа бег 5ег Рго Гуз Аге 645 650 655

Рго ау Рго Тгр 5ег Сіш Рго 5ег Ма! су Тиг Тиг Ге Маї Рго Аа 6650 505 6570 5ег Сім Рго Рго Ре Пе Меї Аїа ма! (ух Сім Ар Сіу Геи Тер 5ег 675 6850 585

Гуз Рго Ге Азп бег РНе ау Рго Су Си Рне Ге 5ег 5ег Ар Ме

630 695 7/0

Су Ахп Ма! бег Азр Меї Ар Тгр Туг Азп Азп 5ег Геци Туг Туг бег 705 710 715 720

Азр ТАг Гуз сім А5р Ма! Ріе Маї Тгр Ге (Гей Ап Су Тиг Ар Пе 725 730 735 зег Си Ап Туг Ні Тем Рго 5ег Ме Аа су Аа Су діа Ге Аа 740 745 750

Ріе Ом Тгр ем б)у Ні Ре ге Тут Тгр Аа ОІУ (уз ТАг Туг Ма! 755 750 765

Пе біІп Аге, біп 5ег Ма! Геи Тнг Оу Ні ТАк Ар Ме ма! Тк Ніб 770 775 780

Уа! 1у5 ей (ей Маї Ахп др Ме маї Ма! Ар 5ег Ма! сіІу Оу Туг 785 790 795 800 мем Туг Тер Те ТЬк Ге Тук 5ег Ма! ОЇм бег ТАу Аге Гец Азп бу 805 810 815

Сі 5ег 5ег Геи Ма! Ге сп Тиг бій Рго Тгр Рне бег СМ (ув Гу 820 825 830

Уа! Ме Аз і еи ТНгіеи дер Ге 5ег Абр Су ей Ге Туг Тгр Іеи 835 840 845

Уа! біп Ар 5ег біІп Сух Пе Ні Гец Туг Тіг Аа Уаї (ем Агя Су 850 855 860 біІп 5ег Тпг бу Ар Тг Тпг Ме Тнг Сім Рле Аа Аа Тгр бег ТПг 865 870 875 880 бег Си Ме 5ег Сп Ап Аа Ге Меї Тує Туг зег СІМ Агр Геи Рне 885 890 895

Тер Ме Азп Су Ре Аге Пе Пе Тиг Тиг біп Ом Пе біу біп цу 900 905 910

Твг 5ег Ма! бег Ма! Геи Си Рго Аа Аге Рпе Азп біІп Ре Ти Пе 915 920 925

Ме Сп Тнг зегеи Гу Рго Теци Рго сім Азп Ріе 5ег Рне ТАг Рго 930 935 940

Гуз Ма! Пе Рго Ар 5ег Уа! сія Сім 5ег 5ег Ре Аге Іе Си су 945 950 955 960

Ап Аа 5ег 5ег Рпе Сіп Пе Ге Тер Авп Оу Рго Рго діа Маї Ар 965 970 975

Тер Оу Маї Маї Рне Туг 5ег Маї Сім Ріе 5ег Аа Ні 5ег ух Ре 980 985 990

Іеи Аа 5ег СОЇ Сп Ніз 5егіеи Рго Маї Рне Тиг Маї сін Оу Сеи 995 1000 1005 сім Рго Туг Аа Ге Ре Азп Ге 5ег Ма! Тиг Рго Тук Тиг Туг 1010 1015 1020

Тгр бу туз Сіу Рго Ту Таг 5егіеи бегіеи Аге Аа Рго біц 1025 1030 1035

Ти Маї Рго 5ег Аа Рго Сім Абп Рго Аге Ме Рле Пе Гей Рго 1040 1045 1050 бег СІ (ух Сух Су Абп Гуз Доба Сід Маї Маї Ма! би Ре Аге 1055 1060 10655

Тгр Азп Гу; Рго (ух Ні сію Азп Су Маі Гец Тниг Гу Ре бі 1070 1075 1080

Ме Ре Туг Асп Пе бег Асп біпй бХег Ме Тіг Азп Су Тпг Суб 1085 1090 1095 бій Абр Тгр Пе Аа Ма Ап. Маї Тег Рго 5ег Ма! Меї 5ег Ріє 1100 1105 1110

Сіл Ге бін біу Меї бег Рго Аге Су Рпе Пе АІа Рне СіІп Ма! 1115 1120 1125

Аге Аа Ріе ТАг б5ег Гуз Су Рго Оу Рго Туг Аа Азр Ма! Уаї 1130 1135 1140

Гуз 5ег Тпг Тнг Зег Січ Ме Азп Рго Рне Рго Ні Гец Пе ТЕГ

1145 1150 1155

Гецец бім Ап (ух Ме Уа! Ріє Геци Азр Меї Азр біп Азл бій 1160 1165 1170

Уа! Ма! Тер Тиг Ріе 5ег Аа сш Аге Ма! Пе бег Аа Ма! Су 1175 11850 1185

Туг Тиг Аа А5р Азп сю Меї бу Туг Туг АІа СІ бу Абр бек 1190 1195 1200 1еи Ре Тецеи Ніх Гец Ніб Абп Аг 5ег 5ег 5ег ОЇ Сеи Ре 1205 1210 1215 біп Абр 5ег (еи Маї Рне Азр. Пе Тег Ма! Ме Таг Пе Ар Тгр 1220 1225 1230

