WO2005012563A1 - Procedimiento para la cuantificación y valoración de la viabilidad de neospora caninum en muestras de semen bovino - Google Patents

Procedimiento para la cuantificación y valoración de la viabilidad de neospora caninum en muestras de semen bovino Download PDF

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semen
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caninum
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Luis Miguel Ortega Mora
Esther COLLANTES FERNÁNDEZ
Javier Regidor Cerrillo
Ignacio FERRE PÉREZ
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Universidad Complutense De Madrid
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Definitions

  • the present invention refers to a procedure for the quantification and assessment of the viability of N. caninum in semen samples. More specifically, the invention relates to the normalization and application of the quantitative real-time PCR technique for the quantification of AD ⁇ of the N caninum parasite in fresh or frozen bovine semen samples and the determination of the viability of the parasite in this fluid by bioassay in mice of the BALB / c nu / nu strain.
  • the above has a great relevance, since the application of these techniques will determine the presence of N. caninum in semen and its viability or infective capacity.
  • Neospora caninum is a parasitic protozoan of the Apicomplexa group described since 1989 as a producer of abortion and neonatal mortality in cattle (Thilsted & Dubey 1989, J. Vet. Diagn. Invest. 1: 205-09). The infection has also been described in other hosts such as goat, sheep, horse, camel, water buffalo, deer, coyote and fox, although the disease is of greater importance in cattle and dogs (Dubey 1999, Vet. Parasitol 84. 349-67).
  • Bovine neosporosis is considered a parasitic disease of cosmopolitan distribution and one of the most frequent causes of reproductive failure in the various countries where it has been studied (Trees et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1195-2000; Anderson et al., 2000, Anim. Reprod. Sci. 60: 417-431), including Spain (González et al., 1999, Vet. Rec. 144: 145-150; Pereira-Bueno et al., 2003 Vet. Parasitol 111: 143-152).
  • the most important clinical manifestation of the infection is abortion in pregnant females and usually takes place between the third and ninth month of pregnancy, being more frequent around 5-6 months.
  • Affected calves born alive may have neuro-muscular problems, the first clinical signs appearing at 4-5 days postpartum, although these may be delayed until two weeks have elapsed. However, the most frequent is the birth of clinically healthy but chronically infected calves (Dubey & Lindsay 1996, Vet. Parasitol. 67: 1-59). In relation to disease transmission, the most recent studies indicate the relatively low importance of postnatal transmission and the persistence, throughout life, of congenital infection (Davison et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29 : 1683-1689; Hietala & Thurmond 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1669-1676).
  • the purpose of the invention is the quantification of
  • the present invention provides a method for extracting AD ⁇ from the parasite from semen samples and subsequent quantification by techniques based on the technique of PCR The procedure that is recommended, fully solves the problem previously exposed and allows the specific quantification of small amounts of parasitic DNA in samples from. Bovine semen both fresh and frozen.
  • the technique that has been standardized for the quantification of N caninum in semen samples has been a quantitative real-time PCR using the SYBR Green I system, which has previously shown a high specificity and sensitivity in infected tissues.
  • This technique has also been applied to quantify the 28S rR ⁇ A gene of the host in order to be able to compare the parasitic load in different samples and correct the presence of potential inhibitors in the PCR.
  • This technique has the advantage over conventional PCR techniques of allowing a quantification of AD ⁇ , faster processing, possibility of reading the samples in 96-well plates and not requiring further development in agarose gels.
  • the advantage of the use of a real-time quantitative PCR with SYBR Green I is that the use of fluorescent probes is not necessary, being possible to quantify both the parasite and the host gene.
  • the present invention also relates to a standardized procedure for assessing the viability of N caninum in semen.
  • the procedure is based on the inoculation of the semen samples in athymic mice of the BALBc nu / nu strain, host sensitive to N caninum infection.
  • the appearance of symptoms compatible with the infection and the quantification of specific AD can of N caninum in Inoculated mouse brain, demonstrates the infective capacity of the analyzed samples.
  • FIG. 1 (A) Standard curve for the quantification of N caninum constructed with serial decimal dilutions of AD ⁇ extracted from cell culture tachyzoites. The Ct values are represented in the standard curve (threshold cycle: cycle in which a sample is considered positive versus logarithm of the number of tachyzoites). (B) Standard curve for quantification of host AD ⁇ constructed with serial 1: 5 dilutions of genomic AD ⁇ extracted from the host. In the standard curve the values of Ct versus logarithm of nanograms of AD ⁇ are represented.
