KR20210057088A - 림프계 장애의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

림프계 장애의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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동 리
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Abstract

림프 이상증의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법이 개시된다.

Description

림프계 장애의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2018년 9월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/728,444에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문은 전부 제시된 바와 같이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 출원은 유전학, 개인 맞춤형 의료 및 림프계 기형의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 새로운 유전적 표적을 제공하고 림프관종증(Lymphangiomatosis) 및 다른 전신 림프 이상증 (generalized lymphatic anomaly: GLA)와 관련된 증상의 개선을 위해 새로운 유전적 표적 및 치료적 처리 양생법을 제공한다.
본 발명이 속한 분야의 상태를 설명하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 여러 간행물 및 특허 문서가 인용된다. 이들 인용구 각각은 전부 제시된 바와 같이 본원에 참조로 포함된다.
림프계는 체액 순환을 유지하고 질환에 대해 몸을 보호하고 소장에서 식이 지방을 흡수하는데 중추적인 역할을 한다 (1). 복합 림프 이상증은 림프관 및 림프 조직 과증식의 비정상적인 형성을 특징으로 한다. 환자는 종종 중증 폐 질환으로 이어질 수 있는 중복 증상을 나타낸다 (2, 3). 림프 이상증의 예는 전신 림프 이상증 (GLA), 림프관 확장증(lymphangiectasia), 및 유미 삼출증(chylous effusion) (심막, 늑막 또는 복막)을 포함한다. 복합 림프 이상증에 대한 연구는 진단의 상당한 어려움으로 인한 분류 및 명명법의 불일치에 의해 방해되었다 (3-6). 복합 림프 이상증의 분자 유전학적 병인이 잘 이해된 것은 아니지만, 림프계의 선천성 기형은 근본적인 유전적 병인과 관련이 있는 것으로 보인다 (7-9). 실제로, 생식계열 및 체세포 체세포 돌연변이는 둘 다 PI3K/mTOR 및 Ras/MAPK 경로에 모여드는 유전자에서 확인되었다 (1, 8).
PI3K/mTOR 및 Ras/MAPK 신호전달 경로의 붕괴 또는 변형은 성숙한 림프망(림프 network)의 구성 중에 정상적인 확장 및 리모델링을 손상시키는 것으로 나타났으며, 이러한 붕괴는 림프성 질환과 관련이 있다. 라파마이신 복합체 1 (mTORC1) 활성의 포유류 표적의 증가를 초래하는, AKT1 및 PIK3CA에서 기능 획득 돌연변이는 프로테우스 증후군(Proteus syndrome) (OMIM 176920), CLOVES 증후군 (OMIM 612918) 및 클리펠-트레노우네이-베버 증후군(Klippel-Trenaunay-Weber syndrome) (OMIM 149000)과 같은 증후군의 일부를 포함하는 림프관 기형에 걸린 환자에서 확인되었다 (9-11). RAS 경로 활성의 조절 장애를 초래하는, KRAS, HRAS, RAF1, PTPN11, SOS1 및 RASA1에서의 돌연변이는 누난 증후군(Noonan syndrome) (OMIM 163950), 코스텔로 증후군(Costello syndrome) (OMIM 218040), 심장-얼굴-피부 증후군(cardiofaciocutaneous syndrome) (OMIM 115150) 및 모세혈관 기형-동정맥 기형 (CM-AVM) 증후군(capillary malformation-arteriovenous malformation syndrome) (OMIM 608354)에서 림프 부종(lymphedema) 또는 림프관 확장증을 유발한다 (12-17).
이러한 이해에도, 림프성 장애 및 림프 이상증, 예컨대 림프관종증/ 림프관 확장증 (LAM), 전신 림프 이상증 (GLA), 및 유미 삼출증에 걸린 환자를 확인하는데 사용하기 위한 유전적 바이오마커가 결여되며, 이들 장애와 관련된 유전적 마커를 표적으로 하는 치료제와 같다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 인간 환자에서 림프 이상증을 진단하기 위한 방법이 제공된다. 예시의 방법은 환자의 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계, 핵산을 분석하여 i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, CBL 및 ARAF 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지 또는 ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, CBL 및 ARAF 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형(linkage disequilibrium)인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및 i) 또는 ii)의 SNV가 존재하는 경우 환자를 림프 이상증으로 진단하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 인간 환자에서 림프 이상증을 진단하기 위한 방법은 인간 환자로부터 유전자형 서열 정보를 얻는 단계, 서열 정보로부터 i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, CBL 및 ARAF 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지 또는 ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, CBL, 및 ARAF 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및 i) 또는 ii)의 SNV가 존재하는 경우 환자를 림프 이상증으로 진단하는 단계를 수반한다.
본 발명은 또한 인간 환자에서 림프 이상증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예시의 방법은 환자의 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계; 핵산을 분석하여 i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SANV)가 존재하는지 또는 ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및 i) 또는 ii)의 하나 이상의 SNV를 가진 것으로 확인된 환자에게 상기 림프 이상증의 치료에 적합한 하나 이상의 작용제를 투여하여, 림프 이상증을 치료하는 단계를 포함한다. 이 방법의 대안의 구체예에서, 유전자형 정보는 환자로부터 얻어지고 i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지 또는 ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지가 결정하기 위해 분석되고; i) 또는 ii)의 하나 이상의 SNV를 가진 것으로 확인된 환자에게 상기 림프 이상증의 치료에 적합한 하나 이상의 작용제가 투여되어, 림프 이상증을 치료한다. 이 방법의 대안의 구체예에서, 유전자형 정보는 환자로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 림프 이상증은 림프관 및/또는 림프 조직 과증식의 비정상적인 형성을 특징으로 한다. 다른 구체예에서, 림프 이상증은 림프관종증 (LAM)이다. 또 다른 구체예에서, 림프 이상증은 전신 림프 이상증 (GLA)이다. 림프 이상증은 심막, 늑막, 또는 복막 삼출을 포함한 유미 삼출증에 의해 특성화될 수 있다.
진단 방법은 생물학적 샘플에서 검출 이후 SNV를 확인하는 보고서를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 기재된 치료 방법은 방법에서 확인된 SNV에 기초하여 림프 이상증에 대해 제안된 치료(들)를 확인하는 보고서를 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, SNV 양성 대상체에게 투여된 작용제는 1) MEK/ERK 억제자; 2) 표 1 및 2에 나열된 작용제/억제자; 3) 표 1 및 2에 나열된 MEK/ERK 억제자 및 하나 이상의 작용제/억제자의 조합; 및/또는 4) 1) mTOR 억제자 및/또는 PIK3K 억제자; 및 2) 하나 이상의 MEK/ERK 억제자의 조합이다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 진단 방법은 진단된 환자에게 상기 림프 이상증을 치료하는데 적합한 하나 이상의 작용제의 유효량을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.
치료 방법의 특정 구체예에서, 예컨대 하나 이상의 림프 이상증 관련된 SNV를 가지고 있는 환자에게 투여되는 작용제는 하나 이상의 MEK/ERK 억제자, 및 상기 억제자 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 MEK/ERK 억제자이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 표 1 및 2에 나열된 하나 이상의 작용제이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 MEK/ERK 억제자 및 표 1 및 2에 나열된 하나 이상의 작용제이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 1) mTOR 억제자 및/또는 PIK3K 억제자; 및 2) 하나 이상의 MEK/ERK 억제자의 조합이다. 일부 구체예에서, 작용제가 mTor 억제자일 때, 라파마이신 및/또는 BEZ-235 (닥톨리십)이 투여된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 mTOR 억제자, 하나 이상의 PIK3K 억제자, 및/또는 하나 이상의 MEK/ERK 억제자는 100μM 미만, 10μM 미만, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 또는 1nM 미만의 IC50을 갖는다.
일부 구체예에서, 환자는 PTPN11에서 SNV를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 환자는 BRAF에서 SNV를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 환자는 KRAS에서 SNV를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 환자는 SOS1에서 SNV를 갖지 않는다. 일부 구체예에서, 환자는 ITGA9에서 SNV를 갖지 않는다.
일부 구체예에서, 표 1 및 2에 나열된 작용제는 조합으로 사용된다. 이들 조합은, 제한되는 것이 아니라, a) 리다포롤리무스 및 트라메티닙; b) 리다포롤리무스 및 셀루메티닙 또는 코비메티닙; c) BEZ235 및 셀루메티닙; d) 오미팔리십 및 셀루메티닙 또는 트라메티닙; e) 에버롤리무스 및 트라메티닙 또는 셀루메티닙; f) 시롤리무스, 리다포롤리무스 및 셀루메티닙; g) 시롤리무스, 리다포롤리무스 및 트라메티닙; h) 토르키닙 및 트라메티닙; i) BEZ235, 토르키닙 및 트라메티닙; 및 j) 시롤리무스 및 게다톨리십 및 트라메티닙을 포함한다. 다른 구체예에서, 치료는 전신성 화학 요법, 인터페론 알파, 방사선 요법, 및/또는 수술을 투여하는 것을 더 포함한다.
일부 구체예에서, SNV는 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이로부터 선택된 SNV로부터 선택되며, 여기서 "c."는 암호화 DNA서열을 지정하고, "p."는 단백질 서열을 지정한다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 상기 기재된 SNV 중 하나 이상의 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 진단 방법은 대상체에게 림프 이상증을 치료하는 것으로 알려져 있는 하나 이상의 작용제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 작용제는 MEK/ERK 억제자이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 표 1 및 2에 나열된 하나 이상의 작용제이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 MEK/ERK 억제자 및 표 1 및 2에 나열된 하나 이상의 작용제이다. 일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 1) mTOR 억제자 및/또는 PIK3K 억제자; 및 2) 하나 이상의 MEK/ERK 억제자의 조합이다. 작용제(들)의 투여는 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감(tapering)을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 PTPN11 유전자에서 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R 중 하나 이상을 검출하는 단계 및 적어도 하나 이상의 MEK/ERK 억제자를 단독으로 또는 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 작용제는 표 1-2로부터 선택되어, 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 BRAF 유전자에서 c.1403T>C:pF468S의 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 진단 방법은 상기 환자를 하나 이상의 MEK/ERK 억제자로 단독으로 또는 조합하여 처리하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 작용제는 표 1-2로부터 선택되어, 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 KRAS에서 c.35G>A:pG12D를 검출하는 단계 및 하나 이상의 mTor 억제자, 및 하나 이상의 MEK/ERK 억제자를 단독으로 또는 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 작용제는 투여를 위해 표 1-2로부터 선택되어, 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 SOS1 에서 c.2536G>A:pE846K의 검출을 포함한다. 일부 구체예에서, 진단 방법은 상기 환자를 하나 이상의 MEK/ERK 억제자로 단독으로 또는 조합하여 처리하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 표 1-2의 작용제가 선택되어, 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 진단 방법은 ITGA9 유전자에서 c.1236+4A>G 및/또는 c.289T>G:p.C97G를 검출하는 단계 및 하나 이상의 MEK/ERK 억제자를 단독으로 또는 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 표 1-2의 적어도 하나의 작용제가 투여되어, 림프 구조 중 하나 이상을 개선하고, 유미 늑막 삼출을 감소시키고, 호흡 기능을 개선하고, 부수적인 약제 사용의 점감을 허용하고, 및/또는 생존을 증가시킨다.
치료에 적합한 ERK/MEK 억제자는, 제한되는 것이 아니라, 셀루메티닙 (AZD6244), PD0325901, 트라메티닙 (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), 피마세르팁 (AS-703026), TAK-733, AZD8330, 비니메티닙 (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, 레파메티닙 (RDEA119, Bay 86-9766), 및 코비메티닙 (GDC-0973, RG7420)을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산을 분석하여 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지를 결정하는 단계는 폴리뉴클레오타이드 샘플을 분석하여 특이적 혼성체화의 검출, 대립유전자 크기의 측정, 제한 단편 길이 다형성 분석, 대립유전자-특이적 혼성체화 분석, 단일 염기 프라이머 신장 반응, 및 증폭된 폴리뉴클레오타이드의 스퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택된 과정을 수행함으로써 상기 SNV의 존재를 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 DNA를 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 RNA를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 SNV(들)를 포함하는 핵산은 인간 환자의 단리된 세포로부터 얻어진다.
일부 구체예에서, 단리된 벡터는 SNV를 가진 핵산을 암호화하며, SNV는 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 숙주 세포는 SNV를 가진 핵산을 암호화하는 단리된 벡터를 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉(transgenic) 동물은 숙주 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 마우스 또는 제브라피쉬(zebrafish)이다.
일부 구체예에서, 작용제의 효과에 대해 스크리닝하는 방법은 숙주 세포 또는 트랜스제닉 동물을 본원에 기재된 하나 이상의 억제자와 단독으로 또는 조합하여 접촉시키는 단계를 포함하거나, 또는 표 1-2의 작용제가 포함된다. 일부 구체예에서, 스크리닝되는 작용제의 효과는 제브라피쉬에서 꼬리 구제(caudal rescue) 또는 분지 구제(branching rescue)이다.
일부 구체예에서, 세포 신호전달을 변화시키는 작용제를 확인하기 위한 방법은 상기 기재된 바와 같이 적어도 하나의 SNV를 포함하는 적어도 하나의 핵산을 발현하는 세포를 제공하는 단계, SNV가 없는 동족 야생형 서열을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 두 세포 집단을 테스트 작용제와 접촉시키는 단계; 및 상기 작용제가 상기 SNV가 없는 세포와 비교하여 핵산을 함유하는 SNV를 가지고 있는 세포의 세포 신호전달을 변화시키는지를 분석하는 단계를 포함한다.
도 1. Ea.hy926 세포주에서 BRAF 및 PTPN11 돌연변이의 과발현은 ERK 신호전달을 활성화시킨다.
도 2. Ea.hy926 세포주에서 BRAF F486S의 과발현은 세포 형태 및 액틴 조직을 변화시킨다.
도 3. MEK 억제자 트라메티닙으로의 처리는 BRAF WT 및 F486S 돌연변이를 과발현하는 세포에서 VE-카데린 표면 염색 및 섬유상 액틴을 증가시킨다.
도 4A - 4B. MEK 억제자는 BRAF WT 및 F486S 돌연변이 과발현 세포에서 ERK 활성화/인산화를 감소시킨다. 도 4b - MEK 억제자는 BRAF WT 및 F486S 돌연변이 과발현 세포에서 ERK 활성화/인산화를 감소시킨다.
도 5A - 5B. MEK 억제자는 PTPN11 돌연변이 과발현 세포에서 ERK 활성화/인산화를 감소시킨다 (도 5A). MEK 억제자는 PTPN11 돌연변이 과발현 세포에서 ERK 활성화/인산화를 감소시킨다 (도 5B).
도 6. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 PD0325901의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 PD0325901에 의해 구제되었으며, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 7. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 CI1040의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 CI1040에 의해 구제되었으며, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 8. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 피마세르팁의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 피마세르팁에 의해 구제되었으며, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 9. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 TAK-733의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 TAK-733에 의해 구제되었으며, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 10. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 AZD8330의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 에 의해 구제되었으며, AZD8330, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 11. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 레파메티닙의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 레파메티닙에 의해 구제되었으며, 세포막에서 pERK 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
도 12. ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 울릭서티닙의 효과. ARAF-S214P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 울릭서티닙에 의해 구제되었으며, 세포막에서 ERK 기질 RSK3의 인산화 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이고; 흰색은 핵에 대한 DAPI 염색이다.
도 13. BRAF 돌연변이 F486S를 발현하는 HDLEC에 대한 울릭서티닙의 효과. BRAF-F486S에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 울릭서티닙에 의해 구제되었으며, 세포막에서 VE-카데린 축적의 증가게 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 BRAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이고; 흰색은 핵에 대한 DAPI 염색이다.
도 14. BRAF 돌연변이 F486S를 발현하는 HDLEC에 대한 트라메티닙의 효과. BRAF-F486S에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 트라메티닙에 의해 구제되었으며, 세포막에서 ERK의 인산화 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 BRAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이고; 흰색은 핵에 대한 DAPI 염색이다.
도 15. RAF1 돌연변이 T145P를 발현하는 HDLEC에 대한 트라메티닙의 효과. RAF1-T145P에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 트라메티닙에 의해 구제되며, 세포막에서 ERK의 인산화 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다.
도 16. KRAS 돌연변이 G12D를 발현하는 HDLEC에 대한 울릭서티닙 및 트라메티닙의 효과. KRAS-G12D에 의해 유도된 세포 형태학적 차이는 트라메티닙 및 울릭서티닙에 의해 구제되며, 세포막에서 ERK의 인산화 수준의 감소 및 VE-카데린 축적의 증가에 의해 예시된 바와 같다.
도 17. RIT1 돌연변이에 의해 유도된 p-ERK의 약한 활성화.
도 18. 3차원 림프 회전타원체 발아 검정은 바닥 상의 발아 길이로 측정된 바와 같이 EPHB4-WT와 비교하여 3개의 상이한 EPHB4 돌연변이를 발현하는 HDLEC에서 증가된 발아 활성을 나타낸다. 라파마이신 및 OSI-027는 둘 다 돌연변이 L778_G779insLMGS에 의해 유도된 발아의 증가를 구제할 수 있다.
도 19. MEK 억제자 및 BEZ235로의 처리는 KRAS 돌연변이 G12D에 의해 유도된 부종을 크게 개선하였다.
도 20. PTPN11 S502A 또는 G503R 돌연변이의 모자이크(mosaic) 발현은 가벼운 림프 이상증 표현형을 발생시켰다.
도 21. 잔기 749 주위의 rasa1a 및 rasa1b 상의 CRISPR 넉아웃(knockout) 표적은 제브라피쉬에서 큰 부종의 형성을 유발하며, 단일 표적화 (rasa1a 또는 rasa1b) 또는 ATG 표적화는 어떠한 표현형도 발생시키지 않았다.
도 22A - 22G. 림프 이상증에 대한 선도 프로밴드(proband)의 임상 이미지 및 분자적 분석. 도 22A) T2-강조 비-대비 림프관 조영도(T2-weighted non-contrast lymphangiogram)의 관상 슬라이스로서, 큰 심막 삼출을 입증한다 (화살표). 도 22B) 건강한 대조군 개인에서의 동적 대비 증강 자기 공명 림프관 조영도(dynamic contrast-enhanced magnetic resonance lymphangiogram)의 최대 강도 투사로서, 왼쪽 무명 정맥으로 향하는 정상적인 TD를 나타낸다. 도 22C) P1에서 동적 대비 증강 자기 공명 림프관 조영도의 최대 강도 투사로서, 역방향 간 폐문 흐름(retrograde liver hilar flow)을 갖는 팽창된 요추 림프망 (화살표 머리) 및 왼쪽에서 무명 정맥을 향하고 종격(mediastinum) 및 심막(pericardium)에 역방향 흐름을 공급하는 팽창되고 구불구불한 TD (화살표)를 나타낸다 (상자). 도 22D) c의 상자 영역의 대비 림프관 조영도로서, 원위 TD에서 기원하는 팽창된 림프망을 통해 종격, 심막 및 폐를 향한 역방향 흐름을 갖는 팽창되고 구불구불한 원위 TD를 입증한다 (화살표). 도 22E) 골반 및 생식기의 관상 최대 강도 투사로서, 양쪽 사타구니 림프절에서 기원하고 음경 및 음낭으로의 역방향 흐름을 공급하는 (화살표) 다수의 팽창된 도관 (화살표 머리)을 입증한다. 도 22F) 무관한 가계도에서 확인된 ARAF에서 재발성 돌연변이의 가계 및 유전자형, c.640T>C (p.S214P). 도 22G) ARAF 단백질의 개략적 위상 배치로서, 별표는 CR2 내의 p.S214P 돌연변이의 위치를 나타낸다. Ser 214 잔기는 척추동물 종 및 모든 RAF 아이소폼(isoform)에 걸쳐 고도로 보존된다.
도 23A - 23J. ARAF-S214P 돌연변이는 ERK1/2 활성을 증가시키고, 림프관 신생 능력을 향상시키고 HDLEC에서 액틴 골격 및 VE-카데린 접합을 변화시켜, 제브라피쉬에서 흉관 (TD)을 팽창시키며, 이것은 코비메티닙에 의해 반전된다. 도 23A) HEK293T 세포에서 ARAF 돌연변이 트랜스펙션은 14-3-3 단백질과의 회합을 손상시키고 p-ERK를 증가시킨다. 표준화된 14-3-3/FLAG 비율은 오른쪽의 패널에 의해 예시되며, 돌연변이에서 감소된 14-3-3 단백질의 동시-면역침강을 나타낸다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± s.e.m으로 나타난다. 이원 독립 t-테스트(Two-tailed unpaired t-test) (자유도 (df)는 4임), ****P = 8.6 x 10-6. 더 양호한 표현을 위해 이미지를 잘라냈다. 도 23B), HEK293T 세포에서 ARAF 돌연변이 트랜스펙션은 WT를 발현하는 세포와 비교하여 p-ERK1/2 발현의 증가를 유도한다 (**P = 0.0026; 이원 독립 t-테스트; df = 8). AKT, p70S6K, mTOR 및 p38의 인산화는 ARAF-S214P에 의해 변화되지 않았다. 표준화된 비율은 오른쪽의 상자 및 수염 플롯(box and whisker plot)에 의해 예시되며, 중앙의 선은 중간을 나타내고, 상자 한계는 사분위수 범위(interquartile range)를 나타내며 수염(whisker)은 최소 내지 최대 데이터 범위를 나타낸다. 6회의 독립적인 실험이 수행되었다. 더 양호한 표현을 위해 이미지를 잘라냈다. 도 23C) ARAF-WT 또는 ARAF-S214P로 형질도입된 1차 HDLEC는 증가하는 농도의 트라메티닙에서 배양되었다. 3회의 독립적인 형질도입의 세포를 이용한 결과가 정량화되고 개개의 값은 산란 점 플롯(scatter dot plot)에서 중첩된 점으로서 그래프로 나타났다. 데이터는 3회의 독립적인 실험평균 ± s.e.m. (오차 막대)으로 나타났다. ARAF-S214P의 형질도입은 p-ERK의 수준을 크게 증가시켰다 (*P = 0.03; df가 4인 이원 독립 t-테스트). 트라메티닙 처리는 p-ERK의 큰 감소로 이어졌다 (100 nM 트라메티닙 처리 및 300 nM 트라메티닙 처리에 대해 *P = 0.02; 1,000 nM 트라메티닙 처리 및 3,000 nM 트라메티닙 처리에 대해 *P = 0.01; df가 4인 이원 독립 t-테스트); NS, 유의하지 않음. 더 양호한 표현을 위해 이미지를 잘라냈다. 도 23D) 3차원 림프 회전타원체 발아 검정은 발아 횟수 (***P = 0.0002) 및 바닥에서의 발아 길이 (***P = 0.0005) 둘 다로 측정된 바와 같이 ARAF-S214P를 발현하는 HDLEC에서 ARAF-WT와 비교하여 증가된 발아 활성을 나타낸다. df가 22인 이원 독립 t-테스트. 회전타원체가 또한 증가하는 농도의 트라메티닙에서 배양되었으며, 이것은 30 nM (****P = 4.68 x 10-5; df = 25), 100 nM (***P = 9.5 x 10-4; df = 23) 및 300 nM (***P = 4.4 x 10-4; df = 24)의 농도에서 발아 횟수 그리고 30 nM (***P = 1.8 x 10-4; df = 25), 100 nM (**P = 0.001; df = 23) 및 300 nM (***P = 3.2 x 10-4; df = 24)의 농도에서 발아 길이 둘 다를 크게 감소시켰다. 이원 독립 t-테스트. HDLEC의 독립적인 형질도입으로 수행된 3회의 실험이 정량화되었고, 3회 실험 모두로부터의 점이 삽입된(interleaved) 상자 및 수염 플롯 (실험 당 3 내지 6개의 회전타원체) 상에 플롯팅되며 (조건 당 15개의 점), 중앙의 선은 중간을 나타내고, 상자 한계는 사분위수 범위를 나타내며 수염은 최소 내지 최대 데이터 범위를 나타낸다. 도 23E) ARAF 돌연변이는 VE-카데린 국소화에 영향을 미치고 (****P = 1.88 x 10-26), 트라메티닙으로의 처리는 VE-카데린의 세포 표면 국소화를 증가시킨다 (****P = 1.63 x 10-19). 빨간색 화살표 머리는 원형질막 염색이라고 불리는 염색을 가리키고, 노란색 화살표 머리는 세포내 염색을 나타낸다. HDLEC의 독립적인 형질도입으로 수행된 3회의 실험은 세포내 염색 및 원형질막 염색에 대해 정량화되었고, 3회 실험 모두의 점 (조건 당 75개의 점)이 상자 및 수염 플롯 (최소 내지 최대) 상에 플롯팅되었으며, 중앙의 선은 중간을 나타내고, 상자 한계는 사분위수 범위를 나타내며 수염은 최소 내지 최대 데이터 범위를 나타낸다. df가 148인 이원 독립 t-테스트; NS, 유의하지 않음. 도 23E에서의 실험의 최대 길이 및 너비가 측정되었고, 길이-대-너비 비율이 계산되었고 오른쪽 상자 및 수염 플롯 (최소 내지 최대; 오른쪽 하단) 상에 플롯팅되었으며, 중앙의 선은 중간을 나타내고, 상자 한계는 사분위수 범위를 나타내며 수염은 최소 내지 최대 데이터 범위를 나타낸다. ARAF-S214P 발현은 크게 증가된 길이/너비 비율을 유발하고 (****P = 9.57 x 10-15) 트라메티닙으로의 처리는 비율을 표준화시킨다 (****P = 7.51 x 10-17; df가 148인 이원 독립 t-테스트; NS, 유의하지 않음). 도 23F) MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 검정은 ARAF-S214P가 형질도입된 HDLEC에서 증식의 증가로 이어지지 않는다는 것을 나타낸다. 대사 활성은 두 개의 파장 (550 및 700 nm)에서 측정된다. 방법에서 기재된 바와 같이 3배수 웰 (n = 3 독립적인 웰)의 내용물을 표시된 시간에 수거하였다. 추세선은 각각의 시점에서의 각각의 형질도입체에 대한 평균을 연결하고, 시점은 모든 데이터 포인트에 대해 측정된 값을 나타낸다. 이 실험은 2회의 독립적인 레트로바이러스 형질도입의 결과를 나타낸다. 도 23G - 도 23I) 상단: 어류 림프계의 개요; 흰색 프레임은 도 23G - 23I에서 조사된 면적을 나타내며 공초점 스캔의 오버레이(overlay)를 나타낸다 (최대 강도 투사). 도 23G - 도 23I에서 TD 및 후주정맥 (posterior cardinal vein: PCV)은 초록색으로 라벨링되고 (tg(mrc1a:EGFP)), TD는 점선으로 윤곽이 드러난다. ARAF 트랜스제닉 (mrc1a:araf) 세포는 빨간색으로 표시된다 (초록색 + 빨간색 → 노란색). 도 23G) ARAF-S214P 발현은 TD의 극심한 팽창으로 이어진다. 도 23H) ARAF-WT (빨간색) 발현은 TD 및 PCV의 형태학에 아무런 효과가 없었다 (둘 다 초록색). 도 23I) 코비메티닙 (1 uM)은 돌연변이에 의해 유도된 팽창을 부분적으로 반전시킨다. 3회의 독립적인 실험이 반복되었으며 23G - 23I에서 유사한 결과를 얻었다. 도 23J), 코비메티닙 처리 유무에 따른 팽창에 대한 신체 분절의 표현형 점수 범주: 정상, 중간 팽창 (TD가 확장되지만 PCV로부터 분리될 수 있다) 및 극심한 팽창 (TD 및 PCV가 중첩됨). 코비메티닙 처리는 극심한 팽창 (****P = 1.33 x 10-5; 일원 독립 t-테스트; 파란색 막대그래프)의 큰 감소로 이어졌고 정상적인 형태학 (***P = 0.00051; 일원 독립 t-테스트; 초록색 막대그래프)로 구제한다. 3회의 독립적인 실험에서, 총 40개의 유충(larvae) 및 120개의 신체 분절이 분석되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± s.e.m으로 나타난다. 미가공 블롯 이미지는 소스(source) 데이터로 이용 가능하다.
