ES2764381T3 - Métodos y composiciones para determinar la resistencia a la terapia de receptor de andrógenos - Google Patents

Métodos y composiciones para determinar la resistencia a la terapia de receptor de andrógenos Download PDF

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Abstract

Un método para determinar si un sujeto es o se volverá menos sensible a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos (AR) de primera o segunda generación, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para determinar la resistencia a la terapia de receptor de andrógenos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
D. Takayoshi et al., J. Steroid Biochem., Vol. 33, N° 5, páginas 845-851, se refiere al establecimiento y caracterización de anticuerpos monoclonales contra el receptor de andrógenos.
La EP 2065474 A1 se refiere a un método para predecir una respuesta clínica de un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad neoplásica a un modo de tratamiento dado mediante la determinación del estado de por lo menos un receptor hormonal seleccionado del grupo que comprende receptor de estrógeno, receptor de progesterona y/o receptor de andrógenos. C.E. Bohl et al., J. Bio. Chem., (2007) vol. 282, N° 18, páginas 13648-13655 se refiere a la estructura cristalina del dominio de unión al ligando del receptor de andrógenos humano t877a complejado con acetato de ciproterona, que proporciona información sobre los cambios conformacionales inducidos por ligandos y el diseño del fármaco basado en la estructura.
Xing Huo et al., Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, (2011) vol. 107, N° 2, páginas 283-289 se refiere a un análisis cuantitativo de la relación estructura-actividad de una nueva serie de productos químicos que antagonizan con WT y MT AR.
K. Haapala et al., Laboratory Investigation (2001) vol. 81, N° 12, páginas 1647-1651 se refiere a las alteraciones del receptor de andrógenos en la recaída de cáncer de próstata durante un bloqueo combinado de andrógenos por orquiectomía y bicalutamida.
La WO 0166599 A1 se refiere a una comparación de las estructuras cristalinas del dominio de unión a ligandos del receptor de andrógenos humano (hAR-LBD) con los dominios de unión al ligando del receptor de progesterona humano (hPR-(hPR-LBD) complejados con el mismo ligando metribolona (R1881).
La US 2010068802 A1 se refiere a variantes de corte y empalme del receptor de andrógenos (AR3, AR4, AR4b, AR5 y AR8) y variantes y fragmentos de los mismos que tienen un papel en la progresión del cáncer de próstata independiente de andrógenos.
El receptor de andrógenos ("AR") es una proteína reguladora transcripcional activada por ligandos que media la inducción de una variedad de efectos biológicos a través de su interacción con los andrógenos endógenos. Los andrógenos endógenos incluyen esteroides como la testosterona y la dihidrotestosterona. La testosterona se convierte en dihidrotestosterona por la enzima 5 alfa-reductasa en muchos tejidos.
Las acciones de los andrógenos con los receptores de andrógenos se han implicado en una serie de enfermedades o afecciones, como cánceres dependientes de andrógenos, virilización en mujeres y acné, entre otros. Los compuestos que disminuyen los efectos de la señalización de andrógenos a través del receptor de andrógenos y/o reducen las concentraciones de los receptores de andrógenos encuentran uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones en las que los receptores de andrógenos desempeñan un papel.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En la presente se describe la identificación de modificaciones en el receptor de andrógenos (AR) que confieren resistencia a los pacientes al tratamiento con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de fenilalanina en la posición 876 de un polipéptido de AR. En algunas realizaciones, la modificación es F876L. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado es resistente a la inhibición por un antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación seleccionado entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado es resistente a la inhibición por un antagonista del receptor de andrógenos de primera generación seleccionado entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida o nilutamida. En algunas realizaciones, el paciente tiene un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular) o cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado muestra una o más actividades de un receptor de AR del tipo salvaje, incluyendo pero no limitadas a, unión a coactivador, unión a ADN, unión a ligando o translocación nuclear. En algunas realizaciones, el antagonista de primera o segunda generación muestra una actividad antagonista disminuida contra un polipéptido de AR modificado en comparación con un polipéptido de AR del tipo salvaje.
En un aspecto, la invención proporciona métodos para determinar si un sujeto es o será resistente a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación, que comprende, consiste de o consiste esencialmente de: (a) probar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor de andrógenos del sujeto para determinar si el polipéptido del receptor de andrógenos codificado se modifica en la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o que se volverá resistente a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además un paso de obtener la muestra del sujeto.
En algunas realizaciones, al sujeto se le ha administrado un antagonista de AR de primera o segunda generación para el tratamiento de un cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular) o cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata resistente a la castración.
En la presente se describen antagonistas de AR de primera o segunda generación para su uso en métodos para determinar si un sujeto al que se le ha administrado un antagonista de AR de primera o segunda generación para el tratamiento de un cáncer es o será menos sensible a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos (AR) de primera o segunda generación, que comprende:
(a) obtener una muestra del sujeto,
(b) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado se modifica en una posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1,
(c) caracterizar al sujeto como resistente o que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación, y
(d) suspender el tratamiento con un antagonista de AR de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación o continuar el tratamiento con un antagonista de AR de primera o segunda generación si el sujeto no tiene la modificación.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), y RD162. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de primera generación se selecciona entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida o nilutamida.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para seleccionar un sujeto para terapia con un antagonista del receptor de andrógenos de tercera generación, que comprende, consiste de o consiste esencialmente de: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor de andrógenos del sujeto para determinar si el polipéptido del receptor de andrógenos codificado se modifica en la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos de tercera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además un paso de obtener la muestra del sujeto. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), y RD162.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para caracterizar el receptor de andrógenos de un sujeto para determinar si dicho sujeto puede ser resistente a la inhibición con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación, que comprende, consiste de o consiste esencialmente de: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor de andrógenos del sujeto para determinar si el polipéptido del receptor de andrógenos codificado se modifica en la posición de aminoácido 876 de la SEQ ID NO: 1; y (b) si el sujeto tiene la modificación en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1, caracterizar el receptor de andrógenos del sujeto como resistente a la inhibición con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además un paso de obtener la muestra del sujeto. En algunas realizaciones, el antagonista de primera o segunda generación muestra una actividad antagonista disminuida contra un polipéptido de AR modificado en comparación con un polipéptido de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), y RD162. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de primera generación se selecciona entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida o nilutamida.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para monitorizar si un sujeto que recibe un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación para el tratamiento de un cáncer ha desarrollado o desarrollará resistencia a la terapia, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene un molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor de andrógenos del sujeto para determinar si el polipéptido del receptor de andrógenos codificado se modifica en la posición de aminoácido 876 de la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o que se volverá resistente a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además un paso de obtener la muestra del sujeto. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de primera generación se selecciona entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida o nilutamida.
En la presente se describe un antagonista AR de primera o segunda generación para su uso en métodos para optimizar la terapia de un sujeto que recibe un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación para el tratamiento de un cáncer, que comprende, consiste de, o consiste esencialmente de: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del receptor de andrógenos del sujeto para determinar si el polipéptido del receptor de andrógenos codificado está modificado en la posición de aminoácido 876 de la SEQ ID NO: 1; y (c) (i) si la muestra tiene la modificación, suspender el tratamiento del sujeto con el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación o (ii) si la muestra no tiene la modificación, continuar el tratamiento del sujeto con el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación si el sujeto no tiene la modificación. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en métodos que comprenden además un paso para obtener la muestra del sujeto. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en métodos que además comprenden, consisten de o consisten esencialmente de suspender el tratamiento con el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación si la muestra del sujeto tiene la modificación en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en un método que además comprende, consiste de, o consiste esencialmente de continuar el tratamiento con un antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación si la muestra del sujeto no tiene la modificación en la posición 876 de SEQ ID NO: 1. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en un método que además comprende, consiste de o consiste esencialmente de administrar un antagonista del receptor de andrógenos de tercera generación que inhibe el AR modificado si la muestra del sujeto tiene la modificación en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de primera generación se selecciona entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida o nilutamida.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende, consiste de, y/o consiste esencialmente de una sustitución o una deleción del aminoácido en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende, consiste de o consiste esencialmente de una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende, consiste de o consiste esencialmente de una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende, consiste de o consiste esencialmente de una sustitución de fenilalanina por leucina en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende, consiste de o consiste esencialmente de una deleción del ácido nucleico que codifica la posición de aminoácido 876 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR modificado tiene (i) una mutación de timina (t) por citosina (c) en una posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácidos nucleicos 2626 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18; (ii) una mutación de citosina (c) por adenina (a) en la posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácidos nucleicos 2628 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18; o (ii) una mutación de citosina (c) por guanina (g) en la posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácidos nucleicos 2628 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico es ARN o ADN. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico es ADN genómico. En algunas realizaciones, el método comprende, consiste de o consiste esencialmente de aislar ARNm de la muestra de ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla de una muestra de células tumorales obtenida del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de biopsia tumoral, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de linfa, o un aspirado de médula ósea obtenido del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra contiene células tumorales circulantes. En algunas realizaciones, la muestra contiene células tumorales diseminadas. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se purifica a partir de la muestra antes de la prueba. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se amplifica antes de la prueba.
En algunas realizaciones, la prueba comprende, consiste de, o consiste esencialmente de realizar la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una muestra de ácido nucleico que codifica la posición 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la amplificación por PCR comprende, consiste de o consiste esencialmente de usar un par de cebadores de oligonucleótidos que flanquean la región que codifica la posición de aminoácido 876 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el método comprende además secuenciar el ácido nucleico amplificado por PCR usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, la prueba comprende, consiste de o consiste esencialmente de poner en contacto el ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico específica de secuencia, en donde la sonda de ácido nucleico específica de secuencia: (a) se une al ácido nucleico que codifica un receptor modificado que se modifica en la posición de aminoácido 876; y (b) no se une al ácido nucleico que codifica el receptor del tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición 876 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación inhibe un polipéptido del receptor de andrógenos de tipo salvaje mediante antagonismo competitivo. En algunas realizaciones, el antagonista del receptor de andrógenos de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100), o RD162.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o trastorno seleccionado entre cáncer, un trastorno inflamatorio o un trastorno proliferativo. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer mediado por AR. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona de un cáncer de próstata, un cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular), o un cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor sólido.
En algunas realizaciones, el sujeto se trata con el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación antes de obtener la muestra del sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto responde al tratamiento con el antagonista del receptor de andrógenos de primera o segunda generación cuando se administra por primera vez. En algunas realizaciones, la muestra para su uso en los métodos es una muestra obtenida al de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 14 meses, 16 meses, 18 meses, 20 meses, 22 meses o 24 meses después de la primera administración con el antagonista de AR de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces durante el transcurso del tratamiento con el antagonista de AR de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, el sujeto responde al tratamiento con el antagonista de AR de primera o segunda generación cuando se administra por primera vez.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para seleccionar compuestos que antagonizan con un receptor de andrógenos modificado, que comprenden, consisten de o consisten esencialmente de: (a) expresar un receptor de andrógenos modificado en una célula, en donde el receptor de andrógenos modificado se modifica en una posición de aminoácido correspondiente a la posición 876 de SEQ ID NO: 1; (b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y (c) detectar el nivel de actividad del receptor de andrógenos en la célula, en donde una disminución en la actividad expresada indica que el compuesto antagoniza con el AR modificado. En algunas realizaciones, el compuesto de prueba muestra actividad antagonista completa hacia el AR modificado. En algunas realizaciones, el compuesto de prueba no muestra actividad agonista hacia el AR modificado. En la presente se describe un inhibidor del receptor de andrógenos de tercera generación identificado por los métodos descritos en la presente. En algunas realizaciones, la modificación del polipéptido de AR usado en el método es una sustitución o deleción del aminoácido en la posición 876 del polipéptido del receptor de andrógenos. En algunas realizaciones, la modificación del polipéptido de AR usado en el método es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico en la posición de aminoácido 876 del polipéptido del receptor de andrógenos. En algunas realizaciones, la modificación del polipéptido de AR usado en el método es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido del receptor de andrógenos. En algunas realizaciones, la modificación del polipéptido de AR usado en el método es una sustitución de fenilalanina por leucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido receptor de andrógenos.
En algunas realizaciones, la célula empleada en el método es deficiente para la expresión del receptor de andrógenos del tipo salvaje, expresa un bajo nivel del receptor de andrógenos de tipo salvaje, o expresa un receptor de AR modificado. En algunas realizaciones, la célula se selecciona entre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3, TSY-PR1, LNCaP, CWR, VCaP y LAPC4. En algunas realizaciones, la célula comprende un gen informador enlazado operativamente a un promotor sensible a los andrógenos. En algunas realizaciones, la actividad del polipéptido de a R se determina analizando la expresión del gen informador. En algunas realizaciones, el promotor comprende un elemento de respuesta a andrógenos. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta a andrógenos es 4XARE o un elemento de probasina. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de probasina, un antígeno específico de la próstata, MMTV LTR, FASN, STEAP4, TMPRSS2, ORM1 o NKX3.1. En algunas realizaciones, el gen informador codifica una proteína seleccionada entre una luciferasa, una proteína fluorescente, una proteína bioluminiscente o una enzima.
En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido del receptor de andrógenos aislado o una variante del mismo que tiene actividad del receptor de andrógenos que comprende una modificación en una posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación confiere resistencia a un antagonista del receptor de andrógenos en el polipéptido del receptor de andrógenos modificado o variante. En algunas realizaciones, la modificación comprende la sustitución del aminoácido en la posición 876 en comparación con un receptor de andrógenos del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitución es F876L. En algunas realizaciones, la modificación comprende una deleción de la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado es un polipéptido recombinante. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una sustitución del aminoácido en la posición 876 en comparación con un receptor de andrógenos del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 y una o más sustituciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una sustitución en el aminoácido en la posición 876 que es F876L. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una o más sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionadas entre una o más sustituciones de aminoácidos asociadas con cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos adicionales se seleccionan entre una o más sustituciones en las posiciones de aminoácidos 701, 741, 874 y 877 en comparación con un receptor de andrógenos del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos adicionales se seleccionan entre T877A, W741C, W741L, W741R, L701H y H874Y. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado es un polipéptido recombinante. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una variante que tiene por lo menos o por lo menos aproximadamente un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde el aminoácido en la posición 876 no es fenilalanina.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido del receptor de andrógenos modificado proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un producto de amplificación por PCR. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula recombinante. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula sintética. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 19 o una variante que tiene por lo menos o por lo menos aproximadamente un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde el codón de ácido nucleico que el aminoácido en la posición 876 no codifica fenilalanina.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido del receptor de andrógenos modificado proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral o plasmídico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivo o inducible. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped, que comprende el vector. En algunas realizaciones, la célula es una célula procariota o una célula eucariota. En la presente se describe, en ciertas realizaciones, un polipéptido de AR mutante expresado por la célula huésped.
En la presente se describe una composición farmacéutica que comprende un inhibidor del receptor de andrógenos de tercera generación identificado por los métodos proporcionados en la presente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En la presente se describen los usos de un inhibidor del receptor de andrógenos de tercera generación identificado por los métodos proporcionados en la presente para la fabricación de un medicamento. En la presente se describen métodos de tratamiento que comprenden administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica, en donde la composición comprende un portador farmacéutico adecuado. Como se describe en la presente, el sujeto tiene cáncer. Como se describe en la presente, el sujeto tiene un cáncer mediado por AR. Como se describe en la presente, el cáncer es un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular) o cáncer de vejiga. Como se describe en la presente, el cáncer es un cáncer de próstata resistente a la castración. Como se describe en la presente, el sujeto expresa un AR mutante. Como se describe en la presente, el AR mutante comprende una sustitución o una deleción del aminoácido en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido del receptor de andrógenos. Como se describe en la presente, la sustitución es F876L. Como se describe en la presente, el antagonista de AR de tercera generación se administra con un agente terapéutico adicional. Como se describe en la presente, el antagonista de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran secuencial, simultánea o intermitentemente. Como se describe en la presente, el agente terapéutico adicional se selecciona entre hormonas, agonistas o antagonistas de receptores hormonales, corticosteroides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de quinasa, inhibidores de HSP90, inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC). Como se describe en la presente, el agente terapéutico adicional es un agonista o antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). Como se describe en la presente, el agonista de GnRH es leuprolida, bruserelina o goserelina.
En otro aspecto, la invención proporciona un microchip que comprende el polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente o un ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR modificado proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una modificación en el aminoácido 876. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácidos que es F876L.
En la presente se describen kits que comprenden el polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En la presente se describe un kit que comprende el ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En la presente se describen kits que comprenden uno o más reactivos para la detección de un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácidos 876. En otro aspecto, la invención proporciona un kit que comprende uno o más reactivos para la detección de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876, como F876L, en donde el kit comprende un cebador de oligonucleótidos que (a) se une al ácido nucleico que codifica un AR modificado que se modifica en la posición de aminoácido 876; y (b) no se une al ácido nucleico que codifica el AR de tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, los kits comprenden un microchip que comprende (a) un polipéptido de AR modificado que tiene una modificación que es F876S, o una porción del mismo que comprende una modificación que es F876S; o (b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante que tiene una modificación que es F876S, o una porción del mismo que comprende una modificación que es F876S.
En otro aspecto, la invención proporciona sistemas para detectar un AR modificado que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera o segunda generación en un sujeto, que comprende: (a) una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto; y (b) una micromatriz que comprende ácido nucleico que codifica un polipéptido de Ar mutante o una porción del mismo que está modificado en una posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la micromatriz está contenida en un microchip. En otro aspecto, la invención proporciona sistemas para detectar un AR modificado que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera o segunda generación en un sujeto, que comprende: (a) una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto; y (b) una sonda de ácido nucleico específica de secuencia, en donde la sonda de ácido nucleico específica de secuencia: (i) se une al ácido nucleico que codifica un AR modificado que está modificado en la posición de aminoácido 876; y (ii) no se une al ácido nucleico que codifica el AR de tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición de aminoácido 876. En otro aspecto, la invención proporciona sistemas para detectar un AR modificado que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera o segunda generación en un sujeto, que comprende: (a) una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de a R del sujeto; y (b) un par de cebadores de oligonucleótidos que flanquean la región de ácido nucleico que codifica el aminoácido 876 de un polipéptido de AR.
En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a un polipéptido receptor de andrógenos modificado proporcionado en la presente, en donde el anticuerpo no se une o se une con menor afinidad a un polipéptido de AR del tipo salvaje que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR modificado comprende una modificación en el aminoácido 876. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácidos que es F876L.
En la presente se describen antagonistas de AR de primera o segunda generación para su uso en métodos de terapia de mantenimiento en un paciente que tiene cáncer, que comprenden: (a) administrar al paciente un régimen de terapia de mantenimiento que comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de antagonista de AR de primera o segunda generación; y (b) monitorizar al paciente a intervalos de tiempo predeterminados durante el transcurso del régimen de terapia de mantenimiento para determinar si el sujeto tiene una mutación en un gen endógeno que codifica AR que resulta en una modificación en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. La monitorización comprende: probar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado se modifica en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en métodos que comprenden además suspender el régimen de terapia de mantenimiento si el sujeto tiene la mutación o continuar el régimen de terapia de mantenimiento si el sujeto no tiene la modificación. En la presente se describen antagonistas de AR para su uso en métodos que comprenden además administrar un antagonista de AR de tercera generación que inhibe el AR modificado si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, la modificación en el polipéptido de AR es F876L. En algunas realizaciones, el antagonista de AR de primera o segunda generación inhibe un polipéptido de AR de tipo salvaje por antagonismo competitivo. En algunas realizaciones, el antagonista de AR de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de vejiga, o un cáncer hepatocelular. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo predeterminado es cada semana, cada mes, cada 2 meses, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses, cada 7 meses, cada 8 meses, cada 9 meses, cada 10 meses, cada 11 meses o cada año.
Otros objetos, características y ventajas de los polipéptidos, ácidos nucleicos, compuestos, métodos y composiciones descritos en la presente serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 ilustra la resistencia a ARN-509 y enzalutamida. (A) proliferación celular de LNCaP y LNCaP ARN-509r1. Las células LNCaP y LNCaP ARN-509r1 se cultivaron en presencia de medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de la adición de ligandos. La proliferación se cuantifica mediante el ensayo de viabilidad basado en luminiscencia CellTiter-Glo® (Promega Corp.) después de un tratamiento compuesto de 7 días. (B) Ensayo de proliferación agonista de líneas celulares LNCaP/AR-Luc, LNCaP/AR-Luc ENZr2 y LNCaP ARN-509r2. Las células se cultivaron en presencia de medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de tratamiento con ligandos durante 7 días. La proliferación se cuantifica mediante el ensayo de viabilidad basado en luminiscencia CellTiter-Glo®. (C) Ensayo de proliferación de antagonista de líneas celulares resistentes a los andrógenos original y de 2a generación. Las células se cultivaron en presencia de medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de tratamiento con ligandos en presencia de R1881 (concentración final=100 pM). La proliferación se cuantifica mediante el ensayo de viabilidad basado en luminiscencia CellTiter-Glo. (D) Representación esquemática de la estructura del dominio de AR que muestra aminoácidos que cuando mutan muestran actividad de ligandos alterada en CRPC.
La Figura 2 ilustra los niveles de AR en líneas celulares resistentes a andrógenos parentales y de 2a generación. Los extractos de proteínas se generaron a partir de células cultivadas en medio empobrecido en hormonas durante 3 días. Se analizaron los niveles de proteína de AR y por transferencia Western. Los niveles de AR se cuantificaron y normalizaron a a-tubulina y se expresaron en relación con las células LNCaP.
La Figura 3 ilustra que ARN-509 y la enzalutamida son agonistas parciales de AR F876L. (A) Actividad agonista y antagonista transcripcional de ARN-509 y enzalutamida en Ar de tipo salvaje o F876L. Se midió la activación transcripcional de un informador de a Re 4X-luciferasa en presencia de una concentración de compuesto creciente en ausencia o presencia de R1881 1 nM (para AR de tipo salvaje) o R1881 5 nM (para AR F876L). (B) Se midió la actividad agonista transcripcional de antiandrógenos de ia y 2a generación y prednisona sobre la activación dependiente de AR de tipo salvaje, F876L, T877A, F876L/T877A, L701H, H874Y y W741C del informador de 4X ARE-luciferasa en células HepG2 transitoriamente transfectadas. La Figura 4 ilustra la actividad agonista y antagonista de VP16-AR (A) y F876L VP16-AR (B) de ARN-509 y enzalutamida. La actividad del informador de 4X ARE-luciferasa se monitorizó en presencia de una concentración creciente de compuesto en ausencia o presencia de R1881 90 pM (para VP16-AR de tipo salvaje) o R1881 1 nM (para F876L VP16-AR).
La Figura 5 ilustra un ensayo de unión competitiva de AR de tipo salvaje (A) frente a AR F876L (B). La unión de 3H-R1881 se realizó en extractos de células PC3 que expresan AR de tipo salvaje o F876L. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes. Barras de error, SEM; n=2.
La Figura 6 ilustra los niveles de AR en líneas celulares que sobreexpresan AR. Los extractos de proteínas se generaron a partir de células LNCaP, LNCap/AR(cs), LNCaP/SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L cultivadas en medio empobrecido en hormonas durante 3 días. Se analizaron los niveles de proteína de AR y por transferencia Western. Los niveles de AR se cuantificaron y normalizaron a actina y se expresaron con respecto a células LNCaP.
La Figura 7 ilustra que la mutación de AR F876L confiere actividad agonista parcial a ARN-509 y enzalutamida. (A) Proliferación celular de LNCaP/AR(cs) y LNCaP/SRaF876L. Las células se cultivaron en presencia de medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de tratamiento con ligando durante 7 días. La proliferación se cuantifica mediante el ensayo de viabilidad basado en luminiscencia CellTiter-Glo. (B) Proliferación celular de LNCaP/AR(cs), LNCaP/SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L. Las células se cultivaron en medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de tratamiento con ligandos durante 7 días. Para los ensayos con antagonistas, los compuestos se añadieron en presencia de R1881 200 pM (concentración final 100 pM). La proliferación se cuantificó usando el ensayo CellTiter-Glo® basado en luminiscencia.
La Figura 8 ilustra el ensayo de interacción N/C de AR. La interacción N/C inducida por ligandos se monitorizó mediante un ensayo híbrido de dos mamíferos en células HepG2. Los antagonistas se analizaron a 8 pM, R1881 a InM.
La Figura 9 ilustra el análisis ChIP de AR de genes objetivo de AR. Se realizaron ensayos ChIP en células LNCaP/AR(cs) y LNCaP/SRaF876L incubadas durante 3 días en medio empobrecido en hormonas seguido de un tratamiento con ligandos de 4 horas. Las células se trataron con antagonista 10 pM en presencia o ausencia de R1881 1 nM. Los datos para AR y control de IgG no específico se presentan como entrada porcentual.
