JP2017513908A - 肺腺癌の治療方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩であるＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ２及びＲＯＳ１阻害薬を用いて、患者、具体的には肺腺癌である患者、より具体的にはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である患者における癌を治療することに関する。肺癌は、全世界における癌関連死の第１位の原因である。標的療法の最近の発展により、小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療にパラダイムシフトがもたらされている。

Description

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１４年４月２５日出願の米国特許仮出願第６１／９８４，５９９号の利益を主張し、当該開示の全体を参照により本明細書に援用する。
配列表
本出願は、２０１５年４月２７日午後１２時５４分に作成された２６ＫＢである、本出願とともに電子的に提出された「ＥＸ１４−００３Ｃ−ＰＣ＿２０１５＿０４＿２０＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称する配列表を含み、この配列表の全体を参照により援用する。
技術分野
本発明は、受容体チロシンキナーゼ阻害薬を用いる、癌、特に肺腺癌の検出、診断及び治療に関する。
肺癌は、全世界における癌関連死の第１位の原因である。標的療法の最近の発展により、小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療にパラダイムシフトがもたらされている。Ｍｏｋ ＴＳ，Ｗｕ ＹＬ，Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔ Ｓ，Ｙａｎｇ ＣＨ，Ｃｈｕ ＤＴ，Ｓａｉｊｏ Ｎ，Ｓｕｎｐａｗｅｒａｖｏｎｇ Ｐ，Ｈａｎ Ｂ，Ｍａｒｇｏｎｏ Ｂ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｙ，Ｏｈｅ Ｙ，Ｙａｎｇ ＪＪ，Ｃｈｅｗａｓｋｕｌｙｏｎｇ Ｂ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ＥＬ，Ｗａｔｋｉｎｓ ＣＬ，Ａｒｍｏｕｒ ＡＡ，Ｆｕｋｕｏｋａ Ｍ． Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｓｅｐ ３；３６１（１０）：９４７−５７．Ｍａｅｍｏｎｄｏ Ｍ，Ｉｎｏｕｅ Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｓ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｉｓｏｂｅ Ｈ，Ｇｅｍｍａ Ａ，Ｈａｒａｄａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｉ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｏｋｉｎａｇａ Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ｔ，Ｏｇｕｒａ Ｔ，Ａｎｄｏ Ｍ，Ｍｉｙａｚａｗａ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｓａｉｊｏ Ｙ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｋ，Ｍｏｒｉｔａ Ｓ，Ｎｕｋｉｗａ Ｔ；Ｎｏｒｔｈ−Ｅａｓｔ Ｊａｐａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＥＧＦＲ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｎ ２４；３６２（２５）：２３８０−８．上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）であるゲフィチニブ及びエルロチニブ、並びに未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のＴＫＩであるクリゾチニブは、ＥＧＦＲ遺伝子変異またはＡＬＫ遺伝子再構成を有するＮＳＣＬＣ患者にて臨床活性が示された。Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｃａｍｉｄｇｅ ＤＲ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｂ，Ｍａｋｉ ＲＧ，Ｏｕ ＳＨ，Ｄｅｚｕｂｅ ＢＪ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｃｏｓｔａ ＤＢ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｌｙｎｃｈ ＴＪ，Ｆｉｄｉａｓ Ｐ，Ｓｔｕｂｂｓ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｅｑｕｉｓｔ ＬＶ，Ｔａｎ Ｗ，Ｇａｎｄｈｉ Ｌ，Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｗｅｉ ＧＣ，Ｓｈｒｅｅｖｅ ＳＭ，Ｒａｔａｉｎ ＭＪ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ｈａｂｅｒ ＤＡ，Ｗｉｌｎｅｒ Ｋ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＧＩ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ．Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｏｃｔ ２８；３６３（１８）：１６９３−７０３．Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｃａｍｉｄｇｅ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｏｌｏｍｏｎ ＢＪ，Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｔａｎ Ｗ，Ｔｙｅ Ｌ，Ｗｉｌｎｅｒ ＫＤ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｐ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｂｅｒｇｅｔｈｏｎ Ｋ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ，Ｏｕ ＳＨ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ＲＯＳ１ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ ３０（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ７５０８）．ＫＩＦ５Ｂ（キネシンファミリー５Ｂ）遺伝子とＲＥＴ癌遺伝子の融合は、近年、ＮＳＣＬＣ患者の１〜２％にてドライバー遺伝子変異であることが報告されており、治療標的として注目されている。Ｋｏｈｎｏ Ｔ，Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，Ｔｏｔｏｋｉ Ｙ，Ｙａｓｕｄａ Ｋ，Ｈｉｒａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｍｍｏ Ｔ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｔｓｕｔａ Ｋ，Ｆｕｒｕｔａ Ｋ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｉｗａｋａｗａ Ｒ，Ｏｇｉｗａｒａ Ｈ，Ｏｉｋｅ Ｔ，Ｅｎａｒｉ Ｍ，Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｈａｕｇｅｎ Ａ，Ｓｋａｕｇ Ｖ，Ｃｈｉｋｕ Ｓ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｉ，Ａｒａｉ Ｙ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｉ，Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＣ，Ｔｓｕｄａ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ Ｊ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ．ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７５−７．Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｄａ Ｍ，Ｔｏｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ，Ｓａｋａｔａ Ｓ，Ｈａｔａｎｏ Ｓ，Ａｓａｋａ Ｒ，Ｈａｍａｎａｋａ Ｗ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ Ｈ，Ｕｅｈａｒａ Ｈ，Ｌｉｍ Ｃｈｏｉ Ｙ，Ｓａｔｏｈ Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｋ，Ｍａｎｏ Ｈ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ．ＲＥＴ，ＲＯＳ１ ａｎｄ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７８−８１．Ｌｉｐｓｏｎ Ｄ，Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ Ｍ，Ｙｅｌｅｎｓｋｙ Ｒ，Ｏｔｔｏ Ｇ，Ｐａｒｋｅｒ Ａ，Ｊａｒｏｓｚ Ｍ，Ｃｕｒｒａｎ ＪＡ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ，Ｂｌｏｏｍ Ｔ，Ｂｒｅｎｎａｎ ＫＷ，Ｄｏｎａｈｕｅ Ａ，Ｄｏｗｎｉｎｇ ＳＲ，Ｆｒａｍｐｔｏｎ ＧＭ，Ｇａｒｃｉａ Ｌ，Ｊｕｈｎ Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＫＣ，Ｗｈｉｔｅ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｚｗｉｒｋｏ Ｚ，Ｐｅｒｅｔｚ Ｔ，Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ Ｈ，Ｓｏｕｓｓａｎ−Ｇｕｔｍａｎ Ｌ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｓａｓａｋｉ Ｈ，Ｋｉｍ ＨＲ，Ｐａｒｋ ＳＩ，Ｅｒｃａｎ Ｄ，Ｓｈｅｅｈａｎ ＣＥ，Ｒｏｓｓ ＪＳ，Ｃｒｏｎｉｎ ＭＴ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＰＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＡＬＫ ａｎｄ ＲＥＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３８２−４．したがって、ＮＳＣＬＣにおける重要なドライバー遺伝子を特定し、患者のそれぞれのゲノムサブセットに合わせた治療法を開発することが一層重要になっている。
Ｍｏｋ ＴＳ，Ｗｕ ＹＬ，Ｔｈｏｎｇｐｒａｓｅｒｔ Ｓ，Ｙａｎｇ ＣＨ，Ｃｈｕ ＤＴ，Ｓａｉｊｏ Ｎ，Ｓｕｎｐａｗｅｒａｖｏｎｇ Ｐ，Ｈａｎ Ｂ，Ｍａｒｇｏｎｏ Ｂ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ Ｙ，Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｙ，Ｏｈｅ Ｙ，Ｙａｎｇ ＪＪ，Ｃｈｅｗａｓｋｕｌｙｏｎｇ Ｂ，Ｊｉａｎｇ Ｈ，Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ＥＬ，Ｗａｔｋｉｎｓ ＣＬ，Ａｒｍｏｕｒ ＡＡ，Ｆｕｋｕｏｋａ Ｍ． Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｓｅｐ ３；３６１（１０）：９４７−５７． Ｍａｅｍｏｎｄｏ Ｍ，Ｉｎｏｕｅ Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｓ，Ｏｉｚｕｍｉ Ｓ，Ｉｓｏｂｅ Ｈ，Ｇｅｍｍａ Ａ，Ｈａｒａｄａ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｉ，Ｆｕｊｉｔａ Ｙ，Ｏｋｉｎａｇａ Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ｔ，Ｏｇｕｒａ Ｔ，Ａｎｄｏ Ｍ，Ｍｉｙａｚａｗａ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｓａｉｊｏ Ｙ，Ｈａｇｉｗａｒａ Ｋ，Ｍｏｒｉｔａ Ｓ，Ｎｕｋｉｗａ Ｔ；Ｎｏｒｔｈ−Ｅａｓｔ Ｊａｐａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｅｄ ＥＧＦＲ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊｕｎ ２４；３６２（２５）：２３８０−８． Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｃａｍｉｄｇｅ ＤＲ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｂ，Ｍａｋｉ ＲＧ，Ｏｕ ＳＨ，Ｄｅｚｕｂｅ ＢＪ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｃｏｓｔａ ＤＢ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｋｉｍ ＷＨ，Ｌｙｎｃｈ ＴＪ，Ｆｉｄｉａｓ Ｐ，Ｓｔｕｂｂｓ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｅｑｕｉｓｔ ＬＶ，Ｔａｎ Ｗ，Ｇａｎｄｈｉ Ｌ，Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｗｅｉ ＧＣ，Ｓｈｒｅｅｖｅ ＳＭ，Ｒａｔａｉｎ ＭＪ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ｈａｂｅｒ ＤＡ，Ｗｉｌｎｅｒ Ｋ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＧＩ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ．Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｏｃｔ ２８；３６３（１８）：１６９３−７０３． Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｃａｍｉｄｇｅ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｓｏｌｏｍｏｎ ＢＪ，Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｓａｌｇｉａ Ｒ，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｂａｎｇ ＹＪ，Ｔａｎ Ｗ，Ｔｙｅ Ｌ，Ｗｉｌｎｅｒ ＫＤ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｐ，Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ Ｍ，Ｂｅｒｇｅｔｈｏｎ Ｋ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ，Ｏｕ ＳＨ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ＲＯＳ１ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ ３０（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ７５０８）． Ｋｏｈｎｏ Ｔ，Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｈ，Ｔｏｔｏｋｉ Ｙ，Ｙａｓｕｄａ Ｋ，Ｈｉｒａｍｏｔｏ Ｍ，Ｎａｍｍｏ Ｔ，Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｔｓｕｔａ Ｋ，Ｆｕｒｕｔａ Ｋ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｙ，Ｉｗａｋａｗａ Ｒ，Ｏｇｉｗａｒａ Ｈ，Ｏｉｋｅ Ｔ，Ｅｎａｒｉ Ｍ，Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｈａｕｇｅｎ Ａ，Ｓｋａｕｇ Ｖ，Ｃｈｉｋｕ Ｓ，Ｙａｍａｎａｋａ Ｉ，Ａｒａｉ Ｙ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｓ，Ｓｅｋｉｎｅ Ｉ，Ｏｇａｗａ Ｓ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＣ，Ｔｓｕｄａ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ，Ｙｏｋｏｔａ Ｊ，Ｓｈｉｂａｔａ Ｔ．ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７５−７． Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｄａ Ｍ，Ｔｏｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ，Ｓａｋａｔａ Ｓ，Ｈａｔａｎｏ Ｓ，Ａｓａｋａ Ｒ，Ｈａｍａｎａｋａ Ｗ，Ｎｉｎｏｍｉｙａ Ｈ，Ｕｅｈａｒａ Ｈ，Ｌｉｍ Ｃｈｏｉ Ｙ，Ｓａｔｏｈ Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ Ｓ，Ｎａｋａｇａｗａ Ｋ，Ｍａｎｏ Ｈ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ．ＲＥＴ，ＲＯＳ１ ａｎｄ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３７８−８１． Ｌｉｐｓｏｎ Ｄ，Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ Ｍ，Ｙｅｌｅｎｓｋｙ Ｒ，Ｏｔｔｏ Ｇ，Ｐａｒｋｅｒ Ａ，Ｊａｒｏｓｚ Ｍ，Ｃｕｒｒａｎ ＪＡ，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｓ，Ｂｌｏｏｍ Ｔ，Ｂｒｅｎｎａｎ ＫＷ，Ｄｏｎａｈｕｅ Ａ，Ｄｏｗｎｉｎｇ ＳＲ，Ｆｒａｍｐｔｏｎ ＧＭ，Ｇａｒｃｉａ Ｌ，Ｊｕｈｎ Ｆ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＫＣ，Ｗｈｉｔｅ Ｅ，Ｗｈｉｔｅ Ｊ，Ｚｗｉｒｋｏ Ｚ，Ｐｅｒｅｔｚ Ｔ，Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎ Ｈ，Ｓｏｕｓｓａｎ−Ｇｕｔｍａｎ Ｌ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｓａｓａｋｉ Ｈ，Ｋｉｍ ＨＲ，Ｐａｒｋ ＳＩ，Ｅｒｃａｎ Ｄ，Ｓｈｅｅｈａｎ ＣＥ，Ｒｏｓｓ ＪＳ，Ｃｒｏｎｉｎ ＭＴ，Ｊaｎｎｅ ＰＡ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＰＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ＡＬＫ ａｎｄ ＲＥＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１８（３）：３８２−４．
これら及び他の要求は、チロシンキナーゼ活性、特に、ＲＯＳ１キナーゼ活性の阻害薬を用いて、肺腺癌を治療するための方法に関する本発明によって満たされる。本方法は、そうした治療を必要とする患者に、治療上有効な量の、ＲＯＳ１キナーゼ及び／またはＲＯＳ１融合タンパク質を調節する化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。一実施形態において、肺腺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。より詳細には、肺腺癌は、最も一般的に、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ（例えば、ＣＤ７４−ＲＯＳ１、ＦＩＧ−ＲＯＳ１、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ））及び他の既知のＲＯＳ１融合タンパク質を有するＮＳＣＬＣである。ＲＯＳ１キナーゼは、ヒト第６染色体（６ｑ２２）上のＲＯＳ１遺伝子によってコードされている。
一態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣの治療を必要とする患者のＮＳＣＬＣを治療するための方法に関し、治療上有効な量の、ＲＯＳ１及び／またはＲＯＳ１融合タンパク質を同時に調節する化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を患者に投与することを含む。
本態様及び他の態様の一実施形態において、ＲＯＳ１キナーゼ阻害薬またはＲＯＳ１融合キナーゼ阻害薬は、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017513908
 式中、
Ｒ１は、ハロであり、
Ｒ２は、ハロであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｑは、ＣＨまたはＮである。
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017513908
 式中、
Ｒ１は、ハロであり、
Ｒ２は、ハロであり、
Ｑは、ＣＨまたはＮである。
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017513908
化合物１は、Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドであり、カボザンチニブという名称で知られている。２０１２年１１月２９日、Ｎ−｛４−［（６，７−ジメトキシキノリン−４−イル）オキシ］フェニル｝−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドのＳ−リンゴ酸塩（すなわち、Ｌ−リンゴ酸塩）（カボザンチニブまたはＣＯＭＥＴＲＩＱ（登録商標）としても知られる）は、進行性／転移性甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）の治療薬として、米国食品医薬品局から承認された。２０１３年１２月、欧州ヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）に提出された、進行性で切除不能な局所進行性または転移性のＭＴＣを指定適応とするＣＯＭＥＴＲＩＱに関する販売承認申請（ＭＡＡ）に対して肯定的な見解を示した。カボザンチニブは、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）及び進行性肝細胞癌（ＨＣＣ）に関するフェーズ３のピボタル試験が進行中であることも含め、広範な開発計画にて評価されている。
化合物１は、ｃ−ＭＥＴ、ＲＥＴ及びＶＥＧＦＲ２の強力な阻害薬である。Ｙａｋｅｓ ＦＭ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｔａｎ Ｊ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｈｉ Ｙ，Ｙｕ Ｐ，Ｑｉａｎ Ｆ，Ｃｈｕ Ｆ，Ｂｅｎｔｚｉｅｎ Ｆ，Ｃａｎｃｉｌｌａ Ｂ，Ｏｒｆ Ｊ，Ｙｏｕ Ａ，Ｌａｉｒｄ ＡＤ，Ｅｎｇｓｔ Ｓ，Ｌｅｅ Ｌ，Ｌｅｓｃｈ Ｊ，Ｃｈｏｕ ＹＣ，Ｊｏｌｙ ＡＨ．カボザンチニブ（ＸＬ１８４）は、ＭＥＴ及びＶＥＧＦＲ２の新しい阻害薬であり、転移、血管新生及び腫瘍成長を同時に抑制する。Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｄｅｃ；１０（１２）：２２９８−３０８；Ｂｅｎｔｚｉｅｎ，Ｆ．，Ｚｕｚｏｗ，Ｍ．，Ｈｅａｌｄ，Ｎ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ａ．，Ｓｈｉ，Ｙ．，Ｇｏｏｎ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｐ．，Ｅｎｇｓｔ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｖｙｓｏｔｓｋａｉａ，Ｖ．，Ｃｈｕ，Ｆ．，Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｒ．，Ｃａｎｃｉｌｌａ，Ｂ．，Ｌａｍｂ，Ｐ．，Ｊｏｌｙ，Ａ．ａｎｄ Ｙａｋｅｓ，Ｍ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ（ＸＬ１８４），ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＲＥＴ，ＭＥＴ，ａｎｄ ＶＥＧＦＲ２，ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｙｒｏｉｄ，２０１３（２３）１５６９−１５７７．前臨床試験において、化合物１によって媒介されたキナーゼ活性の阻害により、腫瘍血管系の迅速かつ強力な退縮、腫瘍侵襲性及び転移の低減、並びに生存期間の延長がもたらされた。Ｓｅｎｎｉｎｏ Ｂ．，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ−Ｏｏｎｕｍａ Ｔ，Ｗｅｉ Ｙ，Ｎａｙｌｏｒ ＲＭ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ＣＷ，Ｂｈａｇｗａｎｄｉｎ Ｖ，Ｔａｂｒｕｙｎ ＳＰ，Ｙｏｕ ＷＫ，Ｃｈａｐｍａｎ ＨＡ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＧ，Ａｆｔａｂ ＤＴ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＤＭ．（２０１２），“Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃ−Ｍｅｔ ａｎｄ ＶＥＧＦ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ．”，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２（３）：２７０−８７（Ｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ，０２／２４／２０１２）．
別の実施形態において、式Ｉ、Ｉａの化合物、化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物として投与される。
一実施形態において、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物として投与され、ＲＯＳ１キナーゼ活性の構成的活性化につながる染色体再構成から生じたオーファン受容体チロシンキナーゼＲＯＳ１を含む発癌性融合キナーゼを阻害するために投与される。これらのＲＯＳ１融合キナーゼが、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩を用いた阻害の標的である。これらの化合物は、肺腺癌、例えば、１つまたは複数の発癌性ＲＯＳ１融合キナーゼを有する非小細胞肺癌を治療するために、薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物として投与することができる。
別の態様において、本発明は、１つまたは複数の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のＲＯＳ１キナーゼ及び／またはＲＯＳ１融合キナーゼ活性を阻害するための方法を提供し、式Ｉの化合物または式Ｉの化合物のリンゴ酸塩若しくは式Ｉの化合物の別の薬学的に許容可能な塩を含む、治療上有効な量の医薬組成物を、ＲＯＳ１キナーゼ及び／またはＲＯＳ１融合ポリペプチドを有する当該非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に投与することを含む。
別の態様において、本発明は、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ及び他の既知のＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ（ＲＯＳ１融合体であるＣＤ７４−ＲＯＳ１、ＦＩＧ−ＲＯＳ１、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）、並びにヒト第６染色体上のＲＯＳ１遺伝子によってコードされる他のＲＯＳ１融合タンパク質を含む）（Ｂｅｒｇｅｔｈｏｎ Ｋ，Ｓｈａｗ ＡＴ，Ｏｕ ＳＨ，Ｋａｔａｙａｍａ Ｒ，Ｌｏｖｌｙ ＣＭ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＮＴ，Ｍａｓｓｉｏｎ ＰＰ，Ｓｉｗａｋ−Ｔａｐｐ Ｃ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ａ，Ｆａｎｇ Ｒ，Ｍａｒｋ ＥＪ，Ｂａｔｔｅｎ ＪＭ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｗｉｌｎｅｒ ＫＤ，Ｋｗａｋ ＥＬ，Ｃｌａｒｋ ＪＷ，Ｃａｒｂｏｎｅ ＤＰ，Ｊｉ Ｈ，Ｅｎｇｅｌｍａｎ ＪＡ，Ｍｉｎｏ−Ｋｅｎｕｄｓｏｎ Ｍ，Ｐａｏ Ｗ，Ｉａｆｒａｔｅ ＡＪ．ＲＯＳ１ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｍａｒ １０；３０（８）：８６３−７０参照）を検出、診断及び治療するための方法を提供し、この方法は、式Ｉの化合物または式Ｉの化合物のリンゴ酸塩若しくは式Ｉの化合物の別の薬学的に許容可能な塩を含む、治療上有効な量の医薬組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１または化合物１のリンゴ酸塩、具体的には化合物１のＳ−リンゴ酸塩である。
別の態様において、本発明は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を必要とする患者の当該肺腺癌を治療するための方法を提供し、この方法は、当該患者に有効量の化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。
Figure 2017513908
別の態様において、本発明は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を必要とする患者の当該肺腺癌を治療するための方法を提供し、この方法は、当該患者に有効量の化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。
Figure 2017513908
別の態様において、本発明は、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を必要とする患者の当該肺腺癌を治療するための方法を提供し、この方法は、当該患者に有効量の化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。
Figure 2017513908
別の態様において、本発明は、ＮＳＣＬＣ細胞におけるＲＯＳ１融合キナーゼ活性を阻害する方法を提供し、この方法は、当該細胞と有効量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩とを接触させることを含む。
Figure 2017513908
 式中、
Ｒ１は、ハロであり、
Ｒ２は、ハロであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
Ｑは、ＣＨまたはＮである。
