KR20190033258A - Bcar4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자를 이용하는 종양 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4는 폐암, 유방암 환자의 암조직에서 정상조직에 비하여 유의적으로 발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 CD63-BCAR4 융합 유전자의 서열로 발현되므로, 이를 폐암 유전자 마커로 사용할 수 있다. 또한, BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)의 발현을 조절하는 것을 통해 암세포의 증식률 및 이주능을 저하시킬 수 있으므로,본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

Description

BACR4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자를 이용하는 종양 진단용 조성물{Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion gene thereof}
본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현 억제제를 포함하는 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
폐암은 암으로 인한 사망에 있어서, 가장 많은 사망률을 나타내는 조직암이다. 세계적으로 매년 1 만명 이상의 환자가 폐암으로 인해 사망하는 것으로 알려져 있다. 폐암은 진행 중에는 증상이 없는 경우가 흔하기 때문에, 증상이 나타날 때 쯤이면 이미 진행된 경우가 많다. 따라서, 폐암을 간단하게 조기 진단하기 위한 방법을 개발하기 위한 필요가 제시되고 있다. 폐암의 진단을 위해 EGFR, KRAS, ALK 등 일부 유전자의 돌연변이가 검사되고 있으나 추가로 폐암 진단의 마커로 사용하기 위한 특이 발현 유전자를 발굴하는 연구가 진행되고 있다.
융합 유전자(fusion gene)는 두 개의 유전자가 한 개의 유전자로 재구성되어 전혀 새로운 기능을 수행하는 유전자이다. 융합 유전자가 형성되는 기작은 크게 3 가지로 분류되며, 서로 다른 염색체의 일부분이 위치 이동하면서 생성될 수 있고, 같은 염색체내에서 일부가 위치 이동하여 생성될 수 있으며, 또는 동일하거나 서로 다른 염색체 내에서 유전자가 각각의 전사체를 만들고 상기 각각의 전사체가 그대로 융합되어 융합 유전자를 생성할 수 있다.
이러한 융합 유전자들은 암 세포를 비롯한 비정상적인 조직 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있어, 최근 암의 진단 및 치료를 위한 표적으로 주목받고 있다. 암 세포에서 융합 유전자의 발현은 혈액암에서 최초 보고된 이래로, 융합 유전자 및 이로부터 발현되는 융합 단백질에 대한 연구가 계속되고 있다. 폐암과 같은 고형암에서는 ALK, ROS1 등 타이로신 키나아제를 암호화하는 유전자가 융합된 형태의 융합 유전자의 발현이 보고되어, 진단에 사용될 뿐 아니라 암 조직에서 융합 유전자가 발현되는 환자에서 타이로신 키나아제의 억제제를 적용하여 효과적인 임상적 치료 효과를 확인한 것으로 보고된 바 있다.
따라서, 융합 유전자는 암 환자에서 낮은 빈도로 발견되나 암특이적 마커로 판단되며, 동시에 표적 치료제로서의 대상이 될 수 있어, 이에 대한 연구가 계속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 폐암 진단에 사용하기 위한 융합 유전자 마커를 발굴하기 위해 노력한 결과, BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)의 mRNA가 폐암 및 유방암 환자의 조직에서 유의적으로 발현됨을 확인하였고, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자를 발굴하였다. 또한, 본 발명자들은 BCAR4 엑손 4 및 Cd63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)를 분리, 동정하여 과발현 세포주를 수립하였다. 정상 기관지상피세포주에 CD63-BCAR4를 과발현한 경우, 세포 증식률 및 이주능이 증가하여 종양세포의 특징을 보였다. CD63-BCAR4 과발현 세포를 이종이식한 마우스에서 종양이 형성되고 이식부위에 형성된 종양이외에도 간에서 여러 개의 종양을 형성하여 전이를 확인하였다. 이와 같은 CD63-BCAR4 과발현 세포의 종양형성 효과는 siRNA를 사용하여 CD63-BCAR4 발현을 억제하였을 때 다시 세포 증식률 및 이주능이 현저히 감소하여 CD63-BCAR4 고유의 기능인 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 폐암 진단을 위한 마커 유전자에 대한 연구가 계속되고 있으며, 특히 암 특이 마커 유전자로서 융합 유전자에 대한 연구가 계속되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, BCAR4 유전자의 엑손4의 과발현 또는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인하여 폐암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, BCAR4 유전자의 엑손4의 과발현 또는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은, 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii) 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 BACR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 융합 유전자는 BCAR4 엑손 4의 5'말단 앞에 CD63의 엑손 2 및 엑손3이 포함된 서열이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다. 융합유전자의 단백질 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브인 것일 수 있으며; 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA로 암호화는 단백질에 특이적인 항체인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 mRNA 발현을 억제하는 제제는, CD63-BCAR4 융합유전자의 mRNA에 대한 siRNA 및 shRNA 중 어느 하나인 것일 수 있으며, 상기 siRNA는 서열번호 7의 염기서열 또는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)는 폐암과 유방암에서 과발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자를 폐암에서 발굴하여, 이를 폐암 유전자 마커로서 제공한다.