도 24A - 24F. MEK 억제자 요법 전에 및 후에 선도 프로밴드에서 폐 기능 테스트 시험 및 임상적 이미지. MEK 억제자 요법 전에 폐 기능 테스트의 결과. 모든 폐활량 측정 수단에서의 유의한 개선에 주목해야 하며, FEV1은 예상치의 23% 내지 42% 개선되고, TLC는 예상치의 29% 내지 56% 개선되고 최대 흡기압 (MIP)은 예상치의 71% 내지 115% 개선된다 (빨간 색으로 표시됨). FVC, 강제 폐활량(forced vital capacity); FEF25-75, 중간 강제 호기 유속(mid forced expiratory flow rates); RV, 잔기량(residual volume); RV/TLC, TLC에 대한 RV의 비율; DLCO [Hb], 헤모글로빈에 대해 보정된 일산화탄소에 대한 폐 확산 용량; DLCO/VA, 폐포 부피 (VA)로 나누어진 DLCO; MEP, 최대 호기압; O2 Sat, 산소 포화도. 도 24B) 의료 요법 시작 직전에 (왼쪽) 및 MEK 억제자 요법이 시작한 후 12개월에 (오른쪽)T2-강조 비-대비 림프관 조영도의 관상 최대 강도 투사는 대규모 팽창 및 비딩(beading) 피하 림프관의 거의 완벽한 재흡수를 입증한다. 도 24C) 처리 전 골반 및 흉부의 대비 림프관 조영도의 관상 최대 강도 투사 (왼쪽)는 중심 림프관의 부족, 횡경막 위 중심 림프 흐름의 결여, 및 복벽을 따라 흐르는 대규모 팽창 및 비딩 양방향 피하 도관을 입증한다. 처리 시작 후 12개월에 (오른쪽) 팽창된 피하 도관의 재흡수가 일어나며, 복벽을 따라 흉부로 연장되는 새로운, 더 정상적으로 보이는 림프망이 형성된다. 도 24D) 처리 전 골반 및 허벅지의 대비 림프관 조영도의 관상 최대 강도 투사 (왼쪽)는 또한 허벅지에서 도관의 부족 및 림프관의 대규모 팽창 및 비딩을 입증한다. 처리 후 (오른쪽), 비정상적으로 팽창된 도관의 재흡수 및 새롭고 더 정상적으로 보이는 림프방의 형성이 일어난다. 도 24E) 처리 전 (왼쪽) 및 처리 후 12개월 (오른쪽)의 흉부 X선으로서 감소된 삼출 및 현저하게 개선된 폐 부피를 나타낸다. 도 24F) 환자의 성장 도표 (왼쪽). 트라메티닙으로의 처리는 13세 (*) 직전에 시작되었고 림프 부종 및 임상적 상태의 개선이 처리 시작 후 대략 3-6개월에 시작하는 것을 관찰하였다. 최대 체중에서 압축 스타킹의 제거 직후 환자의 하지의 사진은 오른쪽 상단에 나타난다. 오른쪽 하단의 이미지는 상응하는 하지의 사진을 나타낸다.
Ras/미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 경로는 세포 증식, 이동, 분화, 및 아폽토시스(apoptosis)에서 중요한 역할을 하며, 이것들은 모두 정상적인 발달에 필수적이다. 중앙 전도성 림프 이상증 (CCLA)은 팽창된 림프 채널, 림프 채널 운동성 장애, 및 림프 배출에 영향을 미치는 말단 폐색을 특징으로 하는 복합 림프 이상증이다. Trenor III와 Chaudry, 및 Clemens et al에서 처음 기재된 바와 같이, CCLA는 2015년에 국제 혈관 이상 연구 협회 (International Society for the Study of Vascular Anomalies: ISSVA)에 의해 채널형 림프관 기형으로 분류되었으며, 제한되는 것은 아니지만, 유미흉증(chylothorax), 유미성 복수(chylous ascites), 림프액 누출 또는 환류, 및 극도의 부기를 포함하는, 밀접하게 관련된 진단 - 전신 림프 이상증 (GLA) -과 임상 증상의 상당한 중첩 패턴을 제공한다. 발명자들은 최근 림프 이상증에 대한 원인으로서, LAM, GLA, 및 CCLA를 포함한, ARAF의 기능 획득 돌연변이를 확인하였다. 본원에서 발명자들은 림프 이상증에서 원인이 되는 변이체로서, LAM, GLA, 및 CCLA를 포함한, KRAS, BIRAF 및 PNPN11의 기능 획득 돌연변이를 기재한다. 이 장애의 발병에 기여하는 SOS1, ITAG9, RASA1, RAF1, RIT1, PIEZO1, EPHB4, NF1, CBL 및 ARAF의 다른 돌연변이가 또한 기재되어 있다.
일반적으로 공지되지 않은 병인의 희귀하고 파괴적인 질환 스펙트럼인 림프 이상증의 치료는 환자 징후에 의존적이다. 원인이 되는 유전자를 확인하는 것은 정확한 의학적 실행에 따라 저렴한 치료법을 개발할 수 있게 할 것이다. 실시예 II에서, 발명자들은 통상적인 시롤리무스 요법에 무반응성인, 발달된 변칙 림프성 질환에 걸린 12세 소년 및 또 다른 무관한 성인 환자에서 재발성 기능 획득 ARAF 돌연변이 (c.640T>C:p.S214P)를 특성화하였다. 돌연변이는 보존된 인산화 부위의 상실로 이어졌다. ARAF-S214P로 형질도입된 세포는 높아진 ERK1/2 활성, 향상된 림프관 신생 능력, 및 액틴 골격 및 VE-카데린 접합의 분해를 나타내며, 이것들은 MEK 억제자 트라메티닙을 사용하여 구제되었다. 돌인변이의 기능적 관련성이 또한 제브라피쉬 모델에서 림프 표현형을 재현시킴으로써 검증되었으며, MEK 억제자를 사용하여 변칙적인 표현형을 구제하였다. MEK 억제자를 이용한 선도 프로밴드의 후속 요법은 극적인 임상적 개선으로 이어졌으며, 림프성 부종의 분해, 폐 기능 테스트에서 현저한 개선, 보충용 산소 요구량의 중지 및 일일 활성의 거의 정상화로 환자 림프계를 리모델링하였다. 발명자들의 결과는 유전적 분류 및 기계론적 이해에 대한 지식이 생물학적 기반 의료 치료를 안내하는 방법에 대한 대표적인 입증을 제공하며, 발명자들의 경우에는 생명을 구하는 것이었다.
이제 본 발명의 특정 구체예에 대하여 상세한 참조가 이루어질 것이며, 이것들의 예는 첨부된 도면에서 예시된다. 본 발명은 예시된 구체예와 함께 기재되지만, 그것들은 본 발명을 상기 구체예로 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 이와 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같이 본 발명 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 동등물을 커버하도록 의도된다.
본 교시내용을 상세히 기재하기 전에, 개시내용이 특정 조성 또는 처리 단계에 제한되지 않으며, 이러한 것들은 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 "하나(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 달리 분명하게 나타나지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 컨쥬게이트"에 대한 지시대상은 복수의 컨쥬게이트를 포함하고 "하나의 세포"에 대한 지시대상은 복수의 세포를 포함한다.
약간의 그리고 실질적이지 않은 편차가 본원에서 본 교시내용의 범위 내에 있도록 본 개시물에서 논의된 온도, 농도, 시간, 등의 앞에 "약"이 나타난다는 것을 알 수 있다. 또한, "포함하다", "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하다", "함유하는", "포함하다", "포함하다", 및 "포함하는"은 제한하는 것으로 의도된 것은 아니다. 앞서 언급된 일반적인 설명 및 상세한 설명은 둘 다 단지 예시이고 설명하기 위한 것이며 교시내용을 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
상기 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는" 것을 나열하는 명세서 내의 구체예는 또한 나열된 구성요소로 "이루어지거나" 또는 "근본적으로 그것들로 이루어지는" 것으로 간주되고; 다양한 구성요소로 "이루어진 것을 나열하는 명세서 내의 구체예는 또한 나열된 구성요소를 "포함하거나" 또는 "근본적으로 그것들로 이루어지는" 것으로 간주되고; 다양한 구성요소로 "본질적으로 이루어지는" 것을 나열하는 명세서 내의 구체예는 또한 나열된 구성요소로 "이루어지거나" 또는 "그것들을 포함하는" 것으로 간주된다 (이 상호 교체 가능성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에는 적용되지 않는다).
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 유기적인 구조의 목적을 위한 것이고 어떠한 방법으로도 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조에 의해 통합된 임의의 문헌이 이 명세서에서 정의된 임의의 용어와 모순되는 경우, 이 명세서는 이를 통제한다. 본 교시내용이 다양한 구체예와 함께 기재되어 있지만, 본 교시내용은 이러한 구체예로 제한하려는 것은 아니다. 이와 달리, 본 교시내용은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 다양한 대안, 변형, 및 동등물을 포함한다.
게다가, "~로 이루어진 군으로부터 선택된" 화합물은 뒤따르는 목록의 화합물 중 하나 이상을 나타내며, 화합물 중 둘 이상의 혼합물 (즉, 조합)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 단리된, 또는 생물학적으로 순수한 분자는 천연 환경으로부터 제거된 화합물이다. 이와 같이, "단리된" 및 "생물학적으로 순수한"이 반드시 화합물이 정제된 정도를 반영하는 것은 아니다. 본 발명의 단리된 화합물은 천연 공급원으로부터 얻어질 수 있거나, 실험실 합성 기술을 사용하여 생산될 수 있거나 또는 임의의 이러한 화학적 합성 경로에 의해 생산될 수 있다.
"림프 이상증"은 림프관 및 림프 조직 과증식의 비정상적인 형성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 나타낸다. 림프 이상증의 비-제한적인 예는 "림프관종증" 또는 "림프관 확장증" (본원에서 전체적으로 LAM으로 불림), 림프관종(lymphangioma), 전신 림프 이상증 (GLA), 및 유미 삼출증, 전신 림프관종, 전신성 낭종성 혈관종증(systemic cystic angiomatosis), 다발성 림프관 확장증, 전신 림프관 기형, CCLA, 확산성 림프관 기형, 카포시형(Kaposiform) LAM 및 진행성 골 용해를 특징으로 하는 림프 기원의 희귀성 혈관 장애인 고함-스타우트 병 (Gorham-Stout disease: GSD)을 포함한다.
임상적으로, 림프관종은 여러 유형으로 분류된다. 이것들은 (1) 모세혈관 크기의 얇은 벽 림프 채널로 구성된 단순형(Simplex) (이 유형은 보통 피부에 영향을 미친다 (국한성 림프관종(lymphangioma circumscriptum))); (2) 낭포성 림프관종(Cystic lymphangioma) (또는 낭포성 하이그로마(cystic hygroma)) (이것은 크기가 몇 밀리미터에서 몇 센티미터의 범위일 수 있으며, 유년기에 일반적으로 목 또는 겨드랑이에서 볼 수 있다); (3) 해면체 (이 유형은 팽창된 림프 채널로 구성되며, 종종 섬유성 외막 코팅을 갖는다. 이것은 보통 흉부, 복부, 및 골의 장기에 영향을 미치는 유형이다)를 포함한다. 이들 림프관종은 각각 본 발명에 포함된다.
"단일 뉴클레오타이드 변이 (SNV)"는 게놈 DNA 내의 위치를 말하며 그 위치에서 보통의 염기와 상이한 단일 염기가 존재한다. SNV는 SNP가 일반적으로 일부 빈도에서 발생하는 (예를 들어, 집단의 특정 퍼센트 초과에서 발생하는) SNV를 나타내는 반면, SNV는 빈도 정보를 제공하지 않는다는 것을 제외하면 SNP와 유사하다. 수백만 개의 SNV가 인간 게놈에서 분류되었다. 일부 SNV는 질환의 원인이 되기도 하지만, 다른 SNV는 게놈 내에서 정상적인 변이이다.
"림프 이상증-관련된-SNV 또는 -특이적 마커"는 림프 이상증에 걸릴 위험의 증가와 관련이 있고 이 질환에 걸리지 않은 환자에서 발견되지 않는 SNV이다. 이러한 마커는 핵산, 이에 의해 암호화되는 단백질, 또는 다른 소분자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다다.
용어 "유전적 변화"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 핵산 분자의 야생형 또는 참조 서열의 변화를 나타낸다. 유전적 변화는, 제한되는 것이 아니라, SNV 및 SNP, 카피 수 변화 (CNV), 염기쌍 치환, 공지된 서열의 핵산 분자로부터 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 추가, 및 결실을 포함한다.
"연계"는 동일한 염색체 상의 위치의 결과로서 함께 유전되는 유전자, 대립유전자, 유전자좌 또는 유전자 마커의 성향을 기재하고, 두 유전자, 대립유전자, 유전자좌 또는 유전자 마커 사이의 퍼센트 재조합 (소위 재조합 분율, 또는 θ)에 의해 측정된다. 두 유전자좌가 염색체 상에서 물리적으로 더 가까울수록, 재조합 분율은 더 낮아질 것이다. 보통, 질환-유발 유전자 내의 다형성 부위가 질환과의 연계에 대해 테스트될 때, 재조합 분율은 0일 것이며, 질환 및 질환-유발 유전자는 항상 동시-유전된다는 것을 나타낸다. 드물게, 유전자가 게놈의 매우 큰 부분에 걸쳐있을 때, 유전자의 한 단부 상의 다형성 부위와 다른 단부 상의 원인이 되는 돌연변이 사이의 재조합을 관찰하는 것이 가능할 수 있다. 하지만, 원인이 되는 돌연변이가 질환과의 연계에 대해 테스트되는 다형성인 경우, 재조합이 관찰되지 않을 것이다.
"센티모르간(Centimorgan)"은 두 유전자 마커, 대립유전자, 유전자 또는 유전자좌 사이의 연계를 나타내는 유전자 거리의 단위이며, 임의의 감수분열 이벤트에 대해 1%의 두 개의 마커 또는 유전자좌 사이의 재조합의 확률과 상응한다.
"연계 불평형" 또는 "대립유전자 회합"은 인근의 염색체 위치에서 집단 내 임의의 특정 대립유전자에 대한 기회에 의해 예상된 것보다 더 빈번한, 특정 대립유전자, 유전자좌, 유전자 또는 유전자 마커와의 특정 대립유전자, 유전자좌, 유전자 또는 유전자 마커의 우선적인 회합을 의미한다.
용어 "고체 매트릭스"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 비드, 극미립자, 마이크로어레이, 미세적정 웰 또는 테스트 튜브의 표면, 계량봉(dipstick) 또는 필터와 같은 임의의 포맷을 나타낸다. 매트릭스의 재료는 폴리스티렌, 셀룰로스, 라텍스, 니트로셀룰로스, 나일론, 폴리아크릴아미드, 덱스트란 또는 아가로스일 수 있다. 고체 매트릭스는 용액 내 매트릭스로부터 제거 가능하도록 그 위에 고정된 핵산을 포함할 수 있다.
"표적 핵산"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 복합 핵산 혼합물에 존재하는 핵산의 이전에 정의된 영역을 나타내는데 정의된 야생형 영역은 적어도 하나의 공지된 뉴클레오타이드 변이를 함유하며, 이것은 림프 이상증과 관련이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 핵산 분자는 cDNA 클로닝 또는 감쇄 혼성체화(subtractive hybridization)에 의해 천연 공급원으로부터 단리되거나 또는 수동으로 합성될 수 있다. 핵산 분자는 트리에스터 합성 방법에 의해 수동으로 또는 자동화된 DNA 합성기를 사용함으로써 합성될 수 있다.
본 발명에서 사용된 핵산에 관하여, 용어 "단리된 핵산"은, DNA에 적용될 때, 유도되는 유기체의 자연 발생한 게놈에서 바로 인접한 (5' 및 3' 방향으로) 서열로부터 분리된 DNA 분자를 나타낸다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. "단리된 핵산 분자"는 또한 cDNA 분자를 포함할 수 있다. 벡터로 삽입된 단리된 핵산 분자는 때때로 본원에서 재조합 핵산 분자로도 불린다.
RNA 분자에 관하여, 용어 "단리된 핵산"은 주로 상기 정의된 단리된 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 나타낸다. 대안으로, 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연 상태에서 (즉, 세포 또는 조직에서) 회합되는 RNA 분자로부터 충분하게 분리된 RNA 분자를 나타낼 수 있다.
핵산에 관하여 용어 "풍부한"은 특정 DNA 또는 RNA 서열이 정상 세포 또는 서열이 취해지는 세포에서보다 관심있는 세포 또는 용액에 존재하는 전체 DNA 또는 RNA 중 훨씬 더 높은 분율 (2 내지 5배)을 구성한다는 것을 의미한다. 이것은 존재하는 다른 DNA 또는 RNA의 양의 우선적인 감소에 의해, 또는 특정 DNA 또는 RNA 서열의 양의 우선적인 증가에 의해, 또는 둘의 조합에 의해 사람에 의해 유발될 수 있다. 하지만, "풍부한"은 다른 DNA 또는 RNA 서열이 존재하지 않는다는 것이 아니라 관심있는 서열의 상대적인 양이 크게 증가했음을 나타낸다는 것을 알아야 한다.
또한 일부 목적을 위해 뉴클레오타이드 서열은 정제된 형태로 존재하는 것이 유리하다. 핵산에 관하여 용어 "정제된"은 절대적인 순수함 (예컨대 균질의 조제물)을 요구하는 것이 아니며; 대신에, 서열이 천연 환경에서보다 상대적으로 더 순수하다는 것을 나타낸다.
용어 "상보적"은 서로 다수의 호의적인 상호작용을 형성할 수 있는 두 개의 뉴클레오타이드를 기재한다. 예를 들어, 아데닌은 그것들이 두 개의 수소 결합을 형성할 수 있기 때문에 티민에 대해 상보적이다. 유사하게, 구아닌 및 시토신은 그것들이 세 개의 수소 결합을 형성할 수 있기 때문에 상보적이다. 따라서, 핵산 서열이 염기 서열, 티민, 아데닌, 구아닌 및 시토신을 함유하는 경우, 이 핵산 분자의 "보체"는 티민을 대신해서 아데닌, 아데닌을 대신해서 티민, 구아닌을 대신해서 시토신, 및 시토신을 대신해서 구아닌을 함유하는 분자일 것이다. 보체는 모 핵산 분자와의 최적의 상호작용을 형성하는 핵산 서열을 함유할 수 있기 때문에, 이러한 보체는 모 분자에 높은 친화도로 결합할 수 있다.
단일 가닥 핵산, 특히 올리고뉴클레오타이드에 관하여, 용어 "특이적으로 혼성체화하는"은 해당 분야에 일반적으로 사용되는 사전 결정된 조건 하에서 이러한 혼성체화를 허용하기에 충분히 상보적인 (때때로 "실질적으로 상보적"이라고 불림) 서열의 두 개의 단일 가닥 뉴클레오타이드 분자 사이의 회합을 나타낸다. 특히, 용어는 본 발명의 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자 내에 함유된 실질적으로 상보적 서열과의 올리고뉴클레오타이드의 혼성체화를 나타내며, 비-상보적 서열의 단일 가닥 핵산과의 올리고뉴클레오타이드의 혼성체화의 실질적인 배제를 나타낸다. 예를 들어, 특이적 혼성체화는 임의의 림프 이상증-특이적 마커 핵산에 혼성체화하지만, 다른 뉴클레오타이드와 혼성체화하지 않는 서열을 나타낼 수 있다. 이러한 마커는, 예를 들어, 본원에 포함된 표에서 나타난 림프 이상증-특이적 마커를 포하만다. 다양한 상보성의 단일 가닥 핵산 분자의 특이적 혼성체화를 가능하게 하는 적절한 조건은 해당 분야에 널리 공지되어 있다.
예를 들어, 명시된 서열 상동성의 핵산 분자 사이에서 혼성체화를 달성하는데 필요한 엄중 조건을 계산하기 위한 하나의 일반적인 공식이 하기 제시된다 (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989):
Tm = 81.5"C + 16.6Log [Na+] + 0.41(% G+C) - 0.63 (% 포름아미드) - 600/듀플렉스(duplex)의 #bp
상기 공식의 예시로서, 42%의 GC 함유랑 및 200개의 염기의 평균 프로브 크기와 함께 [Na+] = [0.368] 및 50% 포름아미드를 사용하면, Tm은 57℃이다. DNA 듀플렉스의 Tm은 상동성이 1% 감소할 때마다 1 - 1.5℃씩 감소하였다. 따라서, 약 75% 초과의 서열 동일성을 갖는 표적은 42℃의 혼성체화 온도를 사용하여 관찰될 것이다. 혼성체화 및 세척의 엄중도는 주로 용액의 염 농도 및 온도에 따라 다르다. 일반적으로, 표적과의 프로브의 어닐링(annealing) 확률을 최대화하기 위해서, 혼성체화는 보통 하이브리드(hybrid)의 계산된 Tm보다 20-25℃ 낮은 염 및 온도 조건에서 수행된다. 세척 조건은 표적에 대한 프로브의 동일성의 정도에 대해 가능한 한 엄중해야 한다. 일반적으로, 세척 조건은 하이브리드의 Tm보다 대략 12-20℃ 더 낮도록 선택된다. 특정 양태, 본 발명의 핵산에서, 중간 엄중도 혼성체화는 42℃에서 6X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA 중에서의 혼성체화로 정의되고, 55℃에서 15분 동안 2X SSC 및 0.5% SDS에서 세척된다. 높은 엄중도 혼성체화는 42℃에서 6X SSC, 5X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA 중에서의 혼성체화로 정의되고, 65℃에서 15분 동안 1X SSC 및 0.5% SDS에서 세척된다. 매우 높은 엄중도 혼성체화는 42℃에서 6X SSC, 5X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA 중에서의 혼성체화로 정의되고, 65℃에서 15분 동안 0.1X SSC 및 0.5% SDS에서 세척된다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 둘 이상의, 바람직하게는 셋 초과의 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산 분자로 정의된다. 올리고뉴클레오타이드의 정확한 크기는 다양한 요인들과 올리고뉴클레오타이드의 특정 용도 및 사용에 따라 다를 것이다. 프로브 및 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 3개의 뉴클레오타이드에서 전체 기링의 핵산 분자까지의 임의의 길이일 수 있고, 명확하게는 3 내지 전체 길이의 폴리뉴클레오타이드의 가능한 모든 수의 인접한 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 길이가 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 길이가 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드이다.