  • the sediment from of the cell fraction was resuspended in 600 ⁇ l of the DNA lysis buffer with proteinase K (final concentration 200 ⁇ g / ml), also being incubated in a water bath at 60 ° C for 1 h.
  • RNAse final concentration 20 ⁇ g / ml
  • DNA purification 200 ⁇ l of a solution for the precipitation of the proteins, contained in the commercial test, was added.
  • the sample was stirred vigorously for 20 s and centrifuged at 13000-16000 x g for 5 min.
  • the precipitated proteins formed an off-white sediment.
  • the sample supernatant was transferred to a clean tube and the sediment with the proteins was removed.
  • the DNA was precipitated by adding 600 ⁇ l of 100% cold isopropanol (stored at -20 ° C), the samples were inverted 50 times and incubated at -20 ° C for 30 min. Then, the samples were centrifuged at 13000-16000 xg / 15 min, and the supernatant was removed being careful not to release the precipitated DNA, which appears as a small sediment.
  • the DNA pellet was washed with 600 ⁇ l of 70% cold ethanol (-20 ° C), and then the samples were centrifuged at 13000-16000 xg for 5 min. The ethanol was then discarded and the samples were allowed to air dry until the alcohol evaporated completely. The sediment was resuspended in 50 ⁇ l of the DNA hydration solution contained in the kit and left overnight at room temperature until completely hydrated. Finally, the samples were stored at -20 ° C until the PCR was performed.
  • glycogen at 20 mg / ml at 600 ⁇ l of isopropanol.
  • the designed oligonucleotides, PF20 (5'-ACTGGAGGCACGCTGAACAC) and PR21 (5'-AACAATGCTTCGCAAGAGGAA) amplify a 76 bp fragment of the Nc-5 region of the N caninum genome (Kaufmann et al., 1995, Mol. Cell. Prob. 10: 289-297) between 247 and 323 bp (GenBank accession no. X84238).
  • the PCR mixture (25 ⁇ l) consisted of 5 ⁇ l of AD ⁇ , 20 pmoles of each oligonucleotide (Amersham Biosciences), 1 x SYBR Green PCR Buffer, 2 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of dATP, dCTP, and dGTP, 400 ⁇ M dUTP, 0.625 U of Amplitaq Gold AD ⁇ polymerase, 0.25 U of AmpErase U ⁇ G (uracil-N-glycosilase), all included in the "SYBR Green PCR Core kit" (Applied Biosystems).
  • the amplification consisted of a cycle of 2 min at 50 ° C, 10 min at 95 ° C, and 40 cycles of 95 ° C for 15 s and 60 ° C for 1 min).
  • the reactions for the quantification of N. caninum and the 28S rR ⁇ A gene were performed in separate tubes in an ABI 7700 Prism Sequence Detector thermocycler (Applied Biosystems).
  • the quantification of N. caninum was performed by interpolation of Ct (threshold cycle: cycle in which a sample is considered positive) on a standard curve constructed with known concentrations of AD ⁇ of the parasite (10 4 - 0.1 tachyzoites) versus their respective Ct.
  • For the quantification of the AD ⁇ of the host another standard curve was constructed with known concentrations of Genomic DNA (500-4 ng). The determination of the Ct value and the number of copies was calculated using the Sequence detector 7700 software (Applied Biosystems).
  • the sensitivity of the quantitative PCR on fresh semen samples was 1 tachyzoite per reaction, the contaminated fresh semen sample was amplified with 10 tachyzoites. The parasite's DNA was detected in the cell fraction.
  • the normalization of the procedure to determine the sensitivity of the bioassay in semen samples includes the evaluation of the infective capacity of N caninum tachyzoites inoculated in fresh semen and semen subjected to a process of dilution in cryopreservatives and freezing.
  • aliquots of 250 ⁇ l of bovine semen were contaminated with different amounts of live tachyzoites obtained in cell culture.
  • fresh semen aliquots were mixed with a commercial diluent (mixture of Tris, glycerol, antibiotics and egg yolk) as a cryopreservative and 250 ⁇ l aliquots were prepared, which were contaminated with serial decimal dilutions of Live tachyzoites prepared with the same procedure described for fresh semen. Subsequently, the different aliquots contaminated with lxlO 5 , lxlO 4 , lxlO 3 , lxlO 2 , 10, 1 and 0 tachyzoites per sample were frozen by immersion in nitrogen vapors for 10 minutes and then stored for 48 hours in nitrogen liquid.
