CN108410991B

CN108410991B - 区分蜱种间和种内特异性的检测方法

Info

Publication number: CN108410991B
Application number: CN201711425575.8A
Authority: CN
Inventors: 刘光远; 刘小翠; 罗金; 陈泽; 任巧云; 刘旻翾; 刘志杰; 独军政; 关贵全; 罗建勋; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN108410991A

Abstract

本发明公开一种可简单、快捷、准确地鉴定区分不同蜱种及区分不同地区的同一蜱种的方法。本发明的方法是：提取蜱的基因组DNA，再用相应的SCAR引物进行扩增，扩增产物在凝胶中进行电泳，根据电泳图中出现在特异位置的条带确定被测蜱的种类。本发明方法中所用的SCAR引物的制备方法是，参照物种通用SRAP引物序列，从蜱基因组中找出与蜱相关的序列扩增多态性片段SRAP，再从蜱SRAP片段中找出序列特征性扩增区域(SCAR)片段，然后设计、得到相应的蜱SCAR扩增引物。本发明的方法特异性强，重复性好，准确性高，可广泛地应用到蜱种间特异性鉴定及种内流行谱系的精准朔源。

Description

区分蜱种间和种内特异性的检测方法

技术领域

本发明涉及一种关于蜱的检测鉴别技术，确切讲是一种简单、快捷、准确地鉴定区分不同蜱种以及区分来自不同地区的同一蜱种的方法，同时提供蜱种间和种内的检测鉴别检测试剂盒。

背景技术

蜱隶属节肢动物门(Arthropoda)蛛形刚(蜱)螨亚纲(Acari)寄螨总目(Parasitiformes)螨亚纲寄螨总目蜱目(Ixodida)，包括硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)、纳蜱科(Nuttalliellidae)共3科900多种(杨亚,刘进辉,伏健,等.硬蜱常用分子分类技术研究进展[J].动物医学进展,2014,35(11):98-100；Barker S C,MurrellA.Systematics and evolution ofticks with a list ofvalid genus and speciesnames[J].Parasitology,2004,129:15-36.)，是一种专性体外吸血性寄生虫。目前，已知至少有10％的蜱是病原携带者(Jongejan F,Uilenberg G.The global importance ofticks[J].Parasitology,2004,129(S1):S3-S14；Schille F.Entomologie aus derMammut-und Rhinoceros-Zeit Galiziens[J].Entomol.Zeitsch,1916,30:42-43.)，能够传播多种病原体，包括病毒、细菌、立克次体、螺旋体、原虫等，可引起并传播200多种人兽共患病。为此，被认为对人类疾病的危害仅次于蚊子(Dantas-Torres F,Chomel B B,OtrantoD.Ticks and tick-borne diseases:a One Healthperspective[J].Trendsinparasitology,2012,28(10):437-446.)。此外，他们对畜牧业的危害也很严重(Kaaya GP.Laboratory and field evaluation of entomogenous fungi for tick control[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2000,916(1):559-564.)，据FAO统计，全球每年仅硬蜱给畜牧业造成的经济损失就高达70亿美元(曹务春等.蜱类及蜱媒疾病的公共卫生学意义[J].中国公共卫生,1999,15(3)221-222)。可见蜱和蜱传病不仅影响动物和人类的健康，还会造成严重的经济损失(曹务春等.蜱类及蜱媒疾病的公共卫生学意义[J].中国公共卫生，1999，15(3)221-222.；孟阳春(主编).蜱螨与人类疾病[M].第1版，合肥：中国科学技术大学出版社，1995:43.；秦文浩，李玉芝，宋彩华.内蒙古牙克石地区蜱消长调查[J].中国人兽共患病杂志，2005，21(11):935.)。目前已有的蜱种特异性和区域特异性鉴定方法包括以16S rRNA、COI和内部转录间隔(ITS)等标记基因为主的分子生物学方法(Shaw M,MurrellA,Barker S.Low intraspecific variation in the rRNA internaltranscribed spacer 2(ITS2)of the Australian paralysis tick,Ixodes holocyclus[J].Parasitology research,2002,88(3):247-252.；古小彬，余增莹，杨光友，等.嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COⅠ和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析[J].畜牧兽医学报，2010，41(6):746-754.；Norris D E,Klompen J S H,Black W C.Comparison ofthemitochondrial 12S and16S ribosomal DNA genes in resolving phylogeneticrelationships among hard ticks(Acari:Ixodidae)[J].Annals of the EntomologicalSociety ofAmerica,1999,92(1):117-129.)，以及形态学分类(杨晓军，陈泽，刘敬泽.蜱类系统分类学研究技术与进展[J].河北师范大学学报：自然科学版，2007，31(2):244-251.；邓国藩.中国硬蜱属记述(蜱螨亚纲:硬蜱科)[J].动物分类学报，1986，1:010.)。对于蜱的形态学鉴定，需要有丰富的经验和知识的专家，鉴定过程非常复杂。此外，对于未成熟的个体(卵、幼蜱)和不完整的标本，很难通过形态学鉴定加以区分(邓国藩,姜在阶.中国经济昆虫志[J].第三十九册-蜱螨亚纲硬蜱科，北京＝科学出版社,，1991.)。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，能对蜱种间特异性鉴定及种内流行谱系的精准朔源鉴定的方法，同时本发明提供用于检测的试剂盒。

本发明的用于区分蜱种间或种内鉴定特异性的SCAR引物的制备方法是：提取蜱的基因组DNA，先参照物种通用SRAP引物序列，从蜱基因组中扩增出与蜱相关的序列扩增多态性片段(SRAP)，再从蜱SRAP片段中找出序列特征性扩增区域(SCAR)片段，然后根据SCAR片段设计并得到相应的蜱SCAR扩增引物。

本发明的用于区分蜱种间或种内特异性检测的方法是：提取蜱的基因组DNA，再用SCAR引物进行扩增，扩增产物在凝胶中进行电泳，根据电泳图中出现在特异位置的条带确定被测蜱的种类。

本发明提供如下两个用于鉴别长角血蜱的试剂盒、两个用于鉴别亚洲璃眼蜱的试剂盒：

用于鉴别长角血蜱的试剂盒，其内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQID NO.4和SEQ ID NO.13；

用于鉴别长角血蜱的试剂盒，其内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQID NO.3和SEQ ID NO.12；

用于鉴别亚洲璃眼蜱的试剂盒，其内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10；

用于鉴别亚洲璃眼蜱的试剂盒，其内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.15。

本发明还提供了如下两个用于鉴别长角血蜱种内特异性的试剂盒，和用于鉴别亚洲璃眼蜱种内特异性的试剂盒：

用于鉴别长角血蜱新疆察县株的试剂盒，其内包括有特异性的SCAR引物SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.14；

