CN102888412A - 一种新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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CN102888412A CN2012103538708A CN201210353870A CN102888412A CN 102888412 A CN102888412 A CN 102888412A CN 2012103538708 A CN2012103538708 A CN 2012103538708A CN 201210353870 A CN201210353870 A CN 201210353870A CN 102888412 A CN102888412 A CN 102888412A
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Abstract

本发明提供一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒，用于不同动物新孢子虫虫感染速殖子、组织包囊和卵囊的检测，本发明还公开了上述nest-PCR检测试剂盒的制备方法，nest-PCR扩增新孢子虫基因某一特异分子片段，用于新孢子虫病的诊断；本发明涉及的新孢子虫和弓形抑制性杂交消减文库筛选到的新孢子虫特异基因SEQno.1为新孢子虫特有基因，因此用nest-PCR法扩增动物组织及粪便样品的SEQno.1基因部分片段可以用于新孢子虫的分子检测，可以用来诊断新孢子虫急性、慢性及隐性感染。

Description

一种新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明提供一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒，用于不同动物新孢子虫虫感染速殖子、组织包囊和卵囊的检测，本发明还公开了上述nest-PCR检测试剂盒的制备方法，属于分子生物学检测技术领域。 
背景技术
新孢子虫（Neospora caninum）作为一种顶复门寄生虫，经系统发育学分析核糖体DNA表明其与弓形虫，Hammondia heydorni在亲缘关系上比较近，在一般的实验检测方法主要以血清学方法为主，包括IFAT，ELISA，PCR等，由于不同于抗原在寄生虫不同阶段的表达和抗体的产生不同，因此ELISA和IFTA不能检测到寄生虫生活史的所有阶段感染，特别是在终宿主和有性增殖阶段。基因组DNA是十分稳定的，贯穿于寄生虫整个生活史，但是目前的新孢子虫PCR检测方法在低丰度样本中存在灵敏度低、特异性差的特点。因此找到新孢子虫特异基因并建立特异的分子生物学诊断方法对寄生虫诊断是有利的。Nest-PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。国内外对于新孢子虫病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还是空白，对该病的检测仍然采用ELISA、IFTA和PCR，远不能满足实际需要。因此，开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。 
发明内容
本发明的目的是公开一种新孢子虫特异nest-PCR（简称：PCR）检测试剂盒，用于检测新孢子虫感染不同动物形成的组织包囊及终宿主排出的卵囊。 
本发明还提供上述检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。 
本发明公开了新孢子虫特异基因序列，见SEQ no.1。 
本发明公开了新孢子虫特异nest-PCR引物，用于扩增新孢子虫基因。 
引物序列如下： 
第一轮PCR引物：
OF：5’- AAACCAGGAAAACAAATGA -3’
OR：5’- TTGACGGTGTCTGAAAATC-3’ ；
第二轮PCR引物：
IF：5'- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3'
IR：5'- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3 ；
本发明还公开一种新孢子虫nest-PCR检测试剂盒，用于诊断新孢子虫病，试剂盒内含：10×PCR反应液，权利要求1中的引物OF、OR和IF、IR用于nest-PCR特异扩增，含SEQ no.1基因的阳性对照作为检测的阳性指示和ddH2O。
 本发明新孢子虫病nest-PCR检测试剂盒的制备方法如下： 
1. 10×PCR反应液：300mM的dNTPs（购自日本TAKARA公司）20μl，Tris（购自美国Pragma公司）2.42mg，KCl（购自美国Sigma公司）7.45mg，MgCl2 （购自美国Sigma公司）0.258mg, 200 U 的Taq酶（购自日本TAKARA公司）20μl，加入150μl ddH2O，用HCl调pH至8.5，用ddH2O定容至200μl；
2. 阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将106个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μl。
3．试剂盒的组装：每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒（整个操作要求无菌环境）： 
10×PCR反应液:200μl，
10mM引物OF: 50μl；
10mM引物OR: 50μl；
10mM引物IF: 50μl；
10mM引物IF: 50μl；
阳性对照DNA: 100μl；
ddH2O: 2ml。
  本发明试剂盒的使用方法如下： 
1）、第一轮PCR扩增：
取待检样品提取基因组DNA后，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl（标本DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH2O补足20μl；阳性对照用量为1μl）：
10×PCR反应液：2μl；
根据提取DNA量决定标本DNA：
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：补足至20μl。
将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min； 
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。
本发明的积极效果在于：nest-PCR扩增新孢子虫基因某一特异分子片段，用于新孢子虫病的诊断；本发明涉及的新孢子虫和弓形抑制性杂交消减文库筛选到的新孢子虫特异基因SEQ no.1为新孢子虫特有基因，因此用nest-PCR法扩增动物组织及粪便样品的SEQ no.1 基因部分片段可以用于新孢子虫的分子检测，可以用来诊断新孢子虫急性、慢性及隐性感染。 
根据新孢子虫基因组设计特异扩增引物，并构建新孢子虫nest-PCR检测试剂盒，并拟应用于临床检测，可准确、快速母畜流产是否由新孢子虫侵染所致，本试剂盒也可用于新孢子虫的分子鉴定。本试剂盒为临床诊断及新孢子虫病流行预测预报提供依据，具有重大的社会意义和广阔的应用前景。具有先进性、特异性和高准确率，而且在测定时简便和易于操作的特点。 
附图说明
图1、本发明试剂盒对新孢子不同生活史阶段的新孢子虫扩增： 
图2、本发明试剂盒检测灵敏度；
图3、本发明试剂盒特异性。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。 
实施例1
本发明根据nest-PCR扩增原理，设计并合成了一组特异扩增新孢子虫基因的nest-PCR引物，并委托上海生物工程有限公司合成引物。引物合成后用灭菌蒸馏水制成100mM原液（储藏液），然后再用ddH2O稀释到10mM做为工作液。引物序列如下：
第一轮PCR引物：
OF：5’- AAACCAGGAAAACAAATGA -3’
OR：5’- TTGACGGTGTCTGAAAATC -3’
第二轮PCR引物：
IF：5'- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3'
IR：5'- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3
实施例2
试剂盒组装：
1）10×PCR反应液：300mM的dNTPs（购自日本TAKARA公司）20μl，Tris（购自美国Pragma公司）2.42mg，KCl（购自美国Sigma公司）7.45mg，MgCl2 （购自美国Sigma公司）0.258mg, 200 U 的Taq酶（购自日本TAKARA公司）20μl，加入150μl ddH2O，用HCl调pH至8.5，用ddH2O定容至200μl；
 2）阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将106个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μl。
 3）试剂盒的组装：每个试剂盒为检测100个样品： 
按下列内容组装试剂盒：
每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒（整个操作要求无菌环境）：
10×PCR反应液200μl，
10mM引物OF 50μl；
10mM引物OR 50μl；
10mM引物IF 50μl；
10mM引物IF 50μl；
阳性对照DNA 100μl；
ddH2O 2ml。
实施例3
本发明试剂盒的使用方法如下：
1）、第一轮PCR扩增：
取待检样品提取基因组DNA后，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl（标本DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH2O补足20μl；阳性对照用量为1μl）：
10×PCR反应液：2μl；
根据提取DNA量决定标本DNA：
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：补足至20μl。
将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min； 
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。
  