  • a commercial diluent mixture of Tris, glycerol, antibiotics and egg yolk
  • mice of the BALBc nu / nu strain Before your inoculation in mice of the BALBc nu / nu strain, the different aliquots were thawed by direct immersion in a 37 ° C water bath and immediately after injected into female mice of the BALBc nu / nu strain of approximately 20-25 grams in weight . After inoculation, the animals were observed daily to detect the appearance of symptoms compatible with neosporosis, including nervous disorders, anorexia and lethargy (Yamage et al., 1996, J. Parasitol. 82: 172-179). When compatible clinical symptoms appeared or after 4 months from the moment of inoculation the mice were sacrificed by CO 2 inhalation.

Abstract

La presencia de N. caninum en muestras de semen bovino se cuantifica mediante una PCR cuantitativa en tiempo real, la cual utiliza el sistema SYBR Green I. Para la extracción del ADN del parásito de semen, se separa el fluido seminal de la fracción celular y se extrae el ADN de cada una de las fracciones utilizando una prueba comercial. Si es semen congelado con diluyente, la muestra se pasa a través de una columna de cromatografía de Sephacryl S-400 y el ADN se precipita con isopropanol y glicógeno. La cuantificación de N. caninum se realiza mediante interpolación del Ct (ciclo umbral: ciclo en el que una muestra es considera positiva) sobre una curva estándar construida con concentraciones conocidas de ADN del parásito frente a sus respectivos CT. Para la cuantificación del ADN del hospedador se realiza con otra curva estándar con concentraciones conocidas de ADN genómico. La viabilidad del parásito se confirma mediante bioensayo, inoculando a ratones BALBc nu/nu la fracción celular de las muestras de semen bovino. La aparición de síntomas compatibles con la infección y/o la cuantificación del ADN del parásito por PCR cuantitativa en muestras de encéfalo demuestra la viabilidad del parásito en la muestra seminal.

Description

TITULO
Procedimiento para la cuantificación y valoración de la viabilidad de Neospora caninum en muestras de semen bovino
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a un procedimiento para la cuantificación y valoración de la viabilidad de N. caninum en muestras de semen. De forma más concreta, la invención se refiere a la normalización y aplicación de la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real para la cuantificación del ADΝ del parásito N caninum en muestras de semen bovino fresco o congelado y la determinación de la viabilidad del parásito en este fluido mediante bioensayo en ratones de la estirpe BALB/c nu/nu. Lo anteriormente expuesto posee una gran relevancia, ya que la aplicación de estas técnicas permitirá determinar la presencia de N. caninum en semen y su viabilidad o capacidad infectiva. Este hecho posee valiosas aplicaciones, particularmente en la especie bovina, donde la inseminación artificial es una práctica habitual y la utilización de técnicas diagnósticas sensibles y específicas se hace necesaria a la hora de determinar el estado sanitario de los sementales bovinos, especialmente en centros de inseminación artificial y en explotaciones en extensivo, dónde la monta natural tiene gran importancia. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Neospora caninum es un protozoo parásito del grupo de los Apicomplexa descrito desde 1989 como agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino (Thilsted & Dubey 1989, J. Vet. Diagnc. Invest. 1: 205-09). La infección también se ha descrito en otros hospedadores como la cabra, oveja, caballo, camello, búfalo de agua, ciervo, coyote y zorro, aunque la enfermedad tiene una mayor importancia en los bovinos y en el perro ( Dubey 1999, Vet. Parasitol. 84. 349-67).