用于鉴别长角血蜱新疆察县株的试剂盒，其内包括有特异性的SCAR引物SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.15。

用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆新源株的试剂盒，其内包括有特异性的SCAR引物SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.16；

用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆察县株的试剂盒，其内包括有特异性的SCAR引物SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.17；

用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆察县株的试剂盒，其内包括有特异性的SCAR引物SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.18。

本发明构建的试剂盒特异性强，重复性好，准确性高，并且试剂盒的操作简单，方便，可靠，可广泛地应用到蜱种间特异性鉴定及种内流行谱系的精准朔源，可以广泛应用到不同地域间动物贸易往来和候鸟迁徙过程中的生物安全检测中，也可以对未知来源或可疑入侵的蜱进行精准的朔源检测，以确定未知来源样本的谱系关系。

附图说明

图1为由SRAP标记性引物Me9-Em15检测的基因多态性的电泳图，图中：1-3为长角血蜱；4-6为青海血蜱；7-9为血红扇头蜱；10-12为亚洲璃眼蜱；13-15为阿坝革蜱；M:DNA分子质量标准。

图2为由SRAP标记性引物Me9-Em15检测的基因多态性的电泳图，图中：1-3为长角血蜱；4-6为青海血蜱；7-9为血红扇头蜱；10-12为亚洲璃眼蜱；13-15为阿坝革蜱；M:DNA分子质量标准。

图3由SRAP标记性引物Me12-Em18检测的基因多态性的电泳图，图中：1-3为长角血蜱；4-6为青海血蜱；7-9为血红扇头蜱；10-12为亚洲璃眼蜱；13-15为阿坝革蜱；M:DNA分子质量标准。

图4为由SRAP标记性引物Me1-Em4检测的中国亚洲璃眼蜱不同地区的基因多态性的电泳图，图中：1-3/5-7为新疆新源县；4为新疆沙雅县；8-9为新疆(地区来源不明)；10-12为内蒙古额济纳旗；13-15为新疆察县。

图5为由SRAP标记性引物Me9-Em9检测的中国亚洲璃眼蜱不同地区的基因多态性。1-3/5-7为新疆新源县；4为新疆沙雅县；8-9为新疆(地区来源不明)；10-12为内蒙古额济纳旗；13-15为新疆察县。

图6为由SRAP标记性引物Me9-Em9检测的中国亚洲璃眼蜱不同地区的基因多态性的电泳图，图中：1-3为新疆察县4-9为河南省安阳市；10-12为河北秦皇岛；13-15为甘肃省平凉市；16-18为甘肃省永靖县；19-21为湖北省大悟县M:DNA分子质量标准

图7为SCAR(特异性片段扩增)引物Me9-Q/Em15-Q对蜱种间特异性鉴定的电泳图，图中：1-3长角血蜱；4-6青海血蜱；7-9血红扇头蜱；10-12亚洲璃眼蜱；13-15阿坝革蜱；16-18微小牛蜱；19-21镰形扇头蜱；22-24龟形花蜱；25-26距刺血蜱；27空白对照；M：DNA分子质量标准。

图8为SCAR(特异性片段扩增)引物Me12-O/Em18-O对蜱种间特异性鉴定的电泳图，图中：1-3长角血蜱；4-6青海血蜱；7-9血红扇头蜱；10-12亚洲璃眼蜱；13-15阿坝革蜱；16-18微小牛蜱；19-21镰形扇头蜱；22-24龟形花蜱；25-26距刺血蜱；27空白对照；M：DNA分子质量标准。

图9为SCAR(特异性片段扩增)引物Me9-S/Em15-S对蜱种间特异性鉴定的电泳图，图中：1-3长角血蜱；4-6青海血蜱；7-9血红扇头蜱；10-12亚洲璃眼蜱；13-15阿坝革蜱；16-18微小牛蜱；19-21镰形扇头蜱；22-24龟形花蜱；25-26距刺血蜱；27空白对照；M：DNA分子质量标准。

图10为SCAR(特异性片段扩增)引物Me9-R/Em15-R对蜱种间特异性鉴定的电泳图，图中：1-3长角血蜱；4-6青海血蜱；7-9血红扇头蜱；10-12亚洲璃眼蜱；13-15阿坝革蜱；16-18微小牛蜱；19-21镰形扇头蜱；22-24龟形花蜱；25-26距刺血蜱；27空白对照；M：DNA分子质量标准。

图11为SCAR(特异性片段扩增)引物Me12HL-F/Em15HL-F对长角血蜱种内不同地区鉴定的电泳图，图中：1-3新疆察县；4-9河南省安阳市；10-12河北省秦皇岛；13-15甘肃省平凉市；16-18甘肃省永靖市；19-21湖北省大悟县；22空白；M：DNA分子质量标准。

图12为SCAR(特异性片段扩增)引物Me12HL-G/Em15HL-G对长角血蜱种内不同地区鉴定的电泳图，图中：1-3新疆察县；4-9河南省安阳市；10-12河北省秦皇岛；13-15甘肃省平凉市；16-18甘肃省永靖县；19-21湖北省大悟县；22空白；M：DNA分子质量标准。

图13为SCAR(特异性片段扩增)引物Me1AA-E/Em4AA-E对亚洲璃眼蜱种内不同地区鉴定的电泳图，图中：1-3新疆新源县；4新疆沙雅县；5-6新疆(地区来源不明)；7-9内蒙古额济纳旗；10-12新疆察县；13-15新疆沙雅；16-18新疆巴楚县夏河；19-21新疆于田县；22-24新疆巴楚县毛拉；25-27新疆轮台县；28新疆克拉玛依市；29新疆且末县；30-31新疆阿拉山口；32新疆尉犁县；33新疆伊吾县；34新疆吐鲁番市；M：DNA分子质量标准。

图14为SCAR(特异性片段扩增)引物Me1AA-B/EmAA-B对亚洲璃眼蜱种内不同地区鉴定的电泳图，图中：1-3新疆新源县；4新疆沙雅县；5-6新疆(地区来源不明)；7-9内蒙古额济纳旗；10-12新疆察县；13-15新疆沙雅；16-18新疆巴楚县夏河；19-21新疆于田县；22-24新疆巴楚县毛拉；25-27新疆轮台县；28新疆克拉玛依市；29新疆且末县；30-31新疆阿拉山口；32新疆尉犁县；33新疆伊吾县；34新疆吐鲁番市；M：DNA分子质量标准。

