TW201622723A - 治療肺腺癌之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係針對利用MET、VEGFR2及ROS1抑制劑治療患者，特定言之患有肺腺癌之患者且更特定言之患有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌之患者的癌症，該抑制劑為式I化合物： □ 或其醫藥學上可接受之鹽。

Description

治療肺腺癌之方法 [相關申請案之交叉引用]
本PCT申請案主張2014年4月25日申請之美國臨時申請案序列號61/984,599之權益，該案之揭示內容係以全文引用之方式併入在此。
本發明係針對使用受體酪胺酸激酶抑制劑對癌症，尤其對肺腺癌進行偵測、診斷及治療。
在全世界範圍內，肺癌為癌症相關之死亡的主要原因。靶向療法之最近發展已引起非小細胞肺癌(NSCLC)之治療模式變化。Mok TS,Wu YL,Thongprasert S,Yang CH,Chu DT,Saijo N,Sunpaweravong P,Han B,Margono B,Ichinose Y,Nishiwaki Y,Ohe Y,Yang JJ,Chewaskulyong B,Jiang H,Duffield EL,Watkins CL,Armour AA,Fukuoka M.Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.N Engl J Med.2009年9月3日；361(10)：947-57。Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K,Sugawara S,Oizumi S,Isobe H,Gemma A,Harada M,Yoshizawa H,Kinoshita I,Fujita Y,Okinaga S,Hirano H,Yoshimori K,Harada T,Ogura T,Ando M,Miyazawa H,Tanaka T,Saijo Y,Hagiwara K,Morita S,Nukiwa T；North-East Japan Study Group.Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.N Engl J Med.2010年6月24日；362(25)：2380-8。表 皮生長因數受體(EGFR)酪胺酸激酶抑制劑(TKI)吉非替尼(gefitinib)及埃羅替尼(erlotinib)以及退行性淋巴瘤激酶(ALK)TKI克唑替尼(crizotinib)已在具有EGFR突變或ALK基因重排之NSCLC患者中顯示臨床活性。Kwak EL,Bang YJ,Camidge DR,Shaw AT,Solomon B,Maki RG,Ou SH,Dezube BJ,Jänne PA,Costa DB,Varella-Garcia M,Kim WH,Lynch TJ,Fidias P,Stubbs H,Engelman JA,Sequist LV,Tan W,Gandhi L,Mino-Kenudson M,Wei GC,Shreeve SM,Ratain MJ,Settleman J,Christensen JG,Haber DA,Wilner K,Salgia R,Shapiro GI,Clark JW,Iafrate AJ.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer.N Engl J Med.2010年10月28日；363(18)：1693-703。Shaw AT,Camidge,Engelman JA,Solomon BJ,Kwak EL,Clark JW,Salgia R,Shapiro,Bang YJ,Tan W,Tye L,Wilner KD,Stephenson P,Varella-Garcia M,Bergethon K,Iafrate AJ,Ou SH.Clinical activity of crizotinib in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)harboring ROS1 gene rearrangement.J Clin Oncol.2012 30(增刊；摘要7508)。最近已報導KIF5B(致動蛋白家族5B)基因與RET致癌基因融合在1%至2% NSCLC患者中為驅動突變，並且作為治療標靶而受到關注。Kohno T,Ichikawa H,Totoki Y,Yasuda K,Hiramoto M,Nammo T,Sakamoto H,Tsuta K,Furuta K,Shimada Y,Iwakawa R,Ogiwara H,Oike T,Enari M,Schetter AJ,Okayama H,Haugen A,Skaug V,Chiku S,Yamanaka I,Arai Y,Watanabe S,Sekine I,Ogawa S,Harris CC,Tsuda H,Yoshida T,Yokota J,Shibata T.KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma.Nat Med.2012年2月12日；18(3)：375-7。Takeuchi K,Soda M,Togashi Y,Suzuki R,Sakata S,Hatano S,Asaka R,Hamanaka W,Ninomiya H,Uehara H,Lim Choi Y,Satoh Y,Okumura S,Nakagawa K,Mano H,Ishikawa Y.RET,ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med.2012年2月12日；18(3)：378-81。Lipson D,Capelletti M,Yelensky R,Otto G,Parker A,Jarosz M,Curran JA,Balasubramanian S,Bloom T,Brennan KW,Donahue A,Downing SR,Frampton GM,Garcia L,Juhn F,Mitchell KC,White E,White J,Zwirko Z,Peretz T,Nechushtan H,Soussan-Gutman L,Kim J,Sasaki H,Kim HR,Park SI,Ercan D,Sheehan CE,Ross JS,Cronin MT,Jänne PA,Stephens PJ.Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies.Nat Med.2012年2月12日；18(3)：382-4。因而，鑒別NSCLC中之關鍵驅動基因並且開發針對患者之各基因組子集的療法正變得愈來愈重要。
此等及其他需要係由必須本發明滿足，本發明係針對一種使用酪胺酸激酶活性，特定言之，ROS1激酶活性之抑制劑來治療肺腺癌的方法。該方法包括向需要該治療之患者投與治療有效量之能調節ROS1激酶及/或ROS1融合蛋白之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，肺腺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。更特定言之，肺腺癌最通常為SLC34A2-ROS1融合陽性NSCLC、CD74-ROS1融合陽性NSCLC、FIG-ROS1融合陽性NSCLC(例如CD74-ROS1、FIG-ROS1、FIG-ROS1(L)、FIG-ROS1(S)及FIG-ROS1(VL))及存在其他已知ROS1融合蛋白之NSCLC。ROS1激酶係由人類染色體6(6q22)上之ROS1基因編碼。
在一個態樣中，本發明係針對一種用於治療有治療需要之患者之NSCLC的方法，該方法包括向該患者投與治療有效量之能同時調節ROS1及/或ROS1融合蛋白之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在此態樣及其他態樣之一個實施例中，ROS1激酶抑制劑或ROS1融合激酶抑制劑為式I化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；R3為(C1-C6)烷基；R4為(C1-C6)烷基；且Q為CH或N。
在另一實施例中，式I化合物為式Ia之化合物 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；且Q為CH或N。
在一另一實施例中，式I化合物為化合物1： 或其醫藥學上可接受之鹽。已知化合物1為N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺且名為卡博替尼。2012年11月29日，美國食品藥物管理局批准N-{4-[(6,7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基]苯基}-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺之S-蘋果酸鹽(亦即，L-蘋果酸鹽)(亦稱為卡博替尼或COMETRIQ®)用於治療漸進性轉移性甲狀腺髓質癌(MTC)。2013年12月，歐洲人用藥品委員會(the European Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP)對市場授權應用(MAA)發表積極意見，向歐洲藥物管理局或EMA提出COMETRIQ用於漸進性、不可切除性、局部晚期或轉移性MTC之所提議之適應症。正在一項廣泛開發計劃中評估卡博替尼，包括正在進行之轉移性腎細胞癌(RCC)及晚期肝細胞癌(HCC)之3期關鍵性試驗。
化合物1為c-MET、RET及VEGFR2之蛋白抑制劑。Yakes FM,Chen J,Tan J,Yamaguchi K,Shi Y,Yu P,Qian F,Chu F,Bentzien F,Cancilla B,Orf J,You A,Laird AD,Engst S,Lee L,Lesch J,Chou YC,Joly AH.Cabozantinib(XL184),a novel MET and VEGFR2 inhibitor,simultaneously suppresses metastasis,angiogenesis,and tumor growth.Mol Cancer Ther.2011年12月10日(12)：2298-308；Bentzien,F.,Zuzow,M.,Heald,N.,Gibson,A.,Shi,Y.,Goon,L.,Yu,P.,Engst,S.,Zhang,W.,Huang,S.,Zhao,L.,Vysotskaia,V.,Chu,F.,Bautista,R.,Cancilla, B.,Lamb,P.,Joly,A.及Yakes,M.In vitro and in vivo activity of cabozantinib(XL184),an inhibitor of RET,MET,and VEGFR2,in a model of medullary thyroid cancer.Thyroid,2013(23)1569-1577。在臨床前研究中，化合物1介導之激酶活性抑制使腫瘤血管結構快速且穩定地退化、減少腫瘤侵襲及轉移，並且延長存活時間。Sennino B.,Ishiguro-Oonuma T,Wei Y,Naylor RM,Williamson CW,Bhagwandin V,Tabruyn SP,You WK,Chapman HA,Christensen JG,Aftab DT,McDonald DM.(2012),「Suppression of tumor invasion and metastasis by concurrent inhibition of c-Met and VEGF signaling in pancreatic neuroendocrine tumors.」,Cancer Discovery,2(3)：270-87(Epublished,02/24/2012)。
在另一實施例中，式I化合物、式Ia化合物、化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係以包含醫藥學上可接受之添加劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組成物的形式投與。
在一個實施例中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係以包含醫藥學上可接受之添加劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組成物的形式投與，以抑制由會導致ROS1激酶活性組成性活化之染色體重排產生之致癌性融合激酶，包括孤兒受體酪胺酸激酶ROS1。使用式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽靶向此等ROS1融合激酶以便抑制。此等化合物可以包含醫藥學上可接受之添加劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組成物的形式投與以治療肺腺癌，例如存在一或多種致癌性ROS1融合激酶之非小細胞肺癌。
在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制一或多種非小細胞肺癌或NSCLC細胞系中之ROS1激酶及/或ROS1融合激酶活性的方法，該方法包括向該等存在ROS1激酶及/或ROS1融合多肽之非小細胞肺癌或NSCLC細胞系投與治療有效量之包含式I化合物或式I化合物之蘋果 酸鹽或式I化合物之另一醫藥學上可接受之鹽的醫藥組成物。
在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測、診斷及治療ROS1融合陽性NSCLC之方法，例如SLC34A2-ROS1融合陽性NSCLC及其他已知ROS1融合陽性NSCLC(包括ROS1融合CD74-ROS1、FIG-ROS1、FIG-ROS1(L)、FIG-ROS1(S)及FIG-ROS1(VL))及人類染色體6上之ROS1基因所編碼之其他ROS1融合蛋白(參見：Bergethon K,Shaw AT,Ou SH,Katayama R,Lovly CM,McDonald NT,Massion PP,Siwak-Tapp C,Gonzalez A,Fang R,Mark EJ,Batten JM,Chen H,Wilner KD,Kwak EL,Clark JW,Carbone DP,Ji H,Engelman JA,Mino-Kenudson M,Pao W,Iafrate AJ.ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers.J Clin Oncol.2012年3月10日；30(8)：863-70)，該方法包括向需要該治療之患者投與治療有效量之包含式I化合物或式I化合物之蘋果酸鹽或式I化合物之另一醫藥學上可接受之鹽的醫藥組成物。在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或化合物1之蘋果酸鹽，尤其是化合物1之S-蘋果酸鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療需要治療之患者之肺腺癌的方法，該肺腺癌為SLC34A2-ROS1融合陽性非小細胞肺癌，該方法包括向該患者投與有效量之化合物1：
或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療需要治療之患者之肺腺 癌的方法，該肺腺癌為CD74-ROS1融合陽性非小細胞肺癌，該方法包括向該患者投與有效量之化合物1：
或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療需要治療之患者之肺腺癌的方法，該肺腺癌為FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌，該方法包括向該患者投與有效量之化合物1：
或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一態樣中，本發明提供一種用於抑制NSCLC細胞中之ROS1融合激酶活性的方法，該方法包括使該細胞與有效量之式I化合物接觸：
或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；R3為(C1-C6)烷基；R4為(C1-C6)烷基；且Q為CH或N。
圖1描繪已知存在於非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤樣品中之ROS1融合蛋白的圖示。ROS1在NSCLC、膠質母細胞瘤及膽管癌中重排。CD74(L)/(S)，分化簇74，長/短同功異形體；EZR，埃茲蛋白(ezrin)；FIG，融合於膠質母細胞瘤中；LRIG3，富白胺酸重複序列及免疫球蛋白樣結構域3；ROS1 TK，具有融合搭配物之ROS1酪胺酸激酶域；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；SLC34A2(L)/(S)，溶質載體家族34(磷酸鈉)，成員2，長/短同功異形體；SDC4，肝素硫酸蛋白醣-4；TPM3，原肌球蛋白3。外顯子編號E32、E34、E35或E36指示ROS1之斷裂點。紅框表示保留在ROS1中之跨膜域。
圖2描繪對已投與單次遞增劑量之化合物1或3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-呱啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼；XALKORI®)的HCC-78 NSCLC細胞中之生體外SLC34A2-ROS1融合磷酸化的抑制。
圖3為本文中表示為SEQ ID NO：1之例示性人類ROS1蛋白的胺基酸序列。
圖4為本文中表示為SEQ ID NO：2之人類ROS1激酶域的例示性胺基酸序列。
縮寫及定義
貫穿本申請案，以下縮寫及術語具有所指示之含義。
符號「-」意謂單鍵；「=」意謂雙鍵。
當描繪或描述化學結構時，除非另外明確陳述，否則假定所有碳均具有氫取代以符合4價。舉例而言，在以下示意圖之左手側的結構中，隱含9個氫。該9個氫描繪於右手側結構中。有時，結構中之特定原子在文本化學式中描述為一或多個氫(明確限定之氫)經取代，例如-CH2CH2-。熟習此項技術者應理解，上述描述性技術在化學技術中通常用於提供複雜結構之簡要及簡單描述。
若基團「R」描繪為「浮」於環系統上，例如，如以下化學式中： 則除非另外定義，否則取代基「R」可駐留於該環系統之任何原子上，呈置換來自環原子之一的所描繪之氫、所隱含之氫或明確限定之氫的形式，只要形成穩定結構即可。
若基團「R」描繪為浮於稠合環系統上，例如，如以下化學式中： 或較 則除非另外定義，否則取代基「R」可駐留於該稠合環系統之任何原子上，呈置換來自環原子之一的所描繪之氫(例如以上化學式中 之-NH-)、所隱含之氫(例如，如在以上化學式中，其中氫並未示出但應理解為存在)或明確限定之氫(例如在以上化學式之情況下，「Z」等於=CH-)的形式，只要形成穩定結構即可。在所描繪之實例中，「R」基團可駐留於稠合環系統之5員或6員環上。當基團「R」描繪為存在於含有飽和碳之環系統上時，例如，如以下化學式中： 其中在此實例中，「y」可大於1，呈各自置換該環上之當前描繪、隱含或明確限定之氫；則除非另外定義，否則在所得結構穩定之情況下，兩個「R」可駐留於同一碳上。一簡單實例為當R為甲基時，所描繪之環的碳(「環」碳)上可存在偕二甲基。在另一實例中，同一碳上之兩個R，包括該碳，可形成環，因而與所描繪之環產生螺環狀環(「螺環基」)結構，例如，如以下化學式中：
「鹵素」或「鹵基」係指氟、氯、溴或碘。
如本文中所使用，「ROS1」蛋白或多肽包括哺乳動物ROS1，例如，人類ROS1激酶蛋白(由ROS1基因編碼)，其為容易異常表現從而導致癌症之2347個胺基酸長的受體酪胺酸激酶。全長人類ROS1激酶(具有人類ROS1蛋白之胺基酸序列)之描述可見於UniProt登錄號P08922。另外，ROS1存在多種天然存在之已知變異體(參見例如Greenman等人，Nature 446：153-158,2007)。鼠類全長ROS1之核苷酸及胺基酸序列為已知的(參見例如UniProt登錄號Q78DX7)。使用常規實驗，一般熟練生物學家將能夠容易地確定非人類哺乳動物ROS1同系物中之相應序列。
「野生型」ROS1意謂正常個體(例如，未罹患癌症之正常個體)之健康(或正常)組織(例如，非癌組織)中之全長ROS1激酶(亦即，對 於人類ROS1而言為移除信號肽序列之後的2347個胺基酸長的多肽(SEQ ID NO：1)或2320個胺基酸長的多肽(成熟序列))的表現及/或活化。ROS1激酶(全長或截短)不像會表現於人類之正常肺組織中。然而，使用下文所描述之方法，發明者已作出如下令人驚訝之發現：使用本文中所描述之化合物特異性抑制肺癌細胞中之ROS1激酶。此種未見典型細胞(例如非癌肺細胞)中之表現的非典型細胞(在此情況下為癌細胞)中之表現為異常的。
已報導膠質母細胞瘤中(參見Charest等人，Charest等人，Genes Chromosomes Cancer 37：58-71,2003；Charest等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：916-921,2003)、肝癌中(參見例如PCT公開案第WO2010/093928號)、膽管癌中(參見Gu等人，PLOS one 2011年6月6日；6(1)：e15640.doi：10.1371/journal.pone.0015640)及NSCLC腺癌中(參見Kurtis D.Davies等人，Identifying and Targeting ROS1 Gene Fusions in Non-Small Cel1 Lung Cancer,Clin Cancer Res.2012年9月1日；18(17)：4570-4579)存在呈與另一蛋白質(例如SLC34A2、CD74或FIG)融合形式之異常表現之ROS1激酶。
