KR102474701B1 - 폐 선암종을 치료하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물인 MET, VEGFR2 및 ROS1의 저해제를 이용하여 환자, 특히 폐 선암종을 지닌 환자, 더욱 구체적으로는 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암을 지닌 환자에서 암의 치료에 관한 것이다:
Figure 112016115330543-pct00034

Description

폐 선암종을 치료하는 방법{METHOD OF TREATING LUNG ADENOCARCINOMA}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 PCT 출원은 2014년 4월 25일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 61/984,599의 유익을 주장하며, 이 기초출원의 개시내용은 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
서열 목록
본 출원은 2015년 4월 27일 오후 12시 54분에 작성된 "EX14-003C-PC_2015_04_20_SEQUENCE_LISTING_ST25.app"라는 명칭의 서열목록의 그의 전문을 참고로 편입하며, 이 서열목록은 26KB이고, 본 명세서와 함께 전자적으로 제출된다.
발명의 기술분야
본 발명은 암, 특히 폐 선암종을 수용체 티로신 키나제의 저해제를 이용해서 검출, 진단 및 치료하는 것에 관한 것이다.
폐암은 전세계적으로 암-관련 사망률의 주된 원인이다. 표적화된 요법의 최근의 발달은 비소세포 폐암(NSCLC)에서 치료 패러다임 변이를 초래하였다[Mok TS, Wu YL, Thongprasert S, Yang CH, Chu DT, Saijo N, Sunpaweravong P, Han B, Margono B, Ichinose Y, Nishiwaki Y, Ohe Y, Yang JJ, Chewaskulyong B, Jiang H, Duffield EL, Watkins CL, Armour AA, Fukuoka M. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 2009 Sep 3;361(10):947-57. Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, Sugawara S, Oizumi S, Isobe H, Gemma A, Harada M, Yoshizawa H, Kinoshita I, Fujita Y, Okinaga S, Hirano H, Yoshimori K, Harada T, Ogura T, Ando M, Miyazawa H, Tanaka T, Saijo Y, Hagiwara K, Morita S, Nukiwa T; North-East Japan Study Group. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 2010 Jun 24;362(25):2380-8]. 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나제 저해제(TKI), 게피티닙 및 에를로티닙 및 역형성 림프종 키나제(ALK) TKI, 크리조티닙은 EGFR 돌연변이 또는 ALK 유전자 재배열을 지닌 NSCLC 환자에서 임상적 활성을 나타내었다[Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, Shaw AT, Solomon B, Maki RG, Ou SH, Dezube BJ,
Figure 112016115330543-pct00001
PA, Costa DB, Varella-Garcia M, Kim WH, Lynch TJ, Fidias P, Stubbs H, Engelman JA, Sequist LV, Tan W, Gandhi L, Mino-Kenudson M, Wei GC, Shreeve SM, Ratain MJ, Settleman J, Christensen JG, Haber DA, Wilner K, Salgia R, Shapiro GI, Clark JW, Iafrate AJ. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010 Oct 28;363(18):1693-703. Shaw AT, Camidge, Engelman JA, Solomon BJ, Kwak EL, Clark JW, Salgia R, Shapiro, Bang YJ, Tan W, Tye L, Wilner KD, Stephenson P, Varella-Garcia M, Bergethon K, Iafrate AJ, Ou SH. Clinical activity of crizotinib in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) harboring ROS1 gene rearrangement. J Clin Oncol. 2012 30 (suppl; abstr 7508)]. KIF5B(키네신 패밀리 5B) 유전자 및 RET 발암유전자의 융합은 최근 NSCLC 환자의 1 내지 2%에서 드라이버 돌연변이로서 보고되었고 치료 표적으로서의 초점이다[Kohno T, Ichikawa H, Totoki Y, Yasuda K, Hiramoto M, Nammo T, Sakamoto H, Tsuta K, Furuta K, Shimada Y, Iwakawa R, Ogiwara H, Oike T, Enari M, Schetter AJ, Okayama H, Haugen A, Skaug V, Chiku S, Yamanaka I, Arai Y, Watanabe S, Sekine I, Ogawa S, Harris CC, Tsuda H, Yoshida T, Yokota J, Shibata T. KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):375-7. Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, Suzuki R, Sakata S, Hatano S, Asaka R, Hamanaka W, Ninomiya H, Uehara H, Lim Choi Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Mano H, Ishikawa Y. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-81. Lipson D, Capelletti M, Yelensky R, Otto G, Parker A, Jarosz M, Curran JA, Balasubramanian S, Bloom T, Brennan KW, Donahue A, Downing SR, Frampton GM, Garcia L, Juhn F, Mitchell KC, White E, White J, Zwirko Z, Peretz T, Nechushtan H, Soussan-Gutman L, Kim J, Sasaki H, Kim HR, Park SI, Ercan D, Sheehan CE, Ross JS, Cronin MT,
Figure 112016115330543-pct00002
PA, Stephens PJ. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):382-4]. 따라서, NSCLC에서 주된 드라이버 유전자를 확인하고 환자의 각 게놈 서브세트에 대한 요법을 개발하는 것이 점점 더 중요해지고 있다.
이들 및 기타 요구는 티로신 키나제 활성, 구체적으로는, ROS1 키나제 활성의 저해제를 사용해서 폐 선암종을 치료하는 방법에 관한 본 발명에 의해 충족된다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 ROS1 키나제 및/또는 ROS1 융합 단백질을 조절하는 치료적 유효량의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 비소세포 폐암(NSCLC)이다. 특히 폐 선암종은 가장 빈번하게는 SLC34A2-ROS1 융합-양성 NSCLC, CD74-ROS1 융합 양성 NSCLC, FIG-ROS1 융합 양성 NSCLC(예컨대 CD74-ROS1, FIG-ROS1, FIG-ROS1(L), FIG-ROS1(S) 및 FIG-ROS1(VL)) 및 기타 공지된 ROS1 융합 단백질을 보유하는 NSCLC이다. ROS1 키나제는 인간에서 염색체 6 상의 ROS1 유전자(6q22)에 의해 암호화된다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 비소세포 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 NSCLC를 치료하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 ROS1 및/또는 ROS1 융합 단백질을 동시에 조절하는 치료적 유효량의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
이러한 양상 및 기타 양상의 하나의 실시형태에 있어서, ROS1 키나제 저해제 또는 ROS1 융합 키나제 저해제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016115330543-pct00003
식 중,
R1은 할로이고;
R2는 할로이며;
R3은 (C1-C6)알킬이고;
R4는 (C1-C6)알킬이며; 그리고
Q는 CH 또는 N이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016115330543-pct00004
식 중,
R1은 할로이고;
R2는 할로이며; 그리고
Q는 CH 또는 N이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016115330543-pct00005
화합물 1은 N-(4-{[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드로서 그리고 명칭 카보잔타닙으로 알려져 있다. 2012년 11월 29일자로, N-{4-[(6,7-다이메톡시퀴놀린-4-일)옥시]페닐}-N'-(4-플루오로페닐) 사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드의 S-말산염(즉, L-말산염)(카보잔티닙 또는 코메트리큐(COMETRIQ)(등록상표)로서도 알려짐)은 진행성, 전이성 수질 갑상선암(MTC)의 치료를 위하여 미국 식약청에 의해 승인되었다. 2013년 12월에, CHMP(European Committee for Medicinal Products for Human Use)는 진행성, 절제 불가능, 국소 진전, 또는 전이성 MTC의 제안된 적응증에 대해서 코메트리큐에 대해서 EMA(European Medicines Agency)에 따라서 MAA(Marketing Authorization Application)에서 긍정적인 의견을 발표하였다. 카보잔티닙은 전이성 신장 세포암(RCC), 및 진행된 간세포암(HCC)에서 진행 중인 3상 임상시험을 비롯하여 광범위한 개발 프로그램에서 평가되고 있다.
화합물 1은 c-MET, RET 및 VEGFR2의 강력한 저해제이다[Yakes FM, Chen J, Tan J, Yamaguchi K, Shi Y, Yu P, Qian F, Chu F, Bentzien F, Cancilla B, Orf J, You A, Laird AD, Engst S, Lee L, Lesch J, Chou YC, Joly AH]. 신규한 MET 및 VEGFR2 저해제인 카보잔티닙(XL184)은, 전이, 신생혈관 생성 및 종양 성장을 동시에 억제한다[Mol Cancer Ther. 2011 Dec;10(12):2298-308; Bentzien, F., Zuzow, M., Heald, N., Gibson, A., Shi, Y., Goon, L., Yu, P., Engst, S., Zhang, W., Huang, S., Zhao, L., Vysotskaia, V., Chu, F., Bautista, R., Cancilla, B., Lamb, P., Joly, A. and Yakes, M]. 갑상선 수질암 모델에서 RET, MET 및 VEGFR2의 저해제인 카보잔티닙(XL184)의 시험관내 및 생체내 활성[Thyroid, 2013 (23) 1569-1577]. 전임상 연구에서, 키나제 활성의 화합물 1-매개 저해는 종양 맥관 구조의 신속하면서도 강인한 퇴행을 일으키고 종양 침습 및 전이를 저감시키며, 그리고 생존을 연장시켰다[Sennino B., Ishiguro-Oonuma T, Wei Y, Naylor RM, Williamson CW, Bhagwandin V, Tabruyn SP, You WK, Chapman HA, Christensen JG, Aftab DT, McDonald DM. (2012), "Suppression of tumor invasion and metastasis by concurrent inhibition of c-Met and VEGF signaling in pancreatic neuroendocrine tumors.", Cancer Discovery, 2(3):270-87 (Epublished, 02/24/2012)].
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia의 화합물, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, ROS1 키나제 활성의 구성적 활성화를 유도하는 염색체 재배열로부터 기인한 희귀 수용체를 포함하는 발암성 융합 키나제를 저해하기 위하여, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다. 이들 ROS1 융합 키나제는 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이용해서 저해를 표적화한다. 이들 화합물은, 폐 선암종, 예를 들어, 1종 이상의 발암성 ROS1 융합 키나제를 보유하는 비소세포 폐암종을 치료하기 위하여, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 비소세포 폐암 또는 NSCLC 세포주에서 ROS1 키나제 및/또는 ROS1 융합 키나제 활성을 저해하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 ROS1 키나제 및/또는 ROS1 융합 폴리펩타이드를 보유하는 상기 비소세포 폐암 또는 NSCLC 세포주에 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 말산염 또는 화학식 I의 화합물의 다른 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 ROS1 융합 양성 NSCLC, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합-양성 NSCLC, 및 기타 공지된 ROS1 융합 양성 NSCLC, 예컨대, ROS1 융합 CD74-ROS1, FIG-ROS1, FIG-ROS1(L), FIG-ROS1(S) 및 FIG-ROS1(VL), 및 인간에서 염색체 6 상의 ROS1 유전자에 의해 암호화된 기타 ROS1 융합 단백질을 검출, 진단 및 치료하는 방법을 제공하되(문헌[Bergethon K, Shaw AT, Ou SH, Katayama R, Lovly CM, McDonald NT, Massion PP, Siwak-Tapp C, Gonzalez A, Fang R, Mark EJ, Batten JM, Chen H, Wilner KD, Kwak EL, Clark JW, Carbone DP, Ji H, Engelman JA, Mino-Kenudson M, Pao W, Iafrate AJ. ROS1 재배열은 폐암의 독특한 분자 부류를 규정한다. J Clin Oncol. 2012 Mar 10;30(8):863-70] 참조), 해당 방법은 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 말산염 또는 화학식 I의 화합물의 다른 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 화합물 1의 말산염, 특히 화합물 1의 S-말산염이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 SLC34A2-ROS1 융합 양성 비소세포 폐암인 폐 선암종을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 환자에게 유효량의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다:
Figure 112016115330543-pct00006
.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 CD74-ROS1 융합 양성 비소세포 폐암인 폐 선암종의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 폐 선암종을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 환자에게 유효량의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다:
Figure 112016115330543-pct00007
.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 FIG-ROS1 융합 양성 비소세포 폐암인 폐 선암종의 치료를 필요로 하는 환자에서 이러한 폐 선암종을 치료하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 환자에게 유효량의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다:
Figure 112016115330543-pct00008
.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 NSCLC 세포에서 ROS1 융합 키나제 활성을 저해하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 상기 세포를 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 접촉시키는 단계를 포함한다:
Figure 112016115330543-pct00009
식 중,
R1은 할로이고;
R2는 할로이며;
R3은 (C1-C6)알킬이고;
R4는 (C1-C6)알킬이며; 그리고
Q는 CH 또는 N이다.
도 1은 비소세포 폐암종(NSCLC) 종양 샘플에서 배출되는 것으로 알려진 ROS1 융합 단백질의 그래픽 표현을 나타낸다. NSCLC, 교모세포종 및 담관 암종에서 ROS1 재배열. CD74(L)/(S), 분화 클러스터 74, 장/단 아이소형태; EZR, 에즈린; FIG, 교모세포종에서의 융합; LRIG3, 류신-풍부 반복부 및 면역글로불린-유사 도메인 3; ROS1 TK, 융합 파트너를 가진 ROS1 티로신 키나제 도메인; SDC4, 신데칸-4; SLC34A2(L)/(S), 용질 담체 패밀리 34(인산나트륨), 멤버 2, 장/단 아이소형태; SDC4, 신데칸-4; TPM3, 트로포미오신 3. 엑손 번호 E32, E34, E35 또는 E36은 ROS1의 브레이트 점을 나타낸다. 적색 박스는 ROS1에 유지된 막관통 도메인을 나타낸다.
도 2는 단일 상승 용량의 화합물 1, 또는 3-[(1R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민(크리조티닙; 잴코리(XALKORI)(등록상표))이 투여된 HCC-78 NSCLC 세포 내 시험관내 SLC34A2-ROS1 융합의 인산화의 저해를 도시한다.
도 3은 본 명세서에서 서열번호 1로 표시된 예시적인 인간 ROS1 단백질의 아미노산 서열이다.
도 4는 본 명세서에서 서열번호 2로 표시된 인간 ROS1 키나제 도메인의 예시적인 아미노산 서열이다.
약어 정의
이하의 약어 및 정의는 본 출원 전체를 통해서 나타낸 의미를 갖는다.
Figure 112016115330543-pct00010
Figure 112016115330543-pct00011
기호 "-"는 단일 결합을 의미하고, "="는 이중 결합을 의미한다.
화학 구조가 표시되거나 설명될 경우, 명확하게 달리 기술하지 않는 한, 모든 탄소는 4의 가전자를 준수하기 위하여 수소 치환을 갖는 것으로 가정된다. 예를 들어, 이하의 도식의 좌측 상의 구조에 있어서, 암시적으로 9개의 수소가 있다. 9개의 수소는 우측 구조에 도시되어 있다. 때로는 구조 내 특정 원자가 수소 또는 수소들을 치환(명백하게 규정된 수소)으로서 갖는 것으로, 예를 들어, -CH2CH2-로 본문의 화학식에 기술된다. 상기 기술적 수법은 달리 복잡한 구조의 설명에 대한 간략화 및 간단화를 제공하기 위하여 화학 분야에서 공통적임을 당업자라면 알 것이다.
Figure 112016115330543-pct00012
"R"기가 예를 들어 하기 화학식에서처럼 고리계 상에 "떠 있는" 것으로 묘사된다면:
Figure 112016115330543-pct00013
달리 규정되지 않는 한, "R" 치환체는 고리계의 임의의 원 상에 존재할 수 있으며, 이것은, 안정적인 구조가 형성되는 한, 고리 원자 중 하나로부터 묘사되거나 암시적이거나 또는 명확하게 정의된 수소의 교체를 가정한다.
"R"기가 예를 들어 하기 화학식에서처럼 융합된 고리계 상에 떠 있는 것으로 묘사된다면:
Figure 112016115330543-pct00014
달리 규정되지 않는 한, "R" 치환체는 융합된 고리계의 임의의 원자 상에 존재할 수 있고, 이것은, 안정한 구조가 형성되는 한, 묘사된 수소(예를 들어, 상기 화학식 중의 -NH-), 암시적 수소(예를 들어, 상기 화학식에서처럼, 수소가 존재하는 것을 이해되지만 도시되어 있지 않은 경우), 또는 명백하게 정의된 수소(예를 들어, 상기 화학식에서, "Z"는 =CH-임)를 고리 원자들 중 하나로 대체한 것을 가정한다. 묘사된 예에서, "R"기는 융합된 고리계의 5-원 또는 6-원 고리 상에 존재할 수 있다. "R"기가 예를 들어 하기 화학식에서처럼 포화 탄소를 함유하는 고리계 상에 존재하는 것으로 묘사된 경우:
Figure 112016115330543-pct00015
이 예에서, "y"는 하나보다 많을 수 있고, 이것은 각각, 고리 상에 현재 묘사되거나, 암묵적이거나 또는 명백하게 정의된 수소를 각각 교체하는 것으로 가정하며; 그런 경우, 달리 정의되지 않는 한, 얻어지는 구조가 안정하다면, 2개의 "R"이 동일 탄소 상에 존재할 수도 있다. 간단한 예로서 R이 메틸기인 경우; 묘사된 고리의 탄소("환형" 탄소) 상에 같은자리(geminal) 다이메틸이 존재할 수 있다. 다른 예에서, 동일 탄소 상에 그 탄소를 포함하여 2개의 R이 고리를 형성할 수 있으며, 이것은, 예를 들어, 하기 화학식에서처럼 묘사된 고리를 가진 스피로 환식 고리("스피로사이클릴"기)를 형성할 수 있다.:
Figure 112016115330543-pct00016
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 요오드를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "ROS1" 단백질 또는 폴리펩타이드는 암을 유발하는 비정상 발현하는 경향이 있는 2347개 아미노산 길이의 수용체 티로신 키나제인 포유동물 ROS1, 예를 들어, 인간 ROS1 키나제 단백질(ROS1 유전자에 의해 암호화됨)을 포함한다. 전장 인간 ROS1 키나제(인간 ROS1 단백질의 아미노산 서열을 가짐)의 기술은 유니프롯(UniProt) 수탁번호 P08922에서 발견할 수 있다. 또한, ROS1의 다수의 공지된 천연형 변이체가 있다(예컨대, 문헌[Greenman et al., Nature 446: 153-158, 2007] 참조). 쥣과 전장 ROS1의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 공지되어 있다(예컨대, 유니프롯 수탁번호 Q78DX7). 관례적인 실험을 이용해서, 통상의 기술을 가진 생물학자라면 비-인간 포유동물 ROS1 동족체에서 대응하는 서열을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
"야생형" ROS1이란 정상의 개체(예컨대, 암을 앓고 있지 않은 정상의 개체)의 건강한(또는 정상의) 조직(예컨대, 비암성 조직)에서의 전장 ROS1 키나제(즉, 인간 ROS1에 대해서, 신호 펩타이드 서열의 제거 후의 2347개 아미노산 길이의 폴리펩타이드(서열번호 1) 또는 2320개 아미노산 길이의 폴리펩타이드(성숙 서열))를 의미한다. (전장 또는 절단된) ROS1 키나제는 인간에서 정상의 폐 조직에서 발현되는 것으로 나타나지 않는다. 그러나, 이하에 기재된 방법을 이용해서, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 화합물을 이용해서 폐암 세포에서 ROS1 키나제의 특정 저해의 놀라운 발견을 하게 되었다. 전형적인 세포(예컨대, 비-암성 폐 세포)에서 발현이 나타나지 않는 비정형 세포(이 경우에 암성 세포)에서의 이러한 발현은 비정상적이다.
다른 단백질, 예를 들어, SLC34A2, CD74 또는 FIG과의 융합의 형태로 비정상적으로 발현된 ROS1 키나제가 교모세포종에서(문헌[Charest et al., Charest et al., Genes Chromosomes Cancer 37: 58-71, 2003; Charest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 916-921, 2003] 참조), 간세포에서(예컨대, PCT 공개 제WO2010/093928호 참조), 담관 암에서(문헌[Gu et al., PLOS one 2011 Jan 6;6(1):e15640. doi: 10.1371/journal.pone.0015640] 참조) 그리고 NSCLC 선암종에서(문헌[Kurtis D. Davies et al. Identifying and Targeting ROS1 Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer, Clin Cancer Res. 2012 September 1; 18(17): 4570-4579] 참조) 보고된 바 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "ROS1 융합"이란 다른 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 전부 또는 일부에 융합된 ROS1 단백질(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 키나제 도메인을 포함하는 ROS1 폴리펩타이드의 일부를 지칭하되, 여기서 그 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 이름은 그 융합 내에서 명명한다. (용어 "융합"은 단순히 제2 유전자로부터의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 융합된 제1 유전자로부터의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 의미한다). 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합은 SLC34A2 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 일부와 키나제 도메인 ROS1을 포함하는 ROS1 폴리펩타이드(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 일부 사이의 융합이다. ROS1 융합은 흔히 염색체 전좌 또는 역전에 기인된다. 수많은 공지된 ROS1 융합이 있으며, 이들의 전부는 본 발명의 ROS1 융합이고, 제한 없이, SLC34A2-ROS1(VS), SLC34A2-ROS1(S), SLC34A2-ROS1(L)를 포함하는 구성원을 가진 SLC34A2-ROS1 융합 단백질(미국 특허 공개 제20100143918호 참조), CD74-ROS1(미국 특허 공개 제20100221737호 참조) 및 FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L) 및 FIG-ROS1(XL)을 포함하는 구성원을 가진 FIG-ROS1 융합 단백질(PCT 공개 제WO2010/093928호 참조)(이들의 개시내용은 각각 그들의 전문이 본 명세서에 편입됨)을 포함한다. ROS1 폴리펩타이드 또는 ROS1 융합 뒤의 (L), (S), (VS), (VL) (XS) 또는 (XL)의 명칭은, 일반적으로 긴, 짧은, 매우 짧은, 매우 긴, 여분의 짧은, 그리고 여분의 긴 ROS1폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 각각 지칭한다.
공지된 ROS1 융합 단백질의 전부는 전장 ROS1의 전체 키나제 도메인을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "ROS1 키나제 활성을 지닌 폴리펩타이드"(또는 "ROS1 키나제 활성을 가진 폴리펩타이드")란 전장 ROS1 단백질의 전체 키나제 도메인을 포함하고 따라서 ROS1 키나제 활성을 보유하는 단백질(또는 폴리펩타이드)을 의미한다. ROS1 키나제 활성을 가진 단백질의 비제한적인 예는, 전장 ROS1 단백질, SLC34A2-ROS1(VS), SLC34A2-ROS1(S), SLC34A2-ROS1(L)을 포함하는 구성원을 가진 SLC34A2-ROS1 융합 단백질(미국 특허 공개 제20100143918호 참조), CD74-ROS1(미국 특허 공개 제20100221737호 참조) 및 FIG-ROS1(S), FIG-ROS1(L) 및 FIG-ROS1(XL)을 포함하는 구성원을 가진 FIG-ROS1 융합 단백질(PCT 공개 제WO2010/093928호 참조), 및 전장 ROS1 키나제 단백질의 키나제 도메인을 유지하는 ROS1 키나제의 임의의 절단된 또는 돌연변이된 형태를 포함한다. ROS1의 예시적인 키나제 도메인은 서열번호 2에 제시되고, "ROS1 키나제 활성을 지닌 폴리펩타이드"는 서열번호 2를 포함하는 아미노산 서열을 가진 것 또는 그의 키나제 활성 부분이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"(또는 "아미노산 서열" 또는 "단백질")란, 바람직하게는, a-아미노산, D-, L-아미노산, 및 이들의 조합의 지정된 순서로의 연결로부터 형성된 중합체를 지칭한다. 하나의 아미노산 잔기와 그 다음 것 간의 연결은 아마이드 결합 또는 펩타이드 결합을 지칭한다. 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 올리고펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열, 및 그의 단편 또는 일부, 그리고 천연형 또는 합성 분자를 지칭하여 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 당단백질 및 리포단백질 등과 같은 유도체화된 분자뿐만 아니라 저분자량 폴리펩타이드를 포함한다. "아미노산 서열" 등과 같은 용어, 예컨대, "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 지칭된 단백질 분자와 연관된 완전, 천연형 아미노산 서열에 대한 지정된 아미노산 서열을 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본 발명의 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열이 돌연변이 단백질의 구조 또는 기능의 유의한 효과 없이 변화될 수 있음이 당업계에서 인지될 것이다. 이러한 서열의 차이가 구성된다면, 활성(예컨대 ROS1의 키나제 도메인)을 결정하는 단백질 상의 임계적 영역이 있을 것을 명심해야 한다. 일반적으로, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능한데, 단, 유사한 기능을 수행하는 잔기가 이용된다. 다른 경우에, 잔기의 종류는 단백질의 비임계적 영역에서 변형이 일어난다면 완전하게 중요하지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 ROS1 활성을 지니는 폴리펩타이드는 실질적인 ROS1 키나제 활성을 나타내는 본 명세서에 기재된 각종 ROS1 융합 폴리펩타이드의 전장 ROS1 단백질의 변이체를 추가로 포함한다. 몇몇 비제한적인 보존적 치환은, 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 간에 서로에 대한 교환; 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환; 아마이드 잔기 Asn 및 Gln의 교환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr의 교환을 포함한다. 당업자에게 공지된 보존적 아미노산 치환의 추가의 예는, 방향족: 페닐알라닌 트립토판 티로신 (예컨대, 트립토판 잔기은 페닐알라닌으로 교체됨); 소수성: 류신 아이소류신 발린; 극성: 글루타민 아스파라긴; 염기성: 아르기닌 라이신 히스티딘; 산성: 아스파르트산 글루탐산; 소형: 알라닌 세린 트레오닌 메티오닌 글리세린이다. 위에서 상세히 나타낸 바와 같이, 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵인 것과 같은(즉, 기능에 대한 상당한 유해 효과를 지니지 않을 것 같은) 것에 대한 추가의 지침은 문헌[Bowie et al., Science 247, 상기 참조]에서 찾을 수 있다.