또한, BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)를 과발현하는 정상 기관지상피세포주가 암세포화되어 세포 증식률 및 이주능이 증가하며, 암세포화된 Cd63-BCAR4 과발현 세포를 이종이식한 마우스에서 종양이 형성되고 간으로의 전이를 나타내었고 이와 같은 효과는 다시 CDd63-BCAR4 발현을 억제하였을 때 다시 세포 증식률 및 이주능이 정상 세포 수준으로 회복될 수 있어, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
도 1은 유방암 및 폐암 환자의 암조직에서 정상조직에 비하여 BCAR4 엑손 4의 과발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 1a는 유방암 환자의 암 조직(T) 및 정상 조직(N)에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이고;
도 1b는 폐암 세포주에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이며;
도 1c는 폐암 환자의 암 조직(T) 및 정상 조직(N)에서 BCAR4 엑손4 mRNA의 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 2는 BCAR4 엑손 4 과발현을 유도한 정상기관지상피세포, 폐암세포, 유방암세포의 세포 증식률과 콜로니형성 증가 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2a는 BCAR4 엑손4를 과발현한 세포에서 세포 성장의 증가를 확인한 결과이고;
도 2b는 BCAR4 엑손4를 과발현한 세포에서 콜로니 형성의 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자가 융합된 융합 유전자(CD63-BCAR4)의 발견된 구조 및 CD63-BCAR4 과발현 세포의 제조를 나타낸다.
도 3a는 CD63-BCAR4 융합 유전자의 서열 및 구조를 나타내는 모식도이고;
도 3b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 도입한 세포에서 과발현 여부를 mRNA와 단백질 수준에서 확인한 결과이다.
도 4는 CD63-BCAR4 과발현 세포의 세포 증식률 및 이주능 증가 양상을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 세포 성장 증가를 확인한 결과이고;
도 4b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 콜로니 형성 증가를 확인한 결과이며;
도 4c는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포의 세포 이주능(migration) 증가 정도를 상처 회복 분석(Wound healing assay)으로 확인한 결과이고;
도 4d는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에서의 세포 이주능 증가 정도를 트랜스웰(Transwell)을 사용하여 확인한 결과이다.
도 5는 CD63-BCAR4 과발현 세포를 피하 접종한 마우스에서 종양 형성 및 간으로의 전이를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 종양 형성의 증가를 확인한 결과이고;
도 5b는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스의 간에서 발견된 종양 조직의 형성을 확인한 결과이며;
도 5c는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 적출한 피하 종양 및 간 종양에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 과발현을 확인한 결과를 나타내고;
도 5d는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포를 피하접종한 마우스에서 적출한 피하 종양 및 간 종양 세포의 세포 이주능을 확인한 결과이다.
도 6은 CD63-BCAR4 과발현 세포에서 특이적 siRNA를 사용하여 CD63-BCAR4 발현을 억제하였을 때, 세포 증식률 및 이주능이 감소하는 결과를 나타낸다.
도 6a는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 과발현한 정상기관지상피세포에 CD63-BCAR4 융합 유전자 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이고;
도 6b는 CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA로 발현 억제한 세포의 세포 이주능 감소 효과를 트랜스웰로 확인한 세포 사진이며;
도 6c는 CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA로 발현 억제한 세포의 세포 이주능 감소 효과를 정량적으로 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 폐암 진단을 위한 마커 유전자에 대한 연구가 계속되고 있으며, 특히 암 특이 마커 유전자로서 융합 유전자에 대한 연구가 계속되고 있다.
이에 따라, 본 발명은 BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 CD63-BCAR4 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 i) 및 ii) 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:
i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계.
본 발명에 있어서, "BCAR4 엑손 4"는 BCAR4 유전자의 4 번째 엑손을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열 중 847 번에서 1224 번째 염기서열에 해당한다.
본 발명에 있어서, "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자"는 BCAR4 엑손 4의 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태를 의미한다. CD63-BCAR4 융합유전자에서는 CD63 유전자의 엑손 2-3이 포함되었으나 BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합유전자의 파트너 유전자는 CD63에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자" 로부터 발현되는 융합 단백질은 BCAR4 엑손 4으로부터 합성되는 아미노산 서열 을 그대로 유지하면서 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자로부터 유래한 아미노산 서열이 연결된 형태이다. 보다 구체적으로, 상기 CD63-BCAR4 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 이로부터 발현되는 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다. 상기 융합 유전자 서열 중에서, CD63 서열은 CD63 mRNA 서열(서열번호 6의 염기서열)의 404 번째 내지 658 번째 서열에 해당하며, BCAR4 엑손 4 서열은 서열번호 3에 해당한다.