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍サンプル中に存在することが知られているＲＯＳ１融合タンパク質のグラフ表示である。ＮＳＣＬＣ、膠芽細胞腫及び胆管癌中のＲＯＳ１再構成。ＣＤ７４（Ｌ）／（Ｓ）：分化抗原分類７４長／短アイソフォーム；ＥＺＲ：エズリン；ＦＩＧ：膠芽細胞腫における融合；ＬＲＩＧ３：ロイシンの多い反復配列及び免疫グロブリン様ドメイン３；ＲＯＳ１ ＴＫ：融合パートナーを有するＲＯＳ１チロシンキナーゼドメイン；ＳＤＣ４：シンデカン−４；ＳＬＣ３４Ａ２（Ｌ）／（Ｓ）：溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）メンバー２長／短アイソフォーム；ＳＤＣ４：シンデカン−４；ＴＰＭ３：トロポミオシン３。エクソン番号Ｅ３２、Ｅ３４、Ｅ３５またはＥ３６は、ＲＯＳ１の切断点を指す。赤いボックスは、ＲＯＳ１で保持される膜貫通ドメインを示す。 化合物１の３−［（１Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン（クリゾチニブ、ＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標））を単回漸増用量で投与したＨＣＣ−７８ＮＳＣＬＣ細胞におけるインビトロでのＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合のリン酸化反応の阻害を示す。 本明細書中で配列番号１として示す代表的なヒトＲＯＳ１タンパク質のアミノ酸配列である。 本明細書中で配列番号２として示すヒトＲＯＳ１キナーゼドメインの代表的なアミノ酸配列である。
略語及び定義
以下の略語及び用語については、本出願の全体を通して以下に示す意味を有する。
Figure 2017513908
Figure 2017513908
記号「−」は、単結合を意味し、「＝」は、二重結合を意味する。
化学構造が図示または記載される場合、別途明記されない限り、全ての炭素は、原子価４に従った水素置換を有することが想定される。例えば、以下の模式図の左側の構造には、９つの水素があることが示唆される。この９つの水素を右側の構造に示す。構造中の特定の原子は、置換として１つの水素または複数の水素（明確に定義された水素）を有するものとして、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−のように文字式で示される場合もある。上述の記述法については、当該化学分野にて一般的であり、さもなければ複雑になる構造の説明に簡潔さ及び単純さをもたらすことは、当業者によって理解される。
Figure 2017513908
基「Ｒ」が、例えば、次式のように、環系上に「浮遊している」ように示される場合、
Figure 2017513908
 別途定めのない限り、置換基「Ｒ」は、環系のどの原子上に存在してもよく、安定した構造が形成されるのであれば、図示され、含意され、または明白に定義された、環原子のうちの１つの水素の置換が想定される。
基「Ｒ」が、例えば、次式のように、縮合環系上に浮遊しているように示される場合、
Figure 2017513908
 別途定めのない限り、置換基「Ｒ」は、縮合環系のどの原子上に存在してもよく、安定した構造が形成されるのであれば、環原子のうちの１つの図示された水素（例えば、上式中の−ＮＨ−）、含意された水素（例えば、上式のように、図示されていないが存在が理解される水素）、または明白に定義された水素（例えば、上式中「Ｚ」が＝ＣＨ−に等しい場合）の置換が想定される。示した例において、「Ｒ」基は、縮合環系の５員環または６員環のいずれに存在してもよい。基「Ｒ」が、例えば、次式のように、飽和炭素を含有する環系上に存在するように示される場合、
Figure 2017513908
 この例にて、「ｙ」は２以上であり得、それぞれのＲにより、現に図示され、含意され、または明白に定義された、環上の水素が置換されることが想定され、また更に、別途定めのない限り、得られる構造が安定であれば、２つの「Ｒ」は、同じ炭素上に存在してもよい。単純な例としては、Ｒがメチル基の場合であり、示された環の炭素（「環状」炭素）上にジェミナルジメチルが存在し得る。別の例としては、同じ炭素上の２つのＲは、その炭素を含め、環を形成してもよく、したがって、例えば、次式のように示される環を有するスピロ環式環（「スピロシクリル」基）構造を与える。
Figure 2017513908
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。
本明細書で使用するとき、「ＲＯＳ１」タンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物のＲＯＳ１、例えば、ヒトＲＯＳ１キナーゼタンパク質（ＲＯＳ１遺伝子によってコードされる）を含む。これは、２３４７アミノ酸長の受容体チロシンキナーゼであり、異常発現して癌をもたらす傾向がある。完全長ヒトＲＯＳ１キナーゼ（ヒトＲＯＳ１タンパク質のアミノ酸配列を有するもの）の説明については、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８９２２に認めることができる。更に、複数のＲＯＳ１の天然バリアントが知られている（例えば、Ｇｒｅｅｎｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４４６：１５３−１５８，２００７参照）。マウス完全長ＲＯＳ１のヌクレオチド及びアミノ酸配列が知られている（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ７８ＤＸ７参照）。生物学の当業者であれば、慣用的実験を用いて、非ヒト哺乳動物のＲＯＳ１ホモログ中の対応する配列を容易に決定することができるであろう。
「野生型」ＲＯＳ１とは、正常な個体（例えば、癌に罹患していない正常な個体）の健康な（または正常な）組織（例えば、非癌性組織）中の完全長ＲＯＳ１キナーゼ（すなわち、ヒトＲＯＳ１の場合、２３４７アミノ酸長のポリペプチド（配列番号１）またはシグナルペプチド配列が除去された後の２３２０アミノ酸長のポリペプチド（成熟配列））を意味する。ＲＯＳ１キナーゼ（完全長または切断型）は、ヒトの正常肺組織では発現しないと思われる。しかしながら、以下に記載の方法を使用して、本発明者らは、本明細書に記載の化合物を用いる、肺癌細胞中のＲＯＳ１キナーゼの特異的阻害に関する驚くべき発見をなした。標準的細胞（例えば、非癌性肺細胞）中で発現が見られない、異型細胞（この場合、癌細胞）におけるこのような発現は、異常である。
別のタンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４またはＦＩＧとの融合体の形態で異常に発現したＲＯＳ１キナーゼは、膠芽細胞腫（Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ３７：５８−７１，２００３；Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：９１６−９２１，２００３参照）、肝臓癌（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０９３９２８参照）、胆管癌（Ｇｕら、ＰＬＯＳ ｏｎｅ ２０１１ Ｊａｎ ６；６（１）：ｅ１５６４０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１５６４０参照）、ＮＳＣＬＣ腺癌（Ｋｕｒｔｉｓ Ｄ．Ｄａｖｉｅｓら、Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＯＳ１ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １；１８（１７）：４５７０−４５７９参照）にて報告されている。
本明細書で使用するとき、「ＲＯＳ１融合体」という用語は、ＲＯＳ１タンパク質のキナーゼドメインを含むＲＯＳ１ポリペプチド（または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の一部が別のポリペプチド（または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の全部または一部に融合したものを指し、その第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの名称が融合体に付けられる。（「融合体」という用語は、第１の遺伝子由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全部または一部が、第２の遺伝子に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの全部または一部に融合したものを単に意味する。）例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体は、ＳＬＣ３４Ａ２ポリペプチド（または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の一部と、キナーゼドメインＲＯＳ１を含むＲＯＳ１ポリペプチド（または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の一部との融合体である。ＲＯＳ１融合体は、多くの場合、染色体転座または逆位から生じる。多数のＲＯＳ１融合体が知られており、それらの全てが本発明のＲＯＳ１融合体であり、限定するものではないが、メンバーとしてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（ＶＳ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（Ｓ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（Ｌ）が含まれるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質（米国特許出願公開第２０１００１４３９１８号参照）、ＣＤ７４−ＲＯＳ１（米国特許出願公開第２０１００２２１７３７号参照）並びにメンバーとしてＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＸＬ）が含まれるＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１０／０９３９２８参照）が挙げられ、これらの開示の全体をそれぞれ本明細書に援用する。ＲＯＳ１ポリペプチドまたはＲＯＳ１融合体の後に続く（Ｌ）、（Ｓ）、（ＶＳ）、（ＶＬ）、（ＸＳ）または（ＸＬ）という表記は、一般に、それぞれ長い、短い、特に短い、特に長い、極めて短い、極めて長いＲＯＳ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。
既知のＲＯＳ１融合タンパク質の全てが完全長ＲＯＳ１の完全なキナーゼドメインを含む。したがって、本明細書で使用するとき、「ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチド」（または「ＲＯＳ１キナーゼ活性を持つポリペプチド」）は、完全長ＲＯＳ１タンパク質の完全なキナーゼドメインを含むタンパク質（またはポリペプチド）を意味し、したがって、ＲＯＳ１キナーゼ活性を保持する。ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するタンパク質の非限定的な例としては、完全長ＲＯＳ１タンパク質、メンバーとしてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（ＶＳ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（Ｓ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（Ｌ）が含まれるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質（米国特許出願公開第２０１００１４３９１８号参照）、ＣＤ７４−ＲＯＳ１（米国特許出願公開第２０１００２２１７３７号参照）並びにメンバーとしてＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＸＬ）が含まれるＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１０／０９３９２８参照）、並びに完全長ＲＯＳ１キナーゼタンパク質のキナーゼドメインを保持するＲＯＳ１キナーゼのあらゆる切断型及び変異型が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＯＳ１の代表的なキナーゼドメインを配列番号２に記載する。「ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチド」は、そのアミノ酸配列に配列番号２またはそのキナーゼ活性部分を含むものである。
本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」（または「アミノ酸配列」または「タンパク質」）は、決められた順序の連結から形成された高分子、好ましくは、a−アミノ酸、Ｄ−、Ｌ−アミノ酸及びこれらの組み合わせの高分子を指す。１つのアミノ酸残基と次のアミノ酸残基との連結は、アミド結合またはペプチド結合と呼ばれる。ポリペプチドの非限定的な例としては、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列及びそれらの断片または一部が挙げられ、天然分子または合成分子を指す。ポリペプチドにはまた、糖タンパク質及びリポタンパク質などの誘導体化された分子並びに低分子量ポリペプチドも含まれる。「アミノ酸配列」及び同様の用語、例えば、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、示したアミノ酸配列について、列挙したタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定するという意味ではない。
本発明のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、変異体タンパク質の構造及び機能に大きな影響をもたらすことなく、変更することができることは当該技術分野において認識されている。配列中にこうした変化が企図される場合、タンパク質上には活性を決定する必須領域（例えば、ＲＯＳ１のキナーゼドメイン）が存在することに留意する必要がある。一般に、類似の機能を果たす残基が使用されることを条件として、三次構造を形成する残基を置き換えることが可能である。他の場合、残基の種類は、タンパク質の非必須領域で変更が生じるのであれば、全く重要でない場合もある。
したがって、本発明のＲＯＳ１活性を有するポリペプチドには、実質的なＲＯＳ１キナーゼ活性を示す、本明細書に記載の完全長ＲＯＳ１タンパク質または種々のＲＯＳ１融合ポリペプチドのバリアントが更に含まれる。いくつかの非限定的な保存的置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間の相互交換；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの交換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換；並びに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの交換が挙げられる。当業者に知られている保存的アミノ酸置換の更なる例は、芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン（例えば、トリプトファン残基をフェニルアラニンで置換する）；疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン；極性：グルタミン、アスパラギン；塩基性：アルギニン、リシン、ヒスチジン；酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；低分子：アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシンである。上に詳述したように、どのアミノ酸変更が表現型的にサイレントである可能性があるか（すなわち、機能に大きな悪影響を及ぼさないと思われるか）に関する更なるガイダンスについては、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、上掲に見出すことができる。
「ＳＬＣ３４Ａ２」は、ヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子タンパク質またはＳＬＣ３４Ａ２遺伝子によってコードされているナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ｂを指し得る。ヒトＳＬＣ３４Ａ２タンパク質（アイソフォームＡ、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１４６９を有するもの）は、６８９アミノ酸タンパク質である。ＳＬＣ３４Ａ２については、本明細書にて更に記載する。
ＣＤ７４はまた、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連インバリアント鎖またはＣＤ７４（分化抗原分類７４）としても知られる、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原γ鎖を指し、ヒトにおいてはＣＤ７４遺伝子によってコードされているタンパク質である。例示的なヒトＣＤ７４タンパク質は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０２０３２９を有するものであり、ｍＲＮＡは、アクセッション番号ＮＭ＿００１０２５１５８である。ＣＤ７４は、１６０個のアミノ酸を有し、第５染色体（５ｑ３２）上に位置するＣＤ７４遺伝子によってコードされている。ＣＤ７４は、９つのエクソンを有する。ＣＤ７４については、本明細書にて更に記載する。
ＦＩＧ（膠芽細胞腫における融合）はまた、「ゴルジ装置関連ＰＤＺ及びコイルドコイルモチーフ含有」または「ＧＯＰＣ」タンパク質とも呼ばれ、第６染色体６ｑ２１上に位置する遺伝子によってコードされている。ヒトにおけるこのタンパク質は、４６２個のアミノ酸を有する。ＦＩＧは、選択的スプライシングによって生成される３つのアイソフォームがある。本発明にて言及するヒトＦＩＧタンパク質の例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｑ９ＨＤ２６−１を有するものである。
「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質または遺伝子」は、パートナーＳＬＣ３４Ａ２とＲＯＳ１との体細胞遺伝子融合体を指す。いくつかの実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２などの融合パートナーのＮ末端ドメインと、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端キナーゼドメインとを含む。融合パートナーのＮ末端ドメインは、融合タンパク質のＮ末端に位置し得、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端キナーゼドメインは、融合タンパク質のＣ末端に位置し得る。融合パートナーは、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質のＮ末端ドメインであってよく、融合タンパク質のＮ末端に位置する。この場合、融合タンパク質は、Ｎ末端にＳＬＣ３４Ａ２タンパク質のＮ末端ドメインと、Ｃ末端にＲＯＳ１タンパク質のＣ末端キナーゼドメインとを含む、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１タンパク質として表すことができる。別の実施形態は、融合パートナーのＮ末端ドメインをコードする遺伝子が５’末端に位置し、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端キナーゼドメインをコードする遺伝子が３’末端に位置する、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を提供する。いくつかの実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質の部分は、異常な染色体転座の結果、機能性キナーゼドメインを含むＲＯＳ１タンパク質の部分にインフレームで融合し、ＳＬＣ３４Ａ２を有するＲＯＳ１染色体再構成が生じる。いくつかの実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質は、融合ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２を含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質は、融合ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４を含み得、本発明にて用いられる機能性ＲＯＳ１キナーゼドメインを有するＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質または遺伝子は、２つの転座パートナーであるＳＬＣ３４Ａ２及びＲＯＳ１に関する他の切断点を含んでもよい。代表的なＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質は、癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができ、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
「ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質または遺伝子」は、パートナーＣＤ７４とＲＯＳ１との体細胞遺伝子融合体を指す。代表的なＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質は、癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができ、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
「ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質または遺伝子」は、パートナーＦＩＧとＲＯＳ１との体細胞遺伝子融合体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト第６染色体の位置６ｑ２１における２４０キロベースの染色体内ホモ欠失がＦＩＧ−ＲＯＳ１遺伝子座の形成の要因である。いくつかの実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１転写物は、７つのＦＩＧエクソン及び９つのＲＯＳ１由来エクソンによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１遺伝子は、構成的活性及び機能性のあるＲＯＳ１キナーゼドメインを有するインフレーム融合タンパク質をコードする。代表的なＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質は、癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができ、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
本発明の目的における「患者」には、ヒト及び他の動物、特に哺乳類、並びに他の生命体が含まれる。したがって、方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。別の実施形態において、患者は哺乳動物であり、別の実施形態において、患者はヒトである。
化合物の「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。薬学的に許容可能な塩は、無毒であることが理解される。好適な薬学的に許容可能な塩に関する更なる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５（参照により本明細書に援用する）またはＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７；６６：１−１９に見出すことができ、両文献を参照により本明細書に援用する。
薬学的に許容可能な酸付加塩の例には、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、並びに有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸、ｐ−トルエンスルホン酸及びサリチル酸などと形成されたものが挙げられる。
「プロドラッグ」とは、例えば、血液中の加水分解によって、インビボで（通常迅速に）変換されて、上式の親化合物を生じる化合物を指す。一般的な例には、カルボン酸部分を持つ活性形を有する化合物のエステル型及びアミド型が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物の薬学的に許容可能なエステルの例には、アルキル基が直鎖または分枝鎖であるアルキルエステル（例えば、約１〜約６個の炭素を有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない。許容可能なエステルにはまた、シクロアルキルエステル及びアリールアルキルエステル、例えば、限定するものではないが、ベンジルが挙げられる。本発明の化合物の薬学的に許容可能なアミドの例には、一級アミド並びに二級及び三級アルキルアミド（例えば、約１〜約６個の炭素を有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の化合物のアミド及びエステルは、従来の方法に従って調製することができる。プロドラッグについての丹念な考察は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，” Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ及びＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に記載されており、本出願において両文献を参照により本明細書に援用する。
「ＲＯＳ１」または「ＲＯＳ１タンパク質」は、膜貫通型受容体チロシンキナーゼであり、本明細書にて更に説明する。
「治療上有効な量」は、患者に投与されたとき、疾患の症状を改善する、本発明の化合物の量である。治療上有効な量は、単独でまたは他の活性成分と組み合わせて、ｃ−Ｍｅｔ及び／若しくはＶＥＧＦＲ２の調節に有効であるか、または癌の治療若しくは予防に有効である化合物の量を含むことが意図される。「治療上有効な量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患状態及びその重症度、治療対象の患者の年齢などに応じて変動する。治療上有効な量は、当業者であれば、その知識及び本開示を考慮して、決定することができる。
本明細書で使用するとき、疾患、障害または症候群を「治療すること」またはこれらの「治療」には、（ｉ）当該疾患、障害または症候群がヒトに生じるのを予防すること、すなわち、当該疾患、障害若しくは症候群に曝されているか、またはその素因のある可能性があるものの、まだその疾患、障害または症候群の症状を経験または呈示していない動物において、その疾患、障害または症候群の臨床症状が発現しないようにすること、（ｉｉ）当該疾患、障害または症候群を後退させ、または阻害すること、すなわち、その発症を抑えること、及び（ｉｉｉ）当該疾患、障害または症候群を緩和すること、すなわち、その疾患、障害または症候群を後退させることが含まれる。当該技術分野で周知のように、全身送達対局所送達、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与時期、薬物相互作用及び状態の重症度についての調整が必要な場合があり、それらは慣用的実験によって確認できる。
本明細書に記載の反応のそれぞれに関する「収率」は、理論収率のパーセンテージとして表す。
実施形態
一実施形態において、式Ｉの化合物は、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017513908
 式中、
Ｒ１は、ハロであり、
Ｒ２は、ハロであり、
Ｑは、ＣＨまたはＮである。
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
Figure 2017513908
 前述のように、化合物１は、本明細書において、Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドと称する。ＷＯ２００５／０３０１４０（参照により全体を本明細書に援用する）は、化合物１を開示し、その作製法を記載し（ＷＯ２００５／０３０１４０、実施例１２、３７、３８及び４８）、キナーゼのシグナル伝達を阻害、制御及び／または調節するための本化合物の治療活性についても開示している（ＷＯ２００５／０３０１４０、アッセイ、表４、項目２８９）。実施例４８は、ＷＯ２００５／０３０１４０の段落［０３５３］に記載されている。
他の実施形態において、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、医薬組成物として投与され、この医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を更に含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１である。
本明細書に記載の式Ｉの化合物、式Ｉａ及び化合物Ｉには、列挙した化合物、並びに個々の異性体及び異性体の混合物のいずれもが含まれる。それぞれの場合において、式Ｉの化合物には、列挙した化合物の薬学的に許容可能な塩、水和物及び／または溶媒和物、並びにそれらのあらゆる個々の異性体または異性体の混合物が含まれる。
他の実施形態において、式Ｉ、Ｉａの化合物または化合物１は、（Ｌ）−リンゴ酸塩であってよい。式Ｉの化合物及び化合物１のリンゴ酸塩は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１１９４及びＵＳＳＮ６１／３２５０９５に記載されており、両出願の全体を参照により本明細書に援用する。
他の実施形態において、式Ｉの化合物は、（Ｄ）−リンゴ酸塩であり、Ｒ−リンゴ酸塩とも称される。
他の実施形態において、式Ｉａの化合物は、リンゴ酸塩である。
他の実施形態において、式Ｉａの化合物は、（Ｌ）−リンゴ酸塩であり、Ｓ−リンゴ酸塩とも称される。
他の実施形態において、化合物１は、（Ｄ）−リンゴ酸塩であり、Ｓ−リンゴ酸塩とも称される。
他の実施形態において、化合物１は、リンゴ酸塩である。
他の実施形態において、化合物１は、（Ｌ）−リンゴ酸塩であり、Ｓ−リンゴ酸塩とも称される。
別の実施形態において、リンゴ酸塩は、米国特許出願第６１／３２５０９５号に開示されている化合物１の（Ｌ）リンゴ酸塩及び／または（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である。また、化合物１のリンゴ酸塩のＮ−１及び／またはＮ−２の結晶形態を含む、結晶性エナンチオマーの性質については、ＷＯ２００８／０８３３１９（参照により全体を援用する）を参照されたい。このような形態の作製法及び特性評価法については、ＰＣＴ／ＵＳ１０／０２１１９４に十分に記載されており、当該開示の全体を参照により本明細書に援用する。
別の実施形態において、本発明は、ＮＳＣＬＣを後退させ、または阻害するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示する実施形態のいずれかにおいて、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
別の実施形態において、本発明は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣを後退させ、または阻害するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示する実施形態のいずれかにおいて、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
