CN111197100A - 犬新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法和应用，其中犬新孢子虫的特异基因序列为SEQ ID NO.1，该特异基因序列在犬新孢子虫基因组中具有五个拷贝，进一步设计了该特异基因序列的扩增引物并构建犬新孢子虫PCR检测试剂盒，拟应用于动物新孢子虫感染的临床检测和筛查，可准确、快速诊断犬新孢子虫感染所致的母畜流产病原以及对动物群体新孢子虫感染的调查。

Description

犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法和应用

技术领域

本发明是关于动物检验检疫技术领域，特别是关于一种犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法和应用。

背景技术

犬新孢子虫(Neospora caninum)隶属于顶复亚门的胞内寄生原虫，可以感染多种动物，能够引起牛、犬等多种动物的神经肌肉系统功能障碍和妊娠动物繁殖障碍。为有效检测犬新孢子虫感染，研究人员已建立了多种血清学和免疫学检测方法，包括间接免疫荧光实验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及改良凝集试验(NAT)等，其中ELISA在检测犬新孢子虫感染最为广泛，但其对于早期感染和5月龄内犊牛感染时效果不佳。PCR扩增是目前运用最普遍的分子生物学工具，以及广泛用于多种疾病和感染的诊断。目前，已经有用于犬新孢子虫诊断的PCR方法，但在低丰度样本中存在灵敏度低、特异性差的特点。因此筛选出犬新孢子虫的特异基因并建立高灵敏度和高特异性的PCR检测方法对犬新孢子虫感染的诊断十分必要。国内外对于犬新孢子虫病的检疫诊断还相对滞后，对该病的检测远不能满足实际需要。因此，建立简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学检测方法势在必行。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬新孢子虫的特异基因序列，该特异基因序列在犬新孢子虫基因组中具有五个拷贝，从而更有利于根据犬新孢子虫基因组序列特征设计特异扩增引物，可准确、快速诊断犬新孢子虫感染所致的母畜流产病原以及对动物群体新孢子虫感染的调查。

为实现上述目的，本发明提供了犬新孢子虫的特异基因序列，所述特异基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一对扩增引物，所述扩增引物用于扩增上述犬新孢子虫的特异基因序列，所述扩增引物具有以下序列：上游引物F：5’-CGCACAAGAAACCGAGGAA-3’(SEQ IDNO.2)，下游引物R：5’-GAAGGCGAGAAGCCCAAGT-3’(SEQ ID NO.3)。

本发明还提供了一种犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，包括上述扩增引物。

本发明还提供了一种犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，包括以下试剂：10×PCR反应液、上述扩增引物、阳性对照DNA、阴性对照、和ddH₂O。

在一优选的实施方式中，所述阳性对照DNA为犬新孢子虫基因组DNA。

在一优选的实施方式中，所述阴性对照为dH₂O。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下操作：10×PCR反应液：300mM的dNTPs(购自日本TAKARA公司)20μL，Tris(购自美国Pragma公司)2.42mg，KCl(购自美国Sigma公司)7.45mg，MgCl2(购自美国Sigma公司)0.258mg,200U的Taq酶(购自日本TAKARA公司)20μL，加入150μL ddH₂O，用HCl调pH至8.5，用ddH₂O定容至200μL；阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为犬新孢子虫基因组DNA，将培养的犬新孢子虫用细胞计数板计数，将10⁷个犬新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μL；试剂盒的组装：按下列内容组装试剂盒：10×PCR反应液:200μL，10mM上游引物F:50μL；10mM下游引物R:50μL；阳性对照DNA:100μL；ddH₂O:2mL；其中，整个操作过程要求在无菌环境下进行。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，包括以下步骤：待检样品DNA的提取：将待检样品用常规方法提取DNA；PCR反应体系的准备：准备待检样品数+2的PCR反应管，每个PCR反应管均做好标记并根据标记按照PCR反应体系添加相应试剂；PCR扩增：将上述PCR反应管置于PCR仪中进行PCR扩增，其中PCR的反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min；以及PCR产物观察：称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解，等胶冷却后在加样孔中分别加样，120V电压下电泳10分钟，之后在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果；其中，所述PCR反应体系包括：10×PCR反应液：2μL；待检样品DNA或阳性对照或阴性对照；10mM上游引物F：1μL；10mM下游引物R：1μL；ddH₂O：补足至20μL。

在一优选的实施方式中，所述待检样品DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，所述阳性对照和所述阴性对照的用量均为1μL。