본 발명에 있어서, "mRNA의 발현 수준을 측정"하는 것은 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부 및 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 구체적으로, 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 검출 방법을 통하여, 정상 대조군 개체와 폐암 의심 개체에서의 mRNA 발현 수준을 비교할 수 있고, 마커 유전자인 BCAR4 융합 유전자의 mRNA 발현 수준이 증가되는 것으로 확인되는 경우, 대상 환자가 폐암인 것으로 진단할 수 있다. 또한, "mRNA 수준을 측정하는 제제"는 프라이머 쌍 또는 프로브를 사용할 수 있으며, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 또는 이를 포함하는 융합 유전자의 핵산 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 서열번호 8은 BCAR4 엑손 4의 발현을 확인할 수 있는 프라이머 쌍의 염기서열이다. 서열번호 9는 CD63-BCAR4 융합유전자의 발현을 확인할 수 있는 프라이머 쌍의 염기서열이다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 폐암 여부를 진단하거나 예후 예측이 가능하다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 폐암의 진단 또는 예후를 예측할수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, "단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"는 폐암의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블롯팅(western blotting), 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 폐암 진단을 위한 정보제공 방법에 있어서, 구체적으로 BCAR4 또는 이를 포함하는 융합 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질 수준을 검출할 수 있으며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질을 분리하여 공지의 공정을 통해 발현 수준을 검출할 수 있다. 여기에서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료는 마커 유전자의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 조직 시료를 사용하는 것이 폐암 특이적인 진단을 위한 관점에서 바람직하다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출방법들을 통하여, 정상 대조군 개체와 폐암 의심개체에서의 mRNA 발현양을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 폐암 의심 개체의 실제 발병을 진단할 수 있다.
단백질 발현 수준의 측정은 ELISA 방법(직접적 ELISA, 간접적 ELISA 또는 샌드위치 ELISA 등), 웨스턴 블랏 또는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 상기 단백질 칩은 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위에 정해진 위치에 배열되어 고밀도록 고정화되어있는 단백질을, 단백질칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유방암 조직 및 폐암 조직을 대상으로 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인한 결과, 유방암 조직 뿐 아니라 폐암 조직에서도 BCAR4 엑손 4의 과발현을 확인하였다(도 1). 이에 따라 BCAR4 엑손 4를 과발현하는 세포주를 제조하였을 때, 암세포주 뿐 아니라 정상 기관지 상피세포주에서도 BCAR4 엑손 4의 과발현에 따라 세포 증식률이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
또한, 본 발명자들은 BCAR4 엑손 4가 포함된 융합 유전자가 폐암 조직에서 유의적으로 발현되는지 확인한 결과, BCAR4 엑손 4의 앞에 CD63 유전자 일부가 융합된 형태의, Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준이 유의적으로 나타나는 것을 확인하였다(도 3a). 이에, 정상 기관지상피세포주에 Cd63-BCAR4 융합 유전자를 과발현하였을 때(도 3b), 증식률 및 이주능이 증가하는 것을 확인하였다(도 4). 아울러, Cd63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포를 마우스에 이종이식하였을 때, 종양 조직이 형성될 뿐 아니라 주변 조직인 간으로 종양이 전이되어, 간에서도 종양이 형성되는 것을 확인하였고, 종양으로부터 분리된 세포에서 암세포의 특징을 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 5).
따라서, 본 발명은 폐암 진단의 유전자 마커로 사용하기 위한 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4) 및 이를 포함하는 융합 유전자의 용도를 제공한다. 본 발명의 BCAR4 엑손 4이 폐암 환자의 조직에서 유의적으로 발현되며, 특히 BCAR4 엑손 4와 CD63 유전자 일부가 융합된 융합 유전자의 서열로 발현되므로, 이를 폐암 유전자 마커로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, "BCAR4 엑손 4"는 BCAR4 유전자의 4 번째 엑손을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 BCAR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되며, 구체적으로 서열번호 5의 염기서열 중 847 번에서 1224 번째 염기서열에 해당한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, "BCAR4 엑손 4를 포함하는 융합 유전자"는 BCAR4 엑손 4의 5' 말단의 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 분리, 동정한 융합 유전자는 CD63-BCAR4 융합 유전자이고, 이는 서열번호 1의 염기서열로 구성된다.
본 발명의 약학적 조성물에서, "mRNA 발현을 억제하는 제제"는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA 중 하나일 수 있으며, 구체적으로 siRNA인 것이 바람직하다. 상기 mRNA 발현을 억제하는 제제가 siRNA일 때, siRNA의 서열은 서열번호 7의 염기서열 또는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 비종양 세포인 BEAS-2B 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 유도하였을 때, 상기 융합 유전자에 의해 비종양성 세포가 암세포화 되는 것을 확인하였으므로, 이를 다시 발현 억제하는 경우에 암세포화된 특성이 유지되는지 확인한 결과, siRNA를 통해 Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 억제하였을 때 암세포화 되었던 비종양 세포의 세포 증식률 및 이주능이 정상세포 수준으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 CD63 유전자 서열이 융합된 융합 유전자(Cd63-BCAR4)의 발현을 조절하는 것을 통해, 암세포의 증식률 및 이주능을 조절할 수 있으므로, 본 발명의 BCAR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자의 발현을 억제할 수 있는 제제를 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 유효성분으로 포함하는 항암 보조제를 제공한다.
본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량으로는, 비경구 투여 시 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여 시는 본 발명의 두류 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
폐암 세포에서 BCAR4 엑손 4(Breast cancer anti-estrogen resistance 4 exon 4)의 발현 수준 확인
<1-1> 폐암 세포에서 BCAR4 엑손 4의 mRNA 발현 수준 확인
BCAR4는 유방암 조직에서 발현되는 것으로 공지된 바 있으며, 이에 따라 타모시펜(tamoxigen) 내성 유전자로서 역할을 하여 에스트로겐(estrogen)에 의존적인 세포의 세포 생장에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 BCAR4가 유방암 외의 조직암에서도 발현 수준이 변화할 수 있는지 확인하고자 하였다.