图15为SCAR(特异性片段扩增)引物Me9AA-N/Em9AA-N对亚洲璃眼蜱种内不同地区鉴定的电泳图，图中：1-3新疆新源县；4新疆沙雅县；5-6新疆(地区来源不明)；7-9内蒙古额济纳旗；10-12新疆察县；13-15新疆沙雅；16-18新疆巴楚县夏河；19-21新疆于田县；22-24新疆巴楚县毛拉；25-27新疆轮台县；28新疆克拉玛依市；29新疆且末县；30-31新疆阿拉山口；32新疆尉犁县；33新疆伊吾县；34新疆吐鲁番市；M：DNA分子质量标准。

具体实施方式

(一)蜱基因组提取

实验前准备：使用(QIAGEN)试剂盒提取实验蜱基因组，参见以下步骤：

1、将实验用蜱放置室温(15℃-25)；

2、准备2个温浴系统：步骤3需要放置56℃；步骤5需要放置70℃；

3、步骤11需要的AE buffer或灭菌水应放置在室温；

4、确认AW1和AW2(AW1和AW2为QINGEN试剂盒中两次冲洗缓冲液为浓缩型的，所以在第一次使用之前需要确定是否已加过规定量的96％-100％的乙醇)已按要求进行处理；

5、如BufferAE或BufferAL(为QIAGEN试剂盒中提供的蜱基因组收集缓冲液)出现沉淀，或者由于温度原因，在温度低的情况下可能会出现结晶，可在56℃加热溶解。

具体操作步骤如下：

1、准备实验所蜱不得超过25mg，吸取300μl 75％的乙醇置于1.5ml的离心管中，然后将蜱放入同一离心管，对蜱进行清洗10min，然后把蜱用灭菌的镊子取出放入新的1.5ml离心管中，再新管中加入200μl 0.9％的NaCl溶液，再次对蜱进行清洗，最后将蜱取出再次放入准备好的新的灭菌离心管中。

2、将装有蜱的1.5ml离心管加盖，置于准备好的液氮中10s，用镊子取出，用研磨杵迅速将蜱研碎。此步骤需戴防冻手套。然后加入180μl ATL buffer(QIAGEN试剂盒中提供)。

3、加入20μl蛋白酶K(QIAGEN试剂盒中提供)，混合后，56℃震荡温浴，直到蜱的组织彻底溶解(一般需1-3h)，如果不是新鲜组织也可过夜消化，不影响结果。

4、取出并短时间离心

5、加入200μl bufferAL，涡旋混合15s，70℃温浴10min，短时间离心。加入溶液后可能会出现沉淀，但温浴后即可溶解，不影响结果。

6、加入96％～100乙醇200μl，涡旋混合15s，短时间离心。

7、将柱子置于2ml收集管中，上述溶液(包括沉淀)移到柱子上，加上盖子，静置3min，6000g(8000rpm)离心1min。将柱子放到干净的2ml收集管中，弃掉含有滤液的管子。如溶液不能完全通过滤膜，可以更高的速度再次离心。

8、加入500μl bufferAW1加上盖子，6000g(8000rpm)离心1min，将柱子置于新的2ml的收集管中，弃掉含有滤液的管子。

9、加入500μlAW2buffer，加上盖子，高速(10000rpm)离心3min。

10、将柱子放入新的2ml收集管中，弃掉含有滤液的旧离心管，高速空离1min。

11、将柱子置于新的1.5ml的离心管中，加入100μl(不能多于100ul)AE buffer或灭菌水。室温静置5min，6000g(8000rpm)离心1min。

12、重复第11步。(两次得到的液体分别放在两个离心管中，做好标记)

可以通过核酸电泳对基因组DNA提取效果进行检测，或是通过核酸测定仪对所提基因组DNA的浓度和OD值进行测定。

13、将提取基因组作为实验扩增模板存放于-20℃备用。

(二)SRAP引物PCR扩增步骤(可参考文献(1)丁炜东,曹丽萍,曹哲明.草鱼种质相关SRAP及SCAR的分子标记[J].动物学报,2008,54(3):475-481.；(2)傅冰.SCAR标记在地木耳菌株分类鉴定中的运用[J].江苏农业科学,2016,44(9):64-66.；(3)Liu JY,Ying Z H,Liu F,et al.Evaluation ofthe use of SCAR markers for screening geneticdiversity ofLentinula edodes strains[J].Currentmicrobiology,2012,64(4):317-325.)。

在PCR管中加入以下成分：

其PCR反应条件是：

扩增反应在普通PCR仪上运行，反应的体系是为10ul，取少量扩增获得的PCR产物用2.50％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

(三)PCR产物纯化、转化及测序

1、PCR产物的纯化

将PCR产物于2.50％的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收方法按照胶回收试剂盒(OMEGA公司)的说明书进行操作。以下所使用Binding buffer，HiBind DNA column，2mlcollection，washing buffer和elution bufeer为OMEGA试剂盒中提供。

操作步骤如下：

(1)、尽可能小的切割含有目的基因的凝胶块。置于1.5ml的离心管中；

(2)、按每100mg琼脂糖加入400μl的binding buffer，置于45～55℃恒温震荡仪水浴5min，中间每隔1～2min取出摇匀一次，直到凝胶块完全溶化；

(3)、短暂离心，然后把溶化后的溶液转移到胶回收试剂盒提供的纯化柱(HiBindDNA column)上，室温放置2～5min，8000rpm离心1min，取出柱芯，将离心下来的液体再次移回柱子，静置2～5min再次8000rpm离心1min，随后弃掉收集管(2ml collection)中的液体，将纯化柱放回收集管中；

(4)、加500μl的washing buffer于柱中，8000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；

(5)、重复第(4)步的操作(再加500μl washing buffer(同第4步中使用的一样))离心，最后10000rpm空离30s，弃掉收集管及收集管中的液体；

(6)、将柱子放入一个新的1.5ml的离心管中，第一次加入15μl蒸馏水(H₂O)或elution bufeer(作为DNA收集缓冲液)至纯化柱膜中央，室温静置3～5min，10000rpm离心1min，洗脱DNA；重复第一次的操作，再次洗脱DNA。用蒸馏水或Elution buffer稀释纯化的PCR产物。相应操作中加入蒸馏水或Elution buffer的量可以根据条带的亮弱程度和个人试验对胶回收产物浓度的要求来调整。将收集的DNA溶液放置-20℃保存，备用。