如本文中所使用，術語「ROS1融合」係指ROS1多肽中包含ROS1蛋白(或編碼其之多肽)之激酶域的部分與另一多肽(或編碼其之聚核苷酸)之整體或部分融合，其中該第二多肽或聚核苷酸之名稱於融合中指定。(術語「融合」單純意謂來自第一基因之多肽或聚核苷酸之整體或部分與來自第二基因之多肽或聚核苷酸之整體或部分融合)。舉例而言，SLC34A2-ROS1融合為SLC34A2多肽(或編碼其之聚核苷酸)之部分與ROS1多肽(或編碼其之聚核苷酸)中包含激酶域ROS1之部分之間的融合。ROS1融合通常由染色體移位或逆位造成。存在許多種已知ROS1融合，其中全部為本發明之ROS1融合且包括而不限於：SLC34A2-ROS1融合蛋白，其成員包括SLC34A2-ROS1(VS)、 SLC34A2-ROS1(S)、SLC34A2-ROS1(L)(參見美國專利申請案第20100143918號)；CD74-ROS1(參見美國專利申請案第20100221737號)；及FIG-ROS1融合蛋白，其成員包括FIG-ROS1(S)、FIG-ROS1(L)及FIG-ROS1(XL)(參見PCT公開案第WO2010/093928號)，該等文獻之揭示內容各自以全文引用之方式併入本文中。在ROS1多肽或ROS1融合後指出(L)、(S)、(VS)、(VL)、(XS)或(XL)一般分別係指長、短、極短、極長、超短及超長ROS1多肽或聚核苷酸。
所有已知ROS1融合蛋白均包含全長ROS1之完整激酶域。因而，如本文中所使用，「有ROS1激酶活性之多肽」(或「具有ROS1激酶活性之多肽」)意謂包括全長ROS1蛋白之完整激酶域且因而保留ROS1激酶活性的蛋白質(或多肽)。有ROS1激酶活性之蛋白質的非限制性實例包括而不限於全長ROS1蛋白；SLC34A2-ROS1融合蛋白，其成員包括SLC34A2-ROS1(VS)、SLC34A2-ROS1(S)、SLC34A2-ROS1(L)(參見美國專利公開案第20100143918號)；CD74-ROS1(參見美國專利公開案第20100221737號)；及FIG-ROS1融合蛋白，其成員包括FIG-ROS1(S)、FIG-ROS1(L)及FIG-ROS1(XL)(參見PCT公開案第WO2010/093928號)；及保留全長ROS1激酶蛋白之激酶域的任何截短或突變形式之ROS1激酶。例示性ROS1之激酶域闡述於SEQ ID NO：2中，故「有ROS1激酶活性之多肽」為胺基酸序列包含SEQ ID NO：2的多肽，或其激酶活性部分。
如本文中所使用，「多肽」(或「胺基酸序列」或「蛋白質」)係指較佳由a-胺基酸、D-胺基酸、L-胺基酸及其組合按限定之順序連接而形成的聚合物。一個胺基酸殘基與下一胺基酸殘基之間的連接稱為醯胺鍵或肽鍵。多肽之非限制性實例包括寡肽、肽、多肽或蛋白質序列及其片段或部分以及天然存在或合成之分子。多肽亦包括衍生之分子，諸如糖蛋白及脂蛋白以及較低分子量多肽。「胺基酸序列」及類 似術語，諸如「多肽」或「蛋白質」，不欲所指示之胺基酸序列侷限於與所述蛋白質分子相關之完整天然胺基酸序列。
此項技術中應認識到，可改變本發明多肽之一些胺基酸序列而不顯著影響突變蛋白質之結構或功能。若涵蓋該等序列差異，則應想到蛋白質上應存在能決定活性之重要區域(例如，ROS1之激酶域)。一般而言，有可能置換會形成三級結構之殘基，條件為使用執行類似功能之殘基。在其他情況下，若改變發生在蛋白質之非重要區域，則殘基類型可能完全不重要。
因而，本發明之有ROS1活性之多肽進一步包括本文中所描述之全長ROS1蛋白或各種ROS1融合多肽之顯示實質性ROS1激酶活性之變異體。一些非限制性保守取代包括脂族胺基酸Ala、Val、Leu及Ile之間彼此交換；羥基殘基Ser與Thr交換；酸性殘基Asp與Glu交換；醯胺殘基Asn與Gln交換；鹼性殘基Lys與Arg交換；及芳族殘基Phe與Tyr交換。熟習此項技術者已知的保守胺基酸取代之其他實例為：芳族：苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸(例如，以苯丙胺酸置換色胺酸殘基)；疏水性：白胺酸、異白胺酸、纈胺酸；極性：麩醯胺酸、天冬醯胺酸；鹼性：精胺酸、離胺酸、組胺酸；酸性：天冬胺酸、麩胺酸；小型：丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸。如上文詳細指示，關於胺基酸變化可能為表現型沈默型(亦即，不可能對功能具有顯著不利影響)之進一步指導可見於以下文獻中：Bowie等人，Science 247,同上。
「SLC34A2」可能係指由人類SLC34A2基因蛋白或SLC34A2基因編碼之鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白2B。人類SLC34A2蛋白(同功異形體A，其NCBI登錄號為NP_001171469)為689個胺基酸之蛋白質。SLC34A2進一步描述於本文中。
CD74亦稱為HLA II類組織相容性抗原γ鏈，亦稱為HLA-DR抗原 相關不變鏈或CD74(分化簇74)，其為由CD74基因編碼之人類蛋白質。說明性人類CD74蛋白之NCBI登錄號為NP_001020329且mRNA登錄號為NM_001025158。CD74具有160個胺基酸且係由位於染色體5上之CD74基因(5q32)編碼。CD74具有9個外顯子。CD74進一步描述於本文中。
FIG(融合於膠質母細胞瘤中)亦稱為「含有高爾基體相關PDZ及捲曲螺旋基元」或「GOPC」蛋白，其係由位於染色體6上6q21處之基因編碼。此人類蛋白質具有462個胺基酸。FIG具有由交替剪接產生之3種同功異形體。本發明中所提及之例示性人類FIG蛋白之UniProtKB識別號為Q9HD26-1。
「SLC34A2-ROS1融合蛋白或基因」係指搭配物SLC34A2與ROS1之體細胞基因融合。在一些實施例中，SLC34A2-ROS1融合蛋白包括諸如SLC34A2之融合搭配物之N末端結構域及ROS1蛋白之C末端激酶域。融合搭配物之N末端結構域可位於融合蛋白質之N末端，且ROS1蛋白之C末端激酶域可位於融合蛋白質之C末端。融合搭配物可為位於融合蛋白質N末端之SLC34A2蛋白N末端結構域。在此情況下，融合蛋白質可表示為包括處於N末端之SLC34A2蛋白N末端結構域及處於C末端之ROS1蛋白C末端激酶域的SLC34A2-ROS1蛋白。另一實施例提供一種編碼融合蛋白質之融合基因，其中編碼融合搭配物N末端結構域之基因位於5'端，且編碼ROS1蛋白C末端激酶域之基因位於3'端。在一些實施例中，SLC34A2蛋白之部分與ROS1蛋白中包含功能激酶域之部分由於在SLC34A2存在下產生ROS1染色體重排之異常染色體移位而同框融合。在一些實施例中，SLC34A2-ROS1融合蛋白可包括融合SLC34A2外顯子4-ROS1外顯子32。在一些實施例中，SLC34A2-ROS1融合蛋白可包括融合SLC34A2外顯子4-ROS1外顯子34。如本發明中所使用之具有功能ROS1激酶域之SLC34A2-ROS1融 合蛋白或基因可含有涉及兩種移位搭配物SLC34A2及ROS1之其他斷裂點。例示性SLC34A2-ROS1融合蛋白可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下，其內容係以全文引用之方式併入本文中。
「CD74-ROS1融合蛋白或基因」係指搭配物CD74與ROS1之體細胞基因融合。例示性CD74-ROS1融合蛋白可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下，其內容係以全文引用之方式併入本文中。
「FIG-ROS1融合蛋白或基因」係指搭配物FIG與ROS1之體細胞基因融合。在一些實施例中，人類染色體6上位置6q21處240千鹼基之染色體內純合子缺失負責形成FIG-ROS1基因座。在一些實施例中，FIG-ROS1轉錄物係由7個FIG外顯子及9個ROS1衍生之外顯子編碼。在一些實施例中，FIG-ROS1基因編碼具有組成活性及功能性ROS1激酶域之同框融合蛋白質。例示性FIG-ROS1融合蛋白可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下，其內容係以全文引用之方式併入本文中。
出於本發明之目的，「患者」包括人類及其他動物，尤其是哺乳動物，及其他生物體。因而，該等方法適用於人類療法及獸醫應用兩者。在另一實施例中，患者為哺乳動物，而在另一實施例中，患者為人類。
化合物之「醫藥學上可接受之鹽」意謂在醫藥學上可接受且具有母體化合物之所要藥理學活性的鹽。應理解，醫藥學上可接受之鹽為無毒的。關於適合之醫藥學上可接受之鹽的其他資訊可見於以下文 獻中：Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company,Easton,PA,1985，其係以引用之方式併入本文中；或S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」J.Pharm.Sci.,1977；66：1-19，兩者均以引用之方式併入本文中。
醫藥學上可接受之酸加成鹽之實例包括與以下諸酸形成之鹽：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物；以及有機酸，諸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、草酸、馬來酸、丙二酸、丁二酸、富馬酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、3-(4-羥基苯甲醯)苯甲酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡糖庚酸、4,4'-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三級丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸、對甲苯磺酸及水楊酸及其類似物。
「前藥」係指經生體內轉化(典型地很快)，例如藉由在血液中水解而產生具有上述化學式之母體化合物的化合物。常見實例包括但不限於具有攜帶甲酸部分之活性形式之化合物之酯及醯胺形式。本發明化合物之醫藥學上可接受之酯的實例包括但不限於烷基酯(例如具有介於約1個與約6個碳之間)，該烷基為直鏈或支鏈。可接受之酯亦包括環烷基酯及芳基烷基酯，諸如但不限於苯甲基。本發明化合物之醫藥學上可接受之醯胺的實例包括但不限於一級醯胺以及二級及三級烷基醯胺(例如具有介於約1個與約6個碳之間)。本發明化合物之醯胺及酯可根據習知方法製備。前藥之詳盡論述提供於以下文獻中：T.Higuchi及V.Stella,「Pro-drugs as Novel Delivery Systems」,A.C.S.專題論文系列第14卷；及Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche編，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987，兩者均出於所有目的以引用之方式併入本文中。
「ROS1」或「ROS1蛋白」為跨膜受體酪胺酸激酶且進一步描述於本文中。
「治療有效量」係指當投與患者時可改善疾病之症狀的本發明化合物之量。治療有效量意欲包括能有效地調節c-Met及/或VEGFR2或有效地治療或預防癌症的單獨或與其他活性成分組合之化合物之量。構成「治療有效量」之本發明化合物之量將視化合物、疾病狀態及其嚴重程度、欲治療之患者之年齡及其類似因素而變化。治療有效量可由熟習此項技術者考慮其知識及本發明來決定。
如本文中所使用之「治療」疾病、病症或症候群包括：(i)預防人類中出現該疾病、病症或症候群，亦即，使該疾病、病症或、症候群之臨床症狀不會在可能曝露於或易感染該疾病、病症或症候群但尚未經歷或顯示該疾病、病症或症候群之症狀的動物中發展；(ii)逆轉或抑制該疾病、病症或症候群，亦即，阻止其發展；及(iii)減輕該疾病、病症或症候群，亦即，使該疾病、病症或症候群退行。如此項技術中已知，調節全身與局部遞送、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、藥物相互作用及病狀嚴重程度可能為必需的，並且將可利用常規經驗確定。
本文中所描述之各反應之「產率」表示為理論產量之百分比。
實施例
在一個實施例中，式I化合物為式Ia之化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；且Q為CH或N。
在另一實施例中，式I化合物為化合物1：
或其醫藥學上可接受之鹽。如先前所指示，化合物1在本文中稱為N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺。以全文引用之方式併入本文中之WO 2005/030140揭示化合物1且描述如何製造該化合物(WO 2005/030140，實例12、實例37、實例38及實例48)，並且亦揭示此化合物抑制、調控及/或調節激酶之信號轉導的治療活性(WO 2005/030140，檢定，表4，表值289)。實例48基於WO 2005/030140中之第[0353]段。
在其他實施例中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係作為醫藥組成物投與，其中該醫藥組成物另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。在一特定實施例中，式I化 合物為化合物1。
如本文中所描述之式I化合物、式Ia化合物及化合物I包括所述化合物以及個別異構體及異構體混合物。在各情況下，式I化合物包括所述化合物之醫藥學上可接受之鹽、水合物及/或溶劑合物及其任何個別異構體或異構體混合物。
在其他實施例中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1可為(L)-蘋果酸鹽。式I化合物及化合物1之蘋果酸鹽揭示於PCT/US2010/021194及USSN 61/325095中，兩者均以全文引用之方式併入本文中。
在其他實施例中，式I化合物為(D)-蘋果酸鹽，其亦稱為R-蘋果酸鹽。
在其他實施例中，式Ia化合物為蘋果酸鹽。
在其他實施例中，式Ia化合物為(L)-蘋果酸鹽，其亦稱為S-蘋果酸鹽。
在其他實施例中，化合物1為(D)-蘋果酸鹽，其亦稱為S-蘋果酸鹽。
在其他實施例中，化合物1為蘋果酸鹽。
在其他實施例中，化合物1為(L)-蘋果酸鹽，其亦稱為S-蘋果酸鹽。
在另一實施例中，蘋果酸鹽呈如美國專利申請案序列號61/325095中所揭示之化合物1之(L)蘋果酸鹽及/或(D)蘋果酸鹽之結晶N-1形式或N-2形式。關於結晶對映異構體(包括化合物1之蘋果酸鹽之N-1及/或N-2結晶形式)之性質，亦參見WO 2008/083319，該文獻係以全文引用之方式併入。製造及表徵該等形式之方法充分描述於PCT/US10/021194中，該文獻係以全文引用之方式併入本文中。
在另一實施例中，本發明係針對一種用於逆轉或抑制NSCLC之方法，在本文中所揭示之任何實施例中，該方法包括向需要該治療之 患者投與治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明係針對一種用於逆轉或抑制SLC34A2-ROS1融合陽性NSCLC之方法，在本文中所揭示之任何實施例中，該方法包括向需要該治療之患者投與治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明係針對一種用於逆轉或抑制CD74-ROS1融合陽性NSCLC之方法，在本文中所揭示之任何實施例中，該方法包括向需要該治療之患者投與治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，本發明係針對一種用於逆轉或抑制FIG-ROS1融合陽性NSCLC之方法，在本文中所揭示之任何實施例中，該方法包括向需要該治療之患者投與治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在一或多種其他治療之前、同時或之後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在一或多種治療之後投與。「治療」意謂熟習此項技術者可利用之治療選項中之任一項，包括手術、化學治療劑、激素療法、抗體、免疫療法、放射性碘療法及輻射。特定言之，「治療」意謂另一化學治療劑或抗體。
因而，在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱治療後投與。
在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在多烯 紫杉醇治療後投與。
在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在HER-2抗體治療後投與。在另一實施例中，該HER-2抗體為曲妥珠單抗。
在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。
在另一實施例中，式I化合物、式Ia化合物、化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係以錠劑或膠囊形式每日一次經口投與。在此等及其他實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽為化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為膠囊或錠劑經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有至多100mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有100mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有95mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有90mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有85mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有80mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有75mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式 作為含有70mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有65mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有60mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有55mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有50mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有45mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有40mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有35mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有30mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有25mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有20mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有15mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式作為含有10mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼形式或以蘋果酸鹽形式 作為含有5mg化合物1之膠囊或錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼或蘋果酸鹽形式作為如下表中所提供之錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼或蘋果酸鹽形式作為如下表中所提供之錠劑每日一次經口投與。
在另一實施例中，化合物1係以其游離鹼或蘋果酸鹽形式作為如下表中所提供之錠劑每日一次經口投與。
可根據化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的所要劑量來調節上文所提供之任何錠劑調配物。因而，可按比例調節各調配物成分之量以提供如先前段落中所提供之含有不同量之化合物1的錠劑調配物。在另一實施例中，調配物可含有20、40、60或80mg化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本發明提供一種用於抑制或逆轉哺乳動物中之異常細胞生長之進展的方法，該方法包括投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白質，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質及包含如由人類染色體6(6q22)上之ROS1基因所編碼之功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白質所介導之癌症。在一個實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，肺腺癌為非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為SLC34A2-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為CD74-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係作為包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物投與。在另一實施例中，式I化合物係在另一治療形式之後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱治療後投與。在另一實 施例中，式I化合物係在克唑替尼治療後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式I化合物係在卡鉑定治療後投與。在另一實施例中，式I化合物係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。