La neosporosis bovina está considerada como una enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las causas más frecuentes de fallo reproductivo en los diversos países donde se ha estudiado (Trees et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1195- 2000; Anderson et al., 2000, Anim. Reprod. Sci. 60: 417-431), incluido España (González et al., 1999, Vet. Rec. 144: 145-150; Pereira-Bueno et al., 2003 Vet. Parasitol. 111: 143-152). La manifestación clínica más importante de la infección es el aborto en las hembras gestantes y generalmente tiene lugar entre el tercer y noveno mes de gestación, siendo más frecuente en torno a los 5-6 meses. Los terneros afectados que nacen vivos pueden presentar problemas neuro-musculares, apareciendo los primeros signos clínicos a los 4-5 días post-parto, aunque estos pueden retrasarse hasta transcurridas dos semanas. Sin embargo, lo más frecuente es el nacimiento de terneros clínicamente sanos, pero crónicamente infectados (Dubey & Lindsay 1996, Vet. Parasitol. 67: 1-59). En relación con la transmisión de la enfermedad, los estudios más recientes indican la importancia relativamente escasa de la transmisión postnatal y la persistencia, durante toda la vida, de la infección congénita (Davison et al., 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1683-1689; Hietala & Thurmond 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1669-1676). La eliminación del parásito en el semen y su posible transmisión venérea o mediante la inseminación artificial viene respaldada por diversos hechos epidemiológicos, tales como la coincidencia temporal del aumento en el título de anticuerpos en hembras al comienzo de la etapa reproductora (Hietala & Thurmond 1999, Int. J. Parasitol. 29: 1669-1676; Pereira-Bueno et al., 2000, Int. J. Parasitol. 30: 906-909), la presencia de anticuerpos específicos frente a la infección por el parásito en sementales bovinos (Caetano da Silva et al., enviado a Vet. Parasitol. para su publicación), pero sobre todo la eliminación seminal demostrada en otros parásitos taxonómicamente muy próximos como Toxoplasma gondii (Spence et al., 1978, Vet. Rec. 102: 38-9; Dubey & Sharma 1980, Am. J. Vet. Res. 41: 749-795).
La posibilidad de contaminación del semen bovino por agentes infecciosos y parasitarios, y su posible transmisión a las hembras receptoras se ha convertido en una de las principales preocupaciones tanto para las autoridades sanitarias como para el sector productivo (Haré 1985, p. 117, In: Office International des Epizooties technical series n° 4). Tanto los sementales como su semen, están sometidos a un programa sanitario estricto que incluye diagnósticos periódicos de las enfermedades más importantes de acuerdo con su historia natural. En este sentido, la normalización y aplicación de técnicas que permitan el estudio de las posibles vías de eliminación y transmisión de la neosporosis, así como el estado sanitario de los sementales bovinos, especialmente de centros de inseminación artificial, es de suma importancia.
En la actualidad en la bibliografía científica se han descrito diversas técnicas de PCR para la detección del ADN del parásito (Dubey 1999, Vet. Parasitol. 84: 349-367), así como una PCR en tiempo real para la cuantificación del parásito en muestras de tejido infectadas (Collantes-Fernández et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40: 1194-1198). Sin embargo, estas técnicas no se encuentran normalizadas para la detección del parásito en semen fresco o congelado. Los fenómenos de inhibición en la PCR para la detección de diversos agentes infecciosos en semen ha sido descrita anteriormente por varios autores (Chistopher-Hennings et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 1730-1734; Santurde et al, 1996, Vet. Microbiol. 49: 81-92; Van Engelenburg et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31: 3129-3235).
Además, en la bibliografía científica se ha descrito la detección y aislamiento del parásito Toxoplasma gondii, filogenéticamente relacionado a N. caninum, mediante bio ensayo por el método de inoculación en un modelo murino susceptible a la toxoplasmosis (Derouin et al., 1987, J. Clin. Microbiol. 25: 1597-1600), método empleado para demostrar su eliminación seminal (Spence et al. 1978, Vet. Rec. 102: 38- 9; Dubey & Sharma 1980, Am. J. Vet. Res. 41: 749-95). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha descrito el desarrollo de un método normalizado para determinar la viabilidad y por tanto la capacidad infectante de N. caninum en semen mediante un bioensayo con hospedadores sensibles a la neosporosis como el gerbo o ratones inmunocomprometidos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Procedimiento para la cuantificación y valoración de la viabilidad de Neospora caninum en muestras de semen bovino.
El procedimiento objeto de la invención tiene por finalidad la cuantificación de
N. caninum en muestras de semen bovino frescas o congeladas y la valoración de su capacidad infectante con objeto de determinar la utilización del animal (o de su semen) con fines reproductivos.
En este sentido, tomando como referencia métodos de extracción de ADΝ a partir de semen descritos en la bibliografía científica (Von Beroldingen et al., 1990; p. 209-223. In H. A. Erlich (ed.) Stockton Press, ew York; Van Engelenburg et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31: 3129-3235), la presente invención proporciona un procedimiento para la extracción de ADΝ del parásito a partir de muestras de semen y su posterior cuantificación por técnicas basadas en la técnica de PCR. El procedimiento que se preconiza, resuelve de forma plenamente satisfactoria la problemática anteriormente expuesta y permite la cuantificación específica de pequeñas cantidades de ADN parasitario en muestras procedentes de. semen bovino tanto frescas como congeladas.