La Figura 10 ilustra que la mutación F876L de AR confiere resistencia aARN-509 y enzalutamida in vivo. Xenoinjertos tumorales de LNCaP/AR(cs) y LNCaP/SRaF876L. Se trató a ratones macho castrados que tenían tumores diariamente con vehículo o compuesto de 30 mg/kg/día. El crecimiento tumoral para cada grupo se presenta como el volumen tumoral medio ± SEM.
La Figura 11 ilustra el programa de dosificación para el estudio de marcador abierto de fase 1/2 de seguridad, farmacocinética y prueba de concepto de ARN-509 en pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración metastásico progresivo avanzado y progresivo.
La Figura 12 ilustra la identificación de AR-F876L en pacientes tratados con ARN-509. (A) Respuesta de PSA de 29 pacientes analizados para la mutación F876l . El extremo terminal de la línea de respuesta de PSA es el momento en el que se seleccionó el plasma del paciente para detectar la mutación F876L mediante análisis BEAMing. El plasma usado en este estudio se recogió inicialmente para determinar la farmacocinética de ARN-509 y, como tal, las muestras no se prepararon usando una metodología para maximizar la proporción de ADNc a ADN de linfocitos. (B) Respuesta de PSA de paciente positivo para F876L. Respuesta de PSA del paciente 7 en el ciclo de tratamiento indicado. Se analizó el plasma circulante para el F876L en los momentos indicados con flechas. Las muestras de plasma sin mutante detectable se indican como "w.t.", la presencia de la mutación F876L está representada por "m". Una muestra de plasma se designaba positiva para el mutante si el porcentaje de perlas mutantes estaba por encima del corte (0,02%) y el número de copias mutantes estimado era > 0,5 (número de equivalentes genómicos en la muestra de plasma x fracción de perlas mutantes=> 0,5).
La Figura 13 ilustra la cantidad relativa de antígeno específico de la próstata (PSA) detectado durante el transcurso del estudio clínico de ARN-509 de fase 1/2 en cada uno de los tres pacientes (7, 10 y 13) que tenían mutaciones somáticas detectables de F876L en AR. La flecha indica la muestra en la que se detectaron las mutaciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION
Cierta terminología
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece el asunto reivindicado. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos en la presente, prevalecerán las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en Internet puede ir y venir, pero se conoce información equivalente y puede accederse fácilmente, por ejemplo, buscando en Internet y/o las bases de datos apropiadas. La referencia a la misma evidencia la disponibilidad y difusión pública de dicha información. En general, los procedimientos para métodos de cultivo celular, infección celular, producción de anticuerpos y biología molecular son métodos comúnmente usados en la técnica. Tales técnicas estándar pueden encontrarse, por ejemplo, en el manual de referencia, como, por ejemplo, Sambrook et al. (2000) y Ausubel et al. (1994)
Como se usa en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas (por ejemplo, "incluir", "incluye" e "incluido") no es limitativo.
Como se usa en la presente, los intervalos y las cantidades pueden expresarse como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 |jg" significa "aproximadamente 5 |jg" y también "5 |jg". En general, el término "aproximadamente" incluye una cantidad que se esperaría que estuviera dentro del error experimental.
Como se usa en la presente, un polipéptido del receptor de andrógenos (AR) se refiere a cualquier proteína o polipéptido del receptor de andrógenos, incluyendo, pero no limitado a, una proteína producida recombinantemente, una proteína producida sintéticamente, una proteína del receptor de andrógenos nativa y una proteína del receptor de andrógenos extraída de células o tejidos. Un polipéptido de AR incluye polipéptidos relacionados de diferentes especies incluyendo, pero no limitadas a, animales de origen humano y no humano. Los polipéptidos de AR de origen no humano incluyen, pero no se limitan a, primates no humanos (por ejemplo, chimpancés y simios), murinos (por ejemplo, ratones y ratas), caninos (perros), felinos (gatos), leporinas (conejos), aviar (pájaros), bovino (vacas), ovino (ovejas), porcino (cerdos), equino (caballos), de peces (pescado), ranina (rana) y otros polipéptidos de AR mamíferos o no mamíferos. Los polipéptidos de AR ejemplares incluyen, por ejemplo, las SEQ ID NO: 1-17. Un polipéptido receptor de andrógenos incluye receptor de andrógenos del tipo salvaje, isoformas de variantes alélicas, mutaciones somáticas que incluyen las encontradas en tumores, moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, proteínas aisladas de tejido y células humanos, y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos del receptor de andrógenos proporcionados en la presente pueden modificarse además mediante la modificación de la secuencia de aminoácidos primaria, mediante deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos. Un polipéptido del receptor de andrógenos incluye cualquier polipéptido de AR o una porción del mismo que tiene actividad de AR, incluyendo por ejemplo, polipéptidos de fusión de un dominio de unión a ligando de AR con un dominio de unión a ADN heterólogo.
Como se usa en la presente, un polipéptido del receptor de andrógenos (AR) mutante, una proteína de AR mutante, un polipéptido de AR modificado o una proteína de AR modificada o se usan indistintamente en la presente y se refieren a un polipéptido del receptor de andrógenos que se modifica en una o más posiciones de aminoácidos. Las modificaciones ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos.
Como se usa en la presente, el término "anti-andrógenos" se refiere a un grupo de compuestos antagonistas de los receptores hormonales que son capaces de prevenir o inhibir los efectos biológicos de los andrógenos en los tejidos normalmente sensibles en el cuerpo.
Como se usa en la presente, el término "inhibidor de AR" o "antagonista de AR" se usan indistintamente en la presente y se refiere a un agente que inhibe o reduce por lo menos una actividad de un polipéptido de AR. Las actividades de AR ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, unión a coactivador, unión a ADN, unión a ligando o translocación nuclear.
Como se usa en la presente, un "antagonista completo" se refiere a un antagonista que, a una concentración eficaz, esencialmente inhibe completamente la actividad de un polipéptido de AR. Como se usa en la presente, un "antagonista parcial" se refiere a un antagonista que es capaz de inhibir parcialmente una actividad de un polipéptido de AR, pero que, incluso a una concentración más alta, no es un antagonista completo. Por "esencialmente completamente" se entiende por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 90%, por lo menos aproximadamente un 95%, por lo menos aproximadamente un 96%, por lo menos aproximadamente un 97%, por lo menos aproximadamente un 98%, por lo menos aproximadamente un 99%, de inhibición o una mayor de la actividad de un polipéptido de AR.
Como se usa en la presente, el término "inhibidor de AR de tercera generación" o "antagonista de AR de tercera generación" se usan indistintamente en la presente y se refieren a un agente que inhibe por lo menos una actividad de un polipéptido de AR que contiene una o más modificaciones de aminoácidos que confieren resistencia a la inhibición por un antagonista de AR de segunda generación, como, por ejemplo, ARN-509 (número CAS N° 956104-40-8), enzalutamida (también conocida como MDV3100; CAS N° 915087-33-1) o RD162 (CAS N° 915087­ 27-3) En algunas realizaciones, un inhibidor de AR de tercera generación inhibe por lo menos una actividad de un polipéptido de AR del tipo salvaje como, pero no limitado a, la unión a coactivador, unión a ADN, unión a ligando o translocación nuclear. En algunas realizaciones, un inhibidor de AR de tercera generación inhibe una actividad de un polipéptido de AR mutante que también es inhibido por un inhibidor de AR de primera o segunda generación.
Como se usa en la presente, la frase "resistente a la inhibición" se refiere a una disminución en la capacidad de un antagonista de AR para inhibir (es decir, antagonizar) una o más actividades de un polipéptido de a R modificado en comparación con un polipéptido de AR del tipo salvaje. Por ejemplo, el antagonista de AR es menos eficaz para inhibir un polipéptido de AR modificado en comparación con un polipéptido de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, la actividad antagonista disminuida contra un polipéptido de AR modificado es de aproximadamente el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 100% en comparación con la actividad antagonista contra un polipéptido de AR del tipo salvaje. Las actividades de AR ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, unión a coactivador, unión a ADN, unión a ligando o translocación nuclear. En algunas realizaciones, el antagonista de AR es incapaz de unirse o se une con afinidad disminuida a un polipéptido de AR modificado.
Como se usa en la presente, el término "inhibidor de AR de segunda generación" o "antagonista de AR de segunda generación" se usan indistintamente en la presente y se refieren a un agente que muestra actividad antagonista completa de un polipéptido de AR del tipo salvaje, pero no muestra actividad antagonista completa de un polipéptido de AR que contiene una o más modificaciones de aminoácidos que confieren resistencia a la inhibición, como una modificación en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido de AR. En algunas realizaciones, el inhibidor de AR de segunda generación no muestra actividad antagonista completa en un polipéptido de AR que tiene una sustitución de aminoácidos que es F876L. En algunas realizaciones, el inhibidor de AR de segunda generación induce actividad de AR (es decir, es un agonista de AR) a concentraciones que son equivalentes o superiores a la concentración requerida para inhibir un AR de tipo salvaje. Los inhibidores de AR de segunda generación difieren de los inhibidores de AR de primera generación, como la bicalutamida y la flutamida, en que los inhibidores de AR de segunda generación actúan como antagonistas completos en las células que expresan niveles elevados de AR como, por ejemplo, en los cánceres de próstata resistentes a la castración (CRPC). Los inhibidores de AR de primera generación, como la bicalutamida y la flutamida, actúan como agonistas en el CRPC. Inhibidores de AR de segunda generación ejemplares incluyen ARN-509, enzalutamida y RD162. En algunas realizaciones, un inhibidor de AR de segunda generación es un agonista de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, un inhibidor de AR de segunda generación se une a un polipéptido de AR en o cerca del sitio de unión al ligando del polipéptido de AR.
El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o doble. A menos que esté específicamente limitado, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se limite de otra manera, el término también se refiere a análogos de oligonucleótidos que incluyen PNA (ácido peptidonucleico), análogos de ADN usados en tecnología antisentido (por ejemplo, fosforotioatos, fosfoamidatos). A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma (incluyendo pero no limitadas a, sustituciones codónicas degeneradas) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados se logran generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem 260:2605-2608; y Cassol et al. (1992) Mol. Cell. Probes 6, 327-331; y Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y no natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural.
Los aminoácidos codificados de manera natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácidos se refieren a agentes que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, como la homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (como, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos son referidos en la presente o por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, de igual manera, son referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Los términos "polipéptido", péptido "y" proteína "se usan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural así como a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un aminoácido de origen no natural, por ejemplo, un análogo de aminoácido. Los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en donde los residuos de aminoácidos están enlazados por enlaces peptídicos covalentes.
Como se usa en la presente, modificación se refiere a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente.
Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias pueden alinearse para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, se introducen huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácido o ácidos nucleicos para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos). Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes pueden entonces compararse. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que el de la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir,% de identidad=N° de posiciones idénticas/N° total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En algunas realizaciones las dos secuencias tienen la misma longitud.
Para determinar el porcentaje de homología entre dos secuencias, se usa el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora a los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se realizan con el programa Nb La St , puntuación=100, longitud de palabra=12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas o divulgadas en la presente. Las búsquedas de proteínas BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3. Para obtener alineaciones con huecos con propósitos de comparación, se utiliza Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Consultar la página web del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología para obtener más detalles (en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov). Las proteínas adecuadas para su uso en los métodos descritos en la presente también incluyen proteínas que tienen entre 1 y 15 cambios de aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína descrita en la presente. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos alterada es por lo menos un 75% idéntica, por ejemplo, un 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína descrita en la presente. Tales proteínas de variantes de secuencias son adecuadas para los métodos descritos en la presente siempre que la secuencia de aminoácidos alterada retenga suficiente actividad biológica para ser funcional en las composiciones y métodos descritos en la presente. Cuando se realizan sustituciones de aminoácidos, las sustituciones deben ser sustituciones de aminoácidos conservadoras. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservadora" se ilustra mediante una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los grupos siguientes: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a Edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224). La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineaciones múltiples locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 se usan para definir sustituciones de aminoácidos conservadoras que, en algunas realizaciones, se introducen en las secuencias de aminoácidos descritas o divulgadas en la presente. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos en base a únicamente las propiedades químicas (como se ha tratado anteriormente), el lenguaje "sustitución de aminoácidos conservadora" se refiere preferiblemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 mayor que -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservadora si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de por lo menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservadoras más preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de por lo menos 2 (por ejemplo, 2 o 3).
Como se usa en la presente, los residuos correspondientes se refieren a residuos que se producen en loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Tales métodos típicamente maximizan las coincidencias e incluyen métodos como el uso de alineaciones manuales y el uso de los numerosos programas de alineación disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la técnica. Al alinear las secuencias de polipéptidos, un experto en la técnica puede identificar los residuos correspondientes, usando los residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineaciones estructurales, por ejemplo usando alineaciones simulados por ordenador de la estructura de la proteína. En otros casos, pueden identificarse las regiones correspondientes.
Como se usa en la presente, una variante alélica o variación alélica hace referencia a un polipéptido codificado por un gen que difiere de una forma de referencia de un gen (es decir, está codificado por un alelo). Típicamente, la forma de referencia del gen codifica una forma del tipo salvaje y/o una forma predominante de un polipéptido de una población o miembro de referencia individual de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre especies, tienen por lo menos un 80%, 90% o más de identidad de aminoácidos con una forma del tipo salvaje y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y de si la comparación es interespecie o intraespecie. En general, las variantes alélicas intraespecies tienen una identidad de por lo menos aproximadamente un 80%, 85%, 90% o 95% o mayor con una forma de tipo salvaje y/o predominante, incluyendo un 96%, 97%, 98%, o más de identidad con una forma del tipo salvaje y/o predominante de un polipéptido.
Como se usa en la presente, las variantes de especies se refieren a variantes del mismo polipéptido entre especies. En general, las variantes interespecies tienen por lo menos aproximadamente un 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad o más con una forma del tipo salvaje y/o predominante de otra especie, incluyendo el 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con una forma de polipéptido del tipo salvaje y/o predominante.
Como se usan en la presente, los términos “tratar”, “tratando” o “tratamiento”, y otros equivalentes gramaticales, incluyen aliviar, calmar o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección, mejorar, prevenir o reducir la apariencia, gravedad o frecuencia de uno o más síntomas adicionales de una enfermedad o afección, mejorar o prevenir las causas metabólicas subyacentes de uno o más síntomas de una enfermedad o afección, inhibir la enfermedad o afección, como por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección provocada por la enfermedad o afección, o inhibir los síntomas de la enfermedad o afección o profiláctica o terapéuticamente. En un ejemplo no limitativo descrito en la presente, para beneficio profiláctico, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación divulgado en la presente se administra a un individuo en riesgo de desarrollar un trastorno particular, predispuesto a desarrollar un trastorno particular, o a un individuo que informa de uno o más de los síntomas fisiológicos de un trastorno. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación divulgado en la presente se administra a un sujeto después del tratamiento con uno o más agentes terapéuticos, o en combinación con el tratamiento con uno o más agentes terapéuticos.
Como se usa en la presente, prevención o profilaxis se refiere a la reducción en el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección.
Los términos "cantidad eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" como se usan en la presente, se refieren a una cantidad de un compuesto inhibidor de AR que es suficiente para tratar un trastorno. En algunas realizaciones, el resultado es una reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de un trastorno, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" para usos terapéuticos es la cantidad de la composición que comprende un compuesto inhibidor de AR divulgado en la presente requerida para proporcionar una disminución clínicamente significativa en un trastorno. Una cantidad "eficaz" apropiada se determina en cualquier caso individual usando cualquier técnica adecuada (por ejemplo, un estudio de incremento de dosis).
El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a un material (por ejemplo, un portador o diluyente), que no anula la actividad biológica o las propiedades de un compuesto inhibidor de AR descrito en la presente, y es relativamente no tóxico (es decir, el material se administra a un individuo sin provocar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera nociva con cualquiera de los componentes de la composición en la que está contenido).
Como se usa en la presente, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal no afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno.
Como se usa en la presente, los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan indistintamente. Ninguno de los términos debe interpretarse en el sentido de requerir la supervisión de un profesional médico (por ejemplo, un médico, una enfermera, un asistente médico, auxiliar o un trabajador de cuidad paliativos). Como se usa en la presente, el sujeto puede ser cualquier animal, incluyendo mamíferos (por ejemplo, un humano o animal no humano) y no mamíferos. En una realización de los métodos y composiciones proporcionados en la presente, el mamífero es un humano.
Como se usa en la presente, "poner en contacto" se refiere al acto de tocar, hacer contacto o acercar sustancias a una proximidad inmediata. El "contacto" se puede lograr mezclando los componentes en una mezcla fluida o semifluida.
Visión general: Función AR y resistencia a los fármacos en el cáncer
El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos y nucleares. Entre esta gran familia de proteínas, solo se conocen cinco receptores de esteroides vertebrados e incluyen el receptor de andrógenos, el receptor de estrógenos, el receptor de progesterona, el receptor de glucocorticoides y el receptor de mineralocorticoides. El AR es una proteína soluble que funciona como un factor de transcripción intracelular. La función de AR está regulada por la unión de los andrógenos, que inicia cambios conformacionales secuenciales del receptor que afectan a las interacciones receptor-proteína y las interacciones receptor-ADN.
El AR se expresa principalmente en los tejidos objetivo de andrógenos, como la próstata, el músculo esquelético, el hígado y el sistema nervioso central (SNC), con el nivel de expresión más alto observado en la próstata, la glándula suprarrenal y el epidídimo. El AR en ciertos casos se activa mediante la unión de andrógenos endógenos, incluyendo la testosterona y la 5a-dihidrotestosterona (5a-DHT).
El AR es un receptor nuclear de 110 kD que, tras la activación por andrógenos, media la transcripción de genes objetivo que modulan el crecimiento y la diferenciación de las células epiteliales de la próstata. El AR está codificado por el gen del AR localizado en el cromosoma X en Xq11-12. El gen del AR comprende 8 exones que codifican el receptor de andrógenos de longitud completa. Similar a los otros receptores de esteroides, el AR no unido se localiza principalmente en el citoplasma y se asocia con un complejo de proteínas de choque térmico (HSP) a través de interacciones con el dominio de unión al ligando. Tras la unión del agonista, el AR pasa por una serie de cambios conformacionales: las proteínas de choque térmico se disocian del AR, y el AR transformado experimenta dimerización, fosforilación y translocación al núcleo, que está mediado por la señal de localización nuclear. El receptor translocado se une al elemento de respuesta a andrógenos (ARE), que se caracteriza por la secuencia consenso de sitio medio de seis nucleótidos dos hexamérica 5-TGTTCT-3 ' dispuesta como repeticiones invertidas espaciadas por tres nucleótidos aleatorios y está localizada en la región promotora o potenciadora de los objetivos del gen del AR. El reclutamiento de otros correguladores de la transcripción (incluidos los coactivadores y correpresores) y la maquinaria transcripcional asegura además la modulación apropiada de la expresión génica regulada por AR. Estos procesos son iniciados por los cambios conformacionales inducidos por ligandos en el dominio de unión al ligando.
La señalización de AR es crucial para el desarrollo y mantenimiento de los órganos reproductores masculinos, incluyendo la glándula prostática, ya que los machos genéticos que albergan la pérdida de la función de las mutaciones de AR y los ratones diseñados con defectos de AR no desarrollan próstatas. Esta dependencia de las células prostáticas de la señalización de AR continúa incluso tras la transformación neoplásica. El agotamiento de andrógenos (por ejemplo, el uso de agonistas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH)) sigue siendo el pilar del tratamiento del cáncer de próstata. Sin embargo, el agotamiento de andrógenos es habitualmente eficaz durante un tiempo limitado y el cáncer de próstata evoluciona para recuperar la capacidad de crecer a pesar de los bajos niveles de andrógenos circulantes.
El cáncer de próstata es el cáncer más frecuente en los hombres. El cáncer de próstata representa aproximadamente el 29 por ciento de todos los nuevos casos de cáncer diagnosticados y el 10 por ciento de las muertes por cáncer en hombres. Además, los hombres americanos a lo largo de su vida tienen una probabilidad de aproximadamente el 17 por ciento de desarrollar cáncer de próstata invasivo. En el diagnóstico inicial, un gran porcentaje de los cánceres de próstata tienen un riesgo bajo a medio, lo que significa que el riesgo de mortalidad a los 10 años es relativamente bajo (hasta 24%) con poca intervención. Sin embargo, los cánceres de próstata avanzados y metastásicos tienen una supervivencia media de 2,5-3 años y se someten a un tratamiento agresivo que incluye cirugía y terapia de castración química.
Dado que la mayoría de las células de cáncer de próstata dependen del AR para su proliferación y supervivencia, el tratamiento generalmente consiste en la administración de agentes que bloquean la producción de testosterona (por ejemplo, agonistas de GnRH), solos o en combinación con antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida), que antagonizan el efecto de cualquier testosterona residual. Desafortunadamente, aunque a menudo inicialmente tiene éxito como lo demuestra una caída en el antígeno específico de la próstata (PSA) y la regresión del tumor visible si lo hay, los tumores metastásicos inevitablemente se vuelven resistentes a la terapia hormonal, en cuyo estadio no existe tratamiento curativo.
Los cánceres de próstata resistentes a las terapias hormonales son referidos actualmente como "resistentes a la castración", lo que implica que han progresado más allá del punto en que los fármacos dirigidos a cualquier punto del eje de andrógenos tendrían alguna utilidad clínica. La evidencia preclínica y clínica indica que el AR es un objetivo terapéutico viable incluso en cánceres resistentes a la castración. Se ha informado que las mutaciones de AR se producen hasta en el 33 por ciento de los casos de cáncer de próstata y se observan con mayor frecuencia después del tratamiento en el estado resistente a la castración dependiente de AR. Se han encontrado mutaciones que alteran la especificidad y la potencia del ligando y que dan como resultado una actividad del receptor independiente del ligando. Las mutaciones específicas varían ampliamente, pero parecen depender del régimen de tratamiento. Adicionalmente, la regulación por incremente del propio AR se ha asociado con la progresión al estado resistente a la castración en modelos tanto de paciente como de animales.
Dos agentes, el acetato de abiraterona (Zytiga; CAS N° 154229-19-3) y el MDV3100 (enzalutamida; CAS N° 915087-33-7), se han empleado recientemente en pruebas clínicas de etapa tardía para el tratamiento de hombres con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). El acetato de abiraterona se dirige a la 7-ahidroxilasa/17,20-liasa (CYP17A), inhibiendo de este modo la biosíntesis de andrógenos residuales. El MDV3100 es un antiandrógeno descubierto en una selección de antiandrógenos potentes que carecen de actividad agonista en el contexto de la sobreexpresión de AR. Las eficacias clínicas del MDV3100 y el acetato de abiraterona respaldan la hipótesis de que el AR continúa promoviendo el crecimiento y la supervivencia del cáncer de próstata resistente a la castración. Desafortunadamente, similar a las terapias de ablación de andrógenos de primera generación, el tratamiento prolongado con acetato de abiraterona o antagonistas de AR de segunda generación finalmente da como resultado resistencia.
Se ha observado resistencia al acetato de abiraterona y al MDV3100 en tanto modelos de cáncer de próstata como en pacientes. Los datos preliminares sugieren que, de manera similar al cáncer de próstata resistente a la castración, la resistencia anti-andrógenos de segunda generación se desarrolla a través de múltiples mecanismos y se cree que el AR sigue siendo un objetivo terapéutico en este contexto. En tanto modelos de xenoinjerto como en pacientes, se ha observado una regulación por incremento de CYP17A y la presencia de niveles de andrógenos picogramo en poblaciones resistentes. La regulación por incremento de CYP17A presumiblemente promueve la resistencia a través de la activación de AR por síntesis de andrógenos intratumorales. En otros casos, la resistencia se correlaciona con niveles de AR aumentados, así como con la localización nuclear. Adicionalmente, numerosas vías de señalización celular que se sabe que activan el AR en ausencia de ligandos endógenos pueden promover la resistencia a la terapia de segunda generación. La observación de que los tumores con niveles altos de Src activado responden pobremente al tratamiento con MDV3100 y con acetato de abiraterona respalda esta hipótesis. Hasta la fecha, no se han descrito mutaciones de AR que confieran resistencia a MDV3100, ARN-509 o abiraterona.
El ARN-509 es un compuesto sintético de tiohidantoína descubierto usando química medicinal guiada por la relación estructura-actividad (SAR) para identificar los anti-andrógenos no esteroideos que retienen la actividad antagonista completa en el contexto de una expresión de AR aumentada. El ARN-509 muestra actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto resistentes y sensibles a la castración de cáncer de próstata y efectos anti-androgénicos en perros que se castran con fenocopia.
Identificación de líneas celulares resistentes a los inhibidores de AR y un polipéptido de AR mutante En la presente se describen ejemplos de trabajo que demuestran la producción de líneas celulares resistentes a fármacos. Los métodos proporcionados pueden emplearse para la generación de una línea celular que sea resistente a la inhibición por un antagonista de AR de segunda generación como, pero no limitado a, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162. Los métodos proporcionados pueden emplearse para la generación de una línea celular que es resistente a la inhibición por un antagonista de AR que inhibe la producción de andrógenos y muestra unión a un receptor de AR. El antagonista de AR que inhibe la producción de andrógenos puede ser un inhibidor de CYP17A y muestra unión a AR. El antagonista de Ar que inhibe la producción de andrógenos y muestra unión a AR puede ser galeterona (TOK001) o acetato de abiraterona. El antagonista de AR que inhibe la producción de andrógenos y muestra unión a AR puede ser TAK-700.