在一些實施例中，本發明提供一種用於抑制或逆轉哺乳動物中之異常細胞生長之進展的方法，該方法包括投與式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白質，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質及包含如由人類染色體6(6q22)上之ROS1基因所編碼之功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白質所介導之癌症。在一個實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，肺腺癌為非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為SLC34A2-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為CD74-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係作為包含式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物投與。在另一實施例中，式Ia化合物係在另一治療形式之後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物係在 多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物係在克唑替尼治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，式Ia化合物或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。
在其他實施例中，本發明提供一種用於抑制或逆轉哺乳動物中之異常細胞生長之進展的方法，該方法包括投與化合物1或其醫藥學上可接受之鹽，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白質，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質及包含如由人類染色體6(6q22)上之ROS1基因所編碼之功能C末端ROS1激酶域的其他ROS1融合蛋白質所介導之癌症。在一個實施例中，癌症為肺腺癌。在另一實施例中，肺腺癌為非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為SLC34A2-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為CD74-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，肺腺癌為ROS1融合陽性非小細胞肺癌。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係作為包含化合 物1或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物投與。在另一實施例中，化合物1係在另一治療形式之後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在卡鉑定及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。在另一實施例中，化合物1或其醫藥學上可接受之鹽係在克唑替尼及/或卡鉑定治療後投與。
在另一實施例中，本發明提供一種用於預防、治療、抑制或逆轉哺乳動物哺乳動物中之異常細胞生長之進展的方法，該方法包括投與化合物1或其醫藥學上可接受之鹽，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白質，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質或其他ROS1融合蛋白質所介導之癌症，其中該癌症先前已用克唑替尼及/或卡鉑定治療方案 加以治療且因此具有抗克唑替尼及/或卡鉑定性。在一些實施例中，抗克唑替尼及/或卡鉑定性癌症攜帶一或多種選自以下之ROS1融合蛋白質：SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質，及/或在SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質或FIG-ROS1(VL)融合蛋白質之ROS1激酶域中含有突變。在一個實施例中，抗克唑替尼及/或卡鉑定性癌症為在CD74-ROS1融合蛋白質之ROS1激酶域中具有突變的癌症。在一相關實施例中，該癌症為克唑替尼難治性CD74-ROS1融合陽性肺腺癌，例如在ROS1激酶域中攜帶突變之克唑替尼難治性CD74-ROS1融合陽性NSCLC。在另一實施例中，抗克唑替尼及/或卡鉑定性癌症為癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如在CD74-ROS1融合蛋白之ROS1激酶域中攜帶選自E1990G、G2032R、L2026M、L1951R、M2128V、K2003I及其組合之突變的抗克唑替尼性NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供一種用於預防、治療、抑制或逆轉哺乳動物哺乳動物中之異常細胞生長(例如癌症)之進展的方法，該方法包括投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白質，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質、FIG-ROS1(VL)融合蛋白質或其他ROS1融合蛋白質所介導之癌症，其中該癌症先前已用克唑替尼及/或卡鉑定治療方案加以治療且因此具有抗克唑替尼及/或卡鉑定性。在一些實施例中，抗克唑替尼及/或卡鉑定性癌症攜帶一或多種選自以下之ROS1融合蛋白質：SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG- ROS1(S)融合蛋白質及FIG-ROS1(VL)融合蛋白質，及/或在SLC34A2-ROS1融合蛋白質、CD74-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1融合蛋白質、FIG-ROS1(L)融合蛋白質、FIG-ROS1(S)融合蛋白質或FIG-ROS1(VL)融合蛋白質之ROS1激酶域中含有突變。在一個實施例中，抗克唑替尼性癌症為在CD74-ROS1融合蛋白質之ROS1激酶域中具有突變的癌症。在一相關實施例中，該癌症為克唑替尼難治性CD74-ROS1融合陽性肺腺癌，例如在ROS1激酶域中攜帶突變之克唑替尼難治性CD74-ROS1融合陽性NSCLC。在另一實施例中，抗克唑替尼性癌症為癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如在CD74-ROS1融合蛋白之ROS1激酶域中攜帶選自E1990G、G2032R、L2026M、L1951R、M2128V、K2003I及其組合之突變的抗克唑替尼性NSCLC。在上述各種實施例中，用於預防、治療、抑制或逆轉哺乳動物哺乳動物中之異常細胞生長之進展的方法包括向需要其之患者投與式I化合物或式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽，例示性治療有效劑量在以下範圍內：約0.01mg/kg至約100mg/kg、或約0.1mg/kg至約75mg/kg、或約0.1mg/kg至約50mg/kg、或約0.1mg/kg至約40mg/kg、或約0.1mg/kg至約30mg/kg、或約0.1mg/kg至約20mg/kg、或約0.1mg/kg至約15mg/kg、或約0.1mg/kg至約10mg/kg、或約0.1mg/kg至約5mg/kg、或約0.1mg/kg至約1mg/kg，其中該異常細胞生長為由ROS1融合蛋白，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白介導之癌症；或在ROS1融合蛋白中攜帶一或多個突變，例如SLC34A2-ROS1融合蛋白、CD74-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1融合蛋白、FIG-ROS1(L)融合蛋白、FIG-ROS1(S)融合蛋白、FIG-ROS1(VL)融合蛋白或其他ROS1融合蛋白之中ROS1激酶域中之突變的癌症，在一些實施例中，包括先前已用克 唑替尼及/或卡鉑定治療方案加以治療且具有抗克唑替尼及/或卡鉑定性之癌症，例如抗克唑替尼性癌症，例如抗克唑替尼性肺腺癌，例如抗克唑替尼性NSCLC。
投與
呈純形式或呈適當醫藥組成物形式之式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽的投與可經由任何接受之投與模式或用於提供類似效用之藥劑來進行。因而，投與可為例如經口、經鼻、非經腸(靜脈內、肌肉內或皮下)、局部、經皮、陰道內、膀胱內、腦池內或直腸，呈固體、半固體、凍乾粉末或液體劑型，諸如錠劑、栓劑、丸劑、軟彈性及硬明膠劑型(其可呈膠囊或錠劑形式)、粉劑、溶液、懸浮液或氣霧劑或其類似形式，特定言之，呈適合於簡單投與精確劑量之單位劑型。
組成物將包括習知醫藥載劑或賦形劑及作為活性劑之式I化合物，且另外可包括載劑及佐劑等。
佐劑包括防腐劑、潤濕劑、懸浮劑、甜味劑、調味劑、芳香劑、乳化劑及分散劑。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物來確保防止微生物活動。亦可能需要包括等張劑，例如糖、氯化鈉及其類似物。可藉由使用延遲吸收之藥劑，例如單硬脂酸鋁及明膠來實現可注射醫藥形式之長期吸收。
若需要，則式I化合物之醫藥組成物亦可含有微量輔助物質，諸如潤濕或乳化劑、pH值緩衝劑、抗氧化劑及其類似物，諸如檸檬酸、去水山梨醇單硬脂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。
組成物之選擇視各種因素而定，諸如藥物投與模式(例如，對於經口投與，呈錠劑、丸劑或膠囊形式之組成物)及藥品物質之生物可用率。最近，已基於可藉由增加表面積，亦即降低粒度來增加生物可 用率之原理開發出醫藥組成物，尤其是對於顯示不良生物可用率之藥物。舉例而言，美國專利第4,107,288號描述一種具有粒度在10至1,000nm範圍內之顆粒的醫藥組成物，其中活性物質係負載於大分子交聯基質上。美國專利第5,145,684號描述醫藥組成物之製造，其中在表面改質劑存在下將藥品物質粉碎成奈米顆粒(平均粒度為400nm)且隨後分散於液體介質中，以得到展現相當高之生物可用率的醫藥組成物。
適合於非經腸注射之組成物可包含生理學上可接受之無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，及用於復原成無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。適合之水性及非水性載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑之實例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油及其類似物)、其適合之混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯，諸如油酸乙酯。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用介面活性劑來維持適當流動性。
一種特定投與途徑為使用可根據欲治療之疾病狀態之嚴重程度加以調節之適宜每日劑量方案經口投與。
用於經口投與之固體劑型包括膠囊、錠劑、丸劑、粉劑及顆粒。在該等固體劑型中，將活性化合物與至少一種惰性慣用賦形劑(或載劑)混合，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣或(a)填充劑或增量劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及矽酸；(b)黏合劑，例如纖維素衍生物、澱粉、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及阿拉伯膠；(c)濕潤劑，例如甘油；(d)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、交聯接甲基纖維素鈉、複合矽酸鹽及碳酸鈉；(e)溶解延遲劑，例如石蠟；(f)吸收促進劑，例如季銨化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇及單硬脂酸甘油酯、硬脂酸鎂及其類似物；(h)吸附劑，例如高嶺土及膨潤土；及(i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬 脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉或其混合物。在膠囊、錠劑及丸劑之情況下，所述劑型亦可包含緩衝劑。
如上文所描述之固體劑型可製備有包衣及外殼，諸如腸溶衣及此項技術中眾所周知的其他包衣及外殼。其可含有鎮靜劑，且亦可具有使其在腸道之某一部分中以延遲方式釋放活性化合物之組成。可使用之包埋組成物之實例為聚合物質及蠟。活性化合物亦可呈微囊封形式，在適當時含一或多種上述賦形劑。
用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。該等劑型係例如藉由在以下各物中對式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及可選醫藥佐劑進行溶解、分散等操作來製備：載劑，諸如水、生理鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇及其類似物；增溶劑及乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺；油劑，特定言之，棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及去水山梨醇脂肪酸酯；或此等物質之混合物及其類似物，從而形成溶液或懸浮液。
除活性化合物以外，懸浮液可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇酯及聚氧化乙烯去水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃蓍膠或此等物質之混合物及其類似物。
用於經直腸投與之組成物為例如栓劑，其可藉由將式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與例如適合之無刺激賦形劑或載劑(諸如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來製備，該等賦形劑或載劑在常溫下為固體但在體溫下為液體且因此當處於適合之體腔中時熔融並在其中釋放活性組分。
用於局部投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽的劑型包括軟 膏、粉劑、噴霧及吸入劑。在可能需要時，在無菌條件下將活性成分與生理學上可接受之載劑及任何防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。亦涵蓋處於本揭示案範疇內之眼用組成物、眼用軟膏、粉劑及溶液。
可使用壓縮氣體來分散式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，呈氣霧劑形式。適用於此目的之惰性氣體為氮氣、二氧化碳等。
一般而言，視預定施用模式而定，醫藥學上可接受之組成物將含有以重量計約1%至約99%之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及以重量計99%至1%之適合醫藥賦形劑。在一個實例中，該組成物將為以重量計介於約5%與約75%之間的式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽，其餘為適合之醫藥賦形劑。
製備該等劑型之實際方法對於熟習此項技術者為已知的，或將顯而易見；例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990)。欲投與之組成物在任何情況下將含有治療有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以便根據本揭示案之教示來治療疾病狀態。
本揭示案之化合物或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物係以治療有效量投與，該治療有效量將視多種因素而變化，包括所用特定化合物之活性、化合物之代謝穩定性及及作用時長、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與模式及時間、排泄速率、藥物組合、特定疾病狀態之嚴重程度及主體正經歷之療法。式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽可以在每天約0.1至約1,000mg範圍內之劑量水準投與患者。對於體重為約70公斤之正常成人，在每天每公斤體重約0.01至約100mg範圍內之劑量為一實例。然而，所使用之特定劑量可變化。舉例而言，劑量可取決於許多因素，包括患者之要求、正在治療之病狀的嚴重程度及所使用之化合物的藥理學活性。針對特定患者確定最佳劑量對於熟習此項技術者為熟知的。
在其他實施例中，式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽可與其他癌症治療同時投與患者。該等治療尤其包括其他癌症化學治療劑、激素替代療法、放射療法或免疫療法。其他療法之選擇將視許多因素而定，包括化合物之代謝穩定性及作用時長、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與模式及時間、排泄速率、藥物組合、特定疾病狀態之嚴重程度及主體正經歷之療法。
在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測、診斷及治療諸如SLC34A2-ROS1融合陽性NSCLC、CD74-ROS1融合陽性NSCLC及FIG-ROS1融合陽性NSCLC以及其他ROS1融合陽性NSCLC之ROS1融合相關疾病之方法。吾等在此更詳細地描述用於偵測及診斷該等病症之方法。可藉由向已鑒別或診斷為患有諸如SLC34A2-ROS1融合陽性NSCLC、CD74-ROS1融合陽性NSCLC及FIG-ROS1融合陽性NSCLC之ROS1融合相關疾病的患者投與治療有效量之包含式I化合物或式I化合物之蘋果酸鹽或式I化合物之另一醫藥學上可接受之鹽(包括在一特定實施例中，式I化合物為化合物1或化合物1之蘋果酸鹽)的醫藥組成物來更好地實現治療此等病症。
在另一態樣中，式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽係投與患者用於預防或治療肺癌。在一些此等實施例中，該方法包括向需要其之患者投與包含至少一種針對ROS1融合蛋白質之抑制劑、至少一種針對編碼該融合蛋白質之ROS1融合基因的抑制劑、至少一種針對ROS1編碼基因之抑制劑或其組合作為活性成分的組成物。
ROS1與融合搭配物SLC34A2、CD74及FIG
下文描述ROS1蛋白、SLC34A2蛋白、CD74蛋白及FIG蛋白、SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合或有時簡稱為「ROS1融合蛋白質及核酸」，包括偵測方法、診斷方法、用於偵測及診斷之套組、篩選方法、用於肺癌患者之治療及預防方法以及各種 療法、用於量測治療有效性之方法及可與各種治療組合使用之其他醫藥成分。
ROS1蛋白為孤兒跨膜受體酪胺酸激酶。人類ROS1激酶蛋白(由ROS1基因編碼)為2347個胺基酸長的受體酪胺酸激酶，其傾向於異常表現，從而導致癌症。全長人類ROS1激酶(具有人類ROS1蛋白之胺基酸序列)之描述可見於UniProt登錄號P08922(E.C.-2.7.10.1)。如表1中所示，ROS1之信號肽、細胞外域、跨膜域及激酶域見於SEQ ID NO：1中之以下胺基酸殘基處。
人類ROS1蛋白可由位於人類染色體6上之人類ROS1基因編碼。ROS1蛋白之C末端結構域可包括由ROS1基因之自第31個或第32個或第34個外顯子至最後一個外顯子(例如第32個或第34個外顯子)之聚核苷酸或其片段編碼之胺基酸序列。ROS1蛋白之C末端結構域可包括自第31個或第32個外顯子之起始位置開始的連續至少約100個胺基酸。舉例而言，ROS1蛋白之C末端結構域可包括自第32個外顯子(長形式)或第34個外顯子(短形式)之起始位置至ROS1蛋白之C末端的連續約100至約700個胺基酸、連續約200至約600個胺基酸或連續約250至約500個胺基酸或連續約270至約425個胺基酸或連續約270至約450個胺基酸或連續約475至約625個胺基酸。ROS1蛋白之推定斷裂點為1750或1852-1853 aa(對於SLC34A2-ROS1融合蛋白質及CD74-ROS1融合蛋 白質)及1880-1881 aa(對於FIG-ROS1融合蛋白質)。
在一個例示性實施例中，編碼人類SLC34A2蛋白之人類SLC34A2基因(mRNA NM_001177998)定位於人類染色體4(4p15.2)且含有13個外顯子及約690個胺基酸之胺基酸長度。由此基因編碼之蛋白質為pH值敏感性鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白。缺乏此基因為肺泡微小結石症之一個誘因。對於此基因，已發現編碼兩種不同的同功異形體的三種轉錄變異體。SLC34A2蛋白可源自於哺乳動物，諸如人類。SLC34A2-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括由自SLC34A2基因之第1個外顯子至第12個外顯子或自第1個外顯子至第4個外顯子或自第1個外顯子至第2個外顯子之聚核苷酸編碼的胺基酸序列。SLC34A2基因結構中之此等最後觀測之外顯子具有推定斷裂點429及2076。SLC34A2-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自SLC34A2蛋白之第1個位置開始之連續至少約30至250個胺基酸(亦即，至少自第1個至第250個位置之胺基酸序列或其片段)。SLC34A2-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自SLC34A2蛋白之第1個胺基酸位置開始之連續約30至250個胺基酸、連續約30至225個胺基酸、連續約40至200個胺基酸或連續約40至175個胺基酸。