2、基因的克隆、测序

(1)、克隆

在1.5ml的收集管中加入以下成分：

加入各种试剂的过程中，需要一边加入一边轻轻混匀，16℃水浴30min。

(2)、目的产物的转化、测序

在连接产物中加入30μl JM109感受态细胞，通过单克隆筛选，菌液PCR检测，阳性菌液样品进行测序(金斯瑞)，正确的菌液测序结果如下：

SEQ IDNo.19>SRAP种间鉴别长角血蜱序列(SRAP-Me9Em15(638bp))，

TGAGTCCAAACCGGTCAAAACCTGCCCAAATGTAGCTCAATTGCAGCAAACCTAATCTAACCCTACCAAACGTCACAGAACACAACCTATGTTAAACGTAATTTAACCCATTCTAGAAGTCCTGTGCGTGGATCTCTTGATATAGCAAAAGCCAGAGTATAAATATATTAACAAAATAACGACGACAGGAAAATTCTGAAAGCAAAAAAAAAAAAAACAACGGAATGGCGGCCTCGAACCTGGGCCTTGTCATTAAAAACCAAGTTCTATATCCCAGCGCTAGAGGGTGTTGCGACCGGGCGGGGGCACCCGATCCGAACTCCGCGGCCTCCGACATACGAGTGGTAGCGTGTATGATGCGAGCGGCCAGCCGCTGTTGCAGCCGTGAAGAAGTCCAGAAGCCGTAGGCTAACGTAACTGTTTACTTCATAGCGAGAGGTGAGCCGAAGCCAAACAACAATGCCCCGACGGGCGAGGTTACAATACAGGACTCGAGCAGAGCGACAACATCGATTCGCTGCTCTAACAGGAATGGTTTACAACGCTTAGGCAGCTCTATTTATACCCAAAAGCGGTAACGGTCAAACGCCAACACGCTGGAACACGCACTACACTCTTTCCAGAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.20>SRAP种间鉴别长角血蜱序列(SRAP-Me12Em18(347bp))，

TGAGTCCAAACCGGTGCGTGCAAAACAAGCGTTATCACCGCCAAAATTTCTCAAATGACGGCAAGAACTAGGTACACCAATGTTCGTTTATCACCTAGCTTGGTACGCAGAAATATAGGGTGCGTTCCCTGCCGGCAAAATGGCCGAGAGGTTAGATGCTAGGCTTCTGTTTTGGAGGTTGGTGGTTCGAATCTTGGCAAGATATTTTCTTTTAGGAGTTTGATAAGCTTTTTTTTACCAGGATATGCGCCTCTTTGTTGCTGTTCATTCCTGAAGTGACGTTATACTCAAACCTCAGTACACAGCAGCGCTGAACTTAGCTTCACGCATTGAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.21>SRAP种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SRAP-Me9Em15(318bp)，

TGAGTCCAAACCGGTCACAGGTCGATAACAGATAATTTACCGGACATGCTCACAAGGCAGCCGTAAAAAAGGACGATTGCACCGCCAGGTTCCACGGTTGCTGCAGATACTGCATGATGCTTGCACCTCGCAAGTTGTATAACAAATGCGCAGATTTTAACTTGGGCCGGAAAATTGACGCTTATTTCTTTTTCTTTATTTCATTTCCTTCATTGCTAAACCCGAACACACGTGAGGGTTCGATCACGCCAATCCGCGAAAAAGGCTGTTTCAAAAGCCAATCCCTATACATCCCGATGTCAGAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.22>SRAP亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me1Em4(549bp))，

TGAGTCCAAACCGGATAGCCGATTTCGTTGGCAATTTCCACTGCGCCTTCTTTGGAGTACGAAGTTTTACCTTTGGGTTGTGGAATTCCCATTTCTTCCAGGGCTTTCTCGAATTTATCACGGTTTTCAGCACGGTCAAGATCTTCCAGCGAAGTTCCCAAAATCTGAACGCCGTGTGCAGCCAGTTTATCCGCCAGATTAATCGCAGTTTGTCCGCCGAACTGAACGATAACGCCTTTTGGTTTTTCCAGCTCAATGATGTTCATGACATCTTCTTCTGTTAAAGGCTCGAAATATAATTTATCTGAAGTAGAAAAATCTGTGGAAACAGTTTCGGGATTATTGTTGATGATGATCGCTTCATATCCCATTTCCTTGATGGCCCAAACCGAGTGAACGGTAGCATAATCGAATTCCACGCCCTGCCCAATTCTGATAGGACCGGAACCCAGAACGATAATTTTCTCTTTGTCAGATGCAACGCTTTCGTTCTCTTCCTCATAAGTTCCGTAGAAATACGGTGTTTCACTTTCAAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.23>SRAP亚洲璃眼蜱种内鉴别新源株序列(SRAP-Me1Em4(648bp))，

TGAGTCCAAACCGGATACAACACAATAAAGTTTTGTTTTACAATGGGACAACCTGGATGGTAAATAGGAGTTGCAAGTTAGGGTCAAGAAAGTACAAGCTGGAATTGTAAAAACCTGGTATATCCCACTGTAAAAATGTTATATGTTTGTTGTGTGTGGAGGTAGGTGACAGTGTCTGTGCAAACTAGACTTACAGTAGACTTTACACCAGACTCCTTTTGGATGAAGAATTGTTGATAGGGGCATGTAGATAATAAATCTTAACTTCAGAGCAAATTCAAATAATGAAAGCCATGTGAAAATTGAATCTAATATTTTTTTTAATGTGAACGCTTATCGGCTTTTACAATTTCTTCTCTGTTTCACGAAATAGAGATGATAAACAAAGCAGGTTTATTGCACAGCAACTAATGTACTACAGGAAGGGTCTGCATCAAAAACACTGCTTCTTGATGGTATCAAAAGTGCATTTGATGTACTTGTGGAAAAGTAGCTGCTGCATGGGGCAGCGACATCCAAAACAGCTGCTTATTAGGCACGCTAGAGTCTACATGTATTTAGAGCTATTATGTATTGTTGTTGCAGTTATTGTAGTCGTTGCTGTAGTAGTTAAATCCTTGAAGCACACTGTCAAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.24>SRAP亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me9Em9(334bp))，

TGAGTCCAAACCGGTCACGCCTAAACTTGAGAAATCTCCTTTTCAGAAAGACTTTATTCGCGCCATTGAAATGATGCCACAACTGATTTGGGTTAGTTCAGCCGGACATCATCTATATAATTCTAATTTTAAACAGTATCTTGCTTCAGATGAGCAAAGCCTGACTGCTCAAAGCTGGCTGAATGCCATTCACCCGGAAGATGCCGAGCATCTGTGTTTTTTATGGGAAAGTGCGCAAAAAAGTGGTCAGAGTTTTGAAAAAGAATGCCGGATTCGGGATCGCCAGCAACGCTATCACTGGTTTTTGTTAATTGCCCGTAATTCGTACGCAGTC。

SEQ IDNo.25>SRAP长角血蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me2Em15(700bp))，