먼저, 다양한 폐암 세포주(총 25종)를 표준 절차에 따라 배양하였다. 배양한 세포를 수득하여 파쇄한 다음 이로부터 mRNA를 수득한 다음, 역전사 PCR을 수행하여 각각의 세포주에 대한 cDNA를 합성하였다. 또한, 폐암 환자(총 49명)로부터 수득한 조직(총 49 시료)을 준비하고, 각각의 조직 시료로부터 mRNA를 추출한 다음, 역전사 PCR을 수행하여 각각의 시료에 대한 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하고, BCAR4의 엑손 4를 표적으로 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 각각의 세포주에서의 BCAR4 mRNA의 발현 수준을 실시간 PCR(real-time PCR)으로 확인하였다. 비교 대상으로 확인하기 위해, 유방암 환자(총 23명)로부터 수득한 조직(총 23시료)에 대하여 동일 방법으로 BCAR4 엑손 4의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 정상 조직(N)과 암조직(T)에서의 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인하였을 때, 유방암환자와 폐암환자의 조직에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 유방암 환자의 암 조직 총 23 시료 중, 9 시료에서 BCAR4 발현 수준이 증가하여 약 30%의 암 조직에서 BCAR4의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 1a). 폐암에 대하여도 BCAR4 엑손 4의 발현 수준을 확인하였다. 총 25 종의 폐암 세포주 중 SNU1327, Hcc1195 및 NCI-H358 을 포함한 폐암세포주에서 BCAR4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1b). 이를 폐암 환자 유래의 조직에서도 비교한 결과, 총 49 명의 조직시료 중 17 개 시료에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 17 개 시료 중에서 13 개의 시료가 EGFR 또는 KRAS 변이를 가지지 않는 환자로부터 수득된 폐암 조직인 것으로 확인하였다(도 1c). EGFR 또는 KRAS 변이를 가지지 않는 환자로부터 수득된 총 30 개의 시료로부터 확인하였을 때 13 개의 시료에서 BCAR4 발현 수준이 증가하여, 약 43% 암조직에서 정상 조직에 비해 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1c). 이를 통해, BCAR4 엑손 4는 폐암과 유방암 조직에서 유의적으로 발현 수준이 증가할 수 있으며, 특히 EGFR 또는 KRAS 돌연변이를 가지지 않은 암세포에서 과발현 빈도가 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다.
<1-2> BCAR4 엑손 4 과발현 암세포의 세포 증식률 변화 확인
BCAR4 엑손 4가 폐암 세포 및 폐암, 유방암 조직에서 발현 수준이 증가하여 있는 것을 확인하였으므로, BCAR4 엑손 4를 과발현한 암세포의 증식률을 확인하였다.
구체적으로, BCAR4 엑손 4를 암호화하는 염기서열(서열번호 2)을 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 내에 삽입하여, BCAR4 엑손 4 과발현을 위한 벡터를 제조하였다. 그런 다음, 제조한 벡터를 H293 세포에 형질도입(transduction)시켜 렌티 바이러스를 제조하고, 이를 이용하여 정상 기관지 상피세포주(non-tumorigenic bronchial epichelial cell line)인 BEAS-2B 세포주, 폐암 세포주인 NCI-H1299 세포주 또는 유방암 세포주인 MDA-MB231 세포주에 감염시켜 BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도하였다. BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도한 각각의 세포주를 액체 배지에 접종하고 총 60 시간 동안 배양하여, 접종 개시 시점을 기준으로 한 상대적인 세포수를 측정하여 세포 증식 정도를 확인하였다. 또한, 상기 BCAR4 엑손 4의 과발현을 유도한 각각의 세포주를 배지에 접종하고 약 2 주간 배양하여, 콜로니 형성 정도를 확인하였다(colony forming assay). 정상 대조군으로 사용하기 위해, BCAR4 엑손 4 염기서열을 포함하지 않는 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 (empty vector) 만을 형질전환시킨 BEAS-2B 세포주, NCI-H1299 세포주 및 MDA-MB231 세포주를 제조하여 동일 방법으로 세포 증식률을 확인하였다.
그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, BCAR4 엑손 4를 과발현하는 세포주에서 세포 성장률 및 콜로니 형성이 증가하는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 각 세포주 중에서, 폐암세포주 뿐만 아니라 유방암 세포주인 MDA-MB231 세포에서 BCAR4 엑손 4의 과발현으로 인한 세포 증식률 및 콜로니 생성능이 높은 수준으로 증가하는 것을 확인하였다.
폐암 세포 내 융합 유전자 발현 여부의 확인
<2-1> 폐암 조직 내에서 Cd63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부 확인
폐암 조직 내에서 BCAR4 엑손 4의 발현 수준이 정상 조직에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, 폐암조직의 전사체 염기서열 분석법 (RNA-sequencing) 을 실시하여 BCAR4의 엑손4를 포함하는 융합 유전자(fusion gene)의 발현을 확인하였다. 전사체 분석 결과로부터 CD63과 BCAR4 유전자의 융합유전자 임을 확인하였고 이를 분리, 동정하여 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드 내에 삽입함으로써 렌티바이러스벡터를 완성하였다구체적으로, 먼저 융합 유전자를 구성하는 각각의 유전자를 확인하고자, 폐암 환자로부터 수득한 폐암 조직으로부터 BCAR4 암호화 서열을 얻어, BCAR4 융합 유전자의 여부를 생거 서열분석 방법(Sanger sequecing method)으로 염기서열분석하여 확인하였다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 BCAR4 엑손 4 유전자(서열번호 3)의 앞에 CD63 유전자의 엑손 2 및 엑손 3 서열 일부(서열번호 4)가 융합되어 있는 것을 확인하였다(도 3a). 이에 따라, 폐암 조직 내에서 발현되는, CD63-BCAR4 융합 유전자(서열번호 1)의 염기 서열을 확보하였다(도 3a).