本发明还提供了上述犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的动物检验检疫领域中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用邻近蛋白生物素标记技术筛选到犬新孢子虫特异基因NcGRA11b(SEQ ID NO.5)，随后在新孢子虫基因组数据库进行BLAST搜索，筛选到与以上基因序列相似度较高的四个特异基因NcGRA11a(SEQ ID NO.4)、NcGRA11c(SEQ ID NO.6)、NcGRA11d(SEQ ID NO.7)、和NcGRA11e(SEQ ID NO.8)。由于目前新孢子虫基因组测序尚未完全，以上涉及的五个特异基因在基因组上的位置以及各自的序列信息还不完整。通过PCR扩增、测序和拼接，我们获得了这五个基因的完整序列信息，并证实这五个基因均位于新孢子虫Chrⅳ染色体上，成线性依次排列。经多序列比对，我们在上述五个特异基因中均发现了特异基因序列SEQ ID NO.1(即SEQ ID NO.1在犬新孢子虫基因组中具有五个拷贝)，进一步根据SEQID NO.1序列特征设计特异扩增引物，经多次扩增和筛选，最终确定了特异扩增引物SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，并构建犬新孢子虫PCR检测试剂盒，应用于动物新孢子虫感染的临床检测和筛查，可准确、快速诊断犬新孢子虫感染所致的母畜流产病原以及对动物群体新孢子虫急性、慢性及隐性感染的调查，本试剂盒也可用于犬新孢子虫的分子鉴定。

(2)本试剂盒为临床诊断和犬新孢子虫病感染/流行的预测预报提供依据，所构建的试剂盒具有特异性好、准确率高的优势，且简便和易于操作。具有重大的社会意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的检测试剂盒特异性的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是根据本发明一实施方式的检测试剂盒灵敏度的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是根据本发明一实施方式的样品检测实例的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过实施例1-3对犬新孢子虫特异基因序列的引物设计、试剂盒的组装及使用方法进行具体描述。

实施例1

本发明根据PCR扩增原理，设计并合成了一组扩增犬新孢子虫特异基因序列SEQID NO.1的PCR引物，引物合成委托北京睿博兴科生物技术有限公司完成。引物合成后用灭菌蒸馏水制成100mM原液(储藏液)，再用ddH₂O稀释到10mM作为工作液。引物序列如下：

上游引物F：5’-CGCACAAGAAACCGAGGAA-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物R：5’-GAAGGCGAGAAGCCCAAGT-3’(SEQ ID NO.3)

实施例2

试剂盒组装

1)10×PCR反应液：300mM的dNTPs(购自日本TAKARA公司)20μL，Tris(购自美国Pragma公司)2.42mg，KCl(购自美国Sigma公司)7.45mg，MgCl2(购自美国Sigma公司)0.258mg，200U的Taq酶(购自日本TAKARA公司)20μL，加入150μL ddH₂O，用HCl调pH至8.5，用ddH₂O定容至200μL。

2)阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为犬新孢子虫基因组DNA，将培养的犬新孢子虫用细胞计数板计数，用10⁷个犬新孢子虫提取基因组DNA，用水稀释至100μL。

3)试剂盒的组装：

按下列内容组装试剂盒(整个操作要求无菌环境)：

10×PCR反应液200μL

10mM上游引物F 50μL

10mM下游引物R 50μL

阳性对照DNA 100μL

ddH₂O 2mL

实施例3

本发明试剂盒的使用方法如下：

取待检样品，按常规方法提取基因组DNA，用本试剂盒内试剂进行PCR扩增。PCR反应加样体系如下，总反应体系为20μL(标本DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH₂O补足20μL；阳性对照用量为1μL)：

10×PCR反应液：2μL

根据提取DNA量决定标本DNA

上游引物F(10mM)：1μL

下游引物R(10mM)：1μL

ddH₂O：补足至20μL

将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并做好标记，置于PCR仪中。PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min。

PCR产物观察：称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热约三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在各加样孔中分别加样，120V电压下电泳10分钟，之后取出琼脂胶在紫外灯下观察实验结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果。

以下进一步通过实施例4-6对犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的特异性、灵敏性度及临床动物试验进行具体描述。

实施例4

试剂盒特异性

以犬新孢子虫和弓形虫速殖子2个样本DNA为模板，用本试剂盒内进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

10×PCR反应液： 2μL

样品： 1μL

上游引物F(10mM)： 1μL

下游引物R(10mM)： 1μL

ddH₂O： 15μL

把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中；PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共34个循环，后72℃延伸5min。

PCR产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120V电压下电泳10分钟，之后取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图1的条带可以看出，最终确定PCR试剂盒为犬新孢子虫特异检测试剂盒(见图1)；图1中，DL2000 plusDNA Maker；1:犬新孢子虫基因组DNA；2：弓形虫基因组DNA；3：阴性对照(dH₂O)。

实施例5

制备的试剂盒灵敏度

1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹、1×10^-1、1×10^-2个犬新孢子虫基因组DNA，用本试剂盒内进行PCR扩增。PCR反应加样体系如下：

10×PCR反应液： 2μL

样品： 1μL

上游引物F(10mM)： 1μL

下游引物R(10mM)： 1μL

ddH₂O： 15μL

将阴性对照加入标记好的管中，然后把样品依次加入并标记好，置于PCR仪中。PCR条件为：94℃预变性5min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min。