Пе бег Аге Ні Геи Тус Рне Аа ец ух Си 5ег Сп Азп Оу 1235 1240 1245

Меї біІп Ма! Ре Авр УаїЇ Аєр Гей аїш Ні Гу Ма! Гу Тує Рго 1250 1255 1260

Аге Сім Ма! ух Пе Ніз Ап. Аге Азп 5ег Тл Пе Це бег Ре 1265 1270 1275 5ег Уа! Туг Рго Іеи Геи 5ег Аге Геи Туг Тгр Тьг Сім Ма! бег 1280 1285 1290

Абп Рве су Тує Оп Мес Ре Туг Туг 5ег Пе Пе 5ег Ні Тиг 1295 1300 1305

Гец Ніх Аге Пе Ген бІп Рго Тс Аа Тиг Азп біп бл Абп Гу 1310 1315 1320

Аге Абп бій Суб Зег Суб А5п. Ма! ТНк Ом Ре Сід Гец зег Су 1325 1330 1335

Аа Меє АїЇа Це Ар Тіу б5ег Ази (ец Сі Гуз Рго Ге Пе Туг 1340 1345 1350

Рпе АїЇа (ух АїЇа Сп Си Пе Тгр Аа Меї Ар ем біс бі Су 1355 1360 1365 біп Су Тгр АгеЕ Ма! Пе Тиг Ма! Рго Аа Мес Геи АїЇа бу Гу 1370 1375 1380

ТЕгГец Маї бег Ге Тнг Ма! Авр су Ар Гец Пе Туг Тер Пе 1385 1390 1395

ШПе Тнг Аа (у Ар бех ТНг Сп Пе Туг СіІп Аа Гуз (ув Оу 1400 1405 1410

Ап Оу Аа Пе Маї бег Сіп Ма! Гуз АІа Ге Агр. 5ег Аге Ні 1415 1420 1425

Ме ем АїЇа Туг 5ег 5ег Ма! Меї Сіп Рго Ре Рго Ар Гуз Аа 1430 1435 1440

Рпе Геи 5ег Геи Аа бег А5р. ТІг Маї СІ Рго Тиг Пе Сем Ап 1445 1450 1455

Аа Тік Ахп ТНг 5ег Гец Тіг Пе Агуїец Ргоїей Аїа Гуз ТАг 1460 1465 1470 бо

Аепіви Ті Тер Туг бу Ме Тлг бег Рго Тк Рго ТНг Тугі ги 1475 1480 1485

Уа! Туг Туг АІа Сію Ма Ахп Ар Аге Іу5 Абп бег 5ег А5ріец 1490 1495 1500

Гуз Туг Аге Пе Гей бід Ре біп Ар ес Пе ДІа Гей Пе Си 1505 1510 1515

А5ріеич сій Рго Рпе 5ег Тіг Туг Меї Пе Сп Пе Аа Маї Гу 1520 1525 1530

Азп Туг Туг 5ег Ар Рго Ге сш Ні Геу Рго Рго бі ув іш 1535 1540 1545

Це тер с гу Тс ух Ап. біу Ма! Рго сій Аа Маї біп Сец 1550 1555 1560

Пе Ахп Так Тиг маї Аго бег Ар Тк 5ег Ге Пе Пе бег Тер 1565 1570 1575

АгеЕ Сію 5ег Ні ух Рго Ап. бу Рго ух С 5ег Уа! АгЕ ТУг

1580 1585 1590

Співи Да Ме 5ег Ніз Тец Аз ен Пе Рго Сім ТНг Рго Гей 1595 1600 1605

Аг біп 5ег ОЇи Рпе Рго Ап Оу Аге Ген ТгІеци Ге маї ТЕГ 1610 1615 1620

АгЕ Теми 5ег Су бі Ап Ме Туг Ма! Кец Гуз Ма! ем Аа Су 1625 1630 1635

Ні бег Січ Січ Меї Тгр Су ТНг бі 5ег Ніх Рго Ма! Тиг Ма! 1640 1645 1650

Сію Ме РНе Асп Тпг Рго біш Гу Рго Туг 5егіен Маї Рго біч 1655 1660 1665

Авп Тис 5егец біп Ре Аблп Тер Гуз Аа Рго Ге Азп Маї Азп 1670 1675 1680

Іец Пе Аге Ріг Тгр Ма! СІш Геи біп Гу5 Тер ух Ту Аза Си 1685 1590 1695 рРпе Туг Ні Маї Гу Тік бег Су бег бІп СІ Рго Ага Туг Ма! 1700 1705 1710

