CN102994642A

CN102994642A - 环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测方法

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Publication number: CN102994642A
Application number: CN201210557013XA
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: SHANGHAI DIDAO TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI DIDAO TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-03-27

Abstract

一种分子生物技术领域的用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，包括引物、探针及其试剂盒，该试剂盒由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组、iPLEX试剂组构成。PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液、HotstarTaq酶、纯水和如SEQIDNo.1~4所示的上游引物和如SEQIDNo.5~8所示的下游引物；SAP酶试剂组含有：SAP缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQIDNo.9~12所示的单碱基延伸引物。利用该试剂盒将肿瘤患者的DNA提取并处理后，可利用飞行质谱方法，检测引物扩增片段内的生物标记，并基于检测结果评价肿瘤患者对环磷酰胺药物的敏感度，本发明通过优化PCR引物、试剂浓度和PCR的条件，避免了非特异性扩增，针对被检测生物标记的特异性大大提高。结果准确，灵敏度高，方法快速简便并且有很高通量。

Description

环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物技术领域的检测方法包括引物、探针及其试剂盒，具体是一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，针对环磷酰胺药物使用者基因内4个生物标记的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

化疗，即用化学合成药物治疗疾病的方法，目前，化疗仍然是对抗癌症的主要武器，肿瘤化学治疗的药物品种有几十种，而且不断有新的更有效的化疗药物面世，相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低；在临床中，发现常规的化学治疗会对一部分患者无效，其结果自然是很多患者不得不承受化疗副作用的折磨和承担高额的医疗费用，因此，对于每个肿瘤患者的个性化治疗就显得非常重要，个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。

近年来国内外肿瘤和化疗药物研究领域相继创建了一系列体内或体外预测肿瘤化疗药物敏感性的方法，常用的有裸鼠皮下移植药敏测定法、人体肿瘤细胞集落测定法、放射性标记代谢物前体掺入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速荧光分析等等，这些方法均存在一些缺点，要么费用昂贵且检测周期长，不适合常规使用；要么需要在体外培养原发肿瘤，检测成功率低，这些缺陷把肿瘤化疗药敏实验限制在了研究性的实验室里，很少有大规模使用的报道。

随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们对肿瘤药物的作用机理和作用过程有了更深刻的认识，有了这些知识，使得通过基因分析来对癌症患者进行个性化治疗成为可能，更为从分子水平研制和开发新一代的，针对药物敏感性进行检测的方法提供了理论基础和大量的实验数据；实验证明，个体基因水平上的差异，包括基因多态性、基因突变和表达差异等，与肿瘤患者对药物的敏感性密切相关，通过检测患者在这些基因上与药物敏感性相关的生物标记，可以预测患者对肿瘤化疗药物的敏感性，帮助进一步指导选择合理的化疗方案。

环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)，是一类应用最广泛的双功能烷化剂类抗癌药物，CTX 是一种前体药物，需在体内经肝微粒体CYPs羟化(主要由CYP2B6、CYP3A4/3A5和CYP2C9 催化)，生成4-OH-CTX后进入循环并分布至组织，在细胞内4-OH-CTX与醛磷酸胺共存并达到动态平衡；而醛酰胺不稳定，在肿瘤细胞内分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥对肿瘤细胞有细胞毒作用，环磷酰胺是双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰DNA及RNA功能，尤以对前者的影响更大，它与DNA发生交叉联结，抑制DNA合成，对S期作用最明显。

人体内代谢药物的主要酶是细胞色素P450超家族(Cytochrome P450 proteins, CYP)，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢；研究人员发现CYP基因上的几个SNP多态性位点与环磷酰胺药物敏感性密切相关，CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因编码的蛋白都属于细胞色素P450酶，它们与抗癌药物环磷酰胺的羟化等代谢过程相关，因此 CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6的基因变化导致个体对环磷酰胺药物的敏感性不同，通过设计试剂盒，检测CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因上的多个SNP生物标记，可以方便、快速的预测环磷酰胺药物对患者个体的疗效。

发明内容

本发明的目的是利用SNP标记检测方便快捷，准确率高的优点，采用Sequenom检测技术，提供一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，包括PCR引物、延伸引物和试剂盒。

本发明涉及一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，其中包括PCR扩增引物，含有SEQ ID No.1 ~4所示的上游引物和SEQ ID No.5~8所示的下游引物。

本发明涉及一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，其中包括单碱基延伸引物，含有SEQ ID No.9~12所示的单碱基延伸引物。

本发明设计一种试剂盒，由PCR扩增试剂组、SAP酶试剂组和iPLEX试剂组构成，其中PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如 SEQ ID No.1 ~4所示的上游引物和如SEQ ID No.5~8所示的下游引物；SAP酶试剂组含有：SAP缓冲液、SAP酶和纯水；iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ ID No.9~12所示的单碱基延伸引物。

上述标记组合优选利用飞行质谱（MALDI-TOF）方法进行检测，检测方法包括以下步骤（1）提取基因组DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮细胞DNA；（2）飞行质谱检测SNP多态；（3）根据SNP分型结果推断环磷酰胺药物敏感度。

本发明对CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6基因上的共4个SNP生物标记进行分型，建立了一个快速，简便，且成本低廉的检测试剂盒，该试剂盒准确度高，灵敏性好，具有很强的实用价值。

具体实施案例

以下施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；实施例1：采用飞行质谱方法对肿瘤患者进行SNP分型及环磷酰胺药物敏感度检测方法：