"SLC34A2"는 인간 SLC34A2 유전자 단백질, 또는 SLC34A2 유전자에 의해 암호화된 나트륨-의존적 인산염 수송 단질 2B를 지칭할 수 있다. 인간 SLC34A2 단백질(아이소폼 A, NCBI 수탁 번호 NP_001171469를 지님)은 689 아미노산 단백질이다. SLC34A2는 여기에서 추가로 기술된다.
CD74는 또한 HLA-DR 항원-연관 불변 사슬 또는 CD74(분화 클러스터 74)로서도 공지된 HLA 부류 II 조직적합성 항원 감마 사슬을 지칭하며, 이는 인간이 CD74 유전자에 의해 암호화된 인간 내 단백질이다. 예시적인 인간 CD74 단백질은 NP_001020329의 NCBI 수탁 번호 및 NM_001025158의 mRNA 수탁 번호를 지닌다. CD74는 160개의 아미노산을 지니고, 그리고 염색체 5(5q32) 상에 위치된 CD74 유전자에 의해 암호화된다. CD74는 9개의 엑손을 지닌다. CD74는 본 명세서에서 더욱 기술된다.
FIG(교모세포종 내 융합됨: Fused in Glioblastoma)는 또한 "골지-연관 PDZ 및 이중나선 모티프 함유" 또는 "GOPC" 단백질을 지칭하고, 6q21에서 염색체 6에 대해 위치된 유전자에 의해 암호화된다. 인간 내 이 단백질은 462개의 아미노산을 지닌다. FIG는 대안적인 접합에 의해 생성된 3개의 아이소폼을 갖는다. 본 발명에서 지칭되는 예시적인 인간 FIG 단백질은 Q9HD26-1의 유니프롯KB(UniProtKB) 식별자를 갖는다.
"SLC34A2-ROS1 융합 단백질 또는 유전자"는 파트너 SLC34A2 및 ROS1의 체세포 유전자 융합을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 단백질은 융합 파트너의 N-말단 도메인, 예컨대, SLC34A2 및 ROS1 단백질의 C-말단 키나제 도메인을 포함한다. 융합 파트너의 N-말단 도메인은 융합 단백질의 N-말단에 위치될 수 있고, ROS1 단백질의 C-말단 키나제 도메인은 융합 단백질의 C-말단에 위치될 수 있다. 융합 파트너는 융합 단백질의 N-말단에 위치될 수 있는 SLC34A2 단백질의 N-말단 도메인일 수 있다. 이 경우에, 융합 단백질은 N-말단에 SLC34A2 단백질의 N-말단 도메인 그리고 C-말단에 ROS1 단백질의 C-말단 키나제 도메인을 포함하는 SLC34A2-ROS1 단백질로서 표시될 수 있다. 다른 실시형태는 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 제공하고, 여기서 융합 파트너의 N-말단 도메인을 암호화하는 유전자는 5' 단부에 위치하고, ROS1 단백질의 C-말단 키나제 도메인을 암호화하는 유전자는 3' 단부에 위치한다. 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2 단백질의 부분들은 비정상 염색체 전좌의 결과로서 기능적 키나제 도메인을 포함하는 ROS1 단백질의 부분에 프렘인 융합되어 SLC34A2를 가진 ROS1 염색체 재배열을 생성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 단백질은 융합 SLC34A2 엑손 4-ROS1 엑손 32를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 단백질은 융합 SLC34A2 엑손 4-ROS1 엑손 34 SLC34A2-ROS1 융합 단백질을 포함할 수 있거나, 또는 본 발명에서 이용되는 바와 같은 기능적 ROS1 키나제 도메인을 가진 유전자는 2개의 전좌 파트너 SLC34A2 및 ROS1을 포괄하는 기타 변곡점을 함유할 수 있다. 예시적인 SLC34A2-ROS1 융합 단백질은 cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/(이의 내용은 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다.
"CD74-ROS1 융합 단백질 또는 유전자"는 파트너 CD74 및 ROS1의 체세포 유전자 융합을 지칭한다. 예시적인 CD74-ROS1 융합 단백질은 cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/(이의 내용은 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다.
"FIG-ROS1 융합 단백질 또는 유전자"는 파트너 FIG 및 ROS1의 체세포 유전자 융합을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 6q21번 위치에서 인간 염색체 6 상의 240 킬로염기의 염색체내 동형접합성 결실이 FIG-ROS1 유전자좌의 형성을 담당한다. 몇몇 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 전사물은 7개의 FIG 엑손 및 9개의 ROS1-유도 엑손에 의해 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 유전자는 구성적 활성 그리고 기능적 ROS1 키나제 도메인과의 프레임내 융합 단백질을 암호화한다. 예시적인 FIG-ROS1 융합 단백질은 cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/(이의 내용은 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여 "환자"는 인간 및 기타 동물, 특히 포유동물, 및 기타 유기체를 포함한다. 따라서, 방법은 인간 요법 및 가축 용도 둘 다에 적용 가능하다. 다른 실시형태에 있어서, 환자는 포유동물이고, 다른 실시형태에 있어서, 환자는 인간이다.
화합물의 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 약제학적으로 허용 가능하고 그리고 모 화합물의 목적으로 하는 약리학적 활성을 지니는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 비독성인 것이 이해된다. 적절한 약제학적으로 허용 가능한 염에 대한 추가의 정보는 문헌[Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985](이것은 참고로 본 명세서에 편입됨) 또는 문헌[S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19](둘 다 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 찾을 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 산 부가염의 예는 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기 산;뿐만 아니라 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산, p-톨루엔설폰산, 및 살리실산 등으로 형성된 것을 포함한다.
"전구약물"은, 예를 들어, 혈액 내 가수분해에 의해 상기 화학식의 모 화합물을 얻기 위하여 생체내에서 (전형적으로 신속하게) 변형되는 화합물을 지칭한다. 공통의 예는, 카복실산 모이어티를 보유하는 활성 형태를 가진 화합물의 에스터 및 아마이드 형태를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 에스터의 예는, 알킬 에스터(예를 들어 약 1개 내지 약 6개의 탄소를 가짐)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄이다. 허용 가능한 에스터는 또한 사이클로알킬 에스터 및 아릴알킬 에스터, 예컨대, 제한 없이 벤질을 포함한다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 아마이드의 예는, 1급 아마이드, 및 2급 및 3급 알킬 아마이드(예를 들어 약 1 내지 약 6개의 탄소를 가짐)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 본의 화합물의 아마이드 및 에스터는 통상의 방법에 따라서 제조될 수 있다. 전구약물의 철저한 논의는 문헌[T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에서 제공되며, 이들은 둘 다 모든 목적을 위하여 참고로 본 명세서에 편입된다.
"ROS1" 또는 "ROS1 단백질"은 막관통 수용체 티로신 키나제이고, 본 명세서에 더욱 기재되어 있다.
"치료적 유효량"은, 환자에게 투여될 경우, 질환의 증상을 치료를 개선하는 본 발명의 화합물의 양이다. 치료적 유효량은 화합물의 양을 단독으로 또는 c-Met, 및/또는 VEGFR2를 조절하는데 유효하거나, 또는 암을 치료 또는 예방하는데 유효한 기타 활성 성분과 병용하여 포함한다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 발명의 화합물의 양은 화합물, 질환 상태 및 그의 중증도, 치료될 대상체의 연령 등에 따라서 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자의 지식 및 본 개시내용을 고려하여 당업자가 통상적으로 결정할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 질환, 장애 또는 증후군의 "치료하는" 또는 "치료"는, (i) 인간에서 일어나는 질환, 장애 또는 증후군을 예방하는 것, 즉, 상기 질환, 장애 또는 증후군에 노출될 수 있거나 이에 취약할 수 있지만 해당 질환, 장애 또는 증후군의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않은 동물에서 상기 질환, 장애 또는 증후군의 임상적 증후군을 발병하지 않는 것; (ii) 질환, 장애 또는 증후군을 역전 또는 저해시키는 것, 즉, 그의 발병을 저지시키는 것; 및 (iii) 질환, 장애 또는 증후군을 완화시키는 것, 즉, 질환, 장애 또는 증후군의 퇴행을 일으키는 것을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 전신 대 국소 전달, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도에 대한 조절이 필요할 수 있고, 일상적인 경험으로 확인 가능할 것이다.
본 명세서에 기재된 반응의 각각에 대한 "수율"은 이론적 수율의 백분율로서 표현된다.
실시형태
일 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016115330543-pct00017
식 중,
R1은 할로이고;
R2는 할로이며; 그리고
Q는 CH 또는 N이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112016115330543-pct00018
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앞서 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 본 명세서에서 N-(4-{[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드로서 지칭한다. 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 WO 2005/030140은, 화합물 1을 개시하고, 그리고 어떻게 제조되는지를 기술하고(WO 2005/030140, 실시예 12, 37, 38 및 48) 그리고 이 키나제의 신호 전달을 저해, 조정 및/또는 조절하기 위한 이 화합물의 치료 활성을 개시한다(WO 2005/030140, 검정, 표 4, 기입 289). 실시예 48은 WO 2005/030140에서 단락 [0353]에 있다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 약제학적 조성물로서 투여되며, 여기서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물 및 화합물 I은, 언급된 화합물뿐만 아니라 개별의 이성질체 및 이성질체들의 혼합물 둘 다를 포함한다. 각 경우에, 화학식 I의 화합물은 언급된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 및/또는 용매화물, 그리고 임의의 개별의 이성질체 및 이들 이성질체의 혼합물을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1은 (L)-말산염일 수 있다. 화학식 I의 화합물의 그리고 화합물 1의 말산염은 PCT/US2010/021194 및 USSN 61/325095에 개시되어 있으며, 이들은 둘 다 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은, 또한 R-말산염이라고도 지칭되는 (D)-말산염이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물은 말산염이다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물은, 또한 S-말산염이라고도 지칭되는 (L)-말산염이다.
다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 또한 S-말산염이라고도 지칭되는 (D)-말산염이다.
다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 말산염이다.
다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 또한 S-말산염이라고도 지칭되는 (L)-말산염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 말산염은 미국 특허 출원 일련번호 61/325095에 개시된 바와 같은 화합물 1의 (L) 말산염 및/또는 (D) 말산염의 결정질 N-1 형태 또는 N-2 형태이다. 또한 화합물 1의 말산염의 N-1 및/또는 N-2 결정질 형태를 포함하는 결정질 거울상이성질체의 특성에 대해서, 전문이 참고로 본 명세서에 편입된 WO 2008/083319 참조. 이러한 형태를 제조하고 특성 규명하는 방법은, PCT/US10/021194(전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 완전히 기재되어 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 NSCLC를 역전 또는 저해시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 본 명세서에 개시된 실시형태들 중 어느 하나에 있어서 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 SLC34A2-ROS1 융합-양성 NSCLC를 역전 또는 저해시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 본 명세서에 개시된 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 CD74-ROS1 융합-양성 NSCLC를 역전 또는 저해시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 본 명세서에 개시된 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 FIG-ROS1 융합-양성 NSCLC를 역전 또는 저해시키는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은, 본 명세서에 개시된 실시형태들 중 어느 하나에 있어서, 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 하나 이상의 다른 치료 전에, 동시에 또는 후속하여 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 하나 이상의 치료에 후속하여 투여된다. "치료"는, 당업자에게 압수가능한 치료 옵션의 어느 하나, 예컨대, 수술, 화학요법제, 호르몬 요법, 항체, 면역요법, 방사성 요오드 요법 및 방사선을 의미한다. 특히, "치료"는 다른 화학요법제 또는 항체를 의미한다.
따라서, 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 HER-2 항체 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, HER-2 항체는 트라스투주맙이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 정제 또는 캡슐로서 1일 1회 경구 투여된다. 이들 및 기타 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염 또는 말산염으로서 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 100㎎까지 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 100㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 95㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 90㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 85㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 80㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 75㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 70㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 65㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 60㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 55㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 50㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 45㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 40㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 35㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 30㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 25㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 20㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 15㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 10㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은, 화합물 1을 5㎎ 함유하는 캡슐 또는 정제로서의 이의 유리염으로서 또는 말산염으로서 1일 1회 경구 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 이하의 표에서 제공되는 바와 같이 정제로서 1일 1회 이의 유리염 또는 말산염으로서 경구 투여된다.
Figure 112016115330543-pct00019
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 이하의 표에서 제공되는 바와 같이 정제로서 1일 1회 이의 유리염 또는 말산염으로서 경구 투여된다.
Figure 112016115330543-pct00020
또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 이하의 표에서 제공되는 바와 같이 정제로서 1일 1회 이의 유리염 또는 말산염으로서 경구 투여된다.
Figure 112016115330543-pct00021
위에서 제공된 정제 제형의 어느 것이라도 요구되는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용량에 따라서 조정될 수 있다. 따라서, 제형 성분의 각각의 양은 이전의 단락들에서 제공된 바와 같은 각종 양의 화합물 1을 함유하는 정제 제형을 제공하도록 비례해서 조정될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 제형은 20, 40, 60 또는 80㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 비정상 세포 성장의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장는 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질 및 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 및 인간 내 염색체 6 상의 ROS1 유전자(6q22)에 의해 암호화되는 바와 같은 기능적 C-말단 ROS1 키나제 도메인에 의해 매개된 암. 일 실시형태에 있어서, 암은 폐 선암종이다. 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 SLC34A2-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 CD74-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 다른 형태의 치료에 후속해서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은시스플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 크리조티닙 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 카보플라틴 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 비정상 세포 성장의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장은 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질 및 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 및 인간 내 염색체 6 상의 ROS1 유전자(6q22)에 의해 암호화되는 바와 같은 기능적 C-말단 ROS1 키나제 도메인을 포함하는 기타 ROS1 융합 단백질에 의해 매개된 암이다. 일 실시형태에 있어서, 암은 폐 선암종이다. 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 SLC34A2-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 CD74-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물은 다른 형태의 치료에 후속해서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물은 카보플라틴 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 비정상 세포 성장의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장은 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질 및 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 및 인간 내 염색체 6 상의 ROS1 유전자(6q22)에 의해 암호화되는 바와 같은 기능적 C-말단 ROS1 키나제 도메인에 의해 매개된 암이다. 일 실시형태에 있어서, 암은 폐 선암종이다. 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 SLC34A2-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 CD74-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 폐 선암종은 ROS1 융합-양성 비소세포 폐암이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1은 다른 형태의 치료에 후속해서 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 카보플라틴 치료 후에 투여된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 비정상 세포 성장의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장은 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 또는 다른 ROS1 융합 단백질에 의해 매개된 암이고, 이때 암은 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴의 치료 요법으로 사전에 치료된 바 있고 그리고 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴에 대해서 내성이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴에 대해서 내성이 있는 암은, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질 및 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질로부터 선택된 1종 이상의 ROS1 융합 단백질을 보유하고/하거나 SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, 또는 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 크리조티닙 및/또는 카보플라틴 내성 암은 CD74-ROS1 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 가진 암이다. 관련된 실시형태에 있어서, 암은 크리조티닙 난치성 CD74-ROS1 융합 양성 폐 선암종, 예를 들어, ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 보유하는, 크리조티닙 난치성 CD74-ROS1 융합 양성 NSCLC이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 크리조티닙 및/또는 카보플라틴 내성 암은, CD74-ROS1 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인 내의 E1990G, G2032R, L2026M, L1951R, M2128V, K2003I 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 보유하는 암, 예를 들어, 크리조티닙 내성 폐 선암종, 예를 들어, 크리조티닙 내성 NSCLC이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유동물에서 비정상 세포 성장, 예를 들어, 암의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장은 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 또는 다른 ROS1 융합 단백질에 의해 매개된 암이고, 이때 암은 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴의 치료 요법으로 사전에 치료된 바 있고 그리고 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴에 대해서 내성이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴에 내성이 있는 암은, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질 및 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질로부터 선택된 1종 이상의 ROS1 융합 단백질을 보유하고/하거나 SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, 또는 FIG-ROS1(VL) 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 크리조티닙 내성 암은 CD74-ROS1 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 가진 암이다. 관련된 실시형태에 있어서, 암은 크리조티닙 난치성 CD74-ROS1 융합 양성 폐 선암종, 예를 들어, ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 보유하는 크리조티닙 난치성 CD74-ROS1 융합 양성 NSCLC이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 크리조티닙 내성 암은, CD74-ROS1 융합 단백질의 ROS1 키나제 도메인 내에 E1990G, G2032R, L2026M, L1951R, M2128V, K2003I, 및 이들의 조합으로부터 선택된 돌연변이를 보유하는 암, 예를 들어, 크리조티닙 내성 폐 선암종, 예를 들어, 크리조티닙 내성 NSCLC이다. 위에서 기재된 각종 실시형태에 있어서, 포유동물에서 비정상 세포 성장의 진행을 저해 또는 역전시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은, 화학식 I의 화합물, 또는 화학식 Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 약 0.01㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 75 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 15 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏ 범위의 예시적인 치료적 유효 용량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 비정상 세포 성장은 ROS1 융합 단백질, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 또는 다른 ROS1 융합 단백질에 의해 매개된 암; 또는 ROS1 융합 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합 단백질, CD74-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1 융합 단백질, FIG-ROS1(L) 융합 단백질, FIG-ROS1(S) 융합 단백질, FIG-ROS1(VL) 융합 단백질, 또는 다른 ROS1 융합 단백질 내의 ROS1 키나제 도메인에 돌연변이를 보유하는 암이며, 이러한 암은, 몇몇 실시형태에 있어서, 크리조티닙, 및/또는 카보플라틴의 치료 요법으로 이미 치료되었고 크리조티닙 및/또는 카보플라틴에 내성인 암, 예를 들어, 크리조티닙 내성 암, 예를 들어, 크리조티닙 내성 폐 선암종, 예를 들어, 크리조티닙 내성 NSCLC를 포함한다.
투여
순수한 형태로의 또는 적절한 약제학적 조성물로의 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 투여는, 유사한 유용성을 제공하기 위한 제제 또는 허용된 투여모드 중의 어느 것을 통해서 수행될 수 있다. 따라서, 투여는, 예를 들어, 고체, 반고체, 동결건조된 분말 또는 액체 투약 형태, 예컨대, 정제, 좌제, 환제, 연질 탄성 및 경질 젤라틴 용량(캡슐 또는 정제 내에 있을 수 있음), 분말, 용액, 현탁액, 또는 에어로졸 등의 형태로, 구체적으로 정확한 투약량의 간단한 투여에 적합한 단위 투약 형태로, 예를 들어, 경구, 비강내, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 국소, 경피, 질내, 방광내, 낭내 또는 직장으로 이루어질 수 있다.
조성물은 통상의 약제학적 담체 또는 부형제 및 활성제로서의 화학식 I의 화합물을 포함할 것이고, 그리고 담체 및 애주번트 등을 포함할 수 있다.
애주번트는 보존제, 습윤제, 현탁제, 감미제, 방향제, 향료, 유화제, 및 붕해제를 포함한다. 미생물의 작용의 예방은 각종 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산 등에 의해 보장될 수 있다. 또한 등장화제, 예를 들어, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사 가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유발될 수 있다.
필요한 경우, 화학식 I의 화합물의 약제학적 조성물은 또한 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 산화방지제 등, 예를 들어, 시트르산, 솔비탄 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올레에이트, 부틸화 하이드록시톨루엔 등과 같은 보조 물질을 최소량 함유할 수 있다.
조성물의 선택은 약물 투여 모드(예컨대, 경구 투여를 위하여, 정제, 환제 또는 캡슐의 형태의 조성물) 및 약물 물질의 생체이용 가능성 등과 같은 각종 인자에 따라 좌우된다. 최근, 약제학적 조성물은 특별히 생체이용 가능성이 표면적을 증가시킴으로써, 즉, 입자 크기를 감소시킴으로써 증가될 수 있는 원리에 기초하여 불량한 생체이용 가능성을 나타내는 약물을 위하여 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허 제4,107,288호는 활성 물질이 거대분자의 가교 매트릭스 상에 지지되어 있는 10 내지 1,000㎚의 크기 범위의 입자를 가진 약제학적 조성물을 기술한다. 미국 특허 제5,145,684호는 약물 물질이 표면 조정제의 존재 하에 나노입자(400㎚의 평균 입자 크기)로 분쇄되고 이어서 현저하게 높은 생체이용 가능성을 나타내는 약제학적 조성물을 부여하기 위하여 액체 매체에 분산되는 약제학적 조성물의 제조를 기술한다.
비경구 주사에 적합한 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 멸균 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액으로의 재구성을 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적절한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유) 및 주사 가능한 유기 에스터, 예를 들어, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴 등과 같은 코팅의 사용에 의해 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
하나의 특정 투여 경로는 치료될 질환-상태의 중증도에 따라서 조절될 수 있는 통상의 1일 투약 요법을 이용하는 경구적이다.
경구 투여용의 고체 투약 형태는 캡슐, 정제, 알약, 분체 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투약 형태에서, 활성 화합물은 규산나트륨 또는 인산이나트륨 등과 같은 적어도 1종의 통상적인 비활성 부형제(또는 담체), 예컨대, 시트르산나트륨 또는 이산이칼슘, 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어, 전분, 락토스, 글루코스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어, 셀룰로스 유도체, 전분, 알기네이트, 젤라틴, 폴리피닐피롤리돈, 수크로스, 및 아카시아검, (c) 보습제, 예를 들어, 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들어, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 크로스카멜로스 나트륨, 규산 착물 및 탄산나트륨, (e) 용액 지연제, 예를 들어, 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예를 들어, 제4급 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, 스테아르산 마그네슘 등, (h) 흡착제, 예를 들어, 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들어, 탤크, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴황산나트륨, 이들의 혼합물 등과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 투약 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 고체 투약 형태는 코팅 및 쉘(shell), 예컨대, 장용 코팅 및 당업계에 잘 공지된 다른 것을 지니도록 제조될 수 있다. 그들은 진정제를 함유할 수 있고, 또한 지연된 방식으로 장관의 특정 부분에서 활성 화합물 또는 화합물들을 방출시키는 화합물을 가질 수 있다. 사용될 수 있는 함입(embedded) 조성물의 예는 폴리머 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한, 적절하다면, 상기 언급한 부형제 중 하나 이상을 지니는 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여용의 액체 투약 형태는 약제학적으로 허용 가능한 유화액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 투약 형태는, 예를 들어, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 임의의 약제학적 애주번트를, 담체, 예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등; 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 다이메틸폼아마이드; 오일, 특히, 면실유, 땅코유, 옥수수 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 솔비탄의 지방산 에스터; 또는 이들 물질의 혼합물 등에 용해, 분산 등 시키고, 이에 따라서 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조된다.
현탁액은, 활성 화합물 이외에, 현탁제, 예를 들어, 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스터, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트래거캔스 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 있다.
직장 투여를 위한 조성물은, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 예를 들어, 적합한 비자극 부형제 또는 담체, 예컨대, 코코아 버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 보통의 온도에서는 고체이지만 체온에서 액체이며, 따라서 적합한 체강 내에 있는 동안 용융되고 그 안의 활성 성분을 방출하는 좌약 왁스와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약이다.
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 국소 투여를 위한 투약 형태는, 연고, 분말, 스프레이 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 약리학적으로 허용 가능한 담체 및 필요로 될 수 있는 임의의 보존제, 완충액 또는 추진제와 멸균 조건 하에 혼합된다. 안과용 조성물, 안 연고, 분말 및 용액이 또한 이 개시내용의 범위 내가 되도록 구성된다.
압축 가스는 에어로졸 형태의 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 분산시키는데 이용될 수 있다. 이 목적을 위하여 적합한 비활성 가스는 질소, 이산화탄소 등이다.
일반적으로, 의도된 투여 모드에 따라서, 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 약 1중량% 내지 약 99중량%의 화학식 I의 화합물(들), 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 99중량% 내지 1중량%의 적절한 약제학적 부형제를 함유할 것이다. 일례에서, 조성물은 약 5% 내지 약 75중량%의 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물(들), 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 것이고, 잔부는 적절한 약제학적 부형제이다.
이러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은, 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 명백할 것이며; 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990)을 참조할 수 있다. 투여될 조성물은, 임의의 사례에서, 본 개시내용의 교시에 따라서 질환-병기의 치료를 위하여 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유한다.