Сух Ап Пе Тиг Ап Гей бі|Іп Рго Туєс ТАк бег Туг Авп Маї Аге 1715 1720 1725

Уа! Ма! Маї Ма! Туг Гу Те сх біІш доп 5ег Тіт бегГеиц Рго 1730 1735 1740

Сім 5ег Ре Гу Тиг Гух Аа Су Маї Рго Азп Гуз Рго Ом Ме 1745 1750 1755

Рго (ух Геци Ме Сім Су бег ух Азп 5ег Пе біІп Тгр Си (у5 1760 1765 1770

Аа сш Авр Ап Сім Су Аг Пе ТАг Тує Тук Це Гец Сім Пе 1775 1780 1785

Агр ух 5ег ТНг 5ег Азп Азп Геи біп Ап біп Ахп гей Аге Тгр 1790 1795 1800

Гуз Меї Тік Ріе Абп Су б5ег Су 5ег 5ег Ма! Су ТАг Тер Гу5 1805 1810 1815 5ег ух Азпіецй Гуз біу Пе Ре біп Рпе Аге Ма! Ма! Аа Аа 1820 1825 1830

Абп А5п їеци бу Ре бу сш Тух 5ег бі Ме 5ег. Си Ап Пе 1835 1840 1845

Пе цеи Маї СУ Ар Азр Ре Тгр Ме Рго Сім Тг 5еє Ре Це 1850 1855 1860

Ге Тиг Пе Пе Маї Су Пе Ре ге Маї Ма! Тпг Пе Рго Се 1565 18570 1875

Твіг Рбе Маї Тгр Ні Агр Аге Гец Гух Ап біІп ух 5ег Аа Гу 1880 1885 1890

Сім Сіу Ма! Тпк Маїїец Це Ап Сіш Ар Гуз ОЇн Гец Аа См 1895 1900 1905

Гей Аге Су Геи Аа Аа Су Ма! С)у Гей Аа Ахп Аа Су Туг 1910 1915 1920

АДіІа Це Ні Тиг Геи Рго Таг сп Сію с) Пе Ом Азп Гей го 1925 1930 1935

Аа Ре Рго Аге Сі Гуз еи Тс ей Аге Гей Ге Ге Су 5ег 1940 1945 1950 сіу АІа РНе сім Сім Маї Туг СІ су Те Аа Ма! Азр Пе Геи 1955 1960 1965

Оу Маї Су бег Оу Сім Пе Гуз Маї АІз Ма! ух ТНг Тец Гу 1970 1975 1980

Гуз ОЇуУ 5ег ТНг Ар Сп Сію Гуз Пе бі Рпе Гец ух бій Аа 1985 1990 1995

НіхГец Меї б5ег (ух Ре Ап Ніє Рго Доп Це Ге Гу Оп Гей 2000 2005 2010 біу Ма! Суз Ге ец Ап бім Рго біп Туг Пе Пе Те бід ей

2015 2020 2025

Меї бі бу су Азріеціец ТНк ТугГеи Ага Ту Аа Аге Меї 2030 2035 2040

Аа Тиг Ре Туг ау Рго Гец Гец Тег Ге Ма! Ар Геи маї А5р 2045 2050 2055 ги Суз МаїЇ Ар Пе бег Ку бу Су Ма! Тугієц Сім Аге Меї 2060 2065 2070

Ніз Ре Пе Ніх Аге Ар Ге Ага Аа Аге Азп Су Геи Ма! бег 2075 2080 2085

Уа! Гуз Ар Тук Тіг 5зег Рго Аге Пе Ма! (у Ме су Азр Ре 2090 2095 2100

Оу 1еи Аа Аге Ар Пе Туг ув Азп Ар Тує Туг. Аге Цуб Аге 2105 2110 2115 ох сш ом ей ге Рго Маї Аг Тер Меї Аа Рго Си бег ги 2120 2125 2130

Ме Азр СМ Пе Ре Тнг Тпг біл б5ег А5р Ма! Тгр. бег Ре бу 2135 2140 2145

Ме ем Пе Тгр СІ Пе Геи ТНг Гец Су Ніз Сіп Рго Тує Рго 2150 2155 2160

Аа Ніх 5ег Ахп Ге Ар Маї Гец Ап Туг Ма! сп. ТАг Су Су 2165 2170 2175

АгиІеи ОЇ Рго Рго Агя Абп Сух Рго Ар Ар Гец Тер Ап Тед 2180 2185 2190

Меї тиг сСіп Су Тгр Аа біп Сію Рго Ар с!п Аге Рго Тег Ре 2195 2200 2205

Ніх Аге Пе біп дер Спец біпіен Ре Агр Азп Ре Ре Геч 2210 2215 2220

А5п бег Пе Туг Туз зег АгеЕ Авр Сім Аа Азп А5п бег Су Маї 2225 2230 2235

Ше деп Ом бег Ре бій бу Си Ар біу Азр Ма! Ме Сух ей 2240 2245 2250

Абп 5ег Ар Ар Ме Меї Рго Маї Аа Геи Мей бю Таг Гу Абп 2255 2260 2265

Ате сій ОМ Ген Асп Туг Меї Ма! Гей АїЇа Тиг сш Су Сі сій 2270 2275 2280

Су Сім би Гу бег бім Су Рго Ге бу Зег СіІп Сі 5ег См 2285 2290 2295 бег Су Су Геч Аге Гуз Ом Сім Цуз Си Рго Ніз Аа А5р Гу 2300 2305 2310