一）提取基因组DNA：本试验的样本是使用刮棒采集的口腔粘膜细胞，室温保存，刮棒采样DNA提取的具体步骤如下：

1）将口腔刮棒上的脱落细胞溶于400μL 1X 裂解液中，加入1μL蛋白酶K，56度水浴30分钟；

2）取出样品置冰水浴1分钟，加入6mol/L NaCl 150μL，剧烈振荡15-20秒，13000转离心10分钟；

3）吸取上清液至新的离心管中，加入1.1mL无水乙醇，上下颠倒10次至絮状DNA沉淀出现。室温放置10分钟，13000转离心2分钟沉淀DNA；

4）弃去上清液，再加入0.25mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，室温放置1分钟后，13000转离心5分钟；

5）用移液器小心吸取乙醇，然后放入通风橱中通风10分钟，然后用35μL TE溶解DNA；6）DNA可在4度保存1-2个月，或者存放在-20度长期保存；

7）使用18μL PCR Master Mix 反应液以及 2μL DNA模板，PCR扩增β-actin 片断，1.5%琼脂糖凝胶，120V电泳15分钟，观察结果合格后转移至PCR管中；

8）紫外分光光度计SMA3000测定溶液中DNA的浓度和A260/A280比值，测量3次取平均值，浓度应在30ng/μL，A260/A280比值应该在1.7-2.0之间，合格的DNA 4℃取用或-20℃保存；

二）飞行质谱检测SNP多态：采用本发明中所述试剂盒对样本中的SNP生物标记进行检测，下面为检测过程：

1）引物与DNA稀释以及质检：PCR引物稀释至终浓度为0.5μM；根据Sequenom的稀释公式，按照单碱基延伸引物的分子量将引物稀释至终浓度为7-14μM之间；

2）PCR扩增：在每个384孔PCR板中加入1μL DNA和4μL PCR扩增试剂，共5μL，按照PCR仪程序1进行扩增：

PCR程序1：94℃ 15min

94℃ 20sec

56℃ 30sec 45 cycles

72℃ 1min

72℃ 3min

4℃ ∞

PCR扩增结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4℃保存；

3）SAP酶处理：在PCR扩增后的产物加入2μL的SAP酶试剂，共7μL，按照PCR仪程序2进行扩增：

PCR程序2：37℃，40min 85℃，5min 4℃，∞

SAP酶处理结束，将384孔板取出短暂离心备用；

4）iPLEX延伸：在SAP酶处理后的产物加入2μL的iPLEX试剂，共9μL。按照PCR仪程序3进行扩增：

PCR程序3：94℃ 30sec

94℃ 5sec

52℃ 5sec 5 cycle 40 cycle

80℃ 5sec

72℃ 3min

4℃ ∞

iPLEX延伸结束，将384孔板取出短暂离心备用；

5）树脂纯化与数据收集：将反应产物（共9μL）加入25μL水进行稀释，使用树脂进行脱盐；将脱盐处理后的样品点在芯片靶点上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据；

三）根据SNP分型结果推断环磷酰胺药物敏感度

根据肿瘤患者样品DNA中4个SNP生物标记的分型结果，我们对患者环磷酰胺药物敏感度进行评价，如果样品DNA中含有对环磷酰胺药物耐药的基因型，我们将对患者进行风险提示。

参考文献

[1] Chang TK, Yu L, Goldstein JA, et al. Identification of the polymorphically expressed CYP2C19 and the wild-type CYP2C9-ILE359 allele as low-Km catalysts of cyclophosphamide and ifosfamide activation. Pharmacogenetics. 1997 Jun;7(3):211-21.

[2] Rodriguez-Antona C, Ingelman-Sundberg M. Cytochrome P450 pharmacogenetics and cancer. Oncogene. 2006 Mar 13;25(11):1679-91. Review.

[3] Takada K, Arefayene M, Desta Z , et al. Cytochrome P450 pharmacogenetics as a predictor of toxicity and clinical response to pulse cyclophosphamide in lupus nephritis. Arthritis Rheum. 2004 Jul;50(7):2202-10.

Claims

1.一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的PCR扩增引物，其特征在于，包含SEQ ID No.1 ~4所示的上游引物和SEQ ID No.5~8所示的下游引物。

2.一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的引物单碱基延伸引物，其特征在于，包含SEQ ID No.9~12所示的单碱基延伸引物。

3.一种用于环磷酰胺抗肿瘤药物敏感度检测的方法，其特征在于，由PCR扩增试剂组、SAP试剂组、iPLEX试剂组构成，包括：

1）PCR扩增试剂组含有：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、纯水和如 SEQ ID No.1 ~4所示的上游引物和如SEQ ID No.5~8所示的下游引物；

2）SAP酶试剂组含有：SAP缓冲液、SAP酶和纯水；

3）iPLEX试剂组含有：iPLEX缓冲液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、纯水和如SEQ ID No.9~12所示的单碱基延伸引物。

4.根据权利要求3所述的方法制造系列试剂盒包括：

1）根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，所述的PCR扩增缓冲液为10×缓冲液,含2mM MgCl₂；

2）根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的MgCl₂浓度为2mM；

3）根据权利要求3所述的方法制造试剂盒，其特征是，所述的dNTP混合液的浓度为500μM；

4）根据权利要求3所述的方法制造试剂盒，其特征是，所述的Hotstar Taq酶为0.5U；

5）根据权利要求3所述的方法制造试剂盒，其特征是，所述的SAP缓冲液为10X缓冲液；

6）根据权利要求3所述的方法制造试剂盒，其特征是，所述的SAP酶为1.7 U/μL的虾碱性磷酸酶；

7）根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的iPLEX缓冲液10×缓冲液；

8）根据权利要求3所述方法制造的试剂盒，其特征是，所述的ddNTP 混合液为经过质量修饰的核苷酸；

9）根据权利要求3所述的方法制造试剂盒，其特征是，所述的单碱基延伸酶为iPLEX聚合酶。