別の実施形態において、本発明は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣを後退させ、または阻害するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示する実施形態のいずれかにおいて、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
別の実施形態において、本発明は、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣを後退させ、または阻害するための方法に関し、この方法は、本明細書に開示する実施形態のいずれかにおいて、そのような治療を必要とする患者に、治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。具体的な実施形態において、式Ｉの化合物は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、１つまたは複数の他の治療の前、それと同時、またはその後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、１つまたは複数の治療の後に投与される。「治療」は、外科手術、化学療法剤、ホルモン療法、抗体、免疫療法、放射性ヨウ素療法及び放射線を含む、当業者に利用可能な治療選択肢のいずれかを意味する。特に、「治療」は、別の化学療法剤または抗体を意味する。
したがって、別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。
別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。
別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、ＨＥＲ−２抗体治療後に投与される。別の実施形態において、ＨＥＲ−２抗体は、トラスツズマブである。
別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。
別の実施形態において、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、錠剤またはカプセル剤にて、１日１回経口投与される。これらの実施形態及び他の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、カプセル剤または錠剤にて、経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、最大１００ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１００ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、９５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、９０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、８５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、８０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、７５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、７０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、６５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、６０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、４５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、４０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、３５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、３０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、２５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、２０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、１０ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、５ｍｇの化合物１を含有するカプセル剤または錠剤にて、１日１回経口投与される。
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に記載する錠剤にて、１日１回経口投与される。
Figure 2017513908
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に記載する錠剤にて、１日１回経口投与される。
Figure 2017513908
別の実施形態において、化合物１は、その遊離塩基またはリンゴ酸塩として、以下の表に記載する錠剤にて、１日１回経口投与される。
Figure 2017513908
上記の錠剤配合のうちのいずれも、所望される化合物１またはその薬学的に許容可能な塩の用量に応じて調整することができる。したがって、配合成分のそれぞれの量を比例調整して、前述の段落に記載した化合物１の種々の量を含有する錠剤配合を得ることができる。別の実施形態において、製剤は、２０、４０、６０または８０ｍｇの化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞増殖の進行を阻害し、または後退させるための方法を提供し、この方法は、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質並びにヒト第６染色体（６ｑ２２）上のＲＯＳ１遺伝子にコードされている機能性Ｃ末端ＲＯＳ１キナーゼドメインを含有する他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌である。一実施形態において、癌は肺腺癌である。別の場合において、肺腺癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物は、別の形態の治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物は、クリゾチニブ治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物は、カルボプラチン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。
いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞増殖の進行を阻害し、または後退させるための方法を提供し、この方法は、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質並びにヒト第６染色体（６ｑ２２）上のＲＯＳ１遺伝子にコードされている機能性Ｃ末端ＲＯＳ１キナーゼドメインを含有する他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌である。一実施形態において、癌は肺腺癌である。別の場合において、肺腺癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物は、別の形態の治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物は、カルボプラチン治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞増殖の進行を阻害し、または後退させるための方法を提供し、この方法は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質並びにヒト第６染色体（６ｑ２２）上のＲＯＳ１遺伝子にコードされている機能性Ｃ末端ＲＯＳ１キナーゼドメインを含有する他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌である。一実施形態において、癌は肺腺癌である。別の場合において、肺腺癌は、非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、肺腺癌は、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与される。別の実施形態において、化合物１は、別の形態の治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、ドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される。別の実施形態において、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩は、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチン治療後に投与される。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞増殖の進行を予防し、治療し、阻害し、または後退させるための方法を提供し、この方法は、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質または他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌であり、癌は、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンの治療レジメンによる処置を以前に受けており、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性がある。いくつかの実施形態において、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性のある癌は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質から選択される１つまたは複数のＲＯＳ１融合タンパク質を有し、かつ／あるいはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質またはＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する。一実施形態において、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性のある癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する癌である。関連する実施形態において、癌は、ＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する、クリゾチニブ難治性であるＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の肺腺癌、例えば、クリゾチニブ難治性ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣである。別の実施形態において、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性のある癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに、Ｅ１９９０Ｇ、Ｇ２０３２Ｒ、Ｌ２０２６Ｍ、Ｌ１９５１Ｒ、Ｍ２１２８Ｖ、Ｋ２００３Ｉ及びこれらの組み合わせから選択される変異を有する、癌、例えば、クリゾチニブ耐性肺腺癌、例えば、クリゾチニブ耐性ＮＳＣＬＣである。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物における異常細胞増殖、例えば癌の進行を予防し、治療し、阻害し、または後退させるための方法を提供し、この方法は、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質または他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌であり、癌は、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンの治療レジメンによる処置を以前に受けており、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性がある。いくつかの実施形態において、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性のある癌は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質及びＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質から選択される１つまたは複数のＲＯＳ１融合タンパク質を有し、かつ／あるいはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質またはＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する。一実施形態において、クリゾチニブに耐性のある癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する癌である。関連する実施形態において、癌は、ＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する、クリゾチニブ難治性であるＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の肺腺癌、例えば、クリゾチニブ難治性ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣである。別の実施形態において、クリゾチニブに耐性のある癌は、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに、Ｅ１９９０Ｇ、Ｇ２０３２Ｒ、Ｌ２０２６Ｍ、Ｌ１９５１Ｒ、Ｍ２１２８Ｖ、Ｋ２００３Ｉ及びこれらの組み合わせから選択される変異を有する、癌、例えば、クリゾチニブ耐性肺腺癌、例えば、クリゾチニブ耐性ＮＳＣＬＣである。上述した各種実施形態において、哺乳動物における異常細胞増殖の進行を予防し、治療し、阻害し、または後退させるための方法は、式Ｉの化合物若しくは式Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲である代表的な治療上有効な用量で、それを必要とする患者に投与することを含み、異常細胞増殖は、ＲＯＳ１融合タンパク質、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質または他のＲＯＳ１融合タンパク質によって媒介される癌であるか、あるいはＲＯＳ１融合タンパク質に１つまたは複数の変異、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｌ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）融合タンパク質、ＦＩＧ−ＲＯＳ１（ＶＬ）融合タンパク質または他のＲＯＳ１融合タンパク質のＲＯＳ１キナーゼドメインに変異を有する癌であり、いくつかの実施形態において、クリゾチニブ及び／またはカルボプラチンの治療レジメンによる処置を以前に受けており、かつクリゾチニブ及び／またはカルボプラチンに耐性のある癌、例えば、クリゾチニブ耐性癌、例えば、クリゾチニブ耐性肺腺癌、例えば、クリゾチニブ耐性ＮＳＣＬＣである。
投与
純粋な形態または適切な医薬組成物での式Ｉの化合物、式Ｉａ若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩の投与は、同様の有用性を提供する、許容される投与様式または薬剤のいずれかを介して行うことができる。したがって、投与は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、軟質及び硬質ゼラチン剤（カプセル剤でも錠剤でもよい）、散剤、液剤、懸濁液またはエアロゾルなどの固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体の剤形、特に、正確な投与量を簡単に投与するのに好適な単位剤形で、例えば、経口的、経鼻的、非経口的（静脈内、筋肉内または皮下）、局所的、経皮的、膣内、膀胱内、槽内または経直腸的であってよい。
組成物は、従来の薬物担体または賦形剤と、活性物質である式Ｉの化合物とを含み、加えて、担体及び補助剤などを含んでよい。
補助剤には、保存剤、湿潤剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味剤、着香剤、乳化剤及び分散剤が挙げられる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより担保することができる。また、等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを含めることが望ましい場合がある。注入可能な医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによりもたらすことができる。
所望により、式Ｉの化合物の医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、抗酸化剤など、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの少量の補助物質を含有してもよい。
組成物の選択は、薬物投与形態（例えば、経口投与の場合は、錠剤、丸剤またはカプセル剤の形態の組成物）及び薬剤物質のバイオアベイラビリティなどの各種要因に依存する。近年、表面積を増加させることにより、すなわち、粒径を小さくすることで、バイオアベイラビリティの向上が可能であるという原理に基づいて、バイオアベイラビリティに劣る薬剤物質に関する医薬組成物が特に開発されている。例えば、米国特許第４，１０７，２８８号は、活性物質が巨大分子の架橋マトリックス上に担持された、１０〜１，０００ｎｍの範囲の大きさの粒子を有する医薬組成物について記載している。米国特許第５，１４５，６８４号は、薬剤物質を表面改質剤の存在下でナノ粒子（平均粒径４００ｎｍ）に粉砕し、次いで液体媒体中に分散させて、著しく高いバイオアベイラビリティを示す医薬組成物を得る、医薬組成物の製造について記載している。
非経口注入に適した組成物は、生理学的に許容される滅菌した水性若しくは非水性溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、及び注入可能な滅菌溶液または分散液中に再構成される滅菌粉末を含み得る。好適な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。
具体的な投与経路の１つは、治療する疾患状態の重症度に応じて調整することができる、簡便な１日の投与計画を用いる、経口投与である。
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形の場合、活性化合物は、少なくとも１つの通常の不活性な賦形剤（または担体）、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、あるいは（ａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、ステアリン酸マグネシウムなど、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイト、並びに（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはこれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。
上記の固体剤形は、腸溶性コーティングなどのコーティング及びシェル並びに当該技術分野において既知の他のものを用いて調製することができる。これらは、安定化剤を含んでもよく、また、腸管のある特定の部分で活性化合物または化合物を遅延方式で放出するような組成物であってよい。使用することができる組み込み組成物の例は、ポリマー物質及びワックスである。活性化合物はまた、適切であれば、上記の賦形剤のうちの１つまたは複数を含むマイクロカプセル化の形態であってもよい。
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容可能な乳剤、液剤、懸濁液、シロップ剤及びエリキシル剤が挙げられる。このような剤形は、例えば、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩及び任意選択の医薬品補助剤を、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体；可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物などに溶解、分散させ、これにより、溶液または懸濁液を形成することなどによって調製される。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天並びにトラガカントまたはこれらの物質の混合物などを含み得る。
直腸投与用の組成物は、例えば、坐薬であってよく、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩と、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤用ワックスなどの好適な非刺激性賦形剤または担体とを混合することによって調製することができる。これらは、常温では固体であるが、体温で液状になるため、好適な体腔中で溶融し、その中の活性成分が放出される。
式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩の局所投与の剤形には、軟膏剤、散剤、スプレー剤及び吸入剤が挙げられる。活性成分は、生理学的に許容される担体及び必要な場合には任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と滅菌条件下で混合される。眼用組成物、眼用軟膏剤、散剤及び液剤もまた、本開示の範囲内であることが企図される。
圧縮ガスを用いて、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩をエアロゾル形態で分散させることができる。この目的に好適な不活性ガスは、窒素、二酸化炭素などである。
一般に、意図する投与方法に応じて、薬学的に許容可能な組成物は、約１重量％〜約９９重量％の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩と、９９重量％〜１重量％の好適な医薬品賦形剤とを含む。一例において、組成物は、式Ｉ、式Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩が約５重量％〜約７５重量％であり、残りが好適な医薬品賦形剤である。
このような剤形を調製するための実際の方法は、当業者に知られており、当業者には明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）を参照されたい。投与する組成物は、いずれにせよ、本開示の教示に従って疾患状態を治療するために、治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を含む。
本開示の化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物は、治療上有効な量で投与され、この量は、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、全般的な健康、性別及び食事、投与の様式及び時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の疾患状態の重症度並びに対象が受けている療法を含む、種々の要因に応じて変化する。式Ｉ、式Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、１日当たり約０．１〜約１，０００ｍｇの範囲の用量で患者に投与することができる。体重約７０キログラムの正常なヒト成人の場合、１日当たり約０．０１〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲の用量が一例である。しかしながら、用いられる具体的な用量は、変動し得る。例えば、用量は、患者の要件、治療を施す状態の重症度、及び用いられる化合物の薬理活性を含む多数の要因に依存し得る。特定の患者に対する最適量の決定は、当業者によく知られている。
他の実施形態において、式Ｉ、式Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、他の癌治療と同時に患者に投与することができる。かかる治療には、とりわけ、他の癌化学療法、ホルモン補充療法、放射線治療または免疫療法が挙げられる。他の療法の選択は、化合物の代謝安定性及び作用期間、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の疾患状態の重症度並びに対象が受けている療法を含む、種々の多数の要因に依存する。
別の態様において、本発明は、ＲＯＳ１融合体に関連する疾患、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ及びＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、並びに他のＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣを検出、診断及び治療するための方法を提供する。このような疾患の検出及び診断のための方法について、本明細書にて更に詳述する。これらの疾患の治療は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣ及びＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣなどのＲＯＳ１融合に関連する疾患を有すると特定されたか、またはその診断を受けた患者に、式Ｉの化合物または式Ｉの化合物のリンゴ酸塩若しくは式Ｉの化合物の別の薬学的に許容可能な塩を含む、治療上有効な量の医薬組成物を投与することにより、良好に達成することができ、具体的な実施形態では、式Ｉの化合物は、化合物１または化合物１のリンゴ酸塩である。
別の態様において、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩は、肺癌を予防または治療するために、患者に投与される。これらの実施形態のいくつかにおいて、方法は、活性成分として、ＲＯＳ１融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害薬、当該融合タンパク質をコードするＲＯＳ１融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬またはそれらの組み合わせ含む組成物を、必要とする患者に投与することを含む。
ＲＯＳ１並びに融合パートナーＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４及びＦＩＧ
ＲＯＳ１タンパク質、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質、ＣＤ７４タンパク質及びＦＩＧタンパク質、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体若しくはＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体または時に単に「ＲＯＳ１融合タンパク質及び核酸」と呼ぶものは、検出、診断の方法、検出及び診断のためのキット、スクリーニングの方法、治療及び予防の方法、並びに肺癌患者のための様々な療法、治療薬及び他の薬物成分の有効性を測定するための方法を含め、以下に記載する種々の治療と組み合わせて使用することができる。
ＲＯＳ１タンパク質は、オルファン膜貫通型受容体チロシンキナーゼである。ヒトＲＯＳ１キナーゼタンパク質（ＲＯＳ１遺伝子によってコードされる）は、２３４７アミノ酸長の受容体チロシンキナーゼであり、異常発現して癌をもたらす傾向がある。完全長ヒトＲＯＳ１キナーゼ（ヒトＲＯＳ１タンパク質のアミノ酸配列を有するもの）の説明については、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８９２２（Ｅ．Ｃ．−２．７．１０．１）に見出すことができる。表１に示すように、ＲＯＳ１のシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びキナーゼドメインは、配列番号１の以下のアミノ酸残基に認められる。
Figure 2017513908
ヒトＲＯＳ１タンパク質は、ヒト第６染色体上に位置するヒトＲＯＳ１遺伝子によってコードされ得る。ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインは、ＲＯＳ１遺伝子の３１番目若しくは３２番目若しくは３４番目のエクソンから最後のエクソン（例えば、３２番目または３４番目のエクソン）までのポリヌクレオチドまたはその断片によってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインは、３１番目または３２番目のエクソンの開始位置から連続して少なくとも約１００のアミノ酸を含み得る。例えば、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインは、３２番目のエクソン（長い形態）または３４番目のエクソン（短い形態）の開始位置からＲＯＳ１タンパク質のＣ末端に向かって、連続して約１００〜約７００のアミノ酸、連続して約２００〜約６００のアミノ酸、または連続して約２５０〜約５００のアミノ酸、または連続して約２７０〜約４２５のアミノ酸、または連続して約２７０〜約４５０のアミノ酸、または連続して約４７５〜約６２５のアミノ酸を含み得る。ＲＯＳ１タンパク質の推定切断点は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質及びＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質については１７５０または１８５２〜１８５３ａａ、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質については１８８０〜１８８１ａａである。
１つの例示的実施形態において、ヒトＳＬＣ３４Ａ２タンパク質（ｍＲＮＡ ＮＭ＿００１１７７９９８）をコードするヒトＳＬＣ３４Ａ２遺伝子は、ヒト第４染色体（４ｐ１５．２）上に局在し、１３のエクソンと、アミノ酸長が約６９０のアミノ酸とを含む。この遺伝子によってコードされているタンパク質は、ｐＨ感受性ナトリウム依存性リン酸輸送体である。この遺伝子の欠損は、肺胞微石症の一因である。２つの異なるアイソフォームをコードする３つの転写バリアントが、この遺伝子について確認されている。ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質は、ヒトなどの哺乳動物に由来し得る。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の１番目のエクソンから１２番目のエクソン、または１番目のエクソンから４番目のエクソン、または１番目のエクソンから２番目のエクソンのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の構造中に最近観察されたこれらのエクソンは、４２９及び２０７６の推定切断点を有する。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質の１番目の位置から連続して少なくとも約３０〜２５０のアミノ酸（すなわち、少なくとも１番目から２５０番目の位置までのアミノ酸配列またはその断片）を含み得る。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質の１番目のアミノ酸位置から連続して約３０〜２５０のアミノ酸、連続して約３０〜２２５のアミノ酸、連続して約４０〜２００のアミノ酸、または連続して約４０〜１７５のアミノ酸を含み得る。