Ар Ре Су біп см С у5 сій Маї Аа Туг Су Рго 5ег Оу Гу 2315 2320 2325

Рго абІш ОМ Те Азп Туг Аа Сух Іец Тек Ні 5ег. СОІУ Туг Су 2330 2335 2340

Ар Оу 5ег Ар «21052 «211» 278 «212» ПРТ «213» Ното заріеп5 «220» «221» МІ5С ЕГЕАТИКЕ «222» (1).4278) «223» Кіназний домен КО51 людини «400» 2 ем Тігіец Аге (еи Теци (ец Су 5ег СІу Аа Рпе бу Сім Маї Туг 1 5 10 15

См су Тлг Аа Маї А5р Пе їеи Су Ма! Оу 5ег су Су Пе Гу зо

Уа! Аа Ма! цу Тиг їеи уз Гух СіІу зег Тік Ар Сп Січ Гуз Пе

СіІц Рне ем Гуз Сім Аа Ні Те и Меї 5ег (ух Ре Ап Ні Рго Абп

МПе Гей (ух Спец бу Маї Су Ге Ге Азп си Рго біп Тує Пе 65 70 75 80

Ме сем Сію еу Ме: сім Сіу біу А5рец їеи ТНг Туг Ге Аге Гу 85 90 95

Ла Ате Меї Аа Тиг Рпе Туг оїу Рго Ге ем Тігеч Ма! А5р ей 100 105 110

Ма! Ар ем Су Ма! Ар Пе 5ег Гуз СМ Су Ма! ТугТец Сім АгЕ 115 120 125

Меї Ні Рне Іе Ні Аге Ар Геиц АїЇа Аа Агя Ап Суб Геци Ма! 5ег 130 135 140 уаїЇ Гуз Азр Туг ТНг бег Рго Аге Ме Ма! Гу Пе су А5р Рпе оїу 145 150 155 160

Гец Ав Аге Ар Пе Туг (ух Абп Абр Туг Туг Аге Гуз Аг ом ої

165 170 175

Оу еп еи Рго Маї Ага Тгр Ме Аа Рго Сім бегіеи Меї Азр біу 180 185 190

Ме РНе Тнг Тнг Сіп 5ег Дер Уаі Тгр бег Ріе Су Пе Гец Пе Тур 195 200 205

Сім Пе Гей ТНг Ге ОМ Ні біІп Рго Туг Рго Аа Ніх бек Ап ей 210 215 220

Авр Уаї (еи Абп Туг Ма! СІп Те біу бу Аге Ге СІЧ Рго Рго Аге 225 230 235 240

Азп Су Рго Ар Ар Ге Тер Ап Гей Мей Тпг Сп Сух Тер Аа СіІп 245 250 255

Сім Рго Ар Сп Аге Рго Тег Рне Ні Апе Пе СіІп Ар Сп Сецч Сп 260 265 275

Ге Ре Агя Азп Рпе Ре 275

«210» З «211» 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» 51С34А2, екзон 4, пряма «4002 З

Ісввашсї стастнє вія 23 «2102 4 «2112 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» СО74, екзон 6, пряма «400» 4 сІССТЕШЕеЕ аазірарсає є 21 «210» 5 «2112» 20 «2122 ДНК

«213» Штучна послідовність «220» «223» КО5І1, екзон 32, обратная «4005 5

Еваагессія вшацтев 20 «2102 6 «211» 23 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «223» ВОБ51, екзон 34, обратная «400» 6 ігааасняє цсіретас саа 23 «210» 7 «2112» 21 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» КО51 ІпУРСЕ Б1

«400» 7

ВІСівЕрсаїа раарацааа р 21 «210» 8 «2115 20 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 ВКО51 ІпУРСВ 2 «А» 8 азасеаавас азарарітре 20 «210» 9 «211» 20 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232 КО51 ІпУРСА К1 «400» 9 вісартввва Чегаасаас 20 «2105 10

«211» 19 «2122 ДНК «2132» Штучна послідовність «220» «223» НО51 ІпУРСА 82 «400» 10 зааснен стеегатсс 193 «210» 11 «211» 18 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» ВО51 Вгеак Кем1 «А» 11 сарсісарсс аасісці 18 «210» 12 «211» 33 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220»

«223» ВО51 Е4ЗД1

«400» 12 їлашссс азасаасесі айазісара сес 3 «210» 13

«211» 23

«212» ДНК

«213» Штучна послідовність

«220»

«223» ВО51 ЕЗАВ

«А0О» 13 тгавасцвї псСгретатс саа 23 «210» 14 «2115 23 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» СО74 ЕЕ «400» 14 ссірадасас сцазразса сса 23

«210» 15 «211» 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «2232» 5ІСЗАД2О БАє «А0О» 15