Como se describe en la presente, se generaron líneas celulares resistentes in vivo en un xenoinjerto de células de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) e in vitro en líneas celulares de cáncer de próstata sensibles a los andrógenos por exposición a concentraciones crecientes de los fármacos anti-andrógenos ARN-509 o MDV3100. En los ensayos de proliferación celular y transcripción, las líneas celulares se segregaron en dos clases distintas.
Las líneas celulares de clase 1 expresaron un mayor nivel de AR en comparación con sus líneas celulares originales y proliferaron en ausencia de andrógenos añadidos. El crecimiento independiente de ligandos de las células de clase 1 no se alteró en presencia de ARN-509, MDV3100 o bicalutamida. El andrógeno sintético, R1881, inhibió la proliferación en las células de clase 1 y es antagonizado por o MDV3100 o ARN-509, lo que indica que AR en estas líneas celulares todavía se une a MDV3100 y ARN-509.
Las líneas celulares resistentes de clase 2 permanecieron dependientes de andrógenos para un crecimiento similar a sus líneas celulares originales. Mientras que ARN-509 y MDV3100 inhibieron la proliferación de la línea celular original, ambos compuestos mostraron actividad agonista y estimularon la proliferación de las líneas celulares de clase 2. El análisis del ácido nucleico que codifica AR en las líneas celulares de clase 2 reveló que las líneas celulares expresaron un AR mutante con una mutación en el dominio de unión al ligando. La mutación fue una mutación con cambio de sentido de timidina (T) a citosina (C) que resultó en una sustitución de aminoácidos de fenilalanina en la posición 876 del AR de tipo salvaje por leucina (F876L).
Como se describe en la presente, en los ejemplos, se han identificado mutaciones en el gen del AR en muestras de plasma de pacientes con cáncer de próstata sometidos a estudios clínicos de fase 1/2 de ARN-509. Las mutaciones identificadas incluyen una mutación con cambio de sentido de timidina (T) a citosina (C) en la posición 2988 (primera posición del codón que codifica fenilamina, que está codificada en el exón 8 del gen del AR), y una mutación con cambio de sentido de citosina (C) a alanina (A) en la posición 2990 (tercera posición del codón que codifica fenilalanina) en una sustitución de aminoácidos de fenilalanina en la posición 876 del AR del tipo salvaje por leucina (F876L). Los pacientes a los que se identificó con estas mutaciones también mostraron niveles crecientes de antígeno específico de la próstata (PSA) durante el transcurso del estudio, lo que indica una resistencia creciente al tratamiento.
En la presente se describen polipéptidos de AR mutantes que contienen una sustitución de aminoácidos de fenilalanina en la posición 876 del Ar de tipo salvaje por leucina (F876L) y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. También se describen en la presente métodos para producir los ácidos nucleicos y polipéptidos de AR mutante descritos en la presente. También se describen en la presente composiciones, combinaciones y kits que contienen los ácidos nucleicos y polipéptidos de AR mutante descritos en la presente. También se proporcionan métodos para usar los polipéptidos de AR mutante para identificar moléculas que interactúan con AR mutante, incluyendo los inhibidores de andrógenos, incluyendo los compuestos inhibidores de AR de tercera generación. También se proporcionan composiciones que contienen las moléculas de interacción con AR mutante, incluyendo las composiciones farmacéuticas de las mismas. También se proporcionan métodos de tratamiento que usan las moléculas de interacción con AR mutante identificadas. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que son ácidos nucleicos sintéticos. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que son moléculas de ADNc. También se describen en la presente polipéptidos de AR mutante producidos por ácidos nucleicos de AR mutante que son ácidos nucleicos sintéticos. También se describen en la presente polipéptidos de AR mutante producidos por ácidos nucleicos de AR mutante que son moléculas de ADNc. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que no contienen ADN genómico de AR. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que no están metilados. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que no contienen secuencias de intrones de AR. También se describen en la presente ácidos nucleicos de AR mutante que comprenden una secuencia de nucleótidos de dos o más exones de la secuencia genómica de AR. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 786 del polipéptido de AR del tipo salvaje.
Como se describe en la presente, la identificación de una mutación en la posición 876 en el AR, como por ejemplo F876L, permite el diseño y la selección de inhibidores eficaces para la inhibición de un AR mutante que tiene una o más mutaciones de resistencia. Tales inhibidores son útiles en aplicaciones clínicas y terapéuticas. Los inhibidores pueden ser útiles para el tratamiento de un cáncer como, por ejemplo, un cáncer mediado por AR como, por ejemplo, un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular) o cáncer de vejiga, como, por ejemplo, un cáncer de próstata, mama, hígado (es decir, hepatocelular) o de vejiga resistente a los fármacos.
Como se describe en las reivindicaciones, los sujetos son seleccionados para la identificación de una mutación en la posición 876 en AR, como por ejemplo F876L. En algunas realizaciones, la identificación de dicha mutación permite la prescripción de un tratamiento contra el cáncer o la modificación de un tratamiento contra el cáncer, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la identificación de dicha mutación se usa para estratificar sujetos para una terapia particular como, por ejemplo, terapia con un inhibidor que inhibe la actividad del AR mutante (es decir, un inhibidor de AR de tercera generación). En algunas realizaciones, la identificación de dicha mutación se usa para caracterizar a un sujeto que tiene un alto riesgo de recaída de una enfermedad o afección como, por ejemplo, un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de hígado (es decir, hepatocelular), o cáncer de vejiga. cáncer. En algunas realizaciones, la identificación de dicha mutación se usa para caracterizar a un sujeto como carente de capacidad de respuesta a un inhibidor de AR particular, como por ejemplo ARN-509, MDV3100 o RD162. En algunas realizaciones, la identificación de dicha mutación se usa para caracterizar a un sujeto como carente de respuesta a un inhibidor de AR que es un inhibidor de CYP17A como, por ejemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona.
Polipéptidos de AR mutante
En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos de AR mutante aislados como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante aislados son polipéptidos de AR mutante no nativos. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante aislados son polipéptidos de AR mutante recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutantes proporcionados en la presente muestran actividad del receptor de andrógenos. Por ejemplo, los polipéptidos de AR mutante se unen a elementos de respuesta a andrógenos y promueven la expresión de genes sensibles a AR. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante contienen una o más sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia a un antagonismo completo por un anti-andrógenos. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante contienen una o más sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia al antagonismo completo por un inhibidor de AR de segunda generación como, pero no limitado a, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante contienen una o más sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia a la inhibición por ARN-509. En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante contienen una o más sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia a la inhibición por enzalutamida (MDV3100). En algunas realizaciones, los polipéptidos de AR mutante contienen una o más sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia a la inhibición por RD162.
En algunas realizaciones, el tratamiento de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente con un inhibidor de AR de segunda generación induce la actividad de AR. Por ejemplo, el inhibidor de AR de segunda generación actúa como un agonista del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el tratamiento de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente con ARN-509 induce la actividad de AR. En algunas realizaciones, el tratamiento de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente con enzalutamida (MDV3100) induce la actividad de AR. En algunas realizaciones, el tratamiento de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente con RD162 induce la actividad de AR.
El polipéptido de AR mutante comprende una modificación en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 (N° de registro P10275) o una posición correspondiente en el polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 2 (N° de registro NP_000035.2). En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución del aminoácido fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido del receptor de andrógenos (AR) mutante no comprende fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución del aminoácido fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituido se selecciona entre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el polipéptido del receptor de andrógenos (AR) mutante comprende una leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico o ácido glutámico en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución del aminoácido fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1, y el aminoácido sustituido se selecciona entre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina y triptófano. En algunas realizaciones, el polipéptido del receptor de andrógenos (AR) mutante comprende una leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina o triptófano en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución del aminoácido fenilalanina a leucina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ Id NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SeQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la modificación comprende una deleción del aminoácido fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende un polipéptido que tiene una leucina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 y que tiene un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende un polipéptido que no tiene una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 y que tiene un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 y una modificación en una o más posiciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 y una modificación en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más posiciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación en una posición de aminoácido adicional. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición de aminoácido 876 y una modificación en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más posiciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una modificación en una posición de aminoácido adicional. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 876 es una sustitución que es F876L.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación en una posición de aminoácido adicional que confiere resistencia a un antagonista de AR de primera o segunda generación o un antagonista de AR que inhibe la producción de andrógenos. En algunas realizaciones, la modificación en la posición del aminoácido además de la modificación en el aminoácido 876 aumenta la resistencia del polipéptido de AR a un antagonista de AR de primera o segunda generación o un antagonista de AR que inhibe la producción de andrógenos en comparación con un polipéptido de AR que solamente comprende la modificación en la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 876 es una sustitución que es F876L.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación seleccionada entre las modificaciones de AR descritas en, por ejemplo, Grasso et al. (2012) Nature 487(7406):239-43; Ning et al. (2012) Urology 80(1):216-8; Cong et al. (2012) Gene 500(2):220-3; Hay et al. (2012) PLoS One 2012;7(3):e32514; Koochekpour (2010) Asian J Androl. 12(5):639-57 ; Waltering et al. (2012) Mol Cell Endocrinol. 360:38-43; Robbins (2012) Mol Cell Endocrinol. 352(1-2):26-33; o Gottlieb et al. (2012) Hum Mutat.
33(5):887-94.. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 876 es una sustitución que es F876L.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación seleccionada entre las modificaciones de AR asociadas con el cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, la modificación asociada con el cáncer de próstata resistente a la castración es una sustitución de aminoácidos como, por ejemplo, T877A, W741C, W741L, W741R, L701H o H874Y. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 876 es una sustitución que es F876L.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 y una modificación en la posición de aminoácido 877. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 877. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 877 es una sustitución del aminoácido treonina. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 877 se selecciona entre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 877 es alanina. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una alanina en la posición de aminoácido 877. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y un alanina en la posición de aminoácido 877.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 741 es una sustitución del aminoácido triptófano. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 741 se selecciona entre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 741 es leucina, cisteína o arginina. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una leucina en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una cisteína en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una arginina en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una leucina en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una cisteína en la posición de aminoácido 741. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una arginina en la posición de aminoácido 741.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 701. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 701. En algunas realizaciones, la modificación en la posición de aminoácido 701 es una sustitución del aminoácido leucina. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 701 se selecciona entre isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, histidina, serina, treonina, cisteína, lisina, arginina, triptófano, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 701 es histidina. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una histidina en la posición de aminoácido 701. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una histidina en la posición de aminoácido 701.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 874. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una modificación en la posición de aminoácido 874. En algunas realizaciones, La modificación en la posición de aminoácido 874 es una sustitución del aminoácido histidina. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 874 se selecciona entre leucina, isoleucina, valina, alanina, fenilalanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, lisina, arginina, triptófano, prolina, tirosina, asparagina, glutamina., ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido 874 es tirosina. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la posición 876 y una tirosina en la posición de aminoácido 874. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una leucina en la posición 876 y una tirosina en la posición de aminoácido 874.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante es una variante del polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición 876 y una o más posiciones de aminoácidos adicionales con respecto al polipéptido de AR de tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. Las variantes ejemplares incluyen, por ejemplo, variantes de especies, variantes alélicas, variantes de corte y empalme de ARN y variantes que contienen mutaciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglutamina de aproximadamente 6 residuos de glutamina consecutivos a aproximadamente 39 residuos de glutamina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglutamina de aproximadamente 16 residuos de glutamina consecutivos a aproximadamente 29 residuos de glutamina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglutamina de aproximadamente 21 residuos consecutivos de glutamina. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de Ar comprende un tracto de poliglutamina de aproximadamente 22 residuos de glutamina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglutamina de aproximadamente 23 residuos de glutamina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglicina de aproximadamente 10 residuos de glicina consecutivos a aproximadamente 27 residuos de glicina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglicina de aproximadamente 23 residuos de glicina consecutivos. En algunas realizaciones, la variante del polipéptido de AR comprende un tracto de poliglicina de aproximadamente 24 residuos de glicina consecutivos.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una porción del polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la porción muestra una actividad de un polipéptido de AR. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende el dominio de unión al ADN de un polipéptido de AR y el dominio de unión al ligando del polipéptido de AR que comprende la modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante consiste esencialmente en el dominio de unión a ADN de un polipéptido de AR y el dominio de unión al ligando del polipéptido de AR que comprende la modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ Id NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente la posición de aminoácido 554 hasta aproximadamente la posición de aminoácido 919 del polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende el dominio de unión al ligando del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante consiste esencialmente en el dominio de unión al ligando del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende la secuencia de aminoácidos desde aproximadamente la posición de aminoácido 554 hasta aproximadamente la posición de aminoácido 919.
En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende la modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR de tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 unido a un polipéptido heterólogo. En algunas realizaciones, la modificación es una sustitución de aminoácidos que es F876L. Los métodos para la generación de proteínas de fusión son conocidos en la técnica e incluyen técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan entre sí en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando extremos terminales de extremos romos o escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos terminales apropiados, relleno de extremos cohesivos como sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligadura enzimática. En algunas realizaciones, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. En algunas realizaciones, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a voladizos complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden ser apareados y reamplificados para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). En algunas realizaciones, hay vectores de expresión disponibles comercialmente que codifican una fracción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR modificado puede clonarse en tal vector de expresión de tal manera que la fracción de fusión esté enlazada en marco al polipéptido de AR modificado.
En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la s Eq ID NO: 1 enlazada a un dominio de unión a ADN heterólogo. En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de Ar mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 enlazada a un dominio de unión a ADN heterólogo. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ADN heterólogo es el dominio de unión al ADN GAL4. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ADN heterólogo es el dominio de unión al ADN LexA. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 enlazado a un dominio de unión a ADN heterólogo a través de un conector peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de a R mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 enlazada a un dominio de unión a ADN heterólogo a través de un conector peptídico.
En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 enlazada a un péptido heterólogo para su uso en un ensayo de interacción de proteínas como, pero no limitado a, un ensayo de dos híbridos de levadura, un sistema de dos híbridos basado en células de mamífero (M2H), un ensayo de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Forster (fluorescencia), una transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET)) o un ensayo de fluorescencia con resolución temporal homogénea (HTRF®). En algunas realizaciones, un polipéptido de AR es una proteína de fusión que comprende el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 enlazada a un péptido heterólogo para su uso en un ensayo de interacción de proteínas como, pero no limitado a, un ensayo de dos híbridos de levadura, un sistema de dos híbridos basado en células de mamífero (M2H), un ensayo de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Forster (fluorescencia), una transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET)) o un ensayo de fluorescencia con resolución temporal homogénea (HTRF®).
En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 enlazado a un polipéptido detectable. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 está enlazada a un polipéptido detectable. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR de tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 está enlazado a una proteína fluorescente como, pero no limitada a, una proteína fluorescente verde (GFP), roja (RFP), cian (CFP), amarilla (YFP) o azul (BFP). En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 está enlazado a una proteína fluorescente como, pero no limitada a, una proteína fluorescente verde (GFP), roja (RFP), cian (CFP), amarilla (YFP) o azul (BFP). En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 está enlazado a una proteína bioluminiscente. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 está enlazado a una proteína bioluminiscente. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 está enlazado a una etiqueta peptídica. En algunas realizaciones, el dominio de unión al ligando de un polipéptido de AR mutante expuesto en la SEQ ID NO: 5 está enlazado a una etiqueta peptídica. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica es una etiqueta de epítopo reconocido por un anticuerpo específico de la etiqueta. En algunas realizaciones, la etiqueta es una etiqueta de epítopo como, pero no limitado a, una c-myc, V-5, hemaglutinina (HA), FLAG. En algunas realizaciones, la etiqueta es una etiqueta de afinidad como, pero no limitado a, biotina, etiqueta estreptocócica, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST) o un marcador poli(His).
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente una matriz que comprende un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido de Ar mutante está unido a un microchip. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante está unido directamente al microchip. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante está unido indirectamente al microchip a través de un conector. En algunas realizaciones, en la presente se proporciona una matriz de microchips que comprende un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente.
Ácidos nucleicos
En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos como se define en las reivindicaciones que codifican polipéptidos de AR mutante. En la presente se proporcionan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de AR mutante descritos en la presente. Los métodos para deducir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos particulares son conocidos en la técnica e implican técnicas estándar de biología molecular. En la presente se proporcionan ácidos nucleicos ejemplares que codifican polipéptidos de AR mutante. Se entiende que debido a la degeneración del código genético existen múltiples variantes de ácidos nucleicos que codifican el mismo polipéptido. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de AR mutante proporcionados en la presente abarcan tales variantes. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante son ácidos nucleicos sintéticos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante son moléculas de ADNc. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante no contienen ADN genómico. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante no están metilados. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante no contienen secuencias de intrón genómico de AR. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante comprenden una secuencia de nucleótidos de dos o más exones de la secuencia genómica de AR, incluyendo el exón 8 o una porción del mismo que comprende la posición de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la posición 876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de AR mutante comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican fenilalanina en una posición correspondiente a la posición 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR mutante comprende una modificación con respecto a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de Ar del tipo salvaje. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la que el polipéptido codificado comprende una sustitución del aminoácido fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante comprende una modificación en la que el polipéptido codificado no comprende fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la modificación del ácido nucleico es una mutación con cambio de sentido o una deleción de uno o más codones que codifican el polipéptido. En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición de amino 876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición de amino 876 del polipéptido de AR es TTC o TTT. En algunas realizaciones, el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR es TTC. En algunas realizaciones, el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR es TTT. En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTC a un codón de ácido nucleico que codifica leucina. En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTT a un codón de ácido nucleico que codifica leucina. En algunas realizaciones, el codón de ácido nucleico que codifica la leucina se selecciona entre TtA, TTG, CTT, CTC, CTA o CTG.
En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C). En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTC a CTC. En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C) en la posición de ácido nucleico 2626 de la secuencia de ácidos nucleicos de AR expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Adenina (A). En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTT a TTA. En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Adenina (A) en la posición de ácido nucleico 2628 de la secuencia de ácidos nucleicos de AR expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Guanina (G). En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTT a TTG. En algunas realizaciones, la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Guanina (G) en la posición de ácido nucleico 2628 de la secuencia de ácidos nucleicos de AR expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la modificación comprende una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C) en la primera posición del codón que codifica F876 del polipéptido de AR y una segunda mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Adenosina (A) en la tercera posición del codón que codifica F876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTT a CTA. En algunas realizaciones, la modificación es un mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C) en la posición de ácida nucleico 2626 y una segunda mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Adenosina (A) en la posición de ácido nucleico 2628 de la secuencia de ácidos nucleicos de AR expuesta en la SEQ ID NO:18.
En algunas realizaciones, la modificación comprende una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C) en la primera posición del codón que codifica F876 del polipéptido de AR y una segunda mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) para Guanina (G) en la tercera posición del codón que codifica F876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, la modificación cambia el codón de ácido nucleico que codifica la fenilalanina en la posición amino 876 del polipéptido de AR de TTT a CTG. En algunas realizaciones la modificación es una mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de Timina (T) por Citosina (C) en la posición de ácido nucleico 2626 y una segunda mutación con cambio de sentido que comprende una sustitución de timina (T) por guanina (G) en la posición de ácido nucleico 2628 de la secuencia de ácidos nucleicos de AR expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR mutante comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR mutante comprende un ácido nucleico que tiene un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleotídicos con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, donde el AR mutante codificado comprende una modificación con respecto al polipéptido de AR de tipo salvaje en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR mutante comprende un ácido nucleico que tiene un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleotídicos con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, donde el AR mutante codificado no comprende una fenilalanina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de Ar mutante comprende un ácido nucleico que tiene un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia de ácidos nucleotídicos con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, donde el AR mutante codificado comprende una leucina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante es un ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante es una molécula de ADN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante es una molécula de ADNc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante es una molécula de ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante es una molécula inhibidora de ARN (es decir, ARNi). En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente es una molécula de ácido nucleico que es complementaria o se une, a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante o una porción del mismo contiene ácido nucleico que codifica un aminoácido en la posición 876 que no es fenilalanina. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente que codifica un polipéptido de AR mutante o una porción del mismo contiene ácido nucleico que codifica leucina en la posición de aminoácido 876.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente es un oligonucleótido que codifica una porción del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente es un oligonucleótido que codifica una porción del polipéptido de AR mutante que contiene un codón de nucleótido que codifica el aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 876. En algunas realizaciones, el codón codifica un aminoácido que no es fenilalanina. En algunas realizaciones, el codón codifica un aminoácido que es leucina.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector como se define en las reivindicaciones que comprende ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de AR mutante proporcionados en la presente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente es un vector que comprende ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de AR mutante proporcionados en la presente es un vector de expresión. En algunas realizaciones, el ácido nucleico proporcionado en la presente es un vector que comprende ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de AR mutante proporcionados en la presente está operativamente enlazado con un promotor para la expresión de los polipéptidos de AR mutante.
En algunas realizaciones, el vector es un vector plasmídico. En algunas realizaciones, el vector es un vector viral. En algunas realizaciones, el vector viral es un vector viral de ADN o ARN. Los vectores virales ejemplares incluyen, pero no están limitados a, un vector de vacuna, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), retrovirus o herpesvirus.
En algunas realizaciones, se proporciona en la presente una matriz que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones que codifica cualquiera de los polipéptidos de AR mutante proporcionados en la presente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de AR mutante está unido a un microchip. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de AR mutante está directamente unido al microchip. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de AR mutante está unido indirectamente al microchip a través de un conector. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente una matriz de microchips que comprende un ácido nucleico que codifica cualquiera de los polipéptidos de a R mutante proporcionados en la presente.
Producción de ácidos nucleicos y polipéptidos.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada como se define en las reivindicaciones que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones se genera mediante métodos recombinantes estándar. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones se genera mediante la amplificación de una secuencia de AR mutante a partir de ADN genómico. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones se genera mediante reacción en cadena de polimerasa usando cebadores específicos de la secuencia AR. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones se genera mediante transcripción inversa de ARNm que codifica un polipéptido de AR mutante.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones se inserta en un vector de expresión y se expresa en una célula huésped o un extracto no celular. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones está operativamente enlazada a un promotor para la expresión del polipéptido de codificación en un extracto celular o no celular. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor inducible.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones es "exógena" a una célula, lo que significa que es extraña para la célula en la que se está introduciendo el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que normalmente no se encuentra la secuencia. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la técnica estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1996.
Los métodos para la expresión de una proteína en una célula son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la expresión en células, como células animales y vegetales. Las células animales ejemplares para la expresión de polipéptidos de AR mutante como se define en las reivindicaciones incluyen pero no están limitadas a bacterias, levaduras, células de insectos y células de mamíferos como, por ejemplo, células de humano, primates, roedores, bovinos y ovinos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el AR mutante se integra en el genoma de la célula huésped.
En algunas realizaciones, un método para la expresión de un polipéptido de AR mutante como se define en las reivindicaciones comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de expresión que codifica un polipéptido de AR mutante de tal manera que la célula produce el polipéptido de AR mutante. En algunos métodos, el ácido nucleico que codifica el polipéptido mutante está conectado al ácido nucleico que codifica una secuencia señal de tal manera que la secuencia señal se expresa como un péptido de fusión con el polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, la secuencia señal permite la secreción del polipéptido de AR mutante por la célula huésped.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante se aísla de una célula huésped que expresa el polipéptido mutante. En algunas realizaciones, se prepara un extracto a partir de la célula huésped y el polipéptido de AR mutante se aísla mediante métodos de purificación como, pero no limitados a, cromatografía o inmunoafinidad con un anticuerpo que es específico para polipéptidos de AR o específico para el polipéptido de AR mutante en particular.
Anticuerpos
El anticuerpo como se define en las reivindicaciones se une a un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente, y se une con menos afinidad o no se une a un polipéptido de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un polipéptido de AR mutante en presencia de un inhibidor de segunda generación como, pero no limitado a, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162.