본 개시내용의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물은, 이용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 화합물의 작용 길이, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이 및 투여시간, 배설률, 약물 병용, 특정 질환-병기의 중증도, 및 숙주가 받는 요법을 비롯한 각종 인자에 따라서 변화될 치료적 유효량으로 투여된다. 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 약 0.1 내지 약 1,000㎎/일 범위의 투약 수준에서 환자에게 투여될 수 있다. 약 70 킬로그램의 체중을 지닌 정상의 인간 성인에 대해서, 약 0.01 내지 약 100㎎/킬로그램(체중)/일의 범위의 투약량이 일례이다. 그러나, 이용되는 특정 투약량은 변할 수 있다. 예를 들어, 투약량은 환자의 요건, 치료 중인 병태의 중증도, 및 이용 중인 화합물의 약리학적 활성을 포함하는 다수의 인자에 따라 좌우될 수 있다. 특정 환자에 대한 최적 투약량의 결정은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
다른 실시형태에 있어서, 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 기타 암 치료와 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 치료는 특히 기타 암 화학요법, 호르몬 대체 요법, 방사선 요법 또는 면역요법을 포함한다. 기타 요법의 선택은 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이 및 투여 모드와 시간, 배설률, 약물 병용, 특정 질환-병기의 중증도, 숙주가 받고 있는 요법을 포함하는 다수의 인자에 따라 좌우될 것이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 기타 ROS1 융합 양성 NSCLC에 부가해서, SLC34A2-ROS1 융합-양성 NSCLC, CD74-ROS1 융합-양성 NSCLC 및 FIG-ROS1 융합-양성 NSCLC 등과 같은 ROS1 융합 관련 질환을 검출, 진단 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 이러한 장애를 검출 및 진단하는 방법을 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명한다. 이들 장애를 치료하는 것은 화학식 I의 화합물 또는 화학식 I의 화합물의 말산염 또는 화학식 I의 화합물의 다른 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 SLC34A2-ROS1 융합-양성 NSCLC, CD74-ROS1 융합-양성 NSCLC 및 FIG-ROS1 융합-양성 NSCLC 등과 같은 ROS1 융합 관련 질환을 지닌 것으로 확인되거나 진단확인되거나 진단하는 것으로 더욱 달성될 수 있으며, 예를 들어, 특정 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물은 화합물 1 또는 화합물 1의 말산염이다.
다른 양상에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 폐암을 예방 또는 치료하기 위하여 환자에게 투여된다. 이들 실시형태 중 몇몇에 있어서, 상기 방법은 ROS1 융합 단백질에 대한 적어도 1종의 저해제, 융합 단백질을 암호화하는 ROS1 융합 유전자적어도 1종의 저해제, 유전자를 암호화하는 ROS1에 대한 적어도 1종의 저해제, 또는 이들의 조합물을, 활성 성분으로서 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
ROS1 그리고 융합 파트너 SLC34A2 , CD74 및 FIG
검출, 진단 방법, 검출 및 진단용 키트, 선별 방법, 폐암 환자에 대한 각종 요법 및 치료 및 예방 방법, 치료의 유효성을 측정하는 방법, 및 기타 약제학적 성분을 포함하는, ROS1 단백질, SLC34A2 단백질, CD74 단백질 및 FIG 단백질, SLC34A2-ROS1 융합, 또는 CD74-ROS1 융합; 또는 FIG-ROS1 융합 또는 (때로는 단순히 "ROS1 융합 단백질 및 핵산"이라고 불림)이 각종 치료와 병용하여 사용될 수 있으며, 이는 이하에 기술된다.
ROS1 단백질은 희귀 막관통 수용체 티로신 키나제이다. 인간 ROS1 키나제 단백질(ROS1 유전자에 의해 암호화됨)은 암을 유발하는 비정상 발현하기 쉬운 2347개의 아미노산 길이의 수용체 티로신 키나제이다. 전장 인간 ROS1 키나제(인간 ROS1 단백질의 아미노산 서열을 지님)의 설명은 유니프롯 수탁번호 P08922(E.C.- 2.7.10.1)에서 발견할 수 있다. 표 1에 나타낸 바와 같이, ROS1의 신호 펩타이드, 세포외, 막관통, 및 키나제 도메인은 서열번호 1의 이하의 아미노산 잔기에서 발견된다.
Figure 112016115330543-pct00022
인간 ROS1 단백질은 인간 염색체 6에 위치된 인간 ROS1 유전자에 의해 암호화될 수 있다. ROS1 단백질의 C-말단 도메인은 ROS1 유전자의 31번째 또는 32번째 또는 34번째 엑손에서부터 최종 엑손(예를 들어, 32번째 또는 34번째 엑손)까지의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. ROS1 단백질의 C-말단 도메인은 31번째 또는 32번째 엑손의 개시 위치로부터 적어도 약 100개의 아미노산을 연속적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, ROS1 단백질의 C-말단 도메인은 32번째 엑손(긴 형태) 또는 34번째 엑손(짧은 형태)의 개시 위치로부터 ROS1 단백질의 C-말단을 향하여 연속적으로 약 100 내지 약 700개의 아미노산, 연속적으로 약 200 내지 약 600개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 250 내지 약 500개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 270 내지 약 425개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 270 내지 약 450개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 475 내지 약 625개의 아미노산을 포함할 수 있다. ROS1 단백질에 대한 추론된 변곡점은 SLC34A2-ROS1 융합 단백질 및 CD74-ROS1 융합 단백질에 대해서 1750, 또는 1852 내지 1853 aa, 그리고 FIG-ROS1 융합 단백질에 대해서 1880 내지 1881 aa이다.
하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 인간 SLC34A2 단백질을 암호화하는 인간 SLC34A2 유전자(mRNA NM_001177998)는 인간 염색체 4(4p15.2)에 국재화되고 13개의 엑손 및 약 690개의 아미노산의 아미노산 길이를 함유한다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 pH-민감성 나트륨-의존적 인산염 수송체이다. 이 유전자에서의 결함은 폐포 미석증의 원인이다. 두 상이한 아이소폼을 암호화하는 3개의 전사물 변이체가 이 유전자에 대해서 발견되었다. SLC34A2 단백질은 포유동물, 예컨대, 인간으로부터 유래될 수 있다. SLC34A2-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 SLC34A2 유전자의 1번째 엑손에서부터 12번째 엑손까지 또는 1번째 엑손에서부터 4번째 엑손까지, 또는 1번째 엑손에서부터 2번째 엑손까지의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SLC34A2 유전자의 구조에서 이들 마지막으로 관찰된 엑손은 429 및 2076번의 추론된 변곡점을 갖는다. SLC34A2-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 SLC34A2 단백질의 1번째 위치로부터 연속적으로 적어도 약 30 내지 250개의 아미노산(즉, 적어도 1번째 내지 250번째 위치의 아미노산 서열 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. SLC34A2-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 SLC34A2 단백질의 제1 아미노산 위치로부터 연속적으로 약 30 내지 250개의 아미노산, 연속적으로 약 30 내지 225개의 아미노산, 연속적으로 약 40 내지 200개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 40 내지 175개의 아미노산을 포함할 수 있다.
하나의 예시적인 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합은 ROS1의 3' 영역에서 SLC34A2의 5' 영역으로 융합되는 인간 염색체 6과 4 간의 염색체 전좌이다. 융합 단백질은 당업자에게 공지되고 되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 각종 방법을 이용해서 검출되고 검증된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 이어서 폐암을 예방 또는 치료하기 위하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 단백질에 대한 적어도 1종의 저해제, 융합 단백질을 암호화하는 SLC34A2-ROS1 융합 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, 유전자를 암호화는 ROS1에 대한 적어도 1종의 저해제, 또는 이들의 조합물을 활성 성분으로서 포함하는 조성물이 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
SLC34A2-ROS1 융합 단백질에서, 융합, 또는 융합 영역은 SLC34A2 유전자 및 ROS1 유전자의 각종 엑손 사이에서 생길 수 있다. 많은 융합이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 융합의 예는 SLC34A2 유전자의 2번째 및/또는 4번째 엑손 및 ROS1 유전자의 32번째 엑손(긴, L) 및/또는 34번째 엑손(짧은, S)을 포함하며, 이는 융합점 또는 변곡점이라 불린다. 기타 ROS1 및 SLC34A2 융합 또는 변곡점이 공지되어 있고, cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다. 용어 "융합 영역"은 융합점 둘레의 폴리뉴클레오타이드 단편(약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드) 또는 폴리펩타이드(약 5 내지 30개의 아미노산) 단편을 지칭할 수 있다.
CD74-ROS1 융합은 ROS1의 3' 영역에서 CD74의 5' 영역으로 융합하는 인간 염색체 5와 6 간의 ROS1-연루 염색체 전좌이다. 융합 단백질은 당업자에게 공지되고 되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 각종 방법을 이용해서 검출되고 검증된다. CD74-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 CD74 유전자의 1번째 엑손에서부터 12번째 엑손까지 또는 1번째 엑손에서부터 4번째 엑손까지, 또는 1번째 엑손에서부터 2번째 엑손까지의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CD74-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 CD74 단백질의 1번째 위치에서부터 연속적으로 적어도 약 30 내지 250개의 아미노산(즉, 적어도 1번째 내지 250번째 위치의 아미노산 서열, 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. CD74-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 CD74 단백질의 1번째 아미노산 위치로부터 연속적으로 약 30 내지 250개의 아미노산, 연속적으로 약 30 내지 225개의 아미노산, 연속적으로 약 40 내지 200개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 40 내지 210개의 아미노산 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
융합 단백질에서, 융합 또는 융합 영역은 CD74 유전자와 ROS1 유전자의 각종 엑손 사이에서 생길 수 있다. 많은 융합이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 CD74-ROS1 융합의 예는 ROS1 유전자의 32번째, 또는 34번째 엑손에 융합되는 CD74 유전자의 6번째 엑손을 포함하며, 이는 융합점 또는 변곡점이라 불린다. 기타 ROS1 및 CD74 융합 또는 변곡점은 알려져 있고, cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다. 용어 "융합 영역"은 융합점 둘레의 폴리뉴클레오타이드 단편(약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드) 또는 폴리펩타이드(약 5 내지 30개의 아미노산) 단편을 지칭할 수 있다.
융합 단백질 FIG-ROS1은 FIG의 5' 영역(GOPC라고도 불림)에서 ROS1의 3' 영역으로 융합하는 인간 염색체 6 상의 염색체내 결실에 기인한다. FIG-ROS1 융합은 담관암종 및 난소암 환자로부터의 샘플에서 각각 8.7% 및 0.5%의 빈도로 확인된 바확인된 바 FIG-ROS1 융합 단백질은 당업자에게 공지되었고 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 각종 방법을 이용해서 검출되고 검증될 수 있다. FIG-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 FIG 단백질의 1번째 위치에서부터 연속적으로 적어도 약 150 내지 500개의 아미노산(즉, 적어도 1번째 내지 500번째 위치의 아미노산 서열, 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. FIG-ROS1 융합 단백질의 N-말단 도메인은 FIG 단백질의 1번째 아미노산 위치로부터 연속적으로 약 150 내지 약 500개의 아미노산, 연속적으로 약 200 내지 450개의 아미노산, 연속적으로 약 220 내지 425개의 아미노산, 또는 연속적으로 약 220 내지 약 420개의 아미노산 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
FIG-ROS1 융합 단백질에서, 융합 또는 융합 영역은 FIG 유전자 및 ROS1 유전자의 각종 엑손 사이에 생길 수 있다. 수개의 FIG-ROS1 융합은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 융합의 예는 ROS1 유전자의 35번째 또는 36번째 엑손에 융합된 FIG 유전자의 4번째 또는 8번째 엑손을 포함하며, 이는 융합점 또는 변곡점이라 불린다. 기타 ROS1 및 FIG 융합 또는 변곡점이 알려져 있고, cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/에서 암 데이터베이스 v.68에서 체세포 돌연변이의 COSMIC-카탈로그에서 찾을 수 있다. 용어 "융합 영역"은 융합점 둘레의 폴리뉴클레오타이드 단편(약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드) 또는 폴리펩타이드(약 5 내지 30개의 아미노산) 단편을 지칭한다.
기타 ROS1 융합 파트너는 본 명세서에서 상세히 기재된 SLC34A2, CD74 및 FIG 융합에 부가해서 TPM3, SDC4, EZR 및 LRIG3을 포함할 수 있다.(본 명세서의 도 1, 그리고 예를 들어, 문헌[Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, Suzuki R, Sakata S, Hatano S, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012, 및 Kurtis D. Davies, Anh T. Le, Mariana F. Theodoro, Margaret C. Skokan, Dara L. Aisner, Eamon M. Berge, Luigi M. Terracciano, Matteo Incarbone, Massimo Roncalli, Federico Cappuzzo, D. Ross Camidge, Marileila Varella-Garcia, and Robert C. Doebelet, Identifying and Targeting ROS1 Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer, (2012), Clin Cancer Res. 2012 September 1; 18(17): 4570-4579] 참조, ROS1 융합 단백질에 관한 이들의 개시의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 편입됨).
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 ROS1 융합 단백질은 기능적 키나제 도메인을 제공하는 인간 ROS1 단백질(예를 들어, 서열번호 1로 제공되는 바와 같은 인간 ROS1)의 C-말단 도메인을 포함하고, 이는 ROS1 단백질의 32번째 엑손의 개시 위치에 대응하는 아미노산으로부터 시작해서 ROS1 단백질의 C-말단을 향해서 연속적인 약 50 내지 300개의 아미노산으로 본질적으로 이루어진다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 엑손 번호는 미국 매릴랜드주의 베테스타에 소재한 미국 국립보건원에 종속되는 미국 국가생물공학센터(NCBI)에 의해 할당된 엑손 번호에 따라서 매겨진다. 몇몇 예시적인 실시형태에 있어서, 융합 단백질 SLC34A2-ROS1은 NCBI에 의해 이와 같이 확인된 아미노산 서열 중 임의의 것을 가질 수 있다. DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 자동화 DNA 서열 또는 자동화 펩타이드 서열에 의해 결정될 수 있다. 이러한 자동화 서열결정 수단에 의해 결정된 (뉴클레오타이드 또는 아미노산) 서열은 실제 서열과 비교해서 부분적인 에러를 포함할 수 있다. 일반적으로 자동화 서열결정에 의해 결정된 서열은 실제 서열과 비교해서 적어도 약 90%, 적어도 20 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.9%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 융합 단백질, 융합 유전자 또는 융합 영역은 NCBI에 의해서 이와 같이 확인된 서열과 비교해서 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 99.9%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
간략화를 목적으로, 이하의 개시내용은 ROS1 융합 단백질 SLC34A2-ROS1을 참고하지만, 이것은 또한 본 명세서에 기재된 기타 ROS1 융합 단백질에 적용될 수도 있다. 예시된 SLC34A2-ROS1 융합 단백질은, 몇몇 실시형태에 있어서, SLC34A2의 80 내지 200개의 N-말단 아미노산 잔기와 ROS1의 적어도 300개의 C-말단 잔기, 바람직하게는 300 내지 500개의 C-말단 아미노산 잔기 범위로 이루어질 수 있다. 융합 유전자는 나선형 도메인과 함께 단백질 티로신 키나제 도메인을 갖는다. 어떠한 이론에도 구속되길 원치 않지만, SLC34A2-ROS1 융합 단백질의 3차 입체 형태가 자가-인산화에 의해 발암성 단백질 티로신 키나제 도메인을 활성화시키는 동질-이량체화를 유도하는 것으로 여겨진다. 종합하여 고려하면, SLC34A2-ROS1 융합 유전자는 고도로 발현될 수 있고, 이어서 SLC34A2로 인해 번역 후에 이량체화될 수 있다. 이어서, 이량체화된 ROS1 단백질 티로신 키나제 도메인은 비정상적으로 자극될 수 있고, 따라서 예를 들어 ROS1 융합 관련 NSCLC 폐암에서 볼 수 있는 바와 같이, 발암성 경로의 자극을 용이하게 한다.
일단 융합이 검출되면, SLC34A2-ROS1의 융합 단백질을 암호화하는 SLC34A2-ROS1의 융합 유전자로서 공지될 것이다. 폐암을 진단하는 정보를 제공하는 방법은, 대상체로부터 얻어진 시험 샘플에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 융합을 검출하는 단계를 포함한다. 진단은 융합 유전자 암호화 융합 단백질을 비교하고; 그리고 ROS1의 과발현은 암이 없는 개체로부터 표준 샘플과 비교되고, 여기서 적어도 하나의 요소가 시험 샘플에서 선택되고 검출될 경우, 대상체는 하기 중 임의의 것 또는 전부로서 확인될 수 있다: 암 환자, 폐암 환자, NSCLC 폐암 환자, ROS1 융합 관련 NSCLC 환자, 및/또는 SLC34A2-ROS1 융합 관련 NSCLC 환자.
염색체 6의 결실, 역전 또는 전좌는 인간 염색체 6의 결실, 역전 또는 전좌를 검출할 수 있는, 예를 들어, 인간 염색체 6에서 역전 영역을 포함하는 연속적인 100 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 폴리뉴클레오타이드 단편을 생성할 수 있는 인간 염색체 6 및/또는 프라이머 쌍에서 결실, 역전 또는 전좌 영역(에 상보적으로 결합)과 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드(프로브)를 이용함으로써 검출될 수 있다. 융합 단백질, 융합 유전자 및 융합 영역은 본 명세서에 기재되어 있다. 예시적인 실시형태에 있어서, 융합 단백질은, 또한 예를 들어, 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 ROS1 특이적 또는 ROS1 융합 특이적 항체의 사용으로 융합 단백질 또는 융합 유전자 또는 융합 유전자에 대응하는 mRNA의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있다.
융합 단백질의 존재는 융합 단백질과 구체적으로는 융합 단백질에 결합하는 물질(예컨대, 항체 또는 앱타머) 간의 상호작용을 측정하는 일반 검정법에 의해 검출될 수 있다. 일반 검정법은 면역크로마토그래피, 면역조직화학 염색, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 효소 면역검정 (EIA), 형광 면역검정(FIA), 발광 면역검정(LIA), 웨스턴 블로팅, FACS 등일 수 있다.
또한, 융합 유전자 또는 mRNA의 존재는, 융합 유전자 또는 mRNA(에 상보적으로 결합할)와 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 사용해서, PCR, FISH(형광 동소 혼성화: fluorescent in situ hybridization) 등과 같은 일반 검정법에 의해 검출될 수 있다. FISH는 이하에 더욱 상세히 기술된다. 융합 유전자는 대량으로 평행한 서열결정 수법을 통해서 전체-전사체 해독(RNA) 및/또는 전체-게놈 DNA 서열결정의 일체화 수법을 이용해서 검출 및/또는 검증될 수 있다. 융합 유전자 또는 mRNA와 혼성화 가능한 폴리뉴클레오타이드는 시험 샘플에서 융합된 또는 절단된 유전자 또는 전사물과의 직접 혼성화에 의해 융합 유전자 또는 mRNA를 검출할 수 있는, siRNA, 올리고뉴클레오타이드, DNA 프로브, 또는 DNA 프라이머일 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 형광 동소 혼성화(FISH)는 (문헌[Verma et al. Human Chromosomes: A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y. (1988)]에 기재된 바와 같이) 본 발명의 방법에서 이용된다. FISH 검정은 1개 이상의 프로브 세트를 이용해서 수행될 수 있고, 실시형태들은 다음과 같이 제공된다: (1) 제1 프로브 세트로서, ROS1 유전자(제1 염색체 부위)를 함유하는 염색체 부위를 표적화하는 제1 프로브 세트임; 이것은 제1 형광 물질로 표지된 프로브 1A 및 제2 형광 물질로 표지된 프로브 1B로 이루어지고; 프로브 1A는 상기 제1 염색체 부위에서 5' 영역인 제1 영역과 상보적이고, 프로브 1B는 상기 제1 영역과는 떨어져서 존재하는 제2 영역과 상보적이고 상기 제1 염색체 부위에 있는 3' 영역이며, 그리고 SLC34A2-ROS1 융합 유전자가 SLC34A2와 ROS1 유전자 간의 전좌에 의해 생성될 경우 ROS1 유전자에서의 변곡점은 상기 제1 영역과 제2 영역 사이의 상기 제1 영역의 3' 꼬리부에 또는 상기 제2 영역의 5' 꼬리부에 위치되고; (2) 제2 프로브 세트로서, SLC34A2 유전자(제2 염색체 부위)를 함유하는 염색체 부위를 표적화하는 제2 프로브 세트임; 이것은 제1 형광 물질로 표지된 프로브 2A 및 제2 형광 물질로 표지된 프로브 2B로 이루어지고; 프로브 2A는 상기 제2 염색체 부위에서 5' 영역인 제1 영역과 상보적이고, 프로브 2B는 상기 제1 영역과는 떨어져서 존재하는 제2 영역과 상보적이고 상기 제1 염색체 부위에 있는 3' 영역이며, SLC34A2-ROS1 융합 유전자가 SLC34A2와 ROS1 유전자 간의 전좌에 의해 생성될 경우 SLC34A2 유전자에서의 변곡점은 상기 제1 영역과 제2 영역 사이의 상기 제1 영역의 3' 꼬리부에 또는 상기 제2 영역의 5' 꼬리부에 위치되고; (3) 상기 프로브 2A와 상기 프로브 1B로 이루어진 제3 프로브 세트; 및 (4) ROS1 유전자를 함유하는 염색체 부위와 상보적인 프로브 4A(제3 염색체 부위), 및 SLC34A2 유전자를 함유하는 염색체 부위와 상보적인 프로브 4B(제4 염색체 부위)로 이루어진 제4 프로브 세트.
상기 제1 염색체 부위의 길이는 0.5 내지 2.0Mb일 수 있다. 상기 제2 염색체 부위의 길이는 0.5 내지 2.0Mb일 수 있다. 상기 제3 염색체 부위의 길이는 0.5 내지 2.0Mb일 수 있다. 상기 제4 염색체 부위의 길이는 0.5 내지 2.0Mb일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, FISH 검정은 기타 물리적 염색체 매핑 수법 및 유전자 지도 데이터와 상관관계가 있을 수 있다. FISH 수법은 잘 알려져 있다(예컨대, 미국 특허 제5,756,696호; 제5,447,841호; 제5,776,688호; 및 제5,663,319호 참조). 유전자 지도 데이터의 예는 문헌[1994 Genome Issue of Science (265: 1981f)]에서 발견할 수 있다). ROS1 단백질을 암호화하는 유전자의 위치와 그리고/또는, ROS1 융합 폴리펩타이드의 경우에, 물리적 염색체 지도 및 특정 질환에 대한, 또는 특정 질환에 걸리기 쉬운 ROS1 융합 단백질의 융합 파트너를 암호화하는 유전자(예컨대, FIG 유전자, SLC34A2 유전자, 또는 CD74 유전자)는, 그 유전자 질환에 연관된 DNA의 영역을 정하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 정상의 담체 또는 병든 개체 간의 유전자 서열의 차이를 검출하는데 이용될 수 있다.
확립된 염색체 마커를 이용한 연쇄 분석 등과 같은 물리적 매핑 및 염색체 제작의 동소 혼성화는 유전자 지도를 연장시키는데 이용될 수 있다. 흔히 다른 포유동물 종, 예컨대, 마우스의 염색체 상에 유전자의 배치는 특정 인간 염색체의 수 또는 부문이 알려져 있지 않더라도 연관된 마커를 드러낼 수 있다. 새로운 서열은 물리적 매핑에 의해 염색체 부문 또는 그의 일부에 할당될 수 있다. 이것은 위치 클로닝 또는 기타 유전자 발견 수법을 이용해서 질환 유전자를 탐색하는 조사자에게 귀중한 정보를 제공한다. 일단 질환 또는 증후군이 특정 게놈 영역, 예를 들어, AT 내지 11q22-23에 유전자 연쇄에 의해 대체로 국재화되어 있다면(Gatti et al., Nature 336:577-580 (1988)), 그 영역에 매핑되는 임의의 서열은 추가의 연구를 위하여 연관된 또는 조절 유전자를 대표할 수 있다. 본 발명의 ROS1 융합을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 일부는, 또한, 정상의 보유체 또는 병든 개체 중에서 전좌, 역전 등으로 인해 염색체 위치에서의 차이를 검출하는데 이용될 수 있다.
ROS1 키나제 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 전장 ROS1 또는 ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1(S))를 검출하는 방법(예컨대, PCR 및 FISH) 전체를 ROS1 키나제 활성을 지니는 폴리펩타이드 또는ROS1 키나제 활성을 지닌 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 다른 방법과 조합될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 생물학적 샘플의 유전 물질 내 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 순환 종양 세포에서의 FIG-ROS1)의 검출은 FIG-ROS1 폴리뉴클레오타이드가 생물학적 샘플 내 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드로서 실제로 발현되는지의 여부를 결정하기 위하여 샘플의 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석 또는 면역-조직화학(IHC) 분석에 의해 수행될 수 있다. 이러한 웨스턴 블롯팅 또는 IHC 분석은 검출된 FIG-ROS1 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 이용해서 수행될 수 있거나, 또는 상기 분석은 구체적으로는 (예컨대, 단백질의 N-말단에 결합하는) 전장 FIG에 또는 (예컨대, ROS1의 키나제 도메인 내 에피토프를 결합하는) 전장 ROS1에 결합하는 항체를 이용해서 수행될 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제7,468,252호 참조).
다른 예에서, Dako의 CISH 수법은 동일한 조직 절편 상에서 면역-조직화학에 의해 발색성 동소 혼성화를 허용한다. CISH 및 FISH에 대해서는 문헌[Eliot et al., Br J Biomed Sci 2008; 65(4): 167-171, 2008] 참조.
본 발명의 다른 양상은 ROS1 키나제에 의해 유발된 폐암 또는 의사 폐암(suspected lung cancer)을 지니는 환자를 진단하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 ROS1 키나제 활성을 지니는 폴리펩타이드, 예컨대, 전장 ROS1 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드(예컨대, FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드, SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드, 또는 CD74-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드)를 암호화하는 핵산 분자에 엄격도 조건 하에 혼성화되는 프로브와 상기 폐암 또는 의사 폐암의 생물학적 샘플(생물학적 샘플이 적어도 하나의 핵산 분자를 포함할 경우)을 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 프로브를 상기 생물학적 샘플 내 적어도 하나의 핵산 분자에의 혼성화는 상기 ROS1 키나제에 의해 유발된 폐암 또는 의사 폐암을 지니는 환자를 확인해준다.