TGAGTCCAAACCGGAGCGGCGCCGGCACGTGCCAGTGCGTCCCATGCTCCTACCAAGTCCTTACGGCGCACTAGGACATCGATACGGCCCCCACTAGGCCAGGGGAGATGACGAACCACGGAATGGCCCACCGAGGCAGCCTTGCCCACCTGAGGGAAAGCGAGCCCAGCGCTGACCAGAGTCTCCGGTGCTTTTGGCCCCATTACCGTGATAATCGCTCGTTCTGCCTCGGCAATTTCTACCTTCGACCAGAAGACCATCATGGTGAGGTATTTCCACAGCGAGTCGAACCCGGAGGGTGAAACGTCGATAAGCACAGAGGATTCGAGAACCGTAATTGTCATATGGTGTTGAATGCGCCCGTTGGCATCCAGGTTGAGCGCCTCTGTAACGGTACCGGGCTTAGCCTCGTCGACCTTCTGGGAAAAAAGCGTGTTGAGGTAGGTCAGCCGATCCTCGCCGGTAATCTCGATGAATCGGTAGTGAGAGCGATCGACCGCTCCGCAATCGTCCTGGAGGTGTCGCTGCTCCACCAGAGGCTGCCCGTAGTGCCAGGCGACGGCAGAGTGCCAGTCACCATTGCCAGGAGCCTCGCCCGCAGTAGCGGCATTCGCAGCGGCTGCACCCGGCACGTGAGAGAGCAGAGGACTTACATATTCAACACTCACCCCAACATGTTAACCAGAATTCGTACGCAGTC。

(四)SCAR引物的设计

将前述测序得到的序列输入软件Primer5.0中，进行序列特征性比对分析，得到SCAR片段，再根据得到SCAR片段设计得到用于扩增的引物，所得到的SCAR引物见表1。

表1本发明中扩增蜱基因组所用的SCAR特异性引物序列

(四)SCAR引物PCR扩增

在PCR管中加入以下成分：

其PCR反应条件是：

扩增反应在PCR仪上运行。反应的体系为10μl，获得的产物在2.50％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。用本发明得到的部分SCAR引物扩增的产物测序结果如下：

SEQ ID No.26SCAR种间鉴别长角血蜱序列(SCAR-Me9-Q，Em15-Q(336bp))，

GTCAAAACCTGCCCAAATGTAGCTCAATTGCAGCAAACCTAATCTAACCCTACCAAACGTCACAGAACACAACCTATGTTAAACGTAATTTAACCCATTCTAGAAGTCCTGTGCGTGGATCTCTTGATATAGCAAAAGCCAGAGTATAAATATATTAACAAAATAACGACGACAGGAAAATTCTGAAAGCAAAAAAAAAAAAAACAACGGAATGGCGGCCTCGAACCTGGGCCTTGTCATTAAAAACCAAGTTCTATATCCCAGCGCTAGAGGGTGTTGCGACCGGGCGGGGGCACCCGATCCGAACTCCGCGGCCTCCGACATACGAGTGGTAGC；

SEQ ID No.27SCAR种间鉴别长角血蜱序列(SCAR-Me12-O，Em18-O(219bp))，

CTCAAATGACGGCAAGAACTAGGTACACCAATGTTCGTTTATCACCTAGCTTGGTACGCAGAAATATAGGGTGCGTTCCCTGCCGGCAAAATGGCCGAGAGGTTAGATGCTAGGCTTCTGTTTTGGAGGTTGGTGGTTCGAATCTTGGCAAGATATTTTCTTTTAGGAGTTTGATAAGCTTTTTTTTACCAGGATATGCGCCTCTTTGTTGCTGTTCAT；

SEQ ID No.28SCAR种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SCAR-Me9-R，Em15-R(176bp))，

CTCACAAGGCAGCCGTAAAAAAGGACGATTGCACCGCCAGGTTCCACGGTTGCTGCAGATACTGCATGATGCTTGCACCTCGCAAGTTGTATAACAAATGCGCAGATTTTAACTTGGGCCGGAAAATTGACGCTTATTTCTTTTTCTTTATTTCATTTCCTTCATTGCTAAACCCG；

SEQ ID No.29SCAR种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SCAR-Me9-S，Em15-S(252bp))，

CACAAGGCAGCCGTAAAAAAGGACGATTGCACCGCCAGGTTCCACGGTTGCTGCAGATACTGCATGATGCTTGCACCTCGCAAGTTGTATAACAAATGCGCAGATTTTAACTTGGGCCGGAAAATTGACGCTTATTTCTTTTTCTTTATTTCATTTCCTTCATTGCTAAACCCGAACACACGTGAGGGTTCGATCACGCCAATCCGCGAAAAAGGCTGTTTCAAAAGCCAATCCCTATACATCCCGATGTCA；

SEQ ID No.30SCAR亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me1AA-E，Em4AA-E(325bp))，

TTATCACGGTTTTCAGCACGGTCAAGATCTTCCAGCGAAGTTCCCAAAATCTGAACGCCGTGTGCAGCCAGTTTATCCGCCAGATTAATCGCAGTTTGTCCGCCGAACTGAACGATAACGCCTTTTGGTTTTTCCAGCTCAATGATGTTCATGACATCTTCTTCTGTTAAAGGCTCGAAATATAATTTATCTGAAGTAGAAAAATCTGTGGAAACAGTTTCGGGATTATTGTTGATGATGATCGCTTCATATCCCATTTCCTTGATGGCCCAAACCGAGTGAACGGTAGCATAATCGAATTCCACGCCCTGCCCAATTCTGATAG；

SEQ ID No.31SCAR亚洲璃眼蜱种内鉴别新源株序列(SCAR-Me1AA-B，Em4AA-B(303bp))，

AATGGGACAACCTGGATGGTAAATAGGAGTTGCAAGTTAGGGTCAAGAAAGTACAAGCTGGAATTGTAAAAACCTGGTATATCCCACTGTAAAAATGTTATATGTTTGTTGTGTGTGGAGGTAGGTGACAGTGTCTGTGCAAACTAGACTTACAGTAGACTTTACACCAGACTCCTTTTGGATGAAGAATTGTTGATAGGGGCATGTAGATAATAAATCTTAACTTCAGAGCAAATTCAAATAATGAAAGCCATGTGAAAATTGAATCTAATATTTTTTTTAATGTGAACGCTTATCGGCTTT；

SEQ ID No.32SCAR亚洲璃眼蜱种内鉴别新疆察县株序列(SCAR-Me9AA-N，Em9AA-N(227bp))，

GGTCACGCCTAAACTTGAGAAATCTCCTTTTCAGAAAGACTTTATTCGCGCCATTGAAATGATGCCACAACTGATTTGGGTTAGTTCAGCCGGACATCATCTATATAATTCTAATTTTAAACAGTATCTTGCTTCAGATGAGCAAAGCCTGACTGCTCAAAGCTGGCTGAATGCCATTCACCCGGAAGATGCCGAGCATCTGTGTTTTTTATGGGAAAGTGCGCAAA；