<2-2> Cd63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포주의 제조
이후 실시예를 수행하기 위해, Cd63-BCAR4 융합 유전자를 과발현하는 세포주를 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 확보한 CD63-BCAR4 융합 유전자(서열번호 1)의 염기 서열을 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드에 삽입하여 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 위한 벡터를 제작하였다. 제작한 벡터는 H293 세포에 형질도입시켜 렌티바이러스를 제조한 다음, 상기 렌티바이러스를 이용하여 정상 기관지 BEAS-2B 세포주에 감염시켜 CD63-BCAR4 융합 유전자의 과발현을 유도하였다. 음성 대조군(control)으로는 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드로부터 제조한 렌티바이러스를 감염시키지 않은 BEAS-2B 세포주를 대상으로 사용하였고, 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드(empty vector)를 사용한 BEAS-2B 세포주를 대상으로 사용하였다.
제조한 실험군 및 대조군 세포 내에서 융합 유전자가 유의적으로 발현되는지 확인하기 위해 유세포분석을 통해 세포 내 GFP의 형광 발색 정도를 확인하였다. 또한, 각 세포주를 파쇄하여 세포의 RNA를 수득해 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 전기영동하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 아울러, CD63-BCAR4 융합 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 여부는, 항-HA 항체를 1차 항체로 하여 웨스턴블럿을 수행해 단백질 발현 여부를 확인하였다.
그 결과 도 3b에서 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 GFP 형광을 나타내지 않는 반면, 미발현 대조군 및 실험군에서 pHRST-IRES-GFP 포함 렌티바이러스로부터 GFP가 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3b). 또한, CD63-BCAR4 융합 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질의 발현 여부를 확인하였을 때, 실험군 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자가 발현되어 이로부터 암호화 되는 단백질(CD63-BCAR4 융합 단백질)이 유의적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 3b).
CD63-BCAR4 융합 유전자 발현에 따른 세포 특징 변화 확인
폐암 조직에서 유의적인 발현수준을 나타내는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 정상 기관지 상피세포주에서 발현 유도하였을 때, 정상 세포주가 암세포에서 나타내는 특징을 함께 나타낼 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주를 0.3×104 세포 내지 2.0×104 세포의 농도로 96 웰 플레이트에 접종한 후, CO2 배양기에서 배양하여 증식 수준을 IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템(Essen Bioscience, Inc., USA)을 사용하여 관찰하였다.
또한, 세포 이주능(migration)을 확인하기 위해서는, 상기 배양한 세포가 웰에 포화 상태로 배양되면, 96-핀 운드 메이커(wound maker)를 사용해 플레이트 바닥을 긁어 세포에 상처(wound)를 유발하였다. 그런 다음, IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템을 이용하여 매 2 시간마다 세포의 이동 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포에서 미발현 대조군(vector)에 비해 유의적으로 증가된 수준의 세포증식률 및 세포 이주능을 나타내는 것을 확인하였다. CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포는 미발현 대조군에 비해 증식 속도가 유의적으로 증가하여, 콜로니 형성 분석(Colony forming assay)을 통해 확인하였을 때 보다 많은 수의 포커스(foci)를 형성하는 것으로 확인하였다(도 4a 및 도 4b). 이주능을 확인하였을 때, CD63-BCAR4 융합 유전자 과발현 세포가 미발현 세포에 비해 유발된 상처부분을 빠르게 채울 수 있어 , 이주능이 보다 높은 수준인 것으로 확인하였다(도 4c 및 도 4d).
CD63-BCAR4 융합 유전자 발현에 따른 종양 형성 확인
<4-1> CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 유도 마우스 모델에서 종양 형성 확인
CD63-BCAR4 융합 유전자를 발현하는 세포는 암세포와 같이 세포 증식속도 및 이주능이 증가하는 것을 확인하여 정상 세포주가 암세포화될 수 있음을 확인하였으므로, 암세포화 되는 세포로부터 종양이 형성되는지 여부를 보다 구체적으로 확인하고자 하였다.