La técnica que se ha estandarizado para la cuantificación de N caninum en muestras de semen ha sido una PCR cuantitativa en tiempo real que emplea el sistema SYBR Green I, la cual ha mostrado previamente una elevada especificidad y sensibilidad en tejidos infectados. Esta técnica también ha sido aplicada para la cuantificación del gen 28S rRΝA del hospedador con el fin de poder comparar la carga parasitaria en diferentes muestras y corregir la presencia de potenciales inhibidores en la PCR. Esta técnica presenta la ventaja sobre las técnicas de PCR convencionales de permitir una cuantificación de ADΝ, mayor rapidez en el procesado, posibilidad de realizar la lectura de las muestras en placas de 96 pocilios y no necesitar de revelado posterior en geles de agarosa. Además, la ventaja de la utilización de una PCR cuantitativa en tiempo real con SYBR Green I radica en que no es necesario la utilización de sondas fluorescentes, pudiéndose usar para la cuantificación, tanto del parásito como del gen del hospedador.
La presente invención también se refiere a un procedimiento normalizado para la valoración de la viabilidad de N caninum en semen. El procedimiento se basa en la inoculación de las muestras de semen en ratones atímicos de la estirpe BALBc nu/nu, hospedador sensible a la infección por N caninum. La aparición de síntomas compatibles a la infección y la cuantificación de ADΝ específico de N caninum en encéfalo del ratón inoculado, demuestra la capacidad infectiva de las muestras analizadas.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción y con objeto de ayudar a una mejor compresión de las características del invento, se acompaña a la presente memoria descriptiva, como parte integrante de la misma, un dibujo en dónde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
La figura 1. (A) Curva estándar para la cuantificación de N caninum construida con diluciones decimales seriadas de ADΝ extraído de taquizoítos de cultivo celular. En la curva estándar están representados los valores de Ct (ciclo umbral: ciclo en el que una muestra es considera positiva versus logaritmo del número de taquizoítos). (B) Curva estándar para la cuantificación del ADΝ del hospedador construida con diluciones 1:5 seriadas de ADΝ genómico extraído del hospedador. En la curva estándar están representados los valores de Ct versus logaritmo de nanogramos de ADΝ.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos:
Ejemplo 1 Extracción del ADN de N caninum en muestras de semen fresco:
Para la extracción del ADΝ de N caninum en muestras de semen se ha normalizado un método de extracción utilizando una prueba comercial: "Genomic-Prep cell and tissue DΝA isolation kit" (Amershan Biosciences). Con el fin de determinar la sensibilidad de la PCR cuantitativa específica de N caninum en muestras de semen fresco, se procedió a contaminar alícuotas de 250 μl de semen fresco bovino con diluciones decimales seriadas de taquizoítos vivos obtenidos previamente de cultivo celular (104-0 taquizoí tos/muestra). En primer lugar, se procedió a la separación del fluido seminal y la fracción celular del semen según está descrito (Van Engelenburg et al, 1993, J. Clin. Microbiol. 31: 3129-3235) con el objetivo de determinar la fracción del semen en la cual el parásito es detectado. Para ello, se centrifugaron las muestras de semen contaminadas con el parásito a 12000 x g durante 3 min. El sobrenadante (fluido seminal: Fl) se separó del sedimento de células (fracción celular: F2) transfiriéndose a un tubo limpio. Posteriormente se añadió a la fracción Fl un volumen equivalente del tampón de lisis de ADΝ suministrado en la prueba comercial, y proteinasa K (Sigma) (200 μg/ml) y se incubó en baño María a 60°C durante 1 hora. El sedimento procedente de la fracción celular se resuspendió en 600 μl del tampón de lisis de ADN con proteinasa K (concentración final 200 μg/ml), incubándose también en baño maría a 60°C durante lh.
Terminada la incubación se añadió una RNAsa (concentración final 20 μg/ml) al lisado de cada fracción y se incubó a 37° C durante 30 min. Posteriormente, para la purificación del ADN, se añadió 200 μl de una solución para la precipitación de las proteínas, contenida en la prueba comercial. Se agitó la muestra vigorosamente durante 20 s y se centrifugó a 13000-16000 x g durante 5 min. Las proteínas precipitadas formaron un sedimento blanquecino. El sobrenadante de las muestras se transfirió a un tubo limpio y el sedimento con las proteínas se eliminó.