SEQ ID No.33SCAR长角血蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me2HL-F，Em15HL-F(351bp))，

AGGGGAGATGACGAACCACGGAATGGCCCACCGAGGCAGCCTTGCCCACCTGAGGGAAAGCGAGCCCAGCGCTGACCAGAGTCTCCGGTGCTTTTGGCCCCATTACCGTGATAATCGCTCGTTCTGCCTCGGCAATTTCTACCTTCGACCAGAAGACCATCATGGTGAGGTATTTCCACAGCGAGTCGAACCCGGAGGGTGAAACGTCGATAAGCACAGAGGATTCGAGAACCGTAATTGTCATATGGTGTTGAATGCGCCCGTTGGCATCCAGGTTGAGCGCCTCTGTAACGGTACCGGGCTTAGCCTCGTCGACCTTCTGGGAAAAAAGCGTGTTGAGGTAGGTCAGCC；

SEQ ID No.34SCAR长角血蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me2HL-G，Em15HL-G(281bp))，

CCAGGGGAGATGACGAACCACGGAATGGCCCACCGAGGCAGCCTTGCCCACCTGAGGGAAAGCGAGCCCAGCGCTGACCAGAGTCTCCGGTGCTTTTGGCCCCATTACCGTGATAATCGCTCGTTCTGCCTCGGCAATTTCTACCTTCGACCAGAAGACCATCATGGTGAGGTATTTCCACAGCGAGTCGAACCCGGAGGGTGAAACGTCGATAAGCACAGAGGATTCGAGAACCGTAATTGTCATATGGTGTTGAATGCGCCCGTTGGCATCCAGGTTGA。

本发明在执行过程中对PCR的退火温度经过了反复的摸索和验证。最终确定为61℃～67℃。在此温度范围之内能够稳定检测样本的特异性条带。

(五)发明方法的评估

(1)种间特异性引物评估

利用本发明的种间特异性引物对被测样品DNA进行扩增，蜱种不同，其扩增产物的电泳胶膜中将在特定位置出现条带，根据这一特征即可确定被检测样品的种类，具体的检测结果参见附图7至图10。从实验结果可见：

1.本发明利用不同蜱种(长角血蜱、亚洲璃眼蜱、青海血蜱、血红扇头蜱、阿坝革蜱、微小牛蜱、距刺血蜱、镰形扇头蜱、龟形花蜱)对引物Me9-Q/Em15-Q和Me12-O/Em18-O的特异性进行评估。结果显示，仅长角血蜱存在特异性的条带，其他蜱种均无条带出现；

2.对于Me9-R/Em15-R引物及Me9-S/Em15-S引物的评估。表明该引物仅对亚洲璃眼蜱特异。

(2)种内特异性引物评估

利用本发明的种内特异性引物对被测样品DNA进行扩增，蜱种不同，其扩增产物的电泳胶膜中将在特定位置出现条带，根据这一特征即可确定被检测样品的种类，具体的检测结果参见附图11至图15。从实验结果可见：

1.本发明对主要分布于我国新疆、河南、河北、甘肃、湖北等区域的长角血蜱不同虫株利用Me2HL-F/Em15HL-F及Me2HL-G/Em15HL-G引物进行鉴定。结果显示，仅新疆察县株有条带出现，其他地区均无条带出现。

2.而引物Me1AA-E/Em4AA-E和Me9AA-N/Em9AA-N仅对新疆察县株的亚洲璃眼蜱特异，其他地域的虫株不反应。

Me1AA-B/Em4AA-B仅对新疆新源株的亚洲璃眼蜱特异，而对其他区域亚洲璃眼蜱检测为阴性。

通过以上实验可知，本发明为一种可以准确确定蜱种间与种内特异性的方法，通过本发明的方法，可以得出蜱其它种的特异性SCAR引物及同一蜱种的种内特异性SCAR引物，并利用这些SCAR引物检测确定蜱的种类或流行区域。本发明操作简单、快捷、准确，能够节省大量的时间和精力，初学者也可以通过该方法进行蜱的分类鉴定，同时利用该方法能够对于未成熟的个体(卵、幼虫)和不完整的样品加以区分，而且还可以对一些未知来源的蜱样本(包括虫体样本和基因样本等)及入侵的蜱种类进行准确的鉴定和朔源。

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 区分蜱种间和种内特异性的检测方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Me9-S)

<400> 1

cacaaggcag ccgtaaaa 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Me9-R)

<400> 2

ctcacaaggc agccgtaaa 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Me12-O)

<400> 3

ctcaaatgac ggcaagaact 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Me9-Q)

<400> 4

gtcaaaacct gcccaaatg 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Me2HL-F)

<400> 5

aggggagatg acgaacca 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Me2HL-G)

<400> 6

ccaggggaga tgacgaacca 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Me1AA-B)

<400> 7

aatgggacaa cctggatgg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Me1AA-E)

<400> 8

ttatcacggt tttcagcacg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Me9AA-N)

<400> 9

ggtcacgcct aaacttgaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Em15-S)

<400> 10

tgacatcggg atgtataggg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Em15-R)

<400> 11

cgggtttagc aatgaaggaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Em18-O)

<400> 12

atgaacagca acaaagaggc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Em15-Q)

<400> 13

gctaccactc gtatgtcgga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Em15HL-F)

<400> 14

ggctgaccta cctcaacacg 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Em15HL-G)

<400> 15

tcaacctgga tgccaacgg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Em4AA-B)

<400> 16

aaagccgata agcgttcac 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Em4AA-E)

<400> 17

ctatcagaat tgggcaggg 19

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Em9AA-N)

<400> 18

ttttgcgcac tttccca 17

<210> 19

<211> 638

<212> DNA

<213> 种间鉴别长角血蜱序列(SRAP-Me9Em15)

<400> 19

tgagtccaaa ccggtcaaaa cctgcccaaa tgtagctcaa ttgcagcaaa cctaatctaa 60

ccctaccaaa cgtcacagaa cacaacctat gttaaacgta atttaaccca ttctagaagt 120

cctgtgcgtg gatctcttga tatagcaaaa gccagagtat aaatatatta acaaaataac 180

gacgacagga aaattctgaa agcaaaaaaa aaaaaaacaa cggaatggcg gcctcgaacc 240

tgggccttgt cattaaaaac caagttctat atcccagcgc tagagggtgt tgcgaccggg 300

cgggggcacc cgatccgaac tccgcggcct ccgacatacg agtggtagcg tgtatgatgc 360

gagcggccag ccgctgttgc agccgtgaag aagtccagaa gccgtaggct aacgtaactg 420

tttacttcat agcgagaggt gagccgaagc caaacaacaa tgccccgacg ggcgaggtta 480

caatacagga ctcgagcaga gcgacaacat cgattcgctg ctctaacagg aatggtttac 540

aacgcttagg cagctctatt tatacccaaa agcggtaacg gtcaaacgcc aacacgctgg 600

aacacgcact acactctttc cagaattcgt acgcagtc 638

<210> 20

<211> 347

<212> DNA

<213> 种间鉴别长角血蜱序列(SRAP- Me12Em18)