PCR产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120V电压下电泳10分钟，取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图2的条带可以看出，最终确定PCR试剂盒可检测到1个犬新孢子虫DNA(见图2)：图2中，DL2000 plus DNAMaker；1-8:犬新孢子虫基因组DNA梯度从1×10⁵-1×10^-2个；9：阴性对照(dH₂O)。

实施例6

临床动物样品检测

采集北京地区流产牛组织样15份，用试剂盒对样本进行检测。

1)流产牛组织样本处理：使用研磨器将流产牛组织(2g)进行研磨，吸取100μL样于灭菌后的1.5mL离心管，用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，按操作手册进行。

2)样品扩增

以提取好的样本DNA为模板，用本试剂盒内试剂进行PCR扩增。PCR反应加样体系如下：

10×PCR反应液： 2μL

样品： 2μL

上游引物F(10mM)： 1μL

下游引物R(10mM)： 1μL

ddH₂O： 14μL

将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品依次加入并做好标记，置于PCR仪中。PCR反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min。

PCR扩增产物观察：

称取琼脂糖，用电泳液混匀后(1.0％)在微波炉中加热三分钟致琼脂糖溶解。等琼脂糖溶液冷却后在加样孔中分别加样，120V电压下电泳10分钟，取出胶板在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果，通过图3的条带可以看出，最终确定PCR试剂盒可用于犬新孢子虫感染样品的检测，其敏感性明显高于扩增新孢子虫Nc5序列。图3中，DL2000 plus DNA Maker；1-15:15份流产牛组织基因组DNA；+：阳性对照；-：阴性对照；B：空白对照。Nc5引物检测作为对照。

3)PCR产物测序

在紫外灯下将出现的扩增条带用洁净的手术刀切下，放入灭菌1.5mL离心管，使用北京索莱宝科技有限公司的DNA胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。经PCR扩增共有4个阳性结果，对阳性结果进行序列测定，序列与目的序列完全一致，正确率为100％。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒及制备方法和应用

<130> P191273DD1F

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 376

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 1

cgcacaagaa accgaggaac ccagccggcg tcgcaagcag gctgcactcg tggccgcagt 60

gctggtagcg gcggccgtct acggtctgcg ttcgtctctc ttgggggttg acaaggtgtc 120

ttcgccgacg gcactccagg ggctcctaaa aaaaccagaa agcatgcacg gcattgatcc 180

tgatgcctcc gtcgacttcc aaccagacgc gtcggtcgag cggcaaatgg aagtgccggc 240

cgaaggtgcg ggtgatgaag tgcgaggttg gcagcattta gtccgggact tttcggcgat 300

gttagcggga gaatatgcgc tatccccgcg cgtcggagcg gtggcctcgg ctgttgcact 360

tgggcttctc gccttc 376

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 2

cgcacaagaa accgaggaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggcgaga agcccaagt 19