１つの例示的実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合は、ＲＯＳ１の３’領域がＳＬＣ３４Ａ２の５’領域に融合する、ヒト第６染色体と第４染色体との間の染色体転座である。融合タンパク質は、当業者に知られている及び／または本明細書に記載される各種方法を用いて、検出及び検証される。いくつかの実施形態では、次いで、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、肺癌を予防または治療するために、それを必要とする患者に投与される。いくつかの実施形態において、活性成分として、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害薬、当該融合タンパク質をコードするＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬またはそれらの組み合わせを含む組成物が、それを必要とする患者に投与される。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質において、融合または融合領域は、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ１遺伝子の種々のエクソン間に生じ得る。多くの融合が当業者に知られている。かかる融合の例には、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の２番目及び／または４番目のエクソンと、ＲＯＳ１遺伝子の３２番目（長い、Ｌ）及び／または３４番目のエクソン（短い、Ｓ）とが挙げられ、これは、融合点または切断点とも呼ばれる。ＲＯＳ１とＳＬＣ３４Ａ２の他の融合または切断点も知られており、これらは癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができる。「融合領域」という用語は、融合点周辺のポリヌクレオチド断片（約１０〜３０ヌクレオチド）またはポリペプチド（約５〜３０アミノ酸）断片を指し得る。
ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合は、ＲＯＳ１の３’領域がＣＤ７４の５’領域に融合する、ヒト第５染色体と第６染色体との間のＲＯＳ１関連染色体転座である。融合タンパク質は、当業者に知られている及び／または本明細書に記載される各種方法を用いて、検出及び検証される。ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＣＤ７４遺伝子の１番目のエクソンから１２番目のエクソン、または１番目のエクソンから４番目のエクソン、または１番目のエクソンから２番目のエクソンのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＣＤ７４タンパク質の１番目の位置から連続して少なくとも約３０〜２５０のアミノ酸（すなわち、少なくとも１番目から２５０番目の位置までのアミノ酸配列またはその断片）を含み得る。ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＣＤ７４タンパク質の１番目のアミノ酸位置から連続して約３０〜２５０のアミノ酸、連続して約３０〜２２５のアミノ酸、連続して約４０〜２００のアミノ酸、若しくは連続して約４０〜２１０のアミノ酸またはその断片を含み得る。
融合タンパク質において、融合または融合領域は、ＣＤ７４遺伝子とＲＯＳ１遺伝子の種々のエクソン間に生じ得る。多くの融合が当業者に知られている。こうしたＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体の例には、ＣＤ７４遺伝子の６番目のエクソンがＲＯＳ１遺伝子の３２番目または３４番目のエクソンに融合したものが挙げられ、融合点または切断点とも呼ばれる。ＲＯＳ１とＣＤ７４の他の融合または切断点も知られており、これらは癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができる。「融合領域」という用語は、融合点周辺のポリヌクレオチド断片（約１０〜３０ヌクレオチド）またはポリペプチド（約５〜３０アミノ酸）断片を指し得る。
融合タンパク質ＦＩＧ−ＲＯＳ１は、ＦＩＧ（ＧＯＰＣとして知られる）の５’領域がＲＯＳ１の３’領域に融合している、ヒト第６染色体上の染色体内欠失から生じる。ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体は、胆管癌及び卵巣癌の患者由来のサンプルにて、それぞれ８．７％及び０．５％の頻度で特定されている。ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質は、当業者に知られている及び／または本明細書に記載される各種方法を用いて、検出及び検証することができる。ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＦＩＧタンパク質の１番目の位置から連続して少なくとも約１５０〜５００のアミノ酸（すなわち、少なくとも１番目から５００番目の位置のアミノ酸配列またはその断片）を含み得る。ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質のＮ末端ドメインは、ＦＩＧタンパク質の１番目のアミノ酸位置から連続して約１５０〜約５００のアミノ酸、連続して約２００〜４５０のアミノ酸、連続して約２２０〜４２５のアミノ酸、若しくは連続して約２２０〜約４２０アミノ酸またはその断片を含み得る。
ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質において、融合または融合領域は、ＦＩＧ遺伝子とＲＯＳ１遺伝子の種々のエクソン間に生じ得る。複数のＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体が当業者に知られている。かかる融合体の例には、ＦＩＧ遺伝子の４番目または８番目のエクソンがＲＯＳ１遺伝子の３５番目または３６番目のエクソンに融合したものが挙げられ、融合点または切断点とも呼ばれる。ＲＯＳ１とＦＩＧの他の融合または切断点も知られており、これらは癌データベースｖ．６８の体細胞変異に関するＣＯＳＭＩＣ−Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｏｓｍｉｃ／）に見出すことができる。「融合領域」という用語は、融合点周辺のポリヌクレオチド断片（約１０〜３０ヌクレオチド）またはポリペプチド（約５〜３０アミノ酸）断片を指し得る。
他のＲＯＳ１融合パートナーには、本明細書に詳述するＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４及びＦＩＧ融合に加えて、ＴＰＭ３、ＳＤＣ４、ＥＺＲ及びＬＲＩＧ３を挙げることができる。（本明細書の図１及び例えばＴａｋｅｕｃｈｉ Ｋ，Ｓｏｄａ Ｍ，Ｔｏｇａｓｈｉ Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｒ，Ｓａｋａｔａ Ｓ，Ｈａｔａｎｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＲＥＴ，ＲＯＳ１ ａｎｄ ＡＬＫ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１２，ａｎｄ Ｋｕｒｔｉｓ Ｄ．Ｄａｖｉｅｓ，Ａｎｈ Ｔ．Ｌｅ，Ｍａｒｉａｎａ Ｆ．Ｔｈｅｏｄｏｒｏ，Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｃ．Ｓｋｏｋａｎ，Ｄａｒａ Ｌ．Ａｉｓｎｅｒ，Ｅａｍｏｎ Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｌｕｉｇｉ Ｍ．Ｔｅｒｒａｃｃｉａｎｏ，Ｍａｔｔｅｏ Ｉｎｃａｒｂｏｎｅ，Ｍａｓｓｉｍｏ Ｒｏｎｃａｌｌｉ，Ｆｅｄｅｒｉｃｏ Ｃａｐｐｕｚｚｏ，Ｄ．Ｒｏｓｓ Ｃａｍｉｄｇｅ，Ｍａｒｉｌｅｉｌａ Ｖａｒｅｌｌａ−Ｇａｒｃｉａ，ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｄｏｅｂｅｌｅｔ，Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＯＳ１ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，（２０１２），Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １；１８（１７）：４５７０−４５７９を参照されたい。）ＲＯＳ１融合タンパク質に関するこれらの開示内容については、その全体を本明細書に援用する。
一実施形態において、本発明のＲＯＳ１融合タンパク質は、機能性キナーゼドメインをもたらすヒトＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメイン（例えば、配列番号１に記載のヒトＲＯＳ１）を含み、このドメインは、ＲＯＳ１タンパク質の３２番目のエクソンの開始位置に該当するアミノ酸から始まりＲＯＳ１タンパク質のＣ末端に向かって連続する約５０〜３００のアミノ酸から本質的になる。
本明細書で使用するとき、エクソン番号は、米国国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡ）が運営する国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によって割り当てられたエクソン番号に従ってナンバリングされる。いくつかの例示的実施形態において、融合タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１は、ＮＣＢＩに従って特定されるアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列及びＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、自動ＤＮＡシークエンサーまたは自動ペプチドシークエンサーによって決定することができる。こうした自動シークエンシング手段によって決定された（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列は、実際の配列と比較して、部分的な誤差を含み得る。一般に、自動シークエンシングによって決定された配列は、実際の配列と比較して、少なくとも約９０％、少なくとも２０の約９５％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９．９％の配列同一性を有し得る。したがって、融合タンパク質、融合遺伝子または融合領域は、ＮＣＢＩに従って特定された配列と比較して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有し得る。
説明を簡潔にするために、以下の開示は、ＲＯＳ１融合タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１について言及するが、本明細書に記載する他のＲＯＳ１融合タンパク質にも該当し得る。例とするＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質は、いくつかの実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２の８０〜２００個のＮ末端アミノ酸残基と、ＲＯＳ１の少なくとも３００個のＣ末端残基（好ましくは３００〜５００個の範囲のＣ末端アミノ酸残基）から構成され得る。融合遺伝子は、ヘリカルドメインとともに、タンパク質チロシンキナーゼドメインを有する。いかなる理論に束縛されるものではないが、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質の三次構造は、自己リン酸化反応によって発癌性タンパク質チロシンキナーゼドメインを活性化するホモ二量体化を誘導すると考えられる。総合すると、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子は、高度に発現され、次いで、翻訳後、ＳＬＣ３４Ａ２により二量体化され得る。その後、二量体化したＲＯＳ１タンパク質チロシンキナーゼドメインは、異常に刺激され得、これにより、例えば、ＲＯＳ１融合関連ＮＳＣＬＣ肺癌に見られるような発癌経路の刺激が促進される。
融合体が検出された場合、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１の融合タンパク質をコードするＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１の融合遺伝子と認められる。肺癌を診断するための情報を得る方法は、対象から得た試験サンプルにて、本明細書に記載の融合体を検出するステップを含む。診断は、融合タンパク質をコードする融合遺伝子及び癌に罹患していない個体からの標準サンプルと比較したＲＯＳ１の過剰発現を比較するものであり、少なくとも１つの要素が選択され、試験サンプル中に検出された場合、その対象について、癌患者、肺癌患者、ＮＳＣＬＣ肺癌患者、ＲＯＳ１融合関連ＮＳＣＬＣ患者及び／またはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合関連ＮＳＣＬＣ患者のいずれかまたは全てであると特定することができる。
第６染色体の欠失、逆位または転座は、ヒト第６染色体中の欠失、逆位若しくは転座領域にハイブリダイズする（相補的に結合する）ことができるポリヌクレオチド（プローブ）及び／またはヒト第６染色体の欠失、逆位若しくは転座を検出することができる（例えば、ヒト第６染色体中の逆位領域を含む連続して１００〜２００のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができる）プライマー対を用いることによって検出され得る。融合タンパク質、融合遺伝子及び融合領域については、本明細書に記載されている。例示的実施形態において、融合タンパク質はまた、融合タンパク質または融合遺伝子または融合遺伝子に対応するｍＲＮＡの存在について、例えば、当該技術分野において知られており、また本明細書に記載するＲＯＳ１特異的またはＲＯＳ１融合特異的抗体を使用して検出することによっても検出され得る。
融合タンパク質の存在は、融合タンパク質と融合タンパク質に特異的に結合する物質（例えば、抗体またはアプタマー）との相互作用を測定する一般的なアッセイによって検出することができる。一般的なアッセイは、免疫クロマトグラフィー、免疫組織化学的染色法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳなどであってよい。
加えて、融合遺伝子またはｍＲＮＡの存在は、融合遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズする（相補的に結合する）ことができるポリヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）などの一般的なアッセイによって検出することができる。ＦＩＳＨについては、以下により詳細に説明する。融合遺伝子は、大量並列シークエンシング技術による全トランスクリプトーム（ＲＮＡ）及び／または全ゲノムＤＮＡシークエンシングの積分法を用いることによって、検出及び／または検証することができる。融合遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーであってよく、試験サンプル中の融合したまたは切断された遺伝子または転写物との直接ハイブリダイゼーションによって、融合遺伝子またはｍＲＮＡを検出することができる。
更なる実施形態において、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を本発明の方法に使用する（Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載の通り）。ＦＩＳＨアッセイは、１つまたは複数のプローブセットを用いて実施することができ、実施形態としては、例えば、（１）ＲＯＳ１遺伝子を含有する染色体部位（第１の染色体部位）を標的にする第１のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識したプローブ１Ａと、第２の蛍光物質で標識したプローブ１Ｂとからなり、プローブ１Ａは、前述の第１の染色体部位内の５’領域である第１の領域に相補的であり、プローブ１Ｂは、前述の第１の領域から離れて位置し、かつ前述の第１の染色体部位内の３’領域である第２の領域に相補的であり、ＲＯＳ１遺伝子の切断点は、ＳＬＣ３４Ａ２とＲＯＳ１の遺伝子間の転座によってＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子が生じる場合、前述の第１の領域の３’末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５’末端部に位置する、第１のプローブセット；（２）ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子を含有する染色体部位（第２の染色体部位）を標的にする第２のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識したプローブ２Ａと、第２の蛍光物質で標識したプローブ２Ｂとからなり、プローブ２Ａは、前述の第２の染色体部位内の５’領域である第１の領域に相補的であり、プローブ２Ｂは、前述の第１の領域から離れて位置し、かつ前述の第２の染色体部位内の３’領域である第２の領域に相補的であり、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の切断点は、ＳＬＣ３４Ａ２とＲＯＳ１の遺伝子間の転座によってＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子が生じる場合、前述の第１の領域の３’末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５’末端部に位置する、第２のプローブセット；（３）前述のプローブ２Ａと前述のプローブ１Ｂとからなる第３のプローブセット、並びに（４）ＲＯＳ１遺伝子を含有する染色体部位（第３の染色体部位）に相補的であるプローブ４ＡとＳＬＣ３４Ａ２遺伝子を含有する染色体部位（第４の染色体部位）相補的であるプローブ４Ｂとからなる第４のプローブセットが提供される。
前述の第１の染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第２の染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第３の染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。前述の第４の染色体部位の長さは、０．５〜２．０Ｍｂであり得る。
いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨアッセイは、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝子マップデータと相関し得る。ＦＩＳＨ技術については、よく知られている（例えば、米国特許第５，７５６，６９６号、同第５，４４７，８４１号、同第５，７７６，６８８号及び同第５，６６３，３１９号参照）。遺伝子マップデータの例は、１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＲＯＳ１タンパク質をコードする遺伝子及び／またはＲＯＳ１融合ポリペプチドの場合にはＲＯＳ１融合タンパク質の融合パートナー（例えば、ＦＩＧ遺伝子、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子またはＣＤ７４遺伝子）をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患素因との間の相関関係は、当該遺伝子疾患に関連するＤＮＡの領域を限定するのに役立ち得る。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常個体、キャリアまたは罹患した個体の間の遺伝子配列の違いを検出することができる。
遺伝子マップを拡張するために、染色体調製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析などの物理的マッピング技術を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数または腕が未知であっても、マウスなどの別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子配置により、関連するマーカーが明らかになる場合がある。新しい配列は、物理的マッピングによって、染色体の腕またはその部分に割り当てることができる。これは、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。遺伝子連鎖によって疾患または症候群が特定のゲノム領域に大まかに局在化された場合（例えば、ＡＴの場合１１ｑ２２−２３（Ｇａｔｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０（１９８８）））、当該領域にマッピングされた任意の配列は、更なる研究に関連する遺伝子または制御遺伝子である場合がある。本発明のＲＯＳ１融合体またはその部分をコードするヌクレオチド配列はまた、正常個体、キャリアまたは罹患した個体間の転座、逆位などによる染色体位置の違いを検出するために用いることができる。
ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、完全長ＲＯＳ１またはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１若しくはＣＤ７４−ＲＯＳ１若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１（Ｓ）などのＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド）を検出する方法（例えば、ＰＣＲ及びＦＩＳＨ）の全ては、ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチドまたはＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する他の方法と組み合わせてもよいことは、理解されるべきである。例えば、生体サンプルの遺伝物質中のＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド（例えば、循環腫瘍細胞中のＦＩＧ−ＲＯＳ１）の検出に続けて、ＦＩＧ−ＲＯＳ１ポリヌクレオチドが生体サンプル中でＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドとして実際に発現しているかどうかを決定するために、サンプルのタンパク質のウェスタンブロット分析または免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を行うことができる。このようなウェスタンブロットまたはＩＨＣ分析は、検出対象のＦＩＧ−ＲＯＳ１ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて実施してもよいし、完全長ＦＩＧ（例えば、タンパク質のＮ末端に結合する）または完全長ＲＯＳ１（例えば、ＲＯＳ１のキナーゼドメイン中のエピトープに結合する）のいずれかに特異的に結合する抗体を用いて分析を実施してもよい。このようなアッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第７，４６８，２５２号参照）。
別の例には、ＤａｋｏのＣＩＳＨ技術により、同じ組織片上で、免疫組織化学を伴う色素ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが可能である。Ｅｌｌｉｏｔら、Ｂｒ Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ ２００８；６５（４）：１６７−１７１，２００８ ｆｏｒ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＣＩＳＨ ａｎｄ ＦＩＳＨを参照されたい。
本発明の別の態様は、ＲＯＳ１キナーゼによって誘導される肺癌に罹患しているか、またはその肺癌の疑いのある患者を診断するための方法を提供する。この方法は、当該肺癌であるか、または肺癌の疑いのある生体サンプル（少なくとも１つの核酸分子を含有する生体サンプル）を、ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、例えば、完全長ＲＯＳ１ポリヌクレオチドまたはＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド（例えば、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドまたはＣＤ７４−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド）などにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブと接触させることを含み、当該生体サンプル中で当該プローブが少なくとも１つの核酸分子にハイブリダイゼーションした場合、当該患者をＲＯＳ１キナーゼによって誘導される肺癌に罹患しているか、またはその肺癌の疑いがあると特定する。
本発明の更に別の態様は、ＲＯＳ１キナーゼによって誘導される肺癌に罹患しているか、またはその肺癌に罹患している疑いのある患者を診断するための方法を提供する。この方法は、当該肺癌であるか、または肺癌の疑いのある生体サンプル（当該生体サンプルは少なくとも１つのポリペプチドを含有する）を、ＲＯＳ１キナーゼ活性を有するポリペプチド（例えば、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチド、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１融合ポリペプチド）に特異的に結合する試薬と接触させることを含み、当該生体サンプル中で当該試薬が少なくとも１つの融合ポリペプチドに特異的に結合した場合、当該患者をＲＯＳ１キナーゼによって誘導される肺癌に罹患しているか、またはその肺癌の疑いがあると特定する。
種々の実施形態において、ＲＯＳ１キナーゼによって誘導される肺癌または肺癌の疑いの特定により、当該肺癌に罹患しているか、またはその肺癌の疑いのある患者をＲＯＳ１阻害治療薬に応答する可能性が高いと特定する。
ＳＬＣ３４Ａ２とＲＯＳ１の遺伝子間の転座を検出するためのキットは、１つまたは複数のプローブセットを含み得る。（１）第１のプローブセットは、第１の蛍光物質で標識したプローブ１Ａと、第２の蛍光物質で標識したプローブ１Ｂとを含み、プローブ１Ａは、前述の第１の染色体部位内の５’領域である第１の領域に相補的であり、プローブ１Ｂは、前述の第１の領域から離れて位置し、かつ前述の第１の染色体部位内の３’領域である第２の領域に相補的であり、ＲＯＳ１遺伝子の切断点は、ＳＬＣ３２Ａ２とＲＯＳ１の遺伝子間の転座によってＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子が生じる場合、前述の第１の領域の３’末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５’末端部に位置する；（２）ＳＬＣ３２Ａ２遺伝子を含有する染色体部位（第２の染色体部位）を標的にする第２のプローブセットであって、第１の蛍光物質で標識したプローブ２Ａと、第２の蛍光物質で標識したプローブ２Ｂとからなり、プローブ２Ａは、前述の第２の染色体部位内の５’領域である第１の領域に相補的であり、プローブ２Ｂは、前述の第１の領域から離れて位置し、かつ前述の第２の染色体部位内の３’領域である第２の領域に相補的であり、ＳＬＣ３２Ａ２遺伝子の切断点は、ＳＬＣ３２Ａ２とＲＯＳ１の遺伝子間の転座によってＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合遺伝子が生じる場合、前述の第１の領域の３’末端部、前述の第１の領域と第２の領域の間、または前述の第２の領域の５’末端部に位置する、第２のプローブセット；（３）前述のプローブ２Ａと前述のプローブ１Ｂとからなる第３のプローブセット、並びにＲＯＳ１遺伝子を含有する染色体部位（第３の染色体部位）に相補的であるプローブ４ＡとＳＬＣ３２Ａ２遺伝子を含有する染色体部位（第４の染色体部位）相補的であるプローブ４Ｂとからなる第４のプローブセット。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１転座の疑いのある患者を特定するのに有用なキットは、プローブの使用説明書、ＤＮＡ対比染色液、ハイブリダイゼーション用緩衝液、封入剤及びコントロールスライドを含む群から選択される１つまたは複数の要素を含む。キットは、本発明の検出方法を簡便にかつ効率的に実施できるようにするものである。キットは、必要な要素（必須構成要素）として、前述の第１のプローブセット、第２のプローブセット、第３のプローブセットまたは第４のプローブセットを含み得る。また、２つまたはそれ以上の種類のプローブセットをキットに含めてもよい。例えば、キットには、第１のプローブセット及び第３のプローブセットを組み込むことができる。各プローブセットに関する詳細は上述したので、ここでは繰り返さない。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの有無の検出は、前述の融合ポリペプチドをコードしているゲノムＤＮＡまたは当該ゲノムＤＮＡの転写物を直接用いて実施することができるが、その転写物の翻訳生成物（前述の融合ポリペプチド）を間接的に用いて実施してもよい。
融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、第６染色体（６ｑ２２）の１１７．６１〜１１７．７５Ｍｂ領域の間の逆位によって形成されるので、本発明の現象を「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの有無の検出」にて検出することができる。この逆位検出において、例えば、ＲＯＳ１遺伝子のキナーゼドメインコード領域から上流の５’側領域とＲＯＳ１遺伝子の当該コード領域から下流の３’側領域との間のスプリットを検出してもよいし、ヘリカルドメインの一部または全てのコード領域とＳＬＣ３２Ａ２遺伝子のコード領域から上流の５’側領域とＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のヘリカルドメインのコード領域から下流の３’側領域との間のスプリットを検出してもよい。
本発明における「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの有無の検出」には、当業者に知られた利用可能な技術を用いることができる。「前述の融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」が対象物である場合、例えば、蛍光などを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ、直接シークエンス法、サザンブロット法またはゲノムマイクロアレイ解析を用いることができる。「前述のゲノムＤＮＡの転写物」が対象物である場合、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、直接シークエンス法、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いることができる。
本発明のキットに、他の要素を更に含めてもよい。これらの他の要素の例には、プローブの使用説明書、ＤＡＰＩなどのＤＮＡ対比染色液、ハイブリダイゼーション用緩衝液、洗浄緩衝液、溶媒、封入剤、コントロールスライド、反応容器及び他の器具である。また、診断目的に関する明細書が含まれてもよい。更に、癌患者の染色体サンプル中におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１転座の検出（陽性特定）が、ＲＯＳ１キナーゼ阻害薬を用いるこれらの患者にて、どのように設定されるべきかを示す明細書などを含めてもよい。加えて、治療コースを決定するための手順及びこの手順の説明を含めてもよい。
比較的に長いプローブ（約２００ｋｂ（プローブ１Ａ）〜約１，３７０ｋｂ（プローブ４Ｂ））が企図される。したがって、プローブと標的配列との間の相補性は、本発明において意図される特異的なハイブリダイゼーションが達成される限り、高度に限定される必要はない。標的配列間の類似性の例は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％である。