용어 "프로브"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 정제된 제한 효소 분해에서와 같이 자연적으로 발생하거나 또는 합성에 의해 생산된 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, RNA 또는 DNA를 나타내며, 이것은 프로브에 상보적인 서열과 어닐링할 수 있거나 또는 그것을 가진 핵산에 특이적으로 혼성체화할 수 있다. 프로브는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 프로브의 정확한 길이는 온도, 프로브의 공급원 및 사용 방법을 포함한 많은 인자들에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 진단 용도에 대해서, 표적 서열의 복잡성에 따라서,
올리고뉴클레오타이드 프로브 (어떤 경우에는 dbSNP 데이터베이스에서 이용 가능한 단일 뉴클레오타이드 다형성과 관련된 명시된 rs 수와 관련된 핵산)는 전형적으로 15-25, 15-35, 20-50, 또는 100개 이상의 뉴클레오타이드를 함유하지만, SNV의 부위가 프로브에 포함된다면 더 적은 수의 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 프로브는 본원에서 특정 표적 핵산 서열의 상이한 가닥에 대해 상보적이도록 선택된다. 이것은 프로브가 일련의 사전 결정된 조건 하에서 각각의 표적 가닥과 "특이적으로 혼성체화하거나" 또는 어닐링할 수 있도록 충분히 상보적이어야 한다는 것을 의미한다. 그러므로, 프로브 서열은 표적의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요가 없다. 예를 들어, 비-상보적 뉴클레오타이드 단편은 프로브의 5' 또는 3' 단부에 부착될 수 있으며, 나머지 프로브 서열은 표적 가닥에 상보적이다. 대안으로, 비-상보적인 염기 또는 더 긴 서열이 프로브에 산재될 수 있으며, 단 프로브 서열은 표적 핵산의 서열과 특이적으로 어닐링하기에 충분한 상보성을 갖는다.
용어 "프라이머"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 생물학적 시스템으로부터 유래되거나, 제한 효소 분해에 의해 생성되거나, 또는 합성에 의해 생산된 올리고뉴클레오타이드, RNA 또는 DNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥를 나타내며, 적절한 환경에 배치될 때, 기능적으로 주형-의존적 핵산 합성의 개시자의 역할을 할 수 있다. 적절한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 전구체, 폴리머라제 효소, 적합한 공동인자 및 적합한 온도 및 pH와 같은 조건과 함께 제공될 때, 프라이머는 3' 말단에서 폴리머라제의 작용 또는 유사한 활성에 의한 뉴클레오타이드의 추가에 의해 연장되어 프라이머 연장 생성물을 수득할 수 있다. 프라이머는 특정 조건 및 적용의 요건에 따라 길이가 다를 수 있다. 예를 들어, 진단적 용도에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 전형적으로 길이가 15-25, 15-40, 20-50개, 등 또는 그 이상의 뉴클레오타이드이다. 프라이머는 원하는 연장 생성물의 합성을 프라이밍(prime)하기에, 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에 사용하기에 적절한 병치로 프라이머의 3' 하이드록실 모이어티(moiety)를 제공하기에 충분한 방식으로 원하는 주형 가닥과 어닐링하기에 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머 서열이 원하는 주형의 정확한 보체를 나타내는 것이 요구되지는 않는다. 예를 들어, 비-상보적 뉴클레오타이드 서열은 달리 상보적인 프라이머의 5' 단부에 부착될 수 있다. 대안으로, 비-상보적 염기는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열 내에 산재될 수 있으며, 단 프라이머 서열은 연장 생성물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하기 위해 원하는 주형 가닥의 서열과의 충분한 상보성을 갖는다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 미국 특허 4,683,195, 4,800,195, 및 4,965,188에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
"siRNA"는 표적화된 유전자의 서열과의 상동성을 갖는 작은 간섭 RNA (siRNA)를 제공함으로써 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵(silencing) 또는 유전자 넉다운(knockdown)을 위한 RNA 간섭에 수반된 분자를 나타낸다. 작은 간섭 RNA (siRNA)는 시험관 내에서(in vitro) 합성될 수 있거나 더 긴 dsRNA로부터의 리보뉴클레아제 III 분열에 의해 생성될 수 있고 서열-특이적 mRNA 분해의 매개자이다. 바람직하게는, 본 발명의 siRNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포르아미디트 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성된다. siRNA는 두 개의 별개의 상보적인 RNA 분자로서, 또는 두 개의 상보적 영역을 가진 단일 RNA 분자로서 합성될 수 있다. 합성 RNA 분자 또는 합성 시약의 상업적인 공급처는 Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, Colo., USA), Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, Ill., USA), Glen Research (Sterling, Va., USA), ChemGenes (Ashland, Mass., USA) 및 Cruachem (GLAgow, UK)을 포함한다. 림프관종증 mRNA를 억제하는데 특이적인 siRNA 작제물은, 예를 들어, 길이가 15-35개의 뉴클레오타이드, 더 전형적으로는 길이가 약 21개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
용어 "벡터"는 세포로 감염되거나, 트랜스펙션되거나 또는 형질전환되고 독립적으로 또는 숙주 세포 게놈 내에서 복제할 수 있는 단일- 또는 이중 가닥 원형 핵산 분자에 관한 것이다. 원형 이중 가닥 핵산 분자는 제한 효소 처리시 절단되어 선형화될 수 있다. 다양한 벡터, 제한 효소, 및 제한 효소에 의해 표적화되는 뉴클레오타이드 서열의 지식은 당업자에게 쉽게 이용 가능하고, 임의의 레플리콘(replicon), 에컨대 플라스미드, 코스미드(cosmid), 바크미드(bacmid), 파지 또는 바이러스를 포함하며, 또 다른 유전자 서열 또는 요소 (DNA 또는 RNA)가 부착되어 부착된 서열 또는 요소의 복제를 유발할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 벡터를 제한 효소로 절단하고 두 조각을 함께 결찰시킴으로써 벡터로 삽입될 수 있다. 복제 또는 결실을 함유하는 유전자 영역을 클로닝할 때, 당업자는 적합한 길이 (예를 들어, 50-100개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)의 영향을 받는 영역의 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)에 있는 플랭킹(flanking) 서열이 클로닝 과정에 이용될 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 이러한 벡터는, 예를 들어, 이러한 변화가 암호화된 단백질에 대해 나타내는 효과를 연구하기 위한 세포주에서 유용성을 가질 것이다.
원핵생물 또는 진핵생물 유기체로의 발현 작제물의 형질전환, 트랜스펙션, 또는 형질도입을 촉진하기 위해 많은 기술이 당업자에게 이용 가능하다. 용어 "형질전환", "트랜스펙션", 및 "형질도입"은 세포 또는 숙주 유기체에 핵산 및/또는 발현 작제물을 삽입하는 방법을 나타낸다. 이들 방법은 숙주 세포 외막 또는 외벽을 관심있는 핵산 분자에 대해 투과성으로 만들기 위해 세포를 고농도의 염, 전기장, 또는 세제로 처리하는 것, 미량 주사, PEG-융합, 등과 같은 다양한 기술들을 수반한다.
용어 "프로모터 요소"는, 적절한 세포 내에서, 전사 인자 및/또는 폴리머라제 결합 및 mRNA로의 벡터 DNA의 일부의 이후의 전사를 촉진할 수 있는 벡터로 통합된 뉴클레오타이드 서열을 기재한다. 한 구체예에서, 본 발명의 프로모터 요소는 후자가 mRNA로 번역되도록 림프 이상증-특이적 마커 핵산 분자의 5' 단부에 선행한다. 숙주 세포 기작은 mRNA를 폴리펩타이드로 번역한다. 프로모터 요소는 관심있는 암호화 영역의 구성적 또는 유도성 발현을 구동시킬 수 있다.
당업자는 핵산 벡터가 프로모터 요소 및 림프 이상증-특이적 마커 암호화 핵산 이외의 핵산 요소를 함유할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 다른 핵산 요소는 복제의 기원, 리보솜 결합 부위, 약물 저항성 효소 또는 아미노산 대사 효소를 암호화하는 핵산 서열, 및 분비 신호, 국소화 신호, 또는 폴리펩타이드 정제에 유용한 신호를 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"레플리콘"은 주로 자체의 제어 하에 복제 가능한 임의의 유전적 요소, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바크미드, 플라스티드(plastid), 파지 또는 바이러스이다. 레플리콘은 RNA 또는 DNA일 수 있고 단일- 또는 이중 가닥일 수 있다.
"발현 오페론"은 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서(enhancer), 번역 시작 신호 (예를 들어, ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 신호, 종결자, 등을 가질 수 있고, 숙주 세포 또는 유기체에서 폴리펩타이드 암호화 서열의 발현을 촉진하는 핵산 분절을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포터", "리포터 시스템", "리포터 유전자", 또는 "리포터 유전자 생성물"은 핵산이 발현될 때, 예를 들어, 생물학적 검정, 면역검정, 방사선 면역검정에 의해, 또는 비색적, 형광원성, 화학발광 또는 다른 방법에 의해 쉽게 측정 가능한 리포터 신호를 생산하는 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하는, 작동 가능한 유전적 시스템을 의미할 것이다. 핵산은 RNA 또는 DNA, 선형 또는 원형, 단일- 또는 이중 가닥, 안티센스(antisense) 또는 센스(sense) 극성일 수 있고 리포터 유전자 생성물의 발현에 필수적인 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. 필요 제어 요소는 리포터 시스템의 성질 및 리포터 유전자가 DNA 또는 RNA 형태로 되어 있는지에 따라 다를 것이지만, 제한되는 것이 아니라, 프로모터, 인핸서, 번역 제어 서열, 폴리 A 추가 신호, 전사 종결 신호 등과 같은 요소를 포함할 수 있다.
도입된 핵산은 수령체 세포 또는 유기체의 핵산으로 통합 (공유 결합)될 수 있거나 되지 않을 수도 있다. 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포에서, 예를 들어, 도입된 핵산은 에피솜 요소 또는 독립적인 레플리콘, 예컨대 플라스미드로서 유지될 수 있다. 대안으로, 도입된 핵산은 수령체 세포 또는 유기체의 핵산으로 통합되고 상기 세포 또는 유기체에서 안정하게 유지될 수 있으며, 더 나아가 수령체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체에 전달되거나 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 핵산은 수령체 세포 또는 숙주 유기체에 일과성으로만 존재할 수 있다.
용어 "선택 가능한 마커 유전자"는, 발현될 때, 형질전환된 세포에 항생제 저항성과 같은 선택 가능한 표현형을 부여하는 유전자를 나타낸다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 암호화 서열의 발현에 필수적인 조절 서열이 암호화 서열의 발현에 영향을 미치기 위해 DNA 분자 내에 암호화 서열에 관하여 적절한 위치에 배치된다는 것을 의미한다. 이 동일한 정의는 때때로 발현 벡터 내에서 전사 유닛 및 다른 전사 제어 요소 (예를 들어, 인핸서)의 배열에 적용된다.
용어 "재조합 유기체" 또는 "트랜스제닉 유기체"는 유전자 또는 핵산 분자의 새로운 조합을 가진 유기체를 나타낸다. 유전자 또는 핵산 분자의 조합은 당업자에게 이용 가능한 다수의 핵산 조작 기술을 사용하여 유기체로 도입될 수 있다. 용어 "유기체"는 적어도 하나의 세포로 구성된 임의의 살아있는 것과 관련이 있다. 유기체는 하나의 진핵생물 세포만큼 단순하거나 또는 포유동물만큼 복잡할 수 있다. 그러므로, 구절 "재조합 유기체"는 재조합 세포, 뿐만 아니라 진핵생물 및 원핵생물 유기체를 포함한다. 트랜스제닉 유기체의 예는 제브라피쉬 또는 마우스를 포함한다.
용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 및 정제된 단백질"이 때때로 본원에서 사용된다. 이 용어는 주로 본 발명의 단리된 핵산 분자의 발현에 의해 생산된 단백질을 나타낸다. 대안으로, 이 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연적으로 회합되는 다른 단백질로부터충분히 분리된 단백질을 나타낼 수 있다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 근본적인 활성을 방해하지 않고, 예를 들어, 불완전한 정제, 안정화제의 추가, 또는 예를 들어, 면역원성 조제물 또는 약학적으로 허용 가능한 조제물로의 배합으로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재를 배제한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
"특이적 결합 쌍"은 서로에 대해 특정한 특이성을 갖고 정상 조건에서 다른 분자보다 우선적으로 서로에 결합하는 특이적 결합 구성원 (sbm) 및 결합 파트너 (bp)를 포함한다. 특이적 결합 쌍의 예는 항원 및 항체, 리간드 및 수용체 그리고 상보적 뉴클레오타이드 서열이 있다. 당업자는 많은 다른 예들을 알고 있다. 또한, 용어 "특이적 결합 쌍"은 또한 특이적 결합 구성원 및 결합 파트너 중 하나 또는 둘 다가 큰 분자의 일부를 포함하는 경우 적용 가능하다. 특이적 결합 쌍이 핵산 서열을 포함하는 구체예에서, 그것들은 검정의 조건 하에서 서로 혼성체화하기 위한 길이, 바람직하게는 10개 초과의 뉴클레오타이드 길이, 더 바람직하게는 15 또는 20개 초과의 뉴클레오타이드 길이일 것이다.
"샘플" 또는 "환자 샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 일반적으로 특정 분자, 바람직하게는 림프 이상증-특이적 마커 분자, 예컨대 하기 제공된 표에서 나타난 마커에 대해 테스트될 수 있는 샘플을 나타낸다. 샘플은 세포, 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 림프, 타액, 눈물, 흉수 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"유전자형 서열 정보"는 일반적으로 대상체의 DNA 또는 RNA의 서열에 관한 임의의 정보를 나타낸다. 유전자형 서열 정보는 전체 게놈, 전체 엑솜(exome) 시퀀싱, 엑솜 시퀀싱, 또는 대상체의 게놈 내의 관심있는 영역의 표적화된 시퀀싱을 포함한다. 유전자형 서열 정보는 또한 특이적 SNV, 예컨대 림프 이상증과 관련된 것으로 본원에서 발견된 것들의 존재 또는 부재에 대한 데이터의 생성을 포함할 수 있다. 이에 더하여, 유전자형 서열 정보는 하나 이상의 림프 이상증-관련된 SNV의 존재 및/또는 발현을 검출하기 위한 프로브의 사용을 포함할 것이다. 유전자형 서열 정보를 얻기 위해 프로브가 사용될 수 있는 방법의 예는 (1) 제자리(in situ) 혼성체화; (2) 서던 혼성체화 (3) 노던 혼성체화; 및 (4) 각종 증폭 반응, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "작용제" 및 "테스트 화합물"은 본원에서 교체 가능하게 사용되고 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질, 예컨대 박테리아, 식물, 균류, 또는 동물 (특히 포유류) 세포 또는 조직으로부터 제조된 추출물을 나타낸다. 생물학적 거대분자는 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 펩타이드/DNA 복합체, 및 본원에 기재된 핵산 또는 그것들의 암호화된 단백질을 함유하는 SNV의 활성을 조절하는 능력을 나타내는 임의의 핵산 기반 분자를 포함한다. 예시의 작용제는, 제한되는 것이 아니라, 적어도 하나의 MEK 억제자를 포함한다. 추가적인 작용제는 또한 표 1-2에 나열된 것들을 포함한다. 작용제는 본원에서 하기 기재된 스크리닝 검정에 포함시킴으로써 잠재적인 생물학적 활성에 대해 평가된다.
"치료"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간을 포함한 포유동물에서 질환에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 커버하고, 질환 또는 질환 진행의 억제, 질환 또는 그 진행의 억제 또는 둔화, 질환 발달의 정지, 질환의 부분적 또는 전체적 완화, 질환 발병의 예방, 또는 질환 증상의 재발 방지를 포함한다. 예시의 치료는 효과적인 용량으로 적어도 하나의 MEK 억제자 및/또는 표 1-2에서 나열된 작용제 중 적어도 하나를 투여하는 것을 포함한다.
용어 "억제" 또는 "억제하다"는 임의의 이벤트 (예컨대 단백질 리간드 결합)의 감소 또는 중지 또는 임의의 표현형 특성의 감소 또는 중지 또는 상기 특성의 발생률, 정도, 또는 가능성의 감소 또는 중지를 포함한다. "감소시키거나" 또는 "억제하는" 것은 기준과 비교하여 활성, 기능, 및/또는 양을 감소시키거나, 감소시키거나 정지시키는 것이다. 억제 또는 감소기 완전할 필요는 없다. 예를 들어, 특정 구체예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 20% 또는 그 이상의 전체적인 감소를 유발하는 능력을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 50% 또는 그 이상의 전체적인 감소를 유발하는 능력을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상의 전체적인 감소를 유발하는 능력을 나타낸다.
용어 "억제자"는 특정 화학 반응, 신호전달 경로 또는 다른 과정을 늦추거나 방지하거나, 또는 특정 반응물, 촉매, 또는 효소의 활성을 감소시키는 작용제를 나타낸다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 인간을 포함한 포유동물을 의미하는 것으로 교체 가능하게 사용된다.
용어 "MEK"는 세포 표면 상의 수용체로부터 세포의 핵의 DNA까지 신호를 전달하는 세포 내 일련의 단백질을 포함하는 MAPK/ERK 경로 (Ras-Raf-MEK-ERK 경로로도 알려져 있음)를 나타낸다. 신호는 신호전달 분자가 세포 표면 상의 수용체에 결합할 때 시작하고 핵 내의 DNA가 단백질을 발현하고 세포에서 세포 분열과 같은 일부 변화를 생산할 때 끝난다. 경로는 MAPK (미토겐-활성화된 단백질 키나제, 원래는 ERK, 세포외 신호-조절된 키나제라고 불림)를 포함한 많은 단백질을 포함하며, 이것들은 이웃하는 단백질에 포스페이트 기를 추가함으로써 전달하고, 이것은 "켜짐(on)" 또는 "꺼짐(off)" 스위치의 역할을 한다.
용어 "MEK 억제자" 또는 "MEK/ERK 억제자"는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 효소 MEK1, MEK2, 및/또는 ERK를 억제하는 작용제를 나타낸다. 그것들은 종종 일부 암에서 과다 활성화되는 MAPK/ERK 경로에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다.용어 "세포 신호전달"은 mTOR 신호전달, 뿐만 아니라 세포 항상성 또는 활성을 지배하는 임의의 다른 신호 도입 경로를 포함할 것이다.
림프 이상증에 걸린 환자의 진단
일부 구체예에서, 림프 이상증에 걸린 환자는 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 유전자형 서열 정보를 얻은 후 SNV의 존재에 기초하여 진단된다. 일부 구체예에서, 림프 이상증에 걸린 환자는 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL로부터 선택된 유전자에서 하나 이상의 SNV, 또는 림프 이상증과 관련된 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL로부터 선택된 유전자에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV의 존재의 검출에 기초하여 진단된다. 일부 구체예에서, 이 하나 이상의 SNV는 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이 또는 표 3에서 나열된 돌연변이 중 어느 것이다.
일부 구체예에서, 특정 대상체에 존재하는 SNV(들)를 확인하는 보고서가 실험 데이터로부터 생성되었다. 일부 구체예에서, 림프 이상증에 대해 제안된 치료(들)을 확인하는 보고서가 유전자형 서열 정보를 사용하여 확인된 SNV(들)에 대한 데이터에 기초하여 생성될 수 있다.
일부 구체예에서, 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 유전자형 서열 정보를 얻은 후, PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF, 및 CBL로부터 선택된 유전자 내에서 하나 이상의 SNV, 또는 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL로부터 선택된 유전자에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV의 존재의 검출에 기초하는 진단은 환자에 대한 치료의 선택을 안내한다. 일부 구체예에서, 환자로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 유전자형 서열 정보를 얻은 후, PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL로부터 선택된 유전자에서의 하나 이상의 SNV, 또는 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1,EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL로부터 선택된 유전자에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV의 존재의 검출에 기초하는 진단은 환자에 대한 치료의 선택을 안내하지 않거나 그것에 영향을 미치지 않는다.
일부 구체예에서, 림프 이상증의 진단은 임상 발표, 스캐닝(scanning) 결과, 및/또는 가족력에만 기초하여 이루어진다. 일부 구체예에서, 림프 이상증의 진단은 유전자 서열 정보에 대한 테스트 없이 이루어진다. 일부 구체예에서, 림프 이상증의 진단은 유전자 서열 정보와 함께 임상 발표에 기초하여 이루어진다.
본 발며에서 개시된 림프 이상증-관련된 SNV는 림프 이상증을 진단하기 위한 많은 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 림프 이상증-관련된 SNV를 포함하는 핵산은 림프 이상증-특이적 마커의 존재 및/또는 발현을 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 림프 이상증-관련된 마커 핵산이 이러한 검정을 위한 프로브로서 이용될 수 있는 방법은 (1) 제자리 혼성체화; (2) 서던 혼성체화 (3) 노던 혼성체화; 및 (4) 각종 증폭 반응, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 림프 이상증-관련된 SNV, 또는 이에 의해 암호화되는 단백질을 검출하기 위한 검정은, 제한되는 것은 아니지만, 체액 (혈액, 소변, 혈청, 위 세척 포함), 임의의 유형의 세포 (예컨대 뇌 세포, 백혈구 세포, 단핵구 세포) 또는 신체 조직을 포함한 임의의 유형의 생물학적 샘플에서 실행될 수 있다.
림프 이상증-관련된 SNV-함유 핵산, 그것을 발현하는 벡터, 림프 이상증-관련된 SNV-함유 마커 단백질 및 항-림프 이상증-특이적 마커 항체는 신체 조직, 세포, 또는 유체에서 림프 이상증-관련된 SNV를 검출하고, 림프 이상증을 검출하고 진단할 목적을 위해 림프 이상증-관련된 SNV-함유 마커 단백질 발현을 변화시키는데 사용될 수 있다.
림프 이상증-관련된 SNV에 기초하여 림프 이상증을 검출 및/또는 진단하기 위한 방법이 포함된다. 방법은 림프 이상증-관련된 SNV를 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 샘플에서 림프 이상증-관련된 SNV 함유 핵산은 샘플에 존재하는 다른 서열과 비교하여 주형의 양을 증가시키기 위해, 예를 들어, PCR을 사용하여 초기에 증폭될 것이다. 이것은 표적 서열이 샘플에 존재하는 경우 높은 정도의 민감도로 검출될 수 있게 한다. 이 초기 단계는 해당 분야에서 점점 더 중요해지고 있는 고 민감도 배열 기술을 사용하여 방지될 수 있다.
대안으로, 새로운 검출 기술은 이 한계를 극복할 수 있고 총 RNA를 1 μg 정도만을 함유하는 작은 샘플의 분석을 가능하게 한다. 공명 광 산란 (Resonance Light Scattering: RLS) 기술을 사용하여, 전통적인 형광 발광 기술과는 대조적으로, 다수의 판독은 비오틴-라벨링된 혼성체화된 표적 및 항-비오틴 항체를 사용하여 소량의 mRNA를 검출할 수 있다. PCR 증폭에 대한 또 다른 대안은 신호 대 잡음 비(signal-to-noise ratio)를 증가시키고 백그라운드 간섭을 감소시키기 위해 플레이너형 도파관 기술 (planar wave guide: PWG)을 수반한다. 두 기술은 Qiagen Inc. (USA)으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
따라서, 상기 언급된 기술 중 어느 것도 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현을 검출 또는 정량화하고 따라서 림프 이상증 또는 그것의 발달 위험을 진단하는데 사용될 수 있다.
림프 이상증에 걸린 환자의 치료
림프 이상증 표현형을 조절하는데 있어서 본원에서 기재된 림프 이상증-관련된 SNV에 의해 수행되는 역할의 설명은 림프 이상증의 치료에 유용한 기존의 요법의 재창출, 및 새로운 요법의 개발을 촉진한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 림프 이상증에 걸린 환자에게 하나 이상의 mTOR 억제자, 하나 이상의 PIK3K 억제자, 및/또는 하나 이상의 MEK 억제자 (예를 들어, 표 1-2의 작용제 중 하나 이상)을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 치료되는 림프 이상증에 걸린 환자는 림프 이상증의 증상 및 양성 가족력에 기초하여 진단되었다. 일부 구체예에서, 다양한 스캐닝 기술, 예컨대 일반 막 방사선 촬영, 골 스캐닝, 전산화 단층촬영, 자기 공명 이미지화, 및 림프 섬광 조영술이 임상 발표와 함께 림프 이상증을 진단하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 림프 이상증을 진단하기 위해 생검이 수행된다. 일부 구체예에서, 림프 이상증은 림프관 과증식에 기초하여 진단된다. 일부 구체예에서, 림프 이상증은 림프관의 비정상적인 형성에 기초하여 진단된다. 일부 구체예에서, 림프 이상증은 심막, 늑막, 또는 복막 삼출을 포함한 유미 삼출증에 기초하여 진단된다.
일부 구체예에서, 치료되는 림프 이상증에 걸린 환자는 본원에서 기재된 진단 방법에 따라 진단되었다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 MEK 억제자 (예를 들어, 표 1-2의 작용제 중 하나 이상; 실시예 II)는 림프 이상증을 치료하기 위한 의약의 제조에 유용하다. 하나 이상의 작용제(들)는 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질과 함께 제제화될 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고 활성 성분의 효험을 방해해서는 안 된다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 에어로졸화, 근육내, 및 복막내 경로에 따라 다를 수 있다. 림프 이상증-관련된 돌연변이를 포함하는 시험관 내 시스템 또는 트랜스제닉 유기체가 인간의 치료를 위한 특정 작용제를 선택하는데 사용될 수 있다.
치료에 유용한 작용제는, 제한되는 것은 아니지만, 표 1 및 2의 작용제를 포함한다. 일부 작용제는 표 1 및 2 둘 다에 나열되어 있고, 작용제들이 두 표 모두에 나열되지 않다는 사실이 아무런 의미를 주어서는 안 된다.
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Figure pct00002
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표 2는 단독으로, 또는 림프 이상증을 치료하기 위해 표 1 또는 표 2의 작용제 중 어느 것과도 조합하여 사용될 수 있는 작용제를 제공한다.
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림프 이상증에 걸린 개체를 치료하기 위해서, 또는 질환의 징후 또는 증상을 경감시키기 위해서, 본원에 개시된 유전자를 표적화하는 적합한 작용제는 환자에게 치료적 이점을 제공하기 위해 조합하여 투여될 수 있다. 이러한 작용제는 유효 용량으로 투여되어야 한다.