En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente se detecta usando anticuerpos que reconocen específicamente los polipéptidos de a R mutante, pero no reconocen los polipéptidos de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente se detecta usando anticuerpos que reconocen específicamente un polipéptido de a R mutante que tiene una leucina en la posición de aminoácido 876, pero no reconocen los polipéptidos de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, los anticuerpos se generan contra una o más formas alélicas del polipéptido de a R mutante proporcionado en la presente. Las técnicas para usar una proteína específica o un oligopéptido como antígeno para provocar anticuerpos que reconocen específicamente epítopos en el péptido o proteína son bien conocidas. En una realización, la secuencia de ADN de la forma alélica deseada del gen objetivo se clona mediante la inserción en un vector de expresión apropiado y se traduce en proteína en una célula huésped procariota o eucariota. La proteína puede recuperarse y usarse como antígeno para provocar la producción de anticuerpos específicos. En otra realización, el ADN de la forma alélica deseada del gen objetivo se amplifica mediante tecnología de PCR y se traduce posteriormente in vitro en proteína para ser usado como el antígeno para provocar la producción de anticuerpos específicos. En otra realización, la secuencia de ADN de los alelos alternativos se usa como base para la generación de péptidos sintéticos que representan la secuencia de aminoácidos de los alelos para su uso como el antígeno para provocar la producción de anticuerpos específicos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos se generan o bien mediante técnicas de anticuerpos monoclonales estándar o se generan mediante sistemas de expresión basados en recombinantes. Ver de manera general, Abbas, Lichtman, y Pober, Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Co. (1991). Se pretende que el término "anticuerpos" incluya moléculas de anticuerpos intactos, así como fragmentos de anticuerpos o derivados, como Fab y F(ab')2, que son capaces de unirse específicamente al antígeno. Los anticuerpos así producidos se unen preferentemente solo a la proteína mutante producida en forma alélica que se usó como antígeno para crear el anticuerpo. Los métodos para generar anticuerpos específicos de alelos también se describen en la Patente de Estados Unidos N° 6.200.754 y la Patente de Estados Unidos N° 6.054.273.
En algunas realizaciones, el anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo humanizado. Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado genéticamente que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina de donante no humano, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la molécula estando derivadas de una o más inmunoglobulinas humanas. En algunas realizaciones, los residuos de soporte de marco se alteran para conservar la afinidad de unión (ver, por ejemplo, Queen et al. Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al. Bio/Technology, 9:421 (1991)). En algunas realizaciones, un anticuerpo aceptor humano adecuado es uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT®, la base de datos Los Alamos y la base de datos Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donante. En algunas realizaciones, un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donante (en base a aminoácidos) es adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR del donante. En algunas realizaciones, se selecciona de manera similar un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones marco constantes o variables de la cadena ligera. En algunas realizaciones, las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor se originan del mismo anticuerpo aceptor. En algunas realizaciones, las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor se originan a partir de los diferentes anticuerpos aceptores. El estado de la técnica describe varias maneras de producir tales anticuerpos humanizados; ver, por ejemplo, la EP-A-0239400 y la EP-A-054951.
En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos para el polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente pueden usarse para detectar la presencia de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente en una muestra, por ejemplo, una muestra de ensayo, una muestra celular, un extracto celular, una muestra biológica o un muestra de paciente, usando técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, transferencia Western, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta y micromatrices de anticuerpos. En algunas realizaciones, los anticuerpos que reconocen específicamente el polipéptido de AR mutante son inhibidores de AR de tercera generación. En algunas realizaciones, la capacidad de un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido de AR mutante para inhibir la actividad biológica del polipéptido de AR mutante puede determinarse usando los métodos descritos en la presente para identificar inhibidores de AR de tercera generación.
Ensayos de diagnóstico para detectar polipéptidos de AR mutante y ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de AR mutante
En la presente se proporcionan métodos que implican la detección de un polipéptido de AR mutante en un sujeto o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante en un sujeto, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o afección mediada por AR. En algunas realizaciones, los métodos se emplean para la selección de sujetos que tienen un cáncer que es resistente a la terapia con un anti-andrógenos, como un antagonista de AR de primera o segunda generación, identificar sujetos para el tratamiento con anti-andrógenos, como un antagonista de AR de primera o segunda generación, monitorizar la terapia de los sujetos que reciben una terapia anti-andrógenos, como un antagonista de AR de primera o segunda generación, optimizar la terapia de los sujetos que reciben una terapia anti-andrógenos, como un antagonista de AR de primera o segunda generación, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante detectado comprende una modificación en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante detectado comprende una sustitución del aminoácido fenilalanina por leucina en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un antagonista de primera o segunda generación.
En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un antagonista de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un antagonista de primera y segunda generación. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una leucina en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un antagonista de primera o segunda generación. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una leucina en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un antagonista de primera y segunda generación. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un inhibidor de CYP17A que se une a AR, como por ejemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona. En algunas realizaciones, un sujeto que tiene un polipéptido de AR mutante que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 es resistente a la inhibición con un inhibidor de CYP17A que se une a AR, como por ejemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para caracterizar un polipéptido de AR que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de segunda generación en un sujeto, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado se modifica en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar el AR como resistente a la inhibición con un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además no administrar un antagonista de AR de segunda generación. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para caracterizar un AR que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera generación en un sujeto, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar el AR como resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para caracterizar un AR que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A en un sujeto, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar el AR como resistente a la inhibición con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto tiene la modificación.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A es galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona. En algunas realizaciones, el método comprende además obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar un sujeto para terapia con un antagonista de AR de segunda generación, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además caracterizar al sujeto como no candidato para la terapia con un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar un sujeto para terapia con un antagonista de AR de primera generación, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista de AR de primera generación si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además caracterizar al sujeto como no candidato para la terapia con un antagonista de AR de primera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar un sujeto para terapia con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además caracterizar al sujeto como no candidato para la terapia con un inhibidor de CYP17A si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A es galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para seleccionar un sujeto para terapia con un antagonista de AR de tercera generación, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista de AR de tercera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto es o es probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR de segunda generación, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto es o es probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera generación, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para determinar si un sujeto es o es probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de Ar del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como probable que se vuelva resistente a la terapia con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A es galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para monitorizar si un sujeto que recibe un antagonista de AR de segunda generación para el tratamiento de un cáncer ha desarrollado o desarrollará resistencia a la terapia, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR de segunda generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para monitorizar si un sujeto que recibe un antagonista de AR de primera generación para el tratamiento de un cáncer ha desarrollado o desarrollará resistencia a la terapia, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de Ar del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera generación si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para monitorizar si un sujeto que recibe un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A para el tratamiento de un cáncer ha desarrollado o desarrollará resistencia a la terapia, que comprende (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) caracterizar al sujeto como resistente o como que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto tiene la modificación. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A es galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En la presente se describen antagonistas de AR de segunda generación para su uso en métodos para optimizar la terapia de un sujeto que recibe un antagonista de AR de segunda generación para el tratamiento de un cáncer, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) suspender el tratamiento con el antagonista de AR de segunda generación si el sujeto tiene la modificación o continuar el tratamiento con el antagonista de AR de segunda generación si el sujeto no tiene la modificación.
En la presente se describen antagonistas de AR de primera generación para su uso en métodos para optimizar la terapia de un sujeto que recibe un antagonista de AR de primera generación para el tratamiento de un cáncer, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) suspender el tratamiento con el antagonista de AR de primera generación si el sujeto tiene la modificación o continuar el tratamiento con el antagonista de AR de primera generación si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el método comprende además un paso de obtener la muestra de ácido nucleico del sujeto.
En la presente se describen inhibidores de CYP17A para su uso en métodos para optimizar la terapia de un sujeto que recibe un antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A para el tratamiento de un cáncer, que comprende: (a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (b) suspender el tratamiento con el antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto tiene la modificación o continuar el tratamiento con el antagonista de AR que es un inhibidor de CYP17A si el sujeto no tiene la modificación. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A es galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona.
En algunas realizaciones, el AR modificado es resistente al antagonismo completo por un antagonista de AR de segunda generación como, por ejemplo, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162. En algunas realizaciones, un antagonista de AR de segunda generación como, por ejemplo, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162 muestra actividad agonista hacia el AR modificado. En algunas realizaciones, el AR modificado es resistente al antagonismo completo por un antagonista de AR de primera generación. En algunas realizaciones, el AR modificado es resistente al antagonismo completo por un antagonista de AR que es un CYP17A.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR es hiperplasia prostática benigna, hirsutismo, acné, adenomas y neoplasias de la próstata, células tumorales benignas o malignas que contienen AR, hiperpilosidad, seborrea, endometriosis, síndrome de ovario poliquístico, alopecia androgénica. hipogonadismo, osteoporosis, supresión de espermatogénesis, libido, caquexia, anorexia, suplementos de andrógenos por niveles de testosterona disminuidos relacionados con la edad, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de endometrio, cáncer uterino, sofocos, enfermedad de Kennedy, atrofia muscular y debilidad, atrofia de la piel, pérdida ósea, anemia, arteriosclerosis, enfermedad cardiovascular, pérdida de energía, pérdida de bienestar, diabetes tipo 2 o acumulación de grasa abdominal.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un tumor sólido. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de hígado o un cáncer de vejiga. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de próstata.
En algunas realizaciones, la muestra es de cualquier tejido o fluido de un organismo. Las muestras incluyen, pero no están limitadas a, sangre completa, médula ósea disociada, aspirado de médula ósea, fluido pleural, fluido peritoneal, fluido de la médula espinal, fluido abdominal, fluido pancreático, fluido cefalorraquídeo, fluido cerebral, ascitis, fluido pericárdico, orina, saliva., lavado bronquial, sudor, lágrimas, flujo auditivo, esputo, fluido hidrocele, semen, flujo vaginal, leche, líquido amniótico y secreciones del tracto respiratorio, intestinal o genitourinario. En realizaciones particulares, la muestra es una muestra de biopsia tumoral. En realizaciones particulares, la muestra es de un fluido o tejido que es parte de, o está asociado con, el sistema linfático o el sistema circulatorio. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre que es una muestra de sangre de cordón, venosa, arterial, periférica, tisular, de cordón. En realizaciones particulares, la muestra es una muestra de suero. En algunas realizaciones, la muestra contiene una o más células tumorales circulantes (CTC). En algunas realizaciones, la muestra contiene una o más células tumorales diseminadas (DTC, por ejemplo, en una muestra de aspirado de médula ósea).
Los métodos para el aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas a partir de células contenidas en muestras de tejidos y fluidos son bien conocidos en la técnica. En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto se aísla de células contenidas en una biopsia tumoral del sujeto. En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto se aísla de las células en un aspirado de médula ósea. En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto se aísla de la muestra de suero contenida en las células. En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto se aísla de la muestra de linfa contenida en las células.
En algunas realizaciones, las muestras se obtienen del sujeto por cualquier medio adecuado para obtener la muestra usando métodos clínicos bien conocidos y rutinarios. Los procedimientos para obtener muestras de fluidos de un sujeto son bien conocidos. Por ejemplo, los procedimientos para extraer y procesar sangre completa y linfa son bien conocidos y pueden emplearse para obtener una muestra para su uso en los métodos proporcionados.
Típicamente, para la recogida de una muestra de sangre, se añade un agente anticoagulante (por ejemplo, EDTA o citrato y heparina o CPD (citrato, fosfato, dextrosa) o sustancias comparables) a la muestra para evitar la coagulación de la sangre. En algunos ejemplos, la muestra de sangre se recoge en un tubo de recolección que contiene una cantidad de EDTA para evitar la coagulación de la muestra de sangre.
En algunas realizaciones, la muestra es una biopsia de tejido y se obtiene, por ejemplo, mediante biopsia con aguja, biopsia con aguja guiada por CT, biopsia por aspiración, biopsia endoscópica, biopsia broncoscópica, lavado bronquial, biopsia por incisión, biopsia por escisión, biopsia por punción, biopsia por raspado, biopsia de piel, biopsia de médula ósea y procedimiento de escisión electroquirúrgica con asa (LEEP). Típicamente, se obtiene una biopsia o espécimen estéril no necrótico que es mayor de 100 mg, pero que puede ser más pequeña, como menos de 100 mg, 50 mg o menos, 10 mg o menos o 5 mg o menos; o más grande, como más de 100 mg, 200 mg o más, o 500 mg o más, 1 gm o más, 2 gm o más, 3 gm o más, 4 gm o más o 5 gm o más. El tamaño de la muestra a extraer para el ensayo depende de una serie de factores que incluyen, pero no están limitados a, el número de ensayos a realizar, la salud de la muestra de tejido, el tipo de cáncer y la condición del paciente. En algunas realizaciones, el tejido se coloca en un recipiente estéril, como un tubo o placa de cultivo estériles, y opcionalmente se sumerge en un medio apropiado. Típicamente, las células se disocian en suspensiones celulares por medios mecánicos y/o tratamiento enzimático como es bien conocido en la técnica. Típicamente, las células se recogen y luego se someten a procedimientos estándar para el aislamiento de ácido nucleico para el ensayo.
En algunas realizaciones, las muestras se obtienen del sujeto a intervalos regulares como, por ejemplo, un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, semanas, cuatro semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, un año, diariamente, semanalmente, bimensualmente, trimestralmente, bianualmente o anualmente. En algunas realizaciones, la recogida de muestras se realiza en un momento predeterminado o a intervalos regulares en relación con el tratamiento con uno o más agentes anticancerígenos. En algunas realizaciones, la recogida de muestras se realiza en un momento predeterminado o a intervalos regulares en relación con el tratamiento con un antagonista de AR, como un antagonista de AR de primera o segunda generación. Por ejemplo, una muestra se recoge a una hora predeterminada o a intervalos regulares antes, durante, o después del tratamiento o entre tratamientos sucesivos. En ejemplos particulares, se obtiene una muestra del sujeto antes de la administración de una terapia contra el cáncer y luego de nuevo a intervalos regulares después de que se ha efectuado el tratamiento. En ejemplos particulares, se obtiene una muestra del sujeto antes de la administración de un antagonista de AR como un antagonista de AR de primera o segunda generación, terapia y luego de nuevo a intervalos regulares después de que se ha efectuado el tratamiento. En algunas realizaciones, el antagonista de AR se selecciona entre bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162. En algunas realizaciones, el antagonista de AR es un inhibidor de CYP17A. En algunas realizaciones, el inhibidor de CYP17A se selecciona entre galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona.
El volumen de una muestra de fluido puede ser cualquier volumen que sea adecuado para la detección de un mutante de AR en los métodos proporcionados. En algunos ejemplos, el volumen de la muestra de fluido depende del método de ensayo particular usado. Por ejemplo, los métodos de ensayo particulares pueden requerir volúmenes de muestra de fluido más grandes o más pequeños dependiendo de factores como, pero no limitados a, la capacidad del dispositivo o método usado y el nivel de rendimiento del método de ensayo. En algunos ejemplos, una muestra de fluido se diluye en un medio apropiado antes de la aplicación del método de ensayo. En algunos ejemplos, se obtiene una muestra fluida de un sujeto y se usa una porción o alícuota de la muestra en el método de ensayo. La porción o alícuota puede diluirse en un medio apropiado antes de la aplicación del método de ensayo.
En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto que es mamífero. Los sujetos mamíferos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, primates como humanos, simios y monos; roedores como ratones, ratas, conejos y hurones; rumiantes como cabras, vacas, venados y ovejas; caballos, cerdos, perros, gatos y otros animales. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un paciente. En algunos ejemplos, el paciente es un paciente humano.
En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto es una muestra de ácido nucleico genómico. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico obtenida del sujeto es una muestra de ARN. En algunas realizaciones, el ARNm se aísla del ARN total en una muestra de ARN. En algunas realizaciones, la muestra de ARN se transcribe inversamente en ADNc. En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico genómico se amplifica mediante un método de amplificación de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método de amplificación de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, la muestra de ácido nucleico genómico se amplifica usando un conjunto de cebadores de nucleótidos específicos para el gen del AR. En algunas realizaciones, el conjunto de cebadores de nucleótidos flanquean la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, el producto de la amplificación es un ácido nucleico que codifica la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR. En algunas realizaciones, se conjuga un cebador específico de secuencia con una molécula detectable, como un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente, un marcador quimioluminiscente, un radiomarcador, un marcador enzimático, un sustrato detectable, o un péptido o molécula que se une a un segunda molécula detectable.
En algunas realizaciones, analizar comprende secuenciar la muestra de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el a R en una muestra de ácido nucleico se amplifica primero por un método como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos de secuencia, y luego se secuencia el fragmento de PCR amplificado. Los métodos de secuenciación ejemplares para su uso en los métodos proporcionados en la presente son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, métodos de terminación de didesoxi o cadena, secuenciación de Maxam-Gilbert, secuenciación de firmas masivamente paralela (o MPSS), secuenciación de polonia, secuenciación de pirosecuencia, secuenciación de tinte Illumina, secuenciación SOLiD (o secuenciación por ligadura), secuenciación de semiconductores iónicos, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de heliscope y secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT).
En algunas realizaciones, las muestras son una muestra de plasma o suero que contiene ADN tumoral circulante (ADNtc), ARN (ARNct) o microARN (ver, por ejemplo, Chan et al. (2007) Br J Cancer. 96(5):681-5). En algunas realizaciones, el ADN que codifica el AR mutante se evalúa mediante el método de secuenciación por PCR BEAMing (perlas, amplificación, emulsión, magnética) (ver, por ejemplo, Li et al. (2006) Nat Methods. 3(2):95-7; Li et al. (2006) Nat Methods. 3(7):551-9 y Diehl et al. (2008) Nat Med. 14(9):985-990). BEAMing es una técnica en la que las moléculas de ADN individuales se unen a perlas magnéticas en emulsiones de agua en aceite y luego se someten a una amplificación por PCR compartimentada. El estado mutacional del ADN unido a las perlas se determina luego por hibridación con sondas específicas de alelos fluorescentes para AR mutante o de tipo salvaje. Luego se usa la citometría de flujo para cuantificar el nivel de ADN mutante presente en el plasma o el suero (ver, por ejemplo, Higgins et al. (2012) Clin Cancer Res 18:3462-3469).
En algunas realizaciones, analizar una muestra para detectar la presencia de ADN que codifica el AR mutante comprende la detección de la mutación con una sonda de oligonucleótidos específica de secuencia que es específica para el ácido nucleico que codifica el AR mutante pero no el AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, analizar comprende (a) poner en contacto una muestra con una sonda de oligonucleótidos específica de la secuencia del ácido nucleico de AR mutante, por lo que si la secuencia de ácido nucleico mutante está presente en la muestra, se forma un complejo de sonda-ADN, y (b) detectar el complejo sonda-ADN. En algunas realizaciones, la sonda de oligonucleótidos es específica para el ácido nucleico que codifica la leucina en una posición correspondiente al aminoácido 876 de un polipéptido de AR. En algunas realizaciones, la sonda específica de secuencia se conjuga con una molécula detectable como un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente, un marcador quimioluminiscente, un radiomarcador, un marcador enzimático, un sustrato detectable, o un péptido o molécula que se une a una segunda molécula detectable.
En algunas realizaciones, los cambios de nucleótidos individuales son detectables por PCR usando marcadores de secuencias polimórficas amplificadas escindidas (CAPS) basadas en PCR que crean sitios de restricción en las secuencias mutantes (Michaels et al (1998) Plant J. 14(3):381-5) o sondas de horquilla específicas de secuencia unidas a fracciones detectables como, pero no limitadas a, un fluoróforo (Mhlanga y Malmberg (2001) Methods 25:463-471). En algunas realizaciones, la sonda específica de secuencia se conjuga con una molécula detectable, como un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente, un marcador quimioluminiscente, un radiomarcador, un marcador enzimático, un sustrato detectable, o un péptido o molécula que se une a una segunda molécula detectable En algunas realizaciones, la sonda de oligonucleótidos es específica para el ácido nucleico que codifica la leucina en una posición correspondiente al aminoácido 876 de un polipéptido de AR.
En algunas realizaciones, analizar una muestra para detectar la presencia de ADN que codifica el AR mutante se realiza usando una matriz de oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Hastia et al. (1999) J Med Genet.
36(10):730-6). En algunas realizaciones, la muestra que contiene ácido nucleico del sujeto se hibrida directamente con el chip. En algunas realizaciones, la muestra que contiene ácido nucleico del sujeto se amplifica usando un método de amplificación como, pero no limitado a, reacción en cadena de polimerasa (PCR), y el ácido nucleico amplificado se hibrida con el chip. En algunas realizaciones, la matriz de oligonucleótidos está contenida en un microchip. En algunas realizaciones, los cambios de nucleótidos individuales son detectables usando microchips.
En algunas realizaciones, analizar una muestra comprende la detección de la mutación con un anticuerpo específico para el polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el método para detectar un polipéptido de a R mutante comprende obtener una muestra de un sujeto, en donde la muestra comprende un polipéptido de AR y probar la muestra para detectar la presencia de un polipéptido de AR mutante poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo que es específico para la unión al polipéptido de AR mutante, y no se une o se une con una afinidad disminuida para el polipéptido de AR del tipo salvaje, en donde la presencia del polipéptido de AR mutante crea un complejo de anticuerpo-polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el método comprende además detectar el complejo anticuerpo-polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el método comprende además detectar el complejo anticuerpo-polipéptido de AR mutante con un reactivo de detección. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de AR mutante se conjuga con una molécula detectable como un marcador fluorescente, un marcador bioluminiscente, un marcador quimioluminiscente, un radiomarcador, un marcador enzimático, un sustrato detectable o un péptido o molécula que se une a una segunda proteína detectable (por ejemplo, un anticuerpo secundario). En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo específico de AR mutante se detecta analizando la molécula detectable. En algunas realizaciones, la unión del anticuerpo específico de AR mutante se detecta usando un anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-IgG). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de biopsia tumoral, un aspirado de médula ósea, una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de linfa.
Identificación de moléculas que interactúan con el receptor de andrógenos mutante
En otro aspecto, la invención proporciona métodos de uso de los polipéptidos de AR mutante para la selección de compuestos que inhiben el receptor mutante (es decir, compuestos inhibidores de AR de tercera generación). En algunas realizaciones, los métodos se emplean para la identificación de compuestos inhibidores de AR de tercera generación para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, los métodos se emplean para la identificación de compuestos inhibidores de AR de tercera generación para el tratamiento de cánceres resistentes, como el cáncer de próstata resistente al tratamiento con antagonistas de AR de segunda generación, como ARN-509, enzalutamida (MDV3100) o RD162.
En algunas realizaciones, un método para identificar compuestos inhibidores de AR de tercera generación comprende (a) expresar un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente en una célula, (b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba y (c) detectar el nivel de actividad de AR en la célula. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con un agonista de AR antes o al mismo tiempo que se pone en contacto la célula con el compuesto de prueba. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con un agonista de AR aproximadamente 1 hora, 2, horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas o más antes de poner en contacto la célula con el compuesto de prueba. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con un agonista de AR al mismo tiempo que se pone en contacto la célula con el compuesto de prueba. En algunas realizaciones, el agonista de AR se selecciona entre metiltrienolona (R1881), DHT, mibolerona (Mb) y testosterona. El polipéptido de AR mutante comprende una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante no contiene una fenilalanina en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante contiene una leucina en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido.
En algunas realizaciones, se usa una línea celular que puede transfectarse con ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR mutante y en la que se puede monitorizar la actividad de AR. En algunas realizaciones, la célula no expresa el AR de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la célula expresa un nivel bajo de AR de tipo salvaje. En algunas realizaciones, la célula expresa un polipéptido de AR mutante endógeno. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante endógeno comprende una modificación en un aminoácido correspondiente al aminoácido 877 de un polipéptido de AR del tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante endógeno comprende una modificación que es una sustitución de Treonina por Alanina en la posición de aminoácido 877 (T877A). En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación en un aminoácido correspondiente al aminoácido 874 de un polipéptido de AR de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una modificación que es una sustitución de Histidina a Tirosina en la posición de aminoácido 874 (H874Y). En algunas realizaciones, la célula se selecciona entre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3 y TSY-PR1. En algunas realizaciones, la línea celular es una línea celular de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, la línea celular se selecciona entre CWR, LNCaP, VCaP y LAPC4.
En algunas realizaciones, la célula expresa establemente el polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el AR mutante se integra en el genoma de la célula.
En algunas realizaciones, el nivel de actividad de AR se detecta usando un gen informador enlazado operativamente a un promotor sensible a AR. En algunas realizaciones, el promotor sensible a AR comprende uno o más elementos de respuesta a andrógenos (ARE) a los que se une el polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona entre una probasina (Pb), un antígeno específico de la próstata (PSA), repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón (MMTV LTR), ácido graso sintasa (FASN), antígeno epitelial transmembrana seis de la próstata 4 (STEAP4), proteasa transmembrana, serina 2 (TMPRSS2), glicoproteína 1 alfa-1-ácida (ORM1) o promotor del gen homeobox humano NKX3.1. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor sintético que contiene uno o más ARE.
En algunas realizaciones, el promotor sensible a AR está enlazado operativamente a un gen informador adecuado que codifica una proteína detectable. Las proteínas detectables ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, luciferasa, proteínas fluorescentes, proteínas bioluminiscentes, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina y cloranfenicol acetiltransferasa. En algunas realizaciones, una disminución en la expresión del gen informador después de la exposición al compuesto de prueba en comparación con un control adecuado indica que el compuesto de prueba es eficaz para la inhibición del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el control es la expresión basal del gen informador antes de la exposición de la célula al compuesto de prueba. En algunas realizaciones, la expresión del gen informador se analiza usando un extracto celular preparado a partir de células de prueba.