第１のプローブセット及び第２のプローブセットを使用する場合、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との間で転座が生じている染色体サンプルでは、２つの蛍光シグナルは、離れて別々に検出され、転座が生じていない染色体サンプルでは、２つの蛍光シグナルは、典型的に、互いに近接して観察されるか、または２つの蛍光シグナルの組み合わせであるシグナル（黄色）が観察される。したがって、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との間の転座の有無は、蛍光シグナルのパターンに反映される。その結果、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ１遺伝子との間の転座は、蛍光シグナルのパターンから判定することができる。
上で得た判断は、典型的に、好ましくは、コントロール（試験サンプル）との結果の比較に基づいてなされる。ここで、コントロールは、非小細胞肺癌に罹患している患者に由来する染色体サンプルまたは前癌性病変を呈する患者に由来する染色体サンプルである。加えて、前癌性病変のない患者に由来する染色体サンプル、癌に罹患していない患者に由来する染色体サンプル、健常な対象から採取した染色体サンプルも同様にコントロールとして使用することができる。また、細胞株由来の染色体サンプルもコントロールに使用することができる。
融合遺伝子がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１の融合タンパク質をコードする融合遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１である場合、融合遺伝子ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１（または任意の他のＲＯＳ１融合遺伝子、例えば、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１）は、融合領域にハイブリダイズする（相補的に結合する）ことができるポリヌクレオチド（プローブ）及び／または融合領域を含む連続して１００〜２００のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対を用いることによって検出することができる。加えて、１つの例示的実施形態において、融合タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１は、融合タンパク質ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１の融合領域に特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて検出することができる。
更に、検出は、発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法と銀ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法の組み合わせである融合アッセイによって実施することができる。本明細書における「融合点」は、ＳＬＣ３４Ａ２の各遺伝子に由来する部分がＲＯＳ１遺伝子に由来する部分に融合する点を指す。
「融合領域（または逆位領域）にハイブリダイズすることができる」という用語は、相補的配列、または融合領域（または逆位領域）の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有することを指し得る。別の実施形態は、融合領域にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド及び融合領域を含む連続して１００〜２００のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対からなる群から選択される１つまたは複数を含む、癌を診断するための組成物を提供する。また、ヒト第６染色体内の逆位領域にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド、ヒト第６染色体の逆位領域を含む連続して１００〜２００のヌクレオチドを有するポリヌクレオチド断片を生成することができるプライマー対、及び融合領域に結合する抗体またはアプタマー。別の実施形態は、癌を診断するための融合タンパク質及び／または融合遺伝子の使用を提供する。患者は、いずれの哺乳動物であってもよく、例えば、ヒトまたはサルなどの霊長類、マウスまたはラットなどのげっ歯類、特にヒトである。言及する任意のアッセイでの使用に好適な試験サンプルは、細胞（例えば、肺細胞）、組織（例えば、肺組織）、体液（例えば、血液）、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞であってよい。サンプルは、腫瘍の外科的生検、腫瘍のコア生検、腫瘍、胸水の微細針吸引生検、並びに患者から細胞及び組織を分離する他の既知の方法による採取を含む、当業者に知られている任意の方法で採取され得る。例えば、ＦＩＳＨアッセイ（本明細書に記載される）を循環腫瘍細胞で実施することができる。
患者は、キナーゼ阻害薬による治療を受けているか、キナーゼ阻害薬での治療計画がある者であり得る。試験サンプルは、ヒト癌細胞に由来する細胞またはその抽出物を含み得る。
別の実施形態は、融合パートナーのＮ末端ドメインをコードする遺伝子が５’末端に位置し、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインをコードする遺伝子が３’末端に位置する、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を提供する。１つの例示的実施形態において、融合タンパク質がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１タンパク質である場合、当該融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２のＮ末端ドメインをコードする遺伝子が５’末端に位置し、ＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインをコードする遺伝子が３’末端に位置する、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１遺伝子として表すことができる。
別の実施形態は、融合遺伝子と、当該融合遺伝子に機能的に連結した任意選択の転写エレメント（例えば、プロモーターなど）とを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態は、発現ベクターを用いて形質転換した形質転換細胞を提供する。
治療または診断の過程で採取される生物学的標本（生検サンプルなど）は、ホルマリン固定されることが多いが、この場合、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの使用が有利である。これは、検出対象であるＤＮＡゲノムがホルマリン固定下で安定であり、かつ検出感度が高いためである。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、生物学的標本中のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド塩基の鎖長を有する下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって検出することができる。
（ａ）ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、生物学的標本中のＣＤ７４−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって検出することができる。
（ａ）ＣＤ７４タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＤ７４タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、生物学的標本中のＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって検出することができる。
（ａ）ＦＩＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＦＩＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、自然界で（すなわち、非人工的に）変異する場合がある。したがって、このような天然バリアントもまた本発明の対象となり得る（以下同様）。
（ａ）に記載した本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＲＯＳ１結合パートナー（すなわち、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質）をコードするポリヌクレオチド、またはＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、生物学的標本にて前述したＲＯＳ１融合タンパク質をコードするゲノムＤＮＡの存在を検出することができれば、いかなるものであってもよい。好ましくは、以下に示す（ａ１）〜（ａ４）である。
（ａ１）ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のエクソン１〜２のヘリカルドメインの一部または全てのコード領域及び当該コード領域から上流の５’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１」ともいう）と、ＲＯＳ１遺伝子のキナーゼドメインのコード領域及び当該コード領域から下流の３’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「３’ＲＯＳ１プローブ１」ともいう）との組み合わせ
（ａ２）ＲＯＳ１遺伝子のキナーゼドメインのコード領域から上流の５’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「５’ＲＯＳ１プローブ１」ともいう）とＲＯＳ１遺伝子のキナーゼドメインのコード領域及び当該コード領域から下流の３’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「３’ＲＯＳ１プローブ１」ともいう）との組み合わせ
（ａ３）ＲＯＳ１遺伝子のフィブロネクチンＩＩＩ型９のコード領域及び当該領域から上流の５’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「５’ＲＯＳ１プローブ２」ともいう）とＲＯＳ１遺伝子の膜貫通ドメインのコード領域及び当該コード領域から下流の３’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「３’ＲＯＳ１プローブ２」ともいう）との組み合わせ
（ａ４）ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のヘリカルドメインの一部または全てのコード領域及び当該コード領域から上流の５’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１」ともいう）と、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のコイルドコイルドメインのコード領域当該コード領域から下流の３’側領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下「３’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１」ともいう）との組み合わせ
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いる（ａ１）のポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域（標的塩基配列）は、標的塩基配列に対する特異性及び検出感度の理由から、好ましくは、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ１遺伝子の融合部位から１，０００，０００塩基以内の領域であり、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いる（ａ２）〜（ａ４）のポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域は、同じ理由から、好ましくは、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子またはＲＯＳ１遺伝子の切断点から１，０００，０００塩基以内の領域である。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いる上記の（ａ）または（ｂ）に記載するポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出感度の理由から、好ましくは、前述の標的塩基配列の全てを網羅することができる複数の種類のポリペプチドからなる集団である。この場合、集団を構成するポリヌクレオチドの長さは、少なくとも１５塩基、好ましくは１００〜１０００塩基である。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いる上記の（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドは、好ましくは、検出用の蛍光色素などによって標識される。このような蛍光色素の例には、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ及びＣｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光色素の他に、ＤＡＢなどの色素（色原体）または酵素的金属沈着に基づく銀などによって、前述のポリヌクレオチドを標識してもよい。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１及び３’ＲＯＳ１プローブ１を使用する場合、５’ＲＯＳ１プローブ１及び３’ＲＯＳ１プローブ１を使用する場合、５’ＲＯＳ１プローブ２及び３’ＲＯＳ１プローブ２を使用する場合、または５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１及び３’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１を使用する場合、これらのプローブは、互いに異なる色素で標識されるのが好ましい。このように異なる色素で標識したプローブの組み合わせを用いてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施する場合、５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１の標識によって生じたシグナル（例えば、蛍光）と３’ＲＯＳ１プローブ１の標識によって生じたシグナルとが重なるとき、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡが検出されたと判定することができる。一方、５’ＲＯＳ１プローブ１の標識によって生じたシグナルと３’ＲＯＳ１プローブ１の標識によって生じたシグナルとが分離しているとき、５’ＲＯＳ１プローブ２の標識によって生じたシグナルと３’ＲＯＳ１プローブ２の標識によって生じたシグナルとが分離しているとき、または５’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１の標識によって生じたシグナルと３’ＳＬＣ３４Ａ２プローブ１の標識によって生じたシグナルとが分離しているとき、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡが検出されたと判定することができる。
ポリヌクレオチドの標識化は、既知の技術によって行うことができる。例えば、ニックトランスレーションまたはランダムプライマー法により蛍光色素などで標識した基質塩基をポリヌクレオチドに組み込むことで、そのポリヌクレオチドを標識化することができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、上記の（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドと前述の生物学的標本をハイブリダイズするときに使用する条件は、関連するポリヌクレオチドの長さなどの各種要因に応じて異なり得るが、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の一例は０．２×ＳＳＣ、６５℃であり、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の一例は２．０×ＳＳＣ、５０℃である。前述の条件と同じストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈比）及び温度並びに界面活性剤（ＮＰ−４０など）の濃度、ホルムアミドの濃度及びｐＨなどの各種条件を適切に選択することによって達成できることに留意されたい。例えば、スクリーニングのための一般的なハイブリダイゼーション条件に関して、中〜高ストリンジェンシー条件下にて、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列若しくはその断片またはその相補的配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学分野にてよく知られている。例示として、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するのに適した中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣ、終夜でのハイブリダイズ、次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣをそれぞれ用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄が含まれる。当業者であれば、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度及び／またはハイブリダイゼーションを行う温度を変更することなどによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを容易に操作することができることを理解するであろう。例えば、別の実施形態において、好適である高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃にハイブリダイゼーションの温度を上げるという点を除いて、上述のものが含まれる。
前述のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外で、上記の（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドを用いてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出するための方法の例は、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロットである。これらの方法において、前述の融合遺伝子は、前述の生物学的標本から得た核酸抽出物を転写した膜上に、中〜高ストリンジェンシー条件下にて、上記の（ａ）または（ｂ）に記載したポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって検出される。（ａ）のポリヌクレオチドを使用する場合、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリペプチド及びＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリペプチドが、膜上に展開された同じバンドを認識するとき、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡが検出されたと判定することができる。
ゲノムマイクロアレイ解析及びＤＮＡマイクロアレイ解析は、上記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いて、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出するための更なる方法である。これらの方法において、（ｂ）のポリヌクレオチドのアレイを基板上に固定し、生物学的標本をアレイ上のポリヌクレオチドと接触させることによって、関連するゲノムＤＮＡを検出する。ＰＣＲまたはシークエンシングにおいて、以下に記載する（ｃ）のポリヌクレオチドを使用して、生物学的標本から作製したＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡを鋳型として用いると、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの一部または全てを特異的に増幅することができる。（ｃ）ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる前述の融合ポリヌクレオチドなどの塩基配列において、一方のプライマーがＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし、もう一方のプライマーがＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーセットである。これらのポリヌクレオチドの長さは、通常、１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。
ＰＣＲによる検出の精度及び感度の観点から、（ｃ）に記載した本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位から５０００塩基以内である前述の融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列である。
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、既知の技術によって適切に設計することができる。「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の有利な例は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｆ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｉｎｔ１５−Ｆ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｉｎｔ１５−Ｆ２、ＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ１６−Ｆ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ２３−Ｆ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ２４−Ｆ１、ＳＬＣ３４Ａ２−Ｆ−ｏｒｆ２４３８及びＳＬＣ３４Ａ２−ｉｎｔ１５−Ｆ３．５からなる群から選択される１つのプライマーと、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｒ１、ＲＯＳ１−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＲＯＳ１−ｉｎｔ７−Ｒ１、ＲＯＳ１−ｉｎｔ１１−Ｒ０．５、ＲＯＳ１−ｉｎｔ１１−Ｒ１、ＲＯＳ１−ｉｎｔ７−Ｒ２及びＲＯＳ１−Ｒ−ｏｒｆ２３６４からなる群から選択される１つのプライマーとからなるプライマーセットである。より好ましくは、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｆ１とＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｒ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｉｎｔ１５−Ｆ１とＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｒ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｉｎｔ１５−Ｆ２とＲＯＳ１−ｉｎｔ１１−Ｒ３、ＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ１６−Ｆ１とＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｒ１、ＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ２３−Ｆ１とＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１−Ｒ１、またはＳＬＣ３４Ａ２−ｅｘ２４−Ｆ１プライマーとＲＯＳ１−ｉｎｔ７−Ｒ１プライマーである。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体を特定、評価または検出する方法；癌、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を有する癌に罹患している対象を特定、評価、検査、及び／または治療する方法；単離されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１の核酸分子、核酸構築物、核酸分子を含有する宿主細胞；精製されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１のポリペプチド及び結合物質；検出試薬（例えば、プローブ、プライマー、抗体、キット、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１核酸またはタンパク質の特異的検出が可能なもの）；例えば、５’ＳＬＣ３４Ａ２−３’ＲＯＳ１、５’ＣＤ７４−３’ＲＯＳ１または５’ＦＩＧ−３’ＲＯＳ１融合を阻害する、例えば、新規キナーゼ阻害薬と相互作用する分子を特定するためのスクリーニングアッセイ；並びに癌、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体の１つまたは複数を有する癌に罹患している対象を検査、特定、評価及び／または治療するためのアッセイ及びキットを提供する。本明細書にて特定する組成物及び方法は、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１の新規阻害薬を特定すること、対象、例えば、癌に罹患している患者を検査、特定または選択すること、及び癌の治療または予防することに使用できる。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１核酸分子。一態様では、本発明は、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧ遺伝子の断片及びＲＯＳ１癌原遺伝子の断片を含む、核酸分子（例えば、単離されたまたは精製された核酸分子）を特徴とする。一実施形態において、核酸分子は、融合体、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４またはＦＩＧの少なくとも１つのエクソンとＲＯＳ１のエクソン（例えば、ＲＯＳ１チロシンキナーゼドメインまたはその断片をコードする１つまたは複数のエクソン）のインフレーム融合体を含む。
例示的実施形態において、５’ＳＬＣ３４Ａ２−３’ＲＯＳ１核酸分子は、コードされた５’ＳＬＣ３４Ａ２−３’ＲＯＳ１融合体が構成的キナーゼ活性を有するように、例えば、本明細書にて言及される癌の細胞中で、例えば、野生型ＲＯＳ１と比較して、活性、例えば、キナーゼ活性が増大するように、十分なＳＬＣ３４Ａ２及び十分なＲＯＳ１配列を含む。一実施形態において、コードされた５’ＳＬＣ３４Ａ２−３’ＲＯＳ１融合体は、ＳＬＣ３４Ａ２由来の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９、１０または１１個のエクソンと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９，１０、１１、１２または１３個のＲＯＳ１エクソンとを含む。一実施形態において、コードされた５’ＳＬＣ３４Ａ２−３’ＲＯＳ１融合ポリペプチドは、ヘリカルドメインまたはその機能性断片と、ＲＯＳ１チロシンキナーゼドメインまたはその機能性断片とを含む。
例示的実施形態において、５’ＣＤ７４−３’ＲＯＳ１核酸分子は、コードされた５’ＣＤ７４−３’ＲＯＳ１融合体が構成的キナーゼ活性を有するように、例えば、本明細書にて言及される癌の細胞中で、例えば、野生型ＲＯＳ１と比較して、活性、例えば、キナーゼ活性が増大するように、十分なＣＤ７４及び十分なＲＯＳ１配列を含む。一実施形態において、コードされた５’ＣＤ７４−３’ＲＯＳ１融合体は、ＣＤ７４由来の少なくとも１、２、３、４、５、６個のエクソンと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９，１０、１１、１２または１３個のＲＯＳ１エクソンとを含む。一実施形態において、コードされた５’ＣＤ７４−３’ＲＯＳ１融合ポリペプチドは、ＩＩ型膜タンパク質ドメインのヘリカルシグナルアンカーまたはその機能性断片と、ＲＯＳ１チロシンキナーゼドメインまたはその機能性断片とを含む。
例示的実施形態において、５’ＦＩＧ−３’ＲＯＳ１核酸分子は、コードされた５’ＦＩＧ−３’ＲＯＳ１融合体が構成的キナーゼ活性を有するように、例えば、本明細書にて言及される癌の細胞中で、例えば、野生型ＲＯＳ１と比較して、活性、例えば、キナーゼ活性が増大するように、十分なＦＩＧ及び十分なＲＯＳ１配列を含む。一実施形態において、コードされた５’ＦＩＧ−３’ＲＯＳ１融合体は、ＦＩＧ由来の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８個のエクソンと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９，１０、１１、１２または１３個のＲＯＳ１エクソンとを含む。一実施形態において、コードされた５’ＦＩＧ−３’ＲＯＳ１融合ポリペプチドは、コイルドコイルドメインまたはその機能性断片と、ＲＯＳ１チロシンキナーゼドメインまたはその機能性断片とを含む。
一実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＳＬＣ３４Ａ２のエクソン２及び／または４とＲＯＳ１のエクソン３２及び／または３４及び／または３５とのインフレーム融合体を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、切断点を含むヌクレオチド配列を含む。例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体は、ＳＬＣ３４Ａ２の少なくともエクソン４またはその断片（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２のエクソン１〜４またはその断片）とＲＯＳ１の少なくともエクソン３２及び／若しくは３４またはその断片（例えば、ＲＯＳ１のエクソン３０〜４３またはその断片）とのインフレーム融合体を含み得る。ある特定の実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体は、５’−ＳＬＣ３４Ａ２〜３’−ＲＯＳ１の構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子のエクソン１〜４またはその断片のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３０〜４３、例えば、３２及び／若しくは３４及び／若しくは３５若しくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一の配列を含む。