<210> 4

<211> 2322

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 4

atgtgtcgag gaggcaaaaa tgtctcacat cgtttggcat ccagagctgg acttcttctg 60

gtcgcctgct gcgcgtgcgc tcttctctct tcgtcgccgc ttcccacgcg gcggtatttc 120

ctgacgttcg gtctcgccag caaagtagtc gtcgatggag aggcggaaaa aggcaatttg 180

gatgtctcag ttcagcagga tgggcgggac aacggggacg ccgacagtct tgacccaatt 240

gatgggtccc cggcggcagc ggtcgaggcg ggcggcttgg ctgccgtaca gcaacagggt 300

cgcagttccc gcggatcgag tgtctcgtac accgtgtcca cccagcgtag ggcgtcaaaa 360

agccggtatg tgttgcctgc ggtcctcatt tctgcccttg cagcagctgg aatgatgggc 420

tacgtcacgc ccaagaaaac gcccgccccc gagaaaacag atgtcgagac ggtcgctgcc 480

cgcgctggtg ccgagcaatt cgactcggat gccacaaccg agcaaaaaag cgcggaaatc 540

gcacaagaaa ccgaggaacc cagccggcgt cgcaagcagg ctgcactcgt ggccgcagtg 600

ctggtagcgg cggccgtcta cggtctgcgt tcgtctctct tgggggttga caaggtgtct 660

tcgccgacgg cactccaggg gctcctaaaa aaaccagaaa gcatgcacgg cattgatcct 720

gatgcctccg tcgacttcca accagacgcg tcggtcgagc ggcaaatgga agtgccggcc 780

gaaggtgcgg gtgatgaagt gcgaggttgg cagcatttag tccgggactt ttcggcgatg 840

ttagcgggag aatatgcgct atccccgcgc gtcggagcgg tggcctcggc tgttgcactt 900

gggcttctcg ccttctcgct ggcagctgct cgacgggcat cgcgtcggag acaacagcaa 960

ggggaagagc gtccagcgtc accaacagcg ggcgaggaac aggcggatcc ggtgcctgct 1020

gaggccgctg ctccggcagc tgaacccgag cagattcccg aggcggaacc tgagaagccg 1080

aaggaggagg aggttcctcc tgtggccgcc cctgcggata tgccggagga agtgcccgag 1140

gaacgcaagc aggaggaggc tggtggtgag gcgttgggcg aggatagggg agagcctacg 1200

aaagagagag gcccagcgtc cgaggatgag tttgaagctg aagagggtcc agagcaggaa 1260

attgtcgtag ttgctgttcc gccattgcct ccaaggccgc ggacaaagct cgagacgctc 1320

tgggaggacg gagaggacgg ggaggcgtct gacgaagaaa aacttgcgaa tatcaaaacc 1380

gccgtgcgga actcggtgag aagatggaag aaccagatag agatatatcg aactcaggcg 1440

aaaaagctgg acgccgagtt caagtccacg tcgacccgcc tggatgaggt caaactgacc 1500

aggcaaccga tcgtgcagag aaaactggag accaagttgg agcagttgtc gcagacacta 1560

gcagatcagt acgagcttac gctggtcatc tccgcactcc agcgcatctc tctctcgctc 1620

ctccatgtcg tggaagacgc ggctacagtt acgggggacc acggtcgaat tgcacagttc 1680

cggatcagcg ccagtgcgag cctggccagt atcctggtct ccctcgagaa ggttcggttg 1740

gaggctttgg aggcacaaga gggtcggggg gaagtgcaag ccggtggtgc atcgttggga 1800

ctcgcgagtt cggcgttacg cagtatcgat ctcatcaagc accagtccaa gaaactgctg 1860

ctacttgttt ctctgctggg ggcggagccg aagacaggcg cgccgcccaa gacagagccg 1920

aaagtcgaca acatgctgga ggcacaagcc gcagagctca gaagtgaact gagcaaaacg 1980

gaggaggcct ccgccttgcg ggaacaggag gcggcactgc tcgcggcgct ggagtcctct 2040

ctacgtaggg cccaagcctt ctttgcgaaa gaagcaaaag tggccgcgga gtttctactg 2100

cagttcggaa gtgcaacgtt acctggagca gccgccacgc taacagagct tcaggacgat 2160

ctgagacttc ggcgcatcag ggtcaccaac gtggaaagtg aacgcaaggc tgtccgcggc 2220

ttaaaaagca ctatcataga aaagcagacc gcgcttgaga agaaacgaaa ggaactaacg 2280

tccgcactgg aagaagtgga aaagaatatc aagggagagt ag 2322

<210> 5

<211> 2883

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 5

atgcgtcgag gaagcgaaaa cttccgccat cttttggcgt ccagagctgg acttcttctg 60

gtcgcctgct gcgcgtgcgc tcttctctct tcggcgccgc ttcccacgcg gcggtatttc 120

ctgacgtttg gtctcgccag cgaagtagtc gtcgatggag aggcggaaaa aggcaatttg 180

gatgtctcag ttcagcagga tgggcgggac aacggggacg ccgacagtct tgacccaatt 240

gatgggtccc cggcggcagc ggtcgaggcg ggcggcttgg ctgccgtaca gcaacagggt 300

cgcagttccc gcggatcgag tgtctcgtac accgtgtcca cccagcgtat ggcgtcaaaa 360

agccggtatg tgttgcctgc ggtcctcatt tccgcccttg cagcagctgg aatgatgggc 420

tacgtcacgc ccaagaaaac gcccgcctcc cagaaagcag atgtccagac ggtcgctgcc 480

cgcgctggtg ccgagcaatt cgactcggct gccaccaaga aaaagagcgc agaaatcgca 540

caagaaaccg aggaatccag acggcgtcgc aagcaggctg cactcgtggc cgcagtgctg 600

gtagcggcgg ccgtctacgg tctgcgttcg tctctcttgg gggttgacaa ggtgtcttcg 660

ccgacggcac tccaggggct cctaaaaaaa ccagaaagca tgcacggcat tgatcctgat 720

gcctccgtcg acttccaacc ggacgcgtcg gtcgagcggc aaatggaagt gccggccgaa 780

ggtgcgggtg atgcagtgcg aggttggcag catttagtcc gggacttttc ggcgatgtta 840

gcgggagaat atgcgctatc cccgcgcgtc ggagcggtgg cctcggctgt tgcacttggg 900

cttctcgcct tctcgctggc agctgctcga cgggcatcgc gtcggagaca acagcaaggg 960

gaagagcgtc cagcgtcacc aacagcaggc gaggaacagg cggatccggt gcctgctgag 1020

gccgcagacc ctgccgctga tcccgagcag gttggcgaga aggagcctaa gaaaccggag 1080

gagaaggagg cgcctgctgc gcccgctgct ccggcagctg aacccgagga gattctcgag 1140

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gagattcccg aggcagaacc tgagaagccg gaggaggagg cgcctgctgc ggcagctgac 1740