<400> 20

tgagtccaaa ccggtgcgtg caaaacaagc gttatcaccg ccaaaatttc tcaaatgacg 60

gcaagaacta ggtacaccaa tgttcgttta tcacctagct tggtacgcag aaatataggg 120

tgcgttccct gccggcaaaa tggccgagag gttagatgct aggcttctgt tttggaggtt 180

ggtggttcga atcttggcaa gatattttct tttaggagtt tgataagctt ttttttacca 240

ggatatgcgc ctctttgttg ctgttcattc ctgaagtgac gttatactca aacctcagta 300

cacagcagcg ctgaacttag cttcacgcat tgaattcgta cgcagtc 347

<210> 21

<211> 318

<212> DNA

<213> 种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SRAP-Me9Em15)

<400> 21

tgagtccaaa ccggtcacag gtcgataaca gataatttac cggacatgct cacaaggcag 60

ccgtaaaaaa ggacgattgc accgccaggt tccacggttg ctgcagatac tgcatgatgc 120

ttgcacctcg caagttgtat aacaaatgcg cagattttaa cttgggccgg aaaattgacg 180

cttatttctt tttctttatt tcatttcctt cattgctaaa cccgaacaca cgtgagggtt 240

cgatcacgcc aatccgcgaa aaaggctgtt tcaaaagcca atccctatac atcccgatgt 300

cagaattcgt acgcagtc 318

<210> 22

<211> 549

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me1Em4)

<400> 22

tgagtccaaa ccggatagcc gatttcgttg gcaatttcca ctgcgccttc tttggagtac 60

gaagttttac ctttgggttg tggaattccc atttcttcca gggctttctc gaatttatca 120

cggttttcag cacggtcaag atcttccagc gaagttccca aaatctgaac gccgtgtgca 180

gccagtttat ccgccagatt aatcgcagtt tgtccgccga actgaacgat aacgcctttt 240

ggtttttcca gctcaatgat gttcatgaca tcttcttctg ttaaaggctc gaaatataat 300

ttatctgaag tagaaaaatc tgtggaaaca gtttcgggat tattgttgat gatgatcgct 360

tcatatccca tttccttgat ggcccaaacc gagtgaacgg tagcataatc gaattccacg 420

ccctgcccaa ttctgatagg accggaaccc agaacgataa ttttctcttt gtcagatgca 480

acgctttcgt tctcttcctc ataagttccg tagaaatacg gtgtttcact ttcaaattcg 540

tacgcagtc 549

<210> 23

<211> 648

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别新源株序列(SRAP-Me1Em4)

<400> 23

tgagtccaaa ccggatacaa cacaataaag ttttgtttta caatgggaca acctggatgg 60

taaataggag ttgcaagtta gggtcaagaa agtacaagct ggaattgtaa aaacctggta 120

tatcccactg taaaaatgtt atatgtttgt tgtgtgtgga ggtaggtgac agtgtctgtg 180

caaactagac ttacagtaga ctttacacca gactcctttt ggatgaagaa ttgttgatag 240

gggcatgtag ataataaatc ttaacttcag agcaaattca aataatgaaa gccatgtgaa 300

aattgaatct aatatttttt ttaatgtgaa cgcttatcgg cttttacaat ttcttctctg 360

tttcacgaaa tagagatgat aaacaaagca ggtttattgc acagcaacta atgtactaca 420

ggaagggtct gcatcaaaaa cactgcttct tgatggtatc aaaagtgcat ttgatgtact 480

tgtggaaaag tagctgctgc atggggcagc gacatccaaa acagctgctt attaggcacg 540

ctagagtcta catgtattta gagctattat gtattgttgt tgcagttatt gtagtcgttg 600

ctgtagtagt taaatccttg aagcacactg tcaaattcgt acgcagtc 648

<210> 24

<211> 334

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me9Em9)

<400> 24

tgagtccaaa ccggtcacgc ctaaacttga gaaatctcct tttcagaaag actttattcg 60

cgccattgaa atgatgccac aactgatttg ggttagttca gccggacatc atctatataa 120

ttctaatttt aaacagtatc ttgcttcaga tgagcaaagc ctgactgctc aaagctggct 180

gaatgccatt cacccggaag atgccgagca tctgtgtttt ttatgggaaa gtgcgcaaaa 240

aagtggtcag agttttgaaa aagaatgccg gattcgggat cgccagcaac gctatcactg 300

gtttttgtta attgcccgta attcgtacgc agtc 334

<210> 25

<211> 700

<212> DNA

<213> 长角血蜱种内鉴别察县株序列(SRAP-Me2Em15)

<400> 25

tgagtccaaa ccggagcggc gccggcacgt gccagtgcgt cccatgctcc taccaagtcc 60

ttacggcgca ctaggacatc gatacggccc ccactaggcc aggggagatg acgaaccacg 120

gaatggccca ccgaggcagc cttgcccacc tgagggaaag cgagcccagc gctgaccaga 180

gtctccggtg cttttggccc cattaccgtg ataatcgctc gttctgcctc ggcaatttct 240

accttcgacc agaagaccat catggtgagg tatttccaca gcgagtcgaa cccggagggt 300

gaaacgtcga taagcacaga ggattcgaga accgtaattg tcatatggtg ttgaatgcgc 360

ccgttggcat ccaggttgag cgcctctgta acggtaccgg gcttagcctc gtcgaccttc 420

tgggaaaaaa gcgtgttgag gtaggtcagc cgatcctcgc cggtaatctc gatgaatcgg 480

tagtgagagc gatcgaccgc tccgcaatcg tcctggaggt gtcgctgctc caccagaggc 540

tgcccgtagt gccaggcgac ggcagagtgc cagtcaccat tgccaggagc ctcgcccgca 600

gtagcggcat tcgcagcggc tgcacccggc acgtgagaga gcagaggact tacatattca 660

acactcaccc caacatgtta accagaattc gtacgcagtc 700

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213> 种间鉴别长角血蜱序列(SCAR-Me9-Q/Em15-Q)