En algunas realizaciones, el nivel de actividad de AR se detecta midiendo la expresión de uno o más genes sensibles a andrógenos endógenos en una célula. En algunas realizaciones, el gen sensible a los andrógenos se regula por incremento (es decir, se induce) en respuesta al tratamiento con andrógenos. En algunas realizaciones, el gen sensible a los andrógenos se regula por disminución (es decir, se reprime) en respuesta al tratamiento con andrógenos. Los genes sensibles as andrógenos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, antígeno específico de la próstata (PSA), antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), prostasina, homólogo 2 de caracol (SLUG), proteasa transmembrana, serina 2 (TMPRSS2), antígeno epitelial transmembrana seis de miembro de la familia de la próstata 4 (STEAP4), proteína de unión a FK5065 (FKBP5), orosomucoide 1/glicoproteína/alfa-1-ácida (ORM1), familia de portador de solutos 35 (SLC35F2/NOV), proteína 3 y 5 de unión a IGF de factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-1), proteína-5 de unión a potenciador de CCAAT, fosfatasa y homólogo de tensina delecionado en el cromosoma 10 (PTEN), FASN, NKX3.1, AMIGO2, BDNF, CAMK2N1, HPGD, NCAPD3, PLD1, IL-15, IL-18, y ERBB2/HER2.
En algunas realizaciones, el nivel de actividad de AR se detecta midiendo la expresión de uno o más genes endógenos que son inducidos por la exposición a un andrógeno o un agonista de AR. En algunas realizaciones, una disminución en la expresión de uno o más genes inducibles por andrógenos después de la exposición al compuesto de prueba en comparación con un control adecuado indica que el compuesto de prueba es eficaz para la inhibición del polipéptido de AR mutante. Los genes inducibles por andrógenos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, antígeno específico de la próstata (PSA), prostasina, homólogo 2 de caracol (SLUG), proteasa transmembrana, serina 2 (TMPRSS2), antígeno epitelial transmembrana seis del miembro de la familia de próstata 4 (STEAP4), proteína 5 de unión a FK506 (FKBP5) y orosomucoide 1/glicoproteína/alfa-1-ácida (ORM1). En algunas realizaciones, La expresión del gen inducible se evalúa en presencia de un agonista de AR. En algunas realizaciones, las células se ponen en contacto con un agonista de andrógenos antes o simultáneamente con el compuesto de prueba.
En algunas realizaciones, el nivel de actividad de AR se detecta midiendo la expresión de uno o más genes endógenos que se reprimen por exposición a un andrógeno o un agonista de AR. En algunas realizaciones, un aumento en o el fallo de reprimir la expresión de uno o más genes reprimidos por andrógenos después de la exposición al compuesto de prueba en comparación con un control adecuado indica que el compuesto de prueba es eficaz para la inhibición del polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, el control es la expresión basal del gen antes de la exposición de la célula al compuesto de prueba. Los genes reprimidos por andrógenos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), familia de portadores de solutos 35 (SLC35F2/NOV), proteína de unión a IGF -3 y -5, proteína-5 de unión a potenciador de CCAAT, fosfatasa y homólogo de tensina delecionado en el cromosoma 10 (PTEN), IL-15, IL-18 y ERBB2/HER2. En algunas realizaciones, la expresión del gen reprimible se evalúa en presencia de un agonista de AR. En algunas realizaciones, las células se ponen en contacto con un agonista de andrógenos antes o simultáneamente con el compuesto de prueba.
Los métodos para medir la expresión de genes endógenos son bien conocidos en la técnica. Los métodos ejemplares para la medición de la expresión génica incluyen, pero no están limitados a, métodos analíticos de proteínas como, por ejemplo, inmunohistoquímica, inmunotransferencia (por ejemplo, análisis Western), cromatografía y métodos analíticos de ácidos nucleicos como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real (RT-PCR), análisis Northern.
En algunas realizaciones, la actividad de un polipéptido de AR mutante se mide usando un ensayo como, pero no limitado a, un ensayo de unión al coactivador de Ar (por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos, ensayos de transferencia de energía de resonancia Forster (fluorescencia), por ejemplo, ensayo de coactivador del receptor de andrógenos LanthaScreen™ TR-FRET), un ensayo de perfil conformacional AfR (ver, por ejemplo, Joseph et al. (2009) PNAS 106(29):12178-12183), un ensayo de unión a ADN de AR (ver, por ejemplo, Roche et al. (1992) Mol. Endocrinol. 6(12):2229-35), inmunoprecipitación de cromatina, ensayo de interacción terminal N/C (ver, por ejemplo, Hsu et al. (2005) Mol. Endocrinology 19(2)350 -361 y Ghali et al. (2003) J Clin Endocrinol Metab. 88(5):2185-93).
En algunas realizaciones, el método para identificar compuestos inhibidores de AR de tercera generación como se define en las reivindicaciones comprende seleccionar un compuesto inhibidor de AR de tercera generación potencial usando modelado asistido por ordenador con un cristal tridimensional o estructura de solución de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante comprende una sustitución de aminoácidos en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante no contiene una fenilalanina en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido de AR mutante contiene una leucina en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido. En algunas realizaciones, el método comprende poner en contacto el polipéptido de AR mutante con el compuesto de prueba y detectar la interacción del compuesto de prueba con el polipéptido de AR mutante. En algunas realizaciones, un compuesto de prueba que interactúa con el polipéptido de AR mutante se identifica como un compuesto inhibidor de AR de tercera generación candidato.
En algunas realizaciones, un compuesto de prueba para su uso en los métodos proporcionados es un miembro de una biblioteca de compuestos. En algunas realizaciones, la generación de una biblioteca de compuestos de prueba es por cualquier método adecuado para la producción de compuestos químicos. Una "biblioteca de compuestos de prueba" se refiere a un panel que comprende una multiplicidad de compuestos de prueba. Se ha descrito un enfoque ejemplar para la síntesis de bibliotecas moleculares de moléculas orgánicas pequeñas (Carell et al. (1994). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061). En algunas realizaciones, los compuestos de prueba proporcionados en la presente se obtienen usando cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida o de fase de solución paralelas espacialmente direccionables, métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución, el método de biblioteca 'una perla un compuesto' y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a las bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Otros métodos ejemplares para la síntesis de bibliotecas moleculares se encuentran en la técnica, por ejemplo en: Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Horwell et al. (1996) Immunopharmacology 33:68 -; y en Gallop et al. (1994); J. Med. Chem 37:1233 -. En algunas realizaciones, las bibliotecas de compuestos se presentan en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner Patente de Estados Unidos N° 5.223.409), esporas (Ladner USP' '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310). En algunas realizaciones, los polipéptidos combinatorios se producen a partir de una biblioteca de ADNc. Los compuestos ejemplares que pueden seleccionarse para actividad incluyen, pero no están limitados a, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas orgánicas pequeñas, y bibliotecas de extractos de productos naturales.
Inhibidores de AR identificados por los métodos de selección
Como se describe en la presente, los inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos de selección proporcionados en la presente son moduladores de AR. Como se describe en la presente, el inhibidor de AR de tercera generación inhibe o reduce por lo menos una actividad de un polipéptido de AR. Las actividades de AR ejemplares incluyen, pero no se limitan a, unión a coactivador, unión a AdN, unión a ligando o translocación nuclear. Como se describe en la presente, el inhibidor de AR de tercera generación inhibe la actividad de un polipéptido de AR en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 98% o 100% en comparación con la actividad del polipéptido de AR en ausencia del inhibidor. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de Ar de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente son agonistas inversos de AR, antagonistas de AR, degradadores de AR, moduladores del tráfico de AR y/o inhibidores de unión a ADN de AR. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente es un agonista inverso de AR. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente son antagonistas de AR. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente son degradadores de AR. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente son moduladores del tráfico de AR. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente son inhibidores de unión a ADN de AR. Como se describe en la presente, el inhibidor de AR inhibe por lo menos una actividad de un polipéptido de AR del tipo salvaje. Como se describe en la presente, el inhibidor de AR inhibe por lo menos una actividad de un polipéptido de AR mutante.
Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente tiene una actividad pro-convulsiva mínima y/o un impacto mínimo en el umbral de convulsión. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente presenta una modulación mínima del canal de cloruro activado por GABA. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente muestra una unión mínima al canal de cloruro activado por GABA. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente tiene un antagonismo mínimo del canal de cloruro activado por GABA. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente es un modulador de AR con interacción mínima con un canal de cloruro activado por GABA. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente es un modulador de AR con una interacción mínima con el canal de cloruro activado por GABAa . Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente es un modulador de AR con una interacción mínima con el canal de cloruro activado por GABAa y/o una penetración mínima de la barrera hematoencefálica. Los ensayos de GABA son conocidos e incluyen, pero no están limitados a, los descritos en Ashok K. Mehta y Maharaj K. Ticku "Characterization of the Picrotoxin Site of GABAA Receptors" Current Protocols in Pharmacology (2000) 1.18.1-1.18.17; Copyright © 2000 por John Wiley & Sons, Inc.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe la translocación nuclear de AR. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe la unión del ADN de AR a los elementos de respuesta a andrógenos. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el reclutamiento de coactivadores en un promotor sensible a AR. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente no muestra actividad agonista en células de cáncer de próstata que sobreexpresan AR.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan AR de tipo salvaje. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan un AR mutante que tiene una mutación F876L. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de Ar de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan el AR de tipo salvaje y un AR mutante que tiene una mutación F876L. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan un AR mutante que tiene una mutación T877A (por ejemplo, tumores de xenoinjerto formados a partir de células LNCaP). Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan AR del tipo salvaje y un AR mutante que tiene una mutación T877A (por ejemplo tumores de xenoinjerto formados a partir de células LNCaP/AR). Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente inhibe el crecimiento de modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata sensibles a la castración y resistentes a la castración que expresan un AR mutante que tiene una mutación T877A y un AR mutante que tiene una mutación F876L.
Composiciones farmacéuticas
En la presente se describe una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos de selección proporcionados en la presente. En la presente se describe el uso de un inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos de selección proporcionados en la presente para la preparación de un medicamento.
Como se describe en la presente, la composición farmacéutica que comprende un inhibidor de AR de tercera generación también contiene por lo menos un ingrediente inactivo farmacéuticamente aceptable. Como se describe en la presente, la composición farmacéutica que comprende un inhibidor de AR de tercera generación se formula para inyección intravenosa, inyección subcutánea, administración oral o administración tópica. Como se describe en la presente, la composición farmacéutica que comprende un inhibidor de AR de tercera generación es un comprimido, una píldora, una cápsula, un líquido, una suspensión, un gel, un coloide, una dispersión, una suspensión, una solución, una emulsión, una pomada o una loción.
Las composiciones farmacéuticas se formulan de manera convencional usando uno o más ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. Un resumen de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente puede encontrarse en, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, séptima Edición (Lippincott Williams y Wilkins, 1999).
En la presente se proporcionan composiciones farmacéuticas, un inhibidor de AR de tercera generación, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y por lo menos un ingrediente inactivo farmacéuticamente aceptable. Como se describe en la presente, el inhibidor de AR de tercera generación descrito en la presente se administra como composiciones farmacéuticas en las que el inhibidor de AR de tercera generación se mezcla con otros ingredientes activos, como en terapia de combinación. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen otros agentes medicinales o farmacéuticos, portadores, adyuvantes, conservantes, estabilizantes, humectantes o agentes emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. En otras realizaciones más, las composiciones farmacéuticas incluyen otras sustancias terapéuticamente valiosas.
Una composición farmacéutica, como se usa en la presente, se refiere a una mezcla de un inhibidor de AR de tercera generación o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, con otros componentes químicos (es decir, ingredientes inactivos farmacéuticamente aceptables) como portadores, excipientes, aglutinantes, agentes de relleno, agentes de suspensión, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes, agentes disgregantes, agentes dispersantes, surfactantes, lubricantes, colorantes, diluyentes, solubilizantes, agentes humectantes, plastificantes, estabilizadores, potenciadores de la penetración, agentes humectantes, agentes antiespumantes, antioxidantes, conservantes, o una o más combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un sujeto, como un mamífero.
Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar ampliamente dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y la salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto usado y otros factores. Los compuestos pueden usarse individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos como componentes de mezclas.
Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente se administran a un sujeto mediante vías de administración apropiadas incluyendo, pero no limitadas a, vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), intranasal, bucal, tópica, rectal o transdérmica. Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen, pero no están limitadas a, dispersiones líquidas acuosas, dispersiones autoemulsionantes, soluciones sólidas, dispersiones liposomales, aerosoles, formas de dosificación sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada.
Como se describe en la presente, la composición farmacéutica comprende además uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales incluyendo, pero no limitados a, corticosteroides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de quinasa, inhibidores de HSP90, e inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC).
Como se describe en la presente, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. Como se describe en la presente, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente.
Métodos terapéuticos
En la presente se describen los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados usando los métodos proporcionados en la presente que se administran para el tratamiento de una enfermedad o afección. También se describen en la presente métodos para tratar una enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR en mamíferos que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
También se describen en la presente métodos que comprenden administrar un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que tiene una enfermedad o afección que está meditada por AR o es dependiente de Ar . También se describe en la presente el uso de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente para la preparación de medicamentos para el tratamiento de una enfermedad o afección que está meditada por AR o es dependiente de AR. También se describe en la presente un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente para el tratamiento de una enfermedad o afección que está meditada por AR o es dependiente de AR. Como se describe en la presente, el sujeto (por ejemplo, un humano) está recibiendo actualmente uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales distintos del compuesto inhibidor de AR de tercera generación.
Como se describe en la presente, el método comprende además administrar uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales distintos de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente. Como se describe en la presente, el uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales distintos de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se seleccionan de: hormonas, agonistas o antagonistas de receptores hormonales, corticosteroides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticancerosos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de quinasas, inhibidores de HSP90, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC). Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra antes de, simultáneamente, después de, o intermitentemente con el uno o más agentes terapéuticamente activos adicionales distintos del compuesto inhibidor de AR de tercera generación.
Como se describe en la presente, al sujeto se le administra un agonista o antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) en combinación con el compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente. Como se describe en la presente, se administra un agonista del receptor de GnRH como leuprolida, bruserelina y goserelina a un sujeto en combinación con el compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente. Los agonistas de los receptores de GnRH provocan un aumento inicial en la producción de hormonas (es decir, "brote clínico") seguido de la inhibición de la producción de la hormona luteinizante, que a su vez provoca una supresión de la testosterona y la dihidrotestosterona, de las que depende el crecimiento continuo de las células de cáncer de próstata. Como se describe en la presente, al sujeto se le administra un agonista o antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) en combinación con un compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente para el tratamiento de una enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR, como cáncer de próstata, mama, vejiga o hepatocelular. Como se describe en la presente, al sujeto se le administra un agonista o antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) en combinación con un compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente para el tratamiento de un cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Como se describe en la presente, al sujeto se le administra un compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente para reducir o inhibir el aumento inicial en la producción de hormonas provocado por el tratamiento con un agonista del receptor de GnRH. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra antes de, simultáneamente, después de, o intermitentemente con un agonista o antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH).
Como se describe en la presente, la enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR es hiperplasia prostática benigna, hirsutismo, acné, adenomas y neoplasias de la próstata, células tumorales benignas o malignas que contienen el receptor de andrógenos, hiperpilosidad, seborrea, endometriosis, síndrome de ovario poliquístico, alopecia androgénica, hipogonadismo, osteoporosis, supresión de espermatogénesis, libido, caquexia, anorexia, suplementos de andrógenos para niveles de testosterona disminuidos relacionados con la edad, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer uterino, cáncer de vejiga, cáncer hepatocelular, sofocos y enfermedad de Kennedy, atrofia y debilidad muscular, atrofia de la piel, pérdida ósea, anemia, arteriosclerosis, enfermedad cardiovascular, pérdida de energía, pérdida de bienestar, diabetes tipo 2 o acumulación de grasa abdominal. Como se describe en la presente, la enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR es un cáncer dependiente de AR o mediado por AR como, por ejemplo, un cáncer de próstata, mama, vejiga o hígado (es decir, hepatocelular).
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Como se describe en la presente, el cáncer es un cáncer dependiente de hormonas. Como se describe en la presente, el cáncer dependiente de hormonas es un cáncer dependiente de AR. Como se describe en la presente, el cáncer es cáncer de próstata. Como se describe en la presente, el cáncer es cáncer de próstata resistente a la castración. Como se describe en la presente, el método de tratamiento del cáncer comprende además administrar al mamífero por lo menos un agente anticancerígeno adicional.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde el mamífero no ha recibido tratamiento con un agente anticancerígeno. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde el mamífero no ha recibido tratamiento con un compuesto quimioterapéutico.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le han administrado uno o más agentes anticancerígenos. Los ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen, pero no están limitados a, agentes terapéuticos hormonales incluyendo, pero no limitados a, antagonistas de AR de primera y segunda generación (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162) y compuestos que inhiben la producción de hormonas (por ejemplo, andrógenos) como por ejemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona, compuestos quimioterapéuticos, antimetabolitos, anticuerpos anticancerígenos, cirugía, radiación y terapia hipertérmica. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le han administrado uno o más compuestos quimioterapéuticos. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le ha tratado con cirugía. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le ha tratado con terapia de radiación. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le ha tratado con una terapia hipertérmica.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se usa para tratar el cáncer de próstata en un mamífero, en donde al mamífero se le han administrado uno o más ciclos de tratamiento con un agente anticancerígeno.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un agonista inverso de a R, antagonista de AR, un degradador de AR, un modulador del tráfico de AR, un inhibidor de unión a ADN de AR, o combinaciones de los mismos.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un agonista inverso de AR.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un antagonista de AR.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un degradador de AR.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto es un modulador de tráfico de AR.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un inhibidor de la unión a ADN de AR.
También se describen en la presente métodos para tratar el cáncer en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto es un inhibidor de la síntesis de proteínas de AR.
Como se describe en la presente, el cáncer es cáncer de próstata. Como se describe en la presente, el cáncer es cáncer de próstata resistente a la castración. Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a ARN-509. Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a enzalutamida (MDV3100). Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a RD162. Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente al acetato de abiraterona. Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a galeterona (TOK001). Como se describe en la presente, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata resistente a TAK-700.
Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente pueden administrarse a un sujeto de varias maneras mediante múltiples vías de administración incluyendo, pero no limitadas a, vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), bucal, tópica o transdérmica. Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen, pero no están limitadas a, dispersiones líquidas acuosas, dispersiones autoemulsionantes, soluciones sólidas, dispersiones liposomales, formas de dosificación sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se administra por vía oral. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se administra por vía intravenosa.
Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se administra por vía tópica. Como se describe en la presente, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se formula en una variedad de composiciones administrables tópicamente como soluciones, suspensiones, lociones, geles, pastas, champús, exfoliantes, frotamientos, frotis, barras medicinales, vendajes medicinales, bálsamos, cremas o pomadas. Tales compuestos farmacéuticos pueden contener solubilizantes, estabilizantes, agentes potenciadores de la tonicidad, tampones y conservantes. Como se describe en la presente, el compuesto antiandrógenos identificado usando los métodos proporcionados en la presente se administra tópicamente a la piel.
También se describe en la presente el uso de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad, trastorno o afecciones en las que la actividad de AR contribuye a la patología y/o síntomas de la enfermedad o afección. Como se describe en la presente, la enfermedad o afección es cualquiera de las enfermedades o afecciones especificadas en la presente.
También se describe en la presente que: (a) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente se administra sistémicamente al mamífero; y/o (b) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra por vía oral al mamífero; y/o (c) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra por vía intravenosa al mamífero; y/o (d) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra mediante inyección al mamífero; y/o (e) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra tópicamente al mamífero; y/o (f) la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra de manera no sistémica o local al mamífero.
También se describen en la presente administraciones individuales de la cantidad eficaz del compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente, por ejemplo, en las que (i) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra una vez; (ii) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra al mamífero varias veces durante el transcurso de un día; (iii) continuamente; o (iv) continuadamente.
También se describen en la presente administraciones múltiples de la cantidad eficaz de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, en donde (i) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra continua o intermitente: como en una dosis individual; (ii) el tiempo entre administraciones múltiples es cada 6 horas; (iii) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra al mamífero cada 8 horas; (iv) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra al mamífero cada 12 horas; (v) el compuesto inhibidor de AR de tercera generación se administra al mamífero cada 24 horas. Como se describe en la presente, el método comprende un descanso de fármacos, en donde la administración del compuesto inhibidor de Ar de tercera generación se suspende temporalmente o la dosis del compuesto que se está administrando se reduce temporalmente; Al final del descanso de los fármacos, se reanuda la dosificación del compuesto. Como se describe en la presente, la duración del descanso de los fármacos varía de 2 días a 1 año.
También se describen en la presente métodos para reducir la activación de AR en un mamífero que comprende administrar al mamífero un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente. Como se describe en la presente, el método comprende reducir la activación de AR en células de próstata en el mamífero. Como se describe en la presente, el método comprende reducir la activación de AR en células no prostáticas. Como se describe en la presente, el método para reducir la activación de AR comprende reducir la unión de los andrógenos al receptor de andrógenos. Como se describe en la presente, el método para reducir la activación de AR comprende reducir la concentración de AR en una célula.
En algunos casos, se divulga en la presente el uso de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones que dependen de AR o están mediadas por AR. Como se describe en la presente, la enfermedad o afección es el cáncer de próstata. Como se describe en la presente, la enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR se describe en la presente.
En algunos casos, se divulga en la presente el uso de un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente en el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones que dependen de AR o están mediadas por AR. Como se describe en la presente, la enfermedad o afección dependiente de AR o mediada por AR se describe en la presente.
En cualquiera de las realizaciones divulgadas en la presente, el mamífero es un humano. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente se administra a un humano.
Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación proporcionado en la presente se usa para disminuir, reducir o eliminar la actividad de AR.
Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados por los métodos divulgados en la presente son moduladores selectivos de AR. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados por los métodos divulgados en la presente tienen una alta especificidad para el AR y tienen actividades farmacológicas deseables, selectivas de tejido. Las actividades farmacológicas deseables, selectivas de tejido incluyen, pero no están limitadas a, actividad antagonista de AR en células de próstata y ninguna actividad antagonista de AR en células no de próstata. Como se describe en la presente, los compuestos inhibidores de AR de tercera generación divulgados en la presente son anti-andrógenos que muestran actividad agonista de AR insignificante o nula.
En la presente se describen compuestos inhibidores de AR de tercera generación identificados por los métodos divulgados en la presente seleccionados de metabolitos activos, tautómeros, solvatos farmacéuticamente aceptables, sales farmacéuticamente aceptables o profármacos de un compuesto inhibidor de AR identificado usando los métodos proporcionados en la presente.
Como se describe en la presente, la composición farmacéutica que comprende compuestos inhibidores de AR de tercera generación se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales que incluyen, pero no están limitados a, corticosteroides, agentes antieméticos, analgésicos, agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios, inhibidores de quinasa, inhibidores de HSP90 e inhibidores de histona desacetilasa (HDAC). Como se describe en la presente, la composición farmacéutica que comprende compuestos inhibidores de AR de tercera generación se administra en combinación con un agente anticancerígeno que incluye, pero no está limitado a, un agente terapéutico hormonal que incluye, pero no está limitado a, antagonistas de Ar de primera y segunda generación (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, hidroxiflutamida, nilutamida, ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162), un compuesto que inhibe la producción de hormonas (por ejemplo, andrógenos) como un inhibidor de CYP17A incluyendo, por ejemplo, galeterona (TOK001), TAK-700 o acetato de abiraterona, compuestos quimioterapéuticos, antimetabolitos, anticuerpos anticancerígenos, cirugía, radiación y terapia hipertérmica. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran en la misma composición. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran como composiciones separadas. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran por la misma vía de administración. Como se describe en la presente, el compuesto inhibidor de AR de tercera generación y el agente terapéutico adicional se administran por vías de administración diferentes.
Kits
Para su uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas en la presente, la invención también proporciona kits como se definen en las reivindicaciones. Tales kits pueden comprender un portador, envase o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes, como viales, tubos y similares, cada uno de los recipientes comprendiendo uno de los elementos separados que se usarán en un método descrito en la presente en. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes están formados de cualquier material aceptable incluyendo, por ejemplo, vidrio o plástico.