ccggcagctg gacctgagca gattccccag gcagaacctg agaagccgaa agaggatgcg 1800

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cgcggtgaac gagaagaaga ggaggaacct agtggtgagg agcccagcga ggcagcggga 1920

gaccccgatg acgatatgct ggatgttagc attgcagatg tccgggaggc agcgttgcag 1980

caggcgaaga gatgtgggga gttcgtgagc aagttccgta tcgcggcgta ttcgctcgaa 2040

atcgcgagtg gtgcactgca gacgcgtatc gaaatagcga ggcagcacgg gcaagatgtt 2100

gtggtgagga caatgtcgga ctcgctgact actactatgc gtcagctcga acttagttac 2160

gaggcgatga ggaaaaacgt tgacctcggc cgcctcgcgc aggcagttgc ttctttggcg 2220

gaaacagtgg agcagggaca gcgagacgga gttattgagg agcagatcgc tccgctcgag 2280

caaaagatgg accaagtcat gagcgagctc gacgagcttg taaaggaatc ggagacagaa 2340

gacactgagg aagaagcggc tgtccccggt gtgaccggct cgccgtcgga accacgagct 2400

ccgagtacag atgatatcaa aaacttgcgc caccaattga agcgcactat acatctgttc 2460

gctaccacgg tggtggcagc ccaggcagat gcgtccacga gtttggggtc acgccgcaag 2520

cttccaggct cggatatcag cgacgctatc gcctggtaca agtcatctat tgccacagca 2580

cacgggctca tcgctgggtt acacaaattc ggcgacccca tcaccgcttc cgtagctttc 2640

ttcaccgagc atgtccagca agccgaggat gatcttaccg cccgagacgt tccaggtgat 2700

tcccccgagg tacagaagct caaagacgaa cttgaacgtc gacgtcaagc ccttgcccgc 2760

acggaggcag tggctgcagc tcttcgacgt gataaggaat atgcagagac cgtgatcagc 2820

ttcgcgcaag aacacctcat ggacctgcag ttcgagtggc agatattcgc cactagtgac 2880

taa 2883

<210> 6

<211> 2565

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 6

atgtcccgtc gtttggcatc cagatgtggg ctgcttctgg tggcttgttg cgccttcacc 60

ctgctcggtg ctgggccgcc tccctcgtcg cggcgtctcc tttccttcag tctcgccatt 120

gagattgaag atggaggaac gggatacaca ggcagggggg tcggggttga ggaacttgtg 180

gagagcaaag ggtccgacag cagctctgga aacccagaca agggtccgcc aatttccccg 240

gcggcgtccg agagggccga ggctgttttc gtgatgcagt ccagcctcgt tggccgcgga 300

aaacgaggtc tgcataacat gtcgactcag cgtagggcgt caaagagccg gtatgtgttg 360

cccgcggtcc tcatttccgc ccttgcagca gctggaatga tgggctacgt cacgcccaag 420

aaaacgcccg cctcccagaa agcagatgtc cagacggtcg ctgcccgcgc tcgtgccgag 480

caattcgcct cggctgccac caagaaaaag agcgcagaaa tcgcacaaga aaccgaggaa 540

tccagacggc gtcgcaagca ggctgcactc gtggccgcag tgctggtagc ggcggtcgtc 600

tacggtctgc gttcgtctct cttgggggtt gacaaggtgt cttcgccgac ggcactccag 660

gggcctctaa aaaaaccaga aagcatgcac ggcattgatc ctgatgcctc cgtcgacttc 720

caaccggacg cgtcggtcga gcggcaaatg gaagtgccgg ccgaaggtgc gggtgatgca 780

gtgcgagctt ggcagcattt agtccgggac ttttcggcga tgttagcggg agaatatgcg 840

ctatccccgc gcgtcggagc ggtggcctcg gctgttgcac ttgggcttct cgccttctcg 900

ctggcagctg ctcgacgggc atcgcgtcgg agacaacagc aaggggaaga gcgtccagcg 960

tcaccaacag caggcgagga acaggcggat ccggtgcctg ctgaggccgc agaccctgcc 1020

gctgatcccg agcaggttgg cgaggaggag cctaagaaac cggaggagaa ggaggcgcct 1080

gctgcgcccg ctgctccggc agctgaaccc gaggagattc ccaaggcaga acccgagaag 1140

ccggaggagg aggaagtgcc tgctgcggcg ggcgcgccgg aagaacctga ggattcgccg 1200

gatggtcagc ccggagagga ggaggaagtg cctgctgcgg cgggcgcgcc ggaagaacct 1260

gaggattcgc cggatggtca gcccggagag gaggagggag ggccggccga cagtgctacg 1320

gcgggtgtac ccgaggaagt atcagaggaa ccagagaagg tggagcagcc tggcggcgtc 1380

gtgccggatg acgccgtggg agagcctgtg ggggaaacgg gcacagagtc cggtgaggca 1440

gaaatgaaaa ctcaagaagg ggaagagtcg ggagaggagg aggagtcggg agaagaggaa 1500

gagccggaga ttcccgtaat tgctgctccg ccattgcctg taaggcgtcg cacaaagctc 1560

gagacgctct gggaggacgg agaggacgaa ggggagtctg accgtgagaa actcgggaat 1620

atcaaggacg ccttgtgcga gtcagtgcga agatggggga gccaggtcag caaatttaga 1680

gttctgacga ggaaaatgga agccaagtgg aactccacaa agatgcgctt gaatgcagtc 1740

gcgctgacca ggcagccgat gatacagaac gaactggaga ccaagctttc agagcttacg 1800

cagaagcttg cagataccca cgacctctct atcgccgtcg ccgcagtcca gcgcctctct 1860