Ісевацієї стаснинс яв 23

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування аденокарциноми легень, що включає етап, на якому вводять пацієнту, який потребує такого лікування, сполуку Формули І Ж о т Же ве зр бе в хх у «З З 23 й ШИК Я ще в М У ТО ТЕ се Б Ї і Це В той З хх оз я жи дія Зх І Формула або її фармацевтично прийнятну сіль, де: А! являє собою галоген; В: являє собою галоген; ВЗ являє собою (С:-Св)алкіл; В" являє собою (С1-Св)алкіл; та О являє собою СН або М, де аденокарцинома легені являє собою недрібноклітинний рак легені, позитивний по злиттю ЗІ С34А2-8051, СО74-КОБІ1 або РІС-ВОБ51.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що сполука Формули І являє собою сполуку Формули Іа

Я ї у ува 3 они ЗУ - З дек ек о Є яю на КІ Ід їх Формула Іа або її фармацевтично прийнятну сіль, де: В' являє собою галоген; В: являє собою галоген; та О являє собою СН або М.

3. Спосіб за будь-яким із пп. 1 або 2, який відрізняється тим, що сполука Формули | являє собою сполуку 1 я я т мч Ве ее нт п кое и Ох З ' сполука 1 або її фармацевтично прийнятну сіль.

4. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що сполука 1 являє собою М-(4-16,7- біс(метилокси)хінолін-4-іл!оксиуфеніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксамід або його фармацевтично прийнятну сіль.

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що сполуки Формули І, Формули іа і сполука 1 являють собою (І )- або (0)-малатну сіль.

6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що сполука Формули І представлена в кристалічній формі М-1 або формі М-2 (І )-малатної солі та/або (0)-малатної солі.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняється тим, що сполуки Формул І, Іа або сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій, допоміжну речовину або розріджувач.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після іншої форми лікування.

9. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном.

10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином.

11. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її Зо фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування карбоплатином та/або гемцитабіном.

12. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І вводять після лікування цисплатином та/або карбоплатином.

13. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування доцетакселем.

14. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом.

15. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном.

16. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування кризотинібом та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем.

17. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль вводять після лікування цисплатином та/або гемцитабіном, та/або доцетакселем.

18. Спосіб лікування недрібноклітинного раку легень, позитивного по злиттю КОБ1, у пацієнта, який потребує такого лікування, що включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки 1 або її фармацевтично прийнятної солі.

19. Спосіб інгібування або реверсування розвитку патологічного клітинного росту у ссавця, який включає етап, в якому вводять сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль, причому патологічний клітинний ріст являє собою рак, опосередкований кіназою КО51.

20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що рак являє собою аденокарциному легені.

21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що аденокарцинома легені являє собою недрібноклітинний рак легені.

22. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що аденокарцинома легені являє собою недрібноклітинний рак легень, позитивний по злиттю 5 С34А2-НО51, СО74-КО51 або РІС- ВО51.

23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій.

24. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій, причому фармацевтичну композицію вводять щоденно протягом більше ніж З місяців.

25. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у вигляді фармацевтичної композиції, що містить сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль ії щонайменше один фармацевтично прийнятний носій; причому фармацевтичну композицію вводять у дозі 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 або 95 мг/добу.

26. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що виявлення недрібноклітинного раку легені, позитивного по злиттю 5ІС34А2-НО51, СО74-КО51 або РІС-КО51, здійснюють |(із Зо застосуванням аналізу РІЗН (флуоресцентної /л 5йи гібридизації), СІЗН (хромогенної /пл 5йи гібридизації) або 5ІЗН (посиленої сріблом /п 5Ли гібридизації).

27. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що виявлення недрібноклітинного раку легені, позитивного по злиттю 5ІС34А2-НО51, СО74-КО51 або РІС-КО51, здійснюють |(із застосуванням будь-якої форми геномної ПЛР, прямого секвенування, ПЛР-секвенування, ЗТ- ПЛР або аналогічного аналізу.

28. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що виявлення недрібноклітинного раку легені, позитивного по злиттю 5ІС34А2-НО51, СО74-КО51 або РІС-КО51, здійснюють |(із застосуванням антитіла, яке специфічно зв'язується з химерним поліпептидом 5І С34А2-8О51, СОр74-КоО51 або РІС-КО51 або його фрагментом.

29. Спосіб діагностики і лікування пацієнта, в якому пацієнт має пухлину НДРЛ (недрібноклітинного раку легені), і вказана пухлина ідентифікована як НДРЛ, позитивна по злиттю 5 С34А2-НО51, СО074-КО51 або РІС-КО51, і вказане лікування включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки Формули І або її фармацевтично прийнятної солі і щонайменше одного фармацевтично прийнятного носія.

30. Спосіб лікування аденокарциноми легені, яка являє собою недрібноклітинний рак легені, позитивний по злиттю 5І С34А2-НОБІ, СО74-КО51 або РІС-КОБІ1, у пацієнта, який потребує такого лікування, що включає етап, в якому вводять вказаному пацієнту терапевтично ефективну кількість сполуки 1 мі х я в в б т те З х Я У ік си, щи 5О пжя ще сполука 1 або її фармацевтично прийнятної солі.