En algunas realizaciones, los kits como se definen en las reivindicaciones son para su uso en la detección de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante en un sujeto o para detectar un polipéptido de AR mutante en un sujeto (es decir, un kit de diagnóstico). En algunas realizaciones, los kits se emplean para seleccionar pacientes para el tratamiento con un antagonista de AR de tercera generación, para identificar sujetos como resistentes o con probabilidad de volverse resistentes a un antagonista de AR de primera o segunda generación, para monitorizar el desarrollo de resistencia a una terapia con antagonista de AR de primera o de segunda generación, o combinaciones de los mismos. Los kits como se definen en las reivindicaciones contienen uno o más reactivos para la detección del ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante, para la detección de polipéptidos de AR mutantes, para la detección de actividad de AR en células del sujeto, o combinaciones de los mismos. Los reactivos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, tampones, reactivos de PCR, anticuerpos, sustratos para tinción enzimática, cromagenes u otros materiales como portaobjetos, recipientes, placas de microtitulación y, opcionalmente, instrucciones para realizar los métodos. Los expertos en la técnica reconocerán muchos otros posibles recipientes y placas y reactivos que pueden usarse para poner en contacto los varios materiales. Los kits también pueden contener muestras de control, como por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, como por ejemplo un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente o ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de AR mutante proporcionado en la presente. En algunas realizaciones, los kits contienen uno o más conjuntos de cebadores de oligonucleótidos para la detección de la expresión de genes de andrógenos endógenos.
En algunas realizaciones, el recipiente(s) puede comprender uno o más antagonistas de AR de primera o segunda generación, opcionalmente en una composición o en combinación con otro agente como se divulga en la presente. El recipiente(s) tiene opcionalmente un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Tales kits comprenden opcionalmente un compuesto con una descripción o etiqueta de identificación o instrucciones relacionadas con su uso en los métodos descritos en la presente.
Un kit comprenderá típicamente uno o más recipientes adicionales, cada uno con uno o más de varios materiales (como reactivos, opcionalmente en forma concentrada, y/o dispositivos) deseables desde el punto de vista comercial y del usuario para el uso de un compuesto descrito en la presente. Ejemplos no limitativos de tales materiales incluyen, pero no están limitados a, tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas; etiquetas de portadores, envases, recipientes, viales y/o tubos que enumeran los contenidos y/o instrucciones de uso, y prospectos con instrucciones de uso. Típicamente también se incluirá un conjunto de instrucciones.
Una etiqueta puede estar en o asociada con el recipiente. Una etiqueta puede estar en un recipiente cuando las letras, números u otros caracteres que forman la etiqueta están adheridos, moldeados o grabados en el propio recipiente; puede asociarse una etiqueta con un recipiente cuando está presente dentro de un receptáculo o portador que también está contenido en el recipiente, por ejemplo, como un prospecto. Puede usarse una etiqueta para indicar que los contenidos se deben usar para una aplicación terapéutica específica. La etiqueta también puede indicar instrucciones para el uso de los contenidos, como en los métodos descritos en la presente.
En la presente se describen artículos de fabricación, que incluyen material de envasado, un compuesto inhibidor de AR de tercera generación identificado usando los métodos proporcionados en la presente dentro del material de envase, y una etiqueta que indica que el compuesto o composición, o la sal farmacéuticamente aceptable, los tautómeros, el N-óxido farmacéuticamente aceptable, el metabolito farmacéuticamente activo, el profármaco farmacéuticamente aceptable o el solvato farmacéuticamente aceptable del mismo que se usan para reducir, disminuir o eliminar los efectos de los receptores de andrógenos, o para el tratamiento, prevención o mejora de uno o más síntomas de una enfermedad o afección que se beneficiaría de una reducción o eliminación de la actividad del receptor de andrógenos.
Producción de líneas celulares resistentes a los andrógenos.
En la presente se describen métodos para producir líneas celulares de cáncer de próstata resistentes al tratamiento con un antagonista de AR. Como se describe en la presente, las líneas celulares de cáncer de próstata son resistentes al tratamiento con ARN-509. Como se describe en la presente, las líneas celulares de cáncer de próstata son resistentes al tratamiento con enzalutamida (MDV3100). Como se describe en la presente, las líneas celulares resistentes generadas por el método proporcionado expresan un nivel más alto de AR en comparación con la línea celular original usada para generar la línea celular resistente. Como se describe en la presente, las líneas celulares resistentes generadas por el método expresan aproximadamente 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10 veces o más de cantidad de AR en comparación con la línea celular original. Como se describe en la presente, las líneas celulares resistentes expresan una proteína de AR mutante.
Como se describe en la presente, el método comprende poner en contacto una línea celular de cáncer de próstata (es decir, una línea celular original) con un antagonista de AR y cultivar las células durante un período de tiempo predeterminado. Como se describe en la presente, el método comprende cultivar las células a concentraciones crecientes del antagonista de AR durante un período de tiempo predeterminado. Como se describe en la presente, la concentración del antagonista de AR varía de aproximadamente 0,1 jM a aproximadamente 100 |jM como, por ejemplo, de 1 jM a aproximadamente 10 jM. Como se describe en la presente, las células se cultivan a 0,8 jM, 1,5 jM, 3 jM y 6 jM del antagonista de AR. Como se describe en la presente, la concentración del antagonista de AR aumenta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces. Como se describe en la presente, la concentración del antagonista de AR aumenta 3 veces. Como se describe en la presente, las células se cultivan en presencia del antagonista de AR 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses o más. Como se describe en la presente, las células se dividen y se vuelven a colocar en placas cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, cada semana o más tiempo. Como se describe en la presente, los medios de cultivo que contienen el antagonista de AR se renuevan todos los días, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, cada semana o más tiempo. Como se describe en la presente, el antagonista de AR es un antagonista de segunda generación. Como se describe en la presente, el antagonista de AR es ARN-509. Como se describe en la presente, el antagonista de AR es enzalutamida (MDV3100).
Como se describe en la presente, la línea celular de cáncer de próstata es una línea celular de adenocarcinoma de próstata humana. Como se describe en la presente, la línea celular de cáncer de próstata es una línea celular LNCaP. Como se describe en la presente, la línea celular de cáncer de próstata sobreexpresa el receptor de andrógenos. Como se describe en la presente, la línea celular de cáncer de próstata es LNCaP/AR(cs) o LNCaP/AR(cs) -Luc.
E JE M P L O S
Estos ejemplos se proporcionan con propósitos ilustrativos solamente y no para limitar el alcance de las reivindicaciones proporcionadas en la presente.
E je m p lo 1: G e n e ra c ió n d e lín ea c e lu la r re s is te n te a fá rm a c o s in vivo
Las líneas celulares resistentes al tratamiento con el compuesto anti-AR ARN-509 se generaron in vivo en ratones con tumores de xenoinjerto de adenocarcinoma de próstata humano (resistentes a la castración LNCaP/AR(cs)). La línea celular LNCaP/AR(cs) sobreexpresa el receptor de andrógenos (AR) 3-5 veces sobre la línea celular LNCaP original que imita el cáncer de próstata resistente a la castración (Chen et al. (2004) Nature Medicine 10:33-39).
Se cultivaron tumores de xenoinjerto LNCaP-AR(cs) en ratones no consanguíneos sin pelo SCID macho castrados de seis semanas de edad (SHO, Charles Rivers Laboratories). Se inyectaron subcutáneamente 1 x 106 células LNCaP-ARcs en RPMI libre de suero al 50% y Matrigel™ al 50% (100 pl/animal) en el costado derecho de 10 ratones 3-5 días después de la castración. El tamaño del tumor se monitorizó diariamente. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de ~200mm3 (aproximadamente 60 días después de la inyección), los animales comenzaron el tratamiento con vehículo solo (n=1) o 30 mg/kg de ARN-509 (n=9) mediante un régimen de dosificación QD (es decir, por vía oral en 15% de vitamina E-TPGS y 65% de una solución de carboximetilcelulosa (CMC) al 0,5% p/v en tampón de citrato 20 mM (pH 4,0)). Inicialmente, el tratamiento con ARN-509 indujo la regresión tumoral. Después de aproximadamente 75 días de dosificación, un único tumor reanudó el crecimiento y progresó a un tamaño mayor que al inicio del tratamiento. Una vez que el tumor resistente alcanzó ~800 mm3, se sacrificó el ratón y se recogió el tumor. Las células tumorales se dispersaron manualmente por homogeneización con una jeringuilla de 3 ml. Las células tumorales se cultivaron en RPMl más FBS al 10% y ARN-509 10 pM. Mediante este método se generó una línea celular resistente.
E je m p lo 2: G e n e ra c ió n d e lín ea s c e lu la re s re s is te n te s a fá rm a c o s in vitro
Se generaron in vitro líneas celulares resistentes al tratamiento con los compuestos anti-AR ARN-509 y MDV3100 usando líneas celulares de adenocarcinoma de próstata humano LNCaP.
Se mantuvieron LNCaP (ATCC), LNCaP/AR(cs) (Guo et al. (2006) Cancer Cell 0:309-19) y LNCaP/AR-Luc (Tran et al. Science (2009) 324 (5928):787-90; Ellwood-Yen et al. (2006) Cancer Res. 66:10513-6) en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las células LNCaP (ATCC), LNCaP/AR(cs) o LNCaP/AR(cs)-Luc se cultivaron a concentraciones crecientes de ARN-509 o MDV3100 durante un curso de 6 meses. Inicialmente, se sembraron 50 ml de células en un matraz de cultivo celular de 225 cm2 a una concentración de aproximadamente 80.000 células/ml y se cultivaron en RPMI más FBS al 10% en presencia de 800 nM de ARN-509 o MDV3100. El medio y el fármaco se cambiaron cada dos semanas y las células se pasaron a matraces de cultivo celular de 75 cm2 según fuese necesario. La concentración de cada compuesto se incrementó varias veces desde aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 6 pM a medida que la tasa de crecimiento de las células tratadas con fármaco aumentó a la de las células de control no tratadas. Después de aproximadamente 6 meses de selección de fármacos, las células se mantuvieron en RPMI más FBS al 10% y Ar N-509 o MDV3100 6 pM. Después de la selección, se obtuvieron 10 líneas celulares independientes resistentes a ARN-509 y MDV3100. Dos líneas se derivaron de células LNCaP (ATCC) seleccionadas en presencia de ARN-509. Cuatro líneas celulares se derivaron de células LNCaP/AR(cs), dos después del tratamiento con ARN-509 y dos después del tratamiento con MDV3100. Las células LNCaP/AR(cs)-Luc se usaron para obtener 4 líneas celulares resistentes, dos del tratamiento con ARN-509 y dos del tratamiento con MDV3100.
E je m p lo 3: E n sa yo s d e p ro life rac ió n p ara p ro b a r la re s is te n c ia a los fá rm a c o s
Se realizaron ensayos de proliferación celular para evaluar la resistencia de las líneas celulares al tratamiento con ARN-509 y MDV3100.
Se realizaron ensayos de proliferación en todas las líneas celulares resistentes a ARN-509 y MDV3100 sembrando 16 pl/pocillo de células a una densidad de 50,000 células por ml en RPMI 1640 libre de rojo fenol (con CSS al 5%) en una placa de cultivo celular de 384 pocillos (Placas de 384 pocillos tratadas con TC de poliestireno negro de fondo plano transparente (Corning)) y se incubaron durante 2 días a 37° C. Para los ensayos de agonistas, se hicieron diluciones semi-log de 11 puntos de cada compuesto en medio de cultivo y a las células se añadieron 16 |j| de cada dilución. ARN-509, MDV3100 y bicalutamida se ejecutaron a una concentración final que varió de 3,16 X 10-5 M a 3,18 X 10-10 M, mientras que el andrógeno sintético metiltrienolona (R1881) se ejecutó a un intervalo de concentración final de 3,16 X 10-8 M a 3,18 X 10-13 M. Para el ensayo en modo antagonista, los compuestos se diluyeron en medio de cultivo que también contenía R1881 200 pM (PerkinElmer, Waltham, MA) (final [R1881]=100 pM) y luego se añadieron a las células (16 jl). Después de 7 días, se añadieron 16 j l del Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) directamente a los cultivos celulares y se midieron las unidades de luminiscencia relativa (RLU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En el ensayo en modo agonista, el porcentaje de viabilidad de las muestras se calculó como: % de viabilidad=100 X ([muestra RLU-medio RLU sin células]/[células tratadas con RLU 1881-medio RLU sin células]) (Tabla 1A). En el ensayo en modo antagonista, el porcentaje de viabilidad de las muestras se calculó como: % de viabilidad=100X ([muestra de RLU-RLU Día 0]/[células tratadas con RLU R1881-RLU Día 0]) (Tabla 1B).
Tabla 1A. Ensayo de proliferación de agonistas (% de viabilidad)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP 100.0
LNCaP/AR(cs) 100.0
Clase 1 100.0 + +
Clase 2 100.0 + +
'+'= <30. '++'= >30
[R1881] = 0.1 nM, [Antagonistas] = 10|uM
Tabla 1B. Ensayo de proliferación de antagonistas (% de viabilidad)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP 100.0
LNCaP/AR(cs) 100.0
Clase 1 100.0 + +
Clase 2 100.0 + + +
'+'= <30. '++'= >30
[R1881] = 0.1 nM, [Antagonistas] = 10|uM
En los ensayos de proliferación, tanto ARN-509 como la enzalutamida fueron antagonistas proliferativos completos en las tres líneas celulares originales LNCaP (Tabla 1A, Figura 1A). Las líneas celulares resistentes se segregaron en dos clases distintas. A diferencia de sus líneas celulares originales, la primera clase de células resistentes a ARN-509 y MDV3100 (Clase 1) prolifera en ausencia de andrógenos añadidos. El crecimiento independiente de ligando de las células no se altera en presencia de ARN-509, MDV3100 o bicalutamida. El andrógeno sintético, R1881, inhibe la proliferación en las células de clase 1 a altas concentraciones. Esta actividad inhibidora del crecimiento de R1881 es antagonizada o por MDV3100 o por ARN-509, lo que indica que AR todavía es capaz de unirse a MDV3100 y ARN-509 en estas líneas celulares.
Las líneas celulares resistentes de clase 1 incluyeron la línea celular derivada del tumor de xenoinjerto de LNCaP-AR(cs), las 2 líneas celulares derivadas de la célula LNCaP/AR(cs) se seleccionaron en presencia de ARN-509, las 2 líneas celulares derivadas de Células LNCaP/AR(cs) se seleccionaron en presencia de MDV3100, las 2 líneas celulares derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc se seleccionaron en presencia de ARN-509, y una de las líneas celulares derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc se seleccionó en presencia de MDV3100.
La segunda clase de líneas celulares resistentes a MDV3100 y ARN-509 (Clase 2) sigue siendo dependiente de andrógenos para el crecimiento, similar a sus líneas celulares originales. Sin embargo, a diferencia de su actividad en las líneas celulares originales, ARN-509 y MDV3100 pueden estimular la proliferación en las líneas celulares de clase 2. La bicalutamida, sin embargo, no estimuló la proliferación en las líneas celulares de clase 2. Las líneas celulares resistentes de clase 2 incluyeron las dos líneas celulares derivadas de células LNCaP seleccionadas en presencia de ARN-509 (LNCaP ARN-509r1 y LNCaP ARN-509r2) y una de las líneas celulares derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc seleccionada en presencia de MDV3100 (LNCaP ENZr2).
La actividad agonista parcial fue independiente del compuesto utilizado para la selección; el ARN-509 y la enzalutamida mostraron actividad agonista parcial en las tres líneas celulares independientemente del compuesto usado para derivar las variantes de resistencia. De acuerdo con la actividad proliferativa, el ARN-509 o la enzalutamida solo antagonizaron parcialmente el crecimiento dependiente de andrógenos de estas líneas resistentes (Tabla 1B,Figura 1B, C).
Ejemplo 4: Ensayos de informador transcripcional para probar la resistencia a los fármacos
Se realizaron ensayos de informadores transcripcionales usando un elemento de respuesta ARE enlazado operativamente a un gen informador para probar la resistencia de las células al tratamiento con ARN-509, MDV3100 y bicalutamida.
Se realizaron ensayos de informadores transcripcionales en todas las líneas celulares resistentes sembrando 100 pl de células a una densidad de 250.000 células/ml en placas de cultivo celular de 96 pocillos en RPMI 1640 suplementado con suero despojado de carbón al 5% y se dejó unir durante la noche a 37° C.
Con la excepción de las células LNCaP/AR(cs)-Luc que contienen un informador sensible a andrógenos integrado, las células se transfectaron transitoriamente usando Lipofectin® (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para las células LNCaP y LNCaP/AR(cs), se realizaron transfecciones por triplicado usando 428 ng de vector informador (pGL4 Pb-Luciferasa (el promotor de probasina de rata en pGL4 (Promega, Madison, WI))), 50 ng de pRL-CMV (vector de normalización, Promega, Madison, WI) y 0,7 pl de Lipofectin®. Después de la transfección, las células se incubaron durante 4 horas.
Las células se trataron luego con los compuestos de prueba ARN-509, MDV3100 y bicalutamida. Para los ensayos de agonistas, los compuestos se diluyeron en serie y se añadieron a las células 50 pl de compuesto más RPMI 1640 más FBS despojado de carbón al 5%. Para los ensayos de antagonistas, los compuestos se diluyeron en serie y se añadieron a las células 50 pl de compuesto con RPMI más R1881 3 nM suplementado con suero despojado de carbón al 5%. Después de 48 horas de incubación, el medio se retiró y las células se lisaron en 40 pl de tampón de lisis (fosfato de Tris 25 mM, CDTA 2 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 0,5%, DTT 2 mM). La actividad de luciferasa de luciérnaga se midió inmediatamente después de la adición de 40 pl de tampón de luciferasa (tricina 20 mM, EDTA 0,1 mM, (MgCo3)4Mg(OH^SH2O 1,07 mM, MgSO42,67 mM, DTT 33,3 mM, coenzima A 270 pM, luciferina 470 pM, ATP 530 pM). La luciferasa de Renilla se midió después de la adición de 40 pl de tampón de coelenterazina l (1,1 M NaCl, 2,2 mM Na2EDTA, 0,22 MKxPO4 (pH 5,1), 0,44 mg/ml de BSA, NaN3 1,3 mM, coelenterazne 1,43 pM, pH final ajustado a 5.0).
Las dos clases de líneas celulares resistentes a ARN-509 y MDV3100 identificadas en los ensayos de proliferación también mostraron propiedades distintas en los ensayos de transcripción. En los ensayos de transfección transitoria usando los informadores de pGL4 Pb-Luciferasa o en los ensayos usando el informador integrado de probasina-luciferasa (es decir, células derivadas de LNCaP/AR(cs)-Luc), ARN-509 y MDV3100 fueron antagonistas eficaces en las células resistentes de clase 1 independientes de andrógenos como se evidencia por una disminución en la actividad de la luciferasa con respecto a ningún control de tratamiento (Tabla 2). Sin embargo, la bicalutamida mostró una actividad agonista aumentada en las células resistentes de clase 1 en comparación con las células originales. En las células resistentes de clase 2, MDV3100 fue un agonista parcial débil en el ensayo de informador de probasina-luciferasa, mientras que la bicalutamida y el ARN-509 no mostraron actividad agonista.
Tabla 2A. Ensayo de Informador Transcripcional de Agonistas (% de actividad
máxima)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP >90
LNCaP/AR(cs) >90
Clase 1 >90 +
Clase 2 >90 +
'+'= <5, '++' = >5
[R1881] = 10 nM, [Antagonistas] = 50 pM
Tabla 2B. Ensayo de Informador Transcripcional de Agonistas (% de actividad
máxima)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
LNCaP >90
LNCaP/AR(cs) >90
Clase 1 >90 + +
Clase 2 >90 +
'+'= <5, '++' = >5
[R1881] = 10 nM, [Antagonistas] = 50 pM
Ejemplo 5: Ensayos transcripcionales de genes endógenos
Se examinaron los efectos del tratamiento con R1881, MDV3100 y bicalutamida sobre la transcripción de genes endógenos.
Los ensayos de transcripción de genes endógenos se realizaron en todas las líneas resistentes colocando en placas 0,5 ml de células a una densidad de 500.000 células/ml en placas de 24 pocillos en RPMI que contenía FBS despojado de carbón (empobrecido en hormonas) al 5% y haciendo crecer las células durante 3 días a 37°C. Luego, las células se trataron durante 24 h con R1881 10 nM, MDV310030 pM o bicalutamida 30 pM.
El ARN total se aisló usando el kit de aislamiento de ARN total Aurum™ (BIO-RAD, Hercules, CA). El ARN (1 pg) se transcribió inversamente usando el kit de síntesis de ADNc iScript (BIO-RAD, Hercules, CA) para producir ADNc. La PCR en tiempo real se realizó usando el instrumento Applied Biosystems 7900HT y Mezcla maestra de PCR verde SYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de PCR se realizaron en 6 pl de acuerdo con el protocolo del fabricante y un protocolo de termociclos de 95° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95° C durante 15 segundos y 58° C durante 1 minuto. La expresión de genes sensible a los andrógenos (PSA, SLUG, TMPRSS2, STEAP4, FKBP5, ORM1, NOV, FASN, NKX3.1, AMIGO2, BDNF, CAMK2N1, HPGD, NCAPD3, PLD1) se normalizó a la expresión de GAPDH y se expresó en relación al tratamiento del vehículo de la línea celular original. Los resultados de la expresión relativa se proporcionan en la Tabla 3A.
Se observaron actividades agonistas selectivas de compuestos y clases similares en genes endógenos sensibles a los andrógenos, pero en el contexto de los genes endógenos, la actividad transcripcional de MDV3100 es más evidente (Tabla 3). En las células resistentes de clase 1, la bicalutamida muestra una actividad transcripcional robusta y el MDV3100 es un agonista transcripcional débil. Por el contrario, en las líneas celulares resistentes de clase 2, la bicalutamida es un agonista transcripcional débil, mientras que el MDV3100 muestra una actividad agonista transcripcional robusta en los genes probados.
Tabla 3A. Actividad transcri cional de enes endó enos Veces sobre vehículo
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
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En un experimento separado, se analizó la expresión génica de los siguientes genes en células LNCaP, LNCaP/AR(cs), LNCaP/AR-Luc, LNCaP ARN-509r1, LNCaP ARN-509r2 y LNCaP/AR-Luc ENZr2: PLD, CAM2KN, NOV, BDNF, AMIGO2, FASN, TMPRSS2, NKX3.1, PSA, FKBP5, HPGD, NCAPD3, SLUG, STEAP4 y ORM. Las células se cultivaron durante 3 días en medio empobrecido en hormonas seguido de tratamiento con vehículo, R1881 1 nM o compuesto 30 pM. La expresión génica se normalizó a GAPDH como se ha descrito anteriormente. Los resultados se presentan en las Tablas 4A y 4B.
Tabla 4A. NCap. LNCaP/AR(cs) y transcripción de líneas resistentes
LNCaP LNCaP/AR cs LNíCaP ARN-509rl
Figure imgf000048_0005
1.2 104.6
NCAPD3 1.00 1.16 0 9 1.00 0.91 1.22 93.05 1.00 1.29 3.12 90.51 NKX3.1 1.00 0.90 1.6
6 30.06 1.00 1.13 2.51 8.82 1.00 6.54 11.55 8.11 NOV 1.00 1.73 2.5
7 0.15 1.00 1.04 1.27 0.04 1.00 1.40 1.39 0.03 ORM1 1.00 0.71 1.1 873.1 1.00 0.84 3.58 3444.3 1.00 15.8 205.0 1296.1
3 0 1 9 7 3 PLD1 1.00 1.09 0.7
0 0.02 1.00 1.04 0.65 0.02
Figure imgf000048_0002
1.00 0.33 0.24 0.03 PSA 1.00 0.66 1.6
9 47.84 1.00 1.43 2.69 19.16 1.00 32.6
7 57.68 85.63 SLUG
Figure imgf000048_0001
1.00 1.27 2.3 129.7
5 9 1.00 1.03 2.06 89.88 1.00 4.66 42.52 164.28
1314.2 1184.4 STEAP4 1
1.00 0.78 1.5 639.
1.00 0.90 1.954 5 3 1.00 3.03 32.22
5 TMPRSS 1.6 10.2
2
Figure imgf000048_0003
1.00 0.77 22.16 1.00 1.06 2.36 17.51 1.00 0 23.75 37.27
Vehí­
Gen ARN EN R188 Vehí­ ARN
culo Z 1 culo ENZ R1881
-509 -509
AM IG02 1.00 1.12 1.2
0 0.68 1.00 0.67 0.63 0.55
BDNF 1.00 1.09 0.8
5 0.40 1.00 1.04 0.77 0.47
CAM2K
N I 1.00 1.17 1.3
9 0.13 1.00 0.46 0.38 0.02
FASN 1.00 1.34 1.2
4 5.58 1.00 0.98 0.93 4.82
FKBP5 1.00 0.99 1.0
4 54.95 1.00 8.00 3.41 48.50
HPGD
Figure imgf000048_0004
1.00 1.48 1.7 100.4
8 3 1.00 1.49 4.56 59.30
NCAPD3 1.00 1.16 1.2 104.6 1.00 1.13 1.35 54.95
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Tabla 4B. Transcri ción de LNCaP/AR-Luc LNCaP/AR-Luc ENZr2
Figure imgf000049_0001
Ejemplo 6: Ensayos de mecanismos de resistencia.