ctgtgggttt tgcgtttcgc gtccagattg gtaacagcag aggcaggcag aatggaccag 1920

aacgatctga cgctcctcaa tgcgaacatg gccagtttct cgataaaatt tgaagtaact 1980

cggatggagc tggcggagct acaaaagcat cgggaggaag gtgaccccgc aggtccagct 2040

tttgggccag cgagtgcgct gatacgtact ctcgaccgga caaggaacat gtataagcaa 2100

cttgtgcaaa ttggcgctgc cttagagacg gcagcgaagg aaggcgttgc gcccacggca 2160

gcgcgggcag tccccaaggc gtccgaggcg caagcctcag agctcagaag tgagctcagc 2220

gaaataaagg acgccgtcgc catggagaag gaggaggagg acttgctcgc ggcgctggag 2280

tccgcgctgc agagggccca agctttcttt gcccaagagc tcaaaatagc tcaggcgaat 2340

ttattacatt tcggaaccgc gcgccgtgga gaagccgcct cgctaattga actccaggaa 2400

gatgttagac aacgacgtct caaagttagc caagtagaga gtgaacgtaa gaatctccac 2460

tctatgagag tcgctttcat ccgtgagcgg gccgaccttg agaacaaaca caaggaacta 2520

acgtccgcac tggaagaagt ggaaaagaat atcaagggag agtag 2565

<210> 7

<211> 2238

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 7

atgcgtcgag gaagcgaaaa cttccgccat cttttggcgt ccagagctgg acttcttctg 60

gtcgcctgct gcgcgtgcgc tcttctctct tcggcgccgc ttcccacgcg gcggtatttc 120

ctgacgtttg gtctcgccag cgaagtagtc gtcgatggag aggcggaaaa aggcaatttg 180

gatgtctcag ttcagcagga tgggcgggac aacggggacg ccgacagtct tgacccaatt 240

gatgggtccc cggcggcagc ggtcgaggcg ggcggcttgg ctgccgtaca gcaacagggt 300

cgcagttccc gcggatcgag tgtctcgtac accgtgtcca cccagcgtat ggcgtcaaaa 360

agccggtatg tgttgcctgc ggtcctcatt tccgcccttg cagcagctgg aatgatgggc 420

tacgtcacgc ccaagaaaac gcccgcctcc cagaaagcag atgtccagac ggtcgctgcc 480

cgcgctggtg ccgagcaatt cgactcggct gccaccaaga aaaagagcgc agaaatcgca 540

caagaaaccg aggaatccag acggcgtcgc aagcaggctg cactcgtggc cgcagtgctg 600

gtagcggcgg ccgtctacgg tctgcgttcg tctctcttgg gggttgacaa ggtgtcttcg 660

ccgacggcac tccaggggct cctaaaaaaa ccagaaagca tgcacggcat tgatcctgat 720

gcctccgtcg acttccaacc ggacgcgtcg gtcgagcggc aaatggaagt gccggccgaa 780

ggtgcgggtg atgcagtgcg aggttggcag catttagtcc gggacttttc ggcgatgtta 840

gcgggagaat atgcgctatc cccgcgcgtc ggagcggtgg cctcggctgt tgcacttggg 900

cttctcgcct tctcgctggc agctgctcga cgggcatcgc gtcggagaca acagcaaggg 960

gaagagcgtc cagcgtcacc aacagcaggc gaggaacagg cggatccggt gcctgctgag 1020

gccgcagacc ctgccgctga tcccgagcag gttggcgaga aggagcctaa gaaaccggag 1080

gagaaggagg cgcctgctgc gcccgctgct ccggcagctg aacccgagga gattccgaag 1140

gcagaacctg agaagctgaa ggaggaagcg gcggcgggtc agactggaga gcagacagaa 1200

cagactgaaa gcggcccgaa ggaagagcgc gacgaacgag aggaagagcc gaagcctgat 1260

ggtgaggagc ggagcgaggc ggcggcaggc gtcgaggaca gtgggttgcc tgatggcgtc 1320

gcaagcgtgc ggtcgggatt gttgcagcag gttcagaaat gccgggagac cgtcctcagg 1380

cttcgaatga aggcgagatc gctggaaact gtggtcagaa acactcaggc acgcatggaa 1440

gtgattaagt cgctcaatca accgaacgtg ctggttacac tgtcggccac gctcaataag 1500

ttcgcggagg aactcgaaag taaccacacg gcggtggtgg caaacgttag gctcggccgc 1560

ctcgcgctgg aagtgtattc tatggcggaa gcggtggaga aaggacagga agacggagtt 1620

gctccggagc agcgtgctgc gctcgagcag aagatggaga aagtcatgag cgagctcgag 1680

aagcttttga aggaatcgga gacagaagac actgaggaag gagcgactgg ccccggtgtg 1740

accggctcgc cgccgggacc cggagctccg agtacagatg atatcaaaag gcttcacctt 1800

cagttgcaga acctcatgca gttcgctacc accacggtgg cggaaggcca ggaagatccg 1860

tccgcggcag cggaaccaga gcccaaggta gcagaccagg aaaccaacat gataaaggtg 1920

aaggaaggac tagatctgac tgagcagcgt gtgaatctgt tacaagagtt tgtagactcg 1980

accgcagctg cagtggcttt cttcgccgat tatgcccaga gagctgagga tgatcttccc 2040

gcccaagaag acgttccagg cgattccgcc gaggtacagc agctcaagga cgaagttgaa 2100

cgtcgacgtg gactgcttgc cggtgcgcag gaagaggctg agtccatccg acaagctagg 2160

gacgttggag tacaacatat gaatttgcta ctgcagcgct tcgagcagct gcagctgcag 2220

gcaccaaaaa atgattag 2238

<210> 8

<211> 2820

<212> DNA

<213> 犬新孢子虫(Neospora caninum)