在一個例示性實施例中，SLC34A2-ROS1融合為人類染色體6與人類染色體4之間涉及ROS1且使ROS1之3'區域與SLC34A2之5'區域融合的染色體移位。使用熟習此項技術者已知及或如本文中所描述之各種方法偵測並驗證融合蛋白質。在一些實施例中，隨後向有需要之患者投與式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於預防或治療肺癌。在一些實施例中，向有需要之患者投與包含至少一種針對SLC34A2-ROS1融合蛋白質之抑制劑、至少一種針對編碼該融合蛋白質之SLC34A2-ROS1融合基因的抑制劑、至少一種針對ROS1編碼基因之抑制劑或其組合作為活性成分的組成物。
在SLC34A2-ROS1融合蛋白質中，融合或融合區可存在於SLC34A2基因與ROS1基因之不同的外顯子之間。許多融合為熟習此項技術者已知的。該等融合之實例包括SLC34A2基因之第2個及/或第4個外顯子與ROS1基因之第32個(長，L)及/或第34個外顯子(短，S)，其稱為融合點或斷裂點。其他ROS1及SLC34A2融合或斷裂點為已知的，且可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。術語「融合區」可能係指融合點周圍之聚核苷酸片段(約10至30個核苷酸)或多肽(約5至30個胺基酸)片段。
CD74-ROS1融合為人類染色體5與人類染色體6之間涉及ROS1且使ROS1之3'區域與CD74之5'區域融合的染色體移位元。使用熟習此項技術者已知及或如本文中所描述之各種方法偵測並驗證融合蛋白質。CD74-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括由自CD74基因之第1個外顯子至第12個外顯子或第1個外顯子至第4個外顯子或自第1個外顯子至第2個外顯子之聚核苷酸編碼的胺基酸序列。CD74-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自CD74蛋白之第1個位置開始之連續至少約30至250個胺基酸(亦即，至少自第1個至第250個位置之胺基酸序列或其片段)。CD74-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自CD74蛋白之第1個胺基酸位置開始之連續約30至250個胺基酸、連續約30至225個胺基酸、連續約40至200個胺基酸或連續約40至210個胺基酸或其片段。
在融合蛋白質中，融合或融合區可存在於CD74基因與ROS1基因之不同的外顯子之間。許多融合為熟習此項技術者已知的。該等CD74-ROS1融合之實例包括CD74基因之第6個外顯子與ROS1基因之第32個或第34個外顯子融合，其稱為融合點或斷裂點。其他ROS1與CD74融合或斷裂點為已知的，且可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68 中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。術語「融合區」可能係指融合點周圍之聚核苷酸片段(約10至30個核苷酸)或多肽(約5至30個胺基酸)片段。
融合蛋白質FIG-ROS1由人類染色體6融合FIG之5'區(aka GOPC)與ROS1之3'區的染色體內缺失產生。已在得自膽管癌及卵巢癌患者之樣品中鑒別FIG-ROS1融合，頻率分別為8.7%及0.5%。可使用熟習此項技術者已知及或如本文中所描述之各種方法偵測並驗證FIG-ROS1融合蛋白質。FIG-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自FIG蛋白之第1個位置開始之連續至少約150至500個胺基酸(亦即，至少自第1個至第500個位置之胺基酸序列或其片段)。FIG-ROS1融合蛋白質之N末端結構域可包括自FIG蛋白之第1個胺基酸位置開始之連續約150至500個胺基酸、連續約200至450個胺基酸、連續約220至425個胺基酸或連續約220至約420個胺基酸或其片段。
在FIG-ROS1融合蛋白質中，融合或融合區域可存在於FIG基因與ROS1基因之不同的外顯子之間。若干FIG-ROS1融合為熟習此項技術者已知的。該等融合之實例包括FIG基因之第4個或第8個外顯子與ROS1基因之第35個或第36個外顯子融合，其稱為融合點或斷裂點。其他ROS1與FIG融合或斷裂點為已知的，且可見於COSMIC，即癌症資料庫v.68中之體細胞突變目錄(cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/)下。術語「融合區」可能係指融合點周圍之聚核苷酸片段(約10至30個核苷酸)或多肽(約5至30個胺基酸)片段。
其他ROS1融合搭配物可包括TPM3、SDC4、EZR及LRIG3，以及本文中詳細描述之SLC34A2、CD74及FIG融合。(參見本文中之圖1及例如Takeuchi K,Soda M,Togashi Y,Suzuki R,Sakata S,Hatano S等人， RET,ROS1 and ALK fusions in lung cancer.Nat Med.2012；及Kurtis D.Davies,Anh T.Le,Mariana F.Theodoro,Margaret C.Skokan,Dara L.Aisner,Eamon M.Berge,Luigi M.Terracciano,Matteo Incarbone,Massimo Roncalli,Federico Cappuzzo,D.Ross Camidge,Marileila Varella-Garcia及Robert C.Doebelet,Identifying and Targeting ROS1 Gene Fusions in Non-Small Cell Lung Cancer,(2012),Clin Cancer Res.2012年9月1日；18(17)：4570-4579，此等關於ROS1融合蛋白質之揭示內容的內容係以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明之ROS1融合蛋白質包含提供功能激酶域之人類ROS1蛋白(例如，如SEQ ID NO.1中所提供之人類ROS1)之C末端結構域，其基本上由自對應於ROS1蛋白之第32個外顯子之起始位置的胺基酸開始且隨後至ROS1蛋白之C末端的連續約50至300個胺基酸組成。
如本文中所使用，外顯子編號係根據由國家衛生研究院(Bethesda，Maryland，USA)所轄國家生物技術資訊中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)分配之外顯子編號進行編號。在一些例示性實施例中，融合蛋白質SLC34A2-ROS1可具有由NCBI鑒別之任何胺基酸序列。DNA分子之核苷酸序列及由DNA分子編碼之蛋白質的胺基酸序列可藉由自動化DNA定序器或自動化肽定序器來測定。與實際序列相比，藉由該等自動化定序手段測定之(核苷酸或胺基酸)序列可包括部分誤差。一般而言，與實際序列相比，藉由自動化定序測定之序列可具有至少約90%、至少20約95%、至少約99%或至少約99.9%之序列一致性。因此，與NCBI鑒定之序列相比，融合蛋白質、融合基因或融合區所具有之胺基酸序列或核苷酸序列可具有至少約90%、至少約95%、至少約99%或至少約99.9%之序列一致性。
出於簡便之目的，以下揭示內容係指ROS1融合蛋白質SLC34A2-ROS1，但亦可適用於本文中所描述之其他ROS1融合蛋白質。在一些實施例中，所例示之SLC34A2-ROS1融合蛋白質可由SLC34A2之80至200個N末端胺基酸殘基及ROS1之至少300個C末端殘基(較佳在300至500個C末端胺基酸殘基範圍內)組成。融合基因具有蛋白質酪胺酸激酶域以及螺旋狀結構域。不希望受任何理論束縛，據信SLC34A2-ROS1融合蛋白質之三級構形誘導同源二聚，此舉將藉由自磷酸化來活化致癌蛋白質酪胺酸激酶域。綜上所述，由於SLC34A2，故SLC34A2-ROS1融合基因可在轉譯之後得以高度表現且隨後二聚。隨後，二聚之ROS1蛋白質酪胺酸激酶域可受到異常刺激，因而促進對致癌途徑之刺激，例如，如ROS1融合相關之NSCLC肺癌中所見。
在偵測到融合後，其將被稱為編碼SLC34A2-ROS1融合蛋白質之SLC34A2-ROS1融合基因。一種提供關於診斷肺癌之資訊的方法，該方法包括在獲自個體之測試樣品中偵測如本文中所描述之融合的步驟。診斷將比較編碼融合蛋白質之融合基因及ROS1之過度表達，與得自未患癌症之個體的標準樣品相比，其中當選擇至少一個要素並在測試樣品中偵測到時，允許將該個體鑒別為任何或所有以下各項：癌症患者、肺癌患者、NSCLC肺癌患者、ROS1融合相關之NSCLC患者及/或SLC34A2-ROS1融合相關之NSCLC患者。
染色體6之缺失、逆位或移位可藉由偵測使用能夠與人類染色體6中之缺失、逆位或移位區雜交(互補結合)的聚核苷酸(探針)及/或能夠偵測人類染色體6之缺失、逆位或移位，例如能夠產生具有連續100至200個核苷酸且包括人類染色體6中之逆位區的聚核苷酸片段的引子配對來偵測。融合蛋白質、融合基因及融合區描述於本文中。在一例示性實施例中，亦可藉由偵測融合蛋白質或融合基因或對應於融合基因之mRNA之存在，例如藉由使用此項技術中已知的及本文中所描述 的ROS1特異性或ROS1融合特異性抗體來偵測融合蛋白質。
融合蛋白質之存在可藉由量測融合蛋白質與特異性結合融合蛋白質之物質(例如抗體或適體)之間的相互作用的一般檢定來偵測。一般檢定可為免疫層析、免疫組織化學染色、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)、酶免疫檢定(EIA)、螢光免疫檢定(FIA)、發光免疫檢定(LIA)、免疫印漬、FACS及其類似檢定。
另外，融合基因或mRNA之存在可使用能夠與該融合基因或mRNA雜交(互補結合)之聚核苷酸，藉由諸如PCR、FISH(螢光原位雜交)及其類似檢定之一般檢定進行偵測。FISH更詳細地描述於下文中。融合基因可藉由使用全轉錄組(RNA)及/或全基因組DNA定序之簡併技術，藉由大規模平行定序技術進行偵測及/或驗證。能夠與融合基因或mRNA雜交之聚核苷酸可為siRNA、寡核苷酸、DNA探針或DNA引子，其可藉由與測試樣品中之融合或截短之基因或轉錄物直接雜交來偵測融合基因或mRNA。
在其他實施例中，本發明之方法中採用螢光原位雜交(FISH)(如Verma等人，Human Chromosomes：A Manual Of Basic Techniques,Pergamon Press,New York,N.Y.(1988)中所描述)。可使用一或多個探針組進行FISH檢定，提供實施例諸如：(1)第一探針組，其為靶向含有ROS1基因之染色體位點(第一染色體位點)的第一探針組；其由經第一螢光物質標記之探針1A及經第二螢光物質標記之探針1B組成；探針1A與第一區互補，該第一區為上述第一染色體位點中之5'區，探針1B與第二區互補，該第二區存在於與上述第一區相距一定距離處且為上述第一染色體位點中之3'區，且當藉由SLC34A2與ROS1基因之間的移位產生SLC34A2-ROS1融合基因時，ROS1基因中之斷裂點位於上述第一區之3'尾部、上述第一區與第二區之間或上述第二區之5'尾部；(2)第二探針組，其為靶向含有SLC34A2基因之染色體位點(第二 染色體位點)的第二探針組；其由經第一螢光物質標記之探針2A及經第二螢光物質標記之探針2B組成；探針2A與第一區互補，該第一區為上述第二染色體位點中之5'區，探針2B與第二區互補，該第二區存在於與上述第一區相距一定距離處且為上述第二染色體位點中之3'區，且當藉由SLC34A2與ROS1基因之間的移位產生SLC34A2-ROS1融合基因時，SLC34A2基因中之斷裂點位於上述第一區之3'尾部、上述第一區與第二區之間或上述第二區之5'尾部；(3)第三探針組，其由上述探針2A及上述探針1B組成；及(4)第四探針組，其由與含有ROS1基因之染色體位點(第三染色體位點)互補的探針4A及與含有SLC34A2基因之染色體位點(第四染色體位點)互補的探針4B組成。
上述第一染色體位點之長度可為0.5-2.0Mb。上述第二染色體位點之長度可為0.5-2.0Mb。上述第三染色體位點之長度可為0.5-2.0Mb。上述第四染色體位點之長度可為0.5-2.0Mb。
在一些實施例中，可將FISH檢定與其他物理染色體定位技術及基因圖資料相關聯。FISH技術為眾所周知的(參見例如美國專利第5,756,696號、第5,447,841號、第5,776,688號及第5,663,319號)。基因圖資料之實例可見於1994 Genome Issue of Science(265：1981f)中。編碼ROS1蛋白之基因及/或在ROS1融合多肽之情況下編碼ROS1融合蛋白質之融合搭配物(例如FIG基因、SLC34A2基因或CD74基因)之基因在物理染色體圖上的位置與特定疾病或特定疾病之素因之間的相關性可有助於確定與該遺傳疾病相關之DNA區域。本發明之核苷酸序列可用於偵測正常個體、攜帶者或受影響個體之間的基因序列差異。
染色體製劑之原位雜交及使用已確定之染色體標記物的物理定位技術(諸如鍵聯分析)可用於擴展基因圖。通常，將基因置放於另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之染色體上可揭示相關標記物，即使並不知曉特定人類染色體之編號或臂。可藉由物理定位將新序列指派於染色 體臂或其部分。由此為使用定位選殖或其他基因發現技術尋求疾病基因之研究者提供有價值之資訊。在已藉由遺傳連鎖將疾病或症候群大致定位於特定基因組區域後，例如將AT大致定位於11q22-23(Gatti等人，Nature 336：577-580(1988))，定位於該區域之任何序列均可表示相關或調控基因以供進一步研究。編碼本發明之ROS1融合之核苷酸序列或其部分亦可用於偵測正常個體、攜帶者或受影響個體之間由於移位、逆位等所致之染色體位置差異。
應理解，偵測編碼具有ROS1激酶活性之多肽的聚核苷酸(例如，全長ROS1或ROS1融合聚核苷酸，諸如SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1(S))的所有方法(例如PCR及FISH)均可與偵測具有ROS1激酶活性之多肽或編碼具有ROS1激酶活性之多肽的聚核苷酸的其他方法組合。舉例而言，若FIG-ROS1聚核苷酸在生物樣品中實際上表現為FIG-ROS1融合多肽，則偵測生物樣品之遺傳物質中的FIG-ROS1融合聚核苷酸(例如循環腫瘤細胞中之FIG-ROS1)之後可對欲測定樣品之蛋白質進行免疫印漬分析或免疫組織化學(IHC)分析。該等免疫印漬或IHC分析可使用特異性結合由所偵測之FIG-ROS1聚核苷酸編碼之多肽的抗體來進行，或該等分析可使用特異性結合全長FIG(例如，結合於該蛋白質之N末端)或全長ROS1(例如，結合ROS1之激酶域中的抗原決定基)之抗體來進行。該等檢定在此項技術中為已知的(參見例如美國專利第7,468,252號)。
在另一實例中，Dako之CISH技術允許對同一組織切片進行顯色原位雜交與免疫組織化學。關於CISH與FISH之比較，參見Elliot等人，Br J Biomed Sci 2008；65(4)：167-171,2008。
本發明之另一態樣提供一種用於將患者診斷為患有由ROS1激酶驅動之肺癌或疑似肺癌的方法。該方法包括使該肺癌或疑似肺癌之生物樣品(其中該生物樣品包含至少一種核酸分子)與能在嚴格條件下與 編碼具有ROS1激酶活性之多肽的核酸分子雜交的探針接觸，該核酸分子為諸如全長ROS1聚核苷酸或ROS1融合聚核苷酸(例如FIG-ROS1融合聚核苷酸、SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸或CD74-ROS1融合聚核苷酸)，且其中該探針與該生物樣品中之至少一種核酸分子雜交可將該患者鑒別為患有由ROS1激酶驅動之肺癌或疑似肺癌。
本發明之另一態樣提供一種用於將患者診斷為患有由ROS1激酶驅動之肺癌或疑似患有肺癌的方法。該方法包括使該肺癌或疑似肺癌之生物樣品(其中該生物樣品包含至少一種核酸分子)與特異性結合具有ROS1激酶活性之多肽(例如FIG-ROS1融合多肽、SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1融合多肽)的試劑接觸，其中該試劑與該生物樣品中之至少一種融合多肽特異性結合可將該患者鑒別為患有由ROS1激酶驅動之肺癌或疑似肺癌。
在各種實施例中，鑒別由ROS1激酶驅動之肺癌或疑似肺癌將鑒別該患者患有可能響應於ROS1抑制性治療劑之肺癌或疑似肺癌。
用於偵測SLC34A2與ROS1基因之間的移位的套組可包括一或多個探針組。(1)第一探針組包括經第一螢光物質標記之探針1A及經第二螢光物質標記之探針1B；探針1A與第一區互補，該第一區為上述第一染色體位點中之5'區，探針1B與第二區互補，該第二區存在於與上述第一區相距一定距離處且為上述第一染色體位點中之3'區，且當藉由SLC32A2與ROS1基因之間的移位產生SLC34A2-ROS1融合基因時，ROS1基因中之斷裂點位於上述第一區之3'尾部、上述第一區與第二區之間或上述第二區之5'尾部；(2)第二探針組，其為靶向含有SLC32A2基因之染色體位點(第二染色體位點)的第二探針組；其由經第一螢光物質標記之探針2A及經第二螢光物質標記之探針2B組成；探針2A與第一區互補，該第一區為上述第二染色體位點中之5'區，探針2B與第二區互補，該第二區存在於與上述第一區相距一定距離處 且為上述第二染色體位點中之3'區，且當藉由SLC32A2與ROS1基因之間的移位產生SLC34A2-ROS1融合基因時，SLC32A2基因中之斷裂點位於上述第一區之3'尾部、上述第一區與第二區之間或上述第二區之5'尾部；(3)第三探針組，其由上述探針2A及上述探針1B組成；及第四探針組，其由與含有ROS1基因之染色體位點(第三染色體位點)互補的探針4A及與含有SLC32A2基因之染色體位點(第四染色體位點)互補的探針4B組成。
適用於鑒別易於發生SLC34A2-ROS1移位之患者的套組包括選自包括以下各項之群的一或多個要素：探針使用說明、DNA對比染色、雜交使緩衝液、密封劑及對照載玻片。該套組使得有可能便利而有效地實施本發明之偵測方法。該套組可包括上述第一探針組、第二探針組、第三探針組或第四探針組作為所需要素(基本成分)。該套組中亦可包括兩種或更多種類型之探針組。舉例而言，該套組可併入第一探針組及第三探針組。由於上文已描述各探針組之細節，故此處將不對其進行重複。
「偵測SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸之存在或不存在」可使用編碼上述融合多肽之基因組DNA或得自該基因組DNA之轉錄物直接進行，但其亦可使用得自該轉錄物之轉譯產物(上述融合多肽)間接地進行。
因為編碼融合多肽之基因組DNA係藉由染色體6(6q22)之117.61-117.75Mb區域之間的逆位來形成，故可在「偵測SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸之存在或不存在」時偵測本到發明之現象。在對逆位進行之此偵測中，舉例而言，可偵測到ROS1基因之激酶域編碼區上游的5'側區域與ROS1基因之該編碼區下游的3'側區域之間的裂縫，或可偵測到SLC32A2基因之部分或所有螺旋狀結構域之編碼區及該編碼區上游的5'側區域與SLC34A2基因之螺旋狀結構域之編碼區下游的3'側區域之 間的裂縫。
熟習此項技術者已知且可利用之技術可用於在本發明中「偵測SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸之存在或不存在」。若「編碼上述融合多肽之基因組DNA」為目標，則可使用例如使用螢光或其類似物之原位雜交(ISH)、基因組PCR、直接定序、南方印漬或基因組微陣列分析。若「來自上述基因組DNA之轉錄物」為目標，則可使用例如RT-PCR、直接定序、北方印漬、點漬或cDNA微陣列分析。
本發明之套組亦可包括其他要素。此等其他要素之實例為探針使用說明書、DNA對比染色(諸如DAPI)、雜交緩衝液、洗滌緩衝液、溶劑、固定介質、對照載玻片、反應容器及其他設備。亦可包括用於診斷目的之說明書。此外，亦可包括顯示如何使用ROS1激酶抑制劑在癌症患者中建立對來自此等患者之染色體樣品中之SLC34A2-ROS1移位進行偵測(陽性鑒別)的說明書。此外，亦可包括確定治療過程之計劃及此計劃之說明。
涵蓋約200kb(探針1A)至約1,370kb(探針4B)之相對較長探針。因此，探針與靶序列之間的互補不需要具有高度限制性，達到可達成本發明所希望之特異性雜交的程度即可。靶序列之間的相似性的實例為至少90%，較佳為至少95%且更佳為至少98%。
在使用第一探針組及第二探針組之情況下，在SLC34A2基因與ROS1基因之間發生移位的染色體樣品中分離且個別地偵測兩個螢光信號；在未發生移位之染色體樣品中，典型地觀測到兩個螢光信號彼此相鄰或觀測到呈兩個螢光信號之組合形式的信號(黃色)。因而，SLC34A2基因與ROS1基因之間存在或不存在移位體現在螢光信號之圖案上。因此，SLC34A2基因與ROS1基因之間的移位可由螢光信號之圖案來確定。
上文得出之判斷較佳地且典型地基於對結果與對照(測試樣品)進 行比較而作出。在此，對照為來源於患有非小細胞肺癌之患者的染色體樣品或來源於展現癌前病變之患者的染色體樣品。另外，得自無癌前病變之患者的染色體樣品、得自未患癌症之患者的染色體樣品或獲自正常健康個體之染色體樣品亦可用作對照。來源於細胞株之染色體樣品亦可用作對照。
當融合基因為編碼融合蛋白質SLC34A2-ROS1之融合基因SLC34A2-ROS1時，融合基因SLC34A2-ROS1(或任何其他ROS1融合基因，例如CD74-ROS1及FIG-ROS1)可藉由使用能夠與融合區雜交(互補結合)之聚核苷酸(探針)及/或能夠產生具有連續100至200個核苷酸且包括融合區之聚核苷酸片段的引物對進行偵測。另外，在一個例示性實施例中，融合蛋白質SLC34A2-ROS1可使用特異性結合融合蛋白質SLC34A2-ROS1之融合區的抗體或適體進行偵測。
另外，可藉由呈顯色原位雜交(CISH)方法與銀原位雜交(SISH)方法之組合形式的融合檢定進行偵測。本說明書中之「融合點」係指來源於個別SLC34A2基因之部分與來源於ROS1基因之部分融合的點。