본 발명의 또 다른 양상은 ROS1 키나제에 의해 유발된 폐암 또는 의사 폐암을 지니는 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 폐암 또는 의사 폐암의 생물학적 샘플(생물학적 샘플이 적어도 하나의 핵산 분자를 포함할 경우)을 구체적으로는 ROS1 키나제 활성을 지니는 폴리펩타이드(예컨대, FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드, SLC34A2-ROS1 또는 CD74-ROS1 융합 폴리펩타이드)에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물학적 샘플 내 적어도 하나의 융합 폴리펩타이드에 대한 상기 시약의 특이적 결합은 상기 ROS1 키나제에 의해 유발된 폐암 또는 의사 폐암을 지니는 환자를 확인해준다.
각종 실시형태에 있어서, ROS1 키나제에 의해 유발되는 폐암 또는 의사 폐암의 확인은 ROS1-저해 치료에 반응할 것 같은 그 폐암 또는 의사 폐암을 지니는 그 환자를 확인해줄 것이다.
SLC34A2 유전자와 ROS1 유전자 간의 전좌를 검출하기 위한 키트는 1개 이상의 프로브 세트를 포함할 수 있다. (1) 제1 프로브 세트는 제1 형광 물질로 표지된 프로브 1A 및 제2 형광 물질로 표지된 프로브 1B를 포함하고; 프로브 1A는 상기 제1 염색체 부위에서 5' 영역인 제1 영역과 상보적이고, 프로브 1B는 상기 제1 영역과는 떨어져서 존재하는 제2 영역과 상보적이고 상기 제1 염색체 부위에 있는 3' 영역이며, 그리고 SLC34A2-ROS1 융합 유전자가 SLC32A2와 ROS1 유전자 간의 전좌에 의해 생성될 경우 ROS1 유전자에서의 변곡점은 상기 제1 영역과 제2 영역 사이의 상기 제1 영역의 3' 꼬리부에 또는 상기 제2 영역의 5' 꼬리부에 위치되고; (2) 제2 프로브 세트로서, SLC32A2 유전자(제2 염색체 부위)를 함유하는 염색체 부위를 표적화하는 제2 프로브 세트임; 이것은 제1 형광 물질로 표지된 프로브 2A 및 제2 형광 물질로 표지된 프로브 2B로 이루어지고; 프로브 2A는 상기 제2 염색체 부위에서 5' 영역인 제1 영역과 상보적이고, 프로브 2B는 상기 제1 영역과는 떨어져서 존재하는 제2 영역과 상보적이고 상기 제1 염색체 부위에 있는 3' 영역이며, SLC34A2-ROS1 융합 유전자가 SLC32A2와 ROS1 유전자 간의 전좌에 의해 생성될 경우 SLC32A2 유전자에서의 변곡점은 상기 제1 영역과 제2 영역 사이의 상기 제1 영역의 3' 꼬리부에 또는 상기 제2 영역의 5' 꼬리부에 위치되고; (3) 상기 프로브 2A와 상기 프로브 1B로 이루어진 제3 프로브 세트; 및 ROS1 유전자를 함유하는 염색체 부위와 상보적인 프로브 4A(제3 염색체 부위), 및 SLC32A2 유전자를 함유하는 염색체 부위와 상보적인 프로브 4B(제4 염색체 부위)로 이루어진 제4 프로브 세트.
SLC34A2-ROS1 전좌되기 쉬운 환자를 확인하는데 유용한 키트는 프로브의 사용 설명서, DNA 대조 염색, 혼성화 용도를 위한 완충액, 봉합재, 및 대조 슬라이드를 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 요소를 포함한다. 키트는 본 발명의 검출 방법을 편리하게 그리고 효율적으로 수행하는 것을 가능하게 한다. 키트는 요구되는 요소(필수 성분)로서 상기 제1 프로브 세트, 제2 프로브 세트, 제3 프로브 세트 또는 제4 프로브 세트를 포함할 수 있다. 2종 이상의 프로브 세트는 또한 키트에 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트는 제1 프로브 세트 및 제3 프로브 세트를 내포할 수 있다. 각 프로브 세트에 대한 상세는 위에서 기재되어 있으므로, 이에 대해서는 여기에서는 반복하지 않을 것이다.
SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 부재의 검출은 게놈 DNA로부터 상기 융합 폴리펩타이드 또는 전사물을 암호화하는 그 게놈 DNA를 직접 이용해서 수행될 수 있지만, 또한 그 전사물(상기 융합 폴리펩타이드)로부터의 번역 산물을 이용해서 직접 수행될 수 있다.
융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA가 염색체 6(6q22)의 117.61 내지 117.75Mb 영역 사이의 역전에 의해 형성되기 때문에, 본 발명의 현상은 "SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 부재의 검출"에서 검출될 수 있다. 역전의 이 검출에서, 예를 들어, ROS1 유전자의 키나제 도메인 암호화 영역으로부터 상류의 5'-측 영역과 ROS1 유전자의 그 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역 사이의 분할이 검출될 수 있거나, 또는 나선형 도메인의 일부 또는 전부의 암호화 영역과 SLC32A2 유전자의 그 암호화 영역으로부터 상류의 5'-측 영역과 SLC34A2 유전자의 나선형 도메인의 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역 간의 분할이 검출될 수 있다.
숙련된 전문자에게 공지되고 입수 가능한 수법은 본 발명에서 "SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 부재의 검출"에서 이용될 수 있다. "상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA"가 대상이면, 예를 들어, 형광 등을 이용하는 동소 혼성화(ISH), 게놈 PCR, 직접 서열분석, 서던 블롯팅 또는 게놈 마이크로어레이 분석이 이용될 수 있다. "상기 게놈 DNA로부터의 전사물"이 대상이면, 예를 들어, RT-PCR, 직접 서열분석, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅 또는 cDNA 마이크로어레이 분석이 이용될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 기타 요소들을 포함할 수 있다. 이들 기타 요소의 예는 프로브의 사용을 위한 명세(혹은 사양), DAPI와 같은 DNA 대조염색, 혼성화 완충액, 세척 완충액, 용매, 마운팅 배지(mounting media), 대조 슬라이드, 반응 용기 및 기타 장비이다. 진단 목적을 위한 명세가 또한 포함될 수 있다. 또한, 암 환자로부터의 염색체 샘플에서 SLC34A2-ROS1전좌의 검출(긍정적인 확인)이 ROS1 키나제 저해제를 이용해서 이들 환자에서 어떻게 셋업되어야 하는지를 나타내는 명세 등이 또한 포함될 수 있다. 게다가, 치료 과정을 결정하는 계획 및 이 계획의 설명서가 또한 포함될 수 있다.
비교적 긴 프로브(대략 200kb(프로브 1A) 내지 대략 1,370kb(프로브 4B))가 구성된다. 따라서, 프로브와 표적 서열 간의 상보성은 본 발명에서 의도된 특정 혼성화가 달성될 정도까지 고도로 제한될 필요가 없다. 표적 서열들 간의 유사성의 예는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%이다.
제1 프로브 세트와 제2 프로브 세트가 사용될 경우에, 두 형광 신호는 SLC34A2 유전자와 ROS1 유전자 간의 전좌가 존재하지 않는 염색체 샘플에서 개별적으로 분리하여 검출되고; 전좌가 일어나지 않았던 염색체 샘플에서, 전형적으로 두 형광 신호는 서로 이웃하는 것으로 관찰되거나, 또는 두 형광 신호의 조합인 신호(황색)이 관찰된다. 따라서, SLC34A2 유전자와 ROS1 유전자 간의 전좌의 유무는 형광 신호의 패턴에 반영된다. 결과적으로, SLC34A2 유전자와 ROS1 유전자 간의 전좌는 형광 신호의 패턴으로부터 결정될 수 있다.
위에서 도달한 판단은 바람직하게는 전형적으로 대조군(시험 샘플)의 결과의 비교에 기초해서 행해진다. 여기서, 대조군은 비소세포 폐암을 지니는 환자로부터 유래된 염색체 샘플 또는 전암성 병변을 나타내는 환자로부터 유래된 염색체 샘플이다. 또한, 전암성 병변이 없는 환자로부터의 염색체 샘플, 암을 지니지 않는 환자로부터의 염색체 샘플 또는 정상의 건강한 대상체로부터 채취한 염색체 샘플이 또한 대조군으로서 이용될 수 있다. 세포의 균주로부터 유래된 염색체 샘플이 또한 대조군으로서 이용될 수 있다.
융합 유전자가 SLC34A2-ROS1의 융합 단백질를 암호화하는 융합 유전자 SLC34A2-ROS1인 경우, 융합 유전자 SLC34A2-ROS1(또는 임의의 다른 ROS1 융합 유전자, 예컨대 CD74-ROS1, 및 FIG-ROS1)은 융합 영역(에 상보적으로 결합)과 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드(프로브) 및/또는 융합 영역을 포함하는 연속하여 100 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 폴리뉴클레오타이드 단편을 생산할 수 있는 프라이머 쌍을 사용함으로써 검출될 수 있다. 또한, 하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 융합 단백질 SLC34A2-ROS1은 융합 단백질 SLC34A2-ROS1의 융합 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용해서 검출될 수 있다.
또한, 검출은 발색성 동소 혼성화(CISH) 방법과 은 동소 혼성화(SISH) 방법의 조합인 융합 검정에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서에서의 "융합점"은 SLC34A2의 각각의 유전자로부터 유래된 부분이 ROS1 유전자로부터 유래된 부분에 융합되는 지점을 지칭한다.
용어 "융합 영역(또는 역전 영역)과 혼성화될 수 있는"이란 상보적 서열 또는 융합 영역(또는 역전 영역)의 것과 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 서열을 지칭한다. 다른 실시형태는 융합 영역과 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 융합 영역을 포함하는 연속하여 100 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 폴리뉴클레오타이드 단편을 생산할 수 있는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 암을 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 또한 인간 염색체 6 내 역전 영역과 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 인간 염색체 6의 역전 영역을 포함하는 연속하여 100 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 폴리뉴클레오타이드 단편을 생산할 수 있는 프라이머 쌍, 및 융합 영역에 결합하는 항체 또는 앱타머. 다른 실시형태는 암을 진단하기 위한 융합 단백질 및/또는 융합 유전자의 사용을 제공한다. 환자는 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 원숭이 등과 같은 영장류, 마우스 또는 래트 등과 같은 설치류, 특히 인간일 수 있다. 언급된 임의의 검정법에 이용하는데 적합한 시험 샘플은, 세포(예컨대, 폐 세포); 조직(예컨대, 폐 조직); 체액(예컨대, 혈액); 순환 종양 DNA, 순환 종양 세포일 수 있다. 샘플은 종양의 수술적 생검, 종양의 코어 생검, 종양의 세침흡인, 흉수, 그리고 환자로부터 세포 및 조직을 분리하는 기타 공지된 방법으로부터의 수집을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 방법에서 수집될 수 있다. 예를 들어, FISH 검정(본 명세서에 기재됨)은 순환 종양 세포 상에서 수행될 수 있었다.
환자는 키나제 저해제로 치료될 계획을 갖거나 치료를 받고 있을 수 있다. 시험 샘플은 인간 암 세포로부터 유래된 세포 또는 이의 추출물을 포함할 수 있다.
다른 실시형태는, 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자를 제공하되, 여기서 융합 파트너의 N-말단 도메인을 암호화하는 유전자가 5' 단부에서 위치되고 ROS1 단백질의 C-말단 도메인을 암호화하는 유전자가 3' 단부에 위치된다. 하나의 예시적인 실시형태에 있어서,융합 단백질이 SLC34A2-ROS1 단백질인 경우, 융합 유전자는 SLC34A2-ROS1 유전자로서 표현될 수 있고, 이때 SLC34A2의 N-말단 도메인을 암호화하는 유전자가 5' 단부에 위치되고 ROS1 단백질의 C-말단 도메인을 암호화하는 유전자가 3' 단부에 위치된다.
다른 실시형태는 융합 유전자 및 임의로 융합 유전자에 작동 가능하게 연결된 전사 요소(예컨대, 촉진제 등)를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 다른 실시형태는 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 세포를 제공한다.
치료 또는 진단 과정에서 얻어진 생물학적 시편(specimen)(생검 샘플 등)은 흔히 포르말린 고정되지만, 이 경우에, 동소 혼성화의 이용은 검출 대상인 DNA 게놈이 포르말린 고정 하에 안정적이기 때문에 그리고 검출 감도가 높기 때문에 유리하다.
동소 혼성화에서, 생물학적 시편에서 SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA는 적어도 15개의 뉴클레오타이드 염기의 사슬 길이를 가진 이하에 기술된 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드를 혼성화함으로써 검출될 수 있다:
(a) SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오타이드
(b) SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위에 혼성화되는 프로브인 폴리뉴클레오타이드.
동소 혼성화에서, 생물학적 시편에서 CD74-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA는 적어도 15개의 염기의 사슬 길이를 가진 이하에 기술된 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드를 혼성화함으로써 검출될 수 있다:
(a) CD74 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오타이드
(b) CD74 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위에 혼성화되는 프로브인 폴리뉴클레오타이드.
동소 혼성화에서, 생물학적 시편에서 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA는 적어도 15개의 염기의 사슬 길이를 가진 이하에 기술된 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드를 혼성화함으로써 검출될 수 있다:
(a) FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오타이드.
(b) FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 의 융합 부위에 혼성화되는 프로브인 폴리뉴클레오타이드.
그러나, 유전자의 DNA 서열은 자연계에서(즉, 비인위적으로) 돌연변이될 수 있다. 따라서, 이러한 자연 변이체는 또한 본 발명의 대상일 수 있다(이하 마찬가지임).
본 발명의 (a)에 기술된 폴리뉴클레오타이드는 임의의 것일 수 있되, 단, ROS1 결합 파트너, 즉, SLC34A2, CD74 또는 FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 ROS1 단백질(이것은 그 폴리뉴클레오타이드의 표적 염기 서열임)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화함으로써 생물학적 시편에서 상기 ROS1 융합 단백질을 암호화하는 게놈 DNS의 존재를 검출할 수 있다. 이것은 바람직하게는 하기 (a1) 내지 (a4)에 기술된 폴리뉴클레오타이드이다.
(a1) SLC34A2 유전자의 암호화 영역으로부터 상류의 엑손 1 내지 2 및 5'-측 영역의 나선형 도메인의 일부 또는 전부의 암호화 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 "5' SLC34A2 프로브 1"이라 지칭됨)와 키나제 도메인의 암호화 영역 및 ROS1 유전자의 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 "3' ROS1 프로브 1"이라 지칭됨)의 조합.
(a2) ROS1 유전자의 키나제 도메인의 암호화 영역으로부터 상류의 5'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "5' ROS1 프로브 1"이라 지칭됨)와 키나제 도메인의 암호화 영역과 ROS1 유전자의 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "3' ROS1 프로브 1"이라 지칭됨)의 조합
(a3) 피브리넥틴 유형-III 9의 암호화 영역 및 ROS1 유전자의 그 영역으로부터 상류의 5'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "5' ROS1 프로브 2"라 지칭됨)와 막관통 도메인의 암호화 영역 및 ROS1 유전자의 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역을 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "3' ROS1 프로브 2"라 지칭됨)의 조합.
(a4) 나선형 도메인의 일부 또는 전부의 암호화 영역 및 SLC34A2 유전자의 그 암호화 영역으로부터 상류의 5'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "5' SLC34A2 프로브 1"이라 지칭됨)와 이중나선 도메인의 암호화 영역 및 SLC34A2 유전자의 그 암호화 영역으로부터 하류의 3'-측 영역에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드(또한 이하 "3' SLC34A2 프로브 1"이라 지칭됨)
동소 혼성화에 이용되는 (a1)의 폴리뉴클레오타이드가 혼성화되는 영역(표적 염기 서열)은 바람직하게는 표적 염기 서열 및 검출 감도에 대한 특이성을 이유로SLC34A2 유전자와 ROS1 유전자의 융합 부위로부터 1,000,000개의 염기 내의 영역이고, 동소 혼성화에 이용되는 (a2) 내지 (a4)의 폴리뉴클레오타이드가 혼성화되는 영역은 바람직하게는 동일한 이유로 SLC34A2 유전자 또는 ROS1 유전자 내의 변곡점으로부터 1,000,000개의 염기 내의 영역이다.
동소 혼성화에 이용되는 상기 (a) 또는 (b)에 기술된 폴리뉴클레오타이드는, 표적 염기 서열 및 검출 감도에 대한 특이성 때문에, 바람직하게는 상기 표적 염기 서열의 전부를 커버할 수 있는 복수의 종류의 폴리펩타이드를 구성하는 수집물이다. 이 경우에, 수집물을 구성하는 폴리뉴클레오타이드의 길이는 적어도 15개의 염기, 바람직하게는 100 내지 1000개의 염기이다.
동소 혼성화에 이용되는 상기 (a) 또는 (b)에 기술된 폴리뉴클레오타이드는,바람직하게는 검출용의 형광 염료 등에 의해 표지화된다. 이러한 형광 염료의 예는 DEAC, FITC, R6G, TexRed 및 Cy5를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광 염료 이외에, 상기 폴리뉴클레오타이드는 또한 효소적 금속 침착에 기반하는 DAB, 또는은 등과 같은 염료(색소원)으로 표지될 수 있다.
동소 혼성화에서, 5' SLC34A2 프로브 1 및 3' ROS1 프로브 1이 이용되면, 또는 5' ROS1 프로브 1 및 3' ROS1 프로브 1이 이용되면, 또는 5' ROS1 프로브 2 및 3' ROS1 프로브 2가 이용되면, 또는 5' SLC34A2 프로브 1 및 3' SLC34A2 프로브 1이 이용되면, 이들 프로브가 상호 상이한 염료로 표지화되는 것이 바람직하다. 동소 혼성화가 이 방식으로 상이한 염료로 표지화된 프로브들의 조합을 이용해서 수행되면, 5' SLC34A2 프로브 1의 표지(예를 들어, 형광)에 의해 생성된 신호 및 3' ROS1 프로브 1의 표지에 의해 생성된 신호가 중첩되는 경우, SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA가 검출되었다고 결정될 수 있다. 한편, 5' ROS1 프로브 1의 표지에 의해 생성된 신호와 3' ROS1 프로브 1의 표지에 의해 생성된 신호가 분할되는 경우, 또는 5' ROS1 프로브 2의 표지에 의해 생성된 신호와 3' ROS1 프로브 2의 표지에 의해 생성된 신호가 분할되는 경우, 또는 5' SLC34A2 프로브 1의 표지에 의해 생성된 신호와 3' SLC34A2 프로브 1의 표지에 의해 생성된 신호가 분할되는 경우, SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA가 검출되었다고 결정될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 표지화는 공지된 수법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 닉(nick) 번역 또는 랜덤 프라이밍에 의해 형광 염료 등으로 표지화된 기질 염기가 폴리뉴클레오타이드에 일체화될 수 있고, 이에 따라서 그 폴리뉴클레오타이드를 표지화할 수 있다. 동소 혼성화에서, 상기 (a) 또는 (b)에서 기술된 폴리뉴클레오타이드와 상기 생물학적 시편을 혼성화할 때 이용되는 조건은 관련된 폴리뉴클레오타이드의 길이 등과 같은 각종 인자에 따라 변할 수 있지만, 높은 엄격한 혼성화 조건의 예는 0.2xSSC, 65℃이고, 낮은 엄격한 혼성화 조건의 예는 2.0xSSC, 50℃이다. 단, 염 농도(SSC의 희석비) 및 온도뿐만 아니라, 계면활성제 (NP-40 등)의 농도, 폼아마아이드의 농도 및 pH 등과 같은 각종 조건을 적절하게 선택하는 상기 조건과 같은 엄격성의 혼성화 조건은 당업자에 의해 달성될 수 있음에 유의해야 한다. 예를 들어, 선별을 위한 일반적인 혼성화 조건을 위하여, 본 명세서에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 상보적 서열에 대한 중간 내지 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 혼성화 조건은 분자 생물학의 분야에서 잘 알려져 있다. 예시의 목적을 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드의 혼성화를 시험하기 위한 적절한 중간 엄격도 조건은 5.배.SSC의 용액, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0) 중에서의 사전세척; 50℃ 내지 60℃, 5X SSC에서 하룻밤 혼성화; 이어서 0.1% SDS를 함유하는 각각 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 20분 동안 65℃에서 2회 세척을 포함한다. 당업자라면 혼성화의 엄격성이 혼성화 용액의 염 함량 및/또는 혼성화가 수행되는 온도를 변화시키는 등에 의해 용이하게 조작될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 또 다른 실시형태에 있어서, 적절한 높은 엄격한 혼성화 조건은 혼성화의 온도가 예컨대 60 내지 65℃ 또는 65 내지 70℃까지 증가되는 예외와 함께 위에 기재된 것들을 포함한다.
상기 동소 혼성화와는 다른 상기 (a) 또는 (b)에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 이용해서 SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA를 검출하기 위한 방법의 예는 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 및 도트 블롯팅이다. 이들 방법에 있어서, 상기 융합 유전자는 상기 (a) 또는 (b)에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 막에 대해서 중간 내지 높은 엄격도 조건 하에 혼성화시킴으로써 검출되고, 상기 막 상에서 상기 생물학적 시편으로부터 얻어진 핵산 추출물이 전사된다. (a)의 폴리뉴클레오타이드를 이용할 경우, SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA가 SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 폴리펩타이드와 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 폴리펩타이드가 막에 대해서 발달된 동일한 밴드를 인식할 경우 검출된 것으로 결정될 수 있다.
게놈 마이크로어레이 분석 및 DNA 마이크로어레이 분석은 상기 (b)의 폴리뉴클레오타이드를 이용해서 SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA를 검출하는 추가의 방법이다. 이들 방법에 있어서, (b)의 폴리뉴클레오타이드의 어레이는 기질에 고정되고, 관련된 게놈 DNA는 어레이 상의 폴리뉴클레오타이드와 접촉하여 생물학적 시편을 배치함으로써 검출된다. PCR 또는 서열결정에 있어서, 이하에 기술되는 (c)의 폴리뉴클레오타이드는, 구체적으로는 주형으로서 생물학적 시편으로부터 제조된 DNA(게놈 DNA, cDNA) 또는 RNA를 이용해서, SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 전부를 증폭하는데 이용될 수 있다. (c) SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위를 샌드위치시키도록 설계된 1쌍의 프라이머인 폴리뉴클레오타이드. "1쌍의 프라이머인 폴리뉴클레오타이드"는 SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 하나의 프라이머와, 표적으로서 제공되는 상기 융합 폴리뉴클레오타이드와 같은 염기 서열에서 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 다른 프라이머로 이루어진 프라이머 세트이다. 이들 폴리뉴클레오타이드의 길이는 통상 15 내지 100개의 염기, 바람직하게는 17 내지 30개의 염기이다.
PCR에 의한 검출 정확도 및 감도의 관점으로부터, 본 발명의 (c)에 기술된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 SLC34A2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 ROS1 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위로부터 5000개 염기 이내의 상기 융합 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열에 대해서 상보적인 서열이다.
"한쌍의 프라이머인 폴리뉴클레오타이드"는 표적으로서 제공되는 SLC34A2-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열에 기초한 공지된 수법에 의해 적절하게 설계될 수 있다. "프라이머의 쌍인 폴리뉴클레오타이드"의 유리한 예는 SLC34A2-ROS1-F1, SLC34A2-int15-F1, SLC34A2-int15-F2, SLC34A2-ex16-F1, SLC34A2-ex23-F1, SLC34A2-ex24-F1, SLC34A2-F-orf2438 및 SLC34A2-int15-F3.5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, SLC34A2-ROS1-R1, ROS1-int11-R3, ROS1-int7-R1, ROS1-int11-R0.5, ROS1-int11-R1, ROS1-int7-R2 및 ROS1-R-orf2364로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 프라이머로 구성된 프라이머 세트이다. 더욱 바람직하게는, 이것은 SLC34A2-ROS1-F1 및 SLC34A2-ROS1-R1, SLC34A2-int15-F1 및 SLC34A2-ROS1-R1, SLC34A2-int15-F2 및 ROS1-int11-R3, SLC34A2-ex16-F1 및 SLC34A2-ROS1-R1, SLC34A2-ex23-F1 및 SLC34A2-ROS1-R1, 또는 SLC34A2-ex24-F1 프라이머 및 ROS1-int7-R1 프라이머이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 SLC34A2-ROS1 융합을 확인, 평가 또는 검출하는 방법; SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합을 지닌 암을 가진 대상체를 확인, 산정, 평가 및/또는 치료하는 방법; 단리된 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 핵산 분자, 핵산 작제물, 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포; 정제된 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 폴리펩타이드 및 결합제; 검출 시약(예컨대, 아마도, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 핵산 또는 단백질의 특정 검출의 예컨대 프로브, 프라이머, 항체, 키트); 예컨대, 5'SLC34A2-3'ROS1, 5'CD74-3'ROS1, 또는 5'FIG-3'ROS1 융합, 예컨대, 신규한 키나제 저해제와 상호작용하거나 예컨대, 저해하는 분자를 확인하는 선별 검정; 뿐만 아니라 암, 예컨대, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1 또는 FIG-ROS1 융합 중 하나 이상을 가진 암을 지니는 대상체를 산정, 확인, 평가 및/또는 치료하기 위한 검정 및 키트를 제공한다. 본 명세서에서 확인된 조성물 및 방법이, 예를 들어, 새로운 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 저해제를 확인하기 위하여; 대상체, 예컨대, 암을 지닌 환자를 평가, 확인 또는 선택하기 위하여; 그리고 암을 치료 또는 예방하기 위하여 이용될 수 있다.
SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 및 FIG-ROS1 핵산 분자. 일 양상에 있어서, 본 발명은 SLC34A2, 또는 CD74, 또는 FIG 유전자의 단편 및 ROS1 프로토-발암유전자의 단편을 포함하는 핵산 분자(예컨대, 단리된 또는 정제된) 핵산 분자를 특징으로 한다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 SLC34A2, CD74, 또는 FIG의 적어도 1개의 엑손 및 ROS1의 엑손(예컨대, ROS1 티로신 키나제 도메인 또는 이의 단편을 암호화하는 1개 이상의 엑손)의 융합, 예컨대, 프레임내 융합을 포함한다.
예시된 실시형태에 있어서, 5'SLC34A2-3'ROS1 핵산 분자는 암호화된 5'SLC34A2-3'ROS1 융합이 구성적 키나제 활성을 갖고, 예컨대, 본 명세서에서 지칭되는 암 세포에서, 야생행 ROS1과 비교해서, 향상된 활성, 예컨대 키나제 활성을 갖도록 충분한 SLC34A2 및 충분한 ROS1 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 암호화된 5'SLC34A2-3'ROS1 융합은 SLC34A2로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 또는 11개의 엑손 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9,10, 11, 12, 또는 13개의 ROS1 엑손을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 암호화 5'SLC34A2-3'ROS1 융합 폴리펩타이드는 나선형 도메인, 또는 그의 기능적 단편, 및 ROS1 티로신 키나제 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
예시된 실시형태에 있어서, 5'CD74-3'ROS1 핵산 분자는 암호화된 5'CD74-3'ROS1 융합이 구성적 키나제 활성을 갖고, 예컨대, 본 명세서에서 지칭되는 암 세포에서, 야생행 ROS1과 비교해서, 향상된 활성, 예컨대 키나제 활성을 갖도록 충분한 CD74 및 충분한 ROS1 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 암호화된 5'CD74-3'ROS1 융합은 CD74로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개의 엑손 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 ROS1 엑손을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 암호화된 5'CD74-3'ROS1 융합 폴리펩타이드는 II형 막 단백질 도메인, 또는 그의 기능적 단편, 및 ROS1 티로신 키나제 도메인 또는 그의 기능적 단편용의 나선형; 신호-앵커를 포함한다.
예시된 실시형태에 있어서, 5'FIG-3'ROS1 핵산 분자는 암호화된 5'FIG-3'ROS1 융합이 구성적 키나제 활성을 갖고, 예컨대, 본 명세서에서 지칭되는 암 세포에서, 야생행 ROS1과 비교해서, 향상된 활성, 예컨대 키나제 활성을 갖도록 충분한 FIG 및 충분한 ROS1 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서 암호화된 5'FIG-3'ROS1 융합은 FIG로부터의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 엑손 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9,10, 11, 12 또는 13개의 ROS1 엑손을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 암호화된 5'FIG-3'ROS1 융합 폴리펩타이드는 이중나선 도메인, 또는 그의 기능적 단편, 및 ROS1 티로신 키나제 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 핵산 분자는 SLC34A2의 엑손 2 및/또는 4와 ROS1의 엑손 32, 및/또는 34, 및/또는 35와의 프레임내 융합을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 변곡점을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, SLC34A2-ROS1 융합은 적어도 SLC34A2의 엑손 4 또는 이의 단편(예컨대, SLC34A2의 엑손 1 내지 4 또는 이의 단편)과 적어도 ROS1의 엑손 32 및/또는 34 또는 이의 단편(예컨대, ROS1 또는 이의 단편의 엑손 30 내지 43)의 프레임내 융합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합은 5'-SLC34A2에서 3'-ROS1로의 배치형태(configuration)에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 SLC34A2 유전자의 엑손 1 내지 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1 유전자의 엑손 30 내지 43, 예컨대 32, 및/또는 34, 및/또는 35의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, CD74-ROS1 융합 핵산 분자는 CD74의 엑손 1 내지 6과 ROS1의 엑손 32 및/또는 34의 프레임내 융합을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 변곡점을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, CD74-ROS1 융합은 CD74의 적어도 엑손 6 또는 이의 단편(예컨대, CD74의 엑손 1 내지 6 또는 이의 단편)과 ROS1의 적어도 엑손 32 및/또는 34, 및/또는 35, 또는 이의 단편(예컨대, ROS1의 엑손 30 내지 43 또는 이의 단편)과의 프레임내 융합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, CD74-ROS1 융합은 5'-CD74에서 3'-ROS1로의 배치형태에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 CD74 유전자, 또는 이의 단편의 엑손 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1 유전자의 엑손 30 내지 43 예컨대 32, 및/또는 34 및/또는 35의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다
일 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 융합 핵산 분자는 FIG의 엑손 1 내지 8, 예컨대 1 내지 4, 또는 1 내지 8과 ROS1의 엑손 32, 및/또는 34, 및/또는 35의 프레임내 융합을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 변곡점을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, FIG-ROS1 융합은 FIG의 적어도 엑손 4 및/또는 엑손 8 또는 이의 단편(예컨대, FIG의 엑손 1 내지 4, 또는 1 내지 8, 또는 이의 단편)과 ROS1의 적어도 엑손 32 및/또는 34, 및/또는 35 또는 이의 단편(예를 들어, ROS1의 엑손 30 내지 43 또는 이의 단편)의 프레임내 융합을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 융합은 5'-CD74에서 3'-ROS1로의 배치형태에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 CD74 유전자의 엑손 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1 유전자의 엑손 30 내지 43 예컨대 32, 및/또는 34, 및/또는 35의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1 융합 핵산 분자는 SLC34A2 유전자의 단편 및 ROS1 프로토-발암유전자의 단편을 포함하는 SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 뉴클레오타이드 서열은 나선형 도메인 또는 그의 기능적 단편, 및 ROS1 티로신 키나제 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 SLC34A2-ROS1 융합 폴리펩타이드를 암호화한다.
또 다른 실시형태에 있어서, CD74-ROS1 융합 핵산 분자는 ROS1 전사물과 CD74 전사물 간의 융합 접합부를 포함하는 CD74-ROS1 융합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1의 적어도 엑손 32 또는 34 또는 35 또는 이의 단편(예컨대, ROS1의 엑손 30 내지 43 또는 이의 단편)과 적어도 엑손 1 또는 이의 단편(예컨대, CD74의 엑손 1 내지 6 또는 이의 단편)의 융합, 예컨대, 프레임내 융합을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, CD74-ROS1 융합은 5'- CD74에서 3'- ROS1로의 배치형태에 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1 유전자의 엑손 30 내지 43, 예컨대 엑손 32, 34, 또는 35에 대응하는 뉴클레오타이드 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 융합 핵산 분자는 ROS1 전사물과 FIG 전사물 간의 융합 접합부를 포함하는 FIG-ROS1 융합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 분자는, ROS1의 적어도 엑손 32 또는 34 또는 35 또는 이의 단편(예컨대, ROS1의 엑손 30 내지 43 또는 이의 단편)과, 적어도 엑손 4 또는 8 또는 이의 단편(예컨대, FIG의 엑손 1 내지 8 또는 이의 단편)의 융합, 예컨대, 프레임내 융합을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, FIG-ROS1 융합은 5'-FIG에서 3'-ROS1로의 배치 형태이다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 ROS1 유전자의 엑손 30 내지 43, 예컨대 엑손 32, 34, 또는 35에 대응하는 뉴클레오타이드 또는 이의 단편, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 및 FIG-ROS1 융합 핵산 분자를 포함하는 핵산 작제물을 특징으로 한다. 소정의 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 천연 또는 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 또한 본 명세서에 기재된 SLC34A2-ROS1 핵산 분자, 예컨대, 본 명세서에 기재된 핵산 분자 및 폴리펩타이드를 생산하는데 적합한 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 벡터 및 숙주 세포가 포함된다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 SLC34A2-ROS1 융합을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 저감하거나 저해하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 이러한 핵산 분자의 예는, 예를 들어, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 및 FIG-ROS1의 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 및 FIG-ROS1 또는 전사 조절 영역을 암호화하는 핵산에 혼성화되고 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1의 mRNA 발현을 차단하거나 저감하는 안티센스 분자, 리보자임, RNAi, 삼중 나선형 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 ROS1 융합을 확인하는데 유용하거나 또는 다르게는 이에 기초하여 포함하거나 측접하거나 혼성화하는 프로브, 프라이머, 베이트(bait) 또는 라이브러리 구성원으로서 적합한 핵산 분자, 예컨대, 핵산 단편을 특징으로 한다. 소정의 실시형태에 있어서, 프로브, 프라이머 또는 베이트 분자는 본 명세서에 기재된 ROS1 융합 핵산 분자의 포획, 검출 또는 단리를 허용하는 올리고뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 ROS1 융합 핵산 분자의 단편에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 핵산 단편, 예컨대, 올리고뉴클레오타이드와 표적 ROS1 융합 서열 간의 서열 동질성은 서열이 표적 서열의 포획, 검출 또는 단리를 허용하도록 충분히 상보적인 한 정확할 필요는 없다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 단편은 약 5 내지 25, 예컨대, 10 내지 20, 또는 10 내지 15개의 뉴클레오타이드 길이 사이의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 프로브 또는 프라이머이다. 다른 실시형태에 있어서, 핵산 단편은 약 100 내지 300 뉴클레오타이드, 130 내지 230 뉴클레오타이드, 150 내지 200 뉴클레오타이드, 200 내지 350, 350 내지 950, 300 내지 600, 500 내지 1000, 750 내지 2000개의 뉴클레오타이드 00 뉴클레오타이드 사이의 올리고뉴클레오타이드 길이를 포함하는 베이트이고, 반드시 ROS1 융합 핵산을 포함하는 것은 아니다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 단편은, 예컨대, 혼성화, SLC34A2-ROS1 융합, 또는 CD74-ROS1 융합, 또는 FIG-ROS1 융합에 의해 확인 또는 포획하는데 이용될 수 있다. 예시적인 예에서, 핵산 단편은, 예컨대, 중간 내지 높은 엄격도 조건 하에서의 혼성화에 의해, 본 명세서에 기재된 SLC34A2-ROS1 융합 또는 CD74-ROS1 융합, 또는 FIG-ROS1 융합을 확인 또는 포획하는데 이용하기 위한, 프로브, 프라이머일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 핵산 단편은 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 변곡점을 확인 또는 포획하는데 유용할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 핵산 단편은 SLC34A2의 엑손 4 또는 13과 ROS1의 엑손 32, 34 또는 35과의 프레임내 융합을 일으키는 염색체 재배열 내의 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 염색체 6 상의 전좌 내의 서열)에 혼성화된다.
본 명세서에 기재된 프로브 또는 프라이머는 예를 들어 FISH 검출 또는 PCR 증폭을 위해, 또는 ROS1 재배열의 RT-PCT 확인 및 결합 파트너의 확인을 위해 사용될 수 있다. 검출이 PCR에 기초한 예시적인 일 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 접합부의 증폭은, 본 명세서에 기재된 염색체 재배열의 접합부 또는 돌연변이와 같은, 예컨대 본 명세서에 기재된 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 접합부에 측접하는 서열을 증폭하는 것에 대해 프라이머 또는 프라이머 쌍을 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 한 쌍의 단리된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 SLC34A2-ROS1 융합에서의 위치를 함유하거나 이에 인접한 영역을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 순방향 프라이머는 SLC34A2, CD74, 또는 FIG 게놈 또는 mRNA 서열 내에 뉴클레오타이드 서열에 혼성화하도록 설계될 수 있다. 다양한 실시형태에 있어서, ROS1, SLC34A2 및 FIG(인간을 포함하는 다양한 종)에 대한 프라이머는 퀴아젠(Qiagen)(카탈로그 번호 QF0018545, QF00449078 및 QF00278992 퀴아젠(미국 메릴랜드주의 게이스버그시에 소재))으로부터 상업적으로 입수 가능하다. 다른 실시형태에 있어서, ROS1 엑손 32 및 엑손 34 역방향 프라이머와 각각 쌍을 지은 SLC34A2 엑손 4 및 CD74 엑손 6 순방향 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머의 세트를 사용하여 환자의 종양 샘플에서 ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재의 확인을 수행할 수 있다. 종양 샘플로부터의 RNA를 아젠코트 포마퓨어법(Agencourt Formapure method)(미국 매사추세츠주의 베벌리시에 소재한 아젠코트 바이오사시언시스사(Agencourt Biosciences))을 이용해서 FFPE 조직으로부터 추출하고 인비트로젠사(Invitrogen)(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 수퍼스크립트(Superscript) III cDNA 합성 키트를 이용해서 역전사시킬 수 있다. 이하의 프라이머는 SLC34A2-ROS1 또는 CD74-ROS1 변곡점을 결정하기 위해 사용될 수 있다: SLC34A2 엑손 4 정방향, TCGGATTTCTCTACTTTTTCGTG(서열번호 3); CD74 엑손 6 정방향, CTCCTGTTTGAAATGAGCAGG(서열번호 4); ROS1 엑손 32 역방향, GGAATGCCTGGTTTATTTGG(서열번호 5); 및 ROS1 엑손 34 역방향, TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAA(서열번호 6). PCR 증폭은 40ng의 cDNA에 의해 표준 조건 하에 플래티늄 타크(Platinum Taq) 중합효소(인비트로젠사)를 사용하여 임의의 PCR 유전자증폭기, 예를 들어 에펜도르프 마스터사이클러 그래디언트(Eppendorf Mastercycler Gradient)(독일 함부르크주의 에펜도르프시에 소재))에서 수행될 수 있다. cDNA는 BigDye 3.0 키트(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재하는 라이프 테크놀로지사(Life Technologies))를 사용하여 서열분석되었다.
핵산 단편은 예컨대 방사성 표지, 형광 표지, 생물발광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 결합 쌍 표지에 의해 검출 가능하게 표지될 수 있거나, 친화도 태그; 태그 또는 확인자(예컨대, 어댑터, 바코드 또는 다른 서열 식별자)를 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시형태에 있어서, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 대상체로부터의 샘플에 존재하는지에 대한 지식을 직접적으로 획득하는 것을 포함하는, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합의 존재를 검출하는 방법. 샘플은 유체, 세포, 조직, 예컨대 종양 조직으로 이루어진 샘플일 수 있고, 이것은 핵산 샘플, 단백질 샘플, 종양 생검 또는 순환하는 종양 세포 또는 핵산을 포함할 수 있고, 이것은 NSCLC, SCLC, SCC, 또는 이들의 조합을 포함하는 폐암 및 선암종 또는 흑색종으로부터 선택될 수 있다.
핵산 분자에서, 그리고 임의의 하기 방법의 사용에 의한 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합을 검출하는 방법: 핵산 혼성화 검정, 증폭 기반 검정, PCR-RFLP 검정, 실시간 PCR, 서열분석, 선별 분석, FISH, 스펙트럼 핵형분석 또는 MFISH, 비교 게놈 혼성화), 동소 혼성화, SSP, HPLC 또는 질량 분광측정 핵형분석.
단백질 샘플을 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 시약과 접촉시키는 방법; 및 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드 및 시약의 복합체의 형성을 검출하는 방법을 포함하는, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는 방법이 기재되어 있다. 폴리펩타이드 검출의 방법은 결합 및 비결합 시약의 검출을 수월하게 하도록 검출 가능한 기에 의해 표지된 시약을 사용하는 것을 포함하고, 시약은 항체 분자이고, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합의 수준 또는 활성이 평가되고, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합은 대상체에서의 치료의 개시 전에, 치료 동안에 또는 치료 후에 검출되고, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합은 암에 의한 진단 시에 검출되고, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합은 미리 결정된 간격으로, 예컨대 제1 시점 및 적어도 후속 시점에서 검출된다.
치료에 대한 반응이 또한 포함되고, 구체적으로는 여기서, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합의 존재의 결정에 반응하여, 하기 중 하나 이상이 이용된다: (1) 환자 집단을 계층화하는 것; (2) 치료에 반응할 것 또는 반응하지 않을 것 같은 대상체를 확인하거나 선택하는 것; (3) 치료 옵션을 선택하는 것; 및/또는 (4) 대상체에서의 질환의 시간 과정을 예측하는 것.
SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 또는 이의 단편을 포함하는 변곡점을 암호화하는 단리된 또는 정제된 핵산 분자는 본 발명의 화합물을 사용하여 NSCLC 및 폐 선암종 ROS1 융합 양성 암의 확인 목적 및 직접적인 특정 치료에 사용된다. 다른 작제물은, 네이티브 또는 이종성 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 단리된 또는 정제된 핵 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 핵산 분자를 포함하여, ROS1 융합 양성 암, 예를 들어 ROS1 재배열된 NSCLC의 직접적인 특정 치료에 사용될 수 있다. SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 또는 이의 단편을 포함하는 변곡점을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 또는 정제된 벡터. 벡터를 포함하는 숙주 세포. 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 또는 삼중 나선형 분자로부터 선택될 수 있는, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합을 암호화하는 핵산 분자의 발현을 특이적으로 감소시키거나 저해하는 핵산 분자. 단리된 또는 정제된 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 변곡점. ROS1 키나제 활성, 및/또는 이량체화 또는 다량체화 활성을 가지는 단리된 또는 정제된 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드. SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단리된 또는 정제된 항체 분자. 항체 분자이되, 상기 항체 분자가 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 대한 단일특이적 항체 분자인, 항체 분자.
본 발명에서 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 번역 생성물을 검출하는 방법의 예는 면역염색, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 유세포분석법, 면역침전 및 항체 어레이 분석이다. 이들 방법에서, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 사용한다. 이러한 항체의 예는 SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질 및 ROS1 단백질의 융합 부위를 함유하는 폴리펩타이드에 특이적인 항체(또한 이하 "융합 부위-특이적 항체"라 지칭됨), ROS1 단백질의 상기 융합 부위로부터의 C 말단 측에서의 영역으로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하는 항체(또한 이하 "ROS1-C 말단 항체"라 지칭됨), 및 SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질의 상기 융합 부위로부터의 N 말단 측에서의 영역으로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하는 항체(또한 이하 "SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG-N 말단 항체"라 지칭됨)이다. 여기서, "융합 부위-특이적 항체"는 상기 융합 부위를 함유하는 폴리펩타이드에 특이적으로는 결합하지만, 야생형(일반 형태) SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질 또는 야생형(일반 형태) ROS1 단백질 중 어느 하나에 결합하지 않는 항체를 의미한다.
SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드는 상기 융합 부위-특이적 항체 또는 상기 ROS1-C 말단 항체 및 SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG-N 말단 항체의 조합에 의해 검출될 수 있다. 그러나, ROS1 단백질의 발현이 예를 들어 정상 폐 세포에서 거의 검출되지 않으므로, 폐 선암종 조직에서의 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드의 존재는 ROS1-C 말단 항체가 면역염색에서 단독으로 사용되는 경우에도 검출될 수 있다.
다양한 실시형태에 있어서, 본 발명의 ROS1 융합 폴리펩타이드의 확인을 위한 면역조직화학 염색(immunohistochemical staining: IHC) 및 웨스턴 블롯팅 적용은 셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology)(미국 매사추세츠주의 댄버스시에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 ROS1 항체인 형광체-ROS1을 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, ROS1 융합 양성 암 세포, 예를 들어 NSCLC ROS1 재배열된 폐암 세포의 확인은 토끼 항-ROS1 단일클론 항체 D4D6, 카탈로그 번호 3287(셀 시그널링 테크놀로지사, 미국 매사추세츠주의 댄버스시에 소재)에 의해 이루어질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, "SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체"는 적절한 공지된 방법을 선택하는 당해 분야의 당업자에 의해 제조될 수 있다. 이러한 공지된 방법의 예는 면역 동물이 ROS1 단백질, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드의 C 말단 부분으로 이루어진 상기 폴리펩타이드, SLC34A2 또는 CD74의 N 말단 부분으로 이루어진 상기 폴리펩타이드, 또는 FIG 단백질 등에 의해 접종되어서 동물의 면역계를 활성화하고, 이후 동물의 혈액 혈청이 회수되는(다중클론 항체) 방법, 및 단일클론 항체를 생성하는 방법, 예컨대 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법 및 파지 디스플레이 방법이다. 표지된 물질이 결합한 항체를 사용하는 경우, 표적 단백질은 표지을 검출함으로써 직접적으로 검출될 수 있다. 표지된 물질은 특별히 제한되지 않지만, 단 이것은 항체에 결합할 수 있고 검출될 수 있다. 예는 퍼옥시다제, β-D-갈락토시다제, 마이크로퍼옥시다제, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase: HRP), 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 로다민 아이소티오사이아네이트(rhodamine isothiocyanate: RITC), 알칼리 포스파타제, 바이오틴 및 방사성 물질을 포함한다. 또한, 표지된 물질이 결합한 항체를 사용하여 표적 단백질을 직접적으로 검출하는 방법 이외에, 단백질 G, 단백질 A 또는 표지된 물질이 결합한 2차 항체를 사용하여 표적 단백질을 간접적으로 검출하는 방법을 또한 이용할 수 있다.
SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 존재가 상기 방법에 의해 대상체로부터 단리된 시편에서 검출되는 경우, ROS1 티로신 키나제 저해제, 예컨대 화학식 I, Ia의 화합물 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 의한 암 치료의 효율이 그 환자에서 높을 것으로 판단되지만, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재가 검출되지 않은 경우, ROS1 티로신 키나제 저해제에 의한 암 치료의 효율이 그 환자에서 낮을 것으로 판단된다.
위에서 기재된 바와 같이, 적어도 15개 염기의 사슬 길이를 가지는 하기 (a) 내지 (c)에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드는 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 유리하게 사용될 수 있다;
(a) SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 프로브 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프로브인 폴리뉴클레오타이드;
(b) SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위에 혼성화하는 프로브인 폴리뉴클레오타이드;
(c) SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 ROS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합 부위를 샌드위치하도록 설계된 한 쌍의 프라이머인 폴리뉴클레오타이드.
이 폴리뉴클레오타이드는 표적 유전자의 특이적 염기 서열에 상보성인 염기 서열을 가진다. 여기서, "상보성"은 완전히 상보성이 아니라는 것을 의미할 수 있고, 단 이것은 예를 들어 중간 내지는 높은 엄격도 조건 하에 혼성화한다. 예를 들어, 이 폴리펩타이드는 기재된 염기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가진다.
(a) 내지 (c)의 폴리뉴클레오타이드에서, DNA 또는 RNA, 뉴클레오타이드의 일부 또는 전부는 인공 핵산, 예컨대 PNA(폴리아마이드 핵산, 펩타이드 핵산), LNA(상표명, 잠긴 핵산, 브릿징된 핵산), ENA(상표명, 2'-O, 4'-C-에틸렌 브릿징된 핵산), GNA(글라이세롤 핵산) 및 TNA(트레오스 핵산)에 의해 치환될 수 있다.
추가로, 상기 기재된 바대로, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드의 번역 생성물을 검출하는 데 유리하게 사용된다. 따라서, 본 발명은 이 항체를 포함하는 ROS1 티로신 키나제 저해제에 의해 암 치료의 유효성을 결정하기 위한 약물을 제공한다.
본 발명의 융합 유전자의 검출 방법은 시험 대상체로부터 얻은 샘플에서 본 명세서의 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 시험 대상체로부터 얻은 샘플, 시험 대상체로부터 수집된 물질(살아 있는 신체로부터 단리된 샘플), 구체적으로는 수집된 임의의 유형의 체액(바람직하게는 혈액), 치조 및 기관지 세척액으로서, 생검을 겪은 샘플 및 가래 샘플을 사용한다. 바람직하게는, 시험 대상체의 폐에서의 이환된 부위로부터의 생검 샘플 또는 가래 샘플이 사용된다. 샘플로부터, 게놈 DNA는 추출되고 사용될 수 있다. 또한, 이의 전사물(게놈의 전사 및 번역의 결과로서 생성된 생성물; 예를 들어, mRNA, cDNA 및 단백질)이 사용될 수 있다. 특히, mRNA 또는 cDNA를 제조하고 사용하는 것이 바람직하다.
게놈 DNA는 공지된 방법에 의해 추출될 수 있고, 추출은 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 용이하게 수행될 수 있다.
검출의 단계는 공지된 유전자 분석 방법(예를 들어, 유전자 검출 방법으로서 흔히 사용되는 공지된 방법, 예컨대 PCR, LCR(리가제 사슬 반응; Ligase chain reaction), SDA(가닥 대체 증폭; Strand displacement amplification), NASBA(핵산 서열 기반 증폭; Nucleic acid sequence-based amplification), ICAN(핵산의 등온 및 키메라 프라이머 개시된 증폭; Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), LAMP(루프 매개 등온 증폭; Loop-mediated isothermal amplification) 방법, TMA(진-프로브의 TMA(Gen-Probe's TMA) 시스템) 방법, 동소 혼성화 방법 및 마이크로어레이)에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화된 핵산이 프로브로서 사용되는 혼성화 기술, 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드와 혼성화된 DNA가 프라이머로서 사용되는 유전자 증폭 기술 등이 사용된다.
구체적으로는, 검출은 시험 대상체로부터 얻은 샘플로부터 유래된 핵산, 예를 들어 mRNA 등을 사용하여 수행된다. mRNA의 양은 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있도록 설계된 프라이머를 사용함으로써 유전자 증폭 반응의 방법에 의해 측정된다. 본 발명의 검출 방법에서 사용된 프라이머, 또는 검출 키트에서 사용된 프라이머는, 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 특이적으로 검출하고, 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열에 기초하여 설계될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. PCR 증폭 모니터 방법에서 사용되는 프라이머는 프라이머 설계 소프트웨어(예를 들어, 피이 바이오시스템즈사(PE Biosystems)에 의해 제조된 프라이머 익스프레스(Primer Express)) 등을 사용하여 설계될 수 있다. 또한, PCR 생성물의 크기가 더 클수록, 증폭 효율이 더 악화하므로, mRNA 또는 cDNA가 증폭될 때 얻어진 증폭 생성물의 크기가 1kb 이하가 되도록 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 설계되는 것이 적절하다.