试验例1
制备的试剂盒对不同生活史阶段的新孢子虫扩增
1）、第一轮PCR扩增：
选取新孢子虫速殖子，新孢子虫感染鼠脑组织DNA及新孢子虫卵囊DNA，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下：
10×PCR反应液：2μl；
样品：          1μl
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：         15μl
将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果（见图1）：图中，M：DL2000 DNA Maker；1: Nc速殖子DNA；2：Nc感染鼠脑组织DNA；3：含Nc卵囊粪便基因组DNA；4:阴性对照。
试验例2 
制备的试剂盒灵敏度
5×105、5×104、5×103、5×102、5、5×10-1、5×10-2个新孢子虫DNA，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下：
10×PCR反应液：2μl；
样品：          1μl
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：         15μl
将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，最终确定nest-PCR试剂盒可检测到0.5个新孢子虫DNA（见附图2）：图中，DL2000 DNA Maker；1-8: 新孢子虫基因组DNA梯度从5×105-5×10-2个；9：阴性对照。
试验例3
试剂盒特异性
以新孢子虫速殖子，新孢子虫感染鼠脑组织DNA及新孢子虫卵囊DNA，弓形虫速殖子DNA， JS3-JS4鉴定的Hammondia heydorni卵囊DNA及犬囊等孢球虫DNA 6个样本DNA为模板，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下：
10×PCR反应液：2μl；
样品：          1μl
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：         15μl
把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，最终确定nest-PCR试剂盒为新孢子虫特异检测试剂盒（见附图3）；图中，DL2000 DNA Maker；1: Nc速殖子DNA 2：Nc感染鼠脑组织DNA；3：含Nc卵囊粪便基因组DNA；4：含Hammondia heydorni卵囊粪便基因组DNA；5：弓形虫基因组DNA；6：犬囊等孢球虫基因组DNA。
实施例5 
实际样品检测
采集沈阳地区犬粪样200份，试剂盒对样品进行检测。
1）   粪便样本处理 ： 称取0.5克粪样于灭菌后的1.5ml离心管，用美国QIAGEN公司QIAamp DNA Stool Mini Kit（货号：51504）提取粪便基因组DNA，按操作手册操作。 
3）样品扩增： 
以提取好的样本DNA为模板，用本试剂盒内试剂进行第一轮PCR扩增。PCR反应加样体系如下：
10×PCR反应液：2μl；
样品：          2μl
引物OF（10mM）：1μl；
引物OR（10mM）：1μl；
ddH2O：         14μl
将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；第一轮PCR条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸60s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
第二轮PCR扩增
以第一轮PCR产物为模板，用本试剂盒内试剂进行第二轮PCR扩增；PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μl；
10×PCR反应液：2μl；
第一轮PCR产物：1μl；
引物IF（10mM）：1μl；
引物IR（10mM）：1μl；
ddH2O：15μl；
第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火40s、72℃延伸30s, 共30个循环，后72℃延伸10min；
PCR产物观察：
称取琼脂糖，用电泳液混匀后（0.8%-1.0%）在微波炉中加热三分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，100V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现421bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。
3）PCR产物测序 
在紫外灯下将出现的扩增条带用洁净的手术刀切下，放入灭菌1.5ml离心管，使用上海生物工程公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（货号：SK8132）回收目的片段，将回收产物送上海生物工程公司测序。经nest-PCR诊断共有57个阳性结果，对阳性结果进行序列测定，正确率为100%。
SEQ No.1
<110> 吉林大学
<120>一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒
<160> 1
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 新孢子虫（Neospora caninum）
<400> 1
 