術語「能夠與融合區(或逆位區)雜交」可能係指具有互補序列或與融合區(或逆位區)之序列具有至少90%序列一致性的序列。另一實施例提供一種用於診斷癌症之組成物，其包括選自由以下各項組成之群的一或多者：能夠與融合區雜交之聚核苷酸、能夠產生具有連續100至200固核苷酸且包括融合區之聚核苷酸片段的一對引子。亦包括能夠與人類染色體6中之逆位區雜交的聚核苷酸、能夠產生具有連續100至200個核苷酸且包括人類染色體6之逆位區之聚核苷酸片段的一對引子及結合融合區之抗體或適體。另一實施例提供融合蛋白質及/或融合基因用於診斷癌症之用途。該患者可為任何哺乳動物，例如靈長類動物，諸如人類或猴子；齧齒動物，諸如小鼠或大鼠；特定言之，人類。適用於所提及之任何檢定的測試樣品可為細胞(例如肺細 胞)；組織(例如肺組織)；體液(例如血液)；循環腫瘤DNA、循環腫瘤細胞。樣品可用熟習此項技術者已知的任何方式進行收集，包括自腫瘤之手術活組織切片、腫瘤之核心活組織切片、腫瘤之細針吸出物、肋膜積液收集及自患者分離細胞及組織的其他已知方法。舉例而言，可對循環腫瘤細胞進行FISH檢定(描述於本文中)。
患者可能正在接受治療或計劃用激酶抑制劑治療。測試樣品可包括來源於人類癌細胞或其提取物之細胞。
另一實施例提供一種編碼融合蛋白質之融合基因，其中編碼融合搭配物N末端結構域之基因位於5'端，且編碼ROS1蛋白C末端結構域之基因位於3'端。在一個例示性實施例中，當融合蛋白質為SLC34A2-ROS1蛋白時，融合基因可表示為SLC34A2-ROS1基因，其中編碼SLC34A2之N末端結構域的基因位於5'端，且編碼ROS1蛋白之C末端結構域的基因位於3'端。
另一實施例提供一種表現載體，其包括融合基因及可操作地連接於該融合基因之視情況存在之轉錄元件(例如啟動子及其類似物)。另一實施例提供一種經表現載體轉型之轉型細胞。
在治療或診斷過程中獲得之生物樣本(活組織切片樣品等)通常經福馬林固定，但在此情況下，宜使用原位雜交，因為作為偵測目標之DNA基因組在福馬林固定下穩定且因為偵測靈敏度較高。
在原位雜交中，生物樣本中編碼SLC34A2-ROS1融合多肽之基因組DNA可藉由使以下(a)或(b)所述之具有至少15個核苷酸鹼基之鏈長度的聚核苷酸雜交進行偵測：(a)呈選自由可與編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸雜交的探針及可與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的探針組成之群的至少一個探針形式的聚核苷酸；(b)呈可與編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚 核苷酸的融合位點雜交的探針形式的聚核苷酸。
在原位雜交中，生物樣本中編碼CD74-ROS1融合多肽之基因組DNA可藉由使以下(a)或(b)所述之具有至少15個鹼基之鏈長度的聚核苷酸雜交進行偵測：(a)呈選自由可與編碼CD74蛋白之聚核苷酸雜交的探針及可與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的探針組成之群的至少一個探針形式的聚核苷酸；(b)呈可與編碼CD74蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點雜交的探針形式的聚核苷酸。
在原位雜交中，生物樣本中編碼FIG-ROS1融合多肽之基因組DNA可藉由使以下(a)或(b)所述之具有至少15個鹼基之鏈長度的聚核苷酸雜交進行偵測：(a)呈選自由可與編碼FIG蛋白之聚核苷酸雜交的探針及可與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的探針組成之群的至少一個探針形式的聚核苷酸；(b)呈可與編碼FIG蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點雜交的探針形式的聚核苷酸。
然而，在自然界中(亦即，非人為)，基因之DNA序列可能突變。因此，該等天然變異體亦可為本發明之目標(類似於下文中)。
本發明之(a)中所述之聚核苷酸可為任何聚核苷酸，條件為其可藉由與編碼ROS1結合搭配物(亦即，SLC34A2、CD74或FIG蛋白)之聚核苷酸或編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交來偵測生物樣本中編碼上述ROS1融合蛋白質之基因組DNA之存在，該等聚核苷酸為該聚核苷酸之靶鹼基序列。其較佳為以下(a1)至(a4)中所述之聚核苷酸。
(a1)與SLC34A2基因外顯子1-2之部分或所有螺旋狀結構域之編碼區及該編碼區上游之5'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「5' SLC34A2探針1」)跟與ROS1基因激酶域編碼區及該編碼區下游之3'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「3' ROS1探針1」)之組合。
(a2)與ROS1基因激酶域編碼區上游之5'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「5' ROS1探針1」)跟與ROS1基因激酶域編碼區及該編碼區下游之3'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「3' ROS1探針1」)之組合。
(a3)與ROS1基因纖連蛋白III型9之編碼區及該區域上游之5'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「5' ROS1探針2」)跟與ROS1基因跨膜域編碼區及該編碼區下游之3'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「3' ROS1探針2」)之組合。
(a4)與SLC34A2基因之部分或所有螺旋狀結構域之編碼區及該編碼區上游之5'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「5' SLC34A2探針1」)跟與SLC34A2基因之捲曲螺旋結構域之編碼區及該編碼區下游之3'側區域雜交的聚核苷酸(在下文中亦稱為「3' SLC34A2探針1」)之組合。
由於對靶鹼基序列之特異性及偵測靈敏度，與原位雜交中所使用之聚核苷酸(a1)雜交之區域(靶鹼基序列)較佳為自SLC34A2基因與ROS1基因之融合位點開始1,000,000個鹼基以內的區域，且出於相同原因，與原位雜交中所使用之聚核苷酸(a2)至(a4)雜交之區域較佳為自SLC34A2基因或ROS1基因中之斷裂點開始1,000,000個鹼基以內的區域。
由於對靶鹼基序列之特異性及偵測靈敏度，原位雜交中所使用之以上(a)或(b)中所述之聚核苷酸較佳為由可涵蓋所有上述靶鹼基序列之多種類型多肽組成之集合。在此情況下，構成該集合之聚核苷酸之長度為至少15個鹼基且較佳為100至1000個鹼基。
原位雜交中所使用之以上(a)或(b)中所述之聚核苷酸較佳藉由螢 光染料或類似物進行標記以便偵測。該螢光染料之實例包括DEAC、FITC、R6G、TexRed及Cy5，但不限於此等。除螢光染料以外，亦可用諸如DAB之染料(色素原)或銀及基於酶促金屬沈積之類似物標記上述聚核苷酸。
在原位雜交中，若使用5' SLC34A2探針1及3' ROS1探針1，或若使用5' ROS1探針1及3' ROS1探針1，或若使用5' ROS1探針2及3' ROS1探針2，或若使用5' SLC34A2探針1及3' SLC34A2探針1，則較佳用互相不同的染料標記此等探針。當使用經不同染料以此方式標記之探針之組合進行原位雜交時，當由5' SLC34A2探針1之標記產生之信號(例如螢光)及由3' ROS1探針1之標記產生之信號重疊時，可確定已偵測到編碼SLC34A2-ROS1融合多肽之基因組DNA。另一方面，當由5' ROS1探針1之標記產生之信號與由3' ROS1探針1之標記產生之信號分開，或由5' ROS1探針2之標記產生之信號與由3' ROS1探針2之標記產生之信號分開，或由5' SLC34A2探針1之標記產生之信號與由3' SLC34A2探針1之標記產生之信號分開時，可確定已偵測到編碼SLC54A2-ROS1融合多肽之基因組DNA。
聚核苷酸標記可藉由已知技術來進行。舉例而言，可將藉由缺口平移或隨機誘發以螢光染料或類似物標記之基質鹼基併入聚核苷酸中，從而標記該聚核苷酸。在原位雜交中，當使以上(a)或(b)及上述生物樣本中所述之聚核苷酸雜交時所使用之條件可視各種因素而變化，諸如相關聚核苷酸之長度，但高嚴格度雜交條件之實例為0.2×SSC、65℃，且低嚴格度雜交條件之實例為2.0×SSC、50℃。應注意，與上述條件具有相同嚴格度之雜交條件可由熟習此項技術者適當地選擇各種條件，諸如鹽濃度(SSC之稀釋比)及溫度以及界面活性劑(NP-40等)之濃度、甲醯胺之濃度及pH值來實現。舉例而言，對於用於篩選之一般雜交條件，提供能夠在中等嚴格度至高嚴格度條件下 與本文中所提供之聚核苷酸序列或其片段或其互補序列雜交的聚核苷酸組成物。雜交技術為分子生物學技術中所熟知的。出於說明之目的，適用於測試本發明聚核苷酸與其他聚核苷酸之雜交的中等嚴格條件包括在5倍SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA之溶液(pH 8.0)中預洗；在50℃至60℃、5X SSC下雜交隔夜；隨後在65℃下洗滌兩次20分鐘，每次用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC。熟習此項技術者應理解，可容易地控制雜交嚴格度，諸如藉由改變雜交溶液之鹽含量及/或進行雜交之溫度。舉例而言，在另一實施例中，適合之高嚴格度雜交條件包括上述雜交條件，除了雜交溫度增至例如60℃至65℃或65℃至70℃。
除上述原位雜交以外，使用以上(a)或(b)中所述之聚核苷酸偵測編碼SLC34A2-ROS1融合多肽之基因組DNA的方法的實例為南方印漬、北方印漬及點漬。在此等方法中，藉由在中等嚴格度至高嚴格度條件下使以上(a)或(b)中所述之聚核苷酸與獲自上述生物樣本之核酸提取物已轉錄在上面之膜進行雜交來偵測上述融合基因。當使用聚核苷酸(a)時，當可與編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸雜交的多肽及可與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的多肽識別該膜上所顯露之同一譜帶時，可確定已偵測到編碼SLC34A2-ROS1融合多肽之基因組DNA。
基因組微陣列分析及DNA微陣列分析為使用以上聚核苷酸(b)偵測編碼SLC34A2-ROS1融合多肽之基因組DNA的其他方法。在此等方法中，將聚核苷酸(b)之陣列固定於基質上，且藉由使生物標本與該陣列上之聚核苷酸接觸來偵測相關基因組DNA。在PCR或定序中，可使用由生物樣本製備之DNA(基因組DNA、cDNA)或RNA作為模板，將下文所述之聚核苷酸(c)用於特異性擴增部分或所有SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸。(c)呈經設計以便將編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點夾在中間的一對引子形式的聚 核苷酸。「呈一對引子形式之聚核苷酸」為在鹼基序列中，一個引子與編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸雜交，且另一引子與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的引子組，諸如充當靶標之上述融合聚核苷酸。此等聚核苷酸之長度正常為15至100個鹼基，且較佳為17至30個鹼基。
自PCR偵測精確度及靈敏度之觀點來看，本發明之(c)中所述之聚核苷酸較佳為上述融合聚核苷酸中自編碼SLC34A2蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點開始5000個鹼基以內的鹼基序列的互補序列。
可基於充當標靶之SLC34A2-ROS1融合聚核苷酸之鹼基序列，藉由已知技術適當地設計「呈一對引子形式之聚核苷酸」。「呈一對引子形式之聚核苷酸」之有利實例為由選自由SLC34A2-ROS1-F1、SLC34A2-int15-F1、SLC34A2-int15-F2、SLC34A2-ex16-F1、SLC34A2-ex23-F1、SLC34A2-ex24-F1、SLC34A2-F-orf2438及SLC34A2-int15-F3.5組成之群的一個引子及選自由SLC34A2-ROS1-R1、ROS1-int11-R3、ROS1-int7-R1、ROS1-int11-R0.5、ROS1-int11-R1、ROS1-int7-R2及ROS1-R-orf2364組成之群的一個引子組成的引子組。更佳地，其為SLC34A2-ROS1-F1及SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-int15-F1及SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-int15-F2及ROS1-int11-R3、SLC34A2-ex16-F1及SLC34A2-ROS1-R1、SLC34A2-ex23-F1及SLC34A2-ROS1-R1或SLC34A2-ex24-F1引子及ROS1-int7-R1引子。
在一些實施例中，本發明提供鑒別、評定或偵測SLC34A2-ROS1融合之方法；鑒別、評定、評估及/或治療患有癌症之個體的方法，例如具有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合之癌症；分離SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1核酸分子、核酸構築體、含有該等核酸分子之宿主細胞；經純化之SLC34A2-ROS1、 CD74-ROS1或FIG-ROS1多肽及黏合劑；偵測試劑(例如，能夠特異性偵測SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1核酸或蛋白質之探針、引子、抗體、套組)；用於鑒別與5' SLC34A2-3' ROS1、5' CD74-3' ROS1或5' FIG-3' ROS1融合相互作用(例如抑制)之分子(例如新穎激酶抑制劑)的篩選檢定；以及用於評估、鑒別、評定及/或治療患有癌症(例如具有SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合中之一或多者的癌症)之個體的檢定及套組。本文中所鑒別之組成物及方法可用於例如鑒別新的SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1抑制劑；評估、鑒別或選擇個體，例如患有癌症之患者；及治療或預防癌症。
SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1及FIG-ROS1核酸分子。在一個態樣中，本發明提供一種核酸分子(例如，經分離或純化之核酸分子)，其包括SLC34A2或CD74或FIG基因之片段及ROS1原癌基因之片段。在一個實施例中，核酸分子包括SLC34A2、CD74或FIG之至少一個外顯子與ROS1之外顯子(例如，一或多個編碼ROS1酪胺酸激酶域或其片段之外顯子)的融合，例如同框融合。
在一說明性實施例中，5' SLC34A2-3' ROS1核酸分子包含足以使所編碼之5' SLC34A2-3' ROS1融合具有組成性激酶活性，例如與野生型ROS1相比具有升高之活性(例如激酶活性)的SLC34A2及ROS1序列，例如在本文中所提及之癌症之細胞中。在一實施例中，所編碼之5' SLC34A2-3' ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6、7、9、10或11個SLC34A2外顯子及至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13個ROS1外顯子。在一個實施例中，所編碼之5' SLC34A2-3' ROS1融合多肽包括螺旋狀結構域或其功能片段及ROS1酪胺酸激酶域或其功能片段。
在一說明性實施例中，5' CD74-3' ROS1核酸分子包含足以使所 編碼之5' CD74-3' ROS1融合具有組成性激酶活性，例如與野生型ROS1相比具有升高之活性(例如激酶活性)的CD74及ROS1序列，例如在本文中所提及之癌症之細胞中。在一實施例中，所編碼之5' CD74-3' ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6個CD74外顯子及至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13個ROS1外顯子。在一個實施例中，所編碼之5' CD74-3' ROS1融合多肽包括II型膜蛋白結構域之螺旋狀信號錨或其功能片段及ROS1酪胺酸激酶域或其功能片段。
在一說明性實施例中，5' FIG-3' ROS1核酸分子包含足以使所編碼之5' FIG-3' ROS1融合具有組成性激酶活性，例如與野生型ROS1相比具有升高之活性(例如激酶活性)的FIG及ROS1序列，例如在本文中所提及之癌症之細胞中。在一實施例中，所編碼之5' FIG-3' ROS1融合包含至少1、2、3、4、5、6、7或8個FIG外顯子及至少1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12或13個ROS1外顯子。在一個實施例中，所編碼之5' FIG-3' ROS1融合多肽包括捲曲螺旋結構域或其功能片段及ROS1酪胺酸激酶域或其功能片段。
在一個實施例中，SLC34A2-ROS1融合核酸分子包括具有SLC34A2之外顯子2及/或4與ROS1之外顯子32及/或34及/或35之同框融合的核苷酸序列。在另一實施例中，核酸分子包括有包括斷裂點之核苷酸序列。舉例而言，SLC34A2-ROS1融合可包括SLC34A2之至少外顯子4或其片段(例如SLC34A2之外顯子1至4或其片段)與ROS1之至少外顯子32及/或34或其片段(例如ROS1之外顯子30至43或其片段)的同框融合。在某些實施例中，SLC34A2-ROS1融合呈5'-SLC34A2至3'-ROS1構形。在一個實施例中，核酸分子包括SLC34A2基因之外顯子1-4之核苷酸序列或其片段。在另一實施例中，核酸分子包括ROS1基因之外顯子30-43(例如32及/或34及/或35)之核苷酸序列或其片段或實質上與其一致之序列。
在一個實施例中，CD74-ROS1融合核酸分子包括具有CD74之外顯子1至6與ROS1之外顯子32及/或34之同框融合的核苷酸序列。在另一實施例中，核酸分子包括有包括斷裂點之核苷酸序列。舉例而言，CD74-ROS1融合可包括CD74之至少外顯子6或其片段(例如CD74之外顯子1至6或其片段)與ROS1之至少外顯子32及/或34及/或35或其片段(例如ROS1之外顯子30至43或其片段)的同框融合。在某些實施例中，CD74-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1構形。在一個實施例中，核酸分子包括CD74基因之外顯子1-6之核苷酸序列或其片段。在另一實施例中，核酸分子包括ROS1基因之外顯子30-43(例如32及/或34及/或35)之核苷酸序列或其片段或實質上與其一致之序列。
在一個實施例中，FIG-ROS1融合核酸分子包括具有FIG之外顯子1至8(例如1至4或1至8)與ROS1之外顯子32及/或34及/或35之同框融合的核苷酸序列。在另一實施例中，核酸分子包括有包括斷裂點之核苷酸序列。舉例而言，FIG-ROS1融合可包括FIG之至少外顯子4及/或外顯子8或其片段(例如FIG之外顯子1至4或1至8或其片段)與ROS1之至少外顯子32及/或34及/或35或其片段(例如ROS1之外顯子30至43或其片段)的同框融合。在某些實施例中，FIG-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1構形。在一個實施例中，核酸分子包括CD74基因之外顯子1-6之核苷酸序列或其片段。在另一實施例中，核酸分子包括ROS1基因之外顯子30-43(例如32及/或34及/或35)之核苷酸序列或其片段或實質上與其一致之序列。
在其他實施例中，SLC34A2-ROS1融合核酸分子包括編碼SLC34A2-ROS1融合多肽的核苷酸序列，該融合多肽包括SLC34A2基因之片段及ROS1原癌基因之片段。在一個實施例中，核苷酸序列編碼包括螺旋狀結構域或其功能片段及ROS1酪胺酸激酶域或其功能片段之SLC34A2-ROS1融合多肽。
在另一實施例中，CD74-ROS1融合核酸分子包括CD74-ROS1融合，該融合包括ROS1轉錄物與CD74轉錄物之間的融合接點。在另一實施例中，核酸分子包括ROS1之至少外顯子32或34或35或其片段(例如ROS1之外顯子30至43或其片段)與至少外顯子1或其片段(例如CD74之外顯子1至6或其片段)之融合，例如同框融合。在某些實施例中，CD74-ROS1融合呈5'-CD74至3'-ROS1構形。在一個實施例中，核酸分子包括對應於ROS1基因之外顯子30-43(例如外顯子32、34或35)之核苷酸或其片段或實質上與其一致之序列。
在另一實施例中，FIG-ROS1融合核酸分子包括FIG-ROS1融合，該融合包括ROS1轉錄物與FIG轉錄物之間的融合接點。在另一實施例中，核酸分子包括ROS1之至少外顯子32或34或35或其片段(例如ROS1之外顯子30至43或其片段)與至少外顯子4或8或其片段(例如FIG之外顯子1至8或其片段)之融合，例如同框融合。在某些實施例中，FIG-ROS1融合呈5'-FIG至3'-ROS1構形。在一個實施例中，核酸分子包括對應於ROS1基因之外顯子30-43(例如外顯子32、34或35)之核苷酸或其片段或實質上與其一致之序列。
在一相關態樣中，本發明提供包括本文中所描述之SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1及FIG-ROS1融合核酸分子之核酸構築體。在某些實施例中，核酸分子可操作地連接於天然或異源調控序列。亦包括有包括本文中所描述之SLC34A2-ROS1核酸分子的載體及宿主細胞，例如適用於產生本文中所描述之核酸分子及多肽的載體及宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供能減少或抑制編碼本文中所描述之SLC34A2-ROS1融合之核酸分子之表現的核酸分子。該等核酸分子之實例包括例如與編碼SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1及FIG-ROS1或SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1及FIG-ROS1之轉錄調控區之核酸雜交且阻斷或減少SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1之mRNA表現 的反義分子、核糖酶、RNAi、三螺旋分子。