더 구체적으로는, 센스 프라이머(5'-프라이머)는 SLC34A2를 암호화하는 부분으로부터 설계되고, 안티센스 프라이머(3'-프라이머)는 ROS1을 암호화하는 부분으로부터 설계된다. 본 발명의 검출 키트에 포함된 프라이머를 사용하는 것이 바람직하고, 검출 키트에서 가장 적합하게 포함된 프라이머를 사용하는 것이 더 바람직하다. PCR 증폭 모니터 방법에서, 각각의 유전자에 상응하는 상기 센스 프라이머를 혼합함으로써 단일 반응 액체에서 모든 융합 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR을 또한 설계할 수 있다. 각각의 증폭 기술에 적합한 방법에 의해, 표적 유전자(전체 유전자 또는 이의 특이적 부분)가 증폭되는지 아닌지를 확인할 수 있다. 예를 들어, PCR 방법에서, PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석되고 브롬화에티듐 염색 등으로 처리되고, 이로써 표적 크기를 가지는 증폭된 단편이 얻어지는지 아닌지를 확인할 수 있다. 표적 크기를 가지는 증폭된 단편이 얻어질 때, 이것은 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드가 시험 대상체로부터 얻은 샘플에 존재한다는 것을 나타낸다. 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드의 존재는 이러한 방식으로 검출될 수 있다.
본 발명의 융합 유전자의 검출 방법은 바람직하게는 유전자 증폭 반응에 의해 시험 대상체로부터 얻은 샘플에서 특이적 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하는 단계 및 표적 크기를 가지는 증폭된 단편이 얻어지는지 아닌지를 검출하는 단계를 포함한다.
혼성화 기술을 이용하는 검출은 예를 들어 노던 혼성화, 도트 블롯팅 방법, DNA 마이크로어레이 방법 및 RNA 보호 방법을 이용하여 수행된다. 혼성화에 사용되는 프로브로서, 중간 내지는 높은 엄격도 조건 하에(바람직하게는 높은 엄격도 조건 하에) 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보성 가닥과 혼성화된 적어도 32개의 연속 염기로 이루어진 핵산 분자의 중심으로서 융합 점의 각각 상류 및 하류에서 16개의 염기로 이루어진 서열을 포함하거나, 이의 상보성 가닥을 포함하는 프로브를 사용할 수 있다.
유전자 증폭 기술, 예컨대 RT-PCR을 또한 사용할 수 있다. RT-PCR 방법에서, PCR 증폭 모니터(실시간 PCR) 방법은 유전자 증폭의 과정 동안에 수행되고, 이로써 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드의 존재는 더 정량적으로 분석될 수 있다. PCR 증폭 모니터 방법이 이용될 수 있다. 실시간 PCR은 공지된 방법이고, 이 방법을 위한 상업적으로 입수 가능한 기기 및 키트를 사용하여 단순히 수행될 수 있다.
본 발명의 실시형태 중 몇몇의 융합 단백질의 검출 방법은 시험 대상체로부터 얻은 샘플에서 특이적 폴리펩타이드, 즉 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드(이하, 검출하고자 하는 폴리펩타이드라 칭함)의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 검출 단계는 시험 대상체로부터 얻은 샘플(예를 들어, 시험 대상체로부터 얻은 암 조직 또는 세포)로부터 유래된 가용화된 액체를 제조하고 액체 중에 함유된 검출하고자 하는 폴리펩타이드를 항-SLC34A2, 또는 항-CD74, 또는 항-FIG 항체 및 항-ROS1 항체와 합함으로서 수행되는 면역검정 방법 또는 효소 활성 검정 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 검출하고자 하는 폴리펩타이드에 특이적인 단일클론 항체 또는 다중클론 항체를 사용하는 기법, 예컨대 효소 면역검정 방법, 이중 항체 샌드위치 ELISA 방법, 형광 면역검정 방법, 방사면역검정 방법 및 웨스턴 블롯팅 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 검출 방법에서 검출되는 폴리펩타이드 또는 검출되는 폴리뉴클레오타이드가 시험 대상체로부터 얻은 샘플로부터 검출될 때, 시험 대상체는 폴리뉴클레오타이드 양성에 의한 암을 가지고 ROS1 저해제를 사용한 치료가 제공되는 대상체(환자)이다.
본 발명의 검출 키트는 본 발명의 검출 방법에서 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드를 특이적으로 검출시킬 수 있도록 설계된 적어도 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다. 센스 및 안티센스 프라이머 세트는 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키기 위해 프라이머로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드의 세트이다.
일 실시형태에 있어서, 융합 유전자의 검출을 위한 본 발명의 프라이머 세트는 (1) SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG를 암호화하는 부분으로부터 설계된 센스 프라이머 및 ROS1을 암호화하는 부분으로부터 설계된 안티센스 프라이머를 포함하고, SLC34A2 또는 CD74, 또는 FIG 및 ROS1 유전자의 융합 유전자를 검출하기 위한 것인 프라이머 세트를 포함하고, 여기서 안티센스 프라이머는 중간 내지는 높은 엄격도 조건 하에(바람직하게는 높은 엄격도 조건 하에) "검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드"와 혼성화하는 핵산 분자(바람직하게는 적어도 16개의 염기로 이루어진 핵산 분자)로 이루어지고, 센스 프라이머는 엄격도 조건 하에(바람직하게는 높은 엄격도 조건 하에) "검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드"의 상보성 가닥과 혼성화하는 핵산 분자(바람직하게는 적어도 16개의 염기로 이루어진 핵산 분자)로 이루어진다.
이하의 프라이머 세트 (2) 및 (3)은 프라이머 세트 (1)의 더 특이적 변이체로서 프라이머 세트에 포함된다.
(2) 적어도 임의의 16개의 연속 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 센스 프라이머의 프라이머 세트.
(3) 적어도 임의의 16개의 연속 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 센스 프라이머의 프라이머 세트.
이 프라이머 세트 (1) 내지 (3)에서, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머가 선택되는 위치 사이의 간격은 바람직하게는 1kb 이하이거나, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머에 의해 증폭된 증폭 생성물의 크기는 바람직하게는 1kb 이하이다.
또한, 프라이머는 일반적으로 15개 내지 40개의 염기로 이루어지고, 바람직하게는 16개 내지 24개의 염기로 이루어지고, 더 바람직하게는 18개 내지 24개의 염기로 이루어지고, 특히 바람직하게는 20개 내지 24개의 염기로 이루어진 가닥 길이를 가진다.
프라이머 세트는 검출하고자 하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키고 검출하기 위해 사용될 수 있다. 더구나, 특별히 제한되지는 않지만, 본 발명의 프라이머 세트에 포함된 각각의 프라이머는 예를 들어 화학 합성에 의해 제조될 수 있다.
ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드를 검출하도록 작동 가능한 예시적인 ROS1, SLC34A2 또는 CD74 프라이머는 표 2에 제공되어 있다.
Figure 112016115330543-pct00023
항암 약물을 선별하는 방법은 샘플 화합물을 융합 단백질을 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및 세포에서 융합 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 샘플 화합물에 의해 처리된 세포에서의 융합 단백질 발현 수준은 샘플 화합물에 의한 처리 전과 또는 미치료 세포에서와 비교하여 감소하고, 샘플 화합물은 항암 약물에 대한 후보 화합물로서 결정된다.
항암 약물을 선별하는 방법은 샘플 화합물의 처리 전에 세포에서 융합 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우에, 샘플 화합물은, 샘플 화합물의 처리 후에 융합 단백질 발현 수준이 동일한 세포에서 샘플 화합물에 의한 처리 전과 비교하여 감소할 때, 항암 약물의 후보 화합물로서 결정될 수 있다. 대안적으로, 항암 약물을 선별하는 방법은 융합 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단계, 및 샘플 화합물을 제공된 세포의 일부와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우에, 샘플 화합물은, 샘플 화합물과 접촉한 세포에서의 융합 단백질 발현 수준이 샘플 화합물과 접촉하지 않은 세포에서와 비교하여 감소할 때, 항암 약물에 대한 후보 화합물로서 결정될 수 있다.
선별 방법에서 사용되는 세포는 암 세포로부터 유래된 세포(여기서 융합 유전자 또는 융합 단백질은 발현되고/되거나 활성화됨), 세포의 추출물 또는 세포의 배양물일 수 있다. 암 세포는 상기 기재된 바대로 고형 암 세포, 특히 폐암, 예를 들어 비소세포 폐암, 예컨대 폐 선암종일 수 있다.
또 다른 실시형태는 샘플 화합물에 의해 융합 단백질을 발현하는 세포를 처리하는 단계; 세포에서 융합 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 폐암에 대한 항암 약물을 선별하는 방법을 제공하고, 여기서 샘플 화합물에 의해 처리된 세포에서의 융합 단백질 발현 수준은 샘플 화합물에 의한 처리 전과 또는 미치료 세포에서와 비교하여 감소하고, 샘플 화합물은 폐암에 대한 항암 약물에 대한 후보 화합물로서 결정된다.
ROS1 융합 단백질(즉, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1 및 FIG-ROS1)은 폐암을 진단하기 위한 또는 폐암을 치료하거나 예방하거나 치료하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 폐암의 치료 또는 예방은 융합 단백질에 대한 적어도 1종의 저해제, 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, ROS1 암호화 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, 또는 이들의 조합의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 저해제는 예컨대 화학식 I, Ia 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
다른 실시형태는 융합 단백질에 대한 적어도 1종의 저해제, 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, ROS1 암호화 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, 또는 이들의 조합의 약학적(치료적) 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하고, 이들 중 임의는 화학식 1의 화합물 및 본 명세서에 개시된 다른 특정한 화합물일 수 있다. 상기 방법은 이러한 치료를 투여하는 단계 전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시형태는 화학식 1을 포함하는 융합 단백질에 대한 적어도 1종의 저해제를, 단독으로 또는 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, ROS1 암호화 유전자에 대한 적어도 1종의 저해제, 또는 이들의 조합과 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 다른 실시형태는 암을 예방 및/또는 치료하기 위한, 융합 단백질에 대한 저해제, 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자에 대한 저해제, ROS1 암호화 유전자에 대한 저해제, 또는 이들의 조합의 용도를 제공한다. 저해제는 예컨대 화학식 I, Ia 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
본 발명에서, 암은 폐암, 특히 소세포 폐암(SCLC) 또는 비소세포 폐암(NSCLC), 예컨대 폐 선암종, 편평 세포 폐 암종, 또는 대세포 폐 암종일 수 있다.
ROS1 융합 단백질에 대한 저해제가 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 융합 유전자에 대한 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이거나, ROS1 암호화 유전자가 siRNA, shRNA, miRNA 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 조성물이되, 융합 유전자 또는 ROS1 암호화 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는, 조성물.
ROS1의 발현 및/또는 ROS1 키나제 활성(예컨대, 전사, 번역, 또는 안정성)을 저해하는 임의의 ROS1 키나제 저해제는 단독으로 또는 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 조합되어 사용될 수 있다.
저해제는 ROS1 특이적일 수 있거나, 이것은 비특이적(예컨대, 비특이적 키나제 저해제, 다중-표적 저해제)일 수 있다. 수개의 ROS1 키나제 저해제가 개발되었고, 이의 임상 적용이 조사 중에 있다. ROS1 키나제 활성의 하류에서, 키나제, 예컨대 포스파티딜이노시톨 3 키나제(PI3K) 및 세포외 신호 키나제 1/2(ERK)(Wixted JH et al. J Biol Chem 2011) 및 STAT3(Hwang JH et al. Mol Endocrinol 2003; 17: 1155-1166)이 존재한다. 이러한 하류 신호 전달 경로를 저해하는 약물은 ROS1 키나제 저해제에 대한 대안으로서 또는 애주번트로서, 단독으로 또는 화학식 1의 화합물과 조합되어 또한 사용될 수 있다.
하나의 모드에서, SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-FIG 전좌 또는 FIG-ROS1 결실을 가지는 것으로 판단된 대상체는 전좌 부위를 지난 부위에서 ROS1 돌연변이를 가지는 것으로 또한 판단된다. ROS1 돌연변이의 예는 활성화 돌연변이이고, 이것은 구성적 키나제 활성이 가능하게 한다. ROS1 활성화 돌연변이는 야생형 돌연변이와 비교하여 활성화를 증가시키는 임의적인 돌연변이이다. 예를 들어, ROS1 활성화 돌연변이는 영구적인 ROS1 활성화를 발생시킬 수 있다. ROS1 저해제와 연관되거나 이의 사용으로 인한 2차 ROS1 활성화 돌연변이 변이체가 심지어 존재할 수 있다. ROS1 신호 활성을 증가시키는 돌연변이가, 예를 들어, ROS1 신호를 증가시키는 키나제 도메인 점 돌연변이, 결실, 삽입, 중복 또는 역전, 또는 이들 2개 이상의 조합으로 인해 발생한다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 ROS1 융합 전좌 또는 결실 둘 다 및 ROS1 돌연변이를 가지는 것으로 판단된 대상체의 경우, ROS1 키나제 저해제에 의해 이들을 치료하기 위해 또한 결정을 할 수 있다. 또한, 치료/치료법은 이 결정에 기초하여 수행될 수 있다.
위에서 기재된 바와 같이, ROS1 티로신 키나제 저해제에 의한 암 치료의 유효성은 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드가 본 발명의 방법에 의해 검출되는 환자에서 높은 것으로 생각된다. 이러한 이유로, 암 치료는 SLC34A2-ROS1, 또는 CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 유전자 및 ROS1 유전자를 보유하는 이 암 환자에 ROS1 티로신 키나제 저해제를 선택적으로 투여함으로써 효과적으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이 ROS1 티로신 키나제 저해제에 의한 암 치료의 유효성이 본 명세서에 기재된 상기 진단 방법에 의해 높은 것으로 결정된 환자에게 화학식 I, Ia 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인 ROS1 티로신 키나제 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, "시편"은 생물학적 시편(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 유체(혈액, 림프액 등), 소화액, 가래, 폐포/기관지 셰척 유체, 소변, 대변)뿐만 아니라, 핵산 추출물(게놈 DNA 추출물, mRNA 추출물, 또는 cDNA 제제 또는 mRNA 추출물로부터 제조된 cRNA 제제) 또는 이들 생물학적 시편으로부터 얻어진 단백질 추출물을 포함한다. 이 시편은 또한 포르말린 고정 처리, 알코올 고정 처리, 냉동 처리 또는 파라핀 포매 처리가 실시된 것일 수도 있다.
또한, 게놈 DNA, mRNA, cDNA 또는 단백질은 당업자에 의해 시편의 종류, 상태 등을 고려해서 적절한 공지된 수법을 선택한 후에 제조될 수 있다.
활성 성분으로서 상기 물질(폴리뉴클레오타이드, 항체)에 부가해서, 본 발명의 약물은 다른 약제학적으로 허용 가능한 성분을 함유할 수 있다. 이러한 성분의 예는 완충제, 유화제, 현탁제, 안정제, 보존제, 생리 식염수 등을 포함한다. 완충제로서, 인산염, 시트르산염, 아세트산염 등이 사용될 수 있다. 유화제로서, 아라비아검, 나트륨 알지네이트, 트래거캔트 등이 사용될 수 있다. 현탁제로서, 글리세롤 모노스테아레이트, 알루미늄 모노스테아레이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 라우릴황산나트륨 등이 사용될 수 있다. 안정제로서, 프로필렌 글리콜, 다이에틸 설파이트, 아스코르브산 등이 사용될 수 있다. 보존제로서, 아자이드화나트륨, 염화벤잘코늄, 파라옥시벤조산, 클로로부탄올 등이 사용될 수 있다.
또한, 폴리뉴클레오타이드 및 항체를 함유하는 제제에 부가해서, 기질, 폴리뉴클레오타이드 및 항체에 수반된 표지의 검출을 위해 필요한 양성 대조군(예를 들어, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리뉴클레오타이드, SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드, 또는 이들을 보유하는 세포 등) 및 음성 대조군, 동소 혼성화 등에 이용되는 대조염색 시약(DAPI 등), 항체 (예를 들어, 2차 항체, 단백질 G, 단백질 A)를 검출하는데 요구되는 분자, 및 항체의 희석 및 세척에 이용되는 완충 용액은 본 발명의 방법에서 이용하기 위한 키트로서 배합될 수 있다. 이 키트는 해당 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 이용하기 위한 상기 키트를 제공한다.
본 명세서에 기재된 검출 방법은 융합 파트너의 N-말단 도메인 및 키나제 도메인을 암호화하는 ROS1 단백질의 C-말단 도메인으로 본질적으로 이루어진 융합 단백질이 검출되는 경우 특히 유용하다. 융합 단백질은 SLC34A2 단백질 또는 이의 단편의 N-말단 도메인 및 키나제 도메인을 암호화하는 ROS1 단백질의 C-말단 도메인으로 본질적으로 이루어진 SLC34A2-ROS1 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은 CD74 단백질 또는 이의 단편의 N-말단 도메인 및 키나제 도메인을 암호화하는 ROS1 단백질의 C-말단 도메인으로 본질적으로 이루어진 CD74-ROS1 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은 FIG 단백질 또는 이의 단편의 N-말단 도메인 및 키나제 도메인을 암호화하는 ROS1 단백질의 C-말단 도메인으로 본질적으로 이루어진 FIG-ROS1 융합 단백질일 수 있다. 상기 방법은 폐암, 특히 비소세포 폐암을 진단하기 위하여 이용될 수 있고, 염색체 6에서 역전, 전좌 또는 결실을 포함하는 ROS1-연루 염색체 재배열; 단백질이 다른 단백질에 융합된 융합 단백질; 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자; 및 암이 없는 개체로부터의 표준 샘플과 비교해서 ROS1의 과발현 중 적어도 하나를 진단하는 것을 포함한다. 상기 군으로부터 선택된 위에 기재된 염색체 재배열들 중 하나가 시험 샘플에서 검출된 경우, ROS1 저해제, 예컨대, 화학식 I, Ia 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 치료를 위한 개체.
화합물 1의 제조
N-(4-{[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드 및 이의 (L)-말산염의 제조.
N-(4-[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드 및 이의 (L)-말산염의 제조를 위하여 이용된 합성 경로는 하기 반응식 1에 표시되어 있다:
반응식 1
Figure 112016115330543-pct00024
4- 클로로 -6,7- 다이메톡시 -퀴놀린의 제조
반응기에 6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-올(10.0㎏) 및 아세토나이트릴(64.0ℓ)을 순차 주입하였다. 얻어진 혼합물을 대략 65℃로 가열하고, 옥시염화인(POCl3, 50.0㎏)을 첨가하였다. POCl3의 첨가 후, 이 반응 혼합물의 온도를 대략 80℃로 승온시켰다. 이 반응은 잔류하는 출발 물질이 2퍼센트 미만인 경우 완결된 것으로 간주되었다(대략 9.0시간)(공정 중 고성능 액체 크로마토그래피[HPLC] 분석). 이 반응 혼합물을 대략 10℃로 냉각시키고 나서 다이클로로메탄(DCM, 238.0㎏), 30% NH4OH(135.0㎏), 및 얼음(440.0㎏)의 냉각 용액으로 반응 중지시켰다. 얻어진 혼합물을 대략 14℃로 가온시키고, 상들을 분액시켰다. 유기 상을 물(40.0㎏)로 세척하고, 진공 증류에 의해 농축시켜 용매(대략 190.0㎏)를 제공하였다. 메틸-t-부틸 에터(MTBE, 50.0㎏)를 이 배취에 첨가하고, 이 혼합물을 대략 10℃로 냉각시키고, 이 동안 생성물이 결정화되었다. 얻어진 고체를 원심분리에 의해 회수하고, n 헵탄(20.0㎏)으로 세척하고 나서, 대략 40℃에서 건조시켜 표제의 화합물(8.0㎏)을 제공하였다.
6,7- 다이메틸 -4-(4-나이트로- 페녹시 )-퀴놀린의 제조
반응기에 4-클로로-6,7-다이메톡시-퀴놀린(8.0㎏), 4-나이트로페놀(7.0㎏), 4-다이메틸아미노피리딘(0.9㎏) 및 2,6-루티딘(40.0㎏)을 순차 주입하였다. 이 반응기 내용물을 대략 147℃까지 가열하였다. 이 반응이 완결되면(공정 중 HPLC 분석에 의해 결정되는 바와 같이 5 퍼센트 미만의 출발 물질이 잔류, 대략 20시간), 반응기 내용물은 대략 25℃로 방랭시켰다. 메탄올(26.0㎏)을 첨가하고 나서 물(50.0㎏)에 용해된 탄산칼륨(3.0㎏)을 첨가하였다. 반응기 내용물을 대략 2시간 동안 교반하였다. 얻어진 고체 석출물을 여과하고, 물(67.0㎏)로 세척하고 나서, 25℃에서 대략 12시간 동안 건조시켜 표제의 화합물(4.0㎏)을 제공하였다.
4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐아민의 제조
폼산칼륨(5.0㎏), 폼산(3.0㎏) 및 물(16.0㎏)을 함유하는 용액을 대략 60℃로 가열된 테트라하이드로퓨란(THF, 40.0㎏) 중 6,7-다이메톡시-4-(4-나이트로-페녹시)-퀴놀린(4.0㎏), 10 퍼센트 탄소 상 팔라듐(50 퍼센트 수분, 0.4㎏)의 혼합물에 첨가하였다. 첨가는, 이 반응 혼합물의 온도가 대략 60℃인 채로 되도록 수행되었다. 반응이 공정 중 HPLC 분석을 이용해서 결정되는 바와 같이 완결된 것으로 간주되면(2 퍼센트 미만의 출발 물질이 잔류, 전형적으로 1 5시간), 반응기 내용물을 여과시켰다. 이 여과액을 대략 35℃에서 진공 증발에 의해 그의 원래의 용적의 절반으로 농축시켜, 생성물의 석출을 유발하였다. 이 생성물을 여과에 의해 회수하고, 물(12.0㎏)로 세척하고, 대략 50℃에서 진공 하에 건조시켜 표제의 화합물(3.0㎏; 97 퍼센트 곡선 하 면적(AUC))을 제공하였다.
1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카복실산 의 제조
트라이에틸아민(8.0㎏)을 배취 온도가 10℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 THF(63.0㎏) 중 상업적으로 입수 가능한 사이클로프로판-1,1-다이카복실산(2 1, 10.0㎏)의 냉각된(대략 4℃) 용액에 첨가하였다. 이 용액을 대략 30분 동안 교반하고 나서, 배취 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 염화티오닐(9.0㎏)을 첨가하였다. 첨가가 완료되면, THF(25.0㎏) 중 4-플루오로아닐린(9.0㎏)의 용액을, 배취 온도가 10℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 첨가하였다. 이 혼합물을 대략 4시간 동안 교반하고 나서, 아이소프로필 아세테이트(87.0㎏)로 희석시켰다. 이 용액을 수성 수산화나트륨(50.0ℓ의 물 중에 2.0㎏ 용해됨), 물(40.0ℓ) 및 수성 염화나트륨(40.0ℓ의 물 중에 10.0㎏ 용해됨)에 첨가하였다. 유기 용액은 진공 증류에 의해 농축시키고 나서 헵탄의 첨가를 행하여 고체의 석출을 유발하였다. 이 고체를 원심분리에 의해 회수하고 나서 대략 35℃에서 진공 하에 건조시켜 표제의 화합물(10.0㎏)을 제공하였다.
1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카보닐 클로라이드의 제조
염화옥살릴(1.0㎏)은 배취 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 THF(11㎏)와 N,N-다이메틸폼마이드(DMF; 0.02㎏)의 혼합물 중 1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카복실산(2.0㎏)의 용액에 첨가하였다. 이 용액은 추가의 가공처리 없이 다음 단계에서 사용되었다.
N-(4-{[6,7- 비스(메틸옥시)퀴놀린 -4-일] 옥시 } 페닐 )-N'-(4- 플루오로페닐 )사이클로프로판-1,1- 다이카복스아마이드 의 제조
1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카보닐 클로라이드를 함유하는 이전의 단계로부터의 용액을 배취 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 THF(27.0㎏) 및 물(13.0㎏) 중 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민(3.0㎏)과 탄산칼륨(4.0㎏)의 혼합물에 첨가하였다. 이 반응이 완료되면(전형적으로 10분), 물(74.0㎏)을 첨가하였다. 이 혼합물을 15 내지 30℃에서 대략 10시간 동안 교반하여, 생성물의 석출을 유발하였다. 생성물을 여과에 의해 회수하고, THF(11.0㎏) 및 물(24.0㎏)의 미리 제조된 용액으로 세척하고, 진공 하에 대략 65℃에서 대략 12시간 동안 건조시켜 표제의 화합물(유리 염기, 5.0㎏)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 10.2 (s, 1H), 10.05 (s, 1H), 8.4 (s, 1H), 7.8 (m, 2H), 7.65 (m, 2H), 7.5 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.25 (m, 2H), 7.15(m, 2H), 6.4 (s, 1H), 4.0 (d, 6H), 1.5 (s, 4H). LC/MS: M+H= 502.