유전적 변화(들)가 확인되면, 요법은 변화된 유전자에 의해 영향을 받는 생물학적 및 신호전달 경로를 조절하도록 고안된다. 예를 들어, MAPK (MEK1/MEK2) 및 ERK 경로를 억제하는 것이 바람직한 경우에, MEK 억제자는 단독으로 또는 다른 MEK/ERK 억제자와 조합하여 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 치료는 PIK3K 억제자와 함께 표 1 또는 2에서 나열된 작용제, 예컨대 mTOR 억제자의 투여를 수반한다. 다른 구체예에서, mTOR 및 MEK/ERK 억제자는 환자에게 치료적 이점을 제공하도록 조합된다. 또 다른 접근법에서, PIK3K 및 MEK/ERK 억제자는 질환의 증상을 개선하기 위해 조합된다. 본원에서 기재된 특이적 ARAF 기능 획득 돌연변이에 대하여, 효과적인 요법은 MEK/ERK 억제자의 투여를 포함한다. 상기 기재된 조합 요법은 첨가제 방식으로 작용할 수 있다. 다른 구체예에서, 조합된 작용제는 상승작용하여 증상을 경감시킨다.
먼저, 생물학적 샘플, 및/또는 유전자형 분석 정보가 환자로부터 얻어질 수 있다. 샘플에 존재하는 핵산으로부터 얻어진 유전 정보는, 예를 들어, 림프 이상증-관련된 SNV의 존재 또는 부재에 대해 평가될 것이다. 림프 이상증 위험 또는 질환의 존재를 나타내는 이들 돌연변이의 존재는, 영향을 받은 유전자의 동시 확인과 함께, 임상의에게 치료제가 적절한지에 대한 지침을 제공한다. 전체 치료 용량 또는 용량들 (둘 이상의 표적이 조절될 때)은 단일 용량으로 대상체에게 투여될 수 있거나 세분화된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있으며, 여기서 다회수/별개의 용량은 더 연장된 기간 동안, 예를 들어, 1일 투약량의 투여를 허용하는 일수의 기간 동안 또는 원하는 기간보다 용량을 투여하기 위한 더 긴 기간 동안 투여된다. 당업자는 대상체에서 유효 용량을 얻는데 필요한 림프 이상증 작용제의 양이 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태, 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여되는 치료 횟수를 포함한 많은 요인들에 따라 다르다는 것을 알고 있을 것이다. 이들 요인을 고려하여, 당업자는 림프 이상증에 걸린 개체를 치료하기 위한 유효 용량을 얻기 위해 특정 용량을 조정할 것이다.
림프 이상증 치료제(들)의 유효 용량은 투여 방식, 및 치료되는 개체의 중량에 따라 다를 것이다. 본원에서 기재된 투약량은 일반적으로 평균의 성인을 위한 것이지만 아동의 치료를 위해 조정될 수 있다. 용량은 일반적으로 약 0.001 mg 내지 약 1000 mg의 범위에 있을 것이다.
림프 이상증, 특히, 더 심각한 형태의 질환으로 고통받고 있는 개체에서, 림프 이상증 치료제의 투여는, 예를 들어, 이러한 질환을 치료하기 위한 통상적인 작용제와 조합으로 투여될 때 특히 유용할 수 있다. 당업자는 림프 이상증 치료제(들)를 단독으로 또는 조합하여 투여할 것이고 폐, 창자, 갑상선, 또는 염증 기능 결정, 방사선학적 또는 면역학적 검정, 또는 지시된 경우, 조직병리학적 방법과 같은 일상적인 방법을 사용하여 이러한 처리의 효과를 모니터링할 것이다. 림프 이상증의 치료를 위한 다른 작용제는 질환을 근본으로 하는 증상을 경감시키기 위해 전신 화학 요법, 인터페론 알파 요법, 방사선 요법, 또는 수술을 포함한다.
약학적 조제물의 투여는 바람직하게는 개체에 이점을 나타내기에 충분한 "유효량"으로 이루어진다. 이 양은 환자에서 림프 이상증 증상을 예방하거나, 경감시키거나, 약화시키거나, 또는 그렇지 않으면 감소시킨다. MEK 억제자 및/또는 표 1-2의 작용제의 유효량으로 림프 이상증에 걸린 환자를 치료하는 것은 림프 구조의 개선, 유미 늑막 삼출의 감소, 호흡 기능의 개선, 부수적인 약제 사용의 점감, 및/또는 생존의 증가를 생산할 수 있다.
약학적 조제물은 투여의 용이함 및 투약량의 균일성을 위해 투약 단위 형태로 제제화된다. 투약 단위 형태는, 본원에서 사용된 바와 같이, 치료받고 있는 환자에 적절한 약학적 조제물의 물리적으로 별개의 단위를 나타낸다. 각각의 투약량은 선택된 약학적 담체에 관하여 원하는 효과를 생산하도록 계산된 활성 성분의 양을 함유해야 한다. 적절한 투약 단위를 결정하는 과정은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
투약 단위는 환자의 중량에 기초하여 비례하게 증가하거나 감소할 수 있다. 특정 병리학적 병태의 경감에 적절한 농도는, 해당 분야에 공지된 바와 같이, 투약 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 약학적 조성물은 비경구, 경구 고체 및 액체 제제로, 피하로, 피내로, 근육내로, 설하로, 국소적으로, 귀로 (OTIC), 볼로, 결막으로, 피부로, 치아로, 전기삼투(electro-osmosis)를 통해, 자궁경내로, 부비강 또는 기도를 통해, 장, 경막외로, 침윤을 통해, 세포 사이로, 복강내로, 동맥내로, 관절내로, 담관내로, 기관지내로, 활액낭내로, 심장내로, 연골내로, 꼬리내로, 해면내로, 강내로, 대뇌내로, 피내로, 림프내로, 심막내로, 복막내로, 비강으로, 경피로, 호흡기관으로, 눈으로, 좌제, 에어로졸, 국소적 또는 다른 공지된 투여경로로 전신으로 투여될 수 있다. 림프 이상증을 치료하는데 유용한 작용제(들)에 더하여, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약물 투여를 향상시키고 용이하게 하는 것으로 알려져 있는 다른 성분을 함유할 수 있다. 따라서, 이러한 조성물은 선택적으로 다른 구성요소, 예컨대 보조제, 예를 들어, 알루미늄 및 마그네슘 하이드록시드의 수성 현탁액, 및/또는 다른 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 식염수를 함유할 수 있다. 다른 가능한 제제, 예컨대 나노입자, 리포솜, 재밀봉된 적혈구, 및 면역학 기반 시스템이 또한 본 발명의 방법에 따라 환자에게 적절한 작용제를 전달/투여하는데 사용될 수 있다. 이러한 작용제를 전달하기 위한 나노입자의 사용, 뿐만 아니라 사용될 수 있는 세포막 투과성 펩타이드 담체는 Crombez et al., Biochemical Society Transactions v35:p44 (2007)에 기재되어 있다.
림프 이상증을 치료하는데 유용한 작용제(들)의 투여는 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현을 성공적으로 검출 또는 정량화하고, 그에 따라 림프 이상증 또는 그것의 발달 위험을 진단한 이후에 실행될 수 있다. 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현의 검출 또는 정량화는 치료에 사용된 특이적 작용제의 선택을 안내할 수 있다. 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현의 검출 또는 정량화는 특정 치료가 주어진 대상체에 적절하지 않다는 것을 나타낼 수 있다.
다른 구체예에서, 림프 이상증에 대한 치료는 질환의 임상적 진단에 기초하여 실행될 수 있고 치료는 유전자 서열 정보의 검출 또는 정량화의 부재시 시작될 수 있다. 다른 구체예에서, 림프 이상증에 대한 치료는 질환의 임상적 진단에 기초하여 실행될 수 있고 치료는 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현의 검출 또는 정량화의 부재시 시작될 수 있다.
다른 구체예에서, 림프 이상증에 대한 치료는 질환의 임상적 진단에 기초하여 실행될 수 있고 치료는 림프 이상증-관련된 SNV 마커 발현이 대조군과 상이하지 않을 때 시작될 수 있다.
일부 구체예에서, 치료는 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL에서 SNV를 갖지 않은 환자에서 투여된다.
일부 구체예에서, 억제자는 미토겐-활성화된 단백질 키나제 효소 MEK1 및/또는 MEK2를 억제하는 MEK1/2 억제자이다. 그것들은 종종 일부 암 및 다른 장애에서 과활성화되는 MAPK/ERK 경로에 영향을 미치는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 동시-투여되는 작용제(들)는 라파마이신 또는 BEZ-235 (닥톨리십)이다. 라파마이신, mTOR 억제자는 시롤리무스로도 알려져 있다. 닥톨리십 또는 NVP-BEZ235로도 알려져 있는 BEZ-235는 p110, PI3K, 및 mTOR에 대해 공지된 활성을 가진 화합물이다.
일부 구체예에서, 치료 방법에서 투여되는 작용제는 라파마이신 (시롤리무스), 에버롤리무스 (RAD001), AZD8055, 템시롤리무스 (CCI-779, NSC 683864), KU-0063794, MHY1485, BEZ235 (NVP-BEZ235, 닥톨리십), PI-103, 토르키닙 (PP242), 타크롤리무스 (FK506), 리다포롤리무스 (데포롤리무스, MK-8669), INK 128 (MLN0128), 복스탈리십 (SAR245409, XL765), 토린 1, 오미팔리십 (GSK2126458, GSK458), OSI-027, PF-04691502, 아피톨리십 (GDC-0980, RG7422), GSK1059615, 게다톨리십 (PF-05212384, PKI-587), WYE-354, AZD2014, 토린 2, WYE-125132 (WYE-132), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, 조타롤리무스 (ABT-578), 타크롤리무스 (FK506), BGT226 (NVP-BGT226), 팔로미드 529 (P529), 및 크리소판산으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 투여되는 작용제는 셀루메티닙 (AZD6244). PD0325901, 트라메티닙 (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), 피마세르팁 (AS-703026), TAK-733, AZD8330, 비니메티닙 (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, 레파메티닙 (RDEA119, Bay 86-9766), 및 코비메티닙 (GDC-0973, RG7420)으로부터 선택된 MEK 억제자이다.
상기 기재된 작용제의 조합은 또한 림프 이상증을 치료하기 위한 본원에서 기재된 치료 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 하기 조합은 추가적으로 작용하거나 또는 상승 작용하여 GLA 및 LAM을 포함한 림프 이상증을 치료할 수 있다. 특정 구체예에서, 투여를 위한 조합은 1) 리다포롤리무스 및 트라메티닙; 2) 리다포롤리무스 및 셀루메티닙 또는 코비메티닙; 3) BEZ235 및 셀루메티닙; 4) 오미팔리십 및 셀루메티닙 또는 트라메티닙; 5) 에버롤리무스 및 트라메티닙 또는 셀루메티닙; 6) 시롤리무스, 리다포롤리무스 및 셀루메티닙; 7) 시롤리무스, 리다포롤리무스 및 트라메티닙; 8) 토르키닙 및 트라메티닙; 9) BEZ235, 토르키닙 및 트라메티닙; 및 10) 시롤리무스 및 게다톨리십 및 트라메티닙으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본원에서 나열된 작용제(들)로의 처리는 전신 화학 요법, 인터페론 알파, 방사선 요법, 및/또는 수술 중 하나 이상과 조합하여 사용된다.
추가적인 유용한 치료 시약을 확인하는 방법
본워에서 확인된 SNV가 림프 이상증의 병인과 관련이 있기 때문에, 이러한 SNV를 함유하는 유전자 및 그것의 암호화된 생성물의 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법은 이 병태의 치료에 효과적인 치료제의 생성을 초래해야 한다.
본원에서 기재된 염색체 영역은 그 활성을 조절하는 치료제의 합리적인 디자인을 위해 적합한 표적을 제공하는 단백질 암호화 영역을 함유한다. 이들 영역에 상응하는 작은 펩타이드 분자는 암호화된 단백질의 활성을 효과적으로 조절하는 치료제의 디자인에 유리하게 사용될 수 있다.
분자적 모델링은 입체 구조 또는 기능에 필요한 핵심 아미노산 잔기에 기초하여 SNV-함유 핵산에 의해 암호화된 단백질의 활성 부위에 결합하는 능력을 가진 특정 유기 분자의 확인을 용이하게 해야 한다. 조합적 화학적 접근법은 가장 큰 활성을 가진 분자를 확인하는데 사용될 것이고 추가의 스크리닝 주기 동안에 이들 분자의 반복이 개발될 것이다. 특정 구체예에서, 후보 약물은 합성 또는 천연 화합물의 큰 라이브러리로부터 스크리닝될 것이다. 한 예는 인간에 의해 사용될 수 있는 화합물의 FDA 승인된 라이브러리이다. 이에 더하여, 화합물 라이브러리는, 제한되는 것은 아니지만, Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Microsource (New Milford, CT), Aldrich (Milwaukee, WI), AKos Consulting and Solutions GmbH (Basel, Switzerland), Ambinter (Paris, France), Asinex (Moscow, Russia), Aurora (Graz, Austria), BioFocus DPI, Switzerland, Bionet (Camelford, UK), ChemBridge, (San Diego, CA), ChemDiv, (San Diego, CA), Chemical Block Lt, (Moscow, Russia), ChemStar (Moscow, Russia), Exclusive Chemistry, Ltd (Obninsk, Russia), Enamine (Kiev, Ukraine), Evotec (Hamburg, Germany), Indofine (Hillsborough, NJ), Interbioscreen (Moscow, Russia), Interchim (Montlucon, France), Life Chemicals, Inc. (Orange, CT), Microchemistry Ltd. (Moscow, Russia), Otava, (Toronto, ON), PharmEx Ltd.(Moscow, Russia), Princeton Biomolecular (Monmouth Junction, NJ), Scientific Exchange (Center Ossipee, NH), Specs (Delft, Netherlands), TimTec (Newark, DE), Toronto Research Corp. (North York ON), UkrOrgSynthesis (Kiev, Ukraine), Vitas-M, (Moscow, Russia), Zelinsky Institute, (Moscow, Russia), 및 Bicoll (Shanghai, China)을 포함하는 다수의 회사로부터 상업적으로 이용 가능하다.
박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물에서 천연 화합물의 라이브러리는 상업적으로 이용 가능하거나 해당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 천연 공급원, 예컨대 동물, 박테리아, 균류, 잎 및 껍질을 포함한 식물 공급원, 및 해양 샘플으로부터 단리된 화합물은 잠재적으로 유용한 약학적 작용제의 존재에 대한 후보로서 분석될 수 있다. 스크리닝되는 약학적 작용제가 또한 화학적 조성물 또는 인공 화합물로부터 유래되거나 합성될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 여러 상업적 라이브러리가 스크리닝에 사용될 수 있다.
약물 스크리닝 검정에서 이용된 폴리펩타이드 또는 단편은 용액 내에 없을 수도 있으며, 고체 지지체에 또는 세포 내에 부착된다. 약물 스크리닝의 한 방법은, 바람직하게는 경쟁적 결합 검정에서, 폴리펩타이드 또는 단편을 발현하는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 안정하게 형질전환된 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포를 이용한다. 살아있는 형태 또는 고정된 형태의 이러한 세포가 표준 결합 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 단편과 테스트되는 작용제 사이의 복합체 형성을 결정하거나, 또는 폴리펩타이드 또는 단편과 공지된 기질 사이의 복합체의 형성이 테스트되는 작용제에 의해 방해되는 정도를 검사할 수 있다.
약물 스크리닝을 위한 추가의 기술은 비기능적이거나 변화된 림프 이상증-관련된 유전자를 가진 숙주 진핵생물 세포주, 세포 (예컨대 내피 세포) 또는 전체 동물 모델 (예를 들어, 트랜스제닉 마우스 또는 제브라피쉬)의 사용을 수반한다. 어떤 경우에는, 트랜스제닉 유기체는 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K의 돌연변이, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G 또는 표 3에서 나타난 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 복합 돌연변이를 가진 세포를 포함한다. 이들 숙주 세포주, 세포 또는 트랜스제닉 동물은 폴리펩타이드 수준에 결함이 있다. 숙주 세포주 또는 세포는 약물 화합물의 존재시 성장한다. 예를 들어, 제브라 피쉬 모델에서, 꼬리 및/또는 D/V 혈관 구조의 구제가 평가될 수 있다. 추가적으로, 숙주 세포주에서 mTOR에 의한 인산화의 유도가 평가될 수 있다.
약물 스크리닝의 예시의 방법은 표 1-2에서 나열된 작용제와 같은 세포 신호전달은 변화시키는 작용제를 확인하기 위한 방법일 것이다. 이 방법은 적어도 하나의 림프 이상증-관련된 SNV를 포함하는 적어도 하나의 핵산을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 림프 이상증-관련된 SNV에 상응하는 동족 야생형 서열을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 적어도 하나의 림프 이상증-관련된 SNV를 발현하는 세포 및 동족 야생형 서열을 발현하는 세포를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계; 및 상기 작용제가 세포 신호전달을 변화시키는지 분석하는 단계를 포함할 것이다.
본 발명의 림프 이상증-관련된 SNV 또는 그것의 기능적 단편을 발현하는 숙주 세포는 림프 이상증의 발달을 조절하는 능력에 대해 잠재적인 화합물 또는 작용제를 스크리닝하는 시스템을 제공한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 림프 이상증 및 비정상적인 혈관 형성과 관련된 비정상적인 MAPK 신호전달의 양태를 조절하는 작용제를 확인하기 위한 검정에서 사용하기 위한 재조합 세포주를 생성하는데 사용될 수 있다. 또한 SNV-함유 핵산에 의해 암호화된 단백질의 기능을 조절할 수 있는 화합물에 대해 스크리닝하는 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 접근법은 파지 표면 상에 핵산을 함유하는 SNV에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편을 발현하도록 조작된 파지 디스플레이 라이브러리의 사용을 수반한다. 이러한 라이브러리는 발현된 펩타이드와 화학적 라이브러리의 구성요소 간의 결합 친화도가 검출될 수 있는 조건 하에서 조합적 화학적 라이브러리와 접촉된다. 미국 특허 6,057,098 및 5,965,456은 이러한 검정을 수행하기 위한 방법 및 장치를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 림프 이상증-관련된 변화된 핵산의 이용 가능성은 본 발명의 변화된 핵산을 가지고 있는 실험실 마우스 계통의 생산을 가능하게 한다. 이들 림프 이상증-관련된 변화된 핵산은 PTPN11 유전자에서의 c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G 또는 표 3에서 나타난 다른 돌연변이를 포함하는 복합 돌연변이일 수도 있다. 본 발명의 림프 이상증-관련된 돌연변이를 발현하는 트랜스제닉 마우스는 림프 이상증으로의 발달 및 진행에 있어서 돌연변이된 핵산에 의해 암호화된 단백질의 역할을 검사하는 모델 시스템을 제공한다. 실험실 마우스에서 전이유전자를 도입하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 세 가지 일반적인 방법은 다음을 포함한다: 1. 초기 배아로의 관심있는 외래 유전자를 암호화하는 레트로바이러스 벡터의 통합; 2. 새로 수정된 난(egg)의 전핵으로의 DNA의 주사; 및 3. 초기 배아로의 유전적으로 조작된 배아 줄기 세포의 통합.
상기 기재된 트랜스제닉 마우스의 생산은 림프 이상증 표현형과 관련된 다양한 과정에서 표적 단백질이 수행하는 역할의 분자적 설명을 용이하게 할 것이다. 이러한 마우스는 전체 동물 모델에서 추정 치료 약물을 연구하기 위한 생체 내(in vivo) 스크리닝 도구를 제공하고 본 발명에 의해 포함된다.
용어 "동물"은 인간을 제외한 모든 척추동물을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 또한 배아기 및 태아기를 포함한 모든 발달 단계의 개개의 동물을 포함한다. "트랜스제닉 동물"은 세포 이하 수준에서의 의도적인 유전적 조작에 의해, 예컨대 표적화된 재조합 또는 재조합 바이러스로의 미량 주사 또는 감염에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 변화되거나 수신된 유전 정보를 가지고 있는 하나 이상의 세포를 함유하는 임의의 동물이다. 용어 "트랜스제닉 동물"은 고전적인 이종 교배 또는 시험관 내 수정을 포함하는 것이 아니라, 하나 이상의 세포가 재조합 DNA 분자에 의해 변화되거나 이것을 수신하는 동물을 포함하는 것을 의미한다. 이 분자는 정의된 유전적 유전자좌에 특이적으로 표적화되거나, 염색체 내에 무작위로 통합되거나, 또는 염색체 외에서 DNA를 복제할 수도 있다. 용어 "생식 세포주 트랜스제닉 동물"은 유전적 변화 또는 유전 정보가 생식 계열 세포로 도입되어, 자손에게 유전 정보를 전달하는 능력을 부여하는 트랜스제닉 동물을 나타낸다. 실제로, 이러한 자손이 상기 변화 또는 유전 정보 중 일부 또는 전부를 소유하는 경우, 그것들 또한 트랜스제닉 동물이다.
유전 정보의 변화는 수령체가 속한 동물의 종에 대해 이질적이거나, 특정 개개의 수령체에 대해서만 이질적이거나, 또는 수령체에 의해 이미 소유된 유전 정보일 수 있다. 마지막 경우에, 변화된 또는 도입된 유전자는 고유한 유전자와 상이하게 발현될 수 있다. 이러한 변화된 또는 외래의 유전 정보는 변화된 림프 이상증-관련된 뉴클레오타이드 서열의 도입을 포함할 것이다.
표적 유전자를 변화시키는데 사용된 DNA는, 제한되는 것이 아니라, 게놈 공급원으로부터의 단리, 단리된 mRNA 주형으로부터 cDNA의 제조, 직접 합성, 또는 이것들의 조합을 포함한 다양한 기술에 의해 얻어질 수 있다.
전이유전자 도입을 위한 표적 세포의 한 가지 유형은 배아 줄기 세포 (ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양된 착상 전 배아로부터 얻어질 수 있다 (Evans et al., (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al., (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069). 전이유전자는 DNA 트랜스펙션과 같은 표준 기술에 의해 또는 레트로바이러스-매개된 형질도입에 의해 효과적으로 ES 세포로 도입될 수 있다. 결과로 생성된 형질전환된 ES 세포는 그 이후 비-인간 동물의 배반포(blastocyst)와 조합될 수 있다. 도입된 ES 세포는 그 이후 배아에 콜로니를 형성하고 결과로 생성된 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다.
개개의 유전자 및 그 발현 생성물의 기여를 결정하는 문제에 대한 한 가지 접근법은 단리된, 돌연변이-함유 림프 이상증-관련된 유전자를 전능(totipotent) ES 세포 (예컨대 상기 기재된 것들)에서 야생형 유전자를 선택적으로 비활성화시키기 위한 삽입 카세트로서 사용한 다음 트랜스제닉 마우스를 생성하는 것이다. 유전자-표적화된 트랜스제닉 마우스의 생성에서 유전자-표적화된 ES 세포의 사용이 기재되어 있고, 다른 곳에서도 검토된다 (Frohman et al., (1989) Cell 56:145-147; Bradley et al., (1992) Bio/Technology 10:534-539).
기술들은 특정 변화를 염색체 대립유전자로 삽입하기 위해 표적화된 상동 재조합을 사용함으로써 임의의 유전자 영역을 비활성화시키거나 원하는 돌연변이로 변화시키는데 이용 가능하다. 하지만, 100%에 가까운 빈도로 발생하는 상동성 염색체외 재조합과 비교하면, 상동성 플라스미드-염색체 재조합은 원래 10-6 내지 10-3의 빈도로만 검출되는 것으로 보고되었다. 비-상동성 플라스미드-염색체 상호작용은 비슷한 상동성 삽입보다 105배 내지 102배 더 높은 수준으로 더 빈번하게 발생한다.
쥐 ES 세포에서 이러한 낮은 비율의 표적화된 재조합을 극복하기 위해서, 희귀 상동 재조합을 검출하거나 선택하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 상동성 변화 이벤트를 검출하기 위한 한 가지 접근법은 상동성 삽입을 위해 형질전환 세포의 풀(pool)을 스크리닝한 후 이어서, 개개의 클론을 스크리닝하기 위한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용한다. 대안으로, 상동성 삽입이 일어날 때에만 활성이어서, 이들 재조합을 직접적으로 선택할 수 있게 하는 마커 유전자가 구성되는 양성 유전자 선택 접근법이 개발되었다. 상동 재조합을 선택하기 위해 개발된 가장 강력한 접근법 중 하나는 변화의 직접적인 선택이 존재하지 않는 유전자에 대한 양성-음성 선택 (PNS) 방법이다. PNS 방법은 마커 유전자가 자체의 프로모터를 갖기 때문에 높은 수준으로 발현되지 않는 유전자를 표적화하는데 더 효율적이다. 비-상동 재조합은 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK) 유전자를 사용하고 간시클로비르 (GANC) 또는 (1-(2-데옥시-2-플루오로-B-D 아라비노플루라노실)-5-아이오도-우라실 (FIAU)과 같은 효과적인 헤르페스 약물을 이용한 비상동성 삽입에 대해 선택함으로써 선택된다. 이 역선택(counter selection)에 의해, 생존하는 형질전환물에서 생동 재조합의 수가 증가할 수 있다. 표적화된 삽입 카세트로서 돌연변이된 림프 이상증-관련된 핵산을 이용하는 것은, 예를 들어, EPHB4 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 면역학적으로 특이적인 항체에 대한 면역반응성의 습득에 의해 가시화된 것으로 성공적인 삽입을 검출하기 위한 수단을 제공하며, 그러므로, 원하는 유전자형을 가진 ES 세포의 스크리닝/선택을 용이하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 넉인(knock-in) 동물은, 예를 들어, 내인성 쥐 유전자가 본 발명의 인간 림프 이상증-관련된 유전자로 대체된 것이다. 이러한 넉인 동물은 림프 이상증의 발달을 연구하기 위한 이상적인 모델 시스템을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 돌연변이된 림프 이상증-관련된 핵산, 그것의 단편, 또는 림프 이상증-관련된 융합 단백질의 발현은 림프 이상증-관련된 핵산 전부 또는 그 일부를 암호화하는 핵산 서열이 특정 조직 또는 세포 유형에서 암호화된 단백질의 발현을 지시하는 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)에 작동 가능하게 연결된 벡터를 사용하여 "조직 특이적 방식" 또는 "세포 유형 특이적 방식"으로 표적화될 수 있다. 이러한 조절 요소는 시험관 내 및 생체 내 적용 둘 다에 대해 유리하게 사용될 수 있다. 조직 특이적 단백질을 지시하기 위한 프로모터는 해당 분야에 널리 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 대안으로, 전이유전자는 조직 특이적 방식 또는 "전신" 방식으로 기능할 수 있는 유도성 프로모터의 제어 하에 있다.