Finalmente, se procedió a la precipitación del ADN añadiendo 600 μl de isopropanol 100% frío (guardado a -20°C), se invirtieron las muestras 50 veces y se incubaron a -20°C durante 30 min. A continuación , se procedió a la centrifugación de las muestras a 13000-16000 x g/ 15 min, y se eliminó el sobrenadante con cuidado de no desprender el ADN precipitado, que aparece como un pequeño sedimento. El sedimento de ADN se lavó con 600 μl de etanol al 70% frío (-20°C), y seguidamente se centrifugaron las muestras a 13000-16000 x g durante 5 min. Después se desechó el etanol y se dejaron secar las muestras al aire hasta la completa evaporación del alcohol. El sedimento se resuspendió en 50 μl de la solución de hidratación de ADN contenida en el kit y se dejó toda la noche a temperatura ambiente hasta su completa hidratación. Por último las muestras se conservaron a -20°C hasta la realización de la PCR.
Ejemplo 2 Extracción del ADN de N caninum en muestras de semen congelado
Para la extracción del ADΝ parasitario a partir de semen congelado y la determinación de la sensibilidad de la PCR cuantitativa en este tipo de muestra, se mezcló semen con un diluyente comercial (mezcla de Tris, glicerol, antibióticos y yema de huevo), preparándose alícuotas de 250 μl las cuales se contaminaron con diluciones decimales seriadas de taquizoítos vivos (104-0 taquizoítos) y posteriormente se congelaron en nitrógeno líquido.
Con el fin de eliminar los potenciales inhibidores presentes en las muestras de semen congelado, debidas a los diluyentes, y tomando como referencia el método descrito por Santurde et al, (1996, Vet. Microbiol. 49: 81-92) se pasó todo el volumen de las muestras (250 μl) a través de una columna de cromatografía de Sephacryl S-400 (Amershan Pharmacia). Para el montaje de la columna se añadió 2 mi de Sephacryl S- 400 a un soporte de polypropyleno (Bio-Rad). La columna se colocó en un tubo de centrífuga y se centrifugó a 1000 x g durante 2 minutos. El equilibrado de la columna se realizó añadiendo 2 mi de solución 0,3M de acetato sódico pH 5,3 y se centrifugó de nuevo a 1000 x g durante 2 min. Este procedimiento se repitió tres veces. El último equilibrado de la columna se hizo con un volumen de 250 μl de TE pH 7,5 y la columna se sometió a otra centrifugación.
Preparada la columna se colocó un tubo de 1,5 mi (sin la tapa) dentro de un tubo de centrífuga y se introdujo la columna de Sephacryl S-400. A continuación se añadió sobre la columna, 250 μl de la muestra de semen congelada y se centrifugó a 1000 x g durante 2 min. Se recogió el filtrado en el tubo, el cuál se procesó siguiendo el mismo procedimiento que para el semen fresco, separando también las dos fracciones: fluido seminal y fracción celular. La única modificación en el procedimiento de extracción del ADN radica en el paso de precipitación con isopropanol, en el cual se añadió 1 μl
glicógeno a 20 mg/ml a los 600 μl de isopropanol.
Una vez extraído el ADN se procedió a determinar la sensibilidad de la PCR cuantitativa en las muestras de semen fresco y congeladas contaminadas con diluciones decimales seriadas de taquizoítos de N. caninum.