구체적으로, 6 주령의 NOG 마우스를 구입하여 환경에 적응할 수 있도록 사육한 다음, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주를 5?106 세포의 농도(in PBS)로 상기 마우스의 피하에 주입하여, 종양이 이종이식된 마우스 모델을 제조하였다. 제조한 마우스 모델은 22주간 사육하여 종양 성장 정도를 확인하였다. 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 pHRST-IRES-GFP 렌티바이러스 플라스미드(empty vector)를 사용한 BEAS-2B 세포주를 이종이식한 마우스 모델을 사용하였다. 실험군 및 대조군 마우스를 22 주간 사육하는 동안 종양의 크기를 측정하고, 사육 기간 종료 후 마우스를 희생하여 형성된 종양 조직 및 간 조직을 수득하였다. 수득한 종양 조직 및 간 조직은 형광 현미경으로 관찰하여 CD63-BCAR4 융합 단백질과 함께 발현되는 GFP 발현 여부를 확인하였다. 그런 다음, 조직 내에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준이 유의적으로 나타나는지 확인하기 위해 상기 종양 조직 및 간 조직을 각각 용해(lysis)하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA로부터 cDNA를 합성하여 이를 주형으로 하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR 증폭을 수행한 후 전기영동하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과 도 5a 내지 도 5c에서 나타난 바와 같이, CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 정상 기관지상피세포주를 이종이식한 마우스 모델에서 이종지식 8주 이후부터 접종한 피하에 종양 조직이 성장하는 것을 확인하였다(도 5a). 종양 형성이 유도된 마우스를 희생하여 종양 조직 및 간 조직을 확인하였을 때, CD63-BCAR4 미발현 대조군 마우스 모델과 비교하여 접종부위 뿐만 아니라 간에서도 여러 개의 종양이 형성되었음을 확인하였다 (도 5b). 종양 조직과 간 조직 모두에서 GFP의 발현이 나타나는 것을 확인하여, 종양 조직 및 간 조직 모두에서 CD63-BCAR4 융합 단백질의 발현이 나타난 것으로 예상할 수 있었다(도 5b). 이와 함께, 조직을 파쇄한 파쇄물로부터 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현을 확인하였을 때, 미발현 대조군에서는 융합 유전자가 발현되지 않는 반면, 실험군 마우스 모델에서는 융합 유전자가 발현되는 것을 확인하였다(도 5c).
<4-2> 마우스 모델에서 증식된 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포의 이주능 확인
CD63-BCAR4 융합 유전자를 발현하는 세포를 생체 내(in vivo)에 주입하였을 때 세포가 증식하여 종양을 형성하는 것을 확인하였으며, 세포 주입 부위 외에도 주변 간 조직에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 및 종양의 형성을 확인하였으므로, 마우스 모델에서 증식된 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포가 주변 조직으로의 전이능을 나타내는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에서 마우스 모델로부터 수득한 종양 조직 및 간 조직을 각각 gentleMACS™ 해리체(gentleMACS™ dissociator)를 사용하여 1차적으로 물리적 파쇄한 다음, 시판되는 키트를 사용하여 물리적 파쇄된 조직에서 세포외 기질을 분해하여 단일 세포 단위로 해리된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 96 웰 플레이트에 접종한 후, CO2 배양기에서 배양하여 포화 상태로 배양한 다음, 96-핀 운드 메이커(wound maker)를 사용해 플레이트 바닥을 긁어 세포에 상처(wound)를 유발하였다. 상처가 유발된 세포는 총 34시간 동안 배양하여 IncuCyte™ Live-세포 이미징 시스템(Essen Bioscience, Inc., USA)을 사용하여 매 2 시간 마다 세포의 이동 정도를 관찰하여, 세포 이동 정도를 확인하였다. 대조군으로서, CD63-BCAR4 미발현 대조군 마우스의 종양 조직으로부터 수득한 세포를 미발현 대조군(empty)으로 사용하였으며, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포를 양성 대조군(CD63-BCAR4)으로 사용하였다.
그 결과, 도 5d 에서 나타난 바와 같이 미발현 대조군에서는 세포 이주능이 낮아 상처가 난 위치로 세포의 이동이 빠르게 나타나지 않는 반면, CD63-BCAR4 발현 실험군의 경우 세포 이주능이 유의적인 수준으로 나타나, 종양 전이 능력이 높은 수준인 것을 확인하였다(도 5d). 특히, 간 조직 유래의 세포는 양성 대조군보다 다소 높은 수준으로 세포 이주능을 나타내어, 상처가 유발된 위치로의 세포 이주능이 가장 빠르게 나타난 것으로 확인하여, CD63-BCAR4 발현 세포의 전이능이 뛰어남을 확인하였다.
CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제에 따른 암세포 증식 억제 및 이주능 감소 효과의 확인
비종양 세포인 BEAS-2B 세포에서 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현을 유도하였을 때, 상기 융합 유전자에 의해 비종양성 세포가 암세포화 되는 것을 확인하였으므로, 이를 다시 발현 억제하는 경우에 암세포화된 특성이 유지되는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 BEAS-2B 세포주에, CD63-BCAR4 융합 유전자에 특이적인 siRNA(서열번호 7 및 서열번호 8)를 형질주입하여 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제를 유도하였다. 그런 다음, 발현 억제를 유도한 세포를 파쇄하여 RNA를 수득하고, CD63-BCAR4 염기서열을 표적하는 프라이머 세트를 사용해 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하여 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 그런 다음, 상기 발현 억제를 유도한 세포에 대하여 웰 이동유도 분석(trans well assay)을 수행하여 세포 이주능을 확인하였다. 대조군으로서, 미발현 대조군(vector)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자를 삽입하지 않은 플라스미드를 사용한 세포주를 사용하였고, 양성 대조군(CD63-BCAR4)으로는 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 세포주를 사용하였다. 또한, 융합 유전자 특이적인 siRNA를 형질주입한 실험군(CD63-BCAR4+si-CD63-BCAR4)와 비교하여, 음성 대조군(CD63-BCAR4+si-control)으로서 무작위한 서열(random sequence)을 사용하여 제작한 siRNA를 형질주입한 세포주를 사용하였다.