本發明亦提供一種適用作探針、引子、誘餌或庫成員之核酸分子，例如核酸片段，其包括、側接、雜交、適用於鑒別或者基於本文中所描述之ROS1融合。在某些實施例中，探針、引子或誘餌分子為允許俘獲、偵測或分離本文中所描述之ROS1融合核酸分子的寡核苷酸。寡核苷酸可包含實質上與本文中所描述之ROS1融合核酸分子之片段互補的核苷酸序列。核酸片段(例如寡核苷酸)與靶ROS1融合序列之間的序列一致性不必為準確的，只要序列互補性足以俘獲、偵測或分離靶序列即可。在一個實施例中，核酸片段為在長度上包括約5至25個，例如10至20個或10至15個核苷酸的寡核苷酸的探針或引子。在其他實施例中，核酸片段為包括約100至300個核苷酸、130至230個核苷酸、150至200個核苷酸、200至350個、350至950個、300至600個、500至1000個、750至2000個核苷酸長的寡核苷酸的誘餌，且未必包括ROS1融合核酸。
在一個實施例中，核酸片段可用於鑒別或俘獲(例如藉由在中等嚴格度至高嚴格度條件下雜交)SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合。在一說明性實例中，核酸片段可為用於鑒別或俘獲(例如藉由雜交)本文中所描述之SLC34A2-ROS1融合或CD74-ROS1融合或FIG-ROS1融合的探針、引子。在一個實施例中，核酸片段可適用於鑒別或俘獲SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1斷裂點。在一個例示性實施例中，核酸片段在可產生SLC34A2之外顯子4或13與ROS1之外顯子32、34或35的同框融合的染色體重排內與核苷酸序列雜交(例如，染色體6上之移位內的序列)。
本文中所描述之探針或引子可用於例如FISH偵測或PCR擴增或用於ROS1重排之RT-PCT證實及結合搭配物之鑒別。在偵測係基於PCR之一個例示性實施例中，SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1 融合接合之擴增可使用一個引子或一對引子來進行，例如用於擴增側接本文中所描述之SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合接合之序列，例如本文中所描述之染色體重排之突變或接合。在一個實施例中，一對分離之寡核苷酸引子可擴增含有SLC34A2-ROS1融合中之位置或與其相鄰的區域。舉例而言，可設計正向引子以便與SLC34A2、CD74或FIG基因組或mRNA序列內之核苷酸序列雜交。在各種實施例中，針對ROS1、SLC34A2及FIG(各種物種，包括人類)之引子可購自Qiagen(目錄號QF0018545、QF00449078及QF00278992，Qiagen，Gaithersburg，MD，USA)。在其他實施例中，可使用一組PCR引子(包括SLC34A2外顯子4及CD74外顯子6正向引子，各自與ROS1外顯子32及外顯子34反向引子配對)在患者之腫瘤樣品上證實ROS1融合聚核苷酸之存在。可使用Agencourt Formapure方法(Agencourt Biosciences，Beverly，MA，USA)自FFPE組織提取腫瘤樣品之RNA，並且使用可購自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)之Superscript III cDNA合成套組進行反轉錄。以下引子可用於測定SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1斷裂點：SLC34A2外顯子4正向引子，TCGGATTTCTCTACTTTTTCGTG(SEQ ID NO：3)；CD74外顯子6正向引子，CTCCTGTTTGAAATGAGCAGG(SEQ ID NO：4)；ROS1外顯子32反向引子，GGAATGCCTGGTTTATTTGG(SEQ ID NO：5)；及ROS1外顯子34反向引子，TGAAACTTGTTTCTGGTATCCAA(SEQ ID NO：6)。可在任何PCR熱循環儀，例如Eppendorf Mastercycler Gradient(Eppendorf，Hamburg，Germany)中使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)在標準條件下利用40ng cDNA進行PCR擴增。使用BigDye 3.0套組(Life Technologies，Carlsbad，CA)對cDNA進行定序。
核酸片段可用例如放射標記、螢光標記、生物發光標記、化學發光標記、酶標記、結合配對標記可偵測地標記，或可包括親和力標 簽、標簽或標誌(例如銜接子、條碼或其他序列標誌)。
在另一例示性實施例中，一種確定SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合之存在的方法包括：直接獲取得自個體之樣品中存在SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合核酸分子或多肽的知識。樣品可為包含體液、細胞、組織(例如腫瘤組織)之樣品，其可包括核酸樣品、蛋白質樣品、腫瘤活組織切片或循環腫瘤細胞或核酸，其可選自肺癌，包括NSCLC、SCLC、SCC或其組合，及腺癌或黑素瘤。
該方法偵測核酸分子中之SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合且使用以下方法中之任一種：核酸雜交檢定、基於擴增之檢定、PCR-RFLP檢定、即時PCR、定序、篩選分析、FISH、光譜核型分析或MFISH、比較基因組雜交、原位雜交、SSP、HPLC或質譜基因型分析。
描述偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或蛋白質之方法，包括使蛋白質樣品與特異性結合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之試劑接觸且偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽與該試劑之複合物之形成的方法。多肽偵測之方法包括使用經可偵測基團標記之試劑來促進對已結合及未結合試劑之偵測，其中該試劑為抗體分子，其中評估SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合之含量或活性，其中在治療個體起始之前、期間或之後偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合，其中在診斷有癌症時偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合，其中在預定間隔(例如第一時間點及至少一个後續時間點)偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合。
亦包括對治療之反應，特定言之，在響應於確定存在SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合之情況下，使用以下各項中之一 或多項：(1)對患者群體進行層選；(2)將個體鑒別或選擇為可能或不可能對治療作出反應；(3)選擇治療選項；及/或(4)預測個體之疾病時程。
編碼SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合或包含其片段之斷裂點的經分離或純化之核酸分子可用於證實目的及使用本發明化合物進行之NSCLC及肺腺癌ROS1融合陽性癌症之定向特異性治療。其他構築體可用於ROS1融合陽性癌症(例如ROS1重排型NSCLC)之定向特異性治療，包括：可操作地連接於天然或異源調控序列的經分離或純化之核SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合核酸分子。一種經分離或純化之載體，其包含編碼SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合或包含其片段之斷裂點的核酸分子。一種宿主細胞，其包含載體。一種核酸分子，其特異性減少或抑制編碼SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合之核酸分子的表現，其可選自反義分子、核糖酶、siRNA或三螺旋分子。一種經分離或純化之SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或含有其片段之斷裂點。經分離或純化之SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽具有ROS1激酶活性及/或二聚或多聚活性。一種經分離或純化之抗體分子，其特異性結合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽。如所描述之抗體分子，其中該抗體分子為針對SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之單特異性抗體分子。
用於偵測本發明中之SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸之轉譯產物的方法的實例為免疫染色、免疫印漬、ELISA、流式細胞術、免疫沈澱及抗體陣列分析。在此等方法中，使用可結合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之抗體。該抗體之實例為對含有SLC34A2或CD74或FIG蛋白與ROS1蛋白 之融合位點之多肽具有特異性的抗體(在下文中亦稱為「融合位點特異性抗體」)、結合由ROS1蛋白之上述融合位點之C末端側上之區域組成之多肽的抗體(在下文中亦稱為「ROS1-C末端抗體」)及結合由SLC34A2或CD74或FIG蛋白之上述融合位點之N末端側上之區域組成之多肽的抗體(在下文中亦稱為「SLC34A2或CD74或FIG-N末端抗體」)。在此，「融合位點特異性抗體」意謂特異性結合含有上述融合位點之多肽但不結合野生型(正常型)SLC34A2或CD74或FIG蛋白或野生型(正常型)ROS1蛋白的抗體。
可藉由上述融合位點特異性抗體或上述ROS1-C末端抗體與SLC34A2或CD74或FIG-N末端抗體之組合來偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽。然而，因為在正常肺細胞中幾乎未偵測到例如ROS1蛋白之表現，故即使ROS1-C末端抗體單獨用於免疫染色，亦可在肺腺癌組織中偵測到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之存在。
在各種實施例中，用於鑒別本發明之ROS1融合多肽之免疫組織化學染色(IHC)及免疫印漬應用可使用可購自Cell Signaling Technology(Danvers，MA，USA)之ROS1抗體磷酸化ROS1來進行。在一個實施例中，ROS1融合陽性癌細胞(例如NSCLC ROS1重排型肺癌細胞)之鑒別可利用兔抗ROS1單株抗體D4D6(目錄號3287；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)進行。
在一些實施例中，「結合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之抗體」可由熟習此項技術者選擇適當之已知方法來製備。該等已知方法之一個實例為用由ROS1蛋白、SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之C末端部分組成之上述多肽、由SLC34A2或CD74或FIG蛋白之N末端部分組成之上述多肽等對免疫動物進行接種，從而活化該動物之免疫系統，且隨後回收該動物之血清 (多株抗體)的方法；及用於產生單株抗體的方法，諸如雜交瘤法、重組DNA法及噬菌體呈現法。若使用與經標記之物質結合的抗體，則可藉由偵測該標記來直接偵測靶蛋白質。經標記之物質不受特定限制，條件為其可結合該抗體且可偵測。實例包括過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、異硫氰酸螢光素(FITC)、異硫氰酸若丹明(RITC)、鹼性磷酸酶、生物素及放射性物質。此外，除使用與經標記之物質結合的抗體直接偵測靶蛋白質之方法以外，亦可使用利用與經標記之物質結合的蛋白G、蛋白A或二次抗體間接偵測靶蛋白質之方法。
若藉由上述方法在自個體分離之樣本中偵測到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸或多肽之存在，則判斷ROS1酪胺酸激酶抑制劑(諸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽)之癌症治療效力在該患者中應較高，而若未偵測到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸之存在，則判斷ROS1酪胺酸激酶抑制劑之癌症治療效力在該患者中應較低。
如上文所描述，以下(a)至(c)中所述之具有至少15個鹼基之鏈長度的任何聚核苷酸均宜用於偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸之存在或不存在：(a)呈選自由可與編碼SLC34A2或CD74或FIG蛋白之聚核苷酸雜交的探針及可與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸雜交的探針組成之群的至少一個探針形式的聚核苷酸；(b)呈可與編碼SLC34A2或CD74或FIG蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點雜交的探針形式的聚核苷酸；(c)呈經設計以便將編碼SLC34A2或CD74或FIG蛋白之聚核苷酸與編碼ROS1蛋白之聚核苷酸的融合位點夾在中間的一對引子形式的聚核苷酸。
此等聚核苷酸具有與靶基因之特定鹼基序列互補的鹼基序列。在此，「互補」可能意謂不完全互補，條件為其可例如在中等嚴格度至高嚴格度條件下雜交。舉例而言，此等多肽與指定鹼基序列具有80%或更高、較佳90%或更高、更佳95%或更高且最佳100%同源性。
在聚核苷酸(a)至(c)中，在部分或所有DNA或RNA中，核苷酸可經諸如PNA(聚醯胺核酸、肽核酸)、LNA(商標，鎖核酸、橋接核酸)、ENA(商標，2'-O,4'-C-亞乙基橋接核酸)、GNA(甘油核酸)及TNA(異赤藻糖核酸)之人造核酸取代。
此外，如上文所描述，結合SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽之抗體宜用於偵測SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸之轉譯產物。因此，本發明提供一種用於測定ROS1酪胺酸激酶抑制劑之癌症治療有效性的有效的藥物，其包含此抗體。
本發明之融合基因之偵測方法包括在獲自測試個體之樣品中偵測本說明書之聚核苷酸之存在的步驟。作為獲自測試個體之樣品，使用自測試個體收集之物質(自活體分離之樣品)，特定言之，所收集之任何類型體液(較佳為血液)、肺泡及支氣管洗滌物、已經歷活組織檢查之樣品及痰液樣品。較佳地，使用得自測試個體肺部受影響區域之活組織檢查樣品或痰液樣品。自該樣品可提取基因組DNA並加以使用。另外，可使用其轉錄物(由於基因組之轉錄及轉譯而產生之產物；例如mRNA、cDNA及蛋白質)。特定言之，較佳製備並使用mRNA或cDNA。
可藉由已知方法提取基因組DNA，且可使用市售DNA提取套組容易地進行提取。
偵測步驟可根據已知的基因分析方法進行(例如，通常用作基因偵測方法之已知方法，諸如PCR、LCR(連接酶鏈反應)、SDA(鏈置 換擴增)、NASBA(基於核酸序列之擴增)、ICAN(等溫及嵌合引子引發之核酸擴增)、LAMP(環介導之等溫擴增)方法、TMA(Gen-Probe之TMA系統)方法、原位雜交法及微陣列)。舉例而言，使用將與欲偵測之聚核苷酸雜交的核酸用作探針的雜交技術，將與欲偵測之聚核苷酸雜交的DNA用作引子的基因擴增技術或類似技術。
特定言之，使用來源於獲自測試個體之樣品的核酸(例如mRNA及其類似物)進行偵測。藉由使用經設計以便能夠特異性擴增欲偵測之聚核苷酸之序列的引子，藉由基因擴增反應法來量測mRNA之量。本發明之偵測方法中所使用之引子或偵測套組中所包括之引子不受特定限制，只要該等引子可特異性擴增欲偵測之聚核苷酸之序列即可，且係基於欲偵測之聚核苷酸之鹼基序列進行設計。可使用引子設計軟體(例如由PE Biosystems製作之Primer Express)及其類似物來設計PCR擴增監測法中所使用之引子。另外，因為PCR產物之尺寸尺寸愈大，擴增效率愈惡化，故有義引子及反義引子經設計以使得當擴增mRNA或cDNA時所獲得之擴增產物之尺寸變成1kb或更小為適當的。
更特定言之，由編碼SLC34A2之部分設計有義引子(5'引子)，且由編碼ROS1之部分設計反義引子(3'引子)。較佳使用本發明之偵測套組中所包括的引子，且更佳使用最適合於包括在該偵測套組中的引子。在PCR擴增監測法中，亦有可能設計多路PCR用於藉由混合對應於個別基因之以上有義引子來偵測單一反應液體中之所有融合聚核苷酸。藉由適合於各擴增技術之方法，有可能證實靶基因(整個基因或其特定部分)是否已經擴增。舉例而言，在PCR方法中，藉由瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物且進行溴化乙菲錠染色及類似操作，藉此有可能證實是否已獲得具有目標尺寸之經擴增片段。當已獲得具有目標尺寸之經擴增片段時，此指示獲自測試個體之樣品中存在欲偵測之聚核苷酸。
本發明之融合基因之偵測方法較佳包括藉由基因擴增反應在獲自測試個體之樣品中偵測特定聚核苷酸之存在的步驟及偵測是否已獲得具有目標尺寸之經擴增片段的步驟。
使用例如北方雜交、點漬法、DNA微陣列法及RNA保護法來進行使用雜交技術之偵測。作為用於雜交之探針，有可能使用包含由分別在作為由至少32個連續鹼基組成之核酸分子之中心的融合點上游及下游的16個鹼基組成且在中等嚴格度至高嚴格度條件下(較佳在高嚴格度條件下)與欲偵測之聚核苷酸或與其互補鏈雜交之序列或包含其互補鏈的探針。
亦有可能使用諸如RT-PCR之基因擴增技術。在RT-PCR方法中，PCR擴增監測(即時PCR)方法係在基因擴增過程中進行，藉此可更定量地分析欲偵測之聚核苷酸的存在。可使用PCR擴增監測法。即時PCR為一種已知方法，並且可使用針對此方法之市售儀器及套組簡單地進行。
本發明之一些實施例之融合蛋白質的偵測方法包括在獲自測試個體之樣品中偵測特定多肽(亦即，由欲偵測之聚核苷酸編碼之多肽，在下文中稱為多肽欲偵測之多肽)之存在的步驟。該偵測步驟可藉由免疫檢定法或酶活性檢定法進行，該等方法係藉由以下方式來進行：製備來源於獲自測試個體之樣品(例如獲自測試個體之癌症組織或細胞)的溶解液體，且將該液體中所含有之欲偵測多肽與抗SLC34A2或抗CD74或抗FIG抗體及抗ROS1抗體組合。較佳地，有可能使用利用對欲偵測之多肽具有特異性的單株抗體或多株抗體的技術，諸如酶免疫檢定法、雙抗體夾心ELISA方法、螢光免疫檢定法、放射免疫檢定法及免疫印漬法。
當自獲自測試個體之樣品中偵測到本發明之偵測方法中欲偵測之聚核苷酸或欲偵測之多肽時，該測試個體為患有聚核苷酸陽性癌症 之個體(患者)且將使用ROS1抑制劑提供治療。
本發明之偵測套組至少包含經設計以便能夠特異性擴增本發明之偵測方法中欲偵測之聚核苷酸的有義引子及反義引子。有義引子及反義引子組為充當用於擴增欲偵測之聚核苷酸的引子的一組聚核苷酸。
在一個實施例中，本發明之用於偵測融合基因之引子組包括(1)包含由編碼SLC34A2或CD74或FIG之部分設計之有義引子及由編碼ROS1之部分設計之反義引子且用於偵測SLC34A2或CD74或FIG與ROS1基因之融合基因的引子組，其中該反義引子由在中等嚴格度至高嚴格度條件下(較佳在高嚴格度條件下)與「欲偵測之聚核苷酸」雜交的核酸分子(較佳為由至少16個鹼基組成之核酸分子)組成，且該有義引子由在嚴格條件下(較佳在高嚴格度條件下)與「欲偵測之聚核苷酸」之互補鏈雜交的核酸分子(較佳為由至少16個鹼基組成之核酸分子)組成。
以下引子組(2)及(3)作為引子組(1)之更特定變異體包括在引子組中。
(2)由至少任何16個連續鹼基組成之寡核苷酸組成的有義引子之引子組。
(3)由至少任何16個連續鹼基組成之寡核苷酸組成的有義引子之引子組。
在此等引子組(1)至(3)中，選擇有義引子與反義引子之位置之間的間隔較佳為1kb或更小，或由有義引子及反義引子擴增之擴增產物的尺寸較佳為1kb或更小。
另外，引子之鏈長度一般由15至40個鹼基組成，較佳由16至24個鹼基組成，更佳由18至24個鹼基組成，且尤佳由20至24個鹼基組成。
引子組可用於對欲偵測之聚核苷酸進行擴增及偵測。此外，儘管不受特定限制，但本發明之引子組中所包括之個別引子可藉由例如化學合成來製備。
可用於偵測ROS1融合聚核苷酸之例示性ROS1、SLC34A2或CD74引子提供於表2中。
篩選抗癌藥物之方法包括：使樣品化合物與表現該融合蛋白質之細胞接觸；及量測該細胞中之融合蛋白質表現量，其中經樣品化合物處理之細胞中之融合蛋白質表現量與用樣品化合物處理之前的融合蛋白質表現量或未經處理之細胞中的融合蛋白質表現量相比有所降低，將該樣品化合物確定為抗癌藥物之候選化合物。
篩選抗癌藥物之方法可進一步包括在樣品化合物處理之前量測細胞中之融合蛋白質表現量的步驟。在此情況下，當樣品化合物處理之後的融合蛋白質表現量與同一細胞中在樣品化合物處理之前的融合蛋白質表現量相比有所降低時，可將樣品化合物確定為抗癌藥物之候選化合物。替代地，篩選抗癌藥物之方法可包括提供表現該融合蛋白 質之細胞及使樣品化合物與所提供之細胞的一部分接觸。在此情況下，當與樣品化合物接觸之細胞中的融合蛋白質表現量與未與樣品化合物接觸之細胞中的融合蛋白質表現量相比有所降低時，可將樣品化合物確定為抗癌藥物之候選化合物。
篩選方法中所使用之細胞可為來源於表現及/或活化融合基因或融合蛋白質之癌細胞、細胞提取物或細胞培養物之細胞。癌細胞可為實性癌細胞，特定言之，肺癌，例如非小細胞肺癌，諸如上文所述之肺腺癌。
另一實施例提供一種篩選針對肺癌之抗癌藥物的方法，包括：用樣品化合物處理表現該融合蛋白質之細胞；量測該細胞中之融合蛋白質表現量，其中經樣品化合物處理之細胞中之融合蛋白質表現量與用樣品化合物處理之前的融合蛋白質表現量或未經處理之細胞中的融合蛋白質表現量相比有所降低，將該樣品化合物確定為針對肺癌之抗癌藥物的候選化合物。