N-(4-{[6,7- 비스(메틸옥시)퀴놀린 -4-일] 옥시 } 페닐 )-N'-(4- 플루오로페닐 )사이클로프로판-1,1- 다이카복스아마이드 , (L) 말산염 의 제조
물(2.0㎏) 중 L-말산(2.0㎏)의 용액을 대략 25℃의 배취 온도를 유지하면서 에탄올 중 사이클로프로판-1,1-다이카복실산 [4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐]-아마이드(4-플루오로-페닐)-아마이드 유리 염기(1 5, 5.0㎏)의 용액에 첨가하였다. 탄소(0.5㎏) 및 티올 실리카(0.1㎏)를 이어서 첨가하고, 얻어진 혼합물을 대략 78℃로 가열하고, 이 시점에서 물(6.0㎏)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 이어서 여과시키고 나서 아이소프로판올(38.0㎏)을 첨가하고, 대략 25℃로 방랭시켰다. 생성물을 여과에 의해 회수하고, 아이소프로판올(20.0㎏)로 세척하고 대략 65℃에서 건조시켜 표제의 화합물(5.0㎏)을 제공하였다.
N-(4-{[6,7- 비스(메틸옥시)퀴놀린 -4-일] 옥시 } 페닐 )-N'-(4- 플루오로페닐 )사이클로프로판-1,1- 다이카복스아마이드 및 이의 (L)- 말산염의 대안적인 제조 .
N-(4-{[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드 및 이의 (L)-말산염의 제조에 이용될 수 있는 대안적인 합성 경로는 PCT/US2012/024591(이 문헌의 전체 내용은 참고로 편입됨)에 기재된 바와 같이, 반응식 2에 표시되어 있다.
반응식 2
Figure 112016115330543-pct00025
4- 클로로 -6,7- 다이메톡시 -퀴놀린의 제조
반응기에 6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-올(47.0㎏) 및 아세토나이트릴(318.8㎏)을 순차 주입하였다. 얻어진 혼합물을 대략 60℃로 가열하고, 옥시염화인(POCl3, 130.6㎏)을 첨가하였다. POCl3의 첨가 후, 반응 혼합물의 온도를 대략 77℃로 승온시켰다. 3% 미만의 출발 물질이 잔류하는 경우(공정 중 고성능 액체 크로마토그래피[HPLC] 분석) 이 반응은 완결된 것으로 간주하였다(대략 13시간). 반응 혼합물을 대략 2 내지 7℃로 냉각시키고 나서 다이클로로메탄(DCM, 482.8㎏), 26 퍼센트 NH4OH(251.3㎏) 및 물(900ℓ)의 냉각 용액으로 반응 중지시켰다. 얻어진 혼합물을 대략 20 내지 25℃로 가온시키고, 상들을 분액시켰다. 유기 상을 AW 하이플로 수퍼-셀(hyflo super-cel) NF(셀라이트(Celite); 5.4㎏)의 층을 통해서 여과시키고, 여과층을 DCM(118.9㎏)으로 세척하였다. 유기 상을 합하여 염수(282.9㎏)로 세척하고 물(120ℓ)과 혼합하였다. 상들을 분액시키고, 유기 상을 진공 증류에 의해 농축시켜 용매(대략 95ℓ의 잔여 용적)를 제거하였다. DCM(686.5㎏)을 유기 상을 수용하는 반응기에 주입하고 진공 증류에 의해 농축시켜 용매(대략 90ℓ의 잔여 용적)를 제거하였다. 메틸 t-부틸 에터(MTBE, 226.0㎏)를 이어서 주입하고 이 혼합물의 온도를 -20 내지 -25℃로 조정하고, 2.5시간 동안 유지시켜 고체 석출을 유발하고, 이 석출물을 이어서 여과시키고 n-헵탄(92.0㎏)으로 세척하고 필터 상에서 대략 25℃에서 질소 하에 건조시켜 표제의 화합물(35.6㎏)을 제공하였다.
4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐아민 의 제조
N,N-다이메틸아세트아마이드(DMA, 184.3㎏)에 용해된 4-아미노페놀(24.4㎏)을 20 내지 25℃에서 4-클로로-6,7-다이메톡시퀴놀린(35.3㎏), 나트륨 t-뷰톡사이드(21.4㎏) 및 DMA(167.2㎏)를 수용하고 있는 반응기에 주입하였다. 이 혼합물을 이어서 100 내지 105℃로 대략 13시간 동안 가열하였다. 공정 중 HPLC 분석을 이용해서 결정된 바와 같이(2 퍼센트 미만의 출발 물질이 잔류) 반응이 완결된 것으로 간조된 후에, 반응기 내용물을 15 내지 20℃에서 냉각시키고, 물(사전-냉각됨, 2 내지 7℃, 587ℓ)을 15 내지 30℃ 온도를 유지하는 속도로 주입하였다. 얻어진 고체 석출물을 여과시키고, 물(47ℓ)과 DMA(89.1㎏)의 혼합물로 세척하고 마지막으로 물(214ℓ)로 세척하였다. 필터 케이크를 이어서 필터 상에서 대략 25℃에서 건조시켜 조질의 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민(LOD에 기초하여 계산된 59.4㎏ 습윤품, 41.6㎏ 건조품)을 수득하였다. 조질의 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민을 테트라하이드로퓨란(THF, 211.4㎏)과 DMA(108.8㎏)의 혼합물 중에서 대략 1시간 동안 환류시키고(대략 75℃) 나서 0 내지 5℃로 냉각시키고, 대략 1시간 동안 숙성시키고, 그 후 고체를 여과시키고, THF(147.6㎏)로 세척하고 필터 상에서 대략 25℃에서 진공 하에 건조시켜 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민(34.0㎏)을 수득하였다.
4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐아민의 대안적인 제조
4-클로로-6,7-다이메톡시퀴놀린(34.8㎏) 및 4-아미노페놀(30.8㎏) 및 나트륨 tert 펜톡사이드(1.8 당량)(88.7㎏, THF 중 35 중량 퍼센트)를 반응기에 주입하고 나서 N,N-다이메틸아세트아마이드(DMA, 293.3㎏)를 주입하였다. 이 혼합물을 이어서 105 내지 115℃로 대략 9시간 동안 가열하였다. 공정 중 HPLC 분석을 이용해서 결정된 바와 같이(2 퍼센트 미만의 출발 물질 잔류) 반응이 완결된 것으로 간주된 후에, 반응기 내용물을 15 내지 25℃에서 냉각시키고, 온도를 20 내지 30℃로 유지하면서 물(315㎏)을 2시간의 기간에 걸쳐서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 이어서 20 내지 25℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 조질의 생성물을 여과에 의해 수집하고 88kg의 물과 82.1㎏의 DMA의 혼합물로 세척하고 나서 175㎏의 물로 세척하였다. 생성물을 필터 드라이어 상에서 53시간 동안 건조시켰다. LOD는 1 퍼센트 w/w 미만을 나타내었다.
대안적인 절차에서, 1.6 당량의 나트륨 tert-펜톡사이드를 이용하고, 이 반응 온도를 110 내지 120℃로 상승시켰다. 또한, 냉각 온도를 35 내지 40℃로 상승시키고, 물 첨가의 개시 온도를 35 내지 40℃로 조정하였으며, 이것은 45℃로의 허용된 발열 반응이었다.
1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카복실산의 제조
트라이에틸아민(19.5㎏)을 배취 온도가 5℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 THF(89.6㎏) 중 사이클로프로판-1,1-다이카복실산(24.7㎏)의 냉각된 (대략 5℃) 용액에 첨가하였다. 이 용액을 대략 1.3시간 동안 교반하고 나서, 배취 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 염화티오닐(23.1㎏)을 첨가하였다. 첨가가 완료된 경우, 이 용액을 온도를 10℃ 아래로 유지하면서 대략 4시간 동안 교반하였다. THF(33.1㎏) 중 4-플루오로아닐린(18.0㎏)의 용액을 이어서 배취 온도가 10℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 첨가하였다. 이 혼합물을 대략 10시간 동안 교반하였으며, 그 후, 이 반응은 완결된 것으로 간주되었다. 이어서 반응 혼합물을 아이소프로필 아세테이트(218.1㎏)로 희석시켰다. 이 용액을 수성 수산화나트륨(10.4　kg, 119ℓ의 물에 용해된 50 퍼센트)으로 순차 세척하고, 물(415ℓ)로, 이어서 물(100ℓ)로 그리고 최종적으로 수성 염화나트륨(100ℓ의 물에 용해된 20.0㎏)으로 희석시켰다. 유기 용액을 진공 증류(100ℓ의 잔여 용적)에 의해 40℃ 아래로 농축시키고 나서 n-헵탄(171.4㎏)을 첨가하여, 고체 석출을 유발하였다. 고체를 여과에 의해 회수하고 n-헵탄(102.4㎏)으로 세척하여, 젖은 조질의 1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카복실산(29.0㎏)을 얻었다. 이 조질의 1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카복실산을 대략 25℃에서 메탄올(139.7㎏)에 용해시키고 나서, 물(320ℓ)을 첨가하여 슬러리화하고, 여과에 의해 회수하였으며, 물(20ℓ) 및 n-헵탄(103.1㎏)으로 순차 세척하고 나서, 대략 25℃에서 질소 하에 필터 상에서 건조시켜 표제의 화합물 (25.4㎏)을 제공하였다.
1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카보닐 클로라이드의 제조
염화옥살릴(12.6㎏)을 배취 온도가 25℃를 초과하지 않는 속도에서 THF(96.1㎏)와 N,N-다이메틸폼아마이드(DMF; 0.23㎏)의 혼합물 중 1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카복실산(22.8㎏)의 용액에 첨가하였다. 이 용액은 추가의 가공처리 없이 다음 단계에서 사용되었다.
1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카보닐 클로라이드의 대안적인 제조
반응기에 1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카복실산(35㎏), 344g의 DMF, 및 175kg의 THF를 주입하였다. 이 반응 혼합물을 12 내지 17℃로 조정하고 나서 이 반응 혼합물에 19.9㎏의 염화옥살릴을 1시간의 기간에 걸쳐서 주입하였다. 반응 혼합물을 12 내지 17℃에서 3 내지 8시간 동안 교반하였다. 이 용액은 추가의 가공처리 없이 다음 단계에서 사용되었다.
사이클로프로판-1,1- 다이카복실산 [4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐 ]- 아마이드 (4- 플루오로 - 페닐 )- 아마이드의 제조
1-(4-플루오로-페닐카바모일)-사이클로프로판카보닐 클로라이드를 함유하는 이전의 단계로부터의 용액을 배취 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하는 속도로 THF(245.7㎏) 및 물(116ℓ) 중 화합물 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민(23.5㎏) 및 탄산칼륨(31.9㎏)의 혼합물에 첨가하였다. 반응이 완결된 경우(대략 20분), 물(653ℓ)을 첨가하였다. 이 혼합물을 20 내지 25℃에서 대략 10시간 동안 교반하여, 생성물의 석출을 유발하였다. 생성물을 여과에 의해 회수하고, THF(68.6㎏) 및 물(256ℓ)의 사전 제작된 용액으로 세척하고, 대략 25℃에서 질소 하에 필터 상에서 우선 건조시키고, 진공 하에 대략 45℃에서 건조시켜 표제의 화합물(41.0㎏, 38.1㎏, LOD에 기초하여 계산됨)을 제공하였다.
사이클로프로판-1,1- 다이카복실산 [4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐 ]- 아마이드 (4- 플루오로 - 페닐 )- 아마이드의 대안적인 제조
반응기에 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민(35.7kg, 1 당량)에 이어서 412.9㎏의 THF를 주입하였다. 이 반응 혼합물에 169㎏의 물 중 48.3의 K2CO3의 용액을 주입하였다. 위에서 1-(4- 플루오로 - 페닐카바모일 )- 사이클로프로판카보닐 클로라이드의 대안적인 제조에서 기재된 산 염화물 용액을 온도를 최소 2시간에 걸쳐서 20 내지 30℃에서 유지하면서 4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐아민을 수용하고 있는 반응기로 옮겼다. 이 반응 혼합물을 최소 3시간 동안 20 내지 25℃에서 교반하였다. 이어서 반응 온도를 30 내지 25℃로 조정하고, 이 혼합물을 교반하였다. 교반을 정지하고, 혼합물의 상들을 분액시켰다. 하부의 수상을 제거하여 따라내었다. 나머지 상부의 유기 상에 804㎏의 물을 첨가하였다. 이 반응물을 최소 16시간 동안 15 내지 25℃에서 교반하였다.
생성물이 석출되었다. 생성물을 여과시키고 179㎏의 물과 157.9㎏의 THF의 혼합물로 2부분으로 나누어 세척하였다. 조질의 생성물을 진공 하에 적어도 2시간 동안 건조시켰다. 이어서 건조된 생성물을 285.1㎏의 THF에 장입하였다. 얻어진 현탁액을 반응 용기에 옮기고, 이 현탁액이 맑은(용해된) 용액이 될 때까지(이를 위하여 대략 30분 동안 30 내지 35℃로 가열을 필요로 함) 교반하였다. 456㎏의 물을 이어서 이 용액에 첨가하고, 또한 20㎏의 SDAG-1 에탄올을 첨가하였다(에탄올은 2시간에 걸쳐서 메탄올로 변성되었다). 이 혼합물은 적어도 16시간 동안 15 내지 25℃에서 교반하였다. 이 생성물을 여과시키고 143㎏의 물과 126.7의 THF의 혼합물로 2부분으로 나누어서 세척하였다. 이 생성물을 40℃의 최고 온도 설정점에서 건조시켰다.
대안적인 절차에서, 산 염화물 형성 동안의 반응 온도를 10 내지 15℃로 조정하였다. 재결정화 온도는 15 내지 25℃에서 45 내지 50℃로 1시간 동안 변화시키고, 2시간에 걸쳐서 15 내지 25℃로 냉각시켰다.
사이클로프로판-1,1- 다이카복실산 [4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐 ]- 아마이드 (4- 플루오로 - 페닐 )- 아마이드 , 말산염의 제조
사이클로프로판-1,1-다이카복실산 [4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐]-아마이드 (4-플루오로-페닐)-아마이드(1-5; 13.3㎏), L-말산(4.96㎏), 메틸 에틸 케톤(MEK; 188.6㎏) 및 물(37.3㎏)을 반응기에 주입하고, 이 혼합물을 대략 2시간 동안 가열 환류시켰다(대략 74℃). 반응기 온도를 50 내지 55℃로 감소시키고, 이 반응기 내용물을 여과시켰다. 위에서 기재된 이들 순차적인 단계를 유사한 양의 출발 물질(13.3㎏), L-말산(4.96㎏), MEK(198.6㎏) 및 물(37.2㎏)에서 시작하여 2회 초과로 반복하였다. 합한 여과액을 대략 74℃에서 MEK(1133.2㎏)(대략 잔여 용적 711ℓ; KF ≤ 0.5 % w/w)를 이용해서 대기압에서 공비혼합 방식으로 건조시켰다. 반응기 내용물의 온도는 20 내지 25℃로 저감시키고, 대략 4시간 동안 유지하여 고체 석출을 유발하였으며, 이 석출물을 여과시키고 MEK(448㎏)로 세척하고 진공 하에 50℃에서 건조시켜 표제의 화합물(45.5㎏)을 제공하였다.
사이클로프로판-1,1- 다이카복실산 [4-(6,7- 다이메톡시 -퀴놀린-4- 일옥시 )- 페닐 ]- 아마이드 (4- 플루오로 - 페닐 )- 아마이드 , (L) 말산염의 대안적인 제조
사이클로프로판-1,1-다이카복실산 [4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐]-아마이드 (4-플루오로-페닐)-아마이드(47.9㎏), L-말산(17.2), 658.2㎏ 메틸 에틸 케톤, 및 129.1㎏ 물(37.3㎏)을 반응기에 주입하고, 이 혼합물을 대략 1 내지 3시간 동안 동안 50 내지 55℃로 가열하고 나서 추가로 4 내지 5시간 동안 55 내지 60℃에서 가열하였다. 이 혼합물은 1㎛ 카트리지를 통한 여과에 의해 투명하게 되었다. 반응기 온도를 20 내지 25℃로 조정하고 55℃의 최대 재킷 온도에서 558 내지 731ℓ의 용적 범위로 150 내지 200 mm Hg의 진공으로 진공 증발시켰다.
진공 증류를 각각 380㎏ 및 380.2㎏의 메틸 에틸 케톤의 주입으로 2회 초과로 수행하였다. 제3회 증류 후, 159.9㎏의 메틸 에틸 케톤을 주입함으로써 배취의 용적을 18 v/w의 사이클로프로판-1,1-다이카복실산 [4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐]-아마이드 (4-플루오로-페닐)-아마이드로 조정하여 880ℓ의 총 용적을 제공하였다. 245.7의 메틸 에틸 케톤을 조정함으로써 추가의 진공 증류를 수행하였다. 반응 혼합물을 적어도 24시간 동안 20 내지 25℃에서 적절한 교반을 행하였다. 생성물을 여과시키고 415.1㎏의 메틸 에틸 케톤으로 3부분으로 나누어서 세척하였다. 생성물을 45℃에서 재킷 온도 설정점으로 진공 하에 건조시켰다.
대안적인 절차에서, 129.9㎏의 물에 용해시킨 17.7㎏의 L-말산의 용액이 메틸 에틸 케톤(673.3㎏) 중 사이클로프로판-1,1-다이카복실산 [4-(6,7-다이메톡시-퀴놀린-4-일옥시)-페닐]-아마이드 (4-플루오로-페닐)-아마이드(48.7㎏)로 첨가되도록 첨가 수순을 변경하였다.
생물학적 실시예
HCC -78 세포 및 NCI- H2228 세포의 성장
HCC-78 세포 및 NCI-H2228 세포는 둘 다 각각 동결된 생물학적 샘플로서 DSMZ 및 ATCC로부터 공급되었고, T-75 플라스크(눙크사(Nunc)) 내로 해동되어, 유착 세포에 대해서 80 내지 90%가 융합될 때까지 또는 세포가 현탁 세포에 대해서 1 내지 2 x 106 세포/㎖의 밀도에서 있을 때까지 성장되었다.
활성화 EML4-ALK 융합을 보유하는 인간 폐 NSCLC 선암종 세포주(ATCC, CRL 5935)인 NCI-H2228 세포를 흑색 96-웰 플레이트(코스타사(Costar), 3904) 상에서 RPMI 1640(ATCC 30-2001) 0.1㎖, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신에서 48시간 또는 72시간 동안 각각 3.5 x 104 세포/웰 및 2.5 x 104 세포/웰의 밀도에서 파종하였다.
활성화 SLC34A2-ROS1 융합 및 형광체-Met를 보유하는 인간 폐 NSCLC 선암종 세포주(DSMZ, ACC 563)인 HCC-78 세포를 흑색 96-웰 플레이트(코스타사, 3904) 상에 RPMI 1640(ATCC 30-2001) 0.1㎖, 10% FBS(열-비활성화, 셀그로사(Cellgro)), 1% 페니실린-스트렙토마이신 중에서 각각 48시간 또는 72시간 동안 2.5 x 104 세포/웰 및 2 x 104 세포/웰의 밀도에서 파종하였다.
세포를 가습된 5% CO2 분위기 중 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 신선한 혈청 무함유 배지 또는 혈청 함유 배지 중 화합물 1의 DMSO 또는 계열 희석액을 세포에 첨가하고 2 내지 4시간 동안 5'-브로모-2'-데옥시-유리딘(BrdU) 표지화 용액(Roche)의 첨가 전에 가습된 5% CO2 분위기 중 37℃에서 48시간 또는 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 검정을 수행하기 전에 현탁 세포를 필터 플레이트(코닝사(Corning), 3504)로 옮겼다. BrdU 혼입을 모니터링함으로써 세포를 증식에 대해서 검정하였다. 세포 증식 ELISA, BrdU(화학발광) 키트(로쉐 바이오사이언시스(Roche Biosciences), 11 669 915 001)로부터의 시약들을 제조사의 지시에 따라서 사용하였다. BrdU 표지화 후에, 세포를 픽스데나트(FixDenat) 용액으로 고정시켰다. 항-BrdU 퍼옥시다제(POD) 접합체를 첨가하고, 플레이트를 1x PBS로 세척하였다. 기질 용액을 첨가하고, 빅터 발락 V 플레이트 리더(Victor Wallac V plate reader)(퍼킨 엘머사(Perkin Elmer)) 상에서 발광 측정치를 취하였다. 증식의 저해 퍼센트는 DMSO 처리된 샘플에 대해서 화합물 1 치료에 의한 세포 증식을 비교함으로써 계산하였다. 5 내지 8가지 화합물 1 농도에서의 저해값 퍼센트를 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
생물학적 실시예
ROS1 인산화의 저해
활성화 SLC34A2-ROS1 융합 및 형광체-Met를 보유하는 인간 폐 NSCLC 선암종 세포주(DSMZ, ACC 563)인 HCC-78 세포를 10% FBS(열-비활성화, 셀그로사) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(셀그로사)을 함유하는 RPMI 1640(ATCC, 30-2001)에서 6-웰 플레이트(눙클론사(Nunclon), 152795) 상에 3 x105 세포/웰에서 파종하였다. 0.3% DMSO(비히클)의 최종 농도에서 10% FBS를 지니는 신선한 배지에서 화합물 1의 DMSO 또는 계열 희석액을 세포에 첨가하고 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 처리 후, 세포를 수집하고, 냉 PBS로 세척하고, 그 즉시 0.15㎖의 냉 용해 완충액(50mM 트리스(Tris) HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP 40, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 1mM EDTA, 50mM NaF, 1mM 피로인산나트륨, 1mM Na3VO4, 2mM PMSF, 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 5 ㎍/㎖ 류펩틴 및 5 ㎍/㎖ 펩스타틴 A)으로 용해시켰다. 용해물을 수집하고, 단백질 농도를 BCA법(피어스사(Pierce))에 의해 측정하였다. 용해물을 수집하고, 단백질 농도를 BCA법(피어스사)에 의해 측정하였다. 용해물을 누파지 LDS(NuPage LDS) 샘플 완충액(인비트로젠사 NP0007) 및 환원제(인비트로젠사 #NP0004)와 혼합하고 나서, 70℃에서 10분 동안 가열하였다. 20㎍의 단백질을 누파지 10% 비스 트리스 겔(Bis Tris gel)(인비트로젠사, NP0302) 상에 장입하였다. 단백질을 나이트로셀룰로스 막(인비트로젠사, LC2001)으로 옮기고 1시간 동안 오딧세이 차단 완충액(Odyssey Blocking Buffer)(리-코르사(Li-Cor), 927 40000) 중에서 차단하고, 0.1% 트윈(Tween) 20을 함유하는 오딧세이 차단 완충액 중에 희석된 항-ROS1 마우스 단클론성 항체(1:1000)(셀 시그널링 테크놀로지사, 3266) 및 항-포스포 ROS1(Y2274) 토끼 항체(1:1000)(셀 시그널링 테크놀로지사, 3077)로 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅하였다. 막을 TBS T 완충액(50mM 트리스 HCl, pH7.2; 150mM NaCl; 0.1% 트윈 20)으로 각각 10분 동안 4회 세척하고, 실온에서 60분 동안 0.1% 트윈 20 및 0.01% SDS를 함유하는 오딧세이 차단 완충액 중에서 염소 항 마우스 IRDye680(리-코르사, 926 32220) 및 염소 항 토끼 IRDye800(리-코르사, 926 32211) 2차 항체로 블로팅하였다. 막을 TBS-T 완충액으로 각각 10분 동안 4회 세척하고, PBS로 2회 헹구었다. 막을 오딧세이 스캐너(Odyssey Scanner)(리-코르사)를 이용해서 스캔하고, 각 대역의 신호 강도를 이미지퀀트(ImageQuant)(몰레큘러 디바이시스사(Molecular Devices))를 이용해서 정량화하였다. IC50 값은 비히클(DMSO) 대조군과 비교하여 화합물 처리된 신호를 기초로 계산하였다.
화합물 1, 또는 3-[(1R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민(크리조티닙; 잴코리(등록상표))의 단일 상승 용량으로 투여된 HCC-78 NSCLC 세포 내 SLC34A2-ROS1 매개 키나제 활성의 저해는 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 ROS1 융합 키나제에 대해서 화합물 1의 강력한 저해 활성을 명확하게 예시하고, 시험관내에서 시험된 농도에서 비교 대조군인 3-[(1R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민(크리조티닙)보다 더욱 강력하다.
생물학적 실시예
HCC -78 NSCLC 세포의 ROS1 -의존적 증식
IC50 값은 각종 농도에서 48 또는 72시간 동안 HCC-78 NSCLC 세포와 함께 활성제의 인큐베이션 후에 화합물 1 및 비교 대조군인 3-[(1R)-1-(2,6-다이클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민(크리조티닙)에 대해서 계산되었다. HCC-78 NSCLC 세포의 증식의 정량화는 제조사의 권장에 따라서 BrdU ELISA(화학발광, 로쉐 바이오사이언시스, 카탈로그 번호 11 669 915 001)를 사용해서 수행되었다. IC50 값(A-E)(50% 저해에서의 농도)의 결정은 위에서 제공된 바와 같이 결정되었고, 그라프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용해서 컴퓨터 계산으로 결정되었다.
Figure 112016115330543-pct00026
기타 실시형태
앞서 언급한 개시내용은 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예로서 일부 상세하게 기재되었다. 본 발명은 다양한 구체적이고 바람직한 실시형태 및 기법을 참조로 하여 기재되었다. 그러나, 본 발명의 정신과 범주 내에 유지된 상태에서 다수의 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 변화 및 변형은 첨부하는 특허청구범위의 범주 내에서 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 기재는 예시적이며, 제한적이지 않은 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다.