La matriz CGH, el perfil de expresión de ARNm y el análisis de secuencia de tumores de cáncer de próstata derivados de pacientes, así como muchos modelos animales e in vitro, han implicado múltiples vías en la progresión al estado resistente a la castración. Tres de las vías activadas más comúnmente identificadas en el cáncer de próstata resistente a la castración son las vías PI3K, Raf y AR. En este ejemplo, se evaluó la fosforilación de Akt y Erk mediante transferencia Western para evaluar los estados de activación de las vías PI3K y Raf, respectivamente.
Para evaluar el modo de resistencia a los fármacos en las líneas celulares de clase 1 y clase 2, se realizó un análisis Western para evaluar los niveles de proteína de AR y el estado de activación de varias vías de señalización celular que se sabe que modulan la actividad de AR y que se activan comúnmente en el cáncer de próstata resistente a la castración. Se determinó la expresión relativa de AR, Akt, Akt fosforilado (Ser473), p44/42 MAPK (Erk1/2), p44/42 MAPK (Erk1/2) fosforilado (Thr202/Tyr204), tubulina y actina.
Para el análisis Western, las células se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero despojado de carbón al 5% durante 3 días. Las células se lisaron en tampón de radioinmunoprecipitación modificado (mRIPA; Tris 10 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1% (v/v), NP-40, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, EDTA 5 mM, pH 7,4) que contenía un coctel inhibidor de proteasa y fosfatasa Halt™ (Thermo Scientific). La proteína total de los lisados clarificados se cuantificó por ensayo Lowry (ensayo de proteína de Biorad DC). A los lisados se añadieron tampón de muestra NuPAGE® lDs y agente reductor de muestra y se calentaron a 70° C durante 10 minutos. Se separaron 20 |jg de proteína celular total en un gel de acrilamida NuPAGE 4-12% Bis Tris y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando un módulo de transferencia Xcell II™ (Invitrogen). Las membranas se incubaron en tampón de bloqueo (LI-COR, Lincoln, NE) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubaciones de 60 minutos con anticuerpos primarios contra el receptor de andrógenos (Santa Cruz Biotechnology N° de cat. SC-816), Akt y Fosfo-Akt (Ser473) (Cell Signaling N° de cat. 9272 y 4058 respectivamente), p44/42 mAp K (Erk1/2) y Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling N° de cat.. 4695 y 4376s respectivamente) y tubulina o actina (Sigma N° de cat. T6199 y A4700 respectivamente). Después de la incubación con una IgG anti ratón o conejo de cabra conjugada IRDye® (LI-COR), las bandas de proteínas se cuantificaron usando un Sistema de obtención de imágenes infrarrojas Odyssey®.
Por transferencia Western, los niveles de AR en las líneas celulares resistentes de clase 1 fueron aproximadamente de 2 a 4 veces más altos que los observados en la línea celular de LNCaP/AR(cs) (Figura 2). Análogo a un aumento aproximado de 3 veces en los niveles de AR que es suficiente para soportar el crecimiento de células LNCaP en un entorno de castración in vivo, la elevación adicional de 2 a 4 veces en los niveles de AR puede ser suficiente para promover la proliferación en ausencia de andrógenos in vitro. Por el contrario, los niveles de AR de las líneas resistentes de clase 2 fueron similares a los observados en las líneas celulares originales. Por tanto, la conversión de enzalutamida y ARN-509 en agonistas parciales en las líneas celulares de clase 2 no se debió a la sobreexpresión de AR. Se observaron diferencias menores en Akt y Erk totales y fosforilados sin cambios consistentes observados en ninguna clase de las líneas celulares resistentes.
Ejemplo 7: Determinación de la secuencia de AR mutante
MDV3100 y ARN-509 son agonistas transcripcionales y proliferativos en las líneas celulares resistentes de clase 2, mientras que la bicalutamida sigue siendo un antagonista. La expresión de AR en células resistentes de clase 2 fue similar a la línea celular original (Ejemplo 6). Por tanto, se determinó la secuencia de AR en células resistentes de clase 2 para verificar si una mutación del dominio de unión al ligando de AR promueve la ganancia de actividad de la función.
El ADNc generado por la transcripción inversa de ARN aislado de células de clase 1 y clase 2 (ver el Ejemplo 5) se usó como plantilla para secuenciar AR. Usando una serie de oligonucleótidos, se generaron los segmentos superpuestos que abarcan el dominio de unión al ligando de AR (c.2013-2757) mediante PCR usando la polimerasa Phusion® (New England Biolabs) usando el protocolo del fabricante. Los productos de PCR se purificaron en gel para eliminar bandas no específicas, así como oligonucleótidos no incorporados. Los productos de PCR purificados se secuenciaron usando oligonucleótidos internos.
Se identificó una única mutación de ácidos nucleicos dentro del dominio de unión al ligando de AR en la posición de nucleótido 2626 en tres líneas celulares derivadas independientemente. La mutación con cambio de sentido identificada en todas las líneas fue Timina (T) a Citosina (C) que convierte la Fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 876 del polipéptido codificado a Leucina (L) (SEQ ID NO: 19). Adicionalmente, la secuenciación de productos de PCR subclonados individuales de la línea celular LNCaP/AR-Luc ENZr2 indicó que en todas las líneas celulares la mutación F876L surgió en el alelo de AR endógeno.
F876 se encuentra en la hélice 11 en una región del bolsillo de unión al ligando de AR que es un punto de acceso para mutaciones de AR de CRPC (Figura ID). Sin embargo, a diferencia de T877 y L701, que coordinan la unión de hidrógeno al grupo 17a-OH de dihidrotestosterona, F876 contribuye a un pequeño núcleo hidrófobo formado por residuos en la hélice 11 (F786, L880), el giro entre las hélices 11 y 12 (F891) y la hélice 3 (F697, L701). Aunque se conservan residuos similares e interacciones de ligandos hidrófobas en el receptor de estrógenos y progesterona, F876 no se ha implicado en la unión de alta afinidad o la selectividad de esteroides. Consistente con el papel relativamente menor que se predice que F876 desempeñará en la unión de esteroides, la mutación AR-F876L no se ha informado en el cáncer de próstata o poblaciones insensibles a los andrógenos.
Ejemplo 8: Expresión del AR mutante en células con deficiencia de AR
Para confirmar que la mutación F876L confiere actividades agonistas a ARN-509 y MDV3100, la mutación de punto se generó en el contexto de AR de tipo salvaje de longitud completa y el receptor mutante LNCaP T877A.
Los mutantes F876L y F876L/T877A se generaron en el plásmido pcDNA3-AR usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se realizaron ensayos de informadores transcripcionales usando un elemento de respuesta ARE enlazado operativamente a un gen informador para probar la actividad transcripcional del AR mutante en respuesta al tratamiento con ARN-509, MDV3100 y bicalutamida.
Los ensayos de informadores transcripcionales se realizaron sembrando 100 pl de células HEPG2 a una densidad de 250.000 células/ml en placas de cultivo celular de 96 pocillos en MEM suplementado con suero despojado de carbón al 10% y dejando unir durante la noche a 37° C.
Las células se transfectaron transitoriamente usando Lipofectin® (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizaron transfecciones por triplicado usando 378 ng de vector informador (4X ARE-Luciferasa o pGL4 Pb-Luciferasa (el promotor de probasina de rata en pGL4 (Promega, Madison, WI)), 50 ng pcDNA-AR (tipo salvaje o mutante) 50 ng de pRL -CMV (vector de normalización) y 0,7 pl de Lipofectin®. Después de la transfección, las células se incubaron durante 4 horas.
Después de la incubación, las células se trataron con los compuestos de prueba ARN-509, MDV3100 y bicalutamida. Para los ensayos de agonistas, los compuestos se diluyeron 1:6 y se añadieron 50 pl de compuesto en MEM más FBS despojado de carbón al 5% a las células para un intervalo de concentración final de 30 pM a 0,64 nM. Para los ensayos de antagonistas, los compuestos se diluyeron en serie con R1881 1 nM (para Ar de tipo salvaje) o R1881 5 nM (para AR de F876L).
Después de 48 horas de incubación, el medio se retiró y las células se lisaron en 40 pl de tampón de lisis (fosfato de Tris 25 mM, CDTA 2 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 0,5%, DTT 2 mM). La actividad de luciferasa de luciérnaga se midió inmediatamente después de la adición de 40 pl de tampón de luciferasa (tricina 20 mM, EDTA 0,1 mM, (MgCo3)4Mg(OH)2^5H2O 1,07 mM, MgSO42,67 mM, DTT 33,3 mM, Coenzima A 270 pM, luciferina 470 pM, ATP 530 pM). La luciferasa de Renilla se midió después de la adición de 40 pl de tampón de coelenterazina (NaCl 1,1 M, Na2EDTA 2,2 mM, MKPO40,22 M (pH 5,1), 0,44 mg/ml de BSA, NaN 1,3 mM, coelenterazina 1,43 pM, pH final ajustado a 5.0).
En los ensayos de transfección transitoria, los antagonistas de AR de segunda generación ARN-509 y MDV3100 indujeron la actividad transcripcional dependiente de AR en el contexto del AR mutante F876L o F876L/T877A, mientras que la inducción de bicalutamida fue mínima (Tabla 5). Por ejemplo, en células HepG2 usando un indicador 4XARE-luciferasa o Pb-luciferasa, ARN-509 y MDV3100, pero no bicalutamida, indujeron actividad transcripcional dependiente de AR en el contexto del AR mutante F876L o F876L/T877A. Esto indica que el mecanismo de resistencia en las líneas celulares de clase 2 es la mutación de AR F876L.
Tabla 5. Actividad transcripcional de AR (Veces de DMSO)
R1881 Bicalutamida MDV3100 ARN-509
AR WT ++
AR F876L ++ + +
'+'= <20, '++'= 10-200, ++ >200
[R1881] = 100 nM, [Antagonistas] = 6,3 pM
Se realizó un segundo experimento de informador de 4X-ARE-Lucifereasa para confirmar los resultados anteriores. En este experimento, también se compararon los anti-andrógenos de primera generación nilutamida e hidroxiflutamida junto con bicalutamida, ARN-509 y enzalutamida. Los ensayos de informadores transcripcionales de AR se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente con modificaciones menores. Se realizaron transfecciones por triplicado usando 50 ng de mutante pCDNA3-AR o pCDNA3-AR, 65 ng de 4X ARE-Luciferasa, 20 ng de pRL (Promega) y 25 ng de pCMX. Para los ensayos de agonistas, los compuestos se diluyeron en serie y se añadieron a las células 50 pl de compuesto más RPMI 1640 suplementado con suero despojado de carbón. Para los ensayos de antagonistas, los compuestos se diluyeron en serie, y se añadieron a las células 50 pl de compuesto con RPMI suplementado con suero despojado de carbón más metiltrienolona (R1881). La concentración de R1881 final usada en los ensayos de antagonistas fue de 1 mM con la excepción de F876L para el que se usó R1881 5 nM.
Como se muestra en la Figura 4, en el contexto de AR del tipo salvaje, ARN-509 y enzalutamida fueron antagonistas completos y con actividad agonista mínima en ensayos de informadores transcripcionales sensibles a andrógenos 4X-ARE. Sin embargo, en las células que expresan AR-F876L o AR F876L/T877A, la enzalutamida y el ARN-509 fueron agonistas transcripcionales parciales (Figura 4A) Por el contrario, los anti-andrógenos de primera generación bicalutamida, nilutamida e hidroxiflutamida mostraron una actividad agonista mínima sobre el mutante F876L (Tabla 6, Figura 4) (Emax=porcentaje máximo de respuesta R1881). Enzalutamida y ARN-509 fueron antagonistas completos de los mutantes de Ar T877A, L701H, H874Y y W741C que o confieren resistencia a los antagonistas de AR de primera generación o amplían las especificidades de los ligandos esteroideos en pacientes con CRPC.
Tabla 6.
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Para probar la competencia de unión al ADN de los mutantes F876L, se generaron constructos de fusión VP16-AR. El pVP16-AR se generó subclonando AR humano de longitud completa en pVP16 (Clontech). Las mutaciones de punto de AR se generaron en VP16-AR usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Los ensayos de transcripción se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente. Se realizaron transfecciones por triplicado usando 35 ng de pVP16-AR o pVP16-F876L, 70 ng de 4X ARE-Luciferasa, 20 ng de pRL (Promega) y 35 ng de pCMX. La actividad del informador 4X ARE-Luciferasa se monitorizó en presencia de concentraciones crecientes de compuestos en ausencia o en presencia de 90 pM de R1881 (para VP16-AR de tipo salvaje) o 1 nM R1881 (para VP16-AR de F876L). La actividad de luciferasa se midió como se ha descrito anteriormente.
En reflejo del ensayo de informadores transcripcionales, en el ensayo de VP16-AR de tipo salvaje, que monitoriza la competencia de unión al ADN del receptor, la enzalutamida y el ARN-509 fueron antagonistas completos (Tabla 7, Figura 4) (Emax=porcentaje máximo de respuesta a R1881). Sin embargo, en el contexto de VP16-AR-F876L, el ARN-509 y la enzalutamida estimularon la unión al ADN de AR. Por tanto, la mutación de AR F876 a L fue suficiente para convertir los antiandrógenos de 2a generación, enzalutamida y ARN-509, en agonistas parciales.
Tabla 7.
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Ejemplo 9: Generación de línea celular estable
En este ejemplo, se generaron líneas celulares con expresión estable del mutante F876L de AR. Se generaron primero los retrovirus pSRaF876L, pQCXIN-AR y pQCXIN-F876L co-transfectando células GP2-293 con pVSV-G (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células PC3 que expresan establemente el tipo salvaje o AR-F876L se generaron mediante transducción de células PC3 con retrovirus pQXIN-AR o pQXlN-F876L y selección en medio RPMI 1640 que contiene 500 pg/ml de gentamicina.
Las células LNCaP que expresaban AR-F876L de manera estable se generaron o transfectando células LNCaP con pCDNA-F876L o transduciendo células LNCaP con retrovirus SRaF876L. Los clones individuales de LNCaP/pCDNA-F876L se aislaron después de la selección en 400 pg/ml de gentamicina. Se seleccionaron grupos de células LNCaP/SRaF876L de 400 mg/ml de gentamicina.
La expresión de la proteína de AR de todas las líneas celulares se validó mediante análisis western usando el anticuerpo N-20 de AR (Santa Cruz Biotechnology).
Ejemplo 10: ensayos de unión a AR de equilibrio
Los ensayos de unión competitiva de AR de tipo salvaje frente a AR F876L se realizaron como se describe en Clegg et al. (2012) Cancer Research 72:1494-503 usando células PC3 que expresan establemente AR de tipo salvaje o AR-F876L como se ha descrito anteriormente. Ki se calculó como Ki = IC50/(1 ([3H-R1881]/Kd)), [3H-R1881] = 0.6 nM.
En los ensayos de unión de AR en equilibrio, el ARN-509 y la enzalutamida se unieron al mutante con una afinidad 30 y 48 veces más alta, respectivamente (Tabla 8, Figura 5) (Kd para R1881: AR = 0.5 nM; AR-F877L = 0.64 nM). Por tanto, la actividad agonista aumentada en AR está asociada con una afinidad de unión aumentada al receptor de tipo salvaje y al receptor F876L, lo que sugiere que la confirmación del agonista permite una afinidad más alta a través de una constante de disociación disminuida.
Tabla 8.
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Ejemplo 11: Expresión de genes objetivo de AR y proliferación de líneas celulares estables de cáncer de próstata F876L
Como se muestra anteriormente, la expresión de AR-F876L fue suficiente para conferir resistencia a enzalutamida y ARN-509 en ensayos basados en informadores transitorios. En este ejemplo, se examinaron los efectos de F876L sobre genes objetivo de AR endógenos y la proliferación en células de cáncer de próstata que expresan de manera estable el mutante. Se diseñaron dos líneas celulares de LNCaP (LNCaP/SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L) como se describe en el Ejemplo 9 para sobreexpresar AR-F876L a niveles comparables al modelo de LNCaP/AR(cs).
Para medir los niveles de AR en las células, se generaron extractos de proteínas a partir de células LNCaP, LNCap/AR(cs), LNCaP/SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L cultivadas en medio empobrecido en hormonas durante 3 días. Los niveles de proteína de AR se analizaron mediante transferencia Western. Los niveles de AR se cuantificaron y normalizaron a actina y se expresaron en relación con la expresión de AR en células LNCaP (Fig. 6) Para el análisis de genes objetivo endógenos, se cultivaron células LNCaP/AR(cs), LNCaP SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L durante 3 días en medio empobrecido en hormonas seguido de tratamiento con vehículo, R1881 1 nM o 1, 3, 10 y 30 pM de ARN-509 o enzalutamida en presencia o ausencia de R1881 1 nM.
Para los ensayos de proliferación, se cultivaron células LNCaP/AR(cs), LNCaP SRaF876L y LNCaP/pCDNAF876L en presencia de medio empobrecido en hormonas durante 2 días seguido de tratamiento con ligando durante 7 días como se ha descrito anteriormente. Para los ensayos de antagonistas, se añadieron ARN-509 o enzalutamida en presencia de R1881 200 pM (concentración final de 100 pM). La proliferación se cuantificó mediante el ensayo de viabilidad basado en luminiscencia CellTiter-Glo como se ha descrito anteriormente.
En las células LNCaP/AR(cs), el ARN-509 y la enzalutamida tuvieron poco efecto sobre la inducción de genes objetivo de AR o actividad proliferativa (Figura 7A, Tabla 9A). Ambos antagonistas bloquearon la transcripción y la proliferación inducidas por R1881 a niveles consistentes con su actividad agonista a la concentración más alta (Figura 7B, Tabla 9B). Por el contrario, en las células que expresan F876L-AR, tanto la enzalutamida como el ARN-509 demostraron una actividad agonista proliferativa y transcripcional robusta (Figs. 7Ay 7B, Tablas 9C-F).
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Ejemplo 12: Interacción de la expresión de N y C de genes objetivo de AR y proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata estables F876L
La interacción del amino-extremo terminal de AR con el carboxi-extremo terminal de AR es importante para la capacidad de transactivación de AR completa. Muchos agonistas de AR completos y parciales estimulan la interacción N-C dependiente de AF2. Se realizó un ensayo de interacción de dos híbridos N-C para evaluar la interacción de los extremos terminales N- y C- de AR en el mutante F87L en presencia de ARN-509 y enzalutamida.
Se generaron pM-AR1-660, pVP16-AR507-919 y pVP16-F876L507-919 subclonando productos de PCR apropiados de pCDNA3-AR y pCDNA3-F876L en pM y pVP16 (Clontech). Para los ensayos de interacción terminal N-C, se realizaron transfecciones por triplicado usando 50 ng de pM-AR1-660, 75 ng de pVP16-AR507-919 o pVP16-F876L507-919, 25 ng de pMH100-Luc y 10 ng de pRL (Promega). Las células transfectadas se incubaron 4 horas y luego se trataron con ligando. ARN-509 y enzalutamida se analizaron a 8 pM y R1881 a InM.
Consistente con sus actividades transcripcionales, la enzalutamida y ARN-509 promovieron la interacción N-C de AR-F876L pero no de AR del tipo salvaje (Figura 8) Por tanto, la actividad agonista de ARN-509 y enzalutamida en AF-F876L se asocia con una conformación de AF-2 similar a un agonista.
Ejemplo 13: Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina de AR
La activación transcripcional de genes objetivo de AR regulados por andrógenos requiere la unión al ADN inducida por agonistas y el posterior reclutamiento de correguladores transcripcionales. Para confirmar los resultados del informador VP16-AR que indican que ARN-509 y la enzalutamida estimulan la unión al ADN de AR-F876L, realizamos un análisis de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de 6 genes objetivo de AR de células tratadas con R1881 y/o se realizó con cada antagonista.
Los ensayos de ChIP se realizaron como se describe en Joseph et al. (2009) PNAS USA 106:12178-83]. Brevemente, se colocaron en placas células LNCaP/AR(cs) y LNCaP SRaF876L en placas de 150 mm (7 x 106 células en 20 ml) en RPMI 1640 suplementado con CSS al 10% durante 3 días. Las células se trataron con antagonista 10 pM en presencia o ausencia de R1881 1 nM durante 4 horas. Después del tratamiento con ligandos, se añadió formaldehído a los medios a una concentración final del 1%, se incubó durante 10 minutos y se inactivó con glicina (concentración final de 125 mM) durante 5 minutos. Las células se lavaron 3 veces con PBS que contenía coctel inhibidor de un único uso de proteasa y fosfatasa 1X Halt™ (1X PI, Thermo Scientific), se sedimentaron, se lisaron en 1 ml de tampón RIPA (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 0,15 M, NP-40 al 1%, desoxicolato de Na al 0,5%, SDS al 0,05%, EDTA 1 mM, IX PI) y se sonicaron hasta que el fragmento de tamaño de ADN medio fue de “ 500 pb. La cromatina reticulada sonicada se diluyó en 3,3 ml de RIPA y se prefiltró con 100 ml de lechada de proteína A/G agarosa al 50% (SC-2003, Santa Cruz Biotechnology) que contenía 200 mg por ml de ADN de esperma de salmón sonicado y 500 mg por ml de BSA. Luego se inmunoprecipitó un ml de cromatina pre-limpiada con 15 pg de anti-AR (SC-816, Santa Cruz Biotechnology) o IgG de conejo normal (SC-2027, Santa Cruz Biotechnology), durante 2 horas a 4° C y se añadieron 100 ml de una lechada al 50% de perlas de proteína A/G agarosa y se incubaron durante la noche a 4°C. Las perlas se lavaron 2 veces secuencialmente en tampón bajo en sal (HEPES 50 mM pH 7,8, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato de Na al 0,1%, SDS al 0,1%), tampón alto en sal (igual como que bajo en sal con NaCl 500 mM), tampón LiCl (Tris 20 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, LiCl 250 mM, NP-40 al 0,5%, desoxicolato de Na al 0,5%) y tampón TE (Tris 50 mM pH 8.0, EDTA 1 mM). Todos los pasos de lavado se realizaron en presencia de 1X Pi. Los complejos de proteína-ADN se eluyeron en 225 ml de tampón de elución (Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, SDS al 1%) a 65° C dos veces durante 15 minutos. Los complejos de proteína-ADN eluidos se reticularon inversamente en presencia de NaCl durante la noche a 65° C y se trataron adicionalmente con EDTA y proteinasa K a 42° C durante 1 hora. Los fragmentos de ADN se purificaron en Tris 10 mM pH 8,5 usando el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen), se diluyeron y analizaron por PCR en tiempo real usando iTaq SYBR Green Supermix con ROX (Bio-Rad). Las muestras se amplificaron en el instrumento ABI 7900HT. Las secuencias de cebadores de oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 8.
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En las células LNCaP/AR(cs), R1881 promovió el ADN de AR (Fig. 9) Consistente con los datos del informador VP16-AR, tanto ARN-509 como enzalutamida promovieron las células LNCaP/SRaF876L de unión al ADN de AR. En presencia de R1881, todos los antagonistas inhibieron la unión del ADN de AR estimulado por R1881 a niveles consistentes con su actividad agonista o antagonista parcial en ambas líneas celulares (Figura complementaria S9).
E je m p lo 14: E fec to s in vivo d e A R F 876L
Para determinar si la alteración de F876L transmite resistencia a enzalutamida y ARN-509 in vivo, se inyectaron (s.c.) líneas celulares de LNCaP que expresaban AR de forma estable en ratones inmunodeficientes castrados y tumores establecidos.
Todos los estudios con animales se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales y se siguieron las directrices institucionales para el uso apropiado y humano de los animales en la investigación. Los experimentos de xenoinjerto in vivo se llevaron a cabo en ratones macho no consanguíneos sin pelo SCID (SHO) (Charles River Laboratories). Los ratones fueron orquiectomizados bajo anestesia isoflorane y se les dio 7-10 días para recuperarse. Las células NCaP/AR(cs) o LNCaP/SRaF876L (como se ha descrito anteriormente) se suspendieron en 50% de RPMI, 50% de Matrigel (BD Biosciences), y se inyectaron 3 X 106 células/xenoinjerto en un volumen de 100 pl. Se observó a los animales semanalmente hasta que el crecimiento tumoral fue evidente. Después de 40-60 días después de la inyección, los animales se aleatorizaron en cohortes de media de carga tumoral equivalente (150-250 mm3) y rango. Todos los compuestos se administraron diariamente mediante alimentación forzada oral a una dosis de 30 mg/kg/día de compuesto. Para todos los estudios de xenoinjerto de LNCaP/AR(cs), se prepararon existencias de fármacos de ARN-509 y enzalutamida en PEG-400 al 18%, Tween-80 al 1% y povidona al 1%, y se formularon para la dosificación en Vitamina E-TPGS al 15% y 6 % de una solución de CMC al 0,5% p/v en tampón de citrato 20 mM (pH 4,0). Se evaluó la farmacocinética de a RN-509 y enzalutamida al final del estudio como se ha descrito anteriormente (Clegg et al. (2012) Cancer Research 72:1494-503).