31. Спосіб за будь-яким з пп. 1-30, який відрізняється тим, що ефективна кількість сполук Формули І, Іа або сполуки 1 забезпечує щонайменше один терапевтичний ефект, вибраний із групи, що складається зі зменшення розміру пухлини, зменшення метастазування, повної ремісії, часткової ремісії, стабілізації захворювання, збільшення загальної частоти відповідей або повної патологічної відповіді.

32. Спосіб інгібування активності химерної кінази КО51 у раковій клітині, що включає приведення в контакт вказаної клітини з ефективною кількістю сполуки Формули я М зуби М Зк жу Ї 3 не ше я Б В г в ле Кк ее б Мо В жопа ев. ех шо х Е- Миши 7 Формула або її фармацевтично прийнятної солі, де: В' являє собою галоген; В2 являє собою галоген; ВЗ являє собою (С:-Св)алкіл; В" являє собою (С1-Св)алкіл; та О являє собою СН або М.

33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що ракова клітина являє собою клітину аденокарциноми недрібноклітинного раку легені.

34. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що ракова клітина являє собою клітину аденокарциноми недрібноклітинного раку легені, позитивного по злиттю 5І СЗ34А2-НОБ51, С074- КОЗ5І1 або РІС-БОБ1.

35. Спосіб за будь-яким із пп. 32-34, який відрізняється тим, що сполука Формули | являє собою сполуку Формули Їа М х М «ек в - Е М З й-я КЕ і т 7 Формула Іа або її фармацевтично прийнятну сіль, де: А! являє собою галоген; Вг являє собою галоген; та Зо О являє собою СН або М.

36. Спосіб за будь-яким із пп. 32-35, який відрізняється тим, що сполука Формули | являє собою сполуку 1

Я кет оре ї ер»

Її. дит нів ! З о бодій Як дв Ку ' га поет Ж зро хх я нм ще Пам 19 сполука 1 або її фармацевтично прийнятну сіль.

37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що сполука 1 являє собою М-(4-16,7- біс(метилокси)хінолін-4-іл!оксиуфеніл)-М'-(4-фторфеніл)циклопропан-1,1-дикарбоксамід або його фармацевтично прийнятну сіль.

38. Спосіб за будь-яким із пп. 32-37, який відрізняється тим, що сполуки Формули І, Формули Їа і сполука 1 являють собою (І )- або (0)-малатну сіль.

39. Спосіб за будь-яким із пп. 32-38, який відрізняється тим, що сполука Формули представлена в кристалічній формі М-1 або формі М-2 (І)-малатної солі та/або (О)-малатної солі.

40. Спосіб за будь-яким із пп. 32-39, який відрізняється тим, що сполуки Формул І, Іа або сполуку 1 або її фармацевтично прийнятну сіль вводять у ракову клітину у вигляді фармацевтичної композиції, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій, допоміжну речовину або розріджувач.

Фіг.1 вові Ж |) і Зима 16м | 7 --( воОЗіЖ 0 см вотк сб) | вові 7 Босуєа | ковку (ос Б | вові І зо ем | позі || - Го я (в вовк 30 г ке |з возі т Сотяма ГЕО вовк З М.11) 5 т ще 2 а с - -ж 6 | Б вк Па 5 Сов Теж вок - 2 5 ЕК З ш о ж

Фіг. 2 Інгібування РКО5 11 вай Б З Я х 07

0.8 з б ; і

« 0.3 в 02 ! 01 Є йо З -4ао(о-1 о 1 2 З а 5 Іов (сполуки), НМ т Кабозантиніб (ІСво-26 НМ) А Кризотиніб ІСев-:743 ЯМ)

Фіг.

З

МКМІТСЦІРК ГЛЛЕАТІЦОСІ, МІБУЧОСТЯЄ МеСІК5СУТИ ПоООГО0оТР НМІ5ЕРСІОС СНЕММВУВОК зо «0 50 бо 70 МСАТКСВЕБС ЕМИЕСББАВСА УБЕЕМПСЕМАСЄ ТРТАРЕАБ5І о5НниМТГКик.