Ejemplo 3 Cuantifícación de N caninum en muestras de semen:
La cuantifícación de N. caninum en muestras de semen se realizó a partir del
ADΝ extraído de muestras de semen según se ha descrito en los ejemplos 1 y 2, y se empleó una PCR cuantitativa utilizando el sistema SYBR Green I (Collantes-Fernández et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40: 1194-1198). Los oligonucleótidos diseñados, PF20 (5'-ACTGGAGGCACGCTGAACAC) y PR21 (5'-AACAATGCTTCGCAAGAGGAA) amplifican un fragmento de 76 pb de la región Nc-5 del genoma de N caninum (Kaufmann et al., 1995, Mol. Cell. Prob. 10: 289-297) entre 247 y 323 pb (GenBank accession no. X84238). Un método similar fue empleado para la cuantificación del gen 28S rRΝA del hospedador (GenBank accession no. X00525), los oligonucleótidos diseñados para este gen PF28S (5'-TGCCATGGTAATCCTGCTCA) y PR28S (5'- CCTCAGCCAAGCACATACACC) amplifican un fragmento de ADΝ de 71 pb. La mezcla de PCR (25μl) consistió en 5 μl de ADΝ, 20 pmoles de cada oligonucleótido (Amersham Biosciences), 1 x SYBR Green PCR Buffer, 2 mM MgCl2, 200 μM de dATP, dCTP, y dGTP, 400 μM dUTP, 0,625 U de Amplitaq Gold ADΝ polymerasa, 0,25 U de AmpErase UΝG (uracil-N-glycosilase), todo incluido en el "kit SYBR Green PCR Core" (Applied Biosystems). La amplificación consistió en un ciclo de 2 min a 50°C, 10 min a 95°C, y 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min). Las reacciones para la cuantificación de N. caninum y el gen 28S rRΝA se realizaron en tubos separados en un termociclador ABI 7700 Prism Sequence Detector (Applied Biosystems). A la vista de la figura 1, la cuantificación de N. caninum se realizó mediante interpolación del Ct (ciclo umbral: ciclo en el que una muestra es considera positiva) sobre una curva estándar construida con concentraciones conocidas de ADΝ del parásito (104-0,1 taquizoítos) frente a sus respectivos Ct. Para la cuantificación del ADΝ del hospedador se construyó otra curva estándar con concentraciones conocidas de ADN genómico (500-4 ng). La determinación del valor del Ct y el número de copias se calculó mediante el software Sequence detector 7700 (Applied Biosystems).
La sensibilidad de la PCR cuantitativa sobre muestras de semen fresco fue de 1 taquizoíto por reacción, amplificándose la muestra de semen fresco contaminada con 10 taquizoítos. El ADN del parásito fue detectado en la fracción celular.
El procedimiento descrito fue aplicado a muestras de semen fresco y congelado procedentes de toros de centros de inseminación los cuales eran seropositivos frente a N. caninum. El ADΝ del parásito fue detectado en varias muestras tanto de semen fresco como congelado y siempre en la fracción celular, en las cuales se pudo cuantifϊcar hasta
1 taquizoíto en 60 ng de ADΝ.
Ejemplo 4 Valoración de la viabilidad de N caninum en muestras de semen:
La normalización del procedimiento para determinar la sensibilidad del bioensayo en muestras de semen, comprende la evaluación de la capacidad infectiva de taquizoítos de N caninum inoculados en semen fresco y semen sometido a un proceso de dilución en crioconservantes y congelación. Con el fin de determinar la sensibilidad del bioensayo en muestras de semen fresco, se procedió a contaminar alícuotas de 250 μl de semen bovino con distintas cantidades de taquizoítos vivos obtenidos en cultivo celular. Para ello, tras el recuento de taquizoítos viables en una cámara Neubauer con azul tripán al 0,05 %, se realizaron diluciones decimales seriadas en tampón fosfato (PBS) estéril y se contaminaron diferentes alícuotas con lxlO4, lxlO3, lxlO2, 10, 1 y 0 taquizoítos por muestra.
Inmediatamente después se procedió a la separación del fluido seminal y la fracción celular del semen de las diferentes alícuotas mediante centrifugación a 1350 x g durante
10-15 minutos, se retiró el sobrenadante (fluido seminal) y el sedimento fue resuspendido en 500 μl de PBS con Penicilina G (lOOOU/ml) y Estreptomicina (100
μg/ml). Las diferentes alícuotas se conservaron a 4° C durante un periodo inferior a los
30 minutos hasta la inoculación por vía intraperitoneal en ratones atímicos de la estirpe
BALBc nu/nu.