본 발명의 림프 이상증-관련된 돌연변이를 암호화하는 핵산 서열은 트랜스제닉 동물에서 발현을 위한 다양한 상이한 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 프로모터는 원하는 세포 유형에서 전이유전자의 발현을 위해 프리온(prion) 유전자 프로모터, 예컨대 햄스터 또는 마우스 Thy-1 프로모터; PGK 프로모터; 또는 CMV 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 트랜스제닉 마우스에 대한 사용 방법이 또한 본원에서 제공된다. 돌연변이된 림프 이상증-관련된 핵산을 함유하는 핵산 또는 그것의 암호화된 단백질이 도입된 트랜스제닉 마우스는, 예를 들어, 림프 이상증의 발달을 조절할 수 있는 것들을 확인하기 위한 치료제를 스크리닝하기 위한 스크리닝 방법을 개발하는데 유용하다.
검출 제품 및 키트
림프 이상증 SNV를 검출하는데 유용한 조성물 또는 제품이 포함된다. 예를 들어, 림프 이상증-관련된 SNV-함유 핵산, 그것을 발현하는 벡터, 림프 이상증-관련된 SNV-함유 마커 단백질 및 항-림프 이상증-특이적 마커 항체는 PTPN11 유전자에서의 SNV c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이를 검출할 수 있는 제품이다. PTPN11 유전자에서의 SNV c.1504T>G:pS502A, c.1510A>G:pM504V, 및/또는 c.1507G>C:pG503R, KRAS에서의 c.35G>A:pG12D, BRAF 유전자에서의 c.1403T>C:pF468S, SOS1 유전자에서의 c.2536G>A:pE846K, 및 ITGA9 유전자에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G를 포함하는 복합 돌연변이를 검출하기에 충분한 길이 및 특성을 가진 핵산 프로브가 또한 포함된다. 그것들이 검출될 수 있도록 검출 제품이 라벨링될 수 있다.
림프 이상증-관련된 SNV를 검출하는데 유용한 임의의 제품이 키트에 포함될 수 있다. 림프 이상증을 치료하는데 유용한 임의의 제품이 키트에 포함될 수 있다. 이러한 검출 및 치료 제품을 함유하는 키트가 포함된다. 키트는 림프 이상증-관련된 SNV 특이적 마커 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 고체 지지체 상에 고정된 이러한 마커, 유전자 칩, 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 라벨, 마커, 리포터, 약학적으로 허용 가능한 담체, 생리학적으로 허용 가능한 담체, 사용 설명서, 용기, 투여용 그릇, 검정 기질, 또는 이것들의 임의의 조합 중 하나 또는 컬렉션을 함유할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시하기 위해 제공된다. 그것들은 어떤 방법으로도 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 I
다른 림프관 기형에 대해 기재된 바와 같이, CCLA는 림프 발달의 선천성 오류의 결과이다. CCLA의 유전적 근거를 확인하기 위해서, 발명자들은 이 환자군의 더 양호한 진단을 허용하는 새로운 고급 이미지화 기술인 동적 대비 자기 공명 림프관 조영도 (DCMRL)에 의해 이미지화된 이형 림프관(dysmorphic 림프s)을 모두 가진 7명의 환자의 DNA 샘플에서 전체 엑솜 시퀀싱을 수행하였다. 발명자들은 5명의 환자를 아마도 표현형을 설명할 수 있는 미스센스(missense), 넌센스(nonsense), 스플라이싱-변화(splice-altering), 및 암호화 삽입-결실(indel) 돌연변이에 대해 검사하였다. 결과는 동의의 변이체, 0.5%보다 높은 소량 대립유전자 빈도 (minor allele frequency: MAF)를 가진 변이체, 및 발명자들의 사내(in-house) 엑솜 변이체 데이터베이스에 의해 대조군에서 사전 확인된 변이체를 배제하도록 필터링되었다. 매뉴얼 큐레이션(curation)을 위해 적절한 후보를 선출했다. 결과로서, 발명자들은 4개의 상이한 유전자 (PTPN11, KRAS, BRAF, 및 SOS1)에서 1개의 체세포 및 5개의 데 노보(de novo) 미스센스 돌연변이를 확인하였으며 이것들은 모두 Ras/MAPK 신호전달 경로에 수반된다 (표 3). 일반적으로, ITGA9 내의 2개의 이형접합성 변이체, c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G가 원발성 림프 부종 및 역방향 림프 흐름을 가진 1명의 환자에서 발견되었다. ITGA9는 세포-세포 부착 및 세포-매트릭스 상호작용을 매개하는 세포 표면 당단백질인 인테그린 알파-9를 암호화한다. 인테그린 알파-9는 VEGF-C에 결합하고 Itga9의 비활성화는 마우스에서 유미흉증을 유발하고 림프 밸브 형성을 방해한다.
이들 단백질 각각에 대한 서열은 NCBI 데이터베이스에서 발견할 수 있고 하기 제시된다.
a) PTPN11 내의 c.1504T>G:pS502A;
NCBI 참조 서열에 존재하는 S502: NP_002825.3
b) PTPN11 내의 c.1510A>G:pM504V;
NCBI 참조 서열에 존재하는 M504: NP_002825.3
c) PTPN1 내의 c.1507G>C:pG503R;
NCBI 참조 서열에 존재하는 G503: NP_002825.3
d) KRAS 내의 c.35G>A:pG12D;
NCBI 참조 서열에 존재하는 G12: NP_203524.1
e) BRAF 내의 c.1403T>C:pF468S;
NCBI 참조 서열에 존재하는 F 468: NP_004324.2
f) SOS1 내의 c.2536G>A:pE846K;
NCBI 참조 서열에 존재하는 E 846: NP_005624.2
g) ITGA9 내의 c.1236+4A*>G 및 c.289T>G:p.C97G;
NCBI 참조 서열에 존재하는 pC97: NP_002198.2.
*변이체는 엑손-인트론 접합부로부터 4-bp 떨어져있고 인트론에 존재한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
NM_002834.3:381-2162 호모 사피엔스(Homo sapiens) 단백질 티로신 포스파타제, 비-수용체 11형 (PTPN11), 전사물 변이체 1, mRNA
Figure pct00009
>NM_004985.4:193-759 호모 사피엔스 KRAS 원 종양 형성 유전자, GTPase (KRAS), 전사물 변이체 b, mRNA
Figure pct00010
>NM_004333.4:62-2362 호모 사피엔스 B-Raf 원 종양 형성 유전자, 세린/트레오닌 키나제 (BRAF), mRNA
Figure pct00011
>NM_005633.3:42-4043 호모 사피엔스 SOS Ras/Rac 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자 1 (SOS1), mRNA
Figure pct00012
Figure pct00013
>NM_002207.2:54-3161 호모 사피엔스 인테그린 서브유닛 알파 9 (ITGA9), mRNA
Figure pct00014
NM_002890.2 4402 bp mRNA 호모 사피엔스 RAS p21 단백질 활성화제 1 (RASA1), 전사물
Figure pct00015
Figure pct00016
NM_002880.2 3291 bp mRNA 호모 사피엔스 Raf-1 원 종양 형성 유전자, 세린/트레오닌 키나제 (RAF1),전사물 변이체 2, mRNA.
Figure pct00017
NM_001142864 7833 bp mRNA 호모 사피엔스 피에조(piezo)-형 물리적 민감성 이온 채널 구성요소 1 (PIEZO1), mRNA.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
NM_004444 4369 bp mRNA 호모 사피엔스 EPH 수용체 B4 (EPHB4), mRNA.
Figure pct00021
Figure pct00022
NM_000267 12381 bp mRNA 호모 사피엔스 뉴로피브로민 1 (NF1), 전사물 변이체 2, mRNA.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
RAS 질환(RASopathy)은 유전적 이종성 장애의 군이며, 이것은 PTPN11 , SOS1 , RAF1, KRAS , HRAS , MAP2K1 , MAP2K2 , NRAS , CBL , SHOC2 , BRAF , RIT1 , A2ML1 , SPRED1 및 NF1을 수반하는 Ras/MAPK 경로에서의 돌연변이와 함께 누난 증후군 (NS), 심장-얼굴-피부 증후군 (CFC), 1형 신경섬유종증(neurofibromatosis type 1: NF1), 다발성 흑자를 동반한 누난 증후군 (Noonan syndrome with multiple lentigines: NSML), 코스텔로 증후군 (CS), 및 레기우스 증후군(Legius syndrome)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. NS에서 림프 결함은 NS의 환자의 부분 집합에서 기재되어 있지만, 심각도, 위치 및 발병 시간이 다르다. 문헌을 검토하여, 발명자들은 늑막 삼출, 심막 삼출, 유미흉증, 수증(hydrops), 림프관 확장증, 및 림프 부종을 포함한, 누난 증후군 또는 누난-유사 증후군 및 림프 결함의 임상적 특징을 제공하는 총 52명의 산전 및 출생 후 환자를 확인하였다. 발명자들은 그들의 질환을 설명하는 PTPN11의 돌연변이를 확인하였다. 따라서, ras/MAPK ERK 경로에서 치료적 개입은 발명자들이 ARAF 돌연변이에 대해 이전에 보여준 것과 유사한 이들 환자의 질환 표현형을 반전시켜야 한다. 따라서, 중앙 전도성 림프 이상증 환자가 Ras/MAPK 경로에서 생식계열 또는 체세포 돌연변이를 갖는다는 발명자들의 발견은 신규하고 치료제 개발을 위한 새로운 표적을 확인한다. 이들 RAS/MAPK 경로를 지지하는 세포 및 모델링 데이터는 하기 기재되어 있다.
잠재적인 ERK-활성화 돌연변이의 효과를 연구하기 위한 세포 모델을 개발하였다. 발명자들은 세포주 Ea.hy926에서 단백질의 야생형 및 돌연변이 버전을 레트로바이러스를 이용하여 발현시켰다. Ea.hy926 세포주는 흑색종 세포주와 인간 제대 정맥 내피 세포의 융합체이다. 그것은 불멸화되고 내피 세포의 일부 특성을 유지한다. 발명자들은 중앙 전도성 림프 이상증의 형태를 유발하는, ARAF 유전자에서 돌연변이의 세포적 결과를 입증하기 위해 이 세포주를 성공적으로 사용하였다. 발명자들은 또한 트라메티닙, MEK 억제자를 사용하여 동일한 세포주에서 돌연변이 ARAF의 효과의 반전을 보여주었다.
도 1은 BRAF 또는 PTPN11 단백질의 WT 또는 돌연변이 버전을 발현하는 EA.hy926 세포에서 활성화된 ERK의 수준을 나타낸다. 단백질 로드(load)에 대해 표준화될 때, 돌연변이 BRAF를 발현하는 세포는이 실험에서 야생형 BRAF를 발현하는 세포보다 5배 더 많은 양의 인산화된 ERK를 함유한다. 돌연변이 BRAF는 ARAF로 이전에 관찰된 바와 같이 WT보다 더 높게 발현된다.
도 2에서, F486S BRAF 돌연변이를 발현하는 세포에서 세포 형태학 변화를 관찰할 수 있었다. 팔로이딘 염색에 의해 나타난 바와 같이, 섬유상은 야생형 BRAF를 발현하는 세포의 세포체 전반에 걸쳐 존재한다. 하지만, 액틴은 대부분 BRAF 돌연변이를 발현하는 세포의 주변부로 제한된다. 이 행동은 ARAF-돌연변이-발현 세포의 이전 관찰과 일치한다. VE-카데린 염색은 WT 또는 돌연변이 BRAF를 발현하는 세포에서 대부분 세포 내에 있다. ARAF에 관한 발명자들의 이전의 결과는 WT BRAF의 고른 발현이 Ea.hy926 세포주에서 ERK 활성화를 유도한다는 것을 시사한다. 이 결과는 VE-카데린을 내재화시키지만, 세포 형태는 WT BRAF에 의해 크게 변하지 않았다. 도 3은 VE-카데린 국소화 및 세포 형태 둘 다에 대한 ERK 활성화의 영향을 강조한다. WT 또는 돌연변이 BRAF를 발현하는 세포의 처리는 VE-카데린에 대한 세포 표면 염색을 극적으로 증가시키고 세포체에서 섬유상 액틴을 증가시켰다. WT 및 돌연변이-발현 세포 간의 형태학적 차이가 이 실험에서는 확연하지 않으며, 이것은 실험 간의 변동성을 나타내거나 도 2와 비교하여 이 실험에서 배양 시간 및 세포 밀도의 증가 때문일 수도 있다. 세포 형태 변화 및 VE-카데린의 분포가 PTPN11의 돌연변이를 나타내는 세포에서 변화되는 것을 관찰하지 못 했다.
더 큰 치료적 효험을 가진 억제자를 확인하기 위한 노력으로, 발명자들은 WT 및 돌연변이 BRAF 또는 PTPN11을 발현하는 세포를 다양한 MEK 억제자로 처리하였다. 도 4 및 5 참조. 발명자들은 비교점으로서 트라메티닙을 사용하여 PD0352971, 피마세르팁, 및 레파메티닙을 이용한 적정 곡선을 수행하였다. 예상된 바와 같이, 억제자는 용량 의존적 방식으로 세포 내 pERK 수준을 감소시킬 수 있었다. 이 실험 설정에서, PTPN11의 돌연변이는 WT PTPN11으로 볼 수 있는 수준의 위 및 아래로 ERK를 활성화시키는 것으로 나타나지 않는다. BRAF F486S는 ERK 활성화를 WT 수준보다 높게 일정하게 유도하지만, 특정 배수 증가는 겔마다 다르다.
림프관 질환의 제브라피쉬 모델
클론을 게놈에서 통합 가능하게 하기 위해 플랭킹 Tol2 트랜스포사제 부위 (Kawakami 1999, 10564832)를 가진 벡터 내 게이트웨이(gateway) 시스템을 사용하여 조립하였다 (Invitrogen, Kwan 2007, Villefranc 2007 17937395, 17948311). 25ng/ul Tol2 mRNA 및 벡터 DNA의 대략 10 pl을 신선한 수정란의 제1 세포에 주사하였다. 작제물을 mrc1a:GFP 발현 캐스퍼 피쉬(casper fish)에 주사하여 림프관을 가시화하였다. 공초점 스캔을 Zeiss LSM710 공초점 현미경 및 Zen 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 이미지의 공초점 z-스택(stack)을 Zeiss Zen 소프트퉤어의 최대 강도 투사 기능을 사용하여 중첩시켰다. 이미지를 imageJ (Fiji) {Schindelin 2012} 및 Powerpoint (Microsoft)에서 편집하였다.
제브라피쉬에서 돌연변이 인간 KRAS G12D가 림프관 발달에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위해서 발명자들은 림프 특이적 mrc1a 프로모터 다음에 돌연변이 및 WT 유전자를 클로닝하였고 (Jung 2017, PMID: 28506987) v2a 자가촉매 분열 부위를 가진 mCherry 형광단에 연결하였다 (Provost 2007, 17941043). 발명자들은 게놈 통합을 위해 플랭킹 Tol2 트랜스포사제 부위를 사용하였다. tol2 mRNA로의 이 작제물의 주사는 표현형이 7dpf (수정 후 일)에 분석될 때 대부분의 주사된 어류에서 전이유전자 및 mCherry 마커를 발현하는 림프관 세포의 작은 패치를 발생시켰다.
발명자들은 트랜스제닉 클론의 가장 일정한 발현을 나타내는 이 스테이지에서 가장 큰 혈관 중 하나인 몸통 흉관에서의 표현형을 조사하였다. WT KRAS 발현은 림프 발달에 대한 영향을 나타내지 않았지만, KRAS G12D는 복부 주정맥과 융합하는 것으로 나타난 흉관의 확장 및 팽창을 유발한다.
추가적인 연구에서, 발명자들은 림프 이상증을 설명하고 새로운 치료적 개입을 위한 기회를 제공하는 RAS/MAPK 경로에서 더 많은 유전자/돌연변이를 확인하였다. 표 3에서 나타난 바와 같이, 발명자들은 RAS/MAPK 신호전달 경로에 모두 수반되는 RASA1, RAF1, RIT1, NF1, CBL1, 및 BRAF에서 생식계열 또는 체세포 돌연변이를 확인하였으며, 림프 이상증에서 RAS/MAPK 경로에서 질환 실체물 간의 공유된 유전적 병인 및 돌연변이의 중요성을 더 지지한다. 이에 더하여, 하나의 동형접합성 미스센스 변이체를 림프 부종 및 림프 전도 장애를 가진 환자에서 발견하였다. 따라서, 발명자들은 선형 RAS/MAPK 경로에서 치료적 개입은 ARAF 돌연변이에 대해 이전에 나타낸 것과 유사한 돌연변이에 의해 유도된 제브라피쉬에서 높아진 ERK1/2 활성 및 림프 표현형을 반전시킬 수 있다는 것을 입증하는 데이터를 제공한다.
발명자들은 잠재적인 ERK-활성화 돌연변이의 효과가 질환 관련 세포 유형에서 돌연변이의 특성을 캡쳐하도록 확립된 세포주 대신에 1차 림프 내피 세포를 사용함으로써 발달되었는지를 더 잘 이해하고 연구하기 위한 세포 모델을 개발하였다. 발명자들은 인간 피부 림프 내피 세포 (HDLEC)에서 야생형 및 돌연변이 버전의 단백질을 레트로바이러스를 이용하여 발현시켰다. 발명자들은 이들 세포를 ARAF 유전자에서 돌연변이의 세포적 결과를 입증하기 위해 성공적으로 사용하였으며, 중앙 전도성 림프 이상증의 형태를 유발하였다. 발명자들은 또한 트라메티닙, MEK 억제자를 사용하여 세포에서 돌연변이 ARAF의 효과의 반전을 나타냈으며, 이것은 발명자들에 의해 최근에 Nature Medicine에서 발표되었다. 추가적으로, 발명자들은 이 모델에서 7개의 추가적인 MEK/ERK 억제자를 테스트하였고 트라메티닙과 비슷한 PD0325901 (도 6), CI1040/PD184352 (도 7), 피마세르팁 (도 8), TAK-733 (도 9), AZD8330 (도 10), 레파메티닙 (도 11), 및 울릭서티닙 (도 12)을 포함한 ARAF 돌연변이에 의해 유도된 효과의 생화학적 및 형태학적 반전을 보여주었다.
도 6-11은 ARAF 돌연변이 S214P를 발현하는 HDLEC에 대한 각각의 상이한 약물 (도면에서 나타난 바와 같음)의 효과를 나타낸다. 테스트된 모든 약물은 ARAF-S214P에 의해 유도된 형태학적 차이를 반전시키기에 충분했으며, 세포막에서 더 많은 VE-카데린 축적을 입증하였다. 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이다.
울릭서티닙은 ERK1/2의 효과적인 경구용 억제자이다. 이전의 연구에서 p-ERK1/2 수준은 울릭서티닙 처리 후 다양한 암 세포주에서 증가한 것으로 나타났다. 하지만, RSK (ERK1/2 단백질 기질)의 인산화는 감소하였으며, 이것은 지속적인 ERK1/2 억제와 일치한다. 도 12 상부 패널에서 나타난 바와 같이, 울릭서티닙 처리는 ERK 기질 RSK3의 인산화를 감소시켰다. 그리고 하부 패널에서, 울릭서티닙은 ARAF-S214P를 발현하는 HDLEC에서 세포-세포 접합부로부터 VE-카데린의 손실을 구제할 수 있으며 300 nM의 농도에서 거의 완벽한 회복을 나타냈다 (도 12; 초록색은 HA 염색에 대한 것이며, 이것은 ARAF 발현 세포를 표시하고; 빨간색은 VE-카데린 염색에 대한 것이고; 흰색은 핵에 대한 DAPI 염색이다). 유사하게, HDLEC에서 BRAF-F486S의 발현은 인접한 세포들 사이에서 VE-카데린 축적의 상당한 부재를 유발하며 (도 13-14), 이것은 기본적으로 ARAF 돌연변이와 유사한 표현형을 생산한다. 예상된 바와 같이, 울릭서티닙 (도 13) 또는 트라메티닙 (도 14) 처리는 표현형을 구제할 수 있고, 트라메티닙 (도 14 상부 패널)은 높아진 ERK 인산화를 억제할 수 있다. 더욱이, RAF1 또는 KRAS 돌연변이를 발현하는 HDLEC는 유사한 형태학적 변화를 나타냈고 유사하게 p-ERK를 증가시켰으며, 이것은 트라메티닙 및 울릭서티닙에 의해 정상화될 수 있었다 (도 15-16). 다른 한편으로, p-ERK의 약한 활성화가 RIT1 돌연변이에 의해 유발된다 (도 17).
발명자들은 림프관 생성에 대한 돌연변이의 효과에 대한 식견을 얻기 위해 HDLEC를 이용한 회전타원체 발아 검정 (3D 림프관 생성 검정)을 활용하였다. EPHB4-ins, EPHB4-R763Q, 또는 EPHB4-K885를 발현하는 HDLEC는 EPHB4-WT를 발현하는 HDLEC와 비교하여 향상된 림프관 신생 능력을 나타내며, 에프린 B2 존재 유무에 관계없이 혈관 내피 성장 인자 C (VEGFC)의 존재시 실행된 3차원 림프 회전타원체 발아 검정에서 발아 길이에 의해 측정된 바와 같다 (도 18, 상부 패널 및 왼쪽 하부 패널). mTORC1 및 mTORC2의 강력하고 선택적인 억제자인 라파마이신 및 OSI-027은 둘 다 돌연변이에서 증가된 발아를 구제할 수 있었다 (도 18, 오른쪽 하부 패널).
제브라피쉬 모델에서, 림프관에서 야생형 KRAS가 아니라 KRAS-G12D 돌연변이의 과발현이 흉관의 확장 및 상당한 부종으로 이어졌다. 발명자들은 mTOR 또는 MEK/ERK 억제자 중 어느 것이 표현형을 구제할 수 있는지를 추가로 조사하였다. 유의한 효과가 없는 라파마이신, CI1040, 및 SL-327과 달리, MEK 억제자로의 처리는 표현형을 크게 개선하였다. 특이적으로, 코비메티닙, 피마세르팁, TAK-733, AZD8330, 및 PD0325901로의 처리는 부종의 감소 및 무질서한 림프 분기의 개선으로 이어졌다 (도 19). 더욱이, PI3K 및 mTOR의 이중 억제자, NVP-BEZ235로의 처리는 부종성 유생의 큰 감소를 나타냈다 (도 19).
발명자들은 또한 제브라피쉬 모델에서 PTPN11 돌연변이를 과발현시켰다. 도 20은 경증 림프 이상증 표현형에서 초래된 PTPN11 S502A 또는 G503R 돌연변이의 모자이크 발현을 나타낸다. 림프 조직의 일부 확장 및 잘못된 유도 또는 후주정맥 및 흉관의 융합이 존재하였다.
제브라피쉬에는 2개의 RASA1 상동체, rasa1a 및 rasa1b가 존재하였다. 발명자들은 rasa1a 및 rasa1b 유전자 둘 다를 표적화하는 gRNA를 디자인하여, Cas9 트랜스제닉 배아에 주사하였으며, 이것은 큰 부종의 형성을 유발하였다 (도 21).
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
실시예 II
ARAF 재발성 돌연변이는 MEK 억제자로 치료 가능한 중앙 전도성 림프 이상증을 유발한다
최근 연구에서 전신 림프 이상증 (GLA) 및 중앙 전도성 림프 이상증 (CCLA)3-5의 부재시 시롤리무스의 이점이 입증되었지만, 이들 실체물 간의 분명한 임상적 차이의 부재는, 진단 기준의 희귀성 및 중첩으로 인해, 혁신적인 요법의 개발을 방해하였다6-9. GLA는 다수의 소낭성/대낭성 림프관 기형의 영역을 갖고 종종 골 파괴를 수반하는 다초점 림프 이상증으로 정의된다9-11. CCLA는, 다른 한편으로, 흉관 (TD) 또는 유미조(cisterna chyli)의 기능 장애를 기재하며, 림프 유체의 역방향 흐름 또는 림프 유체의 비정상적인 배수로 이어진다1,12,13.