AAACCAGGAA AACAAATGAT CACCTTTTCC CTAAAGTAAC GGTCACATTG TTCATCTATA 60
GTGGTCTCTT AACCATGGTC CGCCCCCCAC CCCGTCCCGC TCTGCGTTCC CACTAAATCC 120
TTTACTGATA CAACAGAGCC CGTGCCGCCA CACACAGATC TCGGTCTACG AGCGGGGCGA 180
CGAGAGCGCC CACTTACCAT TTAGGTACAG AAGAACCGTT TTGGGTCGGA AGCCTCCATC 240
ATGGTGCTGT TTGAAGTACT GACCCTCTTC GTACCGGACG ACGGCAAGAG GCTCAAGATG 300
CTCCACGGGC ATGCCCGCGA ACGCGGATAC GATTCTCTCG ATATTCTCTA CGACCCCGGT 360
TTCCCCAATG GCAAGAGGAA CAGACCAGCT GGTTCTTGAT GGACTCTTTT TCGACATGTA 420
GTCGCGCTGA AAGGCACACA ATAACAATAC CCAGGACTTC GTCAGCCAGC CGAGCGAGTG 480
CACGTTCAAC AATGCACATG AAGACAGTGA AGCCGTTCGA CCACGAGACA CTCCAGCACA 540
TTTCTCGTCT AGAATAAATA GCCGCCTCAC AATTTGCGCT GGGTTAGCAC GTAGCTTAAC 600
ACGTTTCTCG TTAGCACAAG TGTGGCTGCG CAATCGTTCG ATGGGCCTTT TGCGGAGTTT 660
ATCTGAAACG TAATTTGAAA CACCTGCTCC CGGCAAACAG ACGATGCACT ATCGTTGTCG 720
GCTGAACTCG TGTGCGGCGT TTAATGCTGA GTCTGGATTT TCAGACACCG TCAA 774
 
SEQ No.2
 
<110> 吉林大学
<120>一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 新孢子虫（Neospora caninum）
<400> 1
AAACCAGGAAAACAAATGA 19
 
SEQ No.3
 
<110> 吉林大学
<120> 一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 新孢子虫（Neospora caninum）
<400> 1
TTGACGGTGTCTGAAAATC 19
 
SEQ No.4
 
<110> 吉林大学
<120>一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 新孢子虫（Neospora caninum）
<400> 1
ACGGTCACAT TGTTCATCTA 20
 
SEQ No.5
 
<110> 吉林大学
<120>一种新孢子虫特异nest-PCR检测试剂盒
<160> 4
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 新孢子虫（Neospora caninum）
<400> 1
 
AAGTCCTGGG TATTGTTATT G 21
 
 
 

Claims (4)

1.新孢子虫特异基因序列，其特征在于：如SEQ no.1所示。
2.用于扩增新孢子虫基因的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：
第一轮PCR引物：
OF：5’- AAACCAGGAAAACAAATGA -3’
OR：5’- TTGACGGTGTCTGAAAATC-3’ ；
第二轮PCR引物：
IF：5'- ACGGTCACATTGTTCATCTA -3'
IR：5'- AAGTCCTGGGTATTGTTATTG-3 。
3.一种新孢子虫特异PCR检测试剂盒，包含：10×PCR反应液，权利要求2中的引物OF、OR和IF、IR用于nest-PCR特异扩增，含SEQ no.1基因的阳性对照作为检测的阳性指示。
4.权利要求3所述的试剂盒制备方法如下：
 1）10×PCR反应液：300mM的dNTPs  20μl，Tris  2.42mg，KCl 7.45mg，MgCl2 0.258mg, 200 U 的Taq酶 20μl，加入150μl ddH2O，用HCl调pH至8.5，用ddH2O定容至200μl；
 2）阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为新孢子虫基因组DNA，将培养的新孢子虫用细胞计数板计数，将106个新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μl；
 3）试剂盒的组装：每个试剂盒为检测100个样品：
按下列内容组装试剂盒：
每个试剂盒为检测100个样品，按下列内容组装试剂盒（整个操作要求无菌环境）：
10×PCR反应液200μl，
10mM引物OF 50μl；
10mM引物OR 50μl；
10mM引物IF 50μl；
10mM引物IF 50μl；
阳性对照DNA 100μl；
ddH2O 2ml。
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