一実施形態において、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＣＤ７４のエクソン１〜６とＲＯＳ１のエクソン３２及び／または３４とのインフレーム融合体を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、切断点を含むヌクレオチド配列を含む。例えば、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体は、ＣＤ７４の少なくともエクソン６またはその断片（例えば、ＣＤ７４のエクソン１〜６またはその断片）とＲＯＳ１の少なくともエクソン３２及び／若しくは３４及び／または３５またはその断片（例えば、ＲＯＳ１のエクソン３０〜４３またはその断片）とのインフレーム融合体を含み得る。ある特定の実施形態において、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体は、５’−ＣＤ７４〜３’−ＲＯＳ１の構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＣＤ７４遺伝子のエクソン１〜６またはその断片のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３０〜４３、例えば、３２及び／若しくは３４及び／若しくは３５若しくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一の配列を含む。
一実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＦＩＧのエクソン１〜８、例えば、１〜４または１〜８とＲＯＳ１のエクソン３２及び／または３４及び／または３５とのインフレーム融合体を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、切断点を含むヌクレオチド配列を含む。例えば、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体は、ＦＩＧの少なくともエクソン４及び／若しくはエクソン８またはその断片（例えば、ＦＩＧのエクソン１〜４若しくは１〜８またはその断片）とＲＯＳ１の少なくともエクソン３２及び／若しくは３４及び／若しくは３５またはその断片（例えば、ＲＯＳ１のエクソン３０〜４３またはその断片）とのインフレーム融合体を含み得る。ある特定の実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体は、５’−ＣＤ７４〜３’−ＲＯＳ１の構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＣＤ７４遺伝子のエクソン１〜６またはその断片のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３０〜４３、例えば、３２及び／若しくは３４及び／若しくは３５若しくはその断片のヌクレオチド配列、またはそれに実質的に同一の配列を含む。
他の実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＳＬＣ３４Ａ２遺伝子の断片及びＲＯＳ１癌原遺伝子の断片を含む、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ヘリカルドメインまたはその機能性断片及びＲＯＳ１チロシンキナーゼドメインまたはその機能性断片を含むＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合ポリペプチドをコードする。
別の実施形態において、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＲＯＳ１転写物とＣＤ７４転写物との間の融合連結体を含むＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体を含む。別の実施形態において、核酸分子は、融合体、例えば、ＲＯＳ１の少なくともエクソン３２若しくは３４若しくは３５またはその断片（例えば、ＲＯＳ１のエクソン３０〜４３またはその断片）と少なくともエクソン１またはその断片（例えば、ＣＤ７４のエクソン１〜６またはその断片）とのインフレーム融合体を含む。ある特定の実施形態において、ＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体は、５’−ＣＤ７４〜３’−ＲＯＳ１の構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３０〜４３、例えば、エクソン３２、３４若しくは３５若しくはその断片に対応するヌクレオチド、またはそれに実質的に同一の配列を含む。
別の実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合核酸分子は、ＲＯＳ１転写物とＦＩＧ転写物との間の融合連結体を含むＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を含む。別の実施形態において、核酸分子は、融合体、例えば、ＲＯＳ１の少なくともエクソン３２若しくは３４若しくは３５またはその断片（例えば、ＲＯＳ１のエクソン３０〜４３またはその断片）と少なくともエクソン４若しくは８またはその断片（例えば、ＦＩＧのエクソン１〜８またはその断片）とのインフレーム融合体を含む。ある特定の実施形態において、ＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体は、５’−ＦＩＧ〜３’−ＲＯＳ１の構造内にある。一実施形態において、核酸分子は、ＲＯＳ１遺伝子のエクソン３０〜４３、例えば、エクソン３２、３４若しくは３５若しくはその断片に対応するヌクレオチド、またはそれに実質的に同一の配列を含む。
関連する態様において、本発明は、本明細書に記載のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１融合核酸分子を含む核酸構築物を特徴とする。ある特定の実施形態において、核酸分子は、天然または異種制御配列に機能的に連結している。また、本明細書に記載のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１核酸分子を含むベクター及び宿主細胞、例えば、本明細書に記載の核酸分子及びポリペプチドを生成するのに適したベクター及び宿主細胞も含まれる。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体をコードする核酸分子の発現を減少させるか、または阻害する核酸分子を特徴とする。このような核酸分子の例には、例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１をコードする核酸またはＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１の転写制御領域にハイブリダイズし、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１のｍＲＮＡ発現を阻害し、または減少させる、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ、三重らせん分子が挙げられる。
本発明はまた、本明細書に記載のＲＯＳ１融合体の特定に有用であり、当該融合体を含むか、当該融合体に隣接するか、ハイブリダイズするか、または別様に当該融合体に基づく、プローブ、プライマー、ベイトまたはライブラリーメンバーに好適な核酸分子、例えば、核酸断片を特徴とする。ある特定の実施形態において、プローブ、プライマーまたはベイト分子は、本明細書に記載のＲＯＳ１融合核酸分子の捕捉、検出または単離を可能にするオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のＲＯＳ１融合核酸分子の断片に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。核酸断片（例えば、オリゴヌクレオチド）と標的ＲＯＳ１融合体の配列間の配列同一性は、それらの配列が標的配列の捕捉、検出または単離を可能にするのに十分に相補的であれば、正確である必要はない。一実施形態において、核酸断片は、約５〜２５、例えば、１０〜２０または１０〜１５ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーである。他の実施形態において、核酸断片は、約１００〜３００ヌクレオチド、１３０〜２３０ヌクレオチド、１５０〜２００ヌクレオチド、２００〜３５０、３５０〜９５０、３００〜６００、５００〜１０００、７５０〜２０００、ヌクレオチド００ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドを含むベイトであり、ＲＯＳ１融合核酸を必ずしも含む必要はない。
一実施形態において、核酸断片は、例えば、ハイブリダイゼーションにより、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体またはＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を特定または捕捉するために使用することができる。例示的な例において、核酸断片は、例えば、中〜高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションにより、本明細書に記載のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体またはＣＤ７４−ＲＯＳ１融合体またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を特定または捕捉する際に使用するためのプローブ、プライマーであり得る。一実施形態において、核酸断片は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１の切断点を特定または捕捉するために有用であり得る。１つの例示的実施形態において、核酸断片は、ＳＬＣ３４Ａ２のエクソン４または１３とＲＯＳ１のエクソン３２、３４または３５とのインフレーム融合体を生成する染色体再構成内のヌクレオチド配列（例えば、第６染色体上の転座内の配列）にハイブリダイズする。
本明細書に記載のプローブまたはプライマーは、例えば、ＲＯＳ１再構成及び結合パートナー特定のためのＦＩＳＨ検出若しくはＰＣＲ増幅またはＲＴ−ＰＣＴ確認に使用することができる。検出がＰＣＲに基づく１つの例示的実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合連結体の増幅は、例えば、本明細書に記載のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合連結体、例えば、本明細書に記載の染色体再構成の変異体または連結体に隣接する配列を増幅するためのプライマーまたはプライマー対を用いて行うことができる。一実施形態において、一対の単離オリゴヌクレオチドプライマーは、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体の位置を含むか、またはその位置に隣接する領域を増幅することができる。例えば、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４またはＦＩＧのゲノムまたはｍＲＮＡ配列内のヌクレオチド配列をハイブリダイズするように、フォワードプライマーを設計することができる。種々の実施形態において、ＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２及びＦＩＧ（ヒトを含む様々な種）のプライマーは、Ｑｉａｇｅｎから市販されている（カタログ番号：ＱＦ００１８５４５、ＱＦ００４４９０７８及びＱＦ００２７８９９２；Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）。他の実施形態において、ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの存在の確認は、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４及びＣＤ７４エクソン６のフォワードプライマーと、ＲＯＳ１エクソン３２及びエクソン３４のリバースプライマーとがそれぞれ対になったものを含むＰＣＲプライマーのパネルを用いて、患者の腫瘍サンプルにおいて実施することができる。腫瘍サンプルに由来するＲＮＡは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｆｏｒｍａｐｕｒｅ法（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＦＦＰＥ組織から抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されているＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ合成キットを用いて逆転写することができる。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１の切断点を決定するために、次のプライマー：ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４のフォワード、ＴＣＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＧ（配列番号３）；ＣＤ７４エクソン６のフォワード、ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＡＧＧ（配列番号４）；ＲＯＳ１エクソン３２のリバース、ＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＴＧＧ（配列番号５）；及びＲＯＳ１エクソン３４のリバース、ＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡ（配列番号６）を用いることができる。ＰＣＲ増幅は、任意のＰＣＲサーマルサイクラー、例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、４０ｎｇのｃＤＮＡとともにＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を標準条件下で用いて実施することができる。ｃＤＮＡは、ＢｉｇＤｙｅ３．０キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて配列決定した。
核酸断片は、例えば、放射標識、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、酵素標識、結合対標識を用いて検出可能に標識してもよいし、親和性タグ、タグまたは識別子（例えば、アダプター、バーコードまたは他の配列識別子）を含めることができる。
別の例示的実施形態において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体の存在を決定する方法は、対象由来のサンプル中にＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合核酸分子またはポリペプチドが存在するという情報を直接得ることを含む。サンプルは、体液、細胞、組織、例えば、腫瘍組織からなるサンプルであってよく、核酸サンプル、タンパク質サンプル、腫瘍生検または循環腫瘍細胞若しくは核酸を挙げることができ、肺癌（ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＳＣＣまたはその組み合わせ）及び腺癌または黒色腫から選択され得る。
核酸分子内のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を検出する方法は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅系アッセイ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ、リアルタイムＰＣＲ、シークエンシング、スクリーニング解析、ＦＩＳＨ、スペクトル核型分析またはＭＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＳＳＰ、ＨＰＬＣまたは質量分析遺伝子型解析のいずれかの使用による。
タンパク質サンプルをＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに特異的に結合する試薬に接触させることと、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドと試薬との複合体の形成を検出することとを含む、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドまたはタンパク質を検出する方法が記載される。ポリペプチド検出法は、結合した試薬と結合していない試薬の検出を容易にする、検出可能な基で標識した試薬を用いることを含み、この試薬は抗体分子であり、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体のレベルまたは活性を評価し、対象において治療を開始する前、治療中または治療後にＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を検出し、癌の診断時にＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を検出し、所定の間隔、例えば、第１の時点及び少なくともそれ以後の時点でＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体を検出する。
治療への応答もまた含まれ、具体的には、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体の存在の決定に応じて、（１）患者集団を層化すること、（２）治療に応答する可能性が高い対象若しくは低い対象を特定若しくは選択すること、（３）治療選択肢を選択すること、及び／または（４）対象の疾患経過を予測することの１つまたは複数が用いられる。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１若しくはＣＤ７４−ＲＯＳ１若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体またはそれらの切断点を含む断片をコードする、単離されたまたは精製された核酸分子は、ＮＳＣＬＣ及び肺腺癌ＲＯＳ１融合遺伝子陽性癌の確認手段並びに本発明の化合物を用いた直接特異的治療に用いることができる。ＲＯＳ１融合遺伝子陽性癌、例えば、ＲＯＳ１再構成ＮＳＣＬＣの直接特異的治療には、他の構築物を用いることができ、これには、天然または異種制御配列に機能的に連結した、単離されたまたは精製されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合核酸分子が挙げられる。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１若しくはＣＤ７４−ＲＯＳ１若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合体またはそれらの切断点を含む断片をコードする核酸分子を含む、単離されたまたは精製されたベクター。ベクターを含む宿主細胞。アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡまたは三重らせん分子から選択することができる、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合をコードする核酸分子の発現を特異的に減少させる、または阻害する核酸分子。単離されたまたは精製されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドまたはそれらの切断点を含む断片。ＲＯＳ１キナーゼ活性及び／または二量体化若しくは多量体化作用を有する、単離されたまたは精製されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチド。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに特異的に結合する、単離されたまたは精製された抗体分子。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに対する単一特異性抗体分子である、抗体分子。
本発明におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出するための方法の例は、免疫染色、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及び抗体アレイ解析である。これらの方法において、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに結合する抗体が用いられる。このような抗体の例は、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質とＲＯＳ１タンパク質との融合部位を含有するポリペプチドに特異的な抗体（以下「融合部位特異的抗体」ともいう）、ＲＯＳ１タンパク質の上述の融合部位からＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下「ＲＯＳ１−Ｃ末端抗体」ともいう）、及びＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質の上述の融合部位からＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下「ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧ−Ｎ末端抗体」ともいう）である。ここで、「融合部位特異的抗体」とは、上述の融合部位を含有するポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質にも、野生型（正常型）ＲＯＳ１タンパク質にも結合しない抗体を意味する。
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドは、上述の融合部位特異的抗体または上述のＲＯＳ１−Ｃ末端抗体とＳＬＣ３４Ａ２若しくはＣＤ７４若しくはＦＩＧ−Ｎ末端抗体との組み合わせによって検出することができる。しかしながら、ＲＯＳ１タンパク質の発現は、例えば、正常肺細胞ではほとんど検出されないため、免疫染色にてＲＯＳ１−Ｃ末端抗体を単独で使用した場合でも、肺腺癌組織におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドの存在を検出することができる。
種々の実施形態において、本発明に係るＲＯＳ１融合ポリペプチドの特定のための免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）及びウェスタンブロットの適用は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＯＳ１、ＲＯＳ１抗体を用いて実施することができる。一実施形態において、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性癌細胞、例えば、ＮＳＣＬＣ ＲＯＳ１再構成性肺癌細胞の特定は、ウサギ抗ＲＯＳ１モノクローナル抗体Ｄ４Ｄ６、カタログ番号３２８７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行うことができる。
いくつかの実施形態において、「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者であれば、適切な既知の方法を選択することによって、作製することができる。このような既知の方法の例は、ＲＯＳ１タンパク質であるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドのＣ末端部分からなる前述のポリペプチド、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質などのＮ末端部分からなる前述のポリペプチドなどを免疫動物に接種することによって、動物の免疫系を活性化した後、その動物の血清を回収する方法（ポリクローナル抗体）、並びにハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法及びファージディスプレイ法などのモノクローナル抗体を作製するための方法である。標識物質を結合させた抗体を使用する場合、その標識を検出することによって、標的タンパク質を直接検出することができる。標識物質は、抗体に結合させることができ、検出することができれば、特に制限されない。例としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン及び放射性物質が挙げられる。更に、標識物質を結合させた抗体を用いて標的タンパク質を直接検出する方法に加えて、標識物質に結合するタンパク質Ｇ、タンパク質Ａまたは二次抗体を用いて標的タンパク質を間接的に検出する方法も用いることができる。
上述の方法によって、対象から分離した標本中にＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が検出された場合、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩などのＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬による癌治療の有効性は、その患者において高いと判断され、一方、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの存在が検出されない場合、ＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬による癌治療の有効性は、その患者において低いと判断される。
上述のように、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの有無の検出には、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載するポリヌクレオチドのいずれかを有利に用いることができる。
（ａ）ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも１つのプローブであるポリヌクレオチド；
（ｂ）ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド；
（ｃ）ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧタンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＯＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの融合部位を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
これらのポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。ここで、「相補的」とは、例えば、中〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするのであれば、完全に相補的でないことを意味し得る。例えば、これらのポリペプチドは、特定の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する。
（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡの一部または全ては、ヌクレオチドがＰＮＡ（ポリアミド核酸、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（商標、ロックド核酸、架橋型核酸）、ＥＮＡ（商標、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン−架橋型核酸）、ＧＮＡ（グリセロール核酸）及びＴＮＡ（トレオース核酸）などの人工核酸で置換されてもよい。
更に、上述した通り、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドの翻訳産物の検出に有利に使用される。したがって、本発明は、この抗体を含む、ＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬による癌治療の有効性を決定するための薬物を提供する。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、試験対象から得たサンプルにおいて、本明細書に係るポリヌクレオチドの存在を検出するステップを含む。試験対象から得たサンプルとして、試験対象から採取した物質（生体から分離したサンプル）、特に、採取された任意の種類の体液（好ましくは血液）、肺胞及び気管支洗浄物、生検を経たサンプル並びに痰サンプルが用いられる。好ましくは、試験対象の肺内の罹患部分に由来する生検サンプルまたは痰サンプルが用いられる。このサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、使用することができる。加えて、その転写物（ゲノムの転写及び翻訳の結果として生成される産物、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク質）を使用することができる。特に、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを作製し、使用するのが好ましい。
ゲノムＤＮＡは、既知の方法で抽出することができ、この抽出は、市販のＤＮＡ抽出キットを使用して容易に行うことができる。
検出ステップは、周知の遺伝子解析法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（ストランド置換増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＩＣＡＮ（等温キメラプライマー開始核酸増幅）、ＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）法、ＴＭＡ（Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅのＴＭＡシステム）法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法及びマイクロアレイなどの遺伝子検出方法として一般に使用されている周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション技術、検出対象のポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとして用いる遺伝子増幅技術などが使用される。
具体的には、試験対象から得たサンプルに由来する核酸、例えば、ｍＲＮＡなどを用いて検出を行う。ｍＲＮＡの量は、検出対象のポリヌクレオチド配列を特異的に増幅することができるように設計されたプライマーを用いる遺伝子増幅反応の方法によって測定される。本発明の検出方法にて用いるプライマーまたは検出キットに含まれるプライマーは、検出対象のポリヌクレオチド配列を特異的に増幅することができ、検出対象のポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計されるプライマーであれば、特に制限されない。ＰＣＲ増幅モニター法に使用するプライマーは、プライマー設計ソフトウェア（例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）などを用いて設計することができる。加えて、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるので、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが増幅したときに得られる増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設計するのが適切である。
より具体的には、センスプライマー（５’プライマー）はＳＬＣ３４Ａ２をコードする部分から設計され、アンチセンスプライマー（３’プライマー）はＲＯＳ１をコードする部分から設計される。本発明の検出キットに含まれるプライマーを用いることが好ましく、検出キットに最も好適に含まれるプライマーを用いることがより好ましい。ＰＣＲ増幅モニター法において、単一の反応液で全ての融合ポリヌクレオチドを検出するために、それぞれの遺伝子に対応する上述のセンスプライマーを混合することによって、マルチプレックスＰＣＲを設計することも可能である。それぞれの増幅技術に適した方法により、標的遺伝子（全遺伝子またはその特定の部分）が増幅されたかどうかを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法において、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色にかけることなどによって、標的サイズを有する増幅断片が得られたかどうかを確認することができる。標的サイズを有する増幅断片が得られた場合、これは、試験対象から得たサンプル中に検出対象のポリヌクレオチドが存在することを示す。検出対象のポリヌクレオチドの存在は、このようにして検出することができる。