그 결과, 도 6a 내지 도 6b, 6c에서 나타난 바와 같이 CD63-BCAR4 융합 유전자 발현 억제를 유도한 실험군 세포에서 특이적 siRNA에 의해 CD63-BCAR4 융합 유전자의 발현이 다시 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6a). CD63-BCAR4 융합유전자의 발현이 억제된 실험군 세포의 세포 증식률 및 이주능을 확인하였을 때, 실험군 세포의 세포 증식률이 현저하게 감소하여 미발현 대조군 수준으로 낮은 세포 증식률을 나타내는 것을 확인하였으며, 세포 이주능 또한 미발현 대조군보다 더 낮은 수준으로 감소하여, 암세포화된 특성을 모두 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 6b 및 도 6c).
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Composition for diagnosing tumor using BCAR4 exon 4 or its fusion gene thereof <130> 1062881 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacgcaaaa aatcaccatg taccaaccta tccaaactta tccatggatg 300 aatctatcca gaagacggga gttccgatgc ttgtcttgct ctgaatgtct gcttgtcacc 360 tgcttagggt tatcgactgt gattctggga ctcattgttg ttctacagga cccctctgac 420 tctgtggttt tctctactgg attaacaatg atagccatag gtgctttttt tgttgtcctc 480 actggagtga cagccctgtg tacggttaca gtcgacgaga acttgcagaa aaccacgagg 540 ctaagactag gagtgatacg aaaaagcgga agtctccaag gaactacaga gccttccatg 600 actcactcaa taatcgctag cacctcgctg tag 633 <210> 2 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly 20 25 30 Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr 35 40 45 Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu 50 55 60 Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr 65 70 75 80 Cys Leu Met Ile Thr Gln Lys Ile Thr Met Tyr Gln Pro Ile Gln Thr 85 90 95 Tyr Pro Trp Met Asn Leu Ser Arg Arg Arg Glu Phe Arg Cys Leu Ser 100 105 110 Cys Ser Glu Cys Leu Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Thr Val Ile 115 120 125 Leu Gly Leu Ile Val Val Leu Gln Asp Pro Ser Asp Ser Val Val Phe 130 135 140 Ser Thr Gly Leu Thr Met Ile Ala Ile Gly Ala Phe Phe Val Val Leu 145 150 155 160 Thr Gly Val Thr Ala Leu Cys Thr Val Thr Val Asp Glu Asn Leu Gln 165 170 175 Lys Thr Thr Arg Leu Arg Leu Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Ser Leu 180 185 190 Gln Gly Thr Thr Glu Pro Ser Met Thr His Ser Ile Ile Ala Ser Thr 195 200 205 Ser Leu 210 <210> 3 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 caaaaaatca ccatgtacca acctatccaa acttatccat ggatgaatct atccagaaga 60 cgggagttcc gatgcttgtc ttgctctgaa tgtctgcttg tcacctgctt agggttatcg 120 actgtgattc tgggactcat tgttgttcta caggacccct ctgactctgt ggttttctct 180 actggattaa caatgatagc cataggtgct ttttttgttg tcctcactgg agtgacagcc 240 ctgtgtacgg ttacagtcga cgagaacttg cagaaaacca cgaggctaag actaggagtg 300 atacgaaaaa gcggaagtct ccaaggaact acagagcctt ccatgactca ctcaataatc 360 gctagcacct cgctgtag 378 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggcggtgg aaggaggaat gaaatgtgtg aagttcttgc tctacgtcct cctgctggcc 60 ttttgcgcct gtgcagtggg actgattgcc gtgggtgtcg gggcacagct tgtcctgagt 120 cagaccataa tccagggggc tacccctggc tctctgttgc cagtggtcat catcgcagtg 180 ggtgtcttcc tcttcctggt ggcttttgtg ggctgctgcg gggcctgcaa ggagaactat 240 tgtcttatga tcacg 255 <210> 5 <211> 1314 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agttagtgct gggaaacagt gctaagaagg atacagtggc tagaagtcgt cctgtcgtcc 60 tgcctcacag taacatcgtt accgaattct cagcaggtga accaaatgaa atggtcaact 120 gaaagccaac cagggtaaaa cagatctttt atttcttgtt gttgttatta ttattttttt 180 ttatgtgggg acattcaagt gaactgctat atgcatttgc ccccagtctc tccttgtgag 240 aagtgaattt cttcaacgtt tatagaactg aggtattaca ttattggatg aattaagaaa 300 acaatctaac ctgatgtgtg aaaatttctg cttgtgagaa tccgtgttat ttcaattatc 360 caatcaagag cctaattcgt ataaaagaaa cacagcagct tgttgctcat ctttttatct 420 aaggacggtt tgtcttgaca gagggtgtct ggctgttttg gggaaactat tcctgacctt 480 attttgacta aaaagttgcc tgctgtacca gggcctgtga tgtgttgata aaatgccaca 540 caaccatttc tcagtgaaaa gcccaaccgg gacttgagtt atgttggtgg ctatggagtt 600 ctgcaatcca caattgatgt tctctaataa ccagtgacct tgagtgaact gtccccaagg 660 caagagcaac cacagctgcg gggagcgttt ggcaatcact atccccaccc aagcttctcc 720 cttgggtctt gtcctgtcac tctggctgga atacaatggc gtaatcatag ctcactgcgg 780 cctccatctc ctgggttcaa gtgattctcc tgcttcagct tcccaagtat ctgggactac 840 aggcatcaaa aaatcaccat gtaccaacct atccaaactt atccatggat gaatctatcc 900 agaagacggg agttccgatg