두 병태 모두 유미흉증, 삼출, 유미성 복수 또는 림프 부종과 함께 나타날 수 있다. 이들 명백하게 이질적인 장애의 중첩은 공통 유전자보다는 공통 경로가 다양한 임상 증후군에 대한 원인이라는 것을 시사하고, 실체물 간의 차이는 인공적일 수 있다는 것을 나타낸다. 본원에서 발명자들은 2명의 무관한 환자에서 복합 림프 이상증을 특징으로 하는 심각하게 진행된 림프성 질환에 대한 근거로서 ARAF에서의 재발성 미스센스 돌연변이를 확인하기 위해 전체 엑솜 시퀀싱 (WES)의 사용을 보고한다. 발명자들의 결과는 유전적 분류가 복합적인 의학적 장애를 범주화하는 방향을 제공하는 방법에 대한 대표적인 증거를 제공하여, 생물학 기반 의학적 치료를 안내하며, 발명자들의 경우에는 생명을 구하는 것이었다.
실시예 II의 실시를 용이하게 하기 위해 다음 재료 및 방법이 제공된다.
환자
필라델피아 아동 병원 (Children's Hospital of Philadelphia: CHOP)의 기관 감사 위원회(Institutional Review Board)로부터의 승인 및 서면 동의서를 얻은 후, 시퀀싱 분석을 위해 선도 프로밴드 (P1) 및 그 부모로부터의 혈액 표본을 얻었다. 프로밴드는 흉부, 심막, 복부, 하지 및 생식기에서 림프 유체의 심각한 축적을 나타내고 CHOP의 림프 영상 및 중재 센터(Center for 림프 Imaging and Interventions)에서 추적 및 치료받고 있다. 무관한 두 번째 성인 환자 (P2)를 이용 가능한 가족 구성원과 함께 림프관종증 & 고함스병 연합의 환자 모집 (Patient Registry of the Lymphangiomatosis & Gorham's Disease Alliance: LGDA)를 통해 모집하였다. P1에 대한 출생 및 가족력은 복부의 왼쪽 측면 상의 모세혈관 기형을 제외하면 평범했고 아동 성장 및 발달 이정표는 정상이었다. 10살에, 그는 하복부, 허벅지, 음낭 및 음경이 부어올랐다. 2개월 후, 그는 호흡 곤란과 운동불내증으로 지역 병원에 입원하였다. 흉부 방사선 사진은 심장 비대(cardiomegaly)를 입증하였고 초음파 심장 진단도는 큰 심막 삼출을 나타냈다. 유미 유체 1 l의 배수와 함께 심장막천자(Pericardiocentesis)를 수행하였다. 전체 비경구 영양제의 제도에도 불구하고, 배수가 계속되어 추가의 관리를 위해 CHOP로 옮겼다. CHOP에서, 초기 평가는 팽창된 요추 및 후복막 네트워크에서 왼쪽에서 무명 정맥을 향하는 팽창되고 구불구불한 TD로의 큰 심막 삼출 및 정방향 흐름을 입증하는 동적 대비 증강 자기 공명 림프관 조영술을 포함하였다 (도 1a,c,d). 영향을 받지 않은 사람의 이미지는 참조로서 도 1b에 나타나있다. 이에 더하여, 간, 장간막, 음경 및 음낭으로의 역방향 림프 흐름이 존재하고, 원위 TD로부터 종격 및 심막으로의 역방향 흐름이 존재한다 (도 1c-e). 그는 비정상적인 종격 및 심막 림프 삼출을 중단시킬 목적으로 원위 TD 및 리피오돌 색전 형성에서 스텐트(stent)의 배치를 겪었다. 그는 안정한 심막 삼출로 1개월 후 퇴원하였지만 그 직후 많은 유체 재축적으로 인한 호흡 곤란을 나타냈으며 보충 산소에 대한 요구량이 증가하였다 (비강 캐뉼라에 의해 최대 5 l). 그는 시롤리무스를 시작하였고 하루에 2.5 mg의 용량에 대해 잘 용인되는 최저치를 기준으로 투여되었으며, 이것은 2016년 5월과 11월 사이에 중간 최저치가 11.8이었다 (범위 6.8-16.2 μg dl-1). 1.5년의 과정에 걸쳐서, 그는
반복적 흉강천자술(repetitive thoracentesis) 및 늑막 배수, 다발성 경피성 림프 색전술, 양측 외과적 흉막 유착술(bilateral surgical pleurodesis) 2회, 허벅지, 복부 및 후복막강에서 및, 악화되는 음경 및 음낭 부종으로 인한 외과용 림프 정맥 문합, 수술 결찰 및 서혜부 림프 채널의 색전술을 포함한 다수의 경피성 중재적 및 수술적 림프 과정을 거친다. 심막 삼출을 제어하기 위한 여러번의 시도에도, 그의 음경, 음낭, 하지 및 하복부 림프 부종은 악화되었고 그의 병태는 완화 관리의 고려가 논의되는 지점까지 계속해서 악화되었다. 마지막 과정을 수행하고 시롤리무스를 트라메티닙 5개월 전에 중단하였다.
Figure pct00030
무관한 성인 여성인 환자 P2는 31세에 림프관종증으로 진단되었다. 그녀는 현저한 폐 침범으로 진단되기 전 수년 동안 광범위한 증상을 나타냈고 흉막 유착술 전에 다수의 흉막 천자 과정을 필요로 했다. 그녀는 위장관의 광범위한 침범을 나타냈으며, 특화된 지방-제한 식단 및 간혈적 전체 비경구 영양제로의 중간 사슬 트리글리세리드 오일 보충을 필요로 했다. 그녀는 설명되지 않은 지속적인 증상 이후 전산화 단층촬영 및 자기 공명 이미지화를 거쳤으며, 이것은 신장, 간, 비장 및 폐에 영향을 미치는 림프관종증과 일치하였다.
간 생검은 림프관종증의 진단을 확인하였다. 그녀는 추가적으로 알부테롤 및 이뇨제로 처리되었고 피로 및 호흡 곤란으로 인해 모터 구동식 스쿠터를 사용하였다. 그녀는 골 관여를 나타내는 것으로 확인되지 않았다. 환자가 림프관종증 & 고함스 병 동맹으로부터 모집되었고 현지인이 아니었기 때문에, 그녀는 추적 조사에 실패했으며 근본적인 림프 장애와 관련된 합병증으로 사망했기 때문에 다른 요법의 시험을 이용할 수 없었다.
WES 및 생물정보학 분석.
발명자들은 엑솜 데이터에서 우성 및 열성 유전 모델과 일치하는 미스센스, 넌센스, 스플라이스 변화 및 암호화 삽입-결실을 검사하였다. 결과를 다음 요인들을 가진 변이체를 배제하도록 필터링하였다: 동의의 변이체; 공지된 위유전자의 변이체; 1000개의 게놈 프로젝트 또는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 엑솜 시퀀싱 프로젝트 (ESP6500SI)로부터의 6,503개의 엑솜에서 0.5%보다 높은 소량 대립유전자 빈도 (MAF)를 가진 변이체; 사내 엑솜 변이체 데이터베이스에 의한 관리범위 내에서 사전 확인된 변이체. 후속 유전자 우선순위 지정은 Online Mendelian Inheritance in Man 데이터베이스를 참조하여 수행하였다. 유해한 예측 및 생물학적 관련성을 기반으로 수행되었다.
포유류 세포주에서 ARAF 돌연변이의 발현 및 특성화
HEK293T 및 HeLa 세포를 American Type Culture Collection으로부터 얻었고 37 ℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 성장시켰다. 1차 성인 HDLEC를 Promocell로부터 얻었고, 제조사의 지시에 따라 내피 세포 성장 배지 MV 2 (Promocell)에서 성장시켰다. Addgene (플라스미드 번호 23725)로부터 얻어진 전장 ARAF cDNA를 원래의 벡터로부터 증폭시키고 BamHI/XhoI 단편으로서 2개의 카피의 FLAG 태그 (DYKDDDDK)에 이어서, 2개의 STREP 태그 (WSHPQFEK)를 함유한 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하였다. S214P 돌연변이를 제조사의 지시에 따라 NEB의 Q5 돌연변이 유발 키트를 사용하여 부위-관련 돌연변이 유발에 의해 도입하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 3 μg DNA (빈 벡터, WT ARAF (ARAF-WT) 또는 ARAF 돌연변이 (ARAF-S214P)) 및 트랜스펙션 시약 9 μl와 함께 Fugene HD (Promega)를 사용하여 HEK293T 및 HeLa에서 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 후 36-48 h에, 세포를 매우 차가운 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)로 2회 세척하였고 용해 완충제 밀리리터 당 20 μl에서 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 50 mM β-글리세로포스페이트, 10% 글리세롤 (w/v), 1% NP-40 (w/v), 1 mM EDTA, 2 mM NaVO4 및 완전 무 EDTA 프로테아제 억제자 칵테일 (Roche Applied Science)을 함유하는 신선하게 제조된 매우 차가운 세포 용해 완충제를 사용하여 얼음 위에서 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리로 제거한 후, 상층액을 수거하고 웨스턴 블롯팅 또는 항-FLAG M2 Affinity Gel (카탈로그 번호 A2220, Sigma)을 이용한 면역침강에 이은 웨스턴 블롯팅에 사용하였다. 면역침강물 및 용해물을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 (Thermo Fisher Scientific)에서 실행시켰고 항-포스포-p70S6K-Thr389 (카탈로그 번호 9205S, Cell Signaling Technology; 1:1,000), 항-포스포-mTOR Ser2448 (카탈로그 번호 5536P, Cell Signaling Technology; 1:1,000), 항-FLAG (카탈로그 번호 F3165, Sigma; 1:4,000), 항포스포-p38 Thr180/Tyr182 (카탈로그 번호 4511, Cell Signaling Technology; 1:1,000), 항-PAN-14-3-3 (카탈로그 번호 sc-629, Santa Cruz Biotechnology; 1:500), 항-포스포-Akt-Ser473 (카탈로그 번호 4060, Cell Signaling Technology; 1:1,000), 항-포스포p44/42-(Erk1/2)-Thr202/Tyr204 (카탈로그 번호 4376, Cell Signaling Technology; 1:1,000) 또는 항-β-액틴 (카탈로그 번호 sc-69879, Santa Cruz Biotechnology; 1:1,000) 항체를 포함한 1차 항체로 블롯팅하였다.
이전에 나타난 바와 같이 pCDNA3.1-F2S2-ARAF-WT 또는 -S214P 작제물의 ARAF 서열을 BamHI/XhoI로 절단하고 아미노말단 FLAG 및 HA 태그를 함유하는 변형된 버전의 pMSCV 플라스미드의 BglII/XhoI 부위에 도입하였다. 바이러스 생산을 HEK293T에서 외피 및 포장 플라스미드와 함께 8 μg의 전체 DNA (pMSCV-ARAF-WT 또는 -S214P 및 18 μl의 트랜스펙션 시약과 함께 Fugene을 사용하여 수행하였다. 72 h 후, 바이러스 상층액을 수고하고 여과하였다. HDLEC를 세포 배양 배지를 8 μg ml-1 폴리브렌으로 보충하고 0.45 μm 필터를 통해 여과된 바이러스 상층액으로 대체하여 감염시켰다. 세포를 650g에서 90 min 동안 회전감염(spinfect)시켰고, 그 이후 6 h 동안 배양하였으며 이 시점에 바이러스 상층액을 표준 배양 배지로 대체하였다. 형질도입된 HDLEC를 실험에서 사용하기 전에 48 h 동안 배양하였다. HA 염색에 의해 관찰된 형질도입 효율은 40% 내지 60%였다.
HDLEC의 면역형광 염색 및 웨스턴 블롯
둥근 (12 mm) 커버슬립 (VWR)을 24-웰 플레이트 (Corning)에서 10분 동안 수중 0.1% 젤라틴으로 코팅한 다음 15 min 동안 공기 전조시켰다. 형질도입된 HDLEC를 트라메티닙의 존재 또는 부재 하에 0.5 ml 배양 배지에 48 h 동안 웰 당 100,000개의 세포로 평판배양하였다. 세포를 따뜻한 무혈청 둘베코 변형 이글 배지로 세척하였고 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS 중의 0.1% BSA로 2회 세척하였다. 세포를 투과시키고 PBS 중의 10% 정상 당나귀 혈청 (Jackson Immunoresearch) 및 0.3% Triton X-100 (Sigma Aldrich)와 함께 인큐베이션하여 블로킹하였다. VE-카데린 항체 (Thermo Fisher Scientific)를 PBS 중의 0.01% 정상 당나귀 혈청, 0.1% BSA 및 0.3% Triton X-100에 희석하였고 (최종 농도: 2 μg ml-1), 염색을 1 h 동안 수행하였다. 커버슬립을 PBS 중의 0.1% BSA로 2회 세척하였다. 염소-항-토끼 Alexa546 (Thermo Fisher Scientific; 최종 농도: 8 μg ml-1) 및 팔로이딘 Alexa350 (Thermo Fisher Scientific; 최종 농도: 5 유닛 ml-1)을 PBS 중의 0.01% 정상 당나귀 혈청, 0.1% BSA 및 0.3% Triton X-100에 희석하였고, 염색을 1 h 동안 수행하였다. 사용될 때, HA-태그 (6E2) 마우스 항체 (카탈로그 번호 2367, Cell Signaling Technology)를 PBS 중의 0.1% BSA 및 0.3% Triton X-100에 1:100으로 희석하였고 염색을 1 h 동안 수행하였다. 커버슬립을 PBS 중의 0.1% BSA로 2회 세척하였고 PBS로 2회 세척하였다. 커버 슬립을 물에 담가서 남은 염을 제거하고, Prolong Gold 안티페이드(antifade) 시약 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 슬라이드에 올려놓았다. 이미지 습득을 Photometrics HQ2 고해상도 흑백 CCD (전하 결합 소자) 카메라가 구비된 Leica DM6000 모터구동식 직립 현미경 상에서 LAS AF 소프트웨어 (Leica Microsystems)를 사용하여 수행하였다. Z-스택(stack)을 X10 배율에서 획득하였다. 이미지를 Fiji 소프트웨어 패키지로 추라로 가공하였다42. 명도 및 대비를 조정하였다. 동일한 명도 및 대비 설정을 모든 이미지에 적용하였다. 형광값을 전체 개개의 세포를 함유하는 관심있는 영역 (ROI), 또는 전체 세포체를 함유하지만 세포-세포 접합부를 배제한 ROI에서 측정하였다. 상기 측정된 값으로부터, 원형질막에 대한 값을 유도하였고 (전체 세포 - 세포내), 세포내 값에 대한 원형질막의 비율을 유도하여 플롯팅하였다. 추가적으로, 라인 툴(line tool) 및 ROI 매니저를 이용하여 세포의 길이 및 너비를 측정하였다. 두 분석 모두에 대하여, 5개의 분명하게 ARAF를 발현하는 세포는 HA 염색에 의해 결정된 바와 같이 X10 시계(field)마다 문석하였다. 실험마다 조건에 따라 5개의 X10 시계를 획득하였다. 실험을 HDLEC의 3개의 독립적인 해동 및 형질도입된 세포로부터 조건 당 총 75개의 세포에 대하여 실행하였다. 트라메티닙을 이용한 HDLEc의 웨스턴 블롯팅을 위해, 20,000개의 형질도입된 HDLEC 세포를 증가하는 양의 트라메티닙의 존재 하에 96-웰 플레이트에 평판배양하였다. 세포를 약물의 존재 하에 24 h 동안 배양한 다음, 40 mM HEPES pH 7.5, 120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 50 mM NaF, 1.5 mM NaVO3 및 프로테아제 억제자 칵테일로 용해시켰다. 4 ℃에서 20,000g로 5 min 동안 원심분리하여 용해물을 제거하였다. 단백질을 4-12% NuPAGE Bis-Tris 겔 상에 분리시켰다. 블롯팅을 상기 기재된 항체를 사용하여 수행하였다.
3차원 림프 회전타원체 발아 검정.
림프 발아 검정에 대한 다세포 회전타원체를 1.5% 아가로스로 사전 코팅된 96웰 플레이트의 웰로 ARAF-WT 또는 ARAF-S214P를 발현하는 7,500개의 HDLEC를 분주함으로써 시작하였다. 이 조건 하에서, 모든 HDLEC가 24 h까지 단일 회전타원체로 응집될 것이다. 형성 후, 각각의 회전타원체를 표시된 농도로 타입 I 콜라겐 (카탈로그 번호 354236, Corning; 최종 농도 = 1.5 mg ml-1; NaOH로 pH 중성화됨) 및 트라메티닙으로 구성된 겔화 용액으로 옮긴 다음, 37 ℃에서 폴리머화시켰다. 고체화되면, 적절한 농도로 트라메티닙을 함유하는 내피 세포 성장 배지 MV 2 (VEGFC 없음)를 콜라겐 겔에 추가하였다. 2일 동안 인큐베이션한 후, EVOS FL Auto Imaging System (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 ~8.5 μm의 단계 크기를 가진 임베딩된(embedded) 회전타원체의 z-스택 이미지를 촬영하였다. 각각의 회전타워체로부터 성장하는 모세혈관-유사 발아의 개수 및 길이를 소프트웨어 ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 측정하였다.
형질도입된 HDLEC를 이용한 MTT 증식 검정
형질도입된 HDLEC의 증식을 Roche Applied Science의 Cell Proliferation Kit I (MTT)을 사용하여 측정하였다. 간략히 말하면, 레트로바이러스 형질도입 후 2 d에, ARAF-WT- 및 -S214P를 발현하는 HDLEC를 수거하고, 계수하여 평평한 바닥의 96-웰 플레이트에 100 μl 배지에 웰 당 10,000개의 세포로 재평판배양하였다. 평판배양 후 표시된 시간에, MTT 10 μl를 적절한 웰에 추가하고, 37 ℃에서 4 h 동안 인큐베이션하였다. 100 μl 부피의 가용화 시약을 추가한 후 이어서 37 ℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 550 nm 및 700 nm에서의 흡광도를 Spectramax i3 Multi Mode 플레이트 판독기 (Molecular Devices) 상에서 측정하였고, A550 nm-A700 nm를 계산하였다. 플레이팅 후 4 h의 시점을 최소 증식된 실험으로 로딩된 세포의 적절한 측정값으로 포함시켰다.
제브라피쉬에서 인간 ARAF 의 트랜스제닉 발현
제브라피쉬를 사용하는 모든 과정은 CHOP의 실험 동물 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었고 (IAC 001154) 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의한 실험 동물 사용 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)에 따른다. 인간 돌연변이 및 WT ARAF cDNA를 종결 코돈 없이 pDONR221 벡터로 클로닝하였고; 제브라피쉬에 적합한 코자크(kozak) 서열 (GCAAACATGG)을 사용하였다43. 발현 작제물을 게이트웨이 클로닝 카세트를 포함한 Tol2 백본 벡터를 사용하여 조립하였다 (44, 45). 작제물에 Tol2 전령 RNA를 동시 주사하였다 (46).
ARAF를 제브라피쉬 mrc1a 프로모터를 사용하여 정맥 및 림프관에서 발현시켰고, 발현을 자가촉매적 V2a 단백질 분열 부위에 의해 ARAF에 연결된 mCherry에 의해 가시화하였다. 이미지화를 위해, 유생을 저융점 아가로스에 올려놓고, 다수의 Z-이미지를 X20 렌즈를 사용하는 Zeiss LSM710 공초점 현미경으로 촬영하였다. 이미지의 공초점 z-스택을 Zeiss Zen 소프트웨어의 최대 강도 투사 기능을 사용하여 중첩시켰다.
TD의 팽창을 분석하기 위해서, TD에서 전이유전자를 발현하는, 분절 간 림프관에 의해 분리된 신체 분절을 선택하였다. 형태학을 정상 (WT), 중간 팽창 (확장되지만 PCV로부터 분리된 TD) 또는 극심한 팽창 (TD 및 PCV는 Z-투사에서 구별 불가능)으로 채점하였다. 이미지를 ImageJ (Fiji)에서 편집하였다. 각 실험을 3회 수행하였고, 총 40마리의 동물을 분석하였다.
제브라피쉬에서 억제 약물 처리
군 당 최대 20마리의 유생이 들어있는 6-웰 플레이트에서 약물 처리를 수행하였다. 코비메티닙을 0.01 M Tris pH 7.2 및 0.1% DMSO를 함유하는 배아 배지에서 희석하였다. 코비메티닙을 1 μM로 사용하였다.
제브라피쉬에서 p- ERK 항체 염색. 어류를 상기 기재된 바와 같이 주사하였고 분명한 WT 또는 돌연변이 ARAF/mcherry 발현을 나타내는 유생을 분석을 위해 선택하였다. 유생을 Tween-20이 들어있는 PBS (PBST) 중의 4% 파라포름알데하이드 용액에서 밤새도록 고정하였다. 유생을 PBST로 세척하고 4 ℃에서 24 h 동안 2% Triton X-100에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 유생을 10% 소 혈청으로 블로킹하고 포스포-ERK T202/Y204 항체 (카탈로그 번호 9101, Cell Signaling Technology, 1:200)로 4 ℃에서 밤새도록 염색하였고, PBST로 세척하고 Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 2차 항체 (카탈로그 번호 A11008, Thermo Fisher Scientific, 1:400)로 염색하였다.
통계학. 모든 세포-기반 검정에 대해, 두 군의 비교를 위해 독립표본 이원 스튜던트 t-테스트(unpaired, two-tailed Student's t-test)에 의해 유의성을 평가하였다. 통계 분석을 GraphPad Prism 7.0d 소프트웨어로 수행하였다. 데이터는 25th 내지 75th 백분위수의 범위에 있는 상자, 최소에서 최대까지의 수염 ㅁ및 중심으로서 중간값을 갖는 상자 수염(box-and-whisker) 플롯으로, 또는 나타난 바와 같이 평균 ± s.e.m.에 대한 막대 그래프와 함께 점 그래프로서 표시된다. HDLEC에 대해 수행된 모든 검정에 대해, 3회의 독립적인 실험을 증식 연구를 제외한 HDLEC의 독립적인 형질도입으로 수행하였으며, 통계 분석은 수행하지 않았다. 14-3-3 단백질 회합 검정에 대해, 3회의 독립적인 실험을 HEK293T 세포의 독립적인 트랜스펙션과 함께 수행하였지만, HEK293T 세포에 대한 다른 결과는 6회의 독립적인 실험을 나타낸다. 모든 제브라피쉬-관련된 검정을 3회의 독립적인 실험으로 수행하고 두 군의 비교를 위해 독립 표본 일원 스튜던트 t-테스트(unpaired, one-tailed Student's t-test)로 테스트하였다.
결과
AKT1, PIK3CA, KRAS, HRAS, NRAS, BRAF, RAF1, PTPN11, SHOC2, CBL, RIT1 및 SOS1의 돌연변이 분석을 포함한 공지된 림프 이상증-관련된 유전자의 WES 분석의 제1 단계는 공개되지 않았다. 환자 P1, CCLA에 걸린 남성 (도 22A, 22C-22E; 상세한 임상 설명에 대한 방법 참조; GenBank Accession No. NG_016339), 및 환자 P2, 이전에 림프관종증으로 진단된 여성 둘 다에 대해 후속 유전자 우선순위 지정은 신규한 X 염색체 ARAF 돌연변이, c.640T>C:p. S214P를 나타냈다. 돌연변이는 보존된 인산화 부위에 영향을 미치며, 이것은 추정상 잔기 Ser 214가 14-3-3 단백질에 의한 억제를 위한 상동성 단백질 C-RAF (RAF1로도 알려져 있음)의 이원성(paralogous) 조절 부위이기 때문에 기능 획득 (GoF) 효과를 발생시켰다. 이 미스센스 돌연변이는 1000 게놈 프로젝트, ESP6500SI, ExAC v0.3, gnomAD v2.1 또는 사내 데이터베이스에서 발명자들이 가지고 있는 5,000개 초과의 샘플의 추가적인 엑솜-시퀀싱 데이터에는 없다. P1 및 두 부모로부터의 혈액 유래된 DNA의 생어(Sanger) 시퀀싱은 이 X-관련 ARAF 돌연변이가 남성 환자에서 나타난 바와 같이 체세포 이형접합성 이벤트로서 발생한다는 것을 확인하였다 (도 22F). P2, 영향을 받지 않은 딸 및 모(mother)에서 ARAF 돌연변이의 생어 시퀀싱은 돌연변이가 P2에만 존재한다는 것을 확인하였다 (도 22F). 부(father)는 시퀀싱에 이용 불가능하지만; 그녀의 부가 호흡 증상에 대해 보고되지 않았기 때문에 ARAF 돌연변이가 P2에서 데 노보 또는 체세포 돌연변이로서 발생할 가능성이 남아있다. 환자 P2는 추적 조사에 실패했고 발명자들은 나중에 그녀가 진단 후 5년에 림프성 질환의 합병증으로 사망했음을 알게 되었다.
ARAF에서 보존된 영역 2 (CR2)에서 14-3-3 결합 부위 중 하나인 Ser 214 잔기는 척추동물 종 전반에 걸쳐 고도로 보존될 뿐만 아니라, RAF 단백질 내에서 고도로 보존되며 (14), 이들 키나제의 기능에 필수적인 역할을 할 수도 있다는 것을 시사한다 (도 22G). ARAF의 인산화된 Ser 214로의 14-3-3 단백질의 결합은 활성화된 Ras에 의한 원형질막으로의 ARAF 단백질의 모집을 방지할 것이다 (15). 이전의 연구에서는 C-RAF에서 ARAF-S214 이원성 잔기 Ser 259의 돌연변이가 14-3-3 단백질의 결합을 손상시켰으며, 원형질막 국소화로 이어져 ERK/MEK 신호전달을 유도한다는 것을 보여주었다 (16). 도 23A에서 나타난 바와 같이, ARAF-S214P로 형질전환된 HEK293T 세포는 인산화의 증가로 측정된 바와 같이 야생형 (WT) ARAF를 발현하는 HEK293T 세포와 비교하여 14-3-3 단백질의 동시-면역침강의 감소를 나타냈고, 차례로 ERK1/2의 훨씬 더 큰 활성화를 나타냈다 (도 23A, 23B). AKT, p70S6K, mTOR 및 p38 (MAP 키나제의 또 다른 패밀리)의 인산화는 ARAF-S214P에 의해 변화되지 않았다 (도 23B). HeLa 세포 및 1차 인간 피부 림프 내피 세포 (HDLEC)에서 유사한 결과를 얻었다 (도 23C). 이 뚜렷한 과활성화는 또한 사이토카인 또는 성장 인자의 부재시에도 존재하였다.