本発明の融合遺伝子の検出方法は、好ましくは、試験対象から得たサンプル中における特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応によって検出するステップと、標的サイズを有する増幅断片が得られたかどうかを検出するステップとを含む。
ハイブリダイゼーション技術を用いる検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法及びＲＮＡプロテクション法を用いて実施される。ハイブリダイゼーションに使用するプローブとして、中〜高ストリンジェンシー条件下（好ましくは高ストリンジェンシー条件下）で、検出対象のポリヌクレオチド若しくはその相補鎖にハイブリダイズする少なくとも３２の連続する塩基からなる核酸分子の中心として、融合点の上流及び下流それぞれ１６塩基からなる配列を含むか、またはその相補鎖を含む、プローブを用いることができる。
ＲＴ−ＰＣＲなどの遺伝子増幅技術を用いることも可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法において、ＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法を遺伝子増幅プロセス中に行うことによって、検出対象のポリヌクレオチドの存在をより定量的に分析することができる。ＰＣＲ増幅モニター法を使用することができる。リアルタイムＰＣＲは、周知の方法であり、この方法のための市販の機器及びキットを使用して、簡便に行うことができる。
本発明の実施形態のいくつかに係る融合タンパク質の検出方法は、試験対象から得たサンプル中の特定のポリペプチド、すなわち、検出対象のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（以下「検出対象のポリペプチド」という）の存在を検出するステップを含む。このような検出ステップは、試験対象から得たサンプル（例えば、試験対象から得た癌組織または癌細胞）に由来する可溶化液を調製し、この液体中に含まれる検出対象のポリペプチドを抗ＳＬＣ３４Ａ２または抗ＣＤ７４または抗ＦＩＧ抗体及び抗ＲＯＳ１抗体と混合することによって行われる、イムノアッセイ法または酵素活性アッセイ法によって実施することができる。好ましくは、検出対象のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる技術、例えば、酵素免疫アッセイ法、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法及びウェスタンブロット法を使用することができる。
本発明の検出方法において、検出対象のポリヌクレオチドまたは検出対象のポリペプチドが試験対象から得たサンプルから検出された場合、試験対象はポリヌクレオチド陽性を有する癌に罹患した対象（患者）であり、ＲＯＳ１阻害薬を用いた治療が提供される。
本発明の検出キットは、本発明の検出方法において、検出対象のポリヌクレオチドを特異的に増幅することができるように設計された少なくともセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。センスプライマー及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
一実施形態において、融合遺伝子の検出のための本発明のプライマーセットは、（１）ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧをコードする部分から設計されたセンスプライマーと、ＲＯＳ１をコードする部分から設計されたアンチセンスプライマーとを含む、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４またはＦＩＧとＲＯＳ１遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットを含み、アンチセンスプライマーは、中〜高ストリンジェンシー条件下（好ましくは高ストリンジェンシー条件下）で「検出対象のポリヌクレオチド」にハイブリダイズする核酸分子（好ましくは少なくとも１６塩基からなる核酸分子）からなり、センスプライマーは、ストリンジェントな条件下（好ましくは高ストリンジェンシー条件下）で「検出対象のポリヌクレオチド」の相補鎖にハイブリダイズする核酸分子（好ましくは少なくとも１６塩基からなる核酸分子）からなる。
プライマーセット（１）のより具体的変形であるプライマーセットには、以下のプライマーセット（２）及びプライマーセット（３）が含まれる。
（２）任意の連続する少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマーのプライマーセット。
（３）任意の連続する少なくとも１６塩基からなるオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマーのプライマーセット。
これらのプライマーセット（１）〜（３）において、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを選択する位置の間隔は、好ましくは１ｋｂ以下であるか、センスプライマー及びアンチセンスプライマーによって増幅される増幅産物のサイズは、好ましくは１ｋｂ以下である。
加えて、プライマーは、通常、１５〜４０塩基からなる鎖長、好ましくは１６〜２４塩基からなる鎖長、より好ましくは１８〜２４塩基からなる鎖長、特に好ましくは２０〜２４塩基からなる鎖長を有する。
プライマーセットは、検出対象のポリヌクレオチドを増幅及び検出するために使用することができる。更に、特に限定されないが、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、例えば、化学合成によって作製することができる。
ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドを検出するために使用することができる代表的なＲＯＳ１、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４プライマーを表２に記載する。
Figure 2017513908
抗癌剤をスクリーニングする方法は、融合タンパク質を発現する細胞にサンプル化合物を接触させることと、その細胞中の融合タンパク質発現レベルを測定することとを含み、サンプル化合物で処置した細胞中の融合タンパク質発現レベルが、サンプル化合物で処置する前の発現レベルまたは非処置細胞中の発現レベルと比較して減少している場合、このサンプル化合物は抗癌剤の候補化合物であると判定される。
抗癌剤をスクリーニングする方法は、サンプル化合物の処置前の細胞中の融合タンパク質発現レベルを測定するステップを更に含み得る。この場合、サンプル化合物は、サンプル化合物の処置後の融合タンパク質発現レベルが同じ細胞中のサンプル化合物による処置前の発現レベルと比較して減少している場合、抗癌剤の候補化合物であると判定され得る。あるいは、抗癌剤をスクリーニングする方法は、融合タンパク質を発現する細胞を供給することと、供給された細胞の一部にサンプル化合物を接触させることとを含み得る。この場合、サンプル化合物は、サンプル化合物と接触させた細胞中の融合タンパク質発現レベルがサンプル化合物に接触させていない細胞中の発現レベルと比較して減少している場合、抗癌剤の候補化合物であると判定され得る。
スクリーニング方法に使用する細胞は、融合遺伝子または融合タンパク質が発現及び／または活性化している癌細胞に由来する細胞、細胞の抽出物または細胞の培養物であってよい。癌細胞は、上述した通り、固形癌細胞、特に肺癌、例えば、肺腺癌などの非小細胞肺癌であってよい。
更に別の実施形態は、肺癌に対する抗癌剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、融合タンパク質を発現する細胞をサンプル化合物で処理することと、その細胞中の融合タンパク質発現レベルを測定することとを含み、サンプル化合物で処置した細胞中の融合タンパク質発現レベルが、サンプル化合物で処置する前の発現レベルまたは非処置細胞中の発現レベルと比較して減少している場合、このサンプル化合物は肺癌に対する抗癌剤の候補化合物であると判定される。
ＲＯＳ１融合タンパク質（すなわち、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１及びＦＩＧ−ＲＯＳ１）は、肺癌の診断または肺癌の治療若しくは予防若しくは治療のためのマーカーとして使用することができる。肺癌の治療または予防は、治療上有効な量の融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害薬、当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬またはそれらの組み合わせを、必要とする患者に投与するステップを含む。阻害薬は、式Ｉ、Ｉａ若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩であり得る。
別の実施形態は、癌を予防及び／または治療する方法を提供し、この方法は、薬学上（治療上）有効な量の融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害薬、当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬またはそれらの組み合わせを、必要とする患者に投与するステップを含み、これらのいずれかは、式１の化合物及び本明細書にて開示した他の特定の化合物であってよい。方法は、このような治療を施すステップに先立って、癌の予防及び／または治療を必要とする患者を特定するステップを更に含み得る。別の実施形態は、癌を予防及び／または治療するための組成物を提供し、融合タンパク質に対する少なくとも１つの阻害薬（式１を含む）を単独でまたは当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する少なくとも１つの阻害薬若しくはそれらの組み合わせとともに投与することを含む。別の実施形態は、癌を予防及び／または治療するために、融合タンパク質に対する阻害薬、当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子に対する阻害薬、ＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する阻害薬またはそれらの組み合わせの使用を提供する。阻害薬は、式Ｉ、Ｉａ若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩であり得る。
本発明において、癌は、肺癌、特に、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、肺腺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌であり得る。
ＲＯＳ１融合タンパク質に対する阻害薬が、融合タンパク質に特異的に結合するアプタマー、融合タンパク質に特異的に結合する抗体からなる群から少なくとも１つ選択され、融合遺伝子またはＲＯＳ１をコードする遺伝子に対する阻害薬が、融合遺伝子またはＲＯＳ１をコードする遺伝子に特異的に結合することができる、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアプタマーからなる群から少なくとも１つ選択される、組成物。
ＲＯＳ１及び／またはＲＯＳ１キナーゼ活性（例えば、転写、翻訳または安定性）の発現を阻害する任意のＲＯＳ１キナーゼ阻害薬は、単独で使用してもよいし、式Ｉ、Ｉａの化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩と組み合わせて使用してもよい。
阻害薬は、ＲＯＳ１に特異的であってもよいし、特異的でなくてもよい（例えば、非特異的キナーゼ阻害薬、複数標的阻害薬）。いくつかのＲＯＳ１キナーゼ阻害薬が開発されており、これらの臨床応用は、調査段階である。ＲＯＳ１キナーゼ活性の下流に、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及び細胞外シグナルキナーゼ１／２（ＥＲＫ）などのキナーゼ（Ｗｉｘｔｅｄ ＪＨら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１１）並びにＳＴＡＴ３（Ｈｗａｎｇ ＪＨら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００３；１７：１１５５−１１６６）がある。こうした下流シグナル伝達経路を阻害する薬物も同様に、ＲＯＳ１キナーゼ阻害薬の代替物として、または補助剤として、単独でまたは式１の化合物と組み合わせて用いることができる。
一様式では、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１若しくはＣＤ７４−ＦＩＧ転座またはＦＩＧ−ＲＯＳ１欠失を有すると判断された対象はまた、転座部位以外の部位にＲＯＳ１変異を有すると判断される。ＲＯＳ１変異の一例は、構成的キナーゼ活性を可能にする活性化変異である。ＲＯＳ１活性化変異は、野生型変異と比較して、活性の増加を引き起こす無作為の変異である。例えば、ＲＯＳ１活性化変異は、恒常的なＲＯＳ１活性化をもたらし得る。更に、ＲＯＳ１阻害薬の使用に関連または起因する二次的なＲＯＳ１活性化変異バリアントが存在し得る。ＲＯＳ１シグナル活性の増加を引き起こす変異は、例えば、キナーゼドメインの点変異、欠失、挿入、重複若しくは逆位またはこれらの２つ以上の組み合わせにより生じ、ＲＯＳ１シグナルの増加を誘発する。本明細書に記載のＲＯＳ１融合転座または欠失とＲＯＳ１変異の両方を有すると判断された対象については、ＲＯＳ１キナーゼ阻害薬による治療を行う決定もなされ得る。加えて、この決定に基づいて、治療／療法が実施され得る。
上述の通り、ＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬による癌治療の有効性は、本発明の方法によってＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチドが検出された患者において高いと考えられる。このため、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１またはＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子及びＲＯＳ１遺伝子を有する癌患者にＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬を選択的に投与することによって、癌治療を効果的に行うことができる。したがって、本発明は、癌を治療するための方法を提供し、この方法は、式Ｉ、Ｉａ若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩であるＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬を、当該ＲＯＳ１チロシンキナーゼ阻害薬による癌治療の有効性が、本明細書に記載する上述の診断方法によって高いと判定された患者に投与するステップを含む。
本発明において、「標本」は、生物学的標本（例えば、細胞、組織、器官、体液（血液、リンパ液など）、消化液、喀痰、肺胞／気管支洗浄物、尿、便）だけでなく、これらの生物学的標本から得た核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物またはｍＲＮＡ抽出物から作製したｃＤＮＡ作製物若しくはｃＲＮＡ作製物）またはタンパク質抽出物も含む。この標本はまた、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理またはパラフィン包理処理を行ったものであってよい。
更に、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質は、当業者であれば、標本の種類、状態などを考慮して、好適な周知の技術を選択した後、作製することができる。
活性成分である上述の物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加えて、本発明の薬物は、他の薬学的に許容可能な成分を含み得る。こうした成分の例には、緩衝剤、乳化剤、懸濁化剤、安定剤、保存剤、生理食塩水などが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩などを用いることができる。乳化剤としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガカントなどを用いることができる。懸濁化剤としては、モノステアリン酸グリセロール、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウムなどを用いることができる。安定剤としては、プロピレングリコール、亜硫酸ジエチル、アスコルビン酸などを用いることができる。保存剤としては、アジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノールなどを用いることができる。
更に、ポリヌクレオチド及び抗体を含む調製物に加えて、基質、陽性対照（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリヌクレオチド、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドまたはこれらを有する細胞など）と当該ポリヌクレオチド及び抗体に付けた標識を検出するために必要な陰性対照、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどに使用する対比染色試薬（ＤＡＰＩなど）、抗体（例えば、二次抗体、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ）を検出する際に必要な分子、並びに抗体の希釈または洗浄に使用する緩衝液などの調製物を、本発明の方法に使用するためのキットとして組み合わせることができる。このキットには、キットの使用説明書を含めてよい。本発明はまた、本発明の方法にて使用するための前述のキットを提供する。
本発明に記載の検出方法は、融合パートナーのＮ末端ドメインとキナーゼドメインをコードするＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインとから実質的になる融合タンパク質を検出するときに、特に有用である。融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２タンパク質またはその断片のＮ末端ドメインとキナーゼドメインをコードするＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインとから実質的になるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、ＣＤ７４タンパク質またはその断片のＮ末端ドメインとキナーゼドメインをコードするＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインとから実質的になるＣＤ７４−ＲＯＳ１融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、ＦＩＧタンパク質またはその断片のＮ末端ドメインとキナーゼドメインをコードするＲＯＳ１タンパク質のＣ末端ドメインとから実質的になるＦＩＧ−ＲＯＳ１融合タンパク質であり得る。方法は、肺癌、特に非小細胞肺癌を診断するために用いることができ、第６染色体におけるＲＯＳ１関連染色体再構成（逆位、転座または欠失を含む）、タンパク質が他のタンパク質と融合している融合タンパク質、融合タンパク質をコードしている融合遺伝子及び癌に罹患していない個体からの標準サンプルと比較したＲＯＳ１の過剰発現のうちの少なくとも１つを検出することを含む。上記群から選択される上述の染色体再構成のうちの１つが試験サンプル中に検出される場合、式Ｉ、Ｉａ若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩などのＲＯＳ１阻害薬の治療のための個体。
化合物１の調製
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド及びその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製
Ｎ−（４−［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド及びその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製のために使用する合成経路をスキーム１に示す。
Figure 2017513908
４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリンの調製
６，７−ジメトキシ−キノリン−４−オール（１０．０ｋｇ）及びアセトニトリル（６４．０Ｌ）を順に反応器に投入した。得られた混合物を約６５℃まで加熱し、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３、５０．０ｋｇ）を加えた。ＰＯＣｌ３の添加後、反応混合物の温度を約８０℃まで上昇させた。出発材料の残余が２％未満になったとき（インプロセス高速液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］分析）、反応完了とみなした（約９．０時間）。反応混合物を約１０℃まで冷却し、次いで、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２３８．０ｋｇ）、３０％ＮＨ４ＯＨ（１３５．０ｋｇ）及び氷（４４０．０ｋｇ）の冷却溶液に入れてクエンチした。得られた混合物を約１４℃まで加温し、相分離した。有機相を水（４０．０ｋｇ）で洗浄し、真空蒸留によって濃縮して溶媒（約１９０．０ｋｇ）を除去した。メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、５０．０ｋｇ）をバッチに加え、混合物を約１０℃まで冷却した。その間に生成物が結晶化した。固体を遠心分離により回収し、ｎヘプタン（２０．０ｋｇ）で洗浄し、約４０℃で乾燥させて、表題化合物（８．０ｋｇ）を得た。
６，７−ジメチル−４−（４−ニトロ−フェノキシ）−キノリンの調製
４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリン（８．０ｋｇ）、４ニトロフェノール（７．０ｋｇ）、４ジメチルアミノピリジン（０．９ｋｇ）及び２，６ルチジン（４０．０ｋｇ）を順に反応器に投入した。反応器の内容物を約１４７℃まで加熱した。反応が完了したら（インプロセスＨＰＬＣ分析による測定で出発材料の残余が５％未満、約２０時間）、反応器の内容物を約２５℃まで冷却した。メタノール（２６．０ｋｇ）を加え、続けて水（５０．０ｋｇ）に溶解させた炭酸カリウム（３．０ｋｇ）を加えた。反応器の内容物を約２時間攪拌した。得られた固体沈殿物を濾過し、水（６７．０ｋｇ）で洗浄し、２５℃で約１２時間乾燥させて、表題化合物（４．０ｋｇ）を得た。
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの調製
ギ酸カリウム（５．０ｋｇ）、ギ酸（３．０ｋｇ）及び水（１６．０ｋｇ）を含有する溶液を、約６０℃まで加熱したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、４０．０ｋｇ）中の６，７−ジメトキシ−４−（４−ニトロ−フェノキシ）−キノリン（４．０ｋｇ）、１０％パラジウム炭素（５０％水湿潤、０．４ｋｇ）の混合物に加えた。添加は、反応混合物の温度が約６０℃に留まるように実施した。インプロセスＨＰＬＣ分析を用いた測定で、反応が完了したとみなされたら（出発材料の残余が２％未満、通常１５時間）、反応器の内容物を濾過した。濾液を約３５℃で真空蒸留して元の体積の半分まで濃縮すると、生成物が沈殿した。生成物を濾過により回収し、水（１２．０ｋｇ）で洗浄し、約５０℃で真空下にて乾燥させ、表題化合物（３．０ｋｇ；９７％の曲線下面積（ＡＵＣ））を得た。
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸の調製
市販のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸（２ １、１０．０ｋｇ）のＴＨＦ（６３．０ｋｇ）冷却溶液（約４℃）に、バッチ温度が１０℃を超えないような速度で、トリエチルアミン（８．０ｋｇ）を加えた。この溶液を約３０分間攪拌し、次いで、バッチ温度を１０℃未満に維持しながら塩化チオニル（９．０ｋｇ）を加えた。添加が完了したら、バッチ温度が１０℃を超えないような速度で、ＴＨＦ（２５．０ｋｇ）中の４−フルオロアニリン（９．０ｋｇ）の溶液を加えた。混合物を約４時間攪拌し、次いで、酢酸イソプロピル（８７．０ｋｇ）で希釈した。この溶液を、水酸化ナトリウム水溶液（水５０．０Ｌ中に２．０ｋｇ溶解）、水（４０．０Ｌ）及び塩化ナトリウム水溶液（水４０．０Ｌ中に１０．０ｋｇ溶解）で順に洗浄した。有機溶液を真空蒸留によって濃縮し、続いてヘプタンを添加すると、固体が沈殿した。固体を遠心分離により回収し、次いで、約３５℃で真空下にて乾燥させて、表題化合物（１０．０ｋｇ）を得た。
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの調製
ＴＨＦ（１１ｋｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；０．０２ｋｇ）の混合物中の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２．０ｋｇ）の溶液に、バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、塩化オキサリル（１．０ｋｇ）を加えた。この溶液を更なる処理を行わずに次の工程に使用した。
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドの調製
ＴＨＦ（２７．０ｋｇ）及び水（１３．０ｋｇ）中の４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３．０ｋｇ）及び炭酸カリウム（４．０ｋｇ）の混合物に、バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、先の工程の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドを含有する溶液を加えた。反応が完了したら（通常１０分）、水（７４．０ｋｇ）を加えた。混合物を１５〜３０℃で約１０時間撹拌すると、生成物が沈殿した。生成物を濾過により回収し、予め作製したＴＨＦ（１１．０ｋｇ）及び水（２４．０ｋｇ）の溶液で洗浄し、約６５℃で真空下にて約１２時間乾燥させて、表題化合物（遊離塩基、５．０ｋｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ１０．２（ｓ，１Ｈ），１０．０５（ｓ，１Ｈ），８．４（ｓ，１Ｈ），７．８（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．５（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．４（ｓ，１Ｈ），４．０（ｄ，６Ｈ），１．５（ｓ，４Ｈ）．ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝５０２．
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド、（Ｌ）リンゴ酸塩の調製
エタノール中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド遊離塩基（１ ５、５．０ｋｇ）の溶液に、約２５℃のバッチ温度を維持しながら、水（２．０ｋｇ）中のＬ−リンゴ酸（２．０ｋｇ）の溶液を加えた。次いで、炭素（０．５ｋｇ）及びチオールシリカ（０．１ｋｇ）を加え、得られた混合物を約７８℃まで加熱し、この時点で水（６．０ｋｇ）を加えた。次いで、反応混合物を濾過し、続いてイソプロパノール（３８．０ｋｇ）を添加し、約２５℃まで冷却した。生成物を濾過により回収し、イソプロパノール（２０．０ｋｇ）で洗浄し、約６５℃で乾燥させて、表題化合物（５．０ｋｇ）を得た。
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド及びその（Ｌ）−リンゴ酸塩の代替調製
Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミド及びその（Ｌ）−リンゴ酸塩の調製に使用することができる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２４５９１（内容全体を参照により援用する）に記載の代替合成経路をスキーム２に示す。
Figure 2017513908
４−クロロ−６，７−ジメトキシ−キノリンの調製
６，７−ジメトキシ−キノリン−４−オール（４７．０ｋｇ）及びアセトニトリル（３１８．８ｋｇ）を順に反応器に投入した。得られた混合物を約６０℃まで加熱し、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３、１３０．６ｋｇ）を加えた。ＰＯＣｌ３の添加後、反応混合物の温度を約７７℃まで上昇させた。出発材料の残余が３％未満になったとき（インプロセス高速液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］分析）、反応完了とみなした（約１３時間）。反応混合物を約２〜７℃まで冷却し、次いで、ジクロロメタン（ＤＣＭ、４８２．８ｋｇ）、２６％ＮＨ４ＯＨ（２５１．３ｋｇ）及び水（９００Ｌ）の冷却溶液に入れてクエンチした。得られた混合物を約２０〜２５℃まで加温し、相分離した。ＡＷ ｈｙｆｌｏ ｓｕｐｅｒ−ｃｅｌ ＮＦ（セライト；５．４ｋｇ）床を通して有機相を濾過し、濾過床をＤＣＭ（１１８．９ｋｇ）で洗浄した。合わせた有機相をブライン（２８２．９ｋｇ）で洗浄し、水（１２０Ｌ）と混合した。相を分離し、有機相を真空蒸留により濃縮して、溶媒を除去した（約９５Ｌの残量）。有機相を入れた反応器にＤＣＭ（６８６．５ｋｇ）を投入し、真空蒸留にて濃縮して、溶媒を除去した（約９０Ｌの残量）。次いで、メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、２２６．０ｋｇ）を投入し、混合物の温度を−２０〜−２５℃に調整し、２．５時間維持すると、固体沈殿物が生じた。次いで、これを濾過し、ｎ−ヘプタン（９２．０ｋｇ）で洗浄し、フィルター上で窒素下にて約２５℃で乾燥させ、表題化合物（３５．６ｋｇ）を得た。
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの調製
２０〜２５℃で、４−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン（３５．３ｋｇ）、ナトリウムｔ−ブトキシド（２１．４ｋｇ）及びＤＭＡ（１６７．２ｋｇ）を入れた反応器に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、１８４．３ｋｇ）中に溶解させた４−アミノフェノール（２４．４ｋｇ）を投入した。次いで、この混合物を１００〜１０５℃まで約１３時間加熱した。インプロセスＨＰＬＣ分析を用いた測定で、反応が完了したとみなされたら（出発材料の残余が２％未満）、反応器の内容物を１５〜２０℃に冷却し、１５〜３０℃の温度を維持する速度で、水（予め冷却、２〜７℃、５８７Ｌ）を投入した。得られた固体沈殿物を濾過し、水（４７Ｌ）及びＤＭＡ（８９．１ｋｇ）の混合物で洗浄し、最後に水（２１４Ｌ）で洗浄した。次いで、濾過ケーキをフィルター上で約２５℃にて乾燥させて、粗製４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（ＬＯＤに基づく算出で５９．４ｋｇ含湿、４１．６ｋｇ乾燥）を得た。粗製４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２１１．４ｋｇ）及びＤＭＡ（１０８．８ｋｇ）の混合物中で約１時間還流（約７５℃）させ、次いで、０〜５℃まで冷却し、約１時間熟成させた後、固体を濾過し、ＴＨＦ（１４７．６ｋｇ）で洗浄し、フィルター上で真空下にて約２５℃で乾燥させて、４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３４．０ｋｇ）を得た。