ROS1融合蛋白質(亦即，SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1及FIG-ROS1)可用作標記物以用於診斷肺癌或用於治療或預防或治療肺癌。治療或預防肺癌包括向需要其之患者投與治療有效量之至少一種針對融合蛋白質之抑制劑、至少一種針對編碼該融合蛋白質之融合基因的抑制劑、至少一種針對ROS1編碼基因之抑制劑或其組合的步驟。該抑制劑可為諸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
另一實施例提供一種預防及/或治療癌症之方法，包括向需要其之患者投與醫藥學上(治療)有效量之至少一種針對該融合蛋白質之抑制劑、至少一種針對編碼該融合蛋白質之融合基因的抑制劑、至少一種針對ROS1編碼基因之抑制劑或其組合，其中任一者均可為本文中所揭示之式1化合物及其他特定化合物。該方法可進一步包括在投與 該治療之步驟之前鑒別需要預防及/或治療癌症之患者的步驟。另一實施例提供用於預防及/或治療癌症之組成物，包括投與至少一種針對該融合蛋白質之抑制劑(包括式1)單獨或與至少一種針對編碼該融合蛋白質之融合基因的抑制劑、至少一種針對ROS1編碼基因之抑制劑及/或其組合。另一實施例提供針對該融合蛋白質之抑制劑、針對編碼該融合蛋白質之融合基因的抑制劑、針對ROS1編碼基因之抑制劑及/或其組合的用途，其係用於預防及/或治療癌症。該抑制劑可為諸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明中，該癌症可為肺癌，特定言之，小細胞肺癌(SCLC)或非小細胞肺癌(NSCLC)，諸如肺腺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌。
如所描述之組成物，其中針對ROS1融合蛋白質之抑制劑為選自由特異性結合該融合蛋白質之適體、特異性結合該融合蛋白質之抗體組成之群的至少一者，且針對該融合基因或ROS1編碼基因之抑制劑為選自由siRNA、shRNA、miRNA及能夠特異性結合該融合基因或ROS1編碼基因之適體組成之群的至少一者。
抑制ROS1表現及/或ROS1激酶活性(例如轉錄、轉譯或穩定性)的任何ROS1激酶抑制劑均可單獨或與式I化合物、式Ia化合物或式1化合物或其醫藥學上可接受之鹽組合使用。
抑制劑可為ROS1特異性抑制劑，或其可為非特異性抑制劑(例如非特異性激酶抑制劑、多靶抑制劑)。已開發出若干種ROS1激酶抑制劑，且正在研究其臨床應用。在ROS1激酶活性下游，存在諸如磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)及細胞外信號激酶1/2(ERK)(Wixted JH等人，J Biol Chem 2011)及STAT3(Hwang JH等人，Mol Endocrinol 2003；17：1155-1166)之激酶。抑制該等下游信號傳送途徑之藥物亦可單獨或與式1化合物組合用作ROS1激酶抑制劑之替代物或作為佐劑。
在一種模式中，被判斷為具有SLC34A2-ROS1或CD74-FIG移位或FIG-ROS1缺失之個體亦被判斷為在除該移位位點以外之位點上具有ROS1突變。ROS1突變之實例為活化突變，其使得能夠具有組成性激酶活性。ROS1活化突變為與野生型突變相比引起活化增加之任意突變。舉例而言，ROS1活化突變可引起永久性ROS1活化。甚至可存在與使用ROS1抑制劑相關或由於使用ROS1抑制劑所致之二次ROS1活化突變變異體。引起ROS1信號活性增加之突變係由於例如激酶域點突變、缺失、插入、複製或逆位或其中兩項或更多項之組合而存在，由此引起ROS1信號增加。對於判斷為具有如本文中所提供之ROS1融合移位或缺失及ROS1突變之個體，亦可作出用ROS1激酶抑制劑對其進行治療的決定。另外，可基於該決定對其進行治療/療法。
如上文所描述，在藉由本發明之方法偵測到SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸之患者中，認為ROS1酪胺酸激酶抑制劑之癌症治療有效性較高。為此，可藉由選擇性地向具有SLC34A2-ROS1或CD74-ROS1或FIG-ROS1融合基因及ROS1基因之癌症患者投與ROS1酪胺酸激酶抑制劑而有效地進行癌症治療。因此，本發明提供一種用於治療癌症之方法，包括將呈式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽形式的ROS1酪胺酸激酶抑制劑投與藉由本文中所描述之上述診斷方法確定該ROS1酪胺酸激酶抑制劑在其中之癌症治療有效性較高的患者的步驟。
在本發明中，「樣本」不僅為生物樣本(例如細胞、組織、器官、體液(血液、淋巴液等)、胃液、痰液、肺泡/支氣管灌洗液、尿液、大便)，而且包括獲自此等生物樣本之核酸提取物(基因組DNA提取物、mRNA提取物或由mRNA提取物製備之cDNA製劑或eRNA製劑)或蛋白質提取物。此樣本亦可為已經過福馬林固定處理、醇固定處理、冷凍 處理或石蠟包埋處理之樣本。
此外，可由熟習此項技術者在考慮樣本之類型、狀態等而選擇適合之已知技術之後製備基因組DNA、mRNA、cDNA或蛋白質。
除作為活性成分之上述物質(聚核苷酸、抗體)以外，本發明之藥物亦可含有其他醫藥學上可接受之成分。該等成分之實例包括緩衝劑、乳化劑、懸浮劑、穩定劑、防腐劑、生理鹽水等。作為緩衝劑，可使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為乳化劑，可使用阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸浮劑，可使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為穩定劑，可使用丙二醇、亞硫酸二乙酯、抗壞血酸等。作為防腐劑，可使用疊氮化鈉、氯化芐二甲烴銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。
此外，除含有聚核苷酸及抗體之製劑以外，諸如偵測附接於該等聚核苷酸及抗體之標記所必須之基質、正對照(例如SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合聚核苷酸、SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或具有其之細胞等)及負對照之製劑、用於原位雜交或類似技術之對比染色試劑(DAPI等)、偵測抗體所需之分子(例如二次抗體、蛋白G、蛋白A)及用於稀釋或洗滌抗體之緩衝溶液可組合為套組以用於本發明之方法中。此套組可包括該套組之使用說明書。本發明亦提供上述套組以便用於本發明之方法中。
當偵測基本上由融合搭配物之N末端結構域及編碼激酶域之ROS1蛋白質之C末端結構域組成的融合蛋白質時，本文中所描述之偵測方法尤其適用。融合蛋白質可為基本上由SLC34A2蛋白之N末端結構域或其片段及編碼激酶結構域之ROS1蛋白之C末端結構域組成的SLC34A2-ROS1融合蛋白質。融合蛋白質可為基本上由CD74蛋白之N末端結構域或其片段及編碼激酶結構域之ROS1蛋白之C末端結構域組 成的CD74-ROS1融合蛋白質。融合蛋白質可為基本上由FIG蛋白之N末端結構域或其片段及編碼激酶結構域之ROS1蛋白之C末端結構域組成的FIG-ROS1融合蛋白質。該方法可用於診斷肺癌，尤其非小細胞肺癌，且包括：偵測涉及ROS1之染色體重排(包括染色體6中之逆位、移位或缺失)、蛋白質與另一蛋白質融合之融合蛋白質、編碼該融合蛋白質之融合基因及與得自未患癌症之個體的標準樣品相比ROS1過度表現中的至少一者。當在測試樣品中偵測到選自以上群組之上述染色體重排之一時，個體可用諸如式I化合物、式Ia化合物或化合物1或其醫藥學上可接受之鹽之ROS1抑制劑加以治療。
化合物1之製備
N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之製備。
用於製備N-(4-[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之合成途徑描繪於流程1中：
4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉之製備
在反應器中依序饋入6,7-二甲氧基-喹啉-4-酚(10.0kg)及乙腈(64.0L)。將所得混合物加熱至約65℃且添加氧氯化磷(POCl3，50.0kg)。在添加POCl3之後，使反應混合物之溫度升至約80℃。當剩餘少於2%起始物質(過程中高效液相層析[HPLC]分析)時認為反應完畢(約9.0小時)。使反應混合物冷卻至約10℃，且隨後在二氯甲烷(DCM，238.0kg)、30% NH4OH(135.0kg)及冰(440.0kg)之冷卻溶液中淬滅。使所得混合物升溫至約14℃並且進行相分離。用水(40.0kg)洗滌有機相且藉由真空蒸餾加以濃縮以移除溶劑(約190.0kg)。將甲基三級丁基醚(MTBE，50.0kg)添加至批料中，並且使混合物冷卻至約10℃，在此期間產物結晶析出。藉由離心回收固體，用正庚烷(20.0kg)洗滌並且在約40℃下乾燥，得到標題化合物(8.0kg)。
6,7-二甲基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉之製備
在反應器中依序饋入4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉(8.0kg)、4-硝基苯 酚(7.0kg)、4-二甲基胺基吡啶(0.9kg)及2,6-二甲基吡啶(40.0kg)。將反應器內含物加熱至約147℃。當反應完畢時(如藉由過程中HPLC分析所測定，剩餘少於5%起始物質，約20小時)，允許反應器內含物冷卻至約25℃。添加甲醇(26.0kg)，隨後添加溶解於水(50.0kg)中之碳酸鉀(3.0kg)。將反應器內含物攪拌約2小時。過濾所產生之固體沈澱物，用水(67.0kg)洗滌，且在25℃下乾燥約12小時，得到標題化合物(4.0kg)。
4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺之製備
將含有甲酸鉀(5.0kg)、甲酸(3.0kg)及水(16.0kg)之溶液添加至6,7-二甲氧基-4-(4-硝基-苯氧基)-喹啉(4.0kg)、10%鈀/碳(50%水潤濕，0.4kg)於四氫呋喃(THF，40.0kg)中之已加熱至約60℃之混合物中。進行該添加以使反應混合物之溫度保持約60℃。當認為反應完畢時(如使用過程中HPLC分析所測定，剩餘少於2%起始物質，典型地15小時)，對反應器內含物進行過濾。在約35℃下藉由真空蒸餾將濾液濃縮至其原始體積之一半，由此使產物沈澱。藉由過濾回收產物，用水(12.0kg)洗滌且在約50℃下在真空下乾燥，得到標題化合物(3.0kg；97%曲線下面積(AUC))。
1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸之製備
將三乙胺(8.0kg)以使得批料溫度不超過10℃之速率添加至市售環丙烷-1,1-二甲酸(2L，10.0kg)於THF(63.0kg)中之冷卻(約4℃)溶液中。將溶液攪拌約30分鐘，且隨後添加亞硫醯氯(9.0kg)，保持批料溫度低於10℃。當添加完畢時，以使得批料溫度不超過10℃之速率添加4-氟苯胺(9.0kg)於THF(25.0kg)中之溶液。將混合物攪拌約4小時，且隨後用乙酸異丙酯(87.0kg)稀釋。依序用氫氧化鈉水溶液(2.0kg溶解於50.0L水中)、水(40.0L)及氯化鈉水溶液(10.0kg溶解於40.0L水中)洗滌此溶液。藉由真空蒸餾濃縮有機溶液，隨後添加庚烷，由 此使固體沈澱。藉由離心回收固體，且隨後在約35℃下在真空下乾燥，得到標題化合物(10.0kg)。
1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之製備
將草醯氯(1.0kg)以使得批料溫度不超過30℃之速率添加至1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(2.0kg)於THF(11kg)與N,N-二甲基甲醯胺(DMF；0.02kg)之混合物中之溶液中。此溶液不經進一步處理即用於下一步驟中。
N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺之製備
將得自先前步驟之含有1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之溶液以使得批料溫度不超過30℃之速率添加至4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(3.0kg)及碳酸鉀(4.0kg)於THF(27.0kg)及水(13.0kg)中之混合物中。當反應完畢時(典型地在10分鐘內)，添加水(74.0kg)。在15℃至30℃下將混合物攪拌約10小時，由此使產物沈澱。藉由過濾移出產物，用THF(11.0kg)及水(24.0kg)之預製溶液洗滌，且在約65℃下在真空下乾燥約12小時，得到標題化合物(游離鹼，5.0kg)。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)：δ 10.2(s,1H),10.05(s,1H),8.4(s,1H),7.8(m,2H),7.65(m,2H),7.5(s,1H),7.35(s,1H),7.25(m,2H),7.15(m,2H),6.4(s,1H),4.0(d,6H),1.5(s,4H).LC/MS：M+H=502。
N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺(L)蘋果酸鹽之製備
將L-蘋果酸(2.0kg)於水(2.0kg)中之溶液添加至環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺游離鹼(1 5，5.0kg)於乙醇中之溶液中，維持批料溫度為約25℃。隨後添加碳(0.5kg)及硫醇二氧化矽(0.1kg)，並且將所得混合物加熱至約78 ℃，此時添加水(6.0kg)。隨後過濾反應混合物，隨後添加異丙醇(38.0kg)並且允許冷卻至約25℃。藉由過濾回收產物且用異丙醇(20.0kg)洗滌，並且在約65℃下乾燥，得到標題化合物(5.0kg)。
N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N’-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之替代製備
可用於製備N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺及其(L)-蘋果酸鹽之替代合成途徑描繪於流程2中，如PCT/US2012/024591中所描述，該文獻之全部內容係以引用之方式併入。
4-氯-6,7-二甲氧基-喹啉之製備
在反應器中依序饋入6,7-二甲氧基-喹啉-4-酚(47.0kg)及乙腈(318.8kg)。將所得混合物加熱至約60℃且添加氧氯化磷(POCl3，130.6kg)。在添加POCl3之後，使反應混合物之溫度升至約77℃。當剩餘少於3%起始物質(過程中高效液相層析[HPLC]分析)時認為反應完畢(約13小時)。使反應混合物冷卻至約2℃至7℃，且隨後在二氯甲 烷(DCM，482.8kg)、26% NH4OH(251.3kg)及水(900L)之冷卻溶液中淬滅。使所得混合物升溫至約20℃至25℃並且進行相分離。使有機相通過AW hyflo super-cel NF(矽藻土；5.4kg)之床進行過濾，且用DCM(118.9kg)洗滌濾床。用鹽水(282.9kg)洗滌所合併之有機相並且與水(120L)混合。進行相分離，且藉由真空蒸餾與移除溶劑來濃縮有機相(約95L殘餘體積)。將DCM(686.5kg)饋入含有有機相之反應器且藉由真空蒸餾與移除溶劑加以濃縮(約90L殘餘體積)。隨後饋入甲基三級丁基醚(MTBE，226.0kg)，並且將混合物之溫度調節至-20℃至-25℃且保持2.5小時，產生固體沈澱物，隨後過濾且用正庚烷(92.0kg)洗滌，並且在約25℃下在氮氣下於過濾器上進行乾燥，得到標題化合物(35.6kg)。
4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺之製備
在20℃至25℃下將溶解於N,N-二甲基乙醯胺(DMA，184.3kg)中之4-胺基苯酚(24.4kg)饋入含有4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(35.3kg)、三級丁醇鈉(21.4kg)及DMA(167.2kg)之反應器中。隨後將此混合物加熱至100℃至105℃後維持約13小時。在認為反應完畢(如使用過程中HPLC分析所測定，剩餘少於2%起始物質)之後，在15℃至20℃下冷卻反應器內含物且以維持15℃至30℃溫度之速率饋入水(經預冷卻，2℃至7℃，587L)。過濾所產生之固體沈澱物，用水(47L)與DMA(89.1kg)之混合物洗滌，且最後用水(214L)洗滌。隨後在約25℃下在過濾器上乾燥濾餅，產生粗製4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(59.4kg濕重，41.6kg乾重，基於LOD進行計算)。使粗製4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺在四氫呋喃(THF，211.4kg)與DMA(108.8kg)之混合物中回流(約75℃)約1小時，且隨後冷卻至0℃至5℃，並且老化約1小時，此後過濾固體，用THF(147.6kg)洗滌且在約25℃下在真空下於過濾器上乾燥，產生4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺 (34.0kg)。
4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺之替代製備
將4-氯-6,7-二甲氧基喹啉(34.8kg)及4-胺基苯酚(30.8kg)及三級戊醇鈉(1.8當量，88.7kg，35重量% THF溶液)饋入反應器中，隨後饋入N,N-二甲基乙醯胺(DMA，293.3kg)。隨後將此混合物加熱至105℃至115℃後維持約9小時。在認為反應完畢(如使用過程中HPLC分析所測定，剩餘少於2%起始物質)之後，在15℃至25℃下冷卻反應器內含物且經2小時添加水(315kg)，同時將溫度維持在20℃至30℃之間。隨後在20℃至25℃下將反應混合物再攪拌1小時。藉由過濾收集粗產物，且依序用88kg水與82.1kg DMA之混合物及175kg水進行洗滌。在過濾乾燥器上將產物乾燥53小時。LOD顯示小於1% w/w。
在一替代程序中，使用1.6當量三級戊醇鈉並且使反應溫度自110℃增至120℃。另外，使冷卻溫度增至35℃至40℃，並且將水添加之起始溫度調節至35℃至40℃，允許放熱溫升至45℃。
1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸之製備
將三乙胺(19.5kg)以使得批料溫度不超過5℃之速率添加至環丙烷-1,1-二甲酸(24.7kg)於THF(89.6kg)中之冷卻(約5℃)溶液中。將溶液攪拌約1.3小時，且隨後添加亞硫醯氯(23.1kg)，保持批料溫度低於10℃。當添加完畢時，將溶液攪拌約4小時，從而保持溫度低於10℃。隨後以使得批料溫度不超過10℃之速率添加4-氟苯胺(18.0kg)於THF(33.1kg)中之溶液。將混合物攪拌約10小時，此後認為反應完畢。隨後用乙酸異丙酯(218.1kg)稀釋反應混合物。依序用氫氧化鈉水溶液(10.4kg，50%，溶解於119L水中)洗滌此溶液，用水(415L)進一步稀釋，隨後用水(100L)洗滌且最終用氯化鈉水溶液(20.0kg，溶解於100L水中)洗滌。在低於40℃下藉由真空蒸餾濃縮有機溶液(100L殘餘體積)，隨後添加正庚烷(171.4kg)，由此使固體沈澱。藉由過 濾回收固體且用正庚烷(102.4kg)洗滌，產生濕潤粗製1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(29.0kg)。在約25℃下將粗製1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸溶解於甲醇(139.7kg)中，隨後添加水(320L)，產生漿液，藉由過濾進行回收，依序用水(20L)及正庚烷(103.1kg)洗滌，且隨後在約25℃下在氮氣下於過濾器上乾燥，得到標題化合物(25.4kg)。
1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之製備
將草醯氯(12.6kg)以使得批料溫度不超過25℃之速率添加至1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(22.8kg)於THF(96.1kg)與N,N-二甲基甲醯胺(DMF；0.23kg)之混合物中之溶液中。此溶液不經進一步處理即用於下一步驟中。
1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之替代製備
將反應器中饋入1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷甲酸(35kg)、344g DMF及175kg THF。將反應混合物調節至12℃至17℃，且隨後經1小時之時段向反應混合物中饋入19.9kg草醯氯。在12℃至17℃下將反應混合物攪拌3至8小時。此溶液不經進一步處理即用於下一步驟中。
環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺之製備
將得自先前步驟之含有1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之溶液以使得批料溫度不超過30℃之速率添加至化合物4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(23.5kg)及碳酸鉀(31.9kg)於THF(245.7kg)及水(116L)中之混合物中。當反應完畢時(在約20分鐘內)，添加水(653L)。在20℃至25℃下將混合物攪拌約10小時，由此使產物沈澱。藉由過濾回收產物，用THF(68.6kg)及水(256L)之預製溶液洗滌，並且於過濾器上首先在約25℃下在氮氣下且隨後在約45℃下在真空下進行乾燥，得到標題化合物(41.0kg，38.1kg，基於LOD進行計算)。
環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺之替代製備