Consistente con los datos in vitro, ni ARN-509 ni la enzalutamida a 30 mg/kg/día afectaron el crecimiento de los tumores LNCaP/AR/SRaF876L (Figura 10) Esta falta de actividad no fue una función de la exposición inesperadamente baja a los compuestos, ya que los niveles de fármaco en plasma del día 28 se cuantificaron y fueron consistentes con estudios anteriores de xenoinjerto de LNCaP/AR (Tabla 9). Además, en un experimento paralelo, ARN-509 a 30 mg/kg/día mostró una actividad antitumoral robusta en el modelo de LNCaP/AR(cs), consistente con los resultados anteriores (Figura 10).
T l . F rm in i x n in r LN P R F 7 L
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Ejemplo 15: Estudio de etiqueta abierta, seguridad de fase 1/2, farmacocinética y prueba de concepto de ARN-509 en pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración avanzado progresivo (CRPC)
En este estudio, se aisló ADN de 29 muestras de plasma de pacientes que participaron en un tratamiento con ARN-509 del estudio clínico de fase 1/2 para el cáncer de próstata. Estos se analizaron usando el método de BEAMing Technology basado en PCR en emulsión (Dressman et al. (2003) PNAS USA100:8817-22). El BEAMing se ha usado con éxito para detectar una variedad de mutaciones derivadas de tumores en oncogenes impulsores como PIKC3a y K-ras en ADNtc derivado de plasma humano (Diehl et al. (2008) Nature Medicine 14:985-90). La mutación AR F876L se identificó en 3 de las 29 muestras de pacientes analizadas.
El estudio clínico realizado fue multiinstitucional, primero en hombres, fase 1/2, estudio de aumento de dosis y prueba de concepto a lo largo de 9 niveles de dosis en el que los pacientes elegibles con CRPC avanzado progresivo recibieron dosis orales de ARN-509 en una base de paciente externo para determinar la seguridad, farmacocinética (PK) y evidencia preliminar de los efectos antitumorales de ARN-509.
Los pacientes con mCRPC fueron asignados secuencialmente a niveles de dosis en cohortes de 3 a 6 pacientes por nivel de dosis usando criterios de aumento de dosis 3x3 estándar.
El objetivo fue determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y/o la dosis recomendada de Fase 2 (RP2D) de ARN-509 que lleva a una toxicidad limitante de la dosis (DLT) en un máximo del 30% de los pacientes. Una DLT se define generalmente como cualquier convulsión de Grado 1 o superior, cualquier toxicidad no hematológica de Grado 3-4 (las toxicidades gastrointestinales deben persistir en Grado 3-4 a pesar de la terapia médica máxima) y/o toxicidad hematológica de grado 4 de más de 5 días de duración, definido por CTCAE V4.0, y que se evalúa como relacionado con el tratamiento con ARN-509. Un esquema del diseño del estudio se proporciona en la Fig. 11.
Los pacientes elegibles que firmaron los documentos de consentimiento informado se inscribieron inicialmente en una cohorte de aumento de la dosis en la que recibirían una dosis oral única de ARN-509 seguida de un período de observación de una semana (Semana PK). La dosificación continua comenzó en el Ciclo 1 Día 1, suponiendo que no se observaron toxicidades inaceptables.
Se monitorizó un mínimo de 3 sujetos en cada nivel de dosis para detectar una DLT hasta el día 28 del Ciclo 1. Si no se observaron DLT en los primeros 3 pacientes a cada nivel de dosis, la inscripción posterior procedió al siguiente nivel de dosis. Si 2 o más pacientes experimentaron una DLT a un nivel de dosis determinado o si se observó un episodio único de convulsiones de cualquier grado a un nivel de dosis determinado, se interrumpió el aumento de la dosis y la MTD se definió como el nivel de dosis anterior. Si no se observaron DLT, RP2D se basó en el perfil farmacocinético y de seguridad general de ARN-509 y se determinó la dosis biológica óptima a partir de datos preclínicos, y no necesariamente la MTD.
La dosis inicial fue de 30 mg/día, con incrementos de 60 mg, 90 mg, 120 mg, 180 mg, 240 mg, 300 mg, 390 mg y 480 mg al día. Se anticipó que estos niveles de dosis abarcan el intervalo de dosis farmacológicamente activo previsto y se encuentran dentro del margen de seguridad indicado por los resultados de la toxicología preclínica.
Después de la selección de 240 mg como RP2D, se incluyeron pacientes elegibles adicionales en la parte de la Fase 2 del estudio, que consiste de 3 cohortes de expansión concurrentes en MTD y/o RP2D para recopilar información de seguridad adicional y proporcionar una señal inicial de actividad antitumoral Las tres cohortes de expansión incluyeron:
1. Tratamiento de CRPC no metastásico sin tratamiento previo (50 pacientes con CRPC no metastásico que no recibieron tratamiento con quimioterapia ni con abiraterona);
2. Tratamiento con CRPC metastásico sin tratamiento previo (20 pacientes con mCRPC que no recibieron quimioterapia ni abiraterona); y
3. CRPC metastásico tratado con abiraterona (10-20 pacientes).
Se esperaba que cada paciente con mCRPC recibiera por lo menos 3 ciclos (12 semanas) de tratamiento continuo y cada paciente con CRPC no metastásico recibiera por lo menos 4 ciclos (16 semanas) de tratamiento continuo. El tratamiento se interrumpió en cualquier momento por progresión de la enfermedad definida por el protocolo o toxicidad inaceptable. Las evaluaciones tumorales se realizaron cada 3 ciclos (12 semanas) para pacientes con mCRPC y cada 4 ciclos (16 semanas) para pacientes con CRPC no metastásico. La seguridad se evaluó desde la primera dosis hasta por lo menos cuatro semanas después de la última dosis o hasta la resolución de la toxicidad relacionada con el fármaco, o cuando la toxicidad se consideró irreversible, lo que sea más largo. El efecto de los alimentos sobre la absorción de ARN-509 y el efecto de ARN-509 sobre la repolarización ventricular se evaluó en la fase de expansión de la Fase 2 en sitios clínicos seleccionados.
El análisis de las muestras usando la tecnología BEAMing en el estudio clínico de ARN-509 actual se llevó a cabo por Inostics GMBH. Se recogió sangre en tubos evacuados K2-EDTA y se mezcló concienzudamente invirtiendo lentamente varias veces. En el plazo de 30 minutos desde la recogida, los tubos se centrifugaron a 2000 x g durante 15 minutos. El plasma se decantó, se transfirió a tubos de almacenamiento criogénico. En el plazo de 90 minutos desde la decantación, el plasma se almacenó a -70° C o menos hasta el análisis. El ADN se purificó de alícuotas de plasma de 300-500 pl y se extrajo como se describe en Diehl et al. (2008) Nature medicine 14:985-90. La detección de mutaciones se realizó de acuerdo con la tecnología BEAMing como se describe en Diehl et al. Brevemente, en el paso inicial de PCR, la región objetivo (~100 pb) se amplificó usando cebadores específicos de genes con secuencias de marcadores y se sometió a una emulsión de PCR que contenía perlas magnéticas recubiertas con cebador. Después de la emulsión, se realizó la discriminación por PCR de perlas del tipo salvaje y mutantes mediante hibridación específica de alelos seguido de citometría de flujo. Los resultados de la citometría de flujo se analizaron usando FCS Express (De Novo Software, Los Ángeles, CA), lo que resultó en la cuantificación de la proporción de alelo mutante sobre los alelos de tipo salvaje.
Las muestras se analizaron para detectar la presencia de AR del tipo salvaje o 3 alelos mutantes de un solo punto que podrían dar como resultado F876L (t2988c, c2990a y c2990g (o t2626c, c2628a y c2928g, respectivamente, en relación a la secuencia que codifica el ácido nucleico de AR expuesta en la SEQ iD NO: 18). Las mutaciones analizadas y la sensibilidad técnica del método BEAMing se muestran en la Tabla 10. Para la detección, la frecuencia debe estar por encima de la cantidad total de genoma equivalente usado por ensayo. Por ejemplo, si está en una muestra, hay 1.000 equivalentes genómicos, pero la fracción calculada de las moléculas de ADN mutante es del 0,02% (1 alelo mutante en 5.000 alelos de tipo salvaje), las muestras se califican como de tipo salvaje.
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Resultados
Un subconjunto de pacientes en todos los grupos de dosis mostró una respuesta de PSA con 14/30 pacientes que mostraron una disminución de 12 semanas de >50% en el PSA en comparación con el valor de referencia. La respuesta de PSA para los 29 pacientes seleccionados se muestra en la Fig. 12. Se analizaron las muestras de plasma pretratamiento y durante el tratamiento. El tiempo de análisis de BEAMing se indica mediante el extremo terminal de la línea de respuesta de PSA. Dieciocho de los 29 pacientes tenían PSA por encima del valor de referencia en el momento del análisis, lo que indica resistencia intrínseca o adquirida a ARN-509.
Se diseñaron tres sondas para monitorizar los 3 cambios de nucleótidos que pueden codificar la sustitución de aminoácidos F876L. Los experimentos de mezcla de dilución con la secuencia mutante y el ADN de tipo salvaje indicaron una sensibilidad técnica del 0,02% (potencial para detectar 1 secuencia mutante entre 5000 del tipo salvaje). En una selección inicial de muestras de plasma de 29 pacientes tratados con ARN-509, se detectó evidencia de la mutación en 3 pacientes (Tablas 11 y 12). En el momento del análisis BEAMing, los pacientes 7 y 10 tenían niveles de PSA por encima del valor de referencia, mientras que el paciente 13 tenía evidencia de aumento de PSA por encima del nadir del tratamiento (Fig. 13) En los 3 pacientes, se detectó el cambio de nucleótidos c2628a. En uno de estos 3 pacientes (paciente 10) también se detectó el mutante t2626c, indicativo de una enfermedad policlonal. Las mutaciones que codifican F876L no se detectaron en ninguna de las muestras de pretratamiento (0/29) lo que sugiere que si estaban presentes antes del tratamiento con ARN-509 estaban por debajo del límite de detección o que las mutaciones surgieron de novo durante el tratamiento con ARN-509. En cualquier escenario, los datos apoyan la hipótesis de que el crecimiento selectivo de las lesiones que llevan el alelo mutante a niveles suficientes para detectarlas en el ADNc depende de la exposición crónica al ARN-509 y se asocia con un aumento del PSA. Para establecer aún más la asociación de F876L con enfermedad progresiva, analizamos muestras de plasma tomadas en puntos temporales adicionales de los 3 pacientes con puntuación positiva durante la selección inicial (Tabla 12). En el paciente 10, la mutación no se detectó en el otro punto temporal analizado (Ciclo 4; PSA 102% de t 0). En el paciente 13, la mutación no se detectó en el ciclo 4 (PSA 16,2% del valor de referencia) o en el ciclo 12 (el paciente obtuvo una puntuación positiva en el ciclo 11). La secuencia mutante en el ciclo 11 estaba en el límite de detección y se estima que surge a través de la amplificación de una molécula mutante individual. Aunque el PSA del paciente 13 estaba aumentando lentamente desde el nadir del tratamiento en los ciclos 11 y 12, en ambos puntos temporales el PSA todavía estaba >60% por debajo del inicio del estudio, y por tanto aún no había surgido una resistencia franca. La identificación de la secuencia mutante en el límite de detección probablemente refleja la presencia de un clon mutante relativamente raro que tiene el potencial de expandirse bajo presión selectiva continuada y eventualmente impulsar la enfermedad progresiva.
Dada la relativamente larga duración del tratamiento del paciente 7, se analizó el plasma de puntos temporales adicionales durante la reducción evidente de PSA; (> 90% de disminución desde el valor de referencia; Ciclo 4, 8 y 10) y en el aumento inicial de PSA desde su punto nadir (Ciclo 15 y 19) (Fig. 13). Curiosamente, no se detectaron mutaciones en las 3 muestras del ciclo de tratamiento 4, 8 y 10, mientras que la mutación c2628a se detectó en las 2 muestras analizadas a partir del aumento inicial de PSA (Ciclo 15 y 19). Estos datos clínicos son consistentes con los datos preclínicos que indican que el cambio de aminoácido F876L es suficiente para transmitir resistencia a ARN-509.
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continuación
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continuación
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Ejemplo 16: Método para la generación de líneas celulares para la selección de fármacos
Para identificar compuestos que retienen la actividad antagonista de AR en el contexto de la mutación F876L del receptor de andrógenos, se adaptan una serie de ensayos in vitro e in vivo como se ha descrito anteriormente.
En un entorno in vitro, se usan ensayos de transcripción de transfección transitoria similares a los descritos en el Ejemplo 8 para identificar compuestos que carecen de actividad agonista y antagonizan completamente la actividad transcripcional de AR tanto de tipo salvaje como de mutante F876L. Para esta selección se emplean células HEPG2 o cualquier célula eucariota en la que se pueda monitorizar la actividad transcripcional de AR.
Como alternativa a la transfección transitoria, se integran establemente el informador transcripcional y el AR F876L en varias líneas celulares y se usan para seleccionar compuestos. La integración estable del AR mutante F876L en una línea celular de cáncer de próstata sensible a los andrógenos como LNCaP, LaPC4 o VCaP mediante el uso de plásmidos (es decir, pCDNA3.1) o la integración viral permite la selección y evaluación de compuestos en entornos transcripcionales, de proliferación y de xenoinjerto. Brevemente, el AR F876L se clona en un vector de expresión retroviral como pQCXIP (Clontech, Mountain View, CA). El plásmido resultante se usa luego para generar existencias virales de alto título para su uso en la generación de líneas celulares transducidas establemente de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las líneas celulares resultantes se usan en ensayos transcripcionales de transfección transitoria como se describe en el Ejemplo 4, ensayos transcripcionales de genes endógenos como se describe en el Ejemplo 5, ensayos de proliferación como se describe en el Ejemplo 3 o estudios de xenoinjerto como se describe en el Ejemplo 1.
Alternativamente, las células se modifican adicionalmente mediante la integración estable de un informador sensible a AR como Cignal Lenti AR Reporter (Qiagen, Valencia, CA) que permite la selección de compuestos en base a informador sin la necesidad de transfección transitoria.

Claims (56)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si un sujeto es o se volverá menos sensible a la terapia con un antagonista del receptor de andrógenos (AR) de primera o segunda generación, que comprende:
(a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y
(b) caracterizar al sujeto como resistente o como que se volverá resistente a la terapia con un antagonista de AR de primera o segunda generación si el sujeto tiene la modificación.
2. El método de la reivindicación 1, en donde al sujeto se le ha administrado un antagonista de AR de primera o segunda generación para el tratamiento de un cáncer, opcionalmente en donde el cáncer es cáncer de próstata.
3. Un método para seleccionar a un sujeto para terapia con un antagonista de AR de tercera generación, que comprende:
(a) analizar una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto para determinar si el polipéptido de AR codificado está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1; y
(b) caracterizar al sujeto como candidato para la terapia con un antagonista de AR de tercera generación si el sujeto tiene la modificación.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la modificación comprende una sustitución o una deleción del aminoácido en la posición de aminoácido 876 en el polipéptido de AR.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la modificación es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR, opcionalmente en el que la modificación es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR, opcionalmente en el que la modificación es una sustitución de fenilalanina por leucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la modificación comprende una deleción de ácido nucleico que codifica la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el ácido nucleico que codifica el polipéptido de AR modificado tiene (i) una mutación de timina (t) a citosina (c) en una posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácido nucleico 2626 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18; (ii) una mutación de citosina (c) a adenina (a) en la posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácido nucleico 2628 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18; o (ii) una mutación de citosina (c) a guanina (g) en la posición de ácidos nucleicos correspondiente a la posición de ácido nucleico 2628 en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico codifica leucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la molécula de ácido nucleico es ARN o ADN, opcionalmente en donde el ADN es ADN genómico.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el método comprende además aislar ARNm de la muestra de ARN.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que analizar comprende amplificar el ácido nucleico que codifica la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR, opcionalmente en donde la amplificación es por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), opcionalmente en donde la amplificación por PCR comprende usar un par de cebadores de oligonucleótidos que flanquean la región que codifica la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el método comprende secuenciar el ácido nucleico amplificado.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que analizar comprende poner en contacto el ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico específica de secuencia, en donde la sonda de ácido nucleico específica de secuencia:
(a) se une al ácido nucleico que codifica un receptor modificado que está modificado en la posición de aminoácido 876; y
(b) no se une al ácido nucleico que codifica el receptor de tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición de aminoácido 876.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la muestra es de una muestra de células tumorales del sujeto.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la muestra es de una muestra de biopsia tumoral, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de linfa, o un aspirado de médula ósea.
16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que la muestra contiene células tumorales circulantes (CTC) o células tumorales diseminadas (DTC).
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el antagonista de AR de primera o segunda generación inhibe un polipéptido de AR del tipo salvaje por antagonismo competitivo, opcionalmente en donde el antagonista de AR de segunda generación se selecciona entre ARN-509, enzalutamida (MDV3100) y RD162.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que el sujeto tiene una enfermedad o trastorno seleccionado entre cáncer, un trastorno inflamatorio o un trastorno proliferativo, opcionalmente en el que el sujeto tiene cáncer, opcionalmente en donde el cáncer es un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de vejiga, o un cáncer hepatocelular, opcionalmente en donde el cáncer es cáncer de próstata, opcionalmente en donde el sujeto tiene un cáncer de próstata resistente a la castración.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el sujeto tiene un tumor sólido.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el sujeto se trata con el antagonista de AR de primera o segunda generación antes de obtener la muestra, opcionalmente en donde la muestra es una muestra obtenida a las 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 14 meses, 16 meses, 18 meses, 20 meses, 22 meses, o 24 meses después de la primera administración con el antagonista de AR de primera o segunda generación, opcionalmente en donde la muestra se obtiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces durante el transcurso de tratamiento con el antagonista de AR de primera o segunda generación.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el sujeto responde al tratamiento con el antagonista de AR de primera o segunda generación cuando se administra por primera vez.
22. Un método para seleccionar compuestos que antagonizan con un AR modificado, que comprende:
(a) expresar un AR modificado en una célula, en donde el AR modificado se modifica en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1;
(b) poner en contacto la célula con un compuesto de prueba; y
(c) detectar el nivel de actividad de AR en la célula, en donde una disminución de la actividad indica que el compuesto antagoniza con el receptor de AR modificado.
23. El método de la reivindicación 22, en el que el compuesto de prueba muestra actividad antagonista completa hacia el receptor de AR modificado.
24. El método de la reivindicación 22 o 23, en el que el compuesto de prueba no muestra actividad agonista hacia el receptor de AR modificado.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en el que la modificación es una sustitución o deleción del aminoácido en la posición 876 del polipéptido de AR.
26. El método de la reivindicación 23, en el que la modificación es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina, metionina, serina, treonina, cisteína, triptófano, lisina, arginina, histidina, prolina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR, opcionalmente en donde la modificación es una sustitución de fenilalanina por un aminoácido seleccionado entre glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR, opcionalmente en donde la modificación es una sustitución de fenilalanina por leucina en la posición de aminoácido 876 del polipéptido de AR.
27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-26, en el que la célula es deficiente para la expresión de AR del tipo salvaje, expresa un nivel bajo de AR del tipo salvaje, o expresa un receptor de AR modificado.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-27, en el que la célula se selecciona entre HeLa, CV1, COS7, HepG2, HEK-293, DU145, PC3, TSY-PR1, LNCaP, CWR, VCaP y LAPC4.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-28, en el que la célula comprende un gen informador enlazado operativamente a un promotor sensible a los andrógenos, opcionalmente en el que la actividad se determina analizando la expresión del gen informador.
30. El método de la reivindicación 29, en el que el promotor comprende un elemento de respuesta a andrógenos, opcionalmente en donde el elemento de respuesta a andrógenos es 4xARE o un elemento de probasina.
31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-30, en el que el promotor es una probasina, un antígeno específico de la próstata, MMTV LTR, FASN, STEAP4, TMPRSS2, ORM1 o promotor NKX3.1.
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22-31, en el que el gen informador codifica una proteína seleccionada entre una luciferasa, una proteína fluorescente, una proteína bioluminiscente o una enzima.
33. Un polipéptido de AR aislado o una variante del mismo que tiene actividad de AR que comprende una modificación en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde la modificación confiere resistencia a un antagonista de AR en el polipéptido de AR modificado o variante.
34. El polipéptido de AR aislado de la reivindicación 33, en el que la modificación comprende la sustitución del aminoácido en la posición 876 en comparación con un AR del tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1, opcionalmente en el que la sustitución es F876L.
35. El polipéptido de AR aislado de la reivindicación 34 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.
36. El polipéptido de AR aislado de la reivindicación 33, en el que la modificación comprende una deleción de la posición de aminoácido 876.
37. El polipéptido de AR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 33-36, en el que el polipéptido comprende una sustitución del aminoácido en la posición 876 en comparación con un AR de tipo salvaje expuesto en la SEQ ID NO: 1 y una o más sustituciones de aminoácidos adicionales, opcionalmente en donde la sustitución en el aminoácido en la posición 876 es F876L.
38. El polipéptido de AR aislado de la reivindicación 37, en el que la una o más sustituciones de aminoácidos adicionales se seleccionan entre una o más sustituciones de aminoácidos asociadas con cáncer de próstata resistente a la castración, opcionalmente en donde la una o más sustituciones de aminoácidos adicionales se seleccionan entre T877A, W741C, W741L, W741R, L701H y H874Y.
39. El polipéptido de AR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 33-38, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o una variante que tiene por lo menos o por lo menos aproximadamente 6un 0%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el polipéptido que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5, en donde el aminoácido en la posición 876 no es fenilalanina.
40. El polipéptido de AR aislado de cualquiera de las reivindicaciones 33-39 que es una proteína recombinante.
41. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de AR modificado de cualquiera de las reivindicaciones 33-40.
42. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 41, en el que el ácido nucleico es una molécula de ADN o ARN.
43. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 41, en el que el ácido nucleico es una molécula de ADNc.
44. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 41 o la reivindicación 42, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 19 o una variante que tiene por lo menos o por lo menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde el codón de ácido nucleico que codifica el aminoácido en la posición 876 no codifica fenilalanina, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico codifica leucina en la posición 876 del polipéptido de AR.
45. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 41-44, opcionalmente en donde el vector es un vector viral o plasmídico.
46. El vector de la reivindicación 45, en el que el ácido nucleico está enlazado operativamente a un promotor, opcionalmente en el que el promotor es un promotor constitutivo o inducible.
47. Una célula huésped, que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 45-46.
48. La célula huésped de la reivindicación 47, en donde la célula es una célula procariota o una célula eucariota, opcionalmente en donde la célula es una célula de mamífero, una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula de anfibio.
49. Un polipéptido de AR mutante expresado por la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 47-48.
50. Un microchip que comprende el polipéptido de AR modificado de cualquiera de las reivindicaciones 33-40 o el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 41-44.
51. El microchip de la reivindicación 50, en el que el polipéptido de AR modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es F876L o el ácido nucleico codifica un polipéptido de AR modificado que tiene una sustitución de aminoácidos que es F876L.
52. Un kit que comprende uno o más reactivos para la detección de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de AR modificado que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876 o un polipéptido de AR modificado que comprende una modificación en la posición de aminoácido 876, opcionalmente en donde el polipéptido de AR modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es F876L, que comprende además un cebador de oligonucleótidos que
(a) se une al ácido nucleico que codifica un AR modificado que está modificado en la posición de aminoácido 876; y
(b) no se une al ácido nucleico que codifica el AR del tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición de aminoácido 876.
53. El kit de la reivindicación 52, que comprende un microchip que comprende
(a) un polipéptido de AR modificado que tiene una modificación que es F876S, o una porción del mismo que comprende una modificación que es F876S; o
(b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante que tiene una modificación que es F876S, o una porción del mismo que comprende una modificación que es F876S.
54. Un sistema para detectar un AR modificado que es resistente a la inhibición con un antagonista de AR de primera o segunda generación en un sujeto, que comprende:
(a) una muestra que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR del sujeto; y (b) (i) una micromatriz que comprende ácido nucleico que codifica un polipéptido de AR mutante o una porción del mismo que está modificado en una posición de aminoácidos correspondiente a la posición de aminoácido 876 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, opcionalmente en donde la micromatriz está contenida en un microchip, o
(b) (ii) una sonda de ácido nucleico específica de secuencia, en donde la sonda de ácido nucleico específica de secuencia:
(i) se une al ácido nucleico que codifica un AR modificado que está modificado en la posición de aminoácido 876; y
(ii) no se une al ácido nucleico que codifica el AR de tipo salvaje que tiene fenilalanina en la posición de aminoácido 876, o
(b) (iii) un par de cebadores de oligonucleótidos que flanquean la región de ácidos nucleicos que codifica el aminoácido 876 de un polipéptido de AR.
55. Un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido de AR modificado de cualquiera de las reivindicaciones 33-40, en donde el anticuerpo no se une o se une con menor afinidad a un polipéptido de AR del tipo salvaje que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.
56. El anticuerpo de la reivindicación 55, en el que el polipéptido de AR modificado comprende una sustitución de aminoácidos que es F876L.
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