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンの代替調製
４−クロロ−６，７−ジメトキシキノリン（３４．８ｋｇ）及び４−アミノフェノール（３０．８ｋｇ）及びナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシド（１．８当量）８８．７ｋｇ、ＴＨＦ中３５重量％）を反応器に投入し、続いて、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、２９３．３ｋｇ）を投入した。次いで、この混合物を１０５〜１１５℃まで約９時間加熱した。インプロセスＨＰＬＣ分析を用いた測定で、反応が完了したとみなされたら（出発材料の残余が２％未満）、反応器の内容物を１５〜２５℃に冷却し、２０〜３０℃の間の温度を維持しながら、水（３１５ｋｇ）を２時間かけて加えた。次いで、反応混合物を２０〜２５℃で更に１時間攪拌した。粗生成物を濾過により回収し、水８８ｋｇ及びＤＭＡ８２．１ｋｇの混合物で洗浄し、続けて水１７５ｋｇで洗浄した。生成物を濾過乾燥機で５３時間乾燥させた。ＬＯＤは、１％ｗ／ｗ未満を示した。
代替手順において、１．６当量のナトリウムｔｅｒｔ−ペントキシドを使用し、反応温度を１１０〜１２０℃上昇させた。加えて、冷却温度を３５〜４０℃に上げ、水添加の開始温度を３５〜４０℃に調整したが、発熱して４５℃になった。
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸の調製
ＴＨＦ（８９．６ｋｇ）中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸（２４．７ｋｇ）の冷却溶液（約５℃）に、バッチ温度が５℃を超えないような速度で、トリエチルアミン（１９．５ｋｇ）を加えた。この溶液を約１．３時間攪拌し、次いで、バッチ温度を１０℃未満に維持しながら塩化チオニル（２３．１ｋｇ）を加えた。添加が完了したら、温度を１０℃未満に維持しつつ、溶液を約４時間攪拌した。次いで、バッチ温度が１０℃を超えないような速度で、ＴＨＦ（３３．１ｋｇ）中の４−フルオロアニリン（１８．０ｋｇ）の溶液を加えた。混合物を約１０時間撹拌した時点で、反応完了とみなした。次いで、反応混合物を酢酸イソプロピル（２１８．１ｋｇ）で希釈した。この溶液を、水（４１５Ｌ）で更に希釈した水酸化ナトリウム水溶液（１０．４ｋｇ、水１１９Ｌ中に５０％溶解）、次いで水（１００Ｌ）、最後に塩化ナトリウム水溶液（水１００Ｌ中に２０．０ｋｇ溶解）で順に洗浄した。有機溶液を４０℃未満で真空蒸留によって濃縮し（１００Ｌの残量）、続いてｎ−ヘプタン（１７１．４ｋｇ）を添加すると、固体が沈殿した。固体を濾過により回収し、ｎ−ヘプタン（１０２．４ｋｇ）で洗浄して、湿った粗製の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２９．０ｋｇ）を得た。粗製１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸をメタノール（１３９．７ｋｇ）中に約２５℃で溶解し、続いて、水（３２０Ｌ）を加えると、スラリーが生じた。これを濾過により回収し、水（２０Ｌ）及びｎ−ヘプタン（１０３．１ｋｇ）で順に洗浄した後、フィルター上で窒素下にて約２５℃で乾燥させて、表題化合物（２５．４ｋｇ）を得た。
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの調製
ＴＨＦ（９６．１ｋｇ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；０．２３ｋｇ）の混合物中の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（２２．８ｋｇ）の溶液に、バッチ温度が２５℃を超えないような速度で、塩化オキサリル（１２．６ｋｇ）を加えた。この溶液を更なる処理を行わずに次の工程に使用した。
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの代替調製
１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボン酸（３５ｋｇ）、ＤＭＦ３４４ｇ及びＴＨＦ１７５ｋｇを反応器に投入した。反応混合物を１２〜１７℃になるように調整し、次いで、反応混合物に１９．９ｋｇの塩化オキサリルを１時間かけて投入した。反応混合物を１２〜１７℃で３〜８時間攪拌した。この溶液を更なる処理を行わずに次の工程に使用した。
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミドの調製
ＴＨＦ（２４５．７ｋｇ）及び水（１１６Ｌ）中の化合物４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（２３．５ｋｇ）及び炭酸カリウム（３１．９ｋｇ）の混合物に、バッチ温度が３０℃を超えないような速度で、先の工程の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドを含有する溶液を加えた。反応が完了したら（約２０分）、水（６５３Ｌ）を加えた。混合物を２０〜２５℃で約１０時間撹拌すると、生成物が沈殿した。生成物を濾過により回収し、予め作製したＴＨＦ（６８．６ｋｇ）及び水（２５６Ｌ）の溶液で洗浄し、最初にフィルター上で窒素下にて約２５℃で乾燥させ、次いで真空下にて約４５℃で乾燥させて、表題化合物（４１．０ｋｇ、３８．１ｋｇ、ＬＯＤに基づいて算出）を得た。
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミドの代替調製
４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミン（３５．７ｋｇ、１当量）、続いて、ＴＨＦ４１２．９ｋｇを反応器に投入した。水（１６９ｋｇ）中のＫ２ＣＯ３（４８．３）の溶液を反応混合物に投入した。４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニルアミンを入れた反応器に、上記の１−（４−フルオロ−フェニルカルバモイル）−シクロプロパンカルボニルクロリドの代替調製に記載した酸塩化物溶液を、２０〜３０℃の温度を維持しながら、最低２時間かけて移した。反応混合物を２０〜２５℃で最低３時間撹拌した。次いで、反応温度を３０〜２５℃に調整し、混合物を攪拌した。攪拌を停止し、混合物の相を分離させた。下層の水相を除去し、捨てた。残った上層の有機相に８０４ｋｇの水を加えた。この反応物を１５〜２５℃で最低１６時間攪拌した。
生成物が沈殿した。生成物を濾過し、水１７９ｋｇ及びＴＨＦ１５７．９ｋｇの混合物で２回に分けて洗浄した。粗生成物を真空下で少なくとも２時間乾燥させた。次いで、乾燥させた生成物をＴＨＦ２８５．１ｋｇ中に収集した。得られた懸濁液を反応容器に移し、懸濁液が透明な（溶解した）溶液になるまで攪拌した。これには、約３０分間の３０〜３５℃までの加熱を要した。次いで、４５６ｋｇの水及び２０ｋｇのＳＤＡＧ−１エタノール（２時間にわたってメタノールで変性させたエタノール）を溶液に加えた。混合物を１５〜２５℃で少なくとも１６時間攪拌した。生成物を濾過し、水１４３ｋｇ及びＴＨＦ１２６．７の混合物で２回に分けて洗浄した。生成物を４０℃の最大温度設定値で乾燥させた。
代替手順において、酸塩化物形成中の反応温度は、１０〜１５℃に調整した。再結晶温度は、１５〜２５℃から４５〜５０℃、１時間に変え、次いで、２時間にわたって１５〜２５℃まで冷却した。
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド、リンゴ酸塩の調製
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（１−５；１３．３ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸（４．９６ｋｇ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ；１８８．６ｋｇ）及び水（３７．３ｋｇ）を反応器に投入し、混合物を約２時間、加熱還流させた（約７４℃）。反応器温度を５０〜５５℃まで下げ、反応器の内容物を濾過した。上記のこれらの連続工程を、同様量の出発材料（１３．３ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸（４．９６ｋｇ）、ＭＥＫ（１９８．６ｋｇ）及び水（３７．２ｋｇ）から出発して、更に２回繰り返した。合わせた濾液を、ＭＥＫ（１１３３．２ｋｇ）を用いて、約７４℃、大気圧で、共沸乾燥させた（およその残量７１１Ｌ；ＫＦ≦０．５％ｗ／ｗ）。反応器の内容物の温度を２０〜２５℃に低下させ、約４時間保持すると、固体沈殿物が生じた。これを濾過し、ＭＥＫ（４４８ｋｇ）で洗浄し、真空下で５０℃にて乾燥させて、表題化合物（４５．５ｋｇ）を得た。
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド、（Ｌ）リンゴ酸塩の代替調製
シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（４７．９ｋｇ）、Ｌ−リンゴ酸（１７．２）、メチルエチルケトン６５８．２ｋｇ及び水１２９．１ｋｇ（３７．３ｋｇ）を反応器に投入し、混合物を５０〜５５℃で約１〜３時間加熱し、次いで５５〜６０℃で更に４〜５時間加熱した。混合物を１μｍカートリッジを通す濾過により清澄にした。反応器温度を２０〜２５℃に調整し、最高ジャケット温度５５℃、１５０〜２００ｍｍＨｇの真空で、５５８〜７３１Ｌの体積範囲まで真空蒸留した。
真空蒸留を更に２回、それぞれ３８０ｋｇ及び３８０．２ｋｇのメチルエチルケトンを投入して、行った。３回目の蒸留後、１５９．９ｋｇのメチルエチルケトンを投入することによって、シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミドが１８ｖ／ｗになるようにバッチ体積を調整し、８８０Ｌの全体積を得た。２４５．７のメチルエチルケトンを調整することによって、更なる真空蒸留を実施した。反応混合物を２０〜２５℃で少なくとも２４時間穏やかに攪拌した。生成物を濾過し、４１５．１ｋｇのメチルエチルケトンで３回に分けて洗浄した。４５℃のジャケット温度設定点で真空下にて生成物を乾燥させた。
代替手順において、添加順序を変更し、水１２９．９ｋｇ中に溶解したＬ−リンゴ酸溶液１７．７ｋｇを、メチルエチルケトン（６７３．３ｋｇ）中のシクロプロパン−１，１−ジカルボン酸［４−（６，７−ジメトキシ−キノリン−４−イルオキシ）−フェニル］−アミド（４−フルオロ−フェニル）−アミド（４８．７ｋｇ）に添加するようにした。
生物学的実施例
ＨＣＣ−７８及びＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞の成長
ＨＣＣ−７８とＮＣＩ−Ｈ２２２８の両細胞をそれぞれＤＳＭＺとＡＴＣＣから凍結生体サンプルとして受け取り、これをＴ−７５フラスコ（Ｎｕｎｃ）中に解凍し、付着細胞の場合は８０〜９０％コンフルエントになるまで、浮遊細胞の場合は細胞密度が１〜２×１０６細胞／ｍＬになるまで、成長させた。
ＮＣＩ−Ｈ２２２８（活性化ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有するヒト肺ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ５９３５））を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ３０−２００１）、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３９０４）上に、０．１ｍｌ中３．５×１０４細胞／ウェル及び２．５×１０４細胞／ウェルの密度でそれぞれ４８時間または７２時間播種した。
ＨＣＣ−７８（活性化ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合体及びｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｍｅｔを有するヒト肺ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５６３））を、ＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ３０−２００１）、１０％ＦＢＳ（加熱不活性、Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３９０４）上に、０．１ｍｌ中２．５×１０４細胞／ウェル及び２×１０４細胞／ウェルの密度でそれぞれ４８時間または７２時間播種した。
３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で１６時間、細胞を成長させた。新鮮な血清不含培地または血清含有培地中のＤＭＳＯまたは化合物１の連続希釈物を細胞に加え、３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間または７２時間インキュベートし、５’−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）標識溶液（Ｒｏｃｈｅ）を２〜４時間加えた。浮遊細胞をフィルタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５０４）に移し、アッセイを実施した。細胞の増殖は、ＢｒｄＵの取り込みをモニターすることによって、アッセイした。細胞増殖ＥＬＩＳＡの試薬であるＢｒｄＵ（化学発光）キット（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１ ６６９ ９１５ ００１）を製造者の説明書に従って用いた。ＢｒｄＵ標識後、ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液で細胞を固定した。抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）複合体を加え、プレートを１×ＰＢＳで洗浄した。基質溶液を加え、Ｖｉｃｔｏｒ Ｗａｌｌａｃ Ｖプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で発光測定値を得た。化合物１処理の細胞増殖とＤＭＳＯ処理サンプルとを比較することによって、増幅阻害パーセンテージを算出した。阻害パーセンテージ値が５〜８の化合物１の濃度をＩＣ５０値の算出に用いた。
生物学的実施例
ＲＯＳ１リン酸化反応の阻害
ＨＣＣ−７８細胞（活性化ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１融合及びｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｍｅｔを有するヒト肺ＮＳＣＬＣ腺癌細胞株（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ５６３））を、１０％ＦＢＳ（加熱不活性、Ｃｅｌｌｇｒｏ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ、３０−２００１）を含む６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、１５２７９５）上に３×１０５細胞／ウェルで播種した。最終濃度０．３％ＤＭＳＯ（ビヒクル）で１０％ＦＢＳを含む新鮮な培地中のＤＭＳＯまたは化合物１の連続希釈物を細胞に加え、３時間インキュベートした。処理後、細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄し、冷却した０．１５ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、５μｇ／ｍＬロイペプチン及び５μｇ／ｍＬペプスタチンＡ）で直ちに溶解した。溶解物を回収し、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を測定した。溶解物を回収し、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を測定した。溶解物をＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００７）及び還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＮＰ０００４）と混合し、次いで、７０℃で１０分間加熱した。ＮｕＰａｇｅ １０％Ｂｉｓ Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０３０２）上に２０μｇのタンパク質をロードした。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＣ２００１）上に移し、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ、９２７ ４００００）で１時間ブロックし、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中に希釈した抗ＲＯＳ１マウスモノクローナル抗体（１：１０００）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２６６）及び抗ｐｈｏｓｐｈｏ ＲＯＳ１（Ｙ２２７４）ウサギ抗体（１：１０００）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３０７７）とともに４℃で終夜インキュベートした。膜をＴＢＳ Ｔ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．２；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）でそれぞれ１０分間４回洗浄し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０１％ ＳＤＳを含有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中のヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０（Ｌｉ−Ｃｏｒ、９２６ ３２２２０）及びヤギ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉ−Ｃｏｒ、９２６ ３２２１１）二次抗体で室温にて６０分間ブロットした。膜をＴＢＳ−Ｔ緩衝液でそれぞれ１０分間４回洗浄し、ＰＢＳで２回すすいだ。Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナー（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて膜をスキャニングし、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて各バンドのシグナル強度を定量化した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照と比較した化合物処理物のシグナルに基づいてＩＣ５０値を算出した。
化合物１の３−［（１Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン（クリゾチニブ、ＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標））を単回漸増用量で投与したＨＣＣ−７８ＮＳＣＬＣ細胞におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１媒介キナーゼ活性の阻害を図１に示す。図１は、ＲＯＳ１融合キナーゼに対する化合物１の強力な阻害活性をはっきりと示しており、インビトロで試験した濃度において、比較対照の３−［（１Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン（クリゾチニブ）よりも強力である。
生物学的実施例
ＨＣＣ−７８ ＮＳＣＬＣ細胞のＲＯＳ１依存的増殖
活性物質とＨＣＣ−７８ ＮＳＣＬＣ細胞を各種濃度で４８時間または７２時間インキュベーションした後の化合物１及び比較対照の３−［（１Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン（クリゾチニブ）のＩＣ５０値を算出した。ＨＣＣ−７８ＮＳＣＬＣ細胞の増殖の定量化は、ＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡ（化学発光、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１１ ６６９ ９１５ ００１）を製造者の推奨に従って実施した。ＩＣ５０値（Ａ〜Ｅ）（５０％阻害濃度）の特定を上記の記載に従って決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてコンピュータで決定した。
Figure 2017513908
他の実施形態
上述の開示について、明確さと理解のために、例示及び実施例を用いて、ある程度詳細に説明し、本発明について、様々な具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲内に留まりつつ、多数の変更及び修正がなされ得ることは理解されるべきである。添付の特許請求の範囲内で、変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、上記の記述は、例示を意図するものであり、限定の意図はないことを理解されたい。
したがって、本発明の範囲は、上記の記述を参照して決定されるべきではなく、むしろ、以下の添付の特許請求の範囲を参照し、かかる請求項が権利主張する等価物の全範囲を含め、決定されるべきである。

Claims (42)

  1. 肺腺癌を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする患者に、式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、前記方法。
    Figure 2017513908
     ［式中、
    Ｒ１は、ハロであり、
    Ｒ２は、ハロであり、
    Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
    Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
    Ｑは、ＣＨまたはＮである。］
  2. 前記肺腺癌が非小細胞肺癌である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記肺腺癌がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記式Ｉの化合物が式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
    Figure 2017513908
     （式中、
    Ｒ１は、ハロであり、
    Ｒ２は、ハロであり、
    Ｑは、ＣＨまたはＮである。）
  5. 前記式Ｉの化合物が、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
    Figure 2017513908
  6. 化合物１が、Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記式（Ｉ）、式Ｉ（ａ）の化合物及び化合物１が、（Ｌ）−または（Ｄ）−リンゴ酸塩である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記式（Ｉ）の化合物が、前記（Ｌ）リンゴ酸塩及び／または前記（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記式Ｉ、Ｉ（ａ）の化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を更に含む医薬組成物として投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、別の形態の治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、シスプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、カルボプラチン治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、カルボプラチン及び／またはゲムシタビン治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記式Ｉの化合物が、シスプラチン及び／またはカルボプラチン治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、ドセタキセル治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、クリゾチニブ治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、クリゾチニブ及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、シスプラチン及び／またはゲムシタビン及び／またはドセタキセル治療後に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  20. 治療上有効な量の化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌の治療を必要とする患者の当該非小細胞肺癌を治療するための方法。
  21. 哺乳動物における異常細胞増殖の進行を阻害し、または後退させるための方法であって、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含み、前記異常細胞増殖がＲＯＳ１キナーゼによって媒介される癌である、前記方法。
  22. 前記癌が肺腺癌である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記肺腺癌が非小細胞肺癌である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記肺腺癌がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である、請求項２１に記載の方法。
  25. 化合物１またはその薬学的に許容可能な塩が、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与される、請求項２４に記載の方法。
  26. 化合物１またはその薬学的に許容可能な塩が、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与され、前記医薬組成物が３ヶ月を超えて毎日投与される、請求項２４に記載の方法。
  27. 化合物１またはその薬学的に許容可能な塩が、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物として投与され、前記医薬組成物が５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５ｍｇ／日の用量で投与される、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌の検出が、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨまたはＳＩＳＨアッセイを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌の前記検出が、ゲノムＰＣＲ、直接シークエンス法、ＰＣＲシークエンス法、ＲＴ−ＰＣＲまたは同様のアッセイのいずれかの形態を用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌の前記検出が、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１若しくはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合ポリペプチドまたはそれらの断片に特異的に結合する抗体を用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
  31. 患者の診断及び治療の方法であって、前記患者がＮＳＣＬＣ腫瘍を有し、かつ前記腫瘍がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性ＮＳＣＬＣであることが特定され、前記治療が治療上有効な量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体の投与を含む、前記方法。
  32. ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌である肺腺癌の治療を必要とする患者の当該肺腺癌を治療するための方法であって、前記患者に治療上有効な量の化合物１またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、前記方法。
    Figure 2017513908
  33. 前記有効量の式Ｉ、Ｉａの化合物または化合物１が、腫瘍サイズの減少、転移の減少、完全寛解、部分寛解、安定的疾患、全奏効率の増加または病理学的完全奏効からなる群から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 癌性細胞におけるＲＯＳ１融合キナーゼ活性を阻害する方法であって、前記細胞を有効量の式Ｉの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩と接触させることを含む、前記方法。
    Figure 2017513908
     ［式中、
    Ｒ１は、ハロであり、
    Ｒ２は、ハロであり、
    Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
    Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
    Ｑは、ＣＨまたはＮである。］
  35. 前記癌性細胞が非小細胞肺癌の腺癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記癌性細胞がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ１、ＣＤ７４−ＲＯＳ１またはＦＩＧ−ＲＯＳ１融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌の腺癌細胞である、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記式Ｉの化合物が式Ｉａの化合物またはそれらの薬学的に許容可能な塩である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
    Figure 2017513908
     ［式中、
    Ｒ１は、ハロであり、
    Ｒ２は、ハロであり、
    Ｑは、ＣＨまたはＮである。）
  38. 前記式Ｉの化合物が、化合物１またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
    Figure 2017513908
  39. 化合物１が、Ｎ−（４−｛［６，７−ビス（メチルオキシ）キノリン−４−イル］オキシ｝フェニル）−Ｎ’−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記式（Ｉ）、式Ｉ（ａ）の化合物及び化合物１が、（Ｌ）−または（Ｄ）−リンゴ酸塩である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記式（Ｉ）の化合物が、前記（Ｌ）リンゴ酸塩及び／または前記（Ｄ）リンゴ酸塩の結晶性Ｎ−１型またはＮ−２型である、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記式Ｉ、Ｉ（ａ）の化合物若しくは化合物１またはそれらの薬学的に許容可能な塩が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を更に含む医薬組成物として、前記癌性細胞に投与される、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
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