<400> 8

atgcatcgag gaggcaaaaa tgtctcacat cgtttggcat ccagatttgg gctccttctg 60

gtagcttgtt gcgccttcac cctgctcggt gctgggccgc ctcccgcgtc gcggcgtctc 120

ctttccttca gtctcgccat tgagattgaa gatggaggaa cgggatacac aggcaggggg 180

gtcggggttg aggaacttgt ggagagcaaa gggtccgaca gcagttctgg aaacccagac 240

aagggtccgc caatttcccc ggcagcatcc gagagggccg aggcggctgc cgtgaaccac 300

tttgccgttg ttggccacgg aaaacgaggt ctgcataaca tgtcgactca gcgtagggcg 360

tcaaagagcc ggtatgtgtt gcccgcggtc ctcatttccg cccttgcagc agctggaatg 420

atgggctacg tcacgcccaa gaaaacgccc gcctcccaga aagcagatgt cgagacggtc 480

gctgcccgcg ctggtgccga gcaattcgac tcggatgcca ccgagaaaaa gagcgcggaa 540

atcgcacaag aaaccgagga atccagacgg cgtcgcaagc aggctgcact cgtggccgca 600

gtgctggtag cggcggccgt ctacggtctg cgttcgtctc tcttgggggt tgacaaggtg 660

tcttctccga cggcactcca ggggctccta aaaaaacctg aaagcatgca cggcattgat 720

cctgatgcct ccgtcgactt ccaaccggac gcgtcggtcg agcggcaaat ggaagtgccg 780

gccgaaggtg cgggtgatga agtgcgaggt tggcagcatt tagtccagga cttttcggcg 840

atgtcagcgg gagaatatgc gctatccccg cgcgtcggag cggtggcctc ggctgttgca 900

cttgggcttc tcgccttctc gctggcagct gctcgacggg catcgcgtcg gagacaacag 960

caaggggaag agcgtccagc gtcaccaaca gcgggcgagg aacaggcgga tccggtgtct 1020

gctgaggccg ttgctccggc agctgaaccc gaggagattc ccaaggcaga acccgagaag 1080

ccggaggagg aggaagtgcc tgctgcggcc gctgacccga cggctcaacc cgaggaaatt 1140

cccaaggctg aacccgagaa gccggaggag gaggaagtgc ctgctgcggg cgctgctccg 1200

gcagctgaac tcgagcagat tcccaaggca gaacctgaga agccggagga ggaggttcct 1260

cctgtggccg ctgacccgac agctgaaccc gaggagatcc ccaaggcaga acctgagaag 1320

tcggaggagg aggaggttcc tcctgtggcc gctgacccga cagctgaacc cgaggagatt 1380

ccgaaggcag aacctgagaa gccggaggag gaggaagtgc ctgctgcggc gggcgcgccg 1440

gaagaacctg aggatttgcc ggaggccgga gaggagggag ggccggccga cagtgctacg 1500

gcgggtgtac ccggggaagt atcagaggaa ccagagaagg tggagcagcc tggcggcgtc 1560

gtgccggatg agcctgtgga agagacgcgc acagaggccc aagagatagg cacagggtcc 1620

caagagatag gcacagggtc ccaagagacg gaaattgggg ctcaaaaggg ggaagagccg 1680

agggaggaga aagggcctga gcgtaccgta ggcgatgagt gggagcgtgg aatggtttcc 1740

ccagagaccg aatccatgtg ggaggacagc gaggatgaag gtgagggcga gttggatatc 1800

catgagctga agtccgccgt gtggaattta atgcgaaaat acgatcagaa gaccgtcaag 1860

tttcgaactc gggtggcaac gctcacaacc acgatcgata acatagaagc ccgcctttac 1920

agaatcagag agctcgggca accgagtgcc gagcagtcac tggttaacgc ggccgagcgt 1980

ttatcggagg agctgatcgg tttgcacgaa ggcgtggtgg aaatctccac gctgcagcgc 2040

ctcaatcttg cagttgtcaa ttgcaaggaa agagtgacca ttgcacaaga ggaggggatg 2100

acaccgcgtg aacatgctgc cttccgggac cacctgaaca tagccatgtc ttacctcgat 2160