ARAF-S214P를 발현하는 HDLEC는 혈관 내피 성장 인자 C (VEGFC)의 부재시 실행된 3차원 림프 회전타원체 발아 검정에서 발아의 수 및 발아 길이로 측정된 바와 같이 ARAF-WT를 발현하는 HDLEC와 비교하여 향상된 림프관 신생 능력을 나타낸다 (도 23D). MEK 억제자 트라메티닙은 돌연변이에서 증가된 발아를 구제하였다 (도 23D). 발명자들은 ARAF-S214P를 발현하는 1차 HDLEC의 내피 접착대 접합부의 형태학적 분석을 수행하였다. 면역형광 현미경 관찰에 의해 나타난 바와 같이, ARAF-S214P 발현은 인접한 세포 사이에서 VE-카데린 축적의 상당한 부재를 유발하였으며 증가된 VE-카데린 내재화를 시사한다 (도23E, 노란색 화살표 머리). 추가적으로, ARAF-S214P의 발현은 액틴 조직을 변화시켰으며, 돌연변이-발현 세포는 세포체 내에 소수의 별개의 F-액틴 필라멘트를 가지고 있다.
발명자들은 이들 이상을 반전시킬 수 있는 MEK1/2 억제자의 능력을 검사하였다. 100 nM 농도의 MEK 억제자 트라메티닙은 ARAF-S214P를 발현하는 HDLEC에서 관찰된 세포-세포 접합부로부터 VE-카데린의 상실을 구제하였으며 세포 단층 온전성의 거의 완벽한 복원 및 접합부 및 액틴 필라멘트에서 VE-카데린의 정상적인 외관의 회복을 나타낸다 (도 23E). ARAF-S214P는 HDLEC에서 ERK를 분명하게 활성화시키고, ERK 활성화는 전형적으로 세포 증식과 관련이 있지만, 발명자들은 2개의 독립적인 레트로바이러스 형질도입에 걸쳐 ARAF-WT- 및 -S214P-발현 HDLEC 사이에서 어떠한 측정 가능한 증식의 차이도 관찰할 수 없었다 (도 23F).
제브라피쉬에서 림프 발달의 분석을 Tg(mrc1a:egfp)y251 트랜스제닉 라인에서 수행하였으며17, 모든 림프 내피 세포를 EGFP로 라벨링하였다. ARAF 발현을 mrc1a 프로모터를 가진 림프관으로 표적화하였고, ARAF-발현 세포를 mCherry 발현으로 표시하였다. ARAF-S214P 발현은 상이한 위치에서 팽창된 림프관을 유도하였고, 가장 일관적으로 발명자들은 몸통 TD의 팽창을 관찰하였다 (도 23G). 그에 반해 ARAF-WT의 발현은 림프 형태학에 영향을 미치지 못 했다 (도 23H). ARAF-S214P의 발현은 제브라피쉬에서 p-ERK를 유도하였다.
MEK 신호전달 억제자가 이상증을 반전시킬 수 있는지를 결정하기 위해서, 발명자들은 림프 전구 세포가 발아하여 TD를 형성할 때 수정 후 3 d (dpf)로부터 mrc1a:ARAFS214P 유생을 코비메티닙으로 처리하였다 (17). 발명자들은 7 dpf에 TD에서 ARAF 발현으로 신체 분절 (체절)을 분석하였고 코비메티닙에 의한 도관 형태학의 상당한 구제를 발견하였다 (도 23I, 23J). 한편, 발명자들은 WT Tg(mrc1a:egfp)y251 유생을 코비메티닙으로 처리하였고, 그것들이 약물을 잘 용인한다는 것을 발견하였다.
ARAF 돌연변이가 시롤리무스에 무반응인 P1에서 기능 획득 효과로 이어지고 MEK 억제자가 형질도입된 내피 세포 및 트랜스제닉 제브라피쉬 모델 둘 다에서 림프 표현형을 구제할 수 있다는 발명자들의 증명을 고려하여, 발명자들은 P1에서 MEK 억제자 요법을 사용하기 위해 기관 감사 위원회 클리어런스(clearance)를 추구하였다. 트라메티닙 (멕키니스트), 식품 의약 안전청 (FDA)-승인된 MEK 억제자는 이후에 이 12살 환자에서 종합 베이스라인 평가 후 오프-라벨(off-label)로 사용되었다.
발명자들은 트라메티닙의 1 mg d-1의 시작 용량을 사용하였고 요법 2개월 이내에 테스트한 폐 기능의 개선을 관찰하기 시작했다 (도 24A). 더욱이, 치료 3개월 후에 림프 유체 체류 및 보충용 산소 요구량이 크게 감소하였고, 그는 물리적 활성의 수준이 개선되고 트라메티닙으로부터 관찰된 부작용 없이 실내 공기를 마실 수 있었다. 요법 12개월에, 폐 기능 테스트는 총 폐 용량의 거의 두 배를 나타냈고 1 s 당 강제 호기량 (FEV1)은 23%에서 예측된 42%로 개선되었다 (도 24A).
표준화된 전해질 (낮은 Na 및 K) 및 자기 공명 이미지화 스캔은 림프계의 재구성을 이용한 림프 리모델링 (도 도 24B -24F), 총 폐 용량 (TLC)의 두 배로 현저한 회복 및 23%에서 예측된 42%로 개선된 1 s 당 강제 호기량 (FEV1)을 나타냈다 (도 24A). 표준화된 전해질 (낮은 Na 및 K) 및 자기 공명 이미지화 스캔은 림프계의 재구성을 이용한 림프 리모델링 (도 24B- 24F), 이 유전적으로 유도된 요법의 시작 전에 빈번하게 입원하는 개체에서 현저한 회복을 나타냈다 (도 24F).
요컨대, 발명자들은 2명의 무관한 림프 이상증에 걸린 환자에 대해 WES를 수행하였고, 예컨대 시롤리무스 요법에 무반응인 진행된 림프성 질환에 걸린 12살 남성에서 ARAF 유전자에서 재발성 기능 획득 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이 ARAF로 형질도입된 HDLEC는 높아진 ERK1/2 활성, 향상된 림프관 신생 능력, 및 액틴 골격 및 VE-카데린 접합부의 분해를 나타냈으며, 이것은 MEK 억제자 트라메티닙을 사용하여 구제되었다. 발아를 VEGFC (강력한 림프관 신생 인자)의 부재 하에 ARAF-S214P-발현 HDLEC에서 관찰하였다 (18). 동일한 조건 하에서, ARAF-WT를 발현하는 세포에서 발아는 없었다. 이것은 ARAF 돌연변이가 VEGFC의 자극 행위를 모방하거나 HDLEC에 의해 VEGFC의 발현을 유도하며, 이것은 내피 세포 발아에 필수적이라는 것을 시사하고, 많은 기질 세포 유형에서 볼 수 있는 바와 같다 (19-21). 발명자들은 변칙적인 림프 표현형을 재현하였으며, MEK 억제자 요법을 사용하여 표현형의 구제를 관찰하는 제브라피쉬 모델에서 ARAF에서의 GoF 돌연변이에 기인한다. 현저하게, 트라메티닙을 사용한 ARAF 돌연변이를 가진 선도 프로밴드의 치료는 환자 증상의 극적인 개선을 초래하며, 팽창되고 일그러진 맥관구조의 리모델링, 림프성 부종의 분해 및 치료 12개월 내 규칙적인 1일 활성의 재개를 나타낸다.
진행중인 환자 모집으로부터, 발명자들은 누난 (또는 누난-관련된) 증후군, 고함-스타우트 병, 카포시형 림프관종증 (KLA), 림프관 확장증 및 CCLA에 걸린 환자를 포함한 추가적인 림프 이상증 환자를 조사하였다. 43명의 추가적인 환자를 시퀀싱할 때, 발명자들은 KRAS, BRAF, RASA1, PTPN11 및 SOS1에서 7개의 추가적인 돌연변이를 확인하였으며 (표 3), RAS-MAPK 신호전달이 다양한 임상적 림프성 질환 징후의 원인이 되는 공통 경로임을 시사한다. 실제로, 림프관 생성의 신호전달에서 RAS-MAPK 경로가 중요한 역할을 한다는 것이 점점 더 인정되고 있다 (21-23). 문헌을 검토하여, 발명자들은 KRAS, HRAS, BRAF, RAF1, PTPN11, SHOC2, CBL, RIT1 및 SOS1에서 돌연변이를 갖는 50명 초과의 환자를 확인하였고, 림프 결함과 함께 늑막 삼출, 심막 삼출, 유미흉증, 수증, 림프관 확장증 및 림프 부종을 포함한 누난 또는 누난-관련된 증후군의 임상적 특징을 제공하였다 (21-23). 발명자들의 작업이 진행 중이지만, 재발성 NRAS 변이체는 GLA(37) 및 KLA(38)에서도 나타났으며, 이들 질환 실체물 사이에서 공유된 유전적 병인 및 림프 이상증의 RAS-MAPK 경로에서 돌연변이의 중요성에 대한 추가의 지지를 제공한다.
인간 암의 RAS 질환에서 돌연변이의 광범위한 유병률이 수십 년 동안 인식되어 왔다. cBioPortal (39) 데이터베이스 (n = 71,857 대상체 및 2019년 2월 6일에 조회됨)를 사용한, 발명자들이 알아낸 ARAF 돌연변이의 면밀한 조사는 ARAF에서 동일한 정확한 돌연변이를 가진 2명의 환자를 나타냈다. 흥미롭게도, 그들은 둘 다 공존하는 TP53 돌연변이를 가지고 있었으며, 이것들은 종양 형성 구동자로 간주된다. 이 잔기에서의 상이한 돌연변이 (S214T, S214A, S214Y, S214C 및 S214F)는, 그 중 셋에서 높아진 MEK/ERK 인산화를 증가시키는 것으로 나타났으며, 상이한 유형의 암에 걸린 10명의 환자에서도 관찰되었다 (40). 하지만, 10명의 환자 중 9명이 TP53, GNAS, AKT2, APC, EGFR, ATM, CHEK2, KIT 또는 U2AF1에서 공존하는 종양 형성 돌연변이를 가지고 있으며, 이들 종양 형성 구동자가 암 세포에서 과도한 증식의 원인이 될 수 있을 가능성을 증가시킨다. ARAF 돌연변이를 가진 선도 프로밴드는 팽창된 림프관을 갖지만 수년의 추적 조사에서 병소 크기의 증가를 나타내지 않았다. 따라서, 이들 데이터는 발명자들이 알아낸 ARAF 돌연변이가 시험관 내에서 림프 내피 세포의 증식의 증가를 구동하지 않을 수 있다는 발명자들의 관찰과 일치한다.
돌연변이-양성 림프 이상증의 유병률에 관하여, 제한되는 것은 아니지만, GLA, 고함-스타우트 병, CCLA, KLA, 클리펠-트레노우네이 증후군 및 카포시형 혈관 내피종(hemangioendothelioma)을 포함한 림프 이상증의 이 군에 대해 다중 센터 임상 시험을 용이하게 하기 위해 림프 이상증 컨소시엄을 형성하는 미국 내 11개 센터 중에서, 중간 내지 중증 질환 과정으로 3,000명이 넘는 환자가 모집되었고, 매년 새로운 환자의 수는 합쳐서 약 300명이다. 현재의 분자적 진단 수율 (20%)에 기초하여, 발명자들은 그들 중 약 20%가 RAS-MAPK 경로에 결함을 가지고 있을 것으로 예상하며, 미국에서 전체적으로 수천 명의 환자가 MEK 억제자 요법으로부터 이익을 얻을 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 발명자들의 작업은 유전적 발견이 질환 분류에 영향을 미치고 정확한 의학적 접근법의 실현인, 이전에 알려지지 않은 병인의 림프 이상증 환자에서 나타난 바와 같이 신규한 생물학적 및 생명을 구하는 치료를 알아내는 방법을 예시한다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
본 발명의 바람직한 구체예 중 어떤 것이 상기 기재되고 특이적으로 예시되어 있지만, 본 발명이 이러한 구체예에 제한되도록 의도되는 것은 아니다. 다음 청구범위에서 제시된 바와 같이 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The Children's Hospital of Philadelphia <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF LYMPHATIC SYSTEM DISORDERS <130> CHOP-P06613WO00 <150> US 62/728,444 <151> 2018-09-07 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1782 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacatcgc ggagatggtt tcacccaaat atcactggtg tggaggcaga aaacctactg 60 ttgacaagag gagttgatgg cagttttttg gcaaggccta gtaaaagtaa ccctggagac 120 ttcacacttt ccgttagaag aaatggagct gtcacccaca tcaagattca gaacactggt 180 gattactatg acctgtatgg aggggagaaa tttgccactt tggctgagtt ggtccagtat 240 tacatggaac atcacgggca attaaaagag aagaatggag atgtcattga gcttaaatat 300 cctctgaact gtgcagatcc tacctctgaa aggtggtttc atggacatct ctctgggaaa 360 gaagcagaga aattattaac tgaaaaagga aaacatggta gttttcttgt acgagagagc 420 cagagccacc ctggagattt tgttctttct gtgcgcactg gtgatgacaa aggggagagc 480 aatgacggca agtctaaagt gacccatgtt atgattcgct gtcaggaact gaaatacgac 540 gttggtggag gagaacggtt tgattctttg acagatcttg tggaacatta taagaagaat 600 cctatggtgg aaacattggg tacagtacta caactcaagc agccccttaa cacgactcgt 660 ataaatgctg ctgaaataga aagcagagtt cgagaactaa gcaaattagc tgagaccaca 720 gataaagtca aacaaggctt ttgggaagaa tttgagacac tacaacaaca ggagtgcaaa 780 cttctctaca gccgaaaaga gggtcaaagg caagaaaaca aaaacaaaaa tagatataaa 840 aacatcctgc cctttgatca taccagggtt gtcctacacg atggtgatcc caatgagcct 900 gtttcagatt acatcaatgc aaatatcatc atgcctgaat ttgaaaccaa gtgcaacaat 960 tcaaagccca aaaagagtta cattgccaca caaggctgcc tgcaaaacac ggtgaatgac 1020 ttttggcgga tggtgttcca agaaaactcc cgagtgattg tcatgacaac gaaagaagtg 1080 gagagaggaa agagtaaatg tgtcaaatac tggcctgatg agtatgctct aaaagaatat 1140 ggcgtcatgc gtgttaggaa cgtcaaagaa agcgccgctc atgactatac gctaagagaa 1200 cttaaacttt caaaggttgg acaagggaat acggagagaa cggtctggca ataccacttt 1260 cggacctggc cggaccacgg cgtgcccagc gaccctgggg gcgtgctgga cttcctggag 1320 gaggtgcacc ataagcagga gagcatcatg gatgcagggc cggtcgtggt gcactgcagt 1380 gctggaattg gccggacagg gacgttcatt gtgattgata ttcttattga catcatcaga 1440 gagaaaggtg ttgactgcga tattgacgtt cccaaaacca tccagatggt gcggtctcag 1500 aggtcaggga tggtccagac agaagcacag taccgattta tctatatggc ggtccagcat 1560 tatattgaaa cactacagcg caggattgaa gaagagcaga aaagcaagag gaaagggcac 1620 gaatatacaa atattaagta ttctctagcg gaccagacga gtggagatca gagccctctc 1680 ccgccttgta ctccaacgcc accctgtgca gaaatgagag aagacagtgc tagagtctat 1740 gaaaacgtgg gcctgatgca acagcagaaa agtttcagat ga 1782 <210> 2 <211> 567 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60 atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120 aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180 caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240 gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300 aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360 ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420 tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480 cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540 tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567 <210> 3 <211> 2301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcggcgc tgagcggtgg cggtggtggc ggcgcggagc cgggccaggc tctgttcaac 60 ggggacatgg agcccgaggc cggcgccggc gccggcgccg cggcctcttc ggctgcggac 120 cctgccattc cggaggaggt gtggaatatc aaacaaatga ttaagttgac acaggaacat 180 atagaggccc tattggacaa atttggtggg gagcataatc caccatcaat atatctggag 240 gcctatgaag aatacaccag caagctagat gcactccaac aaagagaaca acagttattg 300 gaatctctgg ggaacggaac tgatttttct gtttctagct ctgcatcaat ggataccgtt 360 acatcttctt cctcttctag cctttcagtg ctaccttcat ctctttcagt ttttcaaaat 420 cccacagatg tggcacggag caaccccaag tcaccacaaa aacctatcgt tagagtcttc 480 ctgcccaaca aacagaggac agtggtacct gcaaggtgtg gagttacagt ccgagacagt 540 ctaaagaaag cactgatgat gagaggtcta atcccagagt gctgtgctgt ttacagaatt 600 caggatggag agaagaaacc aattggttgg gacactgata tttcctggct tactggagaa 660 gaattgcatg tggaagtgtt ggagaatgtt ccacttacaa cacacaactt tgtacgaaaa 720 acgtttttca ccttagcatt ttgtgacttt tgtcgaaagc tgcttttcca gggtttccgc 780 tgtcaaacat gtggttataa atttcaccag cgttgtagta cagaagttcc actgatgtgt 840 gttaattatg accaacttga tttgctgttt gtctccaagt tctttgaaca ccacccaata 900 ccacaggaag aggcgtcctt agcagagact gccctaacat ctggatcatc cccttccgca 960 cccgcctcgg actctattgg gccccaaatt ctcaccagtc cgtctccttc aaaatccatt 1020 ccaattccac agcccttccg accagcagat gaagatcatc gaaatcaatt tgggcaacga 1080 gaccgatcct catcagctcc caatgtgcat ataaacacaa tagaacctgt caatattgat 1140 gacttgatta gagaccaagg atttcgtggt gatggaggat caaccacagg tttgtctgct 1200 accccccctg cctcattacc tggctcacta actaacgtga aagccttaca gaaatctcca 1260 ggacctcagc gagaaaggaa gtcatcttca tcctcagaag acaggaatcg aatgaaaaca 1320 cttggtagac gggactcgag tgatgattgg gagattcctg atgggcagat tacagtggga 1380 caaagaattg gatctggatc atttggaaca gtctacaagg gaaagtggca tggtgatgtg 1440 gcagtgaaaa tgttgaatgt gacagcacct acacctcagc agttacaagc cttcaaaaat 1500 gaagtaggag tactcaggaa aacacgacat gtgaatatcc tactcttcat gggctattcc 1560 acaaagccac aactggctat tgttacccag tggtgtgagg gctccagctt gtatcaccat 1620 ctccatatca ttgagaccaa atttgagatg atcaaactta tagatattgc acgacagact 1680 gcacagggca tggattactt acacgccaag tcaatcatcc acagagacct caagagtaat 1740 aatatatttc ttcatgaaga cctcacagta aaaataggtg attttggtct agctacagtg 1800 aaatctcgat ggagtgggtc ccatcagttt gaacagttgt ctggatccat tttgtggatg 1860 gcaccagaag tcatcagaat gcaagataaa aatccataca gctttcagtc agatgtatat 1920 gcatttggaa ttgttctgta tgaattgatg actggacagt taccttattc aaacatcaac 1980 aacagggacc agataatttt tatggtggga cgaggatacc tgtctccaga tctcagtaag 2040 gtacggagta actgtccaaa agccatgaag agattaatgg cagagtgcct caaaaagaaa 2100 agagatgaga gaccactctt tccccaaatt ctcgcctcta ttgagctgct ggcccgctca 2160 ttgccaaaaa ttcaccgcag tgcatcagaa ccctccttga atcgggctgg tttccaaaca 2220 gaggatttta gtctatatgc ttgtgcttct ccaaaaacac ccatccaggc agggggatat 2280 ggtgcgtttc ctgtccactg a 2301 <210> 4 <211> 4002 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgcaggcgc agcagctgcc ctacgagttt ttcagcgaag agaacgcgcc caagtggcgg 60 ggactactgg tgcctgcgct gaaaaaggtc caggggcaag ttcatcctac tctcgagtct 120 aatgatgatg ctcttcagta tgttgaagaa ttaattttgc aattattaaa tatgctatgc 180 caagctcagc cccgaagtgc ttcagatgta gaggaacgtg ttcaaaaaag tttccctcat 240 ccaattgata aatgggcaat agctgatgcc caatcagcta ttgaaaagag gaagcgaaga 300 aaccctttat ctctcccagt agaaaaaatt catcctttat taaaggaggt cctaggttat 360 aaaattgacc accaggtttc tgtttacata gtagcagtct tagaatacat ttctgcagac 420 attttaaagc tggttgggaa ttatgtaaga aatatacggc attatgaaat tacaaaacaa 480 gatattaaag tggcaatgtg tgctgacaag gtattgatgg atatgtttca tcaagatgta 540 gaagatatta atatattatc tttaactgac gaagagcctt ccacctcagg agaacaaact 600 tactatgatt tggtaaaagc atttatggca gaaattcgac aatatataag ggaactaaat 660 ctaattataa aagtttttag agagcccttt gtctccaatt caaaattgtt ttcagctaat 720 gatgtagaaa atatatttag tcgcatagta gatatacatg aacttagtgt aaagttactg 780 ggccatatag aagatacagt agaaatgaca gatgaaggca gtccccatcc actagtagga 840 agctgctttg aagacttagc agaggaactg gcatttgatc catatgaatc gtatgctcga 900 gatattttgc gacctggttt tcatgatcgt ttccttagtc agttatcaaa gcctggggca 960 gcactttatt tgcagtcaat aggcgaaggt ttcaaagaag ctgttcaata tgttttaccc 1020 aggctgcttc tggcccctgt ttaccactgt ctccattact ttgaactttt gaagcagtta 1080 gaagaaaaaa gtgaagatca agaagacaag gaatgtttaa aacaagcaat aacagctttg 1140 cttaatgttc agagtggtat ggaaaaaata tgttctaaaa gtcttgcaaa acgaagactg 1200 agtgaatctg catgtcggtt ttatagtcag caaatgaagg ggaaacaact agcaatcaag 1260 aagatgaacg agattcagaa gaatattgat ggttgggagg gaaaagacat tggacagtgt 1320 tgtaatgaat ttataatgga aggaactctt acacgtgtag gagccaaaca tgagagacac 1380 atatttctct ttgatggctt aatgatttgc tgtaaatcaa atcatgggca gccaagactt 1440 cctggtgcta gcaatgcaga atatcgtctt aaagaaaagt tttttatgcg aaaggtacaa 1500 attaatgata aagatgacac caatgaatac aagcatgctt ttgaaataat tttaaaagat 1560 gaaaatagtg ttatattttc tgccaagtca gctgaagaga aaaacaattg gatggcagca 1620 ttgatatctt tacagtaccg gagtacactg gaaaggatgc ttgatgtaac aatgctacag 1680 gaagagaaag aggagcagat gaggctgcct agtgctgatg tttatagatt tgcagagcct 1740 gactctgaag agaatattat atttgaagag aacatgcagc ccaaggctgg aattccaatt 1800 atcaaagcag gaactgttat taaacttata gagaggctta cgtaccatat gtacgcagat 1860 cccaattttg ttcggacatt tcttacaaca tacagatcct tttgcaaacc tcaagaacta 1920 ctgagtctta taatagaaag gtttgaaatt ccagagcctg agccaacaga agctgatcgc 1980 atagctatag agaatggaga tcaacccttg agtgcagaac tgaaaagatt tagaaaagaa 2040 tatatacagc ctgtgcaact gcgagtatta aatgtatgtc ggcactgggt agagcaccac 2100 ttctatgatt ttgaaagaga tgcatatctt ttgcaacgaa tggaagaatt tattggaaca 2160 gtaagaggta aagcaatgaa aaaatgggtt gaatccatca ctaaaataat ccaaaggaaa 2220 aaaattgcaa gagacaatgg accaggtcat aatattacat ttcagagttc acctcccaca 2280 gttgagtggc atataagcag acctgggcac atagagactt ttgacctgct caccttacac 2340 ccaatagaaa ttgctcgaca actcacttta cttgaatcag atctataccg agctgtacag 2400 ccatcagaat tagttggaag tgtgtggaca aaagaagaca aagaaattaa ctctcctaat 2460 cttctgaaaa tgattcgaca taccaccaac ctcactctgt ggtttgagaa atgtattgta 2520 gaaactgaaa atttagaaga aagagtagct gtggtgagtc gaattattga gattctacaa 2580 gtctttcaag agttgaacaa ctttaatggt gtccttgagg ttgtcagtgc tatgaattca 2640 tcacctgttt acagactaga ccacacattt gagcaaatac caagtcgcca gaagaaaatt 2700 ttagaagaag ctcatgaatt gagtgaagat cactataaga aatatttggc aaaactcagg 2760 tctattaatc caccatgtgt gcctttcttt ggaatttatc tcactaatat cttgaaaaca 2820 gaagaaggca accctgaggt cctaaaaaga catggaaaag agcttataaa ctttagcaaa 2880 aggaggaaag tagcagaaat aacaggagag atccagcagt accaaaatca gccttactgt 2940 ttacgagtag aatcagatat caaaaggttc tttgaaaact tgaatccgat gggaaatagc 3000 atggagaagg aatttacaga ttatcttttc aacaaatccc tagaaataga accacgaaac 3060 cctaagcctc tcccaagatt tccaaaaaaa tatagctatc ccctaaaatc tcctggtgtt 3120 cgtccatcaa acccaagacc aggtaccatg aggcatccca cacctctgca gcaggagcca 3180 aggaaaatta gttatagtag gatccctgaa agtgaaacag aaagtacagc atctgcacca 3240 aattctccaa gaacaccgtt aacacctccg cctgcttctg gtgcttccag taccacagat 3300 gtttgcagtg tatttgattc cgatcattcg agcccttttc actcaagcaa tgataccgtc 3360 tttatccaag ttactctgcc ccatggccca agatctgctt ctgtatcatc tataagttta 3420 accaaaggca ctgatgaagt gcctgtccct cctcctgttc ctccacgaag acgaccagaa 3480 tctgccccag cagaatcttc accatctaag attatgtcta agcatttgga cagtccccca 3540 gccattcctc ctaggcaacc cacatcaaaa gcctattcac cacgatattc aatatcagac 3600 cggacctcta tctcagaccc tcctgaaagc cctcccttat taccaccacg agaacctgtg 3660 aggacacctg atgttttctc aagctcacca ctacatctcc aacctccccc tttgggcaaa 3720 aaaagtgacc atggcaatgc cttcttccca aacagccctt ccccctttac accacctcct 3780 cctcaaacac cttctcctca cggcacaaga aggcatctgc catcaccacc attgacacaa 3840 gaagtggacc ttcattccat tgctgggccg cctgttcctc cacgacaaag cacttctcaa 3900 catatcccta aactccctcc aaaaacttac aaaagggagc acacacaccc atccatgcac 3960 agagatggac caccactgtt ggagaatgcc cattcttcct ga 4002 <210> 5 <211> 3108 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggcggcc cggctgcgcc gaggggcgcc gggaggctcc gcgcgctgct gctggcgctg 60 gtggtcgcgg ggatccccgc gggcgcctac aacctcgacc cgcagcgccc cgtgcacttc 120 cagggccccg ctgactcgtt cttcggctac gcagttctgg agcatttcca cgacaacacg 180 cgctgggtcc ttgtgggcgc accaaaggca gattccaaat acagcccttc agtgaagtct 240 cctggggctg tgtttaagtg ccgtgttcac accaaccctg accggagatg caccgaactg 300 gacatggctc gagggaagaa tcggggcacg tcctgcggaa agacctgccg ggaagaccgc 360 gatgatgagt ggatgggggt gagcctggcc cgacagccca aggctgatgg ccgtgtgttg 420 gcctgtgctc atcgctggaa gaacatctac tatgaagccg accacatcct accccatggc 480 ttctgctaca tcatcccctc caacctccag gccaaaggca ggacgctgat cccttgctat 540 gaagagtata agaagaagta cggagaggaa cacggctcct gccaggctgg gatagcgggc 600 ttcttcaccg aggagctggt ggtgatgggt gctccagggt cattttattg ggctggaacc 660 atcaaagtgc tgaaccttac ggacaacacc tatttaaaac tgaacgacga agtgatcatg 720 aacaggcggt acacctacct gggctacgca gtgaccgctg gccacttctc tcacccgtcc 780 accattgatg tggtaggagg tgccccacag