cttgtcttgc tctgaatgtc tgcttgtcac ctgcttaggg 960 ttatcgactg tgattctggg actcattgtt gttctacagg acccctctga ctctgtggtt 1020 ttctctactg gattaacaat gatagccata ggtgcttttt ttgttgtcct cactggagtg 1080 acagccctgt gtacggttac agtcgacgag aacttgcaga aaaccacgag gctaagacta 1140 ggagtgatac gaaaaagcgg aagtctccaa ggaactacag agccttccat gactcactca 1200 ataatcgcta gcacctcgct gtagttgtac attgaaccct ggcatcttcg tctttggaac 1260 taagtctcct gagcattgtt tttaaataga aataaaatct ggcttttaaa aaaa 1314 <210> 6 <211> 1238 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agactaggat ccctggaaaa tggagaagct gtgctaatag aggggggcca gaaatcccca 60 ctctagaatg ctgtagaatg ttgggagaca cccaggatgt gagccaggga ctttctggaa 120 gtgtttgttc tggccccacc cgaccccagg cagtccccag ctgtctgcac agtcggatgg 180 ggagggggct tgcacagagt tggagccaga ggagagagct ggctcatccc ctacggtagg 240 atggggaaac ctcacagacc acattgtcac ccggcctcag ctctccgccc cggcgctcag 300 agggtaactc tcacccacct cgtccgcttc tctgaaccag agtgacccag gctgcgctcc 360 gccccgctct cctaccccga gttggcacgg aggcccggca gccatggcgg tggaaggagg 420 aatgaaatgt gtgaagttct tgctctacgt cctcctgctg gccttttgcg cctgtgcagt 480 gggactgatt gccgtgggtg tcggggcaca gcttgtcctg agtcagacca taatccaggg 540 ggctacccct ggctctctgt tgccagtggt catcatcgca gtgggtgtct tcctcttcct 600 ggtggctttt gtgggctgct gcggggcctg caaggagaac tattgtctta tgatcacgtt 660 tgccatcttt ctgtctctta tcatgttggt ggaggtggcc gcagccattg ctggctatgt 720 gtttagagat aaggtgatgt cagagtttaa taacaacttc cggcagcaga tggagaatta 780 cccgaaaaac aaccacactg cttcgatcct ggacaggatg caggcagatt ttaagtgctg 840 tggggctgct aactacacag attgggagaa aatcccttcc atgtcgaaga accgagtccc 900 cgactcctgc tgcattaatg ttactgtggg ctgtgggatt aatttcaacg agaaggcgat 960 ccataaggag ggctgtgtgg agaagattgg gggctggctg aggaaaaatg tgctggtggt 1020 agctgcagca gcccttggaa ttgcttttgt cgaggttttg ggaattgtct ttgcctgctg 1080 cctcgtgaag agtatcagaa gtggctacga ggtgatgtag gggtctggtc tcctcagcct 1140 cctcatctgg gggagtggaa tagtatcctc caggtttttc aattaaacgg attatttttt 1200 cagaccgaaa agagatggtc tgagtttgtc ttagagtg 1238 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Forward <400> 7 ucuuaugauc acgcaaaaaa ucacc 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 siRNA Sequence_Reverse <400> 8 ggugauuuuu ugcgugauca uaaga 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAR (Exon4) Primer Sequence_Forward <400> 9 tcaccatgta ccaacctatc ca 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCAR (Exon4) Primer Sequence_Reverse <400> 10 gcgaggtgct agcgattatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 Junction(for conforming fusion gene) promer_forward <400> 11 accataatcc agggggctac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD63-BCAR4 Junction(for conforming fusion gene) promer_reverse <400> 12 tcagagcaag acaagcatcg 20

Claims (13)

  1. BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 BACR4 엑손 4는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 유전자는 BACR4 엑손 4의 5' 말단 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태로 융합된 유전자인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 CD63-BCAR4 융합 유전자인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단용 조성물.
  7. i) 폐암 의심 환자로부터 분리된 시료로부터, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA, 또는 이로 암호화되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    ii) 상기 단계 i)에서 측정한 결과를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
  8. BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 BACR4 엑손 4는, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 융합 유전자는, BACR4 엑손 4의 5' 말단 앞 부분에 파트너 유전자의 서열이 연결된 형태로 융합된 유전자인 것을 특징으로 하는, 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 융합 유전자는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 CD36-BCAR4 융합 유전자인것을 특징으로 하는, 폐암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 mRNA 발현을 억제하는 제제는, BACR4 엑손 4 및 이를 포함하는 융합 유전자 중 어느 하나의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 7의 염기서열 또는 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 폐암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
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