<400> 26

gtcaaaacct gcccaaatgt agctcaattg cagcaaacct aatctaaccc taccaaacgt 60

cacagaacac aacctatgtt aaacgtaatt taacccattc tagaagtcct gtgcgtggat 120

ctcttgatat agcaaaagcc agagtataaa tatattaaca aaataacgac gacaggaaaa 180

ttctgaaagc aaaaaaaaaa aaaacaacgg aatggcggcc tcgaacctgg gccttgtcat 240

taaaaaccaa gttctatatc ccagcgctag agggtgttgc gaccgggcgg gggcacccga 300

tccgaactcc gcggcctccg acatacgagt ggtagc 336

<210> 27

<211> 219

<212> DNA

<213> 种间鉴别长角血蜱序列(SCAR-Me12-Q/Em18-Q)

<400> 27

ctcaaatgac ggcaagaact aggtacacca atgttcgttt atcacctagc ttggtacgca 60

gaaatatagg gtgcgttccc tgccggcaaa atggccgaga ggttagatgc taggcttctg 120

ttttggaggt tggtggttcg aatcttggca agatattttc ttttaggagt ttgataagct 180

tttttttacc aggatatgcg cctctttgtt gctgttcat 219

<210> 28

<211> 176

<212> DNA

<213> 种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SCAR-Me9-R/Em15-R)

<400> 28

ctcacaaggc agccgtaaaa aaggacgatt gcaccgccag gttccacggt tgctgcagat 60

actgcatgat gcttgcacct cgcaagttgt ataacaaatg cgcagatttt aacttgggcc 120

ggaaaattga cgcttatttc tttttcttta tttcatttcc ttcattgcta aacccg 176

<210> 29

<211> 252

<212> DNA

<213> 种间鉴别亚洲璃眼蜱序列(SCAR-Me9-S/Em15-S)

<400> 29

cacaaggcag ccgtaaaaaa ggacgattgc accgccaggt tccacggttg ctgcagatac 60

tgcatgatgc ttgcacctcg caagttgtat aacaaatgcg cagattttaa cttgggccgg 120

aaaattgacg cttatttctt tttctttatt tcatttcctt cattgctaaa cccgaacaca 180

cgtgagggtt cgatcacgcc aatccgcgaa aaaggctgtt tcaaaagcca atccctatac 240

atcccgatgt ca 252

<210> 30

<211> 325

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me1AA-E/Em4AA-E)

<400> 30

ttatcacggt tttcagcacg gtcaagatct tccagcgaag ttcccaaaat ctgaacgccg 60

tgtgcagcca gtttatccgc cagattaatc gcagtttgtc cgccgaactg aacgataacg 120

ccttttggtt tttccagctc aatgatgttc atgacatctt cttctgttaa aggctcgaaa 180

tataatttat ctgaagtaga aaaatctgtg gaaacagttt cgggattatt gttgatgatg 240

atcgcttcat atcccatttc cttgatggcc caaaccgagt gaacggtagc ataatcgaat 300

tccacgccct gcccaattct gatag 325

<210> 31

<211> 303

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别新源株序列(SCAR-Me1AA-B/Em4AA-B)

<400> 31

aatgggacaa cctggatggt aaataggagt tgcaagttag ggtcaagaaa gtacaagctg 60

gaattgtaaa aacctggtat atcccactgt aaaaatgtta tatgtttgtt gtgtgtggag 120

gtaggtgaca gtgtctgtgc aaactagact tacagtagac tttacaccag actccttttg 180

gatgaagaat tgttgatagg ggcatgtaga taataaatct taacttcaga gcaaattcaa 240

ataatgaaag ccatgtgaaa attgaatcta atattttttt taatgtgaac gcttatcggc 300

ttt 303

<210> 32

<211> 227

<212> DNA

<213> 亚洲璃眼蜱种内鉴别新疆察县株序列(SCAR-Me9AA-N/Em9AA-N)

<400> 32

ggtcacgcct aaacttgaga aatctccttt tcagaaagac tttattcgcg ccattgaaat 60

gatgccacaa ctgatttggg ttagttcagc cggacatcat ctatataatt ctaattttaa 120

acagtatctt gcttcagatg agcaaagcct gactgctcaa agctggctga atgccattca 180

cccggaagat gccgagcatc tgtgtttttt atgggaaagt gcgcaaa 227

<210> 33

<211> 351

<212> DNA

<213> 长角血蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me2HL-F/Em15HL-F)

<400> 33

aggggagatg acgaaccacg gaatggccca ccgaggcagc cttgcccacc tgagggaaag 60

cgagcccagc gctgaccaga gtctccggtg cttttggccc cattaccgtg ataatcgctc 120

gttctgcctc ggcaatttct accttcgacc agaagaccat catggtgagg tatttccaca 180

gcgagtcgaa cccggagggt gaaacgtcga taagcacaga ggattcgaga accgtaattg 240

tcatatggtg ttgaatgcgc ccgttggcat ccaggttgag cgcctctgta acggtaccgg 300

gcttagcctc gtcgaccttc tgggaaaaaa gcgtgttgag gtaggtcagc c 351

<210> 34

<211> 281

<212> DNA

<213> 长角血蜱种内鉴别察县株序列(SCAR-Me2HL-G/Em15HL-G)

<400> 34

ccaggggaga tgacgaacca cggaatggcc caccgaggca gccttgccca cctgagggaa 60

agcgagccca gcgctgacca gagtctccgg tgcttttggc cccattaccg tgataatcgc 120

tcgttctgcc tcggcaattt ctaccttcga ccagaagacc atcatggtga ggtatttcca 180

cagcgagtcg aacccggagg gtgaaacgtc gataagcaca gaggattcga gaaccgtaat 240

tgtcatatgg tgttgaatgc gcccgttggc atccaggttg a 281

Claims

1.一种用于鉴别长角血蜱的试剂盒，其特征在于盒内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 13。

2.一种用于鉴别长角血蜱的试剂盒，其特征在于盒内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 12。

3.一种用于鉴别亚洲璃眼蜱的试剂盒，其特征在于盒内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 10。

4.一种用于鉴别亚洲璃眼蜱的试剂盒，其特征在于盒内包括有用于区分蜱种间特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.11。

5.一种用于鉴别长角血蜱新疆察县株的试剂盒，其特征在于盒内包括有特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.14。

6. 一种用于鉴别长角血蜱新疆察县株的试剂盒，其特征在于盒内包括有特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO.15。

7. 一种用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆新源县株的试剂盒，其特征在于盒内包括有特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO.16。

8. 一种用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆察县株的试剂盒，其特征在于盒内包括有特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO.17。

9. 一种用于鉴别亚洲璃眼蜱新疆察县株的试剂盒，其特征在于盒内包括有特异性的SCAR引物SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO.18。