Respecto a las muestras de semen congelado, alícuotas de semen fresco se mezclaron con un diluyente comercial (mezcla de Tris, glicerol, antibióticos y yema de huevo) como crioconservante y se prepararon alícuotas de 250 μl, las cuales fueron contaminadas con diluciones decimales seriadas de taquizoítos vivos preparados con el mismo procedimiento descrito para el semen fresco. Posteriormente, las diferentes alícuotas contaminadas con lxlO5, lxlO4, lxlO3, lxlO2, 10, 1 y 0 taquizoítos por muestra se congelaron mediante inmersión en vapores de nitrógeno durante 10 minutos y, a continuación, se conservaron durante 48 horas en nitrógeno líquido. Antes de su inoculación en ratones de la estirpe BALBc nu/nu, las diferentes alícuotas fueron descongeladas mediante inmersión directa en un baño de agua a 37° C e inmediatamente después inyectadas a ratones hembras de la estirpe BALBc nu/nu de aproximadamente 20-25 gramos de peso. Después de la inoculación, los animales fueron observados diariamente para detectar la aparición de síntomas compatibles con neosporosis, incluyendo desórdenes nerviosos, anorexia y letargía (Yamage et al., 1996, J. Parasitol. 82: 172-179). Cuando aparecieron síntomas clínicos compatibles o bien trascurridos 4 meses desde el momento de la inoculación los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2. En la necropsia se retiró el encéfalo en condiciones asépticas y se procedió a la extracción de ADN de una porción de aproximadamente 20 mg, utilizando una prueba comercial: "Genomic-Prep cell and tissue DNA isolation kit" (Amershan Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante y 5 μl de la solución de ADN resultante (100-200 ng) se utilizó como molde para la PCR cuantitativa en tiempo real, según se describe en el ejemplo 3.
Los ratones BALBc nu/nu inoculados con las alícuotas de semen fresco contaminadas con lxlO2 taquizoítos o cantidades superiores desarrollaron síntomas compatibles con la infección entre los 25-30 días postinoculación. Por lo tanto, la sensibilidad del procedimiento fue de lxlO2 taquizoítos en muestras de semen fresco. Igualmente, los ratones inoculados con las muestras de semen congelado contaminadas con lxl O4 o cantidades superiores de taquizoítos desarrollaron síntomas compatibles con la infección a los 25-30 días postinoculación.

Claims

REIVINDICACIONES
Ia.- Procedimiento para la cuantificación del ADN del parásito N. caninum en semen bovino, caracterizado porque requiere la extracción del ADΝ del parásito mediante las siguientes etapas:
a). Separación del fluido seminal (fracción Fl) y fracción celular (F2) del semen por centifugación.
b). Aislamiento del ADΝ de cada fracción mediante uso de una prueba comercial, sometiendo las muestras a una digestión con proteinasa K a 60°C durante 1 h y un tratamiento con una RΝAsa a 37° C durante 30 min.
2a.- Procedimiento para la cuantifϊcación del ADΝ del parásito N. caninum en semen bovino, según reivindicación 1, caracterizado porque para muestras de semen congelado con diluyente, la extracción del ADΝ del parásito requiere:
- El paso a través de una columna de cromatografía de Sephacryl S-400 antes de proceder a la separación de la fracción Fl y F2.
- La precipitación del ADΝ con isopropanol con glicógeno.
3a.- Procedimiento para la cuantificación del ADN del parásito N caninum en semen bovino, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por emplear como técnica una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema SYBR Green I, que comprende las siguientes etapas:
a). Amplificación del ADΝ del parásito empleando como oligonucleótidos los correspondientes a un fragmento de 76 pb de la región Νc-5 del genoma de N. caninum, y cuantificación por interpolación del valor de Ct de la muestra en una curva estándar construida con concentraciones conocidas del ADΝ del parásito.
b). Amplificación del ADΝ del hospedador empleando como oligonucleótidos los correspondientes a un fragmento de ADΝ de 71 pb del gen 28S rRΝA y cuantificación por interpolación del valor de Ct de la muestra en una curva estándar construida con concentraciones conocidas de ADΝ genómico.
4 .- Procedimiento para valorar la viabilidad del parásito N. caninum en muestras de semen bovino, analizadas según reivindicación anterior, caracterizado por su realización mediante bioensayo en ratones de estirpe nude o atímica, que comprende las siguientes etapas:
a). Separación del fluido seminal y fracción celular del semen. b). Inoculación en ratones de estirpe nude o atímica de la fracción celular.
c.) Seguimiento de los ratones inoculados para la detección de los síntomas propios de la neosporosis y/o posterior detección-cuantificación del ADN del parásito mediante la utilización de la PCR cuantitativa en tiempo real a partir de encéfalo.
5a.- Procedimiento para valorar la viabilidad del parásito N caninum en muestras de semen bovino, según reivindicaciones 3 y 4, caracterizado porque la muestra es semen congelado con diluyente.
6a.- Procedimiento para valorar la viabilidad del parásito N caninum en muestras de semen bovino, según reivindicación 4 y 5, caracterizado porque los animales utilizados en el bioensayo son de la estirpe BALB/c nu/nu.
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