БАМЕБСУКТЧІ чІОНКІАОІо яо 90 100 110 120 130 140 БшШТУТКТУВЕ РЕУЛЖРІНЕ ЕТЕЖІЕВЛЛІ ІЕТАСОТОГУЄ РРБРБУКТНЕ НОУРЕТАРЬІ ЕМІБЕБББРІТ 150 160 170 180 190 200 210 УБИБМЮРРОЕ РОСОРІГССЯМУ ВБІВБКМОКОО АСТОВТЕОЕ У5ТІОРМТІчВ ЕБІААММЧЕУС ЕСРЕАЕББІТ 220 230 240 250 260 270 280 Т8ВБАМООБЕ ОМЬРІБВКТЕ ІВКАБІЖНІМ ОБАНСІВІОРА ІУНМІТСІЯУ ОУНООІТУТЕЯ ЕСТОТИАККА 290 300 310 320 330 з40 350 АММ5РУБТЕ ІЕХКОСБОТІБВ ЗІБІГЯМУОВК МУРБІМОЕЦУЄ УСОСЕМСЯМІ ЕЕТТЕРРЕІБЗА РОКІУАОБУМ збо 370 зво 390 400 410 420 стУКчІ во ІТВКАГРУВВ СВСАЕАУуВІУ ЕЗСТІКОЕАІ КРОАКАТІЧК МОтТАОУуКМеТ ЕІ ЗАБНІІ 430 440 «во 460 470 480 490 ГЕРВІРЕАОУуУК ЗЕАСЕКМОВІ, УТОСКУТЕОО ПАСБЕМЕКІМ ССОГЯНІБЕЕ СБОМІЛІКОВ ЗБОСНРІРСВ 500 510 520 539 540 550 560 ТОБІЄМЬКОВ НОАЛІЛЮЩДКРР АГІАІСАММУІЬ ІБОІІВІРЕІ; ОРБАМОМИТУ ЕУКУВТОЮРРО БУТНІРІМІВ 579 5ВО 590 600 610 620 630 СТМІМУРЕІО БАМКЯКУЄУВ АВБРКАРОРЙ ЗЕРЕУСТТІ/ РАЄЕРРРІМА УКЕОСІЛЯКР ПМОРОРОВЕ,, 640 650 во 670 во 590 700 зЗБ5оІсМмУбОоМ 0 пИЖММечи ОоТкагДлЕуУМИ ІНСТРІЗЕНУ НОРБІАСАСА 0 БАБЕКОСНЕЇ, УЖдоКтУУТО тій 728 тза 1740 тва тво 770 кОоБУуБТенНтТО ІЧТНУКІКЦУМ плБУуССТ ПУКТТОХ5УЄ ЗТВТМСЕББІ, УПОТОРМЕЗО ККМІАЦСТІЮМ, 780 790 воо 810 820 810 810 БОС РБОСІНСЖТА УуссОоБТОоОТ ТІТЕЕААИВТ БЕІБОМАСМУ їБОВОЕМІща ЕВІТТТОвТО 85о вео 870 вво во 900 10 ОКТБУБУЦЕР АБЕМОЕТІІО ТОШКРОРОМЕ ЗЕТРЕМІРО5 УОБББЕКІЕС МАББРОТІЛІМ ОРРАЛЛЮЧУ 920 930 940 950 зво 970 зво ЕХ5УКЕБАНО КЕБАБЕОНБІ.

РУЕТУВСОСЕР ХАБЕМІБУТЕ УТУШОКОРЕТ БЬБІВАРЕТУ ЕБАРЕМЕКІК 990 16000 1010 1020 1030 1040 1050 ІБРЕСКССМК 0 МЕЛЛЛЛУВММ КЕКНЕМНСМІТ КЕЕІТЕТМІ5М ОБІТМКТСЕО МІАМУМЧГЛТРБУ МВС ЕСМБР 1050 1070 1080 1090 1100 1119 1120 ЕСЕТІАКОУВА ВКТЗКСРОРУА пУУКЗТТ5ЕЇ МРЕРНІІТІІ, СМКІМЕЦОМО ОМОУУЮТЕБА ЕНМУІЗАУСУТ 1130 1140 115 1150 1170 1180 1190 АРМЕМСТУАЕ СОБОЕСЬНІН о МАБаБЕСКО0Й БІМЕРІТУЇІТ ІЖІБВНІУЕ АСПКЕБОМОМО 0 УКОМОСЕНКУМ 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 КУРЕЕУКІНМ ВНМБТІІЇІ5ЕБУ УРІЇБВСУМТ ЕЧБОМЕСХОМЕ ХХБІІБНТІН ВІГОРТАТМНО оОМКЕМОСеСМ 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 МТЕЕЕЦБОАМ АТГУГЗМОЕКР ПІУБАКАОКІ МАМОСЕССОС НКМІТУРАМІ, дактиУувотУ РОЦІ ТУТІТ 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 АКОБТОІт1УСА ККОМСАТУВО 0 УКАГВБКНІЇ АУББММОРЕР ОКАКЬБГАБО 0 ТтУЕРТІПМАТ Ммт5ОтІНЬРІ, 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 АКТМГТЯОІ ТеРТРТУСУХ ХАЕЛІИЖКМЕ ЗПІКУКІСЕБЕ ООБІАІТЕПІ, ОРЕБТУМІОІ АУКМУІХ5ОРІ, 1180 1290 1500 1510 1520 1530 154590 ЕНІРЕОКЕІМ ОКТЕМОУРЕА 0 УОСІМТТУНЕ ОТ5УПІІБВИНИВЕ ЗНЕРМНСРКЕЄ УВАЖХОЦАІВ5НІ, АГІРЕТРЬКО 1550 1560 1579 1580 1590 1600 1510 БЕЕРМСВІТІ, ІРА БОС УЛЬКМПАСНе ЕЕМИСТЕВНе УТМЕМЕМТРЕ КРУБОМРЕНТ ЗБОВМАКАРІ: 1620 1630 1640 1650 1650 1670 1680 НАЛИТЕЕІУЕ ПОКИКУМЕКУ нУКТЗСВБОЮВ АЖУСМІТНІО РУТБУМУВУМУ 0 УУТКТОСЕМОТ 5ОПРЕБЕКТКА 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 СУРМКРСІРК ппЕСВЕщеТО ЩМЕКАВЕОЧИСК ІТУЧчТІТЕТЕК БТеММЦОМОМ БВИКМТЕМОСЗ сввУустикКк 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 МП КОСІКОвКВУ МААММІАЕСЕ УБСІБЕМІІ, УСООМЯТРЕТ БЕЇІПТІТУСІ ЕБУУТІРІТЕ МИнНЕВІКМОК 1830 18540 1850 1860 1870 1880 1890 ЗАКЕСУТУУ,Ї МЕІЖЕГАВТЕ ВГААаУСТАМ АСУАІНТІРТ ОБЕБЕІтІЕМЕ РАК РЕЕКІЛТІВІ, ПОБСАВЕСЕУТ 1900 1910 1920 1930 1940 1950 1950 ЕОТАУТ ау ОБОЕТЇКУАУК ТЕКСТІ КІБЕТСКЕАНІ.

МБКЕМНЕМІЇ, КОБОМСЬОМЕ РОТІІПЕІМЕ 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 ОСОІШТУВАК АВМАТРУСРЬ ПТІАЛЛАЛИЄС УПІВКОСУТЬ БВМНЕІНВОЇ ААВМСІЛ/БУК ПУТЯРВІУКІ 2040 2050 2066 2070 2080 2090 2100 ОПЕСГАКО1 У КМрУУВКВСЕ СО РУВММАР ЕБІМОСІЕТТ ОБІЛЛІВЕСТІ, чшЕтІтІснО ВУРАНБМНООУ 2110 2120 2130 2140 2150 2160 21720 МТ устоснІ, ЕБЕРЕМСРОПІ, УчІМТОоСспАО ЕРООКРТЕНІН чІОгОГОгЕВМ ЕБІМБІТКБЕ ПЕАМНМБСУТМ 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 ЕБЕЕСЕТМОДУ ІСІМЯБОРІМЕ УАДІМЕТЕМНЕ аІМУМуУСЬТЕ СсОоОснЕКБЕО РІСБОЕБЕВС ОПНКЕЕКЕВН 2250 2250 2270 2280 2290 2300 2310

АРКОЕСОЕКО ЧАХСЕБСЕКРЕ СІНІАСІТНВ стсраБо

2320 2339 2340 2347

- Людський білок КОВІ, номер доступу ОпіРтоє РОВЗ922: БЕО 10 МО: 1

Фіг. 4 Кіназний домен КОБІ, 5БО І МО: 2 Теп ТК Пей Ага Гей пе Пец біу Бек Сіу А1а Рре Сі1іу 01 Уа1! Тут бій сіу ТІ А1а Ууа1ї АвБр ч11е Ггец с1у Мма1 с01у бек С1у 01 Іїе цув Ууаї А1а уаї пув Тик Гей пу ПувБ б1іу Бек Тіг АБр біп п02п ГПу5 І1е бі Рпе Гей Ппув бі АтТа Ні Гей Мес бек Гує Рпе Ап оНіє Рко АБп І1е Гей Гув с1іп Те біу Ууаї Сув теп Ппеп Авп бій Рго сіп Тух І1е т112 Ієц 514 Тєц Мес сі 01у 01У АвБр Ппецп Ге Тік Туу Ппейп Аку пуб Аза Аку Мес Аза Тк РБе Тук б1іу Рго Гей Ппей Тпт Гец Уаї АБр тей Ууа1ї Авр Пец Суб Уа1і АБр І1е бег Гук п1у Сув уаї Тук Пеп Сіц Агу Меє Нік Рпе І1їе Ніє Агд Ар геї Аіїа Аза АК Авп оСув Гей уа1і бек уаі губ Авр Тук Тіт бБег Рко Акоа І1е уаї Ппув І1е с1у Ар Ре 01у Пей А1їа АгЯ АБр ч11е Тук Пубв АбБп АБр Тук Тук Ака Суб АгЯ б1у біц с01у Гей Пей Рго уа1ї Агу Тер Мес А1та Рко стій бБет Без Мес АБр п1у І1е Рпе Тк ТПг біп Бек Авр Уаї! Тгтр Бек Рпе 01У І1е реп І1е Тгр сі І1е Пе Тк пес Ссіу Ніє сіп Рко Тук Рго А1а Нів бЗег Авп о Гец Авр Ма! Пеп Авп оТук Уа! Сіп Трт с1у С1у Акд ГПеп а1и Ркго Рго Аку АвпоСув Рго Авр о Авр Гей Ткр Авп Пец Ме ТІ біп Сув Тер А1а сіп бі Рко АБр б1іп Ага Рко Тк РБе Нів Агу тТ1е біп АБр біп Геп сіп Ге Ре Аг Азп о Ре Ріє