gacaaaggca tcggcaaggt ttatattttc 840 agagctgacc gaagatcagg caccttaatt aagatctttc aagcatcagg taaaaagatg 900 ggctcttact tcggctcctc cttgtgcgca gttgacctga atggggacgg cctctctgac 960 ctgctggtgg gggcccccat gttttctgag atcagggatg agggacaggt cactgtctac 1020 atcaacagag gaaatggagc cctcgaggag cagctggctc tgactgggga tggtgcctac 1080 aatgcgcact ttggagagag cattgccagc ctggacgatc tggacaatga tgggttccca 1140 gatgtggcca ttggtgcacc caaggaggat gacttcgcag gggcggtcta tatctatcat 1200 ggtgatgccg gtgggatagt ccctcagtac tcaatgaaac tgtctgggca gaagataaat 1260 ccagtgctcc ggatgtttgg tcagtccata tcgggaggca ttgatatgga tggaaatggc 1320 tatcctgatg tcactgttgg agccttcatg tccgacagcg tggttcttct cagagcaagg 1380 cctgtcatta cggtggatgt ctccatcttc ctcccgggct ccatcaacat cacagcgcct 1440 cagtgtcacg acggacagca gcctgtgaac tgcctgaacg tcaccacctg cttcagcttc 1500 catggcaaac acgttccagg agagattggc ctgaattatg ttctgatggc tgacgtggcc 1560 aaaaaggaga agggccagat gcccagggtc tactttgtgc tgctgggaga gaccatgggt 1620 caggtcacag agaagctgca gctgacttac atggaggaga cgtgtcgtca ctatgtggcc 1680 catgtgaagc ggagggtgca ggacgtcatc agcccgatcg tgtttgaagc agcctacagc 1740 ctcagtgagc atgtgactgg agaggaggag agggaactgc cgcctctgac accagttctc 1800 cgctggaaaa agggacaaaa gattgcccaa aagaatcaga ctgtttttga aaggaattgc 1860 cgttcagagg actgtgccgc agacctgcag cttcagggta aactgctgct ctccagtatg 1920 gatgagaaaa ccctgtatct agctttgggg gctgtgaaga acatctccct aaacatctct 1980 atctccaacc tcggagatga tgcctatgat gccaacgtgt ccttcaatgt ttcccgggag 2040 ctcttcttca tcaacatgtg gcagaaggag gagatgggca tctcctgtga gctgctggaa 2100 tcggacttcc tcaaatgcag cgtgggattt cctttcatga ggtcaaagtc aaagtatgaa 2160 ttcagcgtga tctttgatac aagccacctg tctggggaag aggaagttct cagcttcatt 2220 gttactgctc agagtggcaa cacggagcgc tctgaatccc tgcatgacaa caccctcgtg 2280 ctgatggtgc cactgatgca cgaggtggac acgtccatca ccggaatcat gtctccaacc 2340 tcctttgtat atggcgagtc cgtggacgca gccaacttca ttcagctgga tgacctggag 2400 tgtcactttc agcccatcaa tatcaccctt caggtctaca acactggccc aagcaccctt 2460 ccagggtcat ctgtcagcat ctctttccct aatcgactct catctggtgg tgcagagatg 2520 tttcatgtcc aggaaatggt ggtgggccaa gagaagggaa actgctcttt ccagaaaaac 2580 ccaactccct gcatcatccc tcaagaacaa gaaaatatct tccacacaat atttgctttt 2640 ttcacaaagt ctggaagaaa agtcttggac tgtgaaaaac caggaatttc ttgcctaaca 2700 gcacactgta actttagtgc tcttgctaaa gaagaaagtc gtactataga catttacatg 2760 ctgctgaaca cagaaatact gaaaaaggac agttcgtctg tcatccagtt catgtcccgc 2820 gccaaggtga aggtggatcc tgccctaagg gtggtggaaa tagctcatgg gaacccagaa 2880 gaggtgacgg tggtcttcga ggccctgcac aatctggagc cccgtggcta cgtcgtgggg 2940 tggatcatcg ccatcagttt gttggtggga atcctcatct tcctgctgct ggccgtgctg 3000 ctctggaaga tgggcttctt tcgccgaagg tacaaagaaa ttatcgaagc tgagaagaac 3060 cggaaagaga atgaagacag ttgggactgg gtccagaaaa accagtga 3108 <210> 6 <211> 4402 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgtaacccag gcagctgggg agcctgggct gtggccctag gagggggcgc ggcggcgggc 60 tctctccttt tgttgttgtt tcctcagcct ggggagctga aggggagacg cgtctgggtg 120 gggctgctcg gagcccgggc ctggtggccc ctggggctcc cgggcgggca gggtagggca 180 gagtagagcg ggcttcaaca tgatggcggc cgaggccggc agtgaggagg gcggcccggt 240 aacagccgga gctggaggag gcggcgcggc agcgggctcc agtgcctatc ccgcagtgtg 300 tcgggtgaag atacccgcgg ccctgcctgt ggcagccgcc ccctatcctg ggctggtgga 360 gaccggagtg gctggaactc tgggtggcgg agccgctttg gggtcagagt tcctaggagc 420 cgggtctgtg gcaggggcac 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ttattcacag ctcttccatg tagacttacc tttcctcata 6660 gagctatcct ggttaataac aggccaagat tctcccatta tcccctgttg tctcctgtag 6720 ctttgataat gcctgggaga ttccttggtg taagtgtcat ggataccgac tgtttttatg 6780 ttggaatttg ttccaacata attagaatct gtttggtgag ttgaaaggta agttggctca 6840 gagttgcaca gtagggcatt aaatgtttaa gcaaagcatc tgcccacact cccctttcca 6900 atctagtgcc ttccttgaac tttttcctga gctgctacgt ccctaatccc ccttgttggg 6960 aggattttcg tatcaccctt atgggacctg tcaccatgtc ctgtactatt tggaattggt 7020 tttccagtct ttcaacaacc gttgtggcta actatgtttt agaagggctg gaggtgtggg 7080 ccctgtcttc gggtctcagg acccaaagat cctttagtca gttgttgggt cttccaagag 7140 ccagacatta atacagattg aactccatca gtcccctaat tgtcagcctt tacctccctc 7200 ccagagcaag gagtttaggg attctaaagc ttagtgtcca cacatcattc taccagacct 7260 tagagcttta gaagctcaat ctaaaatact gtaactcagc ataaactatt actatcactc 7320 ctttgaactc agtctccatg agcagtgttt tgttggaaat acatagaacg gcttaatgcc 7380 tagagggtgg tggatagtga aggacggtca aggttatatt tttgactgct tagggattct 7440 ttggatccaa gaaacagaaa 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ttatttcctg tttttcttcc ctttgtcagt cttcgcatcc 8340 aagatttctt ccctccctct tgtgggccag cctgtcctgt tccagagcta gcctgttcct 8400 gggtagcctt ccttagcctc cattcagcct caggtctttt gccttcttcc gtgtttattt 8460 agagagcaga atctaataac gggttccact gtagccacta tccatggact tctgggtcct 8520 cttcaggttt gagtgcttga aaatgttcat tctctgggct tgtggcctgt ctcctccact 8580 ctcctcctca ccctctcgct ccttcctgtg tgagggccgc tctgcagtaa tgttctcagg 8640 caagccttcc taggcacctc agaaactact ttgccagagc cagtaagaat atataatatt 8700 ggagcagttg ccaggataga aattaaatat agattccagt ttaggataga gtttttaccg 8760 agagctcttt agacagtata cctgtgtctt ctctggcaat tgctttcatt ttagtcctat 8820 ataaaagctt tccttttctg ttttttttta aaactatgct tttgcttgcc taaatctttt 8880 gatcttatat ttctctcatc tcagagcctg tcctgagttg taaggtattt catactgcct 8940 tacttaaaag ttttttaaac tactagagtc atttgataca cacagaagtt acctaataat 9000 ccaaagatgt ccatcaaggg aggaagggtg ggtcatcaga ctttgccttt gatgttgtag 9060 actaggctcc tgagttaagc agcagaggga cagcagtgcc atgtgccttc actgtgtccc 9120 aggaaatctg ggttggttcc agtgggaaat accagtattt cttggttctg gaaagtagca 9180 aaagagtagg agatggggaa atagggatgg ggagagcaag ccccgcatgt ccatggcgag 9240 tcaggtgggg agcacgggtg gaagggccgg ctgttgacag acagactaag ctgtgtggtg 9300 ctcttgccgc cccttcctgg gtacagagct tgagaaaaat gcagccgacc actccctgtg 9360 tttgtacaga gcaaagccca aaagccaacc tcagatctcc tgatttggca gctgaagaaa 9420 tcagcagagt cctgattgcc tgattcagtc ccaaaaatga atgtcaggcc ccgccccctc 9480 cccaccaaca ttgcctctcc tacattctcc ttctgcccct aaatcagaca ggaggccaga 9540 gaggagtatt gctcaatgcg tgctatgtgc aactcctcag gccttgtgcc acctccatgc 9600 tgagccctga agcagggtgt cctgggtgcc tgtgtgtcag ctccctcctc tctacctacc 9660 tctgaccttc ttgtgggtga gggtggccat gcttatggcc atcttaaaac tggagaggca 9720 gagaactact tatgagtctg tagaccacgt gttgtcttcc atggcctgtt tctcctgctg 9780 tctgggtgag tgagcctgca acgcaatgcc catgagagta aatgcctcct gacctaccct 9840 gctcagcact gttctagtgt cttggccttg aaagaaaagc ctgacttcct gctgacacat 9900 gtggtagggg catggcagct atgaggcacc tcctacgtct gttttctggc tgtggtgact 9960 tgggattttt aaccttatat atctttttcc tttactcaaa acaaaacaat ttttagcaca 10020 ctgaaaaaaa aaaaaagcca aatgttttgt gcctttctaa ggcagcactg tatcccaggc 10080 tgcattttag gacttaatat ggaaatacca gagtctgagc tcctctacct tgagtttcat 10140 tagtccttag tgtctaggag acaggaaaga atgctctctg tgactggaga ggtgacatgc 10200 aggtgcagtg tgtctggagt ccctttcccc tgctgtgaga cttcagtgga ggagagaagc 10260 attgtaccct gggatcattt ggttggttcc aatcacaagc ttagttatca ggttgcatgc 10320 cttgtctcct gcaaaagaca gaatgtttca caattcccag gtaaactctg gaccattcca 10380 agtgtcctag ccttctgatg acattaatta cctagttgtg tcgaggagta taggatggac 10440 tctcctgaga aggggaggtt ggtggctttg tcttttcttt ttgctggatc ctgaactggt 10500 ctagacctcc tgcccccacc ccccagcccc catcagatgt ggctggcctt tcatttgaag 10560 gcttcagact taaagcatta agcagctagt gccctctgca gggcctggtt tccccaggga 10620 agggcagcaa ggaacatggg accagaagcc tgtcctcagt aatgtgacta tagtgagctt 10680 tagcaaaagt ttttctatat aatgacatct tacttatctt ttaccctttc ctcagttttc 10740 ccctgccttt aactaataaa gaattgggag acagaaattt taaagtcctc cttattcaag 10800 attttgaaat tcttagcctg ggagtgctgg agagaacctg atgctttctc cagaatgaag 10860 agtcccaatt tgtatatcag tgttaagaag aaaacaaaac aaacacatag gtgagatttt 10920 cgtggactat tttaaaaatg tgtcattaat ataaaaaatt tatattagca gtatttaatc 10980 attctcacct gtaaagaata agaaaaacag aaggtaaata ttcttacaga gaatagcaga 11040 gctttaagat tcattttcat tttaagtcca ttttattttg ccagtgtatt aatgtttaga 11100 agtctgtttt actaatgtta tttattaatt ttttttcatt tccatacaca gttagttaac 11160 taaagagctt tttcaagcac ccatgtctgt aaaaaaatat ttttaaataa agtttctttt 11220 gttgtagcag aaaaaaaaaa a 11241 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a zebrafish-adapted kozak sequence <400> 12 gcaaacatgg 10 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tccacgtcca ctc 13 <210> 14 <211> 13 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tccacgycca ctc 13 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Pro Leu Gln Arg Ile Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Xenopus tropicalis <400> 16 Ser Leu Gln Arg His Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Ile Asp 1 5 10 15 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 17 Gln Arg Leu Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val Thr Met Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Leu Ser Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn Val His Ile 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Phe Gly Gln Arg Gln Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val 1 5 10 15

Claims (40)

  1. 인간 환자에서 림프 이상증을 진단하기 위한 방법으로서,
    a) 환자의 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b) 핵산을 분석하여
    i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지; 또는
    ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및
    c) i) 또는 ii)의 SNV가 존재하는 경우 환자를 림프 이상증으로 진단하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 인간 환자에서 림프 이상증을 진단하기 위한 방법으로서,
    a) 인간 환자로부터 유전자형 서열 정보를 얻는 단계;
    b) 서열 정보로부터
    i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지; 또는
    ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및
    c) i) 또는 ii)의 SNV가 존재하는 경우 환자를 림프 이상증으로 진단하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  3. 인간 환자에서 림프 이상증을 치료하기 위한 방법으로서,
    a) 환자의 핵산을 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b) 핵산을 분석하여
    i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지; 또는
    ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF, 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및
    c) i) 또는 ii)의 하나 이상의 SNV를 가진 것으로 확인된 환자에게 상기 림프 이상증의 치료에 적합한 하나 이상의 작용제를 투여하여, 림프 이상증을 치료하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  4. 인간 환자에서 림프 이상증을 치료하기 위한 방법으로서,
    a) 인간 환자로부터 유전자형 서열 정보를 얻는 단계;
    b) 서열 정보로부터
    i) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF, 및 CBL 중 하나 이상에서 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV)가 존재하는지; 또는
    ii) PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF, 및 CBL 중 하나 이상에서의 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계; 및
    c) i) 또는 ii)의 하나 이상의 SNV를 가진 것으로 확인된 환자에게 림프 이상증의 치료에 적합한 하나 이상의 작용제를 투여하여, 림프 이상증을 치료하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  5. 제3 항 또는 제4 항에 있어서, 상기 림프 이상증의 치료에 적합한 상기 작용제는 1) MEK/ERK 억제자; 2) 표 1 및 2에 나열된 작용제/억제자; 3) 표 1 및 2에 나열된 MEK/ERK 억제자 및 하나 이상의 작용제/억제자의 조합; 및/또는 4) 1) mTOR 억제자 및/또는 PIK3K 억제자; 및 2) 하나 이상의 MEK/ERK 억제자의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 표 1 또는 2에서 나열된 억제자, 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, SNV는
    a) PTN11에서의 c.1504T>G:pS502A, C1510A>G:pM504V 및 c.1507G>C:pG503R;
    b) KRAS에서의 c.35G>A:pG12D;
    c) BRAF에서의 c.1403T>C:pF468S 및 c.2128-G>T;
    d) SOS1에서의 c.2536G>A:pE846K
    e) ITGA9에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G;
    f) RASA1에서의 c.475_476del:p.(L159Gfs*20) 및 c.2246G>C p.R749P;
    g) RAF1에서의 c.433A>C:p.T145P;
    h) RIT1에서의 c.270G>T:p.M90I;
    i) PIEZ01에서의 c.7289C>T:p.P2430L;
    j) EPHB4에서의 c.2288G>A:p.R763Q 및 c.2654A>G:p.K885R
    k) NF1에서의 c.1034_1043del:p.(L345Pfs*28;
    l) CBL에서의 c.1096-1G>T 및 c.2322T>G:p.Y774*;
    m) ARAF에서의 c.640T>c:pS214P; 및
    n) a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k), l) 및 m) 중 하나 이상과 연계 불평형인 SNV
    중 적어도 하나로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 인간 환자에서 림프 이상증을 치료하기 위한 방법으로서 1) a MEK/ERK 억제자; 2) 표 1 및 2에 나열된 작용제/억제자; 3) 표 1 및 2에 나열된 MEK/ERK 억제자 및 하나 이상의 작용제/억제자의 조합; 및/또는 4) 1) mTOR 억제자 및/또는 PIK3K 억제자; 및 2) 하나 이상의 MEK/ERK 억제자의 조합으로부터 선택된 작용제의 유효량을 투여하여, 림프 이상증을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 있어서, 림프 이상증은 림프관의 비정상적인 형성 및/또는 조직 과증식을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 림프 이상증은 림프관종증 (LAM)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 림프 이상증은 전신 림프 이상증 (GLA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 림프 이상증은 심막, 늑막, 또는 복막 삼출을 포함한 유미 삼출증인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1 항 또는 제3 항에 있어서, 방법은 생물학적 샘플에서 검출 이후 SNV를 확인하는 보고서를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 방법에서 확인된 SNV에 기초하여 림프 이상증에 대해 제안된 치료(들)를 확인하는 보고서를 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 방법은 진단된 환자에게 상기 림프 이상증을 치료하는데 적합한 하나 이상의 작용제의 유효량을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 작용제 또는 상기 억제자는 표 1 및 2에서 나열된 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 피마세르팁, 레파메티닙 및/또는 트라메티닙으로부터 선택된 MEK 억제자가 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제는 100μM 미만, 10μM 미만, 1μM 미만, 100nM 미만, 10nM 미만, 또는 1nM 미만의 IC50을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16 항에 있어서, 작용제는 mTOR 신호전달을 억제하고 추가적인 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에 있어서, 추가적인 생물학적 활성은 PI3K의 억제, FK506 결합 단백질의 억제, DNA-PK의 억제, p110의 억제, 또는 p70S6K의 억제인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 PTPN11 내에 SNV를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 KRAS 내에 SNV를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 BRAF 내에 SNV를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 SOS1 내에 SNV를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 ITGA9에서 SNV를 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 임의의 조합으로 다음 SNV 중 1, 2, 3, 4, 또는 5개를 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) PTN11에서의 c.1504T>G:pS502A, C1510A>G:pM504V 및 c.1507G>C:pG503R;
    b) KRAS에서의 c.35G>A:pG12D;
    c) BRAF에서의 c.1403T>C:pF468S 및 c.2128-G>T;
    d) SOS1에서의 c.2536G>A:pE846K
    e) ITGA9에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G;
    f) RASA1에서의 c.475_476del:p.(L159Gfs*20) 및 c.2246G>C p.R749P;
    g) RAF1에서의 c.433A>C:p.T145P;
    h) RIT1에서의 c.270G>T:p.M90I;
    i) PIEZ01에서의 c.7289C>T:p.P2430L;
    j) EPHB4에서의 c.2288G>A:p.R763Q 및 c.2654A>G:p.K885R;
    k) NF1에서의 c.1034_1043del:p.(L345Pfs*28;
    l) CBL에서의 c.1096-1G>T 및 c.2322T>G:p.Y774*;
    m) ARAF에서의 c.640T>c:pS214P.
  27. 제26 항에 있어서, 환자는 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PEIZO1, EPHB4, NF1, ARAF 및 CBL 중 하나 이상 내의 상기 SNV와 연계 불평형인 SNV를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1 항 내지 제27 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 전신 화학 요법, 인터페론 알파, 방사선 요법, 및/또는 수술을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1 항 또는 제3 항에 있어서, 핵산을 분석하여 PTPN11, KRAS, BRAF, SOS1, ITGA9, RASA1, RAF1, RIT1, PIEZO1, EPHB4, NF1, CBL 및 ARAF 중 하나 이상 내의 단일 뉴클레오타이드 변이체 (SNV), 또는 상기 SNV와 연계 불평형인 SNV가 존재하는지를 결정하는 단계는 폴리뉴클레오타이드 샘플을 분석하여 특이적 혼성체화의 검출, 대립유전자 크기의 측정, 제한 단편 길이 다형성 분석, 대립유전자-특이적 혼성체화 분석, 단일 염기 프라이머 신장 반응, 및 증폭된 폴리뉴클레오타이드의 스퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택된 과정을 수행함으로써 상기 SNV의 존재를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1 항 내지 제29 항 중 어느 한 항의 방법으로서, 생물학적 샘플은 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1 항 내지 제30 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SNV(들)를 포함하는 핵산은 인간 환자의 단리된 세포로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 다음으로부터 선택된 SNV를 가진 핵산을 암호화하는 단리된 벡터:
    a) PTN11에서의 c.1504T>G:pS502A, C1510A>G:pM504V 및 c.1507G>C:pG503R;
    b) KRAS에서의 c.35G>A:pG12D;
    c) BRAF에서의 c.1403T>C:pF468S 및 c.2128-G>T;
    d) SOS1에서의 c.2536G>A:pE846K
    e) ITGA9에서의 c.1236+4A>G 및 c.289T>G:p.C97G;
    f) RASA1에서의 c.475_476del:p.(L159Gfs*20) 및 c.2246G>C p.R749P;
    g) RAF1에서의 c.433A>C:p.T145P;
    h) RIT1에서의 c.270G>T:p.M90I;
    i) PIEZ01에서의 c.7289C>T:p.P2430L;
    j) EPHB4에서의 c.2288G>A:p.R763Q 및 c.2654A>G:p.K885R;
    k) NF1에서의 c.1034_1043del:p.(L345Pfs*28;
    l) CBL에서의 c.1096-1G>T 및 c.2322T>G:p.Y774*; 및
    m) ARAF에서의 c.640T>c:pS214P.
  34. 제33 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 제34 항의 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물.
  36. 제35 항에 있어서, 트랜스제닉 동물은 마우스 또는 제브라피쉬인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 동물.
  37. 세포 신호전달을 변화시키는 작용제를 확인하기 위한 방법으로서,
    a) 제1 항 내지 제41 항 중 어느 한 항에서 청구된 바와 같이, 적어도 하나의 SNV 또는 상기 SNV와 연계 불평형인 SNV를 포함하는 적어도 하나의 핵산을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
    b) a)의 SNV에 상응하는 동족 야생형 서열을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
    c) a) 및 b)의 세포를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    d) 상기 작용제가 단계 b)와 비교하여 단계 a)의 세포의 세포 신호전달을 변화시키는지를 분석하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  38. 제37 항에 있어서, 상기 작용제는 MEK/ERK 억제자인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38 항에 있어서, 상기 MEK/ERK 억제자는 셀루메티닙 (AZD6244). PD0325901, 트라메티닙 (GSK1120212), PD184352 (CI-1040), 피마세르팁 (AS-703026), TAK-733, AZD8330, 비니메티닙 (MEK162, ARRY-162, ARRY-438162), SL-327, 레파메티닙 (RDEA119, Bay 86-9766), 및 코비메티닙 (GDC-0973, RG7420)으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39 항에 있어서, 상기 억제자는 셀루메티닙인 것을 특징으로 하는 방법.
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