在反應器中依序饋入4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺(35.7kg，1當量)及412.9kg THF。向反應混合物中饋入48.3 K2CO3於169kg水中之溶液。經最少2小時將以上1-(4-氟-苯基胺甲醯基)-環丙烷羰基氯之替代製備中所描述之酸氯化物溶液轉移至含有4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯胺之反應器中，同時將溫度維持在20℃與30℃之間。在20℃至25℃下將反應混合物攪拌最少3小時。隨後將反應溫度調節至30℃至25℃，並且攪拌混合物。停止攪拌並且允許對混合物進行相分離。移出下部水相且丟棄。向剩餘上部有機相中添加804kg水。在15℃至25℃下將反應物攪拌最少16小時。
使產物沈澱。過濾產物且用179kg水與157.9kg THF之混合物分兩份進行洗滌。在真空下將粗產物乾燥至少2小時。隨後將經乾燥之產物溶解於285.1kg THF中。將所得懸浮液轉移至反應容器中並且攪拌，直至懸浮液變成澄清(溶解)溶液，此結果需要加熱至30℃至35℃後維持約30分鐘。隨後經2小時向溶液中添加456kg水，以及20kg SDAG-1乙醇(含甲醇之變性乙醇)。在15℃至25℃下將混合物攪拌至少16小時。過濾產物且用143kg水與126.7kg THF之混合物分兩份進行洗滌。在40℃之最高溫度設定點下乾燥產物。
在一替代程序中，將酸氯化物形成期間之反應溫度調節至10℃至15℃。將再結晶溫度自15℃至25℃變成45℃至50℃後維持1小時，且隨後經2小時冷卻至15℃至25℃。
環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺蘋果酸鹽之製備
將環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(1-5；13.3kg)、L-蘋果酸(4.96kg)、甲基乙基酮 (MEK；188.6kg)及水(37.3kg)饋入反應器中並且將混合物加熱至回流(約74℃)後維持約2小時。使反應器溫度降至50℃至55℃，並且過濾反應器內含物。將此等上述順序步驟再重複兩次，以類似量之起始物質(13.3kg)、L-蘋果酸(4.96kg)、MEK(198.6kg)及水(37.2kg)為起始物。在約74℃下，在大氣壓下使用MEK(1133.2kg)對所合併之濾液進行共沸乾燥(近似殘餘體積711L；KF0.5% w/w)。將反應器內含物之溫度降至20℃至25℃並且保持約4小時，產生固體沈澱物，進行過濾，用MEK(448kg)洗滌且在50℃下在真空下乾燥，得到標題化合物(45.5kg)。
環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(L)蘋果酸鹽之替代製備
將環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(47.9kg)、L-蘋果酸(17.2kg)、658.2kg甲基乙基酮及129.1kg水饋入反應器中並且將混合物加熱至50℃至55℃後維持約1至3小時，且隨後在55℃至60℃下再維持4至5小時。藉由通過1μm濾筒進行過濾使混合物澄清。將反應器溫度調節至20℃至25℃，並且在150-200mm Hg真空下在最高夾套溫度為55℃之情況下真空蒸餾至558至731L之體積範圍。
分別在饋入380kg及380.2kg甲基乙基酮之情況下再進行兩次真空蒸餾。在第三次真空蒸餾之後，藉由饋入159.9kg甲基乙基酮將批料之體積調節至18 v/w環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺，得到880L之總體積。藉由調節245.7甲基乙基酮再進行真空蒸餾。在20℃至25℃下將反應混合物適度攪拌至少24小時。過濾產物且用415.1kg甲基乙基酮分三份進行洗滌。在45℃之夾套溫度設定點下在真空下乾燥產物。
在一替代程序中，改變添加順序以便將17.7kg L-蘋果酸溶解於 129.9kg水中之溶液添加至含環丙烷-1,1-二甲酸[4-(6,7-二甲氧基-喹啉-4-基氧基)-苯基]-醯胺(4-氟-苯基)-醯胺(48.7kg)之甲基乙基酮(673.3kg)中。
生物學實例
HCC-78及NCI-H2228細胞之生長
分別自DSMZ及ATCC接收呈冷凍生物樣品形式之HCC-78及NCI-H2228細胞，於T-75燒瓶(Nunc)中解凍且生長直至80%至90%匯合(對於黏附之細胞)或直至細胞之密度為1-2×106個細胞/毫升(對於懸浮細胞)。
將帶有活化EML4-ALK融合之人類肺NSCLC腺癌細胞系NCI-H2228(ATCC，CRL 5935)分別以3.5×104個細胞/孔及2.5×104個細胞/孔之密度接種於黑色96孔板(Costar，3904)上含10% FBS、1%青黴素-鏈黴素之0.1ml RPMI 1640(ATCC 30-2001)中，歷經48小時或72小時。
將帶有活化SLC34A2-ROS1融合及磷光體-Met之人類肺NSCLC腺癌細胞系HCC-78(DSMZ，ACC 563)分別以2.5×104個細胞/孔及2×104個細胞/孔之密度接種於黑色96孔板(Costar，3904)上含10% FBS(熱失活，Cellgro)、1%青黴素-鏈黴素之0.1ml RPMI 1640(ATCC 30-2001)中，歷經48小時或72小時。
使細胞在37℃下在濕潤5% CO2氛圍中生長16小時。將DMSO或化合物1之連續稀釋於新鮮無血清培養基或含血清培養基中添加至細胞中且在37℃下在濕潤5% CO2氛圍中培育48小時或72小時，隨後添加5'-溴-2'-去氧尿苷(BrdU)標記溶液(Roche)後維持2至4小時。將懸浮細胞轉移至濾板(Corning，3504)，隨後進行檢定。藉由監測BrdU併入來檢定細胞之增殖。得自Cell Proliferation ELISA BrdU(化學發光)套組(Roche Biosciences，11 669 915 001)之試劑係根據製造商之說明 書加以使用。在BrdU標記之後，用FixDenat溶液固定細胞。添加抗BrdU過氧化物酶(POD)結合物且用1×PBS對板進行洗滌。添加基質溶液，且在Victor Wallac V培養板讀數器(Perkin Elmer)上進行螢光量測。藉由比較化合物1處理下之細胞增殖與經DMSO處理之樣品來計算對增殖之抑制百分比。使用5至8種化合物1濃度下之抑制百分比值來計算IC50值。
生物學實例
對ROS1磷酸化之抑制
將帶有活化SLC34A2-ROS1融合及磷光體-Met之人類肺NSCLC腺癌細胞系HCC-78細胞(DSMZ，ACC 563)以3×105個細胞/孔接種於6孔板(Nunclon，152795)上含10% FBS(熱失活，Cellgro)及1%青黴素-鏈黴素(Cellgro)之RPMI 1640(ATCC，30-2001)中。將DMSO或化合物1之連續稀釋於含10% FBS之新鮮培養基中(最終濃度0.3% DMSO(媒劑))添加至細胞中且培育3小時。在處理之後，收集細胞且用冷PBS洗滌並且立即用0.15mL冷溶解緩衝液(50mM Tris HCl pH 8.0、150mM NaCl、1% NP 40、0.1% SDS、0.5%去氧膽酸鈉、1mM EDTA、50mM NaF、1mM焦磷酸鈉、1mM Na3VO4、2mM PMSF、10μg/mL蛋白酶抑素、5μg/mL亮肽素及5μg/mL胃酶抑素A)溶解。收集溶解物，且藉由BCA方法(Pierce)量測蛋白質濃度。收集溶解物，且藉由BCA方法(Pierce)量測蛋白質濃度。將溶解物與NuPage LDS樣品緩衝液(Invitrogen NP0007)及還原劑(Invitrogen #NP0004)混合，隨後在70℃下加熱10min。將20μg蛋白質裝載於NuPage 10% Bis Tris凝膠(Invitrogen，NP0302)上。將蛋白質轉移至硝化纖維膜(Invitrogen，LC2001)，在Odyssey阻斷緩衝液(Li-Cor，927 40000)中阻斷1小時，且在4℃下與稀釋於含0.1% Tween 20之Odyssey阻斷緩衝液中之抗ROS1小鼠單株抗體(1：1000)(Cell Signaling Technology，3266)及抗磷 酸ROS1(Y2274)兔抗體(1：1000)(Cell Signaling Technology，3077)一起培育隔夜。將膜洗滌四次，歷經10min，每次利用TBST緩衝液(50mM Tris HCl，pH7.2；150mM NaCl；0.1% Tween 20)，並且在室溫下與山羊抗小鼠IRDye680(Li-Cor，926 32220)及山羊抗兔IRDye800(Li-Cor，926 32211)二次抗體一起在含0.1% Tween 20及0.01% SDS之Odyssey阻斷緩衝液中印漬60分鐘。將膜洗滌四次，歷經10min，每次利用TBS-T緩衝液，並且用PBS沖洗兩次。使用Odyssey掃描器(Li-Cor)對膜進行掃描，且使用ImageQuant(Molecular Devices)對各譜帶之信號強度進行定量。基於化合物處理對比媒劑(DMSO)對照之信號來計算IC50值。
對投與單次遞增劑量之化合物1或3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-呱啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼；XALKORI®)的HCC-78 NSCLC細胞中SLC34A2-ROS1介導之激酶活性的抑制示於圖1中。圖1明確說明化合物1對ROS1融合激酶之有效抑制活性，且在生體外測試濃度下與比較對照3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-呱啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼)相比更有效。
生物學實例
HCC-78 NSCLC細胞之ROS1依賴性增殖
在將活性劑與HCC-78 NSCLC細胞以各種濃度培育48或72小時之後，計算化合物1及比較對照3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-呱啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺(克唑替尼)之IC50值。使用BrdU ELISA(化學發光，Roche Biosciences，目錄號11 669 915 001)根據製造商之推薦對HCC-78 NSCLC細胞之增殖進行定量。IC50值(A至E)(50%抑制時之濃度)之確定係如上文所提供來測定，且使用GraphPad Prism軟體由電腦確定。
IC50資料提供：E-5,000-10,000nM；D-1,000-5,000nM；C-500-1000nM；B-100-500nM；A-10-100nM。
其他實施例
出於明確性及理解之目的，已藉由說明及實例方式在一定程度上詳細描述上述揭示內容。已參考各種特定及較佳實施例及技術描述本發明。然而，應理解，可進行許多變化及修改而仍在本發明之精神及範疇內。熟習此項技術者應顯而易見，可在所附申請專利範圍之範疇內實施變化及修改。因此，應理解，以上描述意在為說明性而非限制性的。
因此，不應參考以上描述來確定本發明之範疇，而是應替代地參考以下所附申請專利範圍以及該等申請專利範圍所授權之等效物的完整範疇來確定。
<110> 美商艾克賽里克斯公司
<120> 治療肺腺癌之方法
<130> 224990/EX14-003C-PC/370960
<140> TW 104113427
<141> 2015-04-27
<150> US 61/984599
<151> 2014-04-25
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2347
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2347)
<223> 人類ROS1蛋白UniProt登錄號P08922
<400> 1
<210> 2
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(278)
<223> 人類ROS1激酶域
<400> 2
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC34A2外顯子4正向
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD74外顯子6正向
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1外顯子32反向
<400> 5
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1外顯子34反向
<400> 6
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 InVPCR F1
<400> 7
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 InvPCR F2
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 InvPCR R1
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 InvPCR R2
<400> 10
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 Break Rev1
<400> 11
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 E43R1
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ROS1 E34R
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD74 E5F
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC34A2 E4F
<400> 15

Claims (42)

  1. 一種式I化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；R3為(C1-C6)烷基；R4為(C1-C6)烷基；且Q為CH或N，其係用於製備治療肺腺癌之藥物。
  2. 如請求項1之用途，其中該肺腺癌為非小細胞肺癌。
  3. 如請求項1之用途，其中該肺腺癌為SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該式I化合物為式Ia之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R1為鹵基；R2為鹵基；且Q為CH或N。
  5. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該式I化合物為化合物1： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 如請求項5之用途，其中化合物1為N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺，或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該式(I)化合物、式I(a)化合物及化合物1為(L)-或(D)-蘋果酸鹽。
  8. 如請求項1至7中任一項之用途，其中該式(I)化合物呈該(L)蘋果酸鹽及/或該(D)蘋果酸鹽之結晶N-1形式或N-2形式。
  9. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該藥物另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
  10. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係繼另一治療形式之後投與。
  11. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在順鉑及/或吉西他濱(gemcitabine)治療後投與。
  12. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在卡鉑定(carboplatin)治療後投與。
  13. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在卡鉑定及/或吉西他濱治療後投與。
  14. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在順鉑及/或卡鉑定治療後投與。
  15. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在多烯紫杉醇(doectaxel)治療後投與。
  16. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在克唑替尼(crizotinib)治療後投與。
  17. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在克唑替尼及/或吉西他濱治療後投與。
  18. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在克唑替尼及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。
  19. 如請求項1至9中任一項之用途，其中該藥物係在順鉑及/或吉西他濱及/或多烯紫杉醇治療後投與。
  20. 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製備治療ROS1融合陽性非小細胞肺癌的藥物。
  21. 一種化合物1或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製備抑制或逆轉哺乳動物中之異常細胞生長之進展的藥物，其中該異常細胞生長為由ROS1激酶介導之癌症。
  22. 如請求項21之用途，其中該癌症為肺腺癌。
  23. 如請求項21之用途，其中該肺腺癌為非小細胞肺癌。
  24. 如請求項21之用途，其中該肺腺癌為SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。
  25. 如請求項24之用途，其中該藥物另外包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。
  26. 如請求項24之用途，其中該藥物另外包含至少一種醫藥學上可 接受之載劑；其中該藥物係每日投與，持續3個月以上。
  27. 如請求項24之用途，其中該藥物另外包含至少一種醫藥學上可接受之載劑；其中該藥物係以每天5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65、70、75、80、85、90或95mg之劑量投與。
  28. 如請求項24之用途，其中該SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌之偵測係使用FISH、CISH或SISH檢定來進行。
  29. 如請求項24之用途，其中該SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌之偵測係使用任何形式之基因組PCR、直接定序、PCR定序、RT-PCR或類似檢定來進行。
  30. 如請求項24之用途，其中該SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌之偵測係使用特異性結合SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合多肽或其片段之抗體來進行。
  31. 一種式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及至少一種醫藥學上可接受之載劑之用途，其係用於製備診斷並治療患者之藥物，其中該患者患有NSCLC腫瘤且該腫瘤經鑒別為SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性NSCLC。
  32. 一種化合物1： 或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製備治療肺腺癌的藥物，該肺腺癌為SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌。
  33. 如請求項1至32中任一項之用途，其中該藥物產生選自由以下各項組成之群的至少一種治療效果：減少腫瘤尺寸、減少轉移、完全緩解、部分緩解、穩定疾病、增加總體反應率或病理性完全反應。
  34. 一種式I化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；R3為(C1-C6)烷基；R4為(C1-C6)烷基；且Q為CH或N，其係用於製備抑制癌細胞中之ROS1融合激酶活性的藥物。
  35. 如請求項34之用途，其中該癌細胞為非小細胞肺癌腺癌細胞。
  36. 如請求項34之用途，其中該癌細胞為SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1或FIG-ROS1融合陽性非小細胞肺癌腺癌細胞。
  37. 如請求項34至36中任一項之用途，其中該式I化合物為式Ia之化合物 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：R1為鹵基；R2為鹵基；且Q為CH或N。
  38. 如請求項34至37中任一項之用途，其中該式I化合物為化合物1： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  39. 如請求項38之用途，其中化合物1為N-(4-{[6,7-雙(甲基氧基)喹啉-4-基]氧基}苯基)-N'-(4-氟苯基)環丙烷-1,1-二甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  40. 如請求項34至39中任一項之用途，其中該式(I)化合物、式I(a)化合物及化合物I為(L)-蘋果酸鹽或(D)-蘋果酸鹽。
  41. 如請求項34至40中任一項之用途，其中該式(I)化合物呈該(L)蘋果酸鹽及/或該(D)蘋果酸鹽之結晶N-1形式或N-2形式。
  42. 如請求項34至41中任一項之用途，其中該藥物另外包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
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