agcatgcgcg gggagacgtc ggcgacacaa ggcactccgg ggggaacgac tgacataaga 2220

gctgagacag aacacaggcc atcacaagag gctctggacc ttaaggatat caatttcttg 2280

agacgtcagt tgaagcaaat caggaagcag tgcgctgcgg cgatggcgtc gcccaagaca 2340

ggtccgtcca cgacagcaca ggaatccgcc aatactgccg tggcgtacgc cagaaggatc 2400

cgcagtgcac tacaaaaaat tagtgaggac atcaaagtcc gagagaccgt ggagaggcag 2460

cttgaagagc tggagatagg gctgaatgct gccgaaaatt ttttctacgg acacatgatg 2520

gtagggaacg aggtggattt cttcgaagag gatggctcgg aggccggcgt cgaacttgac 2580

agcgtaatgg acgaggagct caaggaggag atccaacgtc gacggaggag gctgatccgc 2640

accgtacgag aacgcgaggc tttcatgaca acacaattgc tggtccgaaa atatgtggac 2700

atgctctttg aagataaagc gctacttgag cgcgcactgg aggaggtgga aaacgtggta 2760

caggaagaat tgcgtgtccc gccagttggt gagacgcaga ctcagcatca cgtcagctga 2820

Claims (10)

1.一种犬新孢子虫的特异基因序列，其特征在于，所述特异基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一对扩增引物，所述扩增引物用于扩增权利要求1所述的犬新孢子虫的特异基因序列，其特征在于，所述扩增引物具有以下序列：

上游引物：5’-CGCACAAGAAACCGAGGAA-3’(SEQ ID NO.2)，

下游引物：5’-GAAGGCGAGAAGCCCAAGT-3’(SEQ ID NO.3)。

3.一种犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的扩增引物。

4.如权利要求3所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括以下试剂：10×PCR反应液、阳性对照DNA、阴性对照、和ddH₂O。

5.如权利要求4所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA为犬新孢子虫基因组DNA。

6.如权利要求4所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为dH₂O。

7.权利要求4所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下操作：

10×PCR反应液的制备：300mM的dNTPs 20μL，Tris 2.42mg，KCl 7.45mg，MgCl₂0.258mg，200U的Taq酶20μL，加入150μL ddH₂O，用HCl调pH至8.5，用ddH₂O定容至200μL；

阳性对照DNA的制备：阳性对照DNA为犬新孢子虫基因组DNA，将培养的犬新孢子虫用细胞计数板计数，将10⁷个犬新孢子虫提取基因组DNA，然后稀释为100μL；

试剂盒的组装：按下列内容组装试剂盒：

10×PCR反应液:200μL，

10mM上游引物:50μL；

10mM下游引物:50μL；

阳性对照DNA:100μL；

ddH₂O:2mL；

其中，整个操作过程要求在无菌环境下进行。

8.权利要求4所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

待检样品DNA的提取：将待检样品提取DNA；

PCR反应体系的准备：准备待检样品数+2的PCR反应管，每个PCR反应管均做好标记并根据标记按照PCR反应体系添加相应试剂；

PCR扩增：将上述PCR反应管置于PCR仪中进行PCR扩增，其中PCR的反应条件为：94℃预变性4min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s,共34个循环，后72℃延伸5min；以及

PCR产物观察：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后在紫外灯下观察扩增结果，如果出现376bp扩增条带为阳性结果，不出现则为阴性结果；

其中，所述PCR反应体系包括：10×PCR反应液：2μL；待检样品DNA或阳性对照或阴性对照；10mM上游引物：1μL；10mM下游引物：1μL；ddH₂O：补足至20μL。

9.如权利要求8所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，其特征在于，所述待检样品DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，所述阳性对照和所述阴性对照的用量均为1μL。

10.权利要求4所述的犬新孢子虫特异PCR检测试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的动物检验检疫领域中的应用。

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