그러므로, 본 발명의 범위는 상기 기재를 참조하지 않고 결정되어야 하지만, 대신에 이러한 청구범위에 부여되는 등가물의 전체 범위와 함께 이하에 첨부하는 청구범위를 참조로 하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Exelixis Inc. Aftab, Dana T Yu, Peiwen <120> Method of Treating Lung Adenocarcinoma <130> 224990/EX14-003C-PC/370960 <150> US 61/984599 <151> 2014-04-25 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2347 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2347) <223> Human ROS1 Protein UniProt Accession No. P08922 <400> 1 Met Lys Asn Ile Tyr Cys Leu Ile Pro Lys Leu Val Asn Phe Ala Thr 1 5 10 15 Leu Gly Cys Leu Trp Ile Ser Val Val Gln Cys Thr Val Leu Asn Ser 20 25 30 Cys Leu Lys Ser Cys Val Thr Asn Leu Gly Gln Gln Leu Asp Leu Gly 35 40 45 Thr Pro His Asn Leu Ser Glu Pro Cys Ile Gln Gly Cys His Phe Trp 50 55 60 Asn Ser Val Asp Gln Lys Asn Cys Ala Leu Lys Cys Arg Glu Ser Cys 65 70 75 80 Glu Val Gly Cys Ser Ser Ala Glu Gly Ala Tyr Glu Glu Glu Val Leu 85 90 95 Glu Asn Ala Asp Leu Pro Thr Ala Pro Phe Ala Ser Ser Ile Gly Ser 100 105 110 His Asn Met Thr Leu Arg Trp Lys Ser Ala Asn Phe Ser Gly Val Lys 115 120 125 Tyr Ile Ile Gln Trp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Gly Ser Trp Thr Tyr 130 135 140 Thr Lys Thr Val Ser Arg Pro Ser Tyr Val Val Lys Pro Leu His Pro 145 150 155 160 Phe Thr Glu Tyr Ile Phe Arg Val Val Trp Ile Phe Thr Ala Gln Leu 165 170 175 Gln Leu Tyr Ser Pro Pro Ser Pro Ser Tyr Arg Thr His Pro His Gly 180 185 190 Val Pro Glu Thr Ala Pro Leu Ile Arg Asn Ile Glu Ser Ser Ser Pro 195 200 205 Asp Thr Val Glu Val Ser Trp Asp Pro Pro Gln Phe Pro Gly Gly Pro 210 215 220 Ile Leu Gly Tyr Asn Leu Arg Leu Ile Ser Lys Asn Gln Lys Leu Asp 225 230 235 240 Ala Gly Thr Gln Arg Thr Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Thr Leu Pro Asn 245 250 255 Thr Ile Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Ala Val Asn Glu Val Gly Glu Gly 260 265 270 Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ile Thr Thr Ser Ser Ser Ala Val Gln Gln 275 280 285 Glu Glu Gln Trp Leu Phe Leu Ser Arg Lys Thr Ser Leu Arg Lys Arg 290 295 300 Ser Leu Lys His Leu Val Asp Glu Ala His Cys Leu Arg Leu Asp Ala 305 310 315 320 Ile Tyr His Asn Ile Thr Gly Ile Ser Val Asp Val His Gln Gln Ile 325 330 335 Val Tyr Phe Ser Glu Gly Thr Leu Ile Trp Ala Lys Lys Ala Ala Asn 340 345 350 Met Ser Asp Val Ser Asp Leu Arg Ile Phe Tyr Arg Gly Ser Gly Leu 355 360 365 Ile Ser Ser Ile Ser Ile Asp Trp Leu Tyr Gln Arg Met Tyr Phe Ile 370 375 380 Met Asp Glu Leu Val Cys Val Cys Asp Leu Glu Asn Cys Ser Asn Ile 385 390 395 400 Glu Glu Ile Thr Pro Pro Ser Ile Ser Ala Pro Gln Lys Ile Val Ala 405 410 415 Asp Ser Tyr Asn Gly Tyr Val Phe Tyr Leu Leu Arg Asp Gly Ile Tyr 420 425 430 Arg Ala Asp Leu Pro Val Pro Ser Gly Arg Cys Ala Glu Ala Val Arg 435 440 445 Ile Val Glu Ser Cys Thr Leu Lys Asp Phe Ala Ile Lys Pro Gln Ala 450 455 460 Lys Arg Ile Ile Tyr Phe Asn Asp Thr Ala Gln Val Phe Met Ser Thr 465 470 475 480 Phe Leu Asp Gly Ser Ala Ser His Leu Ile Leu Pro Arg Ile Pro Phe 485 490 495 Ala Asp Val Lys Ser Phe Ala Cys Glu Asn Asn Asp Phe Leu Val Thr 500 505 510 Asp Gly Lys Val Ile Phe Gln Gln Asp Ala Leu Ser Phe Asn Glu Phe 515 520 525 Ile Val Gly Cys Asp Leu Ser His Ile Glu Glu Phe Gly Phe Gly Asn 530 535 540 Leu Val Ile Phe Gly Ser Ser Ser Gln Leu His Pro Leu Pro Gly Arg 545 550 555 560 Pro Gln Glu Leu Ser Val Leu Phe Gly Ser His Gln Ala Leu Val Gln 565 570 575 Trp Lys Pro Pro Ala Leu Ala Ile Gly Ala Asn Val Ile Leu Ile Ser 580 585 590 Asp Ile Ile Glu Leu Phe Glu Leu Gly Pro Ser Ala Trp Gln Asn Trp 595 600 605 Thr Tyr Glu Val Lys Val Ser Thr Gln Asp Pro Pro Glu Val Thr His 610 615 620 Ile Phe Leu Asn Ile Ser Gly Thr Met Leu Asn Val Pro Glu Leu Gln 625 630 635 640 Ser Ala Met Lys Tyr Lys Val Ser Val Arg Ala Ser Ser Pro Lys Arg 645 650 655 Pro Gly Pro Trp Ser Glu Pro Ser Val Gly Thr Thr Leu Val Pro Ala 660 665 670 Ser Glu Pro Pro Phe Ile Met Ala Val Lys Glu Asp Gly Leu Trp Ser 675 680 685 Lys Pro Leu Asn Ser Phe Gly Pro Gly Glu Phe Leu Ser Ser Asp Ile 690 695 700 Gly Asn Val Ser Asp Met Asp Trp Tyr Asn Asn Ser Leu Tyr Tyr Ser 705 710 715 720 Asp Thr Lys Gly Asp Val Phe Val Trp Leu Leu Asn Gly Thr Asp Ile 725 730 735 Ser Glu Asn Tyr His Leu Pro Ser Ile Ala Gly Ala Gly Ala Leu Ala 740 745 750 Phe Glu Trp Leu Gly His Phe Leu Tyr Trp Ala Gly Lys Thr Tyr Val 755 760 765 Ile Gln Arg Gln Ser Val Leu Thr Gly His Thr Asp Ile Val Thr His 770 775 780 Val Lys Leu Leu Val Asn Asp Met Val Val Asp Ser Val Gly Gly Tyr 785 790 795 800 Leu Tyr Trp Thr Thr Leu Tyr Ser Val Glu Ser Thr Arg Leu Asn Gly 805 810 815 Glu Ser Ser Leu Val Leu Gln Thr Gln Pro Trp Phe Ser Gly Lys Lys 820 825 830 Val Ile Ala Leu Thr Leu Asp Leu Ser Asp Gly Leu Leu Tyr Trp Leu 835 840 845 Val Gln Asp Ser Gln Cys Ile His Leu Tyr Thr Ala Val Leu Arg Gly 850 855 860 Gln Ser Thr Gly Asp Thr Thr Ile Thr Glu Phe Ala Ala Trp Ser Thr 865 870 875 880 Ser Glu Ile Ser Gln Asn Ala Leu Met Tyr Tyr Ser Gly Arg Leu Phe 885 890 895 Trp Ile Asn Gly Phe Arg Ile Ile Thr Thr Gln Glu Ile Gly Gln Lys 900 905 910 Thr Ser Val Ser Val Leu Glu Pro Ala Arg Phe Asn Gln Phe Thr Ile 915 920 925 Ile Gln Thr Ser Leu Lys Pro Leu Pro Gly Asn Phe Ser Phe Thr Pro 930 935 940 Lys Val Ile Pro Asp Ser Val Gln Glu Ser Ser Phe Arg Ile Glu Gly 945 950 955 960 Asn Ala Ser Ser Phe Gln Ile Leu Trp Asn Gly Pro Pro Ala Val Asp 965 970 975 Trp Gly Val Val Phe Tyr Ser Val Glu Phe Ser Ala His Ser Lys Phe 980 985 990 Leu Ala Ser Glu Gln His Ser Leu Pro Val Phe Thr Val Glu Gly Leu 995 1000 1005 Glu Pro Tyr Ala Leu Phe Asn Leu Ser Val Thr Pro Tyr Thr Tyr 1010 1015 1020 Trp Gly Lys Gly Pro Lys Thr Ser Leu Ser Leu Arg Ala Pro Glu 1025 1030 1035 Thr Val Pro Ser Ala Pro Glu Asn Pro Arg Ile Phe Ile Leu Pro 1040 1045 1050 Ser Gly Lys Cys Cys Asn Lys Asn Glu Val Val Val Glu Phe Arg 1055 1060 1065 Trp Asn Lys Pro Lys His Glu Asn Gly Val Leu Thr Lys Phe Glu 1070 1075 1080 Ile Phe Tyr Asn Ile Ser Asn Gln Ser Ile Thr Asn Lys Thr Cys 1085 1090 1095 Glu Asp Trp Ile Ala Val Asn Val Thr Pro Ser Val Met Ser Phe 1100 1105 1110 Gln Leu Glu Gly Met Ser Pro Arg Cys Phe Ile Ala Phe Gln Val 1115 1120 1125 Arg Ala Phe Thr Ser Lys Gly Pro Gly Pro Tyr Ala Asp Val Val 1130 1135 1140 Lys Ser Thr Thr Ser Glu Ile Asn Pro Phe Pro His Leu Ile Thr 1145 1150 1155 Leu Leu Gly Asn Lys Ile Val Phe Leu Asp Met Asp Gln Asn Gln 1160 1165 1170 Val Val Trp Thr Phe Ser Ala Glu Arg Val Ile Ser Ala Val Cys 1175 1180 1185 Tyr Thr Ala Asp Asn Glu Met Gly Tyr Tyr Ala Glu Gly Asp Ser 1190 1195 1200 Leu Phe Leu Leu His Leu His Asn Arg Ser Ser Ser Glu Leu Phe 1205 1210 1215 Gln Asp Ser Leu Val Phe Asp Ile Thr Val Ile Thr Ile Asp Trp 1220 1225 1230 Ile Ser Arg His Leu Tyr Phe Ala Leu Lys Glu Ser Gln Asn Gly 1235 1240 1245 Met Gln Val Phe Asp Val Asp Leu Glu His Lys Val Lys Tyr Pro 1250 1255 1260 Arg Glu Val Lys Ile His Asn Arg Asn Ser Thr Ile Ile Ser Phe 1265 1270 1275 Ser Val Tyr Pro Leu Leu Ser Arg Leu Tyr Trp Thr Glu Val Ser 1280 1285 1290 Asn Phe Gly Tyr Gln Met Phe Tyr Tyr Ser Ile Ile Ser His Thr 1295 1300 1305 Leu His Arg Ile Leu Gln Pro Thr Ala Thr Asn Gln Gln Asn Lys 1310 1315 1320 Arg Asn Gln Cys Ser Cys Asn Val Thr Glu Phe Glu Leu Ser Gly 1325 1330 1335 Ala Met Ala Ile Asp Thr Ser Asn Leu Glu Lys Pro Leu Ile Tyr 1340 1345 1350 Phe Ala Lys Ala Gln Glu Ile Trp Ala Met Asp Leu Glu Gly Cys 1355 1360 1365 Gln Cys Trp Arg Val Ile Thr Val Pro Ala Met Leu Ala Gly Lys 1370 1375 1380 Thr Leu Val Ser Leu Thr Val Asp Gly Asp Leu Ile Tyr Trp Ile 1385 1390 1395 Ile Thr Ala Lys Asp Ser Thr Gln Ile Tyr Gln Ala Lys Lys Gly 1400 1405 1410 Asn Gly Ala Ile Val Ser Gln Val Lys Ala Leu Arg Ser Arg His 1415 1420 1425 Ile Leu Ala Tyr Ser Ser Val Met Gln Pro Phe Pro Asp Lys Ala 1430 1435 1440 Phe Leu Ser Leu Ala Ser Asp Thr Val Glu Pro Thr Ile Leu Asn 1445 1450 1455 Ala Thr Asn Thr Ser Leu Thr Ile Arg Leu Pro Leu Ala Lys Thr 1460 1465 1470 Asn Leu Thr Trp Tyr Gly Ile Thr Ser Pro Thr Pro Thr Tyr Leu 1475 1480 1485 Val Tyr Tyr Ala Glu Val Asn Asp Arg Lys Asn Ser Ser Asp Leu 1490 1495 1500 Lys Tyr Arg Ile Leu Glu Phe Gln Asp Ser Ile Ala Leu Ile Glu 1505 1510 1515 Asp Leu Gln Pro Phe Ser Thr Tyr Met Ile Gln Ile Ala Val Lys 1520 1525 1530 Asn Tyr Tyr Ser Asp Pro Leu Glu His Leu Pro Pro Gly Lys Glu 1535 1540 1545 Ile Trp Gly Lys Thr Lys Asn Gly Val Pro Glu Ala Val Gln Leu 1550 1555 1560 Ile Asn Thr Thr Val Arg Ser Asp Thr Ser Leu Ile Ile Ser Trp 1565 1570 1575 Arg Glu Ser His Lys Pro Asn Gly Pro Lys Glu Ser Val Arg Tyr 1580 1585 1590 Gln Leu Ala Ile Ser His Leu Ala Leu Ile Pro Glu Thr Pro Leu 1595 1600 1605 Arg Gln Ser Glu Phe Pro Asn Gly Arg Leu Thr Leu Leu Val Thr 1610 1615 1620 Arg Leu Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Val Leu Lys Val Leu Ala Cys 1625 1630 1635 His Ser Glu Glu Met Trp Cys Thr Glu Ser His Pro Val Thr Val 1640 1645 1650 Glu Met Phe Asn Thr Pro Glu Lys Pro Tyr Ser Leu Val Pro Glu 1655 1660 1665 Asn Thr Ser Leu Gln Phe Asn Trp Lys Ala Pro Leu Asn Val Asn 1670 1675 1680 Leu Ile Arg Phe Trp Val Glu Leu Gln Lys Trp Lys Tyr Asn Glu 1685 1690 1695 Phe Tyr His Val Lys Thr Ser Cys Ser Gln Gly Pro Ala Tyr Val 1700 1705 1710 Cys Asn Ile Thr Asn Leu Gln Pro Tyr Thr Ser Tyr Asn Val Arg 1715 1720 1725 Val Val Val Val Tyr Lys Thr Gly Glu Asn Ser Thr Ser Leu Pro 1730 1735 1740 Glu Ser Phe Lys Thr Lys Ala Gly Val Pro Asn Lys Pro Gly Ile 1745 1750 1755 Pro Lys Leu Leu Glu Gly Ser Lys Asn Ser Ile Gln Trp Glu Lys 1760 1765 1770 Ala Glu Asp Asn Gly Cys Arg Ile Thr Tyr Tyr Ile Leu Glu Ile 1775 1780 1785 Arg Lys Ser Thr Ser Asn Asn Leu Gln Asn Gln Asn Leu Arg Trp 1790 1795 1800 Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Cys Ser Ser Val Cys Thr Trp Lys 1805 1810 1815 Ser Lys Asn Leu Lys Gly Ile Phe Gln Phe Arg Val Val Ala Ala 1820 1825 1830 Asn Asn Leu Gly Phe Gly Glu Tyr Ser Gly Ile Ser Glu Asn Ile 1835 1840 1845 Ile Leu Val Gly Asp Asp Phe Trp Ile Pro Glu Thr Ser Phe Ile 1850 1855 1860 Leu Thr Ile Ile Val Gly Ile Phe Leu Val Val Thr Ile Pro Leu 1865 1870 1875 Thr Phe Val Trp His Arg Arg Leu Lys Asn Gln Lys Ser Ala Lys 1880 1885 1890 Glu Gly Val Thr Val Leu Ile Asn Glu Asp Lys Glu Leu Ala Glu 1895 1900 1905 Leu Arg Gly Leu Ala Ala Gly Val Gly Leu Ala Asn Ala Cys Tyr 1910 1915 1920 Ala Ile His Thr Leu Pro Thr Gln Glu Glu Ile Glu Asn Leu Pro 1925 1930 1935 Ala Phe Pro Arg Glu Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gly Ser 1940 1945 1950 Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Glu Gly Thr Ala Val Asp Ile Leu 1955 1960 1965 Gly Val Gly Ser Gly Glu Ile Lys Val Ala Val Lys Thr Leu Lys 1970 1975 1980 Lys Gly Ser Thr Asp Gln Glu Lys Ile Glu Phe Leu Lys Glu Ala 1985 1990 1995 His Leu Met Ser Lys Phe Asn His Pro Asn Ile Leu Lys Gln Leu 2000 2005 2010 Gly Val Cys Leu Leu Asn Glu Pro Gln Tyr Ile Ile Leu Glu Leu 2015 2020 2025 Met Glu Gly Gly Asp Leu Leu Thr Tyr Leu Arg Lys Ala Arg Met 2030 2035 2040 Ala Thr Phe Tyr Gly Pro Leu Leu Thr Leu Val Asp Leu Val Asp 2045 2050 2055 Leu Cys Val Asp Ile Ser Lys Gly Cys Val Tyr Leu Glu Arg Met 2060 2065 2070 His Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser 2075 2080 2085 Val Lys Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Ile Val Lys Ile Gly Asp Phe 2090 2095 2100 Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Lys Arg 2105 2110 2115 Gly Glu Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu 2120 2125 2130 Met Asp Gly Ile Phe Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly 2135 2140 2145 Ile Leu Ile Trp Glu Ile Leu Thr Leu Gly His Gln Pro Tyr Pro 2150 2155 2160 Ala His Ser Asn Leu Asp Val Leu Asn Tyr Val Gln Thr Gly Gly 2165 2170 2175 Arg Leu Glu Pro Pro Arg Asn Cys Pro Asp Asp Leu Trp Asn Leu 2180 2185 2190 Met Thr Gln Cys Trp Ala Gln Glu Pro Asp Gln Arg Pro Thr Phe 2195 2200 2205 His Arg Ile Gln Asp Gln Leu Gln Leu Phe Arg Asn Phe Phe Leu 2210 2215 2220 Asn Ser Ile Tyr Lys Ser Arg Asp Glu Ala Asn Asn Ser Gly Val 2225 2230 2235 Ile Asn Glu Ser Phe Glu Gly Glu Asp Gly Asp Val Ile Cys Leu 2240 2245 2250 Asn Ser Asp Asp Ile Met Pro Val Ala Leu Met Glu Thr Lys Asn 2255 2260 2265 Arg Glu Gly Leu Asn Tyr Met Val Leu Ala Thr Glu Cys Gly Gln 2270 2275 2280 Gly Glu Glu Lys Ser Glu Gly Pro Leu Gly Ser Gln Glu Ser Glu 2285 2290 2295 Ser Cys Gly Leu Arg Lys Glu Glu Lys Glu Pro His Ala Asp Lys 2300 2305 2310 Asp Phe Cys Gln Glu Lys Gln Val Ala Tyr Cys Pro Ser Gly Lys 2315 2320 2325 Pro Glu Gly Leu Asn Tyr Ala Cys Leu Thr His Ser Gly Tyr Gly 2330 2335 2340 Asp Gly Ser Asp 2345 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(278) <223> Human ROS1 Kinase Domain <400> 2 Leu Thr Leu Arg Leu Leu Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr 1 5 10 15 Glu Gly Thr Ala Val Asp Ile Leu Gly Val Gly Ser Gly Glu Ile Lys 20 25 30 Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Lys Gly Ser Thr Asp Gln Glu Lys Ile 35 40 45 Glu Phe Leu Lys Glu Ala His Leu Met Ser Lys Phe Asn His Pro Asn 50 55 60 Ile Leu Lys Gln Leu Gly Val Cys Leu Leu Asn Glu Pro Gln Tyr Ile 65 70 75 80 Ile Leu Glu Leu Met Glu Gly Gly Asp Leu Leu Thr Tyr Leu Arg Lys 85 90 95 Ala Arg Met Ala Thr Phe Tyr Gly Pro Leu Leu Thr Leu Val Asp Leu 100 105 110 Val Asp Leu Cys Val Asp Ile Ser Lys Gly Cys Val Tyr Leu Glu Arg 115 120 125 Met His Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Ser 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Thr Ser Pro Arg Ile Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly 145 150 155 160 Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg Lys Arg Gly Glu 165 170 175 Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Met Asp Gly 180 185 190 Ile Phe Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Ile Trp 195 200 205 Glu Ile Leu Thr Leu Gly His Gln Pro Tyr Pro Ala His Ser Asn Leu 210 215 220 Asp Val Leu Asn Tyr Val Gln Thr Gly Gly Arg Leu Glu Pro Pro Arg 225 230 235 240 Asn Cys Pro Asp Asp Leu Trp Asn Leu Met Thr Gln Cys Trp Ala Gln 245 250 255 Glu Pro Asp Gln Arg Pro Thr Phe His Arg Ile Gln Asp Gln Leu Gln 260 265 270 Leu Phe Arg Asn Phe Phe 275 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC34A2 exon 4 forward <400> 3 tcggatttct ctactttttc gtg 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD74 exon 6 forward <400> 4 ctcctgtttg aaatgagcag g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 exon 32 reverse <400> 5 ggaatgcctg gtttatttgg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 exon 34 reverse <400> 6 tgaaacttgt ttctggtatc caa 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 InvPCR F1 <400> 7 gtctggcata gaagattaaa g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 InvPCR F2 <400> 8 aaacgaagac aaagagttgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 InvPCR R1 <400> 9 gtcagtggga ttgtaacaac 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 InvPCR R2 <400> 10 aaacttgttt ctggtatcc 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 Break Rev1 <400> 11 cagctcagcc aactcttt 18 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 E43R1 <400> 12 tctatttccc aaacaacgct attaatcaga ccc 33 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROS1 E34R <400> 13 tgaaacttgt ttctggtatc caa 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD74 E5F <400> 14 cctgagacac cttaagaaca cca 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC34A2 E4F <400> 15 tcggatttct ctactttttc gtg 23

Claims (42)

  1. SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00027

    식 중,
    R1은 할로이고;
    R2는 할로이며;
    R3은 (C1-C6)알킬이고;
    R4는 (C1-C6)알킬이며; 그리고
    Q는 CH 또는 N이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00039

    식 중,
    R1은 할로이고;
    R2는 할로이며; 그리고
    Q는 CH 또는 N이다.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 하기 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00029
    .
  6. 제5항에 있어서, 상기 화합물 1은 N-(4-{[6,7-비스(메틸옥시)퀴놀린-4-일]옥시}페닐)-N'-(4-플루오로페닐)사이클로프로판-1,1-다이카복스아마이드, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 화학식 I, 화학식 Ia의 화합물 및 화합물 1은 (L)- 또는 (D)-말산염인, 약제학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 제5항에 있어서, 상기 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물로서 투여되는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 다른 형태의 치료에 후속해서 투여되는, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 카보플라틴 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 카보플라틴 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 시스플라틴 및/또는 카보플라틴 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 도세탁셀 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 크리조티닙 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  19. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 시스플라틴 및/또는 젬시타빈 및/또는 도세탁셀 치료 후에 투여되는, 약제학적 조성물.
  20. 치료적 유효량의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, ROS1 융합-양성 비소세포 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 ROS1 융합-양성 비소세포 폐암을 치료하기 위한 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00041
    .
  21. 포유동물에서 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00042
    .
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제21항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하고; 상기 약제학적 조성물은 3개월 초과 동안 매일 투여되는, 약제학적 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하고; 상기 약제학적 조성물은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 ㎎/일의 투약량으로 투여되는, 약제학적 조성물.
  28. 제21항에 있어서, 상기 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암의 검출이 FISH, CISH 또는 SISH 검정을 이용해서 행해지는, 약제학적 조성물.
  29. 제21항에 있어서, 상기 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암의 검출이 게놈 PCR, 직접 서열분석, PCR 서열분석, RT-PCR 또는 유사한 검정 중 임의의 형태를 이용해서 행해지는, 약제학적 조성물.
  30. 제21항에 있어서, 상기 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 비소세포 폐암의 검출이 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용해서 행해지는, 약제학적 조성물.
  31. 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 환자는 NSCLC 종양을 갖고, 상기 종양은 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합-양성 NSCLC로서 확인되며, 상기 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00043

    식 중,
    R1은 할로이고;
    R2는 할로이며;
    R3은 (C1-C6)알킬이고;
    R4는 (C1-C6)알킬이며; 그리고
    Q는 CH 또는 N이다.
  32. 환자에서 SLC34A2-ROS1, CD74-ROS1, 또는 FIG-ROS1 융합 양성 비소세포 폐암인 폐 선암종을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 치료적 유효량의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 약제학적 조성물:
    Figure 112022042376460-pct00030
    .
  33. 제5항에 있어서, 유효량의 화학식 I, Ia의 화합물, 또는 화합물 1은 종양의 크기의 저감, 전이의 저감, 완전 관해, 부분 관해, 안정적인 질환, 전체 반응속도 증가, 또는 병리적 완료 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료 효과를 나타내는, 약제학적 조